Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Альдегиддегидрогенеза высших растений

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Альдегиддегидрогенеза высших растений"

о Он

" '?/.[)? (Я;

Российская Академия наук Сибирское отделение Новосибирский институт биоорганической химии

На правах рукописи УДК 577.15:582.5

Ли Наталья Геннадьевна

Альдегиддегидрогенеза

высших растений

(03.00.04 - биохимия)

АВТОРЕФЕРАТ . диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Российская Академия наук

Сибирское отделение Новосибирский институт биоорганической химии

На правах рукописи УДК 577.15:582.5

Ли Наталья Геннадьевна

Альдегиддегидрогенеза высших растений

(03.00.04 - биохимия)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в Якутском институте биологии СО РАН.

Научные руководители:

кандидат биологических наук Алексеев В.Г.

кандидат биологических наук Осаковский В .А.

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор химических наук Нсвииский ГА. кандидат химических наук

Рогожин В .В.-

Новосибирский институт молекулярной патологии и экологической биохимии

Защита состоится '-" 1994г. в-часов на заседании

Специализированного совета К 003.52.01 в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск 90, прЛ аврснтьева,8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии.

Автореферат разослан"-"_1994г.

Ученый секретарь Специализированного совета,

кандидат химических наук ¿С/ . О.С.Федорова

общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Альдегидцегидрогеназа относится к группе малоизученных растительных ферментов, который катализирует процесс окисления химически и физиологически активных соединений-альдегидов. При широкой субстратной специфичности' фермент обладает наибольшим сродством к ацетальдегиду.

Биологическая роль этого фермента в клетках высших растений недостаточно выяснена. Трудности в изучении данной проблемы связаны, главным образом, со слабой изученностью субклеточной локализации данного фермента, а также его кинетических и физико-химических свойств.

Цель работы состояла в выяснении локализации АльДГ в основных компартаментах растительной клетки, разработке методов выделения хлоропластной АльДГ и очистки митохондриального фермента; характеристике некоторых физико-химических свойств этих форм фермента, а также попытке объяснить биологическую роль АльДГ высших растений.

Научная новизна работы. Впервые показано, что АльДГ локализуется не только в цитоплазме и митохондриях, но и хлороплас-тах растительной клетки. Впервые изучены кинетические свойства этого фермента; показано, что он обладает высоким сродством к ацетальдегиду.

* Проведенный сравнительный анализ трех форм растительной АльДГ показал, что лучшими каталитическими свойствами по отношению к ацетальдегиду обладает иитохондриальный фермент.

Оценена молекулярная масса митохондриального фермента (204,2 кДа), показано, что фермент состоит из двух типов субъединиц.

Разработан метод препаративного получения субъединицы 54 кДа митохондриальной АльДГ, определен ее аминокислотный состав и л/-конец, а также проведен сравнительный анализ данной субъединицы с соответствующими субъединицами фермента, выделенного из других организмов.

Предложена метаболическая модель, объясняющая биологическую роль АльДГ в клетках высших растений.

Практическая ценность работы. Разработан метод получения в препаративных количествах высокоочищенного фермента митохондриальной алъдегидцегицрогенаэы.

3

Получение высокоочищенного препарата суоъединицы о4 кДа митохондриального фермента позволило получить моноклональные антитела, которые являются уникальным инструментом для проведения иммунохимических исследований.

Аппробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на семинаре отдела биохимии Института биоорганической химии (Новосибирск,I9S2), на семинаре отдела биохимии и физиологии растений Иркутского института физиологии и биохимии растений (1991), на семинаре отдела физиологии и биохимии Института биологии ЯНЦ СО АН СССР (IS8S) и на научной сессии Института биологии ЯНЦ СО АН СССР (1991).

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, результатов, экспериментальной части, обсуждения, выводов и списка литературы; содержит 83 страницы машинописного текста, 13 таблиц, 17 рисунков. Библиографический список состоит из III наименований литературных источников.

Дубликации. По результатам исследований, изложенных в диссертации, опубликовано 4 статьи.

Содержание работы. Альдегиддегидрогеназа катализирует процесс окисления химически и физиологически активных соединений-альдегидов. Фермент высших растений отличен по своим свойствам от фермента дрожжевого и животного происхождения. Известно, что в высших растениях существуют две формы этого фермента: митохо-ндриалькая и цитоплаэматическая. Однако, малая изученность их не позволяет достаточно полно представить их свойства и функции.

В данной работе представлены новые данные по выяснению локализации данного фермента в растительной клетке, изучению физико-химических свойств разных его фЬрм, получению высокоочи-щенного митохондриального фермента и на основе этих результатов предложена метаболическая модель функционирования растительной альдегиддегидрогенаэы.

I. Изучение хлоропластной альдегидцегидрогеназы.

Альдегиддегидрогеназу (АльДГ) экстрагировали из хлоропла-стов методом солюбилизации их 0,5$ раствором дигитонинав среде выделения хлоропластов. Полученный экстракт содержал алко-гольдегидрогеназу, активность которой превышала активность АльДГ в 20 раз, но полностью ингибировалась 50 мМ растворомпи-

4

разола. В зависимости от вида растения удельная активность АльДГ в значительной степени варьирует. Наибольшей удельной активностью обладали хлоропласты из листьев мал (Таблица I).

Таблица I

Удельные активности АльДГ хлоропластов из разных растительных источников

Вич оастения Удельная активность АльДГ,

растения нкзль/(мин-мг) белка

Ппеница "Якутянка-224" 0,057 0,018

Арктофила рыжеватая 0,15?0,05

Маш 0,6*0,25

На рис.1 представлена хроматограмма АльДГ, полученная при очистке фермента на ДЕАЕ-целлюлозе, уравновешенной буфером А. Фермент элюируется с колонки одной активной фракцией при достаточно высокой ионной силе (0,18 М КС?), что свидетельствует о выраженной зараженности молекулы фермента. Вследствие этого данный способ очистки является весьма эффективным, позволяющим" очистить фермент в 104 раза по активности.

Активные фракции в дальнейшем собирали и методом ультрафильтрации оценивали фильтрационную способность молекулы АльДГ на мембранных фильтрах ХМ-50 и ХМ-ЮО. Фильтры ХМ-50 в отличие от ХМ-ЮО удерживали молекулы фермента. Это различие в. прохождении через указанные фильтры позволили" приблизительно оценить молекулярную массу АльДГ,. рав-ную 50.-100 кДа.

Были изучены следующие энзимологические параметры фермента: а) К^(каж) для ацетальдегида была определена графическим методом в координатах Лайнуивера-Бэрка и равна 11,5 мкМ; б) Кэд(каж) для НАД, определенная тем же методом, характеризуется высоким значением, равным 1,3 мМ; в) зависимость активности АльДГ от рН среды изучали в диапазоне рН 7,8-9,7, при этом рН-оптимум активности оказался равным 8,8; г) температурный оптимум активности фермента достигается при 35 °С. При данной температуре активность АльДГ повышается в 8 раз по сравнению с активностью при комнатной температуре. Дальнейшее повышение температуры приводит к инактивации фермента (Рис.2); д) хлоропла-

5

люлозе (колонка 3,5x7,0), уравновешенной 0.02М К-фо-сфатнш буфером, рН 8,8, содержащим 5 мМ дитиотреи-тол, дититонин, объем фракций - 5 мл.

Рис.2. Зависимость отдельной активности АльДГ от

температуры.

б

стная АльДГ является сульфгидрильным ферментом, он стабилизируется дитиотреитолом (5 м.М) и полностью ингибируется растпо-ром ингибитора п-хлормеркурибенэсята натрия (150 мк.М).

Таким образом, -описанная Аль",Г локализуется, по-видимому, в строме хлоропластов и обладает достаточно высоким сродством к ацетальдегипу. Небольшое значение молекулярной массы белка свидетельствует о его малых размерах, что отличает фермент не только от известных-растительных альдегиддегидрогеназ, но и АльДГ из других организмов.

2. Исследование свойств митохондриальной альдегидцегидрогенаэы

а) Очистка митохондриальной АльДГ методом ионообменной и аффинной хроматографии

АльДГ выделяли из митохондрий методом ступенчатой экстракции вначале 1%, затем 1,5% раствором тритона Х-ЮО впервые предложенным Аскером. Такой характер солюбилизации фермента обусловлен, вероятно, тем, что он является гидрофобным белком, прочно связанным с мембраной. При извлечении из мембран фермент становится очень лабильным. Для повышения стабильности фермента в процессе его выделения мы использовали дитиотреитол в концентрации 5 мМ, что сохраняло активность фермента в течение двух дней.

На первой стадии очистки использовали ионообменную хроматографию на ДЕАЕ-целлюлозе, профиль элюции которой представлен на рис.3. Альдегиддегидрогеназа элюируется практически до градиента КС£(0-0,2 М) вслед за неадсорбированной фракцией белков, что свидетельствует о слабой отрицательной заряженности фермента..

Наиболее эффективная очистка достигалась на стадии аффинной хроматографии на 5'АМР-сефарозе (Рис.4). Фермент полностью адсорбируется на сефарозе, в то время как основная масса белков в этих условиях не связывается. Полное алюирование фермента осуществляется при внесении в буфер НАД и повышении его рН до 7,9.

Сводная характеристика препарата после каждого этапа очистки представлена в таблице 3.

Рис.3. Хроматография альдегиддегидрогеназы на ДЕАЕ-целлю-лозе. I - поглощение при 620 нм (определение концентрации белка по методу Бредфорд), 2 - активность фермента (отбирали фра-«"»» 9-12).

Ас го

Рис.4. Хроматография альдегиддегидрогеназы на 5'АМР-сефа-розе. I - поглощение при 620 нм (определение концентрации белка по методу Бредфорд), 2 - активность фермента (отбирали фракции 46-51).

е

Таблица 3

Очистка мятохондриальной альдегивдегидрогеназы из корней мал

Концен- Удель- Сушарная Степень

трация Кол-во ная актнв- очистки Стадия Объеа, белка, белка, актив» ность, по _ очистки ил иг/ил иг ность, нмоль/кпн тивно- бел-

сти ку

ниоль

ШТН'МГ

Экстракция

ИЗ МКТОХО-

ндрнй 1,5-

процентным

раствором

тритона

Х-100

Ионообменная хроматография на ДЕАЕ--целлюлозе

Аффинная хроматография на 5 АМР-се-фарозе

24

14

6,6 158,4 , 2,55 403,9

1,0

13,0 29,4 411,6 11,59 II

3,6 0,12 0,43 350,0 151,2 137,25 366

Результаты получены при использовании 0,8 кг корней маш.

б) Ферментативные свойства альдегиддегидрогеназы

I) Кц(каж) для ацетальдегида и НАД, а также Умах оценивали методом графического определения в координатах Ханса и Вольфа (S/u - по оси ординат, S - по оси абсцисс, где 5 - концентрация ацетальдегида) с помощью компьютерного анализа экспериментальных данных (Рис.5). Значение Кц(каж) для ацетальдегида равно 0,2 мкЫ. По данным Аскера и Дэвиса Кц(каж) для ацетальдегида митохондриальной АльДГ из пятидневных эпикотилей го-

Рис.5. Влияние концентрации ацетальдегида С?) на активность альдегиддегидрогеназы (концентрация ацетальдегида 1-50 мкМ).

роха равна 1,6 мкМ. Различие в полученных и литературных данных, вероятно, можно объяснить разной степенью очистки фермента. Аскер и Дэвис использовали один этап очистки - аффинную хромотографию на 5'АМР-сефарозе. Следует отметить высокую степень сродства митохондриального фермента к ацетальдегиду, По-видимому, эта форма альдегиддегидрогеназы ответственна, главным образом, за утилизацию ацетальдегида в митохондриях растительной клетки.

Ку(каж) для НАД равна 348 мкМ. Фермент строго специфичен к кофактору НАД и не проявляет активности с НАДН 2) Влияние РН и температуры на ферментативную активность. Исследовали изменение активности АльДГ в К-фосфатном буфере в диапазоне рН 7,0-9,0. При рН 8,0 фермент проявляет наибольшую активность. Изменение ферментативной активности в диапазоне 5-45 °С позволило найти температурный опттум активности, равный 35 °С. При этой температуре активность фермента повышается по сравнению с активностью при 20 °С в 2,6 раза. Это свойство было использовано для оптимизации условий спектрофотометрического определения альдегидцегидрогеназной активности во всех проводимых экспериментах. 3) Кинетика инактивации альдегиддегидрогеназы гид-роксимеркурибензоатом (НМБ). Фермент стабилизируется дитиотре-.итолом и ингибируется НЫВ. В отсутствие дитиотреитола он очень чувствителен к действию ингибитора. На рис.6 представлена ки-

4.0

2.0

V, ималь мин~' мг~1

50

150 [НМбЬмкМ

Рис.6. Кривая зависимости скорости инактивации альдегидцегидрогеназы от концентрации ингибитора

нетика инактивации фермента при действии ингибитора в присутствии в реакционной среде дитиотреитола (40 мкМ). 4) Электро-форетический анализ очищенного препарата АльДГ. Анализ очищенного препарата АльДГ проведен с помощью электрофореза в полиакрил ауидном геле (4-1556) в системе Дэвиса (Рис.7).

Видно, что препарат в этой системе представлен одним основным компонентом, который проявляет альдегиддегидрогеназную активность. Содержание АльДГ в препарате после аффинной хроматографии составляет 70-8Ь%. В дальнейшем для получения гомогенного препарата фермента использовали экстракцию белка из геля. Таким образом, разработанная методика очистки АльДГ позволяет получить злектрофоретически гомогенный белок. 5) Молекулярная масса нативного фермента АльДГ и его субъединицы. На рис.8 представлены кривые седиментации при зональном центрифугировании в градиенте сахарозы (5-20%) АльДГ корней маш и маркерного белка алкогольдегдегидрогеназы (АДГ) печени крысы.

Оценку молекулярной массы АльДГ проводили с использованием следующей формулы:

Д/Д = оум)0»36, где Д^ - расстояние пиков активности от мениска, — моле-

Рис.7. Электрофоретические спектры препарата альдегид-

дегидрогеназы после двух стадий очистки: I - первое направление: электрофорез в градиентном полиакриламидноа геле в системе Дэвпса (гель окразэн кумасси (а), тетразолиевыи методой (б), П - денскто-грамла геля, Ш - второе направление: электрофорез в полиакрилааядноы геле (10?) в присутствит Дв-//а (стрелкой отвлечено пологегае АльДГ).

~5М : ' 75М

Ы'<рралции

Рнс.8. Ультрацентрифугирование АльДГ в градиенте плотности сахарозы (5-20%): I - удельная активность АльДГ (ордината слева), 2 - удельная активность АДГ (ордината справа).

кулярная масса исследуемого белка, Н - молекулярная масса АДГ, равная 80 кДа. Молекулярная масса АльДГ оказалась равной 204,2 гсДа. У высших растений молекулярная масса фермента бнла оценена лишь для цятоплазыатической формы; она составила согласно данным гель-фильтрации 150 кДа {ТакоисЬи Лу 1981).

Анализ субъединичного состава фермента проводили электро-форэтичесшш методом в денатурирующих-условиях. Для этого трек градиентного электрофореза в системе Дэвиса вклпчаля а процессе полимеризации в систему полиакриламидного геля, содерпаче-го/?5 -л'а. Электрофореграма второго направления предстатзгепа на рис.7. Полоса АльДГ, сформировавшаяся в первом направления электрофореза, движется кагс один компонент во втором направлении. Аналогичный электрофорез с маркерными белками позволил оценить молекулярную массу субъединицы, которая оказалась разной 58 кДа.

Значения молекулярных масс нативного белка и его полипептида позволили сделать предположение, что альдегидцегидрогена-за является олигомернш белком, составлен!пи из 3-4 одинаковых

субъединиц с молекулярной массой 58 кДа.

В дальнейшем при получении препаративных количеств исследуемого белка, на каждом этапе очистки препарат подвергался анализу методом аналитического электрофореза в денатурирующих условиях. Исходный аффинноочищенный препарат содержал несколько полипептидных компонентов. Основным являлся полипептид с молекулярной массой 54 кДа - субъединица нативного фермента АльДГ с молекулярной массой 204,2 кДа, а в качестве дополнительных обнаруживались полипептиды с молекулярными массами 41 и 39 кДа. Полипептиды не были связаны друг с другом дисульфид-иыми мостиками, поскольку картина электрофоретического разделения восстановленных и невосстановленных образцов не менялась. 6) Способы разделения белков аффинноочищенного препарата АльДГ.

Первоначально было предпринято несколько попыток разделения белков аффинноочищенного препарата с помощью ряда вариантов высокоэффективной хроматографии в неденатурирусщих условиях: ионообменная хроматография на катионнообменнике и гель-фильтрация. Наиболее эффектиным способом разделения белков препарата АльДГ оказалась гель-фильтрация в денатурирующих условиях. Отказ от сохранения белка в неденатурированном состоянии и подавление сопутствующих адсорбционных взаимодействий с матрицей благодаря использованию иона додецилсульфата, позволили в значительной мере разделить полипептиды с молекулярными массами 54 и 41 кДа. Для увеличения эффективности хроматографиче-ского процесса использовались две последовательно соединенные колонки Т5К-3000£й£ Следует отметить, что и в этом случае не удалось достичь полного разделения полипептидов с молекулярными массами 54 и 41 кДа в виде отдельных пиков. Однако, объемы выхода полипептидов на колонке различаются таким образом, что левая часть пика на профиле элюции (Рис.9,10) представлена полипептидом с молекулярной массой 54 кДа в достаточно чистом виде. Поэтому для препаративного выделения субъединицы АльДГ с молекулярной массой 54 кДа был выбран именно данный вид хроматографии. О достаточной чистоте препарата свидетельствует также его злектрофоретический анализ в градиентном полиакрила-мидном геле (Рис.11). Интересно, что при электрофоретическом анализе АльДГ, выделенной из Л5рег$Шиз П.1Ыи(ап$ были также обнаружены два полипептида с молекулярными массами 54 и 41 кДа. Возможно, полипептид с молекулярной массой 41 кДаяв-

V!

Рис.9. Высокоэффективная гель-фильтрация препарата альдегивдегидрогеназы в денатурирующих условиях. Стрелкой показан момент нанесения образца на колонку.

ляется продуктом протеолитической деградации полипептида с молекулярной массой 54 кДа, протекающей в ходе очистки белка. Возможно также, что молекула АльДГ обладает гетероолигомернойорганизацией, хотя известно, что фермент дрожжевого и животного происхождения имеет олигомерную структуру, состоящую из идентичных субъединиц.

Препарат 54 кДа субъединицы, полученной с помощью высокоэффективной гель-фильтрации в денатурирующих условиях, был использован для определения ^-конца и ее аминокислотного состава.

Аминокислотный анализ выполнен на трех образцах, средние значения которых представлены в таблице 4. Рассчитанное значение индекса полярности равно 38$. По сравнению с таковыми из других источников митохоадриальный фермент корней мал более гидрофобен. Сведения по аминокислотному составу других альде-гидцегидрогеназ высших растений в литературе отсутствует. На гидрофобный характер фермента указывает и его экстрагнруемость из митохондрий I,5-процентным раствором тритона Х-100 и его способность сорбироваться на колонке с обращеннофазовкм сорбентом. М- конец оказался блокированным, что свидетельствует о достаточной степени чистоты полученного препарата.

Таким образом, наа впервые удалось получить в препаративных количествах субъединицу 54 кДа изучаемого фермента, а также выяснить его субъединичный и аминокислотный состав, что в

Ч'ГГУПЧ'Г

г л

л >

— 94

— £7

— 45

— $0

— ЮЛ

—т.

Рис.10. Электрофореграммы фракций препарата альдегиддегидрогеназы после высокоэффективной гель--фильтрацкн в денатурируюарпс условиях. Линии I и 2 - аликвоты фракций 5 и 6 соответственно.

Рис.11. Электрофореграмма высокого разрешения фракций альдегивдегицро-геназы после высокоэффективной гель-фильтрации в денатурирующих условиях. Указано положение маркерных белков.

Таблица 4

Сравнение аминокислотного состава митохондриальных альдегиддегидрогеназ корней маш {Рка$ео(и5 аспеиз) и животных объектов

Мг субъединицы 54 кДа 60 кДа 62 кДа

Аминокислоты корни маш печень крысы, (Л>/?/огД9&8) печень человека, ISeacoz , 1988)

Jsp 29 62 49

G?x 34 63 54

Sen 18 59 32

G-'y 69 97 44

His 7 9 7

J*9 15 18 20

Thr 23 32 27

Jia 68 62 48

Pro 27 10 24

V'QI 7 II 17

36 23 45

met 5 13 8

Cys 4 16 8

Us 23 15 25

и и 38 42 35

Phe ■ 17 17 24

Tcp 34 31 4 27 4

■У -конец блокирован -

С -конец - блокирован -

Сумма аминоки- 454_ слотных остатков 604 490

Индекс полярности, 1а 38,2 46,3 43

совокупности с изученными свойствами является основой для последующего детального познания структуры и функции этого фермента.

3. Биологическая функция растительной альдегиддегидрогеназы

Нами было показано, что удельная активность АльДГ в значительной степени варьирует в зависимости от вида растения. Наилучшей активностью обладает фермент, выделенный из тканей маш, что было продемонстрировано нами на хлоропластном (табл.1) и митохондриальном ферменте (Таблица 5).

Таблица 5

Сравнительная характеристика основных кинетических параметров миэдуонцриальной АльДГ, полученной из корней пшеницу и маш (препарат получен экстракцией митохондрий 5,5% раствором тритона Х-100)

Удельная Объект активность, исследования нмоль/мин-мг Км(каж) для аце-тальде-гида.мкМ Км(каж) Для НАД, мМ рН-оп-тимум Температурный оптимум

Корни пшеницы 0,460+0,15 Корни маш 2,55+0,31 10,0 10,0 0,4 0,27 8,5 8,5 32 °С 35 °С

С целью получения информации о характере метаболических процессов, в которые может быть вовлечен фермент, мы проследили динамику изменения его удельной активности в процессе развития растения. При этом фермент, выделенный из водорастворимой фракции семян, проявлял чрезвычайно низкую активность

АльДГ (Табл.б), а соотношение акт М^-- равнялось 16.000.

акт АльДГ

При прорастании семян активность АльДГ заметно возрастает и при последующем развитии растения практически не меняется. Изменение активности, так называемых "катаболических"ферментов носит противоположный характер, что было продемонстрировано нами на примере "анаэробного" фермента метаболизма ата-нола-алкогольгидрогеназы. Приведенные в табл.6 данные по характеру изменения алкогольгидрогеназной активности следует, что

18

Таблица б

Динамика изменения альдегиддегидрогеназной активности митохондрий в зависимости от возраста растений

Объект исследования

Удельная активность, нмоль/мин-мг

АДГ

АльДГ

Семена пшеницы Эпикотели:

а) 3-дневные этиолированные растения

б) 5-дневные этиолированные растения

в) ^-дневные этиолированные растения

1200?0,35 150+0,39

80+0,41

35*0,18

0,076^0,015 0,400^0,03

0,460^0,65

0,500*0,064

с усилением окислительных процессов в клетке уровень активности АДГ снижается. Таким образом, АльДГ, по-видимому, участвует в основных процессах роста и развития растения, а не в катаболизме запас??ых веществ растительной клетки. Асинхронный характер изменения ферментативной активности этих двух ферментов ставит под сомнение возможность участия растительной АльДГ в процессе метаболизма этанола, как это имеет место в клетках .дрожжей и животных, где АльДГ и АДГ совместно выполняют соответственно энергетическую и детоксикационную функции. На осно-' вании полученной информации о степени компартменталияации известных форм АльДГ, их физико-химических свойств, а также анализа литературы, мы предложили метаболическую модель, объясняющую биологическую роль АльДГ в соответствующих органеллах (Рис.12).

■Рис.12. Пути биосинтеза ацетил-КоА в растительной клетке

Из работ японских исследователей известно, что цитоплазма-тическая АльДГ может выполнять функцию поставки ацетил-КоА для биосинтеза соединений терпеноидного класса по следующей схеме:

Пируват|-

Пируватдекар-

боксилаза

■^цетальдедиг)-

АльДГ

Уксусная •кислота Г

ацетил-КоА-синтетаза

^цетил^йА]

|Мевалоновая кислота_

¡Терпе~ны]

Факт обнаружения хлоропластной АльДГ интересен в связи с существующей проблемой автономного биосинтеза ацетил-КоА внутри хлоропластов. Согласно концепции экстрапластидного происхождения ацетил-КоА, ацетат, образовавшийся в митохондриях при ферментативном распаде ацетил-КоА (рис.12), мигрирует в хлоро-пласты, где при участии фермента ацетил-КоА-синтетазы образуются ацетил-КоА, необходимый, прежде всего, для биосинтеза жирных кислот и, фениллипидов. Трудности обнаружения пируватдеги-дрогеназной активности в хлоропластах поставили по1$ сомнение возможность автономного биосинтеза ацетил-КоА в этих органел-

20

лах. Однако, обнаружение в хлоропластах фермента АльДГ говорит в пользу возможности функционирования альтернативного пути биосинтеза ацетил-КоА, который продемонстрировали Такеучи и Уритани на примере цитоплазматичвской формы АльДГ (см.схему на с.20). Мы не располагаем сведениями относительно локализации в митохондриях ферментов пируватдекарбоксилазы и ацетил-КоА-син-тетазы. К сожалению, неизвестно также субмитохондриальное распределение растительной альдегиддегидрогенаэы. Однако, на основе полученных нами некоторых экспериментальных данных, главным образом по свойствам митохондриального фермента, у нас сложилось определенное представление о возможной функции данного фермента в митохондриях. Альдегиддегидрогеназа митохондрий имеет ряд особенностей. Из приведенных в табл.? значений кинетических параметров фермента следует, что митохондрии гораздо эффективнее окисляют эндогенный ацетальдегид, чем цитоплазмати-ческая форма (даже при условии ее активации) и хлоропластная.

Находясь в достаточно компартментализованкых условиях в клетке, а также обладая способностью эффективно обеспечить процесс окисления ацетальдегида, митохондриальная АльДГ может участвовать в тонкой регуляции эндогенных концентраций ацетальдегида в митохондриях. Различия в свойствах между цитоплазматичвской, митохондриальнсй и хлоропластной формами фермента представляют собой, по-видимому, адаптированность организма к различным функциональным нуждам определенных субклеточных ор-ганелл.

Таблица 7

Свойства растительной альдегиддегидрогенаэы

Форш ал ь дети дде~ гидро-геназы

Удельная актив-

ность , нмоль/мич«мг таль-дегид

Км(каж),мкМ рН-оп' аце- гши

Темпе-

М, кДа

н~А~ч Ра£УР~ Фёр^суоъе-

(К-фос- ный оп- мент диница фатный тимум, буфер) град

Цитоплазматическая (литературные данные)

Митохондриальная

Хлоропла^-стная

135

350

10,4

7,0

- 8,0

0,2 348 8,0 35 11,5 1390 8,8 35

150

204 54 50-100 -

основные вывода

1. Показано, что в клетках высших растений (маш, пшеница, арктофила рыжеватая) наряду с цитоплазматической и митохондриальной имеется хлоропластная форма альдегиддегидрогеназы . (АльДГ), локализованная в стромальной фракции. Впервые разработан метод ее выделения, изучены основные кинетические параметры (Ку для субстратов, температурный и рН-оптимумы активности, влияние на активность фермента ингибитора ХМБ), приблизительно оценена молекулярная масса"белка - 50-100 кДа.

2. Установлено, что АльДГ, выделенная из ткачей маш, обладает наибольшей удельной активностью по сравнению с ферментом из других растительных источников.

Изучены эчзимологические параметры (Кщ для субстратов, температурный и рН-оптимумы активности) двух форм растительной АльДГ: митохондриальной и хлоропластной. Митохондриальчый фермент имеет большую удельную активность и более высокое сродство к ацетальдегиду. Получение электрофоретически гомогенного препарата этого фермента с удельной активностью 350 нмоль/мин-мг позволило впервые оценить его молекулярную массу (204,0 кДа) и провести анализ субъедичичного состава митохондриальной АльДГ. Показано, что фермент состоит из двух типов субъединиц с молекулярной массой 54 и 41 кДа. Сделано предположение о еубъединичной структуре фермента. • ,

3. Разработан метод препаративного получения субъединицы 54 кДа митохондриального фермента, определены ее аминокислотный состав и .V -концевая аминокислота. Впервые проведен сравнительный анализ субъединицы 54 кДа с соответствующими субъединицами фермента, выделенного из других организмов. Растительный фермент имеет более гидрофобную природу по сравнению с белком животного происхождения (индекс полярности растительного полипептида 54 кДа равен 38%). Условия экстракции АльДГ из, митохондрий, поведение фермента в ходе очистки, а также степень его полярности указывают на мембранную природу данного белка.

4. Предложена метаболическая модель функционирования АльДГ в основных компартаментах растительной клетки. Сделано предположение о том, что метаболический путь с участием АльДГ

в цитоплазме и хлоропластах клеток растений является альтерна-

22

тивным путем поставки ацетил-КоА. Митохондриальный фермент, находясь в довольно компартыентализованных условиях в клетке, а также обладая способностью эффективно обеспечивать процесс окисления ацетальдедига, может участвовать в тонкой регуляции эндогенных концентраций ацетальдегида в митохондриях.

По теме диссертации автором опубликованы следующие статьи:

1. Ли Н.Г., ОсаковскиЙ B.JI. Альдегидцегидрогеназа хлоро-пластов листьев высших растений // Сибирский биологический журнал. - 1991. - Вып. 2. - С.20-25.

2. Ли Н.Г., Пономарев А.Г., Бубякина В.В. и др. Альдегид-дегидрогеназа митохондрий корней маш Pha^eotte uaieuf // Биохимия. - 1990. - Т. 55, вып. 9. - C.I590-I597.

3. Осадковский В.Л., Пономарев А.Г., Бубякина В.В., Тата-ринова Т.Д., Кононова С.К., Ли Н.Г. и др. Аминокислотный состав и антигенная активность субъединицы 54 кДа альдегиддегидро-геназы из митохондрий корней маш // Биохимия. - 1992. - Т. 57, вып. 3. - С.418-428.

4. Ли Н.Г. Альдегиддегидрогеназа митохондрий корней маш // Биохимия метаболизма этанола высших организмов. - Якутск, 1991. - С.16-217

Альдегиддегидрогенеза высших растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ли Наталья Геннадьевна

Подписано в печать 17.03.94. Формат 64x80/16. Бумага тип. №2 Печать офсетная. Печ. л. 1,75. Уч.-изд. л. 2,18. Тираж 80 экз.

_Заказ ррр_

Издательство ЯГУ- 677891, г. Якутск, ул. Белинского, 58