Активные формы кислорода в гибели клеток растений

Несов, Артем Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Активные формы кислорода в гибели клеток растений
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Активные формы кислорода в гибели клеток растений"

московский государственный университет

имени М.В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

005048385

НЕСОВ Артем Владимирович

АКТИВНЫЕ ФОРМЫ КИСЛОРОДА В ГИБЕЛИ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ: РОЛЬ МИТОХОНДРИЙ, ^БРН-ОКСИДАЗЫ ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ И АПОПЛАСТНОЙ ПЕРОКСИДАЗЫ

03.01.05 - физиология и биохимия растений

автореферат диссертации иа соискание ученой степени кандидата биологических наук

10 ЯНВ 2013

Москва-2013

005048385

Работа выполнена на кафедре иммунологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор

Самуилов Виталий Дмитриевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор

Звягильская Рената Александровна

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Егор Юрьевич Плотников

Ведущая организация: институт физиологии растений имени К.А. Тимирязева

Защита состоится 15 февраля 2013 г. в _ на заседании

диссертационного совета Д 501.001.46 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, дом 1, строение 12, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, биологический факультет, аудитория_.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан_2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета . -, ^/У ^-,

У и

к.б.н. М.А. Гусаковская J/] (

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

В отличие от животных, у растений нет специализированных клеток, поглощающих и обезвреживающих патогенов. Каждая клетка растения обладает способностью к защите от патогена. При распознавании инфекционных возбудителей или их сигнальных соединений включается гиперчувствительный ответ (ГО), сопровождающийся продукцией активных форм кислорода (АФК), гибелью клеток растения и гибелью патогенного микроорганизма, вторгшегося в ткани растения. Это препятствует распространению инфекции на другие клетки. Программируемая клеточная смерть (ПКС) играет важную роль в онтогенезе и поддержании тканевого гомеостаза организма. Являясь составляющей иммунитета, ПКС вовлечена в защиту от инфекционных возбудителей как у животных, так и у растений. Важную роль в ПКС играют биоэнергетические структуры клетки. Для реализации ПКС необходимы АФК: анаэробиоз или антиоксиданты предотвращают ПКС (Самуилов и др., 2002; Васильев и др., 2009). Митохондрии - поставщики ряда белков, участвующих в ПКС. Дыхательная цепь митохондрий животных является одним из источников АФК, вызывающих клеточную гибель. АФК у растений образуются в электронтранспортных цепях хлоропластов и митохондрий, ЫАБРН-оксидазой плазматической мембраны клеток и апопластной пероксидазой.

Принятые сокращения: АФК - активные формы кислорода; ГО - гиперчувствительный ответ; ДНФ - 2,4-динитрофенол; ДХФ - 2,4-дихлорфенол; ПК - пальмитиновая кислота; ПКС -программируемая клеточная смерть; ПХФ - пентахлорфенол; CK - салициловая кислота; УК -устьичные клетки; ХКФ - л-хлоркарбонилцианидфенилгидразон; ЭК - эпидермальные клетки; Ci2TPP+ - додецилтрифенилфосфоний; DCF - 2',7-дихлорфлуоресцеин; DCFH - 2',7-дихлорфлуоресцин; DPI - дифенилениодоний; PCB" - фенилдикарбаундекаборан; SkQl - 10-(6'-пластохинонил) децилтрифенилфосфоний; SkQRl - 10-(пластохинонил)децилродамин 19; ТВ" - тетрафенилбор; TMRE+ - этиловый эфир тетраметилродамина; ТРР* -тетрафенилфосфоний; Ду - трансмембранная разность электрических потенциалов.

Перспективно исследование влияния митохондриально-направленных антиоксидантов-катионов, способных накапливаться в клетках и митохондриях в соответствии с мембранным потенциалом, который генерируется на цитоплазматической и митохондриальной мембранах (знак «минус» - на внутренней стороне). Их концентрация в митохондриях может увеличиваться на несколько порядков. Это позволяет их использовать в низких концентрациях, которые не являются токсичными. Первый антиоксидант такого типа - MitoQ (Murphy et al., 2007). Это убихинон, связанный с катионом децилтрифенилфосфония. Он может восстанавливаться компонетами дыхательной цепи и проявлять таким образом многократное действие. В.П.Скулачев предложил заменить убихинон в составе липофильного антиоксиданта на пластохинон, более сильный антиоксидант. Полученные производные пластохинона получили название SkQ, где Sk -проникающий катион, связанный через декановый или пентановый линкер с Q -пластохиноном (Скулачев, 2007). Митохондриально-направленные липофильные антиоксиданты позволяют исследовать образование АФК в митохондриях и их участие в гибели клеток. Цель и задачи исследования

Цель работы - исследовать роль дыхательной цепи митохондрий, NADPH-оксидазы плазматической мембраны и апопластной пероксидазы в образовании АФК в ПКС у растений. Были поставлены и решены следующие задачи:

1. Исследовать защитное действие хинона, ковалентно связанного с проникающими через мембраны митохондриально-направленными катионами (SkQ), на ПКС у растений, вызванную хитозаном и цианидом.

2. Выяснить действие катионов тетрафенилфосфония (ТРР+), додецилтрифенилфосфония (Ci2TPP+) и этилового эфира тетраметилродамина (TMRE+), входящих в состав синтетических хинонов SkQ, на ПКС у растений. Сравнить действие катионов с действием проникающих анионов тетрафенилбора (ТВ") и фенилдикарбаундекаборана (PCB").

3. Используя ингибиторы флавиновых ферментов (хинакрин и дифенилениодоний), исследовать роль NADPH-оксидазы в ПКС.

4. Исследовать действие фенольных соединений, субстратов апопластной пероксидазы, на ИКС у растений. Сопоставить действие фенольных соединений и протонофорных разобщителей окислительного фосфорилирования. Научная новизна

Митохондриально направленный синтетический проникающий хинон SkQl предотвращает программируемую гибель клеток растений индуцированную CN" или хитозаном. Проникающие катионы ТРР+, Ci2TPP+ и TMRE+, входящие в состав митохондриально-направленных липофильных антиоксидантов SkQ, в фемто- и пикомолярных концентрациях предотвращали хитозан-индуцированное разрушение ядер в эпидермальных клетках эпидермиса из листьев гороха. Выявлено защитное действие проникающих анионов ТВ" и PCB", предотвращающих хитозан-индуцированное разрушение ядер клеток. Их эфективность ниже, чем у проникающих катионов. Установлено, что ингибиторы флавиновых ферментов хинакрин и дифенилениодоний (DPI) предотвращают хитозан- и С>Г-индуцированное разрушение ядер клеток растений. В тех же концентрациях они не оказывали влияние на дыхание и фотосинтетическое выделение Ог нарезками листьев. Эти данные свидетельствовуют о NADPH-оксидазе плазматической мембраны в качестве источника АФК для ПКС у растений. Фенольные соединения, которые являются регенерируемыми субстратами пероксидазы, оказывают защитный эффект при хитозан-индуцированной клеточной гибели. Сходным действием обладают фенольные разобщители окислительного фосфорилирования. Практическое значение работы

Полученные данные расширяют представления об участии митохондрий, NADPH-оксидазы плазматической мембраны, апопластной пероксидазы и АФК в программируемой гибели клеток растений, действии митохондриально-направленных антиоксидантов. Результаты могут быть использованы в курсах лекций и практикумах по клеточной биологии, цитологии, биоэнергетике, физиологии растений и биохимии. Поскольку ПКС играет важную роль в фитоиммунитете, полученные данные могут в перспективе использоваться для создания новых сортов

сельскохозяйственных растений, обладающих повышенной устойчивостью к патогенам.

Апробация работы и публикации

Диссертация апробирована и рекомендована к защите на заседании кафедр иммунологии и физиологии растений биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова в 2012 г. Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), международной конференции «Российская биоэнергетика: от молекул к клетке» (Москва, 2005), международной конференции «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2005), международной конференции молодых ботаников (Санкт-Петербург, 2006), международной 14-ой Европейской биоэнергетической конференции (Москва, 2006), международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007» (Москва, 2007), IV съезде российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008). По материалам диссертации опубликованы б работ в журналах, входящих в список ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Работа изложена на 126 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц и 36 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов, их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 259 отечественных и зарубежных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследования

Объектом исследования был горох посевной Pisum sativum L. сорта Альфа. В экспериментах использовали пленки эпидермиса листьев 8-17-суточных проростков гороха. Пленки эпидермиса листьев - монослои из клеток двух типов: фототрофных устьичных (замыкающих клеток устьиц) и хемотрофных эпидермальных (покровных). Этот выбор обусловлен удобством исследований клеток посредством

световой микроскопии. Эпидермальные клетки (ЭК) разнообразны по форме. Их основная функция - покровная и защитная.

Пленки эпидермиса отделяли от нижней поверхности листа пинцетом и помещали в полистирольные культуральные планшеты со средой инкубации таким образом, чтобы поверхность пленки, покрытая кутикулой, была обращена вверх. В опытах с оксиметрией 40 мг листьев нарезали квадратами 2-3 мм бритвенным лезвием.

Каждый опыт проводили в двух-трех повторностях. В каждой из повторностей обследовали не менее 300-500 клеток, определяли долю клеток с разрушенными ядрами и клеток, лишенных ядер (Samuilov et al., 2003). На рисунках представлены среднеарифметические данные, полученные на 300-500 клетках с указанием доверительного интервала. Математическая обработка проводилась в программе Microsoft Excel, для оформления и представления данных использовали CorelDraw. Оксиметрия

Фотосинтез и дыхание нарезок листьев гороха регистрировали полярографически по изменению парциального давления Ог в закрытой ячейке. Изменение содержания кислорода измеряли в ячейке объемом 1,5 мл Pt-электродом Кларка закрытого типа при непрерывном перемешивании на магнитной мешалке. Электрический сигнал от электрода Кларка регистрировали на компьютере через аналого-цифровой преобразователь с помощью программы Record 4. В стандартных условиях при температуре 25° С концентрация 02 в дистиллированной воде -220 мкМ. Концентрацию кислорода в полярографической ячейке, содержащей среду инкубации, определяли добавлением дитионита, приводящим к полному исчезновению 02 в растворе. Скорость выделения/поглощения 02 выражали в нмолях 02, выделенного/поглощенного в расчете на 1 мг хлорофилла за 1 ч. Инфильтрация и инкубация с реагентами

Плешей эпидермиса помещали в полистирольные 6- или 12-луночные культуральные планшеты и инкубировали в 2 мл бидистиллированной воды (контроль). Для обеспечения быстрого проникновения реагентов в клетки использовали метод их инфильтрации под вакуумом. Эпидермальные пленки

инкубировали в растворах в условиях вакуума (5-8 мм рт. ст.) в течение 1 мин. Время «вакуумирования» подбирали с таким расчетом, чтобы инфильтрация не вызывала повреждений клеток в образце. Дальнейшую инкубацию клеток проводили в стандартных условиях в темноте или на свету в зависимости от задач эксперимента. Инкубация с KCN составляла 22-23 ч.

Поскольку хитозан (Fluka, Швейцария) малорастворим в воде, пленки эпидермиса предварительно обрабатывали взвесью хитозана (100 мкг/мл) в бидистиллированной воде при постоянном перемешивании на магнитной мешалке в полипропиленовых сосудах в течение 30 мин. Пленки помещали на поверхность взвеси так, чтобы поврежденная сторона контактировала с хитозаном. Инкубация с хитозаном составляла 3-6 ч. Световая микроскопия

После инкубации образцы обрабатывали в течение 5 мин фиксатором Батталья (хлороформ, 96% этанол, ледяная уксусная кислота, 40%-ный формалин в соотношении 5:5:1:1). Затем образцы отмывали этанолом в течение 10 мин. После инкубации в воде в течение 5 мин, образцы окрашивали ядерным красителем гематоксилином Карацци в течение 40 мин.

Для приготовления красителя Карацци последовательно смешивали 0,5 г гематоксилина, 25 г KA1(S04)2' 12Н20, 100 мл глицерина, 400 мл Н20, 0,1 г KJ и инкубировали при дневном освещении в открытой колбе в течение 2 недель. Гематоксилин относится к основным красителям, он окрашивает клеточное ядро. Окрашенные эпидермальные пленки отмывали водопроводной водой и затем исследовали на световых микроскопах Carl Zeiss Primo Star и Carl Zeiss Laboval 4 (Германия).

Конфокальная микроскопия

Конфокальную микроскопию проводили на микроскопе Carl Zeiss Axiovert 200М (Германия), оборудованном конфокальной сканирующей приставкой Zeiss LSM510Meta. Для регистрации образования АФК пленки эпидермиса обрабатывали 20 мкМ диацетатом 2',7-дихлорфлуоресцина в течение 10 мин в темноте. Флуоресценцию образовавшегося 2',7-дихлорфлуоресцеина возбуждали при 488 нм (аргоновый лазер) и регистрировали при 500-530 нм.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Дыхательная цепь митохондрий как источник АФК для ПКС

Митохондрии играют важную роль в ПКС. Их дыхательная цепь является одним из основых источников АФК, принимающих участие в клеточной гибели (Ravagnan et al., 2002; van Gurp et al., 2003; Saelens et al., 2004).

Действие SkQ

Исследованы хиноны, ковалентно связанные с синтетическими проникающими катионами (Скулачев, 2007). Одно из таких соединений -10-(6'-пластохинонил)децилтрифенилфосфоний (SkQ I), состоящий из пластохинона и

lOOi

Эпидермальные клетки О Хитозан • Безхитозана

Устьичные клетки О KCN о Без KCN

9 8 7 - lg[SkQ1, М]

10 9

- lg[SkQ1, М]

Рис. 1. Действие Бк01 на хитозан-индуцированное разрушение ядер эпидермальных клеток (ЭК)

(а) и КСК1-индуцированное разрушение ядер устьичных клеток (УК) (б) в эпидермисе из листьев гороха в темноте. В опыте (а) пленки эпидермиса в 2 мл дистиллированной воды дополняли БкСИ, инкубировали 2 ч в темноте, добавляли хитозан (100 мкг/мл), где отмечено, и инкубировали на магнитной мешалке 30 мин и затем 5 ч без перемешивания в темноте. В опыте

(б) пленки эпидермиса в 2 мл дистиллированной воды дополняли Бк01, проводили вакуум-инфильтрациго в течение 1 мин, инкубировали 2 ч в темноте, добавляли 2,5 мМ КСЧ вновь проводили вакуум-инфильтрацию в течение 1 мин, инкубировали 22 ч в темноте. Разрушение ядер в контроле (без добавок) в опыте (а) составляло 7,8 ± 1,4%, а в опыте (б) отсутствовало. Прерывистой линией обозначены концентрации ЭкСИ, вызывающие полумаксимальный защитный эффект.

проникающего катиона С)0ТРР+. Хиноны SkQ накапливаются в митохондриях по градиенту мембранного потенциала (Ду), генерируемому при дыхании или гидролизе ATP. SkQ являются регенерируемыми антиоксидантами многократного действия. На клетках HeLa и фибробластов человека установлено, что они в чрезвычайно низких концентрациях блокируют апоптоз, вызванный Н202 (Скулачев, 2007). Хиноны MitoQ и SkQ предотвращают ПКС у растений (Васильев и др., 2011).

Рис. 1 показывает, что SkQl в значительной мере предотвращает разрушительное действие хитозана и CN" на ядра эпидермальных и устьичных клеток (ЭК и УК). Аналогично действует 10-(пластохинонил)децилродамин 19 (SkQRl) (Васильев и др., 2011). Какое действие окажут катионные компоненты, входящие в состав синтетических производных хинонов, на ПКС?

Действие проникающих ионов на ПКС

Образование АФК в митохондриях зависит от мембранного потенциала, его уменьшение на 10-15% снижает скорость образования АФК в 10 раз (Korshunov et al., 1997). На рис. 2, а, б додецилтрифенилфосфоний (С12ТРР+) в низких концентрациях подавляет образование АФК, регистрируемое по флуоресценции дихлорфлуоресцеина (DCF). Ci2TPP+ предотвращает хитозан-индуцированное разрушение ядер ЭК (рис. 2, в). Его защитное действие максимально при 10'1О-Ю"9 М и снижается при дальнейшем увеличении концентрации. Разрушение ядер ЭК предотвращалось также катионами тетрафенилфосфония (ТРР+) и этилового эфира тетраметилродамина (TMRE+), защита была максимальна соответственно при 10"|г-10'п и Ю'"-10"8 М и снималась при 10"6 М (данные не представлены).

Защитное действие проникающих катионов снималось при увеличении их концентрации. Эти соединения, во-первых, могут оказывать детергентное действие в повышенных концентрациях, которое приводит к нарушению липидного бислоя мембран. Во-вторых, может происходить подавление окислительного фосфорилирования в митохондриях, которое приводит к включению программы гибели клеток по пути некроза.

S 250

s 200

150

■e Ю0

о хитозан, • без хитозана

11 10 9 - lg[C,JPP\ М]

# #

Рис. 2. Действие С12ТРР+ на выход флуоресценции DCF и хитозан-индуцированное разрушение ядер ЭК в эпидермисе из листьев гороха. В вариантах а, б к кусочкам листовой пластинки добавляли С12ТРР\ инкубировали 30 мин, добавляли 10 мкМ диацетата дихлорфлуоресцина и инкубировали 10 мин. Флуоресценцию DCF регистрировали у края кусочков листовой пластинки, (а) - суммарная картина (максимальная проекция) флуоресценции DCF с 20-30 оптических срезов; (б) - флуоресценция DCF в митохондриях. В варианте (в) пленки эпидермиса в 2 мл дистиллированной воды обрабатывали хитозаном (100 мкг/мл) на магнитной мешалке 30 мин, дополняли С12ТРР+ в виде солей с В Г и инкубировали 3 ч без перемешивания в темноте. Состояние клеточных ядер регистрировали в 300-500 клетках в каждом из вариантов опыта. Молярная концентрация катионов, при которой наблюдается полумаксимальный защитный эффект, отмечена прерывистым перпендикуляром к абсциссе.

Испытаны также проникающие синтетические анионы тетрафенилбора (ТЕГ) и фенилдикарбаундекаборана (PCB"). Эти соединения, не способные к электрофоретическому перемещению в митохондриальный матрикс и, напротив, отторгаемые им, также предотвращали хитозан-индуцированное разрушение ядер ЭК (Васильев и др., 2012). Максимальное действие ТВ" и PCB" регистрировалось при 10"7—10"6 М и выше, то есть в концентрациях, на несколько порядков превышающих концентрации проникающих катионов (рис. 3).

Рис. 3. Действие анионов ТВ" и PCB" на хитозан-индуцированное разрушение ядер ЭК в эпидермисе из листьев гороха. ТВ" и PCB" использовали в виде солей с Na+. Условия опыта, как на рис. 2 в.

Проникающие катионы С|2ТРР+ или SkQl в комбинации с анионами жирных кислот являются митохондриально-направленными протонофорами (Severin et al.. 2010). Протонированная жирная кислота пересекает мембрану, перенося Н+ в митохондриальный матрикс (рис. 4, а). Затем жирная кислота диссоциирует на внутренней поверхности внутренней мембраны митохондрий и возникший анион связывается с катионом Ci2TPP+. Образованная катион-анионная пара диффундирует через мембрану наружу, где ионная пара распадается, катион С,2ТРР+ возвращается назад по градиенту Дх|/, генерируемому дыхательной цепью

или АТРазой. Пальмитат (2 мкМ) в комбинации с С12ТРР предотвращает хитозан-индуцированное разрушение ядер ЭК (рис. 5, а).

Проникающие анионы могут снизить Д\|/ и АрН, транспортируясь через мембраны совместно с ИН/ (рис. 4, б). Защитное действие ТВ" на хитозан-индуцированное разрушение ядер ЭК усиливается >Ш4С1 (рис. 5, б). В клетках эпидермиса, изолированного из листьев, содержатся эндогенные жирные кислоты и МН4+, вследствие чего защитное действие проникающих катионов и анионов может проявляться и без их добавления.

а н+

СН3(СН2)14СООН«-*-[СН3(СН2)14СООГ [С12ТРР]+-► С12ТРР+

±_|_| Межмембранный объем I_

I Внутренная мембрана | ; митохондрии !

\ \ Матрикс митохондрии \ У Т СН3(СН2)14СООН —т-*- [СН3(СН2),4СОО]-[С12ТРР]+<-С12ТРР

й+

NH,

[NH4]+[TB]"4-

-ТВ"

Межмембранный объем

Внутренная мембрана митохондрии

Матрикс митохондрии

NH3

Т7 н+

[NH4]+[TB]-

-»►ТВ~

Рис. 4. Схема действия комбинации пальмитиновой кислоты с Ci2TPP+ (а; по Severin et al., 2010) и комбинации NH4+ с ТВ" (б).

Концентрации С50 проникающих катионов, при которых хитозан-индуцированное разрушение ядер ЭК снижается в 2 раза, находились в фемто- и пикомолярных диапазонах (таблица). Для проникающих анионов ТВ" и PCB" величины С50 были выше. Фенол и флуоресцеин обладали защитным действием от

хитозана. Флуресцеин структурно сходен с родаминами, но в отличие от них содержит свободную гидроксильную группу, как у фенолов.

100 1 80Н

а I

5 60

3 40

£ 20

[Ь

гЬ

л<Г

г*>

А"

+41 о

¿Р ^

<Р V*

-4х

л"

гЬ

1+1

Нп

гЬ

-1*

Рис. 5. Действие комбинации пальмитиновой кислоты (ПК) с С-|гТРР+ (а) и комбинации ЫН4С1 с ТВ" (б) на хитозан-индуцированное разрушение ядер ЭК в эпидермисе из листьев гороха. Условия опыта, как на рис. 3. Добавки: 2 мкМ ПК, Ю"10 М С12ТРР+, 10"5 М ЫН4С1, 10"5 М ТВ-

Таблица. Концентрации (С50) различных агентов для 50%-ного подавления разрушения ядер ЭК в эпидермисе из листьев гороха, вызванного хитозаном.

Защитный агент с50,м

8к(31 1,2х10"9

ТРР+ 6,0х10~14

С12ТРР+ 1,4x10"11

ТМЯБ+ 1,1x10~12

Флуоресцеин 8,1x10"'°

ТВ" 6,0х10"8

РСВ" 5,1x10"'°

Фенол 3,1x10""

2. NADPH-оксидаза плазматической мембраны как источник АФК для ПКС

NADPH-Оксидаза - ферментный комплекс плазматической мембраны клеток у животных, растений и грибов, катализирующий трансмембранный перенос электронов от цитозольного NADPH на внеклеточный 02 с образованием 02' (Bedard et al., 2007). АФК, образованные NADPH-оксидазой растений, играют важную роль в фитоиммунитете (Bedard et al., 2007; Sumimoto, 2008; Marino et al, 2012). По-видимому, NADPH-оксидаза является источником АФК для реализации СМ~-индуцированной клеточной смерти у гороха (Самуилов и др., 2006; 2008). Ингибиторы NADPH-оксидазы клеток животных хинакрин и DPI также были эффективны на клетках растений (Van Gestelen et al., 1997).

100-

X ш

§ о 503 x

100 150

DPI, мкМ

100

ä 80 et

i 60 x x <D

3 40

ä CO

го ü. 20

a) m

Ei о

CD x

200

40 60 80 DPI, MKM

100

¡Темнота ЩСвет

A o\ <j\ 0\ X« 0\ <j\ л\ qf O4- <5X

Рис. 6. Действие дифенилениодония (DPI) на дыхание (а), фотосинтетическое выделение 02 (б) в нарезках листьев, на CNT-индуцированное разрушение ядер УК в темноте (в) и на свету (г) и на хитозан-индуцированное разрушение ядер ЭК в

темноте (ô) в эпидермисе из листьев гороха. Пленки эпидермиса после инфильтрации с DPI инкубировали 30 мин, затем проводили инфильтрацию с 2,5 мМ KCN и инкубировали 23, 15 и 3,5 ч в опытах (в-д) соответственно.

Действие ингибиторов флавиновых ферментов на ПКС

DPI не влиял на дыхание и фотосинтетическое выделение 02 нарезок листьев гороха в концентрации до 100-200 мкМ (рис. 6, а, б), но в концентрации 50-100 мкМ предотвращал СЫ"-индуцированное разрушение ядер УК и хитозан-индуцированное разрушение ядер ЭК в пленках эпидермиса листьев в темноте и на свету (рис. 6, е-д).

Испытано также действие хинакрина, который, как и DPI, является ингибитором флавиновых ферментов. Хинакрин не влиял на поглощение 02 и фотосинтетическое выделение 02 нарезками листьев в концентрации меньше 0,1 мМ. В концентрации 10-50 мкМ хинакрин подавлял разрушение ядер, вызванное CN" и хитозаном на свету и в темноте (данные не представлены). Ранее было показано, что хинакрин подавлял и предотвращал Н202- и менадион-индуцированное образование DCF из DCFH в пленках эпидермиса из листьев гороха (Самуилов и др., 2006).

3. Апопластная пероксидаза как источник АФК для ПКС

Апопластная пероксидаза участвует в реализации гиперчувствительного ответа у растений как поставщик АФК (Grant et al., 2000; Geiszt, Leto, 2004; Lee et al., 2006; Davies et al., 2006). Пероксидазы принимают участие в образовании лигнина и суберина, укрепляющих клеточные стенки и препятствующих продвижению патогена, синтезе фитоалексинов (Almagro et al., 2009). Пероксидаза может катализировать зависимое от Н202 окисление салициловой кислоты (СК). При этом возникают свободные радикалы СК", образующие СК+ и 02 ' (Kawano, 2003).

Действие субстратов пероксидазы и разобщителей окислительного фосфорилирования на ПКС

Мы исследовали влияние фенола и других фенольных соединений на ПКС, вызванную хитозаном. На рис. 7, а, б фенол в низких концентрациях предотвращал образование АФК, регистрируемое по флуоресценции DCF. Фенол, как субстрат пероксидазы, предотвращал действие хитозана на ЭК в концентрациях 10~'°-10~6 М. Защитное действие фенола снижалось при увеличении концентрации и снималась

при концентрации 1 мМ. Сходное защитное действие оказывают другие фенольные

соединения - дихлорфенол, катехол, салициловая кислота.

Хитозан +

12 11 10 9 8 7 6 - 1д[Фенол, М]

Рис. 7. Действие фенола на выход флуоресценции DCF в УК, обработанных хитозаном, и на хитозан-индуцированное разрушение ядер ЭК эпидермиса из листьев гороха. В вариантах (а, б) пленки эпидермиса 30 мин окрашивали 20 мкМ диацетата DCFH, отмывали от излишков красителя в дистиллированной воде, добавляли фенол и 20 мин обрабатывали 1 мг/мл хитозаном на магнитной мешалке. Флуоресценцию DCF возбуждали при 488 нм и регистрировали при 500-530 нм. Фл - флуоресценция DCF, ПС - изображение в проходящем свете. На диаграмме (б) отмечены средние значения максимального выхода флуоресценции DCF в устьичных клетках с доверительным интервалом (а=0,05) (флуоресценцию регистрировали в 45-63 клетках) по данным изображений клеток, как на рисунке (а). Масштабная линейка - 20 мкм. В варианте (в) пленки эпидермиса в 2 мл дистиллированной воды обрабатывали хитозаном (100 мкг/мл) на магнитной мешалке 30 мин, дополняли фенолом и инкубировали 3 ч без перемешивания в темноте. Состояние клеточных ядер регистрировали в 300-500 клетках в каждом из вариантов опыта. Концентрация фенола, при которой наблюдается полумаксимальный защитный эффект, отмечена прерывистым перпендикуляром к абсциссе.

Контроль

1 мкМ ХКФ

. JT"- )

200

? 150'

— 1д[ХКФ. М]

15 14 13 12 11 10 9 - 1д[ПХФ, М]

16 15 14 13 12 11 10 9 - 1д[ХКФ, М]

Рис. 8. Действие ХКФ и ПХФ на выход флуоресценции DCF, на хитозан-индуцированное разрушение ядер ЭК в эпидермисе из листьев гороха. Ломаной линией отмечены митохондрии, в который определяли выход флуоресценции DCF. Условия опыта, как на рис. 2.

Предотвращение хитозан-индуцированной ПКС проникающими катионами связано с тем, что они снижают трансмембранную разность электрохимических потенциалов (Др) в митохондриях, подавляя образование АФК. Поэтому мы исследовали действие протонофорных разобщителей окислительного

фосфорилирования, снимающих Др и подавляющих образование АФК в митохондриях (Korshunov et al., 1997).

На рис. 8, а, б .м-хлоркарбонилцианидфенилгидразон (ХКФ) предотвращает образование АФК, регистрируемое по флуоресценции DCF. Хитозан-индуцированное разрушение ядер ЭК предотвращалось протонофорными разобщителями пентахлорфенолом (ПХФ), 2,4-динитрофенолом (ДНФ) и jw-хлоркарбонилцианид-фенилгидразоном (ХКФ) (рис. 8, в, г; данные с ДНФ не представлены). Их защитное действие проявляется в концентрациях более низких, чем у фенола.

Действие доноров электронов для пероксидазы-оксидазы на ПКС Фенол - субстрат пероксидазы (Hauser, Olsen, 1998). Был испытан ряд соединений в качестве доноров электронов в реакции восстановления Н202 с участием пероксидазы хрена. Непригодность соединений

регистрировали по выделению 02 в ответ на последующее добавление каталазы. Каталаза

Фенол Hz02

Каталаза

ю о

Пероксидаза Фенол

Каталаза

3 мин

Рис. 9. Фенол как субстрат пероксидазы. В полярографическую ячейку, содержащую 50 м№ фосфатный буфер, рН 7, добавляли 20 и/мл каталазы, 0,1 мМ Н202| 10 и/мл пероксидазы хрена и 0,2 мМ фенола. Н202 регистрировали по выделению 02 после добавки каталазы.

В присутствии каталазы Н202 регистрируется по выделению 02 (рис. 9, а). С фенолом в отсутствие пероксидазы в ответ на добавку Н202 и каталазы также регистрируется выделение 02 (рис. 9, б). В присутствии 0,2 мМ фенола и пероксидазы не наблюдается выделения 02 после добавки каталазы (рис. 9, в). В пероксидазную

реакцию вступают фенол, 2,4-дихлорфенол и флуоресцеин. ДНФ, TMRE, PCB, DCFH-DA не поддерживают пероксидазную реакцию.

т 4i

1 2

ёз <

I 2Н 5

¡2 1 о о о.

о ^

100

я 80-

с;

9> 60

J2 X X

щ /in

3 40 >

О.

РЗ

(£ 20

0|П,1!,11,П,г-|,гп,М, 04-О*" <ß> j? гЧ4 <? 4®

ftl

^ А

г ^ ф

I ^ ф

О<&

хГ

„О^ X

«V

¿У ¿Р А°'

Рис. 10. (а) Действие различных соединений на окисление ЫАОН с участием пероксидазы. К раствору 0,1 мМ ЫАОН в 50 мМ фосфатном буфере, рН 7, добавляли 10 ед. активности/мл пероксидазы хрена, 0,5 мМ Н202 и отмеченные соединения. Окисление МАЙН определяли по изменению оптической плотности при 340 нм, используя коэффициент молярной экстинкции при 339 нм 6200 М"1см~1. (б) Действие малата как субстрата малатдегидрогеназы на хитозэн-индуцированное разрушение ядер ЭК в эпидермисе из листьев гороха. Пленки эпидермиса обрабатывали хитозаном (100 мкг/мл) на магнитной мешалке 30 мин, добавляли 5 мМ малата, 5 мМ сукцината и 0,1 мМ фенола и инкубировали 3 ч без перемешивания в темноте.

Пероксидазы также катализируют реакции, в которых акцептором электронов является 02. Для этих реакций, называемых пероксидазно-оксидазными, пригодны немногие доноры электронов. Они включают ИЛЬН, дигидроксифумарат, индол-3-ацетат, нафтогидрохиноны.

Per2+ + 02 + 4H+ -> Peri+ (соединение III) + 2H20, Perc+ + DIf-> Per5+ + D + H*.

PerG+ (соединение III) - каталитически неактивная форма фермента. Фенольные соединения в сочетании с NADH переводят пероксидазу из состояния Ре/1' в активную форму (Halliwell, 1978).

Рис. 10, а иллюстрирует действие различных соединений на окисление NADH с участием пероксидазы хрена. Лишь фенол и ДХФ поддерживали окисление NADH. Проникающие катионы, как и катионные производные пластохинона, были не эффективны.

Малат, субстрат апопластной малатдегидрогеназы, пополняя фонд апопластного NADH, субстрата пероксидазы, предотвращал хитозан-индуцированное разрушение ядер ЭК и снимал повреждающее действие фенола в повышенной концентрации - 0,1 мМ (рис. 10, б). Сукцинат не обаладал защитным действием. Восстановление NAD+ малатом реализуется посредством малатдегидрогеназы, прочно связанной с клеточной стенкой (Elstner and Heupel, 1976; Mâder and Fiissl, 1982). Малат выделяется в апопласт УК мезофилла и может поглощаться УК из апопласта, регулируя С02-зависимое движение устьиц (Kirk et al., 1978; Lee et al., 2008). Таким образом, фенольные соединения вместе с апопластной пероксидазой и малатдегидрогеназой защищают ЭК от губительного действия хитозана.

Предложена последовательность реакций (рис. 11), которая объединяет пероксидазные и пероксидазно-оксидазные реакции с участием NADH (Самуилов и др., 2010).

Рис. 11. Действие пероксидазы, использующей фенол как субстрат. PhOH - фенол, PhO' - радикал фенола. Цифры при Per отражают количество окислительных эквивалентов, которых недостает железу и тему фермента.

выводы

1. Пластохинон, связанный с проникающим через мембраны катионом додецилтрифенилфосфония (8к(21), предотвращал программируемую клеточную смерть (ПКС), регистрируемую по зависимому от активных форм кислорода (АФК) разрушению клеточных ядер, индуцированную хитозаном или СЫ~.

2. Проникающие катионы тетрафенилфосфония и додецилтрифенилфосфония входящие в состав 8к(21 и этиловый эфир тетраметилродамина, входящий в состав родаминового ЭкС^И, в субнаномолекулярных концентрациях и проникающие анионы тетрафенилбора и фенилдикарбаундекаборана в микромолярных концентрациях предотвращали хитозан-индуцированное разрушение ядер эпидермальных клеток. Действие катионов усиливалось пальмитатом, а действие анионов - посредством ЫН4С1. Предположительно проникающие катионы переносятся с жирными кислотами, а анионы -совместно с ЫН4+ через мембрану митохондрий, что сопровождается снижением Ар на внутренней мембране митохондрий, подавляющим образование АФК.

3. Хитозан-индуцированное разрушение ядер эпидермальных клеток и С>-Г-индуцированное разрушение ядер устьичных клеток в эпидермисе из листьев гороха предотвращалось ингибиторами ИАБРН-оксидазы плазматической мембраны дифенилениодонием и хинакрином в концентрациях, не оказывающих влияние на дыхание и фотосинтетическое выделение 02 нарезками листьев гороха. Полученные данные свидетельствуют об участии ИАОРН-оксидазы плазматической мембраны в ПКС у растений.

4. Субстраты апопластной пероксидазы, соединения фенольной природы, предотвращали хитозан-индуцированное разрушение ядер эпидермальных клеток. Сходным действием обладали пентахлорфенол, 2,4-динитрофенол и л/-хлоркарбонилцианидфенилгидразон. Субстрат малатдегидрогеназы малат, пополняя фонд апопластного МАБН, способного восстанавливать фенольные соединения, предотвращал ПКС, индуцированную хитозаном.

5. Данные позволяют заключить, что вызванная хитозаном гибель клеток гороха, предотвращается митохондриально-направленными антиоксидантами-хинонами и проникающими через мембраны ионами. Дыхательная цепь митохондрий, ЫАБРН-оксидаза плазматической мембраны и апопластная пероксидаза могут служить источниками АФК при ПКС у растений.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах, входящих в список ВАК РФ

1. Самуилов В.Д., Киселевский Д.Б., Синицын С.В., Шестак A.A., Лагунова Е.М., Несов A.B. Н202 усиливает СЬГ-индуцировапный апоптоз в листьях гороха (2006) Биохимия, 71, 481-492.

2. Васильев Л.А., Воробьев A.A., Дзюбинская Е.В., Несов A.B.. Шестак A.A., Самуилов В.Д. Вызванная ОТ гибель клеток в листьях растений (2007) Биохимия, 72, 707-713.

3. Самуилов В.Д., Киселевский Д.Б., Шестак A.A., Несов A.B.. Васильев Л.А. Активные формы кислорода в программируемой гибели устьичных клеток гороха растений (2008) Биохимия, 73, 1344-1354.

4. Самуилов В.Д., Васильев Л.А., Дзюбинская Е.В., Киселевский Д.Б., Несов A.B. Программируемая клеточная смерть у растений: защитное действие фенольных соединений от хитозана и Н202 (2010) Биохимия, 75, 313-320.

5. Киселевский Д.Б., Кузнецова Ю.Е., Васильев Л.А., Лобышева Н.В., Зиновкин P.A., Несов A.B.. Шестак A.A., Самуилов В.Д. Действие Са2+ на программируемую гибель устьичных и эпидермальных клеток в листьях гороха (2010) Биохимия, 75, 717-726.

6. Васильев Л.А., Киселевский Д.Б., Дзюбинская Е.В., Несов A.B.. Самуилов В.Д. Программируемая гибель клеток у растений: защитное действие катионов тетрафенилфосфония и тетраметилродамина, используемых в качестве трансмембранных переносчиков хинонов (2012) Биохимия, 77, 454—462.

Тезисы конференций

1. Несов А.В.. Синицын С.В., Самуилов В.Д. Жизнеспособные, но не культивируемые формы бактерий у растений. Материалы VIII молодёжной конференции ботаников в Санкт-Петербурге. 17-21 мая 2004 г. Санкт-Петербург. Сборник тезисов, с. 131-132.

2. Синицын С.В., Несов А.В.. Безряднов Д.В., Тимофеев К.Н., Федоренко Т.А., Самуилов В.Д. НгОг-индуцированное ингибирование фотосинтетического выделения 02 клетками Anabaena variabilis. Третий съезд биофизиков России. 24-29 июня 2004 г. Воронеж. Тезисы докладов. Том И. с. 456-457.

3. А.У. Nesov. Yu. V. Kusnetsova, А.А. Shestak, D.B. Kiselevsky. Reactive oxygen species and their sources in programmed death of pea guard cells. "Российская биоэнергетика: от молекул к клетке". 21-23 февраля 2005 г. Москва. Сборник тезисов, с. 54.

4. Киселевский Д.Б., Шестак А.А., Несов А.В.. Кузнецова Ю.Е., Самуилов В.Д. Влияние ингибиторов флавиновых ферментов и Са2+ на индуцируемую цианидом гибель устьичных клеток гороха. Международная научная конференция "Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах" памяти проф. М.В. Гусева. 16-19 мая 2005 г. Москва. Материалы конференции, с. 78.

5. Nesov А.V.. Shestak А.А., Kiselevsky D.B., Samuilov V.D. Effect of quinacrine and diphenylene iodonium, flavine enzymes inhibitors, on programmed cell death of pea guard cell. Материалы I(IX) Международной конференции молодых ботаников в Санкт-Петербурге. 21-26 мая 2006 г. Санкт-Петербург. Сборник тезисов, с. 228.

6. Kiselevsky D.B., Shestak А.А., Sinitsyn S.B., Nesov A.V.. Samuilov V.D. Cyanide-induced apoptosis in pea leafs. 14th European bioenergetics conference. Moscow State University, Moscow, Russian Federation. 22 July-27 July 2006. Biochim. Biophys. Acta, 14, 499.

7. Васильев JI.B., Несов A.B.. Дзюбинская E.B. CN'-Индуцированпая клеточная гибель в листьях растений. Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2007". 11-14 апреля 2007 г. Москва. Секция "Биология". Тезисы докладов, с. 162.

8. Киселевский Д.Б., Шестак А.А., Несов А.В.. Кузнецова Ю.Е., Васильев Л.А., Самуилов В.Д. Активные формы кислорода и их источники при программируемой гибели клеток гороха. IV съезд российского общества биохимиков и молекулярных биологов. 11-15 мая 2008 г. Новосибирск. Сборник тезисов, с. 323.

9. Кузнецова Ю.Е., Киселевский Д.Б., Несов А.В.. Васильев Л.А., Шестак А.А., Самуилов В.Д. Действие Са2+ на CN~- и хитозан-индуцированную гибель устьичных и эпидермальных клеток листьев гороха. Конференция «Экосистемы, организмы, инновации», 29 октября 2008 г. Москва. Сборник тезисов.

10.D.B. Kiselevskiy D.B., E.V. Dzyubinskaya, А.У. Nesov. L.A. Vasil'ev, V.D. Samuilov. Mitochondria-addressed cations prevent programmed cell death in pea leaves and delay leaf senescence and death in Arabidopsis thaliana. Программируемая гибель клеток в биологии и медицине: 4-5 июня, 2012 г. Москва. Сборник тезисов, с. 25.

Подписано в печать:

10.12.2012

Заказ № 7967 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www. autoreferat. ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Несов, Артем Владимирович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Иммунитет растений.

2.2. Программируемая гибель клеток.

2.2.1. Современные представления о гибели клеток.

2.2.2. Каспазы.

2.2.3. Программируемая клеточная смерть (ПКС) у растений и животных

2.2.4. Участие митохондрий и хлоропластов в ПКС.

2.2.5. Проникающие ионы, производные убихинона и пластохинона.

2.2.6. ПКС в онтогенезе растений.

2.2.7. Гиперчувствительный ответ клеток растений.

2.3. Активные формы кислорода.

2.4.]ЧАБРН-оксидаз а.

2.4.1. Формы и структура ЫАБРН-оксидаз.

2.4.2. Регуляция активности МАОРН-оксидазы растений.

2.4.3. Ингибиторы КАОРН-оксидазы.

2.5. Пероксидазы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Активные формы кислорода в гибели клеток растений"

В отличие от животных у растений нет специализированных защитных клеток (фагоцитов), поглощающих и обезвреживающих патогенов. Каждая клетка растения обладает способностью к защите от патогена. При распознавании инфекционных возбудителей или их сигнальных соединений включается гиперчувствительный ответ (ГО), сопровождающийся продукцией активных форм кислорода (АФК), гибелью клеток растения и гибелью патогенного микроорганизма, вторгшегося в ткани растения. Это препятствует распространению инфекции на другие клетки.

Программируемая клеточная смерть (ПКС) играет важную роль в онтогенезе и поддержании тканевого гомеостаза организма. Являясь составляющей иммунитета, ПКС вовлечена в защиту от инфекционных возбудителей как у животных, так и у растений.

Механизмы ПКС у растений изучены в меньшей степени, чем у животных и человека, однако имеющиеся данные свидетельствуют о наличии универсальных сигнальных путей и механизмов гибели клеток. Важную роль в ПКС играют биоэнергетические структуры клетки. Митохондрии - поставщики ряда белков, включающих ПКС. Дыхательная цепь митохондрий животных является одним из источников АФК, вызывающих клеточную гибель (Скулачев, 2000).

Перспективно исследование влияния митохондриально-направленных антиоксидантов-катионов, способных накапливаться в клетках и митохондриях в соответствии с мембранным потенциалом, который генерируется на цитоплазматической и митохондриальной мембранах (знак «минус» - на внутренней стороне). Их концентрация в митохондриях может увеличиваться на несколько порядков. Это позволяет их использовать в низких концентрациях, которые не являются токсичными. Первый антиоксидант такого типа - Мцо(). Это убихинон, связанный с катионом децилтрифенилфосфония. Он может восстанавливаться компонетами дыхательной цепи и проявлять таким образом многократное действие. В.П.Скулачев предложил заменить убихинон в составе липофильного антиоксиданта на пластохинон, более сильный антиоксидант. Полученные производные пластохинона получили название SkQ, где Sk - проникающий катион, связанный через декановый или пентановый линкер с Q - пластохиноном (Скулачев, 2007). Митохондриально-направленные липофильные антиоксиданты позволяют исследовать образование АФК в митохондриях и их участие в гибели клеток.

АФК в клетках растений образуются в электронтранспортных цепях хлоропластов и митохондрий, в пероксисомах, аппарате Гольджи, эндоплазматическом ретикулуме. Источником АФК, участвующих в ГО, служит NADPH-оксидаза плазматической мембраны клеток. NADPH-Оксидаза — ферментный комплекс плазматической мембраны клеток у животных, растений и грибов, катализирующий трансмембранный перенос электронов от цитозольного NADPH на внеклеточный Оо с образованием Ог' (Bedard et al., 2007). АФК, образованные NADPH-оксидазой растений, играют важную роль в фитоиммунитете (Bedard et al., 2007; Sumimoto, 2008; Marino et al, 2012). По-видимому, NADPH-оксидаза является источником АФК для реализации CN -индуцированной клеточной смерти у гороха (Самуилов и др., 2006; 2008). Апопластная пероксидаза участвует в реализации гиперчувствительного ответа у растений как поставщик АФК (Grant et al., 2000; Geiszt, Leto, 2004; Lee et al., 2006; Davies et al., 2006). Пероксидаза может катализировать зависимое от Н2Ог окисление салициловой кислоты (СК). При этом возникают свободные радикалы СК\ образующие СК+ и О2' (Kawano, 2003).

Представляется интересным исследовать участие и роль этих трех систем ответственных за образование АФК в ПКС у растений.

Цель и задачи работы

Цель работы - исследовать роль дыхательной цепи митохондрий, ЫАОРН-оксидазы плазматической мембраны и апопластной пероксидазы в образовании АФК в ПКС у растений.

Задачи:

1. Исследовать защитное действие хинона, ковалентно связанного с проникающими через мембраны митохондриально-направленными катионами (БкС?), на ПКС у растений, вызванную хитозаном и цианидом.

2. Выяснить действие катионов тетрафенилфосфония (ТРР+), додецилтрифенилфосфония (С^ТРР*) и этилового эфира тетраметилродамина (ТМЯЕ+), входящих в состав синтетических хинонов ЭкС), на ПКС у растений. Сравнить действие катионов с действием проникающих анионов тетрафенилбора (ТВ-) и фенилдикарбаундекаборана (РСВ).

3. Используя ингибиторы флавиновых ферментов (хинакрин и дифенилениодоний), исследовать роль КАЭРН-оксидазы в ПКС.

4. Исследовать действие фенольных соединений, субстратов апопластной пероксидазы, на ПКС у растений. Сопоставить действие фенольных соединений и протонофорных разобщителей окислительного фосфорилирования.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Несов, Артем Владимирович

5. ВЫВОДЫ

1. Пластохинон, связанный с проникающим через мембраны катионом додецилтрифенилфосфония (БкСН), предотвращал программируемую клеточную смерть (ПКС), регистрируемую по зависимому от активных форм кислорода (АФК) разрушению клеточных ядер, индуцированную хитозаном или С>Г.

2. Проникающие катионы тетрафенилфосфония и додецилтрифенилфосфония входящие в состав 8к(21 и этиловый эфир тетраметилродамина, входящий в состав родаминового ЭкС^Ю, в субнаномолекулярных концентрациях и проникающие анионы тетрафенилбора и фенилдикарбаундекаборана в микромолярных концентрациях предотвращали хитозан-индуцированное разрушение ядер эпидермальных клеток. Действие катионов усиливалось пальмитатом, а действие анионов - посредством ТЧЬЦО. Предположительно проникающие катионы переносятся с жирными кислотами, а анионы - совместно с МН4+ через мембрану митохондрий, что сопровождается снижением Др на внутренней мембране митохондрий, подавляющим образование АФК.

3. Хитозан-индуцированное разрушение ядер эпидермальных клеток и С>Г -индуцированное разрушение ядер устьичных клеток в эпидермисе из листьев гороха предотвращалось ингибиторами ЫАОРН-оксидазы плазматической мембраны дифенилениодонием и хинакрином в концентрациях, не оказывающих влияние на дыхание и фотосинтетическое выделение СЬ нарезками листьев гороха. Полученные данные свидетельствуют об участии ЫАОРН-оксидазы плазматической мембраны в ПКС у растений.

4. Субстраты апопластной пероксидазы, соединения фенольной природы, предотвращали хитозан-индуцированное разрушение ядер эпидермальных клеток. Сходным действием обладали пентахлорфенол, 2,4-динитрофенол и ти-хлоркарбонилцианидфенилгидразон. Субстрат малатдегидрогеназы малат, пополняя фонд апопластного ЫАОН, способного восстанавливать фенольные соединения, предотвращал ПКС, индуцированную хитозаном.

5. Данные позволяют заключить, что вызванная хитозаном гибель клеток гороха, предотвращается митохондриально-направленными антиоксидантами-хинонами и проникающими через мембраны ионами. Дыхательная цепь митохондрий, ЫАОРН-оксидаза плазматической мембраны и апопластная пероксидаза могут служить источниками АФК при ПКС у растений.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследована роль дыхательной цепи митохондрий, ЫАОРН-оксидазы плазматической мембраны и апопластной пероксидазы в образовании АФК и ПКС у растений. Накапливающийся в митохондриях по градиенту мембранного потенциала антиоксидант БкСН, добавленный в субнаномолярных концентрациях, предотвращал разрушение ядер эпидермальных клеток, вызванное хитозаном, производным хитина, компонента клеточных стенок грибов. Сходный эффект оказывали накапливающиеся в митохондриях проникающие катионы, входящие в состав 8к(3. Проникающие анионы, не накапливающиеся, а выбрасывающиеся из митохондрий по градиенту Дер, защищали клетки от разрушения ядер, но в концентрациях на несколько порядков, превышающих таковые для катионов. Пальмитат усиливал защитное действие испытанных катионов, а ЫН4С1 - защитное действие анионов. Предположительно, катионы способствуют переносу через митохондриальную мембрану анионов жирных кислот, а анионы - переносу через мембрану >Ш4+. Разобщители окислительного фосфорилирования, как и катионы в низких концентрациях подавляли хитозан-индуцированное разрушение ядер. Эффект разобщителей и катионов с жирными кислотами объясняется тем, что, будучи переносчиками Н+ через мембраны, они подавляют образование Дер и генерацию АФК в митохондриях.

Источниками АФК при гиперчувствительном ответе у растений являются ЫАОРН-оксидаза и апопластная пероксидаза. Хитозан-индуцированное разрушение ядер эпидермальных клеток и СЫ~-индуцированное разрушение ядер устьичных клеток в эпидермисе из листьев гороха предотвращалось ингибиторами ЫАОРН-оксидазы дифенилениодонием и хинакрином. Соединения фенольной природы, субстраты апопластной пероксидазы, в низких концентрациях снижают хитозан-индуцированное разрушение ядер эпидермальных клеток, способствуя окислению МАБН пероксидазой. Малат, субстрат малатдегидрогеназы, пополняя фонд апопластного ЫАОН, восстанавливающего фенольные соединения, предотвращает ПКС, индуцированную хитозаном.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Несов, Артем Владимирович, Москва

1. Бакеева J1.E., Дзюбинская Е.В., Самуилов В.Д. (2005) Программируемая клеточная смерть у растений: ультраструктурные изменения в устьичных клетках гороха. Биохимия, 70, 1177-1185.

2. Барыкина Р.П., Веселова Т.Д., Девятов А.Г., Джалилова Х.Х., Ильина Г.М., Чубатова Н.В. (2000) Основы микротехнических исследований в ботанике. Справочное руководство. Москва, МГУ.

3. Ванюшин Б.Ф. (2001) Апоптоз у растений. Успехи биологической химии, 41, 3-38.

4. Васильев JI.A., Дзюбинская Е.В., Зиновкин P.A., Киселевский Д.Б., Лобышева Н.В., Самуилов В.Д. (2009) Вызванная хитозаном программируемая гибель клеток у растений Биохимия, 74, 1270-1279.

5. Васильев J1.A., Дзюбинская Е.В., Киселевский Д.Б., Шестак A.A., Самуилов В.Д. (2011) Программируемая гибель клеток растений: защитное действие митохондриально-направленных хинонов. Биохимия, 76, 1374-1386.

6. Вахрушева O.A., Недоспасов С.А. (2011) Система врожденного иммунитета у растений. Молекулярна биология, 45, 1-10.

7. Глянько А.К., Ищенко A.A., Митанова Н.Б., Васильева Г.Г. (2009) НАДФН-оксидаза растений. Bien. Харюв. нацюн. аграрн. ун-ту. Сер. Бюлогля, ВИП. 2 (17), 6-18.

8. Гордеева A.B., Звягильская P.A., Лабас Ю.А. (2003) Взаимосвязь между активными формами кислорода и кальция в живых клетках. Биохимия, 68, 1318-1322.

9. Гордеева A.B., Лабас Ю.А., Звягильская P.A. (2004) Апоптоз одноклеточных организмов: механизмы и эволюция. Биохимия, 69, 1301-1313.

10. Дзюбинская Е.В., Киселевский Д.Б., Бакеева Л.Е., Самуилов В.Д. (2006) Программируемая клеточная смерть у растений: действие ингибиторов синтеза белка и структурные изменения в устьичных клетках гороха. Биохимия, 71, 493-504.

11. Дьяков Ю.Т, Багирова С.Ф. (2011) Что общего в иммунитете растений и животных? Природа, 11, 52-58.

12. Киселевский Д.Б., Кузнецова Ю.Е., Васильев Л.А., Лобышева Н.В., Зиновкин P.A. , Несов A.B., Шестак A.A., Самуилов В.Д. (2010) Действие Са2+ на программируемую гибель устьичных и эпидермальных клеток в листьях гороха. Биохимия, 75, 717-726.

13. Клейтон Р. (1984) Фотосинтез: физические механизмы и химические модели. Москва, Мир.

14. Лагунова Е.М. (2003), Программированная клеточная смерть у растений: роль хлоропластов. Кандидатская диссертация.

15. Метлицкий Л.В., Озерецковская О.Л. (1973). Фитоалексины. Москва,1. Наука.

16. Новожилова А.П., Плужников H.H., Новиков B.C. (1996) В кн. Программированная клеточная гибель (под ред. Новикова B.C.), Наука, СПб, стр. 9-29.

17. Паушева З.П. (1976) Практикум по г^итологии растений. Москва,1. Колос.

18. Проскуряков С.Я., Габай В.Л., Конопляников А.Г. (2002) Некроз -активная, управляемая, форма программируемой клеточной смерти. Биохимия, 67,467-491.

19. Самуилов В.Д. (2005) Проблемы биоэнергетики в эволюции живого. Биохимия, 70, 302-307.

20. Самуилов В.Д., Васильев JI.A., Дзюбинская Е.В., Киселевский Д.Б., Несов A.B. (2010) Программируемая клеточная смерть у растений: защитное действие фенольных соединений от хитозана и Н2О2. Биохимия, 75, 313-320.

21. Самуилов В.Д., Киселевский Д.Б., Синицын C.B., Шестак A.A., Лагунова Е.М., Несов A.B. (2006) Н202 усиливает CN -индуцированный апоптоз в листьях гороха Биохимия, 71, 481^192.

22. Самуилов В.Д., Киселевский Д.Б., Шестак A.A., Несов A.B., Васильев JI.A. (2008) Активные формы кислорода в CN —индуцированной программируемой гибели устьичных клеток гороха. Биохимия, 73, 1344-1354.

23. Самуилов В.Д., Лагунова В.Д., Дзюбинская Е.В., Изюмов Д.С., Киселевский Д.Б., Макарова Я.В. (2002) Участие хлоропластов в программируемой гибели клеток у растений. Биохимия, 67, 757-765.

24. Самуилов В.Д., Лагунова Е.М., Бешта O.E., Киташов A.B. (2000) (А) Индуцированное CN разрушение ядер в клетках листьев гороха. Биохимия, 65, 817-824.

25. Самуилов В.Д., Олескин A.B., Лагунова Е.М. (2000) (Б) Программируемая клеточная смерть. Биохимия, 65, 1029—1046.

26. Самуилов В.Д., Лагунова Е.М., Гостимский С.А., Тимофеев К.Н., Гусев М.В. (2003) Роль фотосистем II и I хлоропластов в апоптозе устьичных клеток гороха. Биохимия, 68, 1113-1116.

27. Скулачев (2007) Попытка биохимиков атаковать проблему старения: «мегапроект» по проникающим ионам. Первые итоги и перспективы. Биохимия, 72, 1700-1714.

28. Скулачев В.П. (1969) Аккумуляция энергии в клетке. Наука, Москва.

29. Скулачев В.П. (2000) Кислород и явления запрограммированной смерти. Первое Северинское чтение, М. ИБМХ РАМН.

30. Скулачев В.П. (2009) Новые сведения о биохимии запрограммированного старения организма и антиоксидантная защита митохондрий. Биохимия, 74, 1400-1403.

31. Скулачев В.П., Богачев А.В., Каспаринский Ф.О. (2010) Мембранная биоэнергетика. Издательство Московского университета, Москва.

32. Тарчевский И.А. (2002) Сигнальные системы клеток растений. М., Наука, 294 с.

33. Тарчевский И.А. (1993) Катаболизм и стресс у растений. М., Наука.198 с.

34. Тарчевский И.А. (2011) Патоген-индуцируемые белки растений. Прикл. микробиология и биохимия, 37, 1—15.

35. Федоренко Т.А. (1999) Лаг-фаза ССЬ-зависимого выделения 02 освещенными клетками цианобактерий. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва.

36. Часов А.В., Алексеева В.Я., Колесников О.П., Минибаева Ф.В. (2010) Активация экстраклеточной пероксидазы корней пшеницы при действии ксенобитиков. Прикладная биохимия и микробиология, 46, 472^478.

37. Affourtit С., Albury M.S., Crichton P.G. and Moore A.L. (2002) Exploring the molecular nature of alternative oxidase regulation and catalysis. FEBS Lett., 510, 121-126.

38. Agrawal G.K., Iwahashi H„ Rakwal R. (2003) Small GTPase "Pop" molecular switch for plant defense responses. FEBS Lett., 546, 173-180.

39. Agrios G.N. (2004) Plant Pathology. Elsevier Academic Press. 5ed edition. P. 221.

40. Allen J.F. (1984) Photosynthesis and phosphorylation of light-harvesting chlorophyll-a/B-protein in intact chloroplasts effects of uncouplers. FEBS Lett., 166, 237-244.

41. Almagro L., Gomez Ros L.V., Belchi-Navarro S., Bru R., Ros Barcelo A. and M. Pedreno A. (2009) Class III peroxidases in plant defence reaction. J. Exp. Botany, 60, 337-390.

42. Arnon D.I. (1949) Copper enzymes in isolated chloroplasts. Polyphenoloxidase in Beta vulgaris. Plant Physiol., 24, 1-15.

43. Asada K. (1999) The water-water cycle in chloroplasts: scavenging of active oxygens and dissipation of excess photons. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 50, 601-639.

44. Asai T., Stone J.M., Heard J.E., Kovtun Ye., Yorgey P., Sheen J., Ausubel M. (2000) Fumonsin B1-induced cell death in Arabidopsis protoplasts requires jasmonate-, ethylene-, and salicylate-dependent signaling pathways. Plant Cell, 12, 1823-1835.

45. Auclair C. and Voisin E. (1985) in CRC Handbook of Methods for Oxygen Radical Research (Greenwald, R.A., ed) CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida, pp.123-132.

46. Averyanov A. (2008) Oxidative burst and plant desease resistance. Front, in Bioscience, 1, 142-152.

47. Bakeeva L.E., Grinius L.L., Jasaitis A.A., Kuliene V.V., Levitsky D.O., Liberman E.A., Severina I.I. and Skulachev V.P. (1970) Conversion ofbiomembrane-produced energy into electric form. II. Intact mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 216, 13-21.

48. Balk J., Chew S.K., Leaver C.J., McCabe P.F. (2003) The intermembrane space of plant mitochondria contains a DNase activity that may be involved in programmed cell death. Plant J., 34, 573-583.

49. Banfi B., Tirone F., Durussel I., Knisz J., Moskwa P., Molnar G.Z., Krause K.H., Cox J.A. (2004) Mechanism of Ca2+ activation of the NADPH oxidase 5 (NOX5). J. Biol. Chem., 279, 18583-18591.

50. Beckers C.M., van Hinsbergh V.W., van Nieuw Amerongen G.P. (2010) Driving Rho GTPase activity in endothelial cells regulates barrier integrity. Thromb Haemost. 103, 40-55.

51. Bedard K., Lardy B., Krause K-H. (2007) NOX family NADPH oxidases: Not just in mammals. Biochimie, 89, 1107-1112.

52. Bender, A., Hajieva, P., and Moosmann, B. (2008) Adaptive antioxidant methionine accumulation in respiratory chain complexes explains the use of a deviant genetic code in mitochondria. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 105, 16496-16501.

53. Besson-Bard A., Pugin A., Wendehenne D. (2008) New insights into nitric oxide signaling in plants. Annu. Rev. Plant Biol., 59, 21-39.

54. Blommaart E.F.C., Krause U., Schellens J.P.M., Vreeling-Sindelarova H. and Meijer A.J. (1997) The phosphathidylinositol 3-kinase inhibitors wortmanninand LY294002 inhibit autophagy in isolated rat hepatocytes. Eur. J. Biochem., 243, 240-246.

55. Boiler T. and Felix G. (2009) A renaissance of elicitors: perception of microbe-associated molecular patterns and danger signals by pattern-recognition receptors. Annu. Rev. Plant Biol., 60, 379-406.

56. Borisova M.M., Kozuleva M.A., Rudenko N.N., Naydov I.A., Klenina I.B., Ivanov B.N. (2012) Photosynthetic electron flow to oxygen and diffusion of hydrogen peroxide through the chloroplast envelope via aquaporins. BBA, 1817, 1314-1321.

57. Bosch M., Franklin-Tong V.E. (2007a) Self-incompatibility in papaver: signalling to trigger PCD in incompatible pollen. J. Exp. Bot., 59(3), 481^490.

58. Bosch M., Franklin-Tong V.E. (2007b) Temporal and spatial activation of caspase-like enzymes induced by self-incompatibility in papaver pollen. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 104(46), 8327-8332.

59. Boyce M., Degterev A., Yuan J. (2004) Caspases: an ancient cellular sword of Damocles. Cell Death Differ., 11, 29-37.

60. Bronnikova, T.V., Fed'kina, V.R., Schaffer, W.M. and Olsen, L.F. (1995) Period-doubling bifurcations in a detailed model of the peroxidase-oxidase reaction. J. Phys. Chem., 99, 9309-9312.

61. Cai H., Griendling K.K., Harrison D.G. (2003) The vascular NADPH oxidase as therapeutic targets in cardiovascular diseases. Trends Pharmacol. Sci., 24, 471—478.

62. Campa C., Schmitt-Kopplin P., Cataldi T.R., Bufo S.A., Freiteg D., Kettrup A. (2000) Analysis of cyanogenic glycosides by micellar capillary electrophoresis. J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl., 739, 95-100.

63. Caplan J., Padmanabhan M. and Dinesh-Kumar S.P. (2008) Plant NB-LRR immune receptors: from recognition to transcriptional reprogramming. Cell Host & Microbe, 3, 126-135.

64. Cascales Angosto M. (2005) Estallido respiratorio de los fagocitos. Anal. Real. Acad. Nac. Farm., 71, 365-386.

65. Cathcart M.K. (2004) Regulation of superoxide anion production by NADPH oxidase in monocytes/macrophages-contributions to atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol., 24, 23-28.

66. Chang H.Y. and Yang X. (2000) Proteases for cell suicide: functions and regulation of caspases. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64, 821-846.

67. Chichkova N.V., Tuzhikov A.I., Taliansky M. and Vartapetian A.B. (2012) Plant phytaspases and animal caspases: structurally unrelated death proteases with a common role and specificity. Physiol. Plantarum, 145, 77-84.

68. Chung N. and Aust S.D. (1995) Veratryl alcohol- mediated indirect oxidation of pentachlorophenol by lignin peroxidase. Arch. Biochem. Biophys., 322, 143-148.

69. Clarke P.G. (2002) Apoptosis: From morphological types of cell death to interacting pathways. Trends Pharmacol. Sci. 23, 308-309.

70. Cross A., Segal A.W. (2004) The NADPH oxidase of professional phagocytes-prototype of the NOX electron transport chain systems. Biochim. Biophis. Acta, 1657, 1-22.

71. Curtis M.J. and Wolpert T.J. (2002) The oat mitochondrial permeability transition and its implication in victorin binding and induced cell death. Plant J., 29, 295-312.

72. Dangl J.L., Jones J.D.G. (2001) Plant pathogens and integrated defense responses to infection. Nature, 411, 826-833.

73. Danon A., Delorme V., Mailhac N., Gallois P. (2000) Plant programmed cell death: a common way to die. Plant Physiol. Biochem., 38, 647-655.

74. Dat J.F., Pellinen R., Beeckman T., Van De Cotte B., Langebartels C., Kangasjarvi J., Inze D. and Van Breusegem F. (2003) Changes in hydrogen peroxide homeostasis trigger an active cell death process in tobacco. Plant J., 33, 621-632.

75. Daugas E., Nochy D., Ravagnan L., Loeffler M., Susin S.A., Zamzami N., Kroemer G. (2000) Apoptosis-inducing factor (AIF): a ubiquitous mitochondrial oxidoreductase involved in apoptosis. FEBSLett., 476, 118-123.

76. Day R.B., Okada M„ Ito Y., Tsukada K„ Zaghouani H., Shibuya N„ and Stacey G. (2001) Binding site for chitin oligosaccharides in the soybean plasma membrane. Plant Physiol., 126, 1162-1173.

77. De Pinto M.C., Locato V. & De Gara L. (2012) Redox regulation in plant programmed cell deathpce. Plant, Cell and Environment., 35, 234-244.

78. Doke N. (2003) Nicotiana benthamiana gp91phox homologs NbrbohA and NbrbohB participate in H202 accumulation and resistance to Phytophthora infestans. Plant Cell., 15, 706-718.

79. Dunn W.A.Jr (1990) Studies on the mechanisms of autophagy: formation of the autophagic vacuole. J. Cell Biol. 110, 1923-1933.

80. Dusting G.J., Selemidis S., Jaing F. (2005) Mechanisms for suppressing NADPH oxidase in the vascular wall. Mem. Inst. Oswaldo Cruz., Rio de Janeiro, 100, 97-103.

81. Elstner, E.F. and Heupel, A. (1976) Formation of hydrogen peroxide by isolated cell walls from horseradish (Armoracia lapathifolia Gilib.) Planta, 130, 175-180.

82. Estelle M. (2001) Proteases and cellular regulation in plants. Curr. Opin. Plant Biol., 4, 254-260.

83. Festjens N., Vanden Berghte T., Vandenabeele P. (2006) Necrosis, a well-orchestrateted from of cell demise: signaling cascades, important mediators and concomitant immune response. Biochim. Biophys. Acta 1757, 1371-1387.

84. Fisher D.B. (2000) In: Buchanan B.B., Gruissem W. and Joner R.L., eds., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, Ed. 1. American Society of Plant Physiologists, Rockville, MD, pp. 730-784.

85. Frahry G. and Schopfer P. (2001) NADH-stimulated, cyanide-resistant superoxide production in maize coleoptiles analyzed with a tetrazolium-based assay. Planta, 212, 175-183.

86. Frahry G. and Shopfer P. (1998) Inhibition of 02-reducing activity of horseradish peroxidase by diphenyleneiodonium. Phytochemistry, 48, 223-227.

87. Fukuda H. (1997) Tracheary Element Differentiation. Plant Cell, 9, 1147-1156.

88. Fukuda H. (2000) Programmed cell death of tracheary elements as a paradigm in plants. Plant Mol. Biol., 44, 245-253.

89. Garmier M, Priault P., Vidal G., Driscoll S., Djebbar R., Boccara M., Mathieu C., Foyer C.H., De Paepe R. (2007) Light and oxygen are not required for harpin-induced cell death. J. Biol. Chem., 282, 37556-37566.

90. Geiszt M., Leto T.L. (2004) The Nox family of NAD(P)H oxidases: host defense and beyond. J. Biol. Chem., 279, 51715-51718.

91. Golstein P., Aubry L., Levraud J.-P. (2003) Cell-death alternative model organisms: why and which? Mol. Cell Biol, 4, 798-807.

92. Grant J.J. and Loake G.J. (2000) Role of reactive oxygen intermediates and cognate redox signaling in disease resistance. Plant Physiol., 124, 21-29.

93. Gray J., Close P.S., Briggs S.P., Johal G.S. (1997) A novel suppressor of cell death in plants encoded by the lis 1 gene of maize. Cell, 89, 25-31.

94. Gray J., Janick-Buckner D., Buckner B„ Close P.S., Johal G.S. (2002) Light-dependent death of maize lis 1 cells is mediated by mature chloroplasts. Plant Physiol., 130, 1894-1907.

95. Gray J.C. (2003) Chloroplast-to-nucleus signalling: a role for Mg-protoporphyrin. Trends Genet., 19, 526-529.

96. Greenberg J.T. (1996) Programmed cell death: a way of life for plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 12094-12097.

97. Groom Q.J., Torres M.A., Fordham-Skelton A.P., Hammond-Kosack K.E., Robinson N.J., Jones J.D. (1996) RbohA, a rice homologue of the mammalian gp91phox respiratory burst oxidase gene. Plant J., 10, 515-522.

98. Gross, G.G., Janse, C. and Elstner, E.F. (1977) Involvement of malate, monophenols and the superoxide radical in hydrogen peroxide formation by isolated cell walls from horseradish (Armoracia lapathifolia Gilib.) Planta, 136, 271-276.

99. Gullner G. and Dodge A.D. (2000) Effect of singlet oxygen generating substances on the ascorbic acid and glutathione content in pea leaves. Plant Sci., 154, 127-133.

100. Halliwell, B. (1978) Biochemical mechanisms accounting for the toxic action of oxygen on living organisms: the key role of superoxide dismutase. Cell Biol. Int. Rep., 2,113-128.

101. Hatfield, R. and Vermerris, V. (2001) Lignin formation in plants. The dilemma of linkage specificity. Plant Physiol., 126, 1351-1357.

102. Hauser M.J.B. and Olsen L.F. (1998) The role of naturally occurring phenols in inducing oscillations in the peroxidase-oxidase reaction. Biochemistry, 37, 2458-2469.

103. Hetfield R. and Vermerris V. (2001) Lignin formation in plants. The dilemma of linkage specificity. Plant Physiol., 126, 1351-1357.

104. Hirsch R.E., Lewis B.D., Spalding E.P. and Sussman M.R. (1998) A role for the AKT1 potassium channel in plant nutrition. Science, 280, 918-921.

105. Hoeberichts F.A. and Woltering E.J. (2002) Multiple mediators of plant programmed cell death: interplay of conserved cell death mechanisms and plant-specific regulators. BioEssays, 25, 47-57.

106. Holtje J.-V. (1995) From growth to autolysis: the murein hydrolases in Escherichia coli. Arch. Microbiol., 164, 243-254.

107. Jabs T. (1999) Reactive oxygen intermediates as mediators of programmed cell death in plants and animals. Biochem. Pharmacol., 57, 231-245.

108. Jones A. (2000) Does plant mitochondrion integrate sellular stress and regulate programmed cell death? Trends Plant Sci., 5, 225-229.

109. Jones J.D.G., Dangl J.L. (2006) The plant immune system. Nature, 444, 323-329.

110. Kanafy K.A., Krumenacker J.S., Murad F. (2001) NO, nitrotyrosine and cyclic GMP in signal transduction. Med. Sci. Monit., 7, 801-819.

111. Kawahara T., Quinn M.T., Lambeth D. (2007) Molecular evolution of the reactive oxygen-generating NADPH oxidase (Nox/Duox) family of enzymes. BMC Evol Biol, 7, 109.

112. Kawano T. (2003) Roles of the reactive oxygen species-generating peroxidase reaction in the plant defense and growth induction. Plant Cell, 21, 829-837.

113. Kawasaki T., Hemmi K., Ono E., Hatakeyama S., Iwano M., Saton H. and Shimamoto K. (1999) The small GTP-binding protein Rac is a regulator of cell death in plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 96, 10922-10926.

114. Keller T., Damude H.G., Werner D., Doerner P., Dixon R.A. and Lamb C. (1998) A plant homolog of the neutrophil NADPH oxidase gp91phox subunit gene encodes a plasma membrane protein with Ca2+ binding motifs. Plant Cell, 10, 255-266.

115. Kerr J.F.R., Wyllie A.H., Currie A.R. (1972) Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implication in tissue kinetics. Brit. J. Cancer, 26, 239-257.

116. Klein J.A., Longo-Guess C.M., Rossmann M.P., Serburn K.L., Hurd R.E., Frankel W.N., Bronson R.T., Ackerman S.L. (2002) The harlequin mouse mutation down-regulates apoptosis-inducing factor. Nature, 419, 367-374.

117. Klionsky D.J., Cregg J.M., Dunn W.A.J., Emr Jr.S.D., Sakai Y., Sandoval I.V., Sibirny A., Subramani S., Thumm M., Veenhuis M. and Ohsumi Y. (2003) A unified nomenclature for yeast autophagy-related genes. Dev. Cell, 5, 513-519.

118. Klionsky D.J., Emr S.D. (2000) Autophagy as a regulated pathway of cellular degradation. Science, 290, 1717-1721.

119. Kobayashi M., Kawakita K., Maeshima M., Doke N., Yoshioka H. (2006) Subcellular localization of Strboh proteins and NADPH-dependent 02~ generating activity in potato tuber tissues. J. Exp. Bot., 57, 1373-1379.

120. Kobayashi M., Ohura I., Kawakita K., Yokota N., Fujiwara M., Shimamoto K., Doke N. and Yoshioka H. (2007) Calcium-dependent protein kinases regulate the production of reactive oxygen species by potato NADPH oxidase. Plant Cell, 19, 1065-1080.

121. Koraimann G. (2003) Lytic transglycosylases in macromolecular transport systems of Gram-negative bacteria. Cell. Mol. Life Sci., 60, 2371-2388.

122. Korshunov S.S., Korkina O.V., Ruuge E.K., Skulachev V.P. and Starkov A.A. (1998) Fatty acids as natural uncouplers preventing generation of 02~ and H202 by mitochondria in the resting state. FEBSLett., 435, 215-218.

123. Korshunov S.S., Skulachev V.P., Starkov A.A. (1997) High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS Lett., 416, 15-18.

124. Korthout H.A.A.J., Berecki G., Bruin W., van Duijn B., Wang M. (2000) The presence and subcellular localization of caspase 3-like proteinases in plant cells. FEBS Lett., 475, 139-144.

125. Kuthanova A., Opatrny Z., Fischer L. (2008) Is internucleosomal DNA fragmentation an indicator of programmed death in plant cells? J. Exp. Bot., 59(8), 2233-2240.

126. Macpherson N., Takeda S., Shang Z., Dark A., Mortimer J.C., Brownlee C., Dolan L., Davies J.M. (2008) NADPH oxidase involvement in cellular integrity. Planta, 111, 1415-1418.

127. Maekawa T., Kufer T.A., Schulze-Lefert P. (2011) NLR functions in plant and animal immune systems: so far and yet so close. Nature Immun., 12, 818-826.

128. Majander A., Finel M. and Wikstrom M. (1994) Diphenyleneiodonium inhibits reduction of iron-sulfur clusters in the mitochondrial NADPH-ubiquinone oxidoreductase (complex I). J. Biol. Chem., 269, 21037-21042.

129. Marino D., Dunand C., Puppo A., and Pauly N. (2012) A burst of plant NADPH oxidases. Trends in Plant Sci., 17, 9-15.

130. Marty F. (1999) Plant vacuoles. Plant Cell, 11, 589-599.

131. Meyer J.W., Schmitt M.E. (2000) A central role for the endothelial NADPH oxidase in atherosclerosis. FEBSLett., 472, 1-4.

132. Mihalache C.C., Simon H.U. (2012) Autophagy regulation in macrophages and neutrophils. Experem. Cell Research, 318, 1187-1192.

133. Miramar M.D., Costantini P., Ravagnan L., Saraiva L.M., Haouzi D., Brothers G., Penninger J.M., Peleato M.L., Kroemer G., Susin S.A. (2001) NADH oxidase activity of mitochondrial apoptosis-inducing factor. J. Biol. Chem., 276, 16391-16398.

134. Mittler R., Lam E. (1996) Sacrifice in the face of foes: pathogen-induced programmed cell death in plants. Trends Microbiol., 4, 10-15.

135. Mizushima N. and Klionsky D.J. (2007) Protein turnover via autophagy: implications for metabolism. Annu. Rev. Nutr., 27, 19-40.

136. Moore A.L., Siedow J.N. (1991) The regulation and nature of the cyanide-resistant alternative oxidase of plant mitochondria. Biochim Biophys Acta., 1059, 121-140.

137. Mullineaux P. and Karpinski S. (2002) Signal transduction in response to excess light: getting out of the chloroplast. Curr. Opin. Plant Biol., 5, 43^48.

138. Murphy T.M., Auh C.K. (1996) The superoxide syntheses of plasma membrane preparation from cultured rose cell. Plant Physiol., 110, 621-629.

139. Nagata S. (2000) Apoptotic DNA fragmentation. Exp. Cell. Res., 256,12.18.

140. Nagata S., Nagase H., Kawane K., Mukae N., Fukuyama H. (2003) Degradation of chromosomal DNA during apoptosis. Cell Death Dijfer., 10, 108-116.

141. Nagy G., Koncz A., Perl A. (2003) T cell activation-induced mitochondrial hyperpolarization is mediated by Ca2+ and redox-dependent production of nitric oxide. J. Immunol., 171, 5188-5197.

142. Nauseef W.M. (2008) Biological Roles for the NOX family NADPH oxidases. JBC, 283, 16961-16965.

143. Ning S.B., Wang L., Song Y.C. (2002) Identification of programmed cell death in situ in individual plant cells in vivo using a chromosome preparation technique. J. Exp. Bot., 369, 651-658.

144. Noctor G., Foyer C.H. (1998) Ascorbate and glutathione: keeping active oxygen under control. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 49, 249-279.

145. Nürnberger T., Brunner F., Kemmerling B., Piater L. (2004) Innate immunity in plants and animals: striking similarities and obvious differences. Immunol. Rev., 198, 249-266.

146. O'Donnell V.B., Tew D.G., Jones O.T. and England P.J. (1993) Studies on the inhibitory mechanism of iodonium compounds with special reference to neutrophil NADPH oxidase. Biochem. J., 290, 41^49.

147. Palmgren M.G. (2001) PLANT PLASMA MEMBRANE H+-ATPases: Powerhouses for Nutrient Uptake. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 52, 817-845.

148. Papadakis A.K. and Roubelakis-Angelakis K.A. (1999) The generation of active oxygen species differs in tobacco and grapevine mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 121, 197-205.

149. Petrosillo G., Casanova G., Matera M., Ruggiero F.M., Paradies G. (2006) Interaction of peroxidized cardiolipin with rat-heart mitochondrial membranes: induction of permeability transition and cytochrome c release. FEBS Lett., 580, 6311-6316.

150. Pillidge C. J., Rallabhandi P.S.V.S., Tong X.-Z., Gopal P. K„ Farley P.C., Sullivan P.A. (2002) Autolysis of Lactococcus lactis. Internation Dairy J., 12, 133-140.

151. Quivino B.F., Noh Y.S., Himelbian E., Amasino R.M. (2000) Molecular aspects of leaf senescence. Trends Plant Sci., 5, 278-282.

152. Ramasarma T., Swaroop A., MacKellar W. and Crane F.L. (1981) Generation of hydrogen peroxide on oxidation of NADH by hepatic plasma membranes. J. Bioenerg. Biomembr., 13, 241-253.

153. Ravagnan L., Roumier T., Kroemer G. (2002) Mitochondria, the killer organelles and their weapons. J. Cell. Physiol, 192, 131-137.

154. Reggiori F. and Klionsky D.J. (2002) Autophagy in the eucaryotic cell. Eucaryot. Cell, 1, 11-21.

155. Rice K.C., Bayles K.W. (2003) Death's toolbox: examining the molecular components of bacterial programmed cell death. Mol. Microbiol, 50, 729-738.

156. Rodermel S. (2001) Pathways of plastid-to-nucleus signaling. Trends Plant Sci., 6,471-478.

157. Rutherford A.W. and Krieger-Liszkay A. (2001) Herbicide-induced oxidative stress in photosystem II. Trends Biochem. Sci., 26, 648-653.

158. Ryerson D.E., Heath M.C. (1996) Cleavage of nuclear DNA into oligonucleosomal fragments during cell death induced by fungal infection or by abyotic treatments. Plant Cell, 8, 393-402.

159. Saelens X., Festjens N., Walle L.V., van Gurp M., van Loo G., Vandenabeele P. (2004) Toxic proteins released from mitochondria in cell death. Oncogene, 23, 2861-2874.

160. Sagi M. and Fluhr R. (2001) Superoxide production by plant homologues of the gp91phox NADPH oxidase: modulation of activation by calcium and by tobacco mosaic virus infection. Plant Physiol, 126, 1281-1290.

161. Sagi M. and Fluhr R. (2006) Production of reactive oxygen species by plant NADPH oxidases. Plant Physiol, 141, 336-340.

162. Samuilov V.D., Lagunova E.M., Kiselevsky D.B., Dzyubinskaya E.V., Makarova Ya.V., Gusev M.V. (2003) Participation of chloroplasts in plant apoptosis. Biosci. Rep., 23, 103-117.

163. Saviani E.E., Orsi C.H., Oliveira J.F., Pinto-Maglio C.A., Sallgado I. (2002) Participation of the mitochondrial permeability transition pore in nitric oxide-indused plant cell death. FEBS Lett., 510, 136-140.

164. Sawada N., Li Y., Liao J.K. (2010) Novel aspects of the roles of Racl GTPase in the cardiovascular system. Curr Opin Pharmacol., 10, 116-121.

165. Segal A. (2008) The function of the NADPH oxidase of phagocytes and its relationship to other NOXs in plants, invertebrates and mammals. Int. J. Biochem Cell Biol., 40, 604-618.

166. Shimamoto K., Takahashi A., Eiichiro O., Hatakeyama S., Iwano M., Kawasaki T. (1999) Programmed cell death in plants. Plant Biotechnoi, 16, 49-53.

167. Sies H. (1993) Strategies of antioxidant defense. Eur. J. Biochem., 215, 213-219.

168. Simon-Plas F., Elmayan T., Blein J.-P. (2002) The plasma membrane oxidase NtrbohD is responsible for AOS production in elicited tobacco cells. Plant J., 31, 137-147.

169. Singh R., Cuervo A.M. (2011) Autophagy in the cellular energetic balance. Cell Metab., 13, 495-504.

170. Skulachev V.P. (2006) Bioenergetic aspects of apoptosis, necrosis and mitoptosis. Apoptosis, 11,473-485.

171. Skulachev V.P., Sharaf A.A. and Liberman E.A. (1967) Proton conductors in the respiratory chain and artificial membranes. Nature, 216, 718-719.

172. Sluse F.E., Jarmuszkiewicz W. (1998) Alternative oxidase in the branched mitochondrial respiratory network: an overview on structure, function, regulation, and role. Braz J Med Biol Res., 31, 733-747.

173. Solomon M., Belenghi B., Delledonne M., Menachem E., Levine A. (1999) The involvement of cysteine proteases and protease inhibitor genes in the regulation of programmed cell death in plants. Plant Cell, 11, 431^443.

174. Sondergaard T.E., Schulz A. and Palmgren M.G. (2004) Energization of transport processes in plants. Roles of the plasma membrane H+-ATPase. Plant Physiol., 136, 2475-2482.

175. Sumimoto H. (2008) Structure, regulation and evolution of Nox-family NADPH oxidases that produce reactive oxygen species. FEBS J., 275, 3249-3277.

176. Sun Y.-L., Zhu H.-Z., Zhou J., Dai Y.R., Zhai Z.-H. (1999) Menadione-induced apoptosis and the degradation of lamin-like proteins in tobacco protoplasts. Cell. Mol. Life Sci., 55, 310-316.

177. Takatsuka, C., Inoue, Y., Matsuoka, K., and Moriyasu, Y. (2004) 3-Methyladenine inhibits autophagy in tobacco culture cells under sucrose starvation conditions. Plant Cell Physiol., 45, 265-274.

178. Taylor R.C., Cullen S.P. and Martin S.J. (2008) Apoptosis: controlled demolution at the cellular level. Mol. Cell Biol., 9,231-241.

179. Tenhaken R., Levine A., Brisson L.F., Dixon R.A. and Lamb C. (1995) Function of the oxidative burst in hypersensitive disease resistance. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 92, 4158^1163.

180. Tewari R.K., Hahn E.J., Paek K.Y. (2008) Function of nitric oxide and superoxide anion in the adventitious root development and antioxidant defence in Panax ginseng. Plant Cell, 27, 563-573.

181. Thordal-Christensen H„ Zhang Z.G., Wei Y.D., Collinge D.B. (1997) Subcellular localization of H202 in plants. H202 accumulation in papillae and hypersensitive response during the barley-powdery mildew interaction. Plant J., 11, 1187-1194.

182. Tirone F„ Cox J.A. (2007) NADPH oxidase 5 (NOX5) interacts with and is regulated by calmodulin. FEBSLett., 581, 1202-1208.

183. Torres M.A. and Dangle J.L. (2005) Functions of the respiratory burst oxidase in biotic interactions, abiotic stress and development. Cur. Opin. in Plant Biol, 8, 397^03.

184. Torres M.A., Danyl J.L., Jones JDG (2002) Arabidopsis gp91phox homologues AtrbohD and AtrbohF and required for accumulation of reactive oxygen intermediates in the plant defense response. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99,517-522.

185. Torres M.A., Onouchi H., Hamada S., Machida C., Hammond-Kosack K.E., Jones J.D. (1998) Six Arabidopsis thaliana homologues of the human respiratory burst oxidase (gp91phox). Plant J., 14, 365-370.

186. Tossi V., Lamattina L., Cassia R. (2009) A possible mechanism for the apocynin-induced nitric oxide accumulation in plants. Plant Signal Behav., 9, 880-882.

187. Tsiatsiani L., Van Breusegem F., Gallois P., Zavialov A., Lam E., Bozhkov P.V. (2011) Metacaspases. Cell Death Differ., 18, 1279-1288.

188. Van den Worm E. (2001) Investigation on apocynin, a potent NADPH oxidase inhibitor. Ph.D., Utrecht.

189. Van der Biezen E.A., Jones J.D. (1998) Plant disease-repsistance proteins and the gene-for-gen concept. Trends Biochem. Sci., 23, 454-456.

190. Van Doom W.G. (2011) Classes of programmed cell death in plants, compared to those in animals. J. Exp Bot., 62, 4749—4761.

191. Van Doom W.G., Woltering E.J.(2008) Physiology and molecular biology of petal senescence. J. Exp. Bot., 59(3), 453-480.

192. Van Gestelen P., Asard H. and Caubergs R.J. (1997) Solubilization andseparation of plant plasma membrane NADPH-02" synthase from other NAD(P)H oxidoreductases. Plant Physiol, 115, 543-550.

193. Van Gurp M., Festjens N., van Loo G., Saelens X., Vandenabeele P.2003) Mitochondrial intermembrane proteins in cell death. Biochem. Biophys. Res. Comm., 304, 487^97.

194. Vanyushin B.F., Bakeeva L.E., Zamyatnina V.A., Aleksandrushkina N.I.2004) Apoptosis in plants: specific features of plant apoptotic cells and effect of various factors and agents. Int Rev Cytol, 233, 135-79.

195. Vartapetian A.B., Tuzhikov A.I., Chichkova N.V., Taliansky M., Wolpert T.J. (2011) A plant alternative to animal caspases: subtilisin-like proteases. Cell Death Differ., 18, 1289-1297.

196. Vercammen D., Declercq W., Vandenabeele P., and Van Breusegem F. (2007) Are metacaspases caspases? J. of Cell Biol, 179, 375-380.

197. Verhagen A.M., Ekert P.G., Pakusch M„ Silke J., Connolly L.M., Reid G.E., Moritz R.L., Simpson R.J., Vaux D.L. (2000) Identification of DIABLO, amammalian protein that promotes apoptosis by binding to an antagonizing IAP proteins. Cell, 102,43-53.

198. Vetter J. (2000) Plant cyanogenic glycosides. Toxicon, 38, 11-36.

199. Vianello A. and Macri F. (1991) Generation of superoxide anion and hydrogen peroxide at the surface of plant cells. J. Bioenerg. Biomembr., 23, 409-423.

200. Vinogradov A.D. and Grivennikova V.G. (2005) Generation of superoxide-radical by the NADH:ubiquinone oxidoreductase of heart mitochondria. Biochemistry (Mosc), 70, 120-127.

201. Wan L., Xia Q., Qui X., Selvaraj G. (2002) Early stages of seed development in Brassica napus: a seed coat-specific cysteine proteinase associated with programmed cell death of the inner integument. Plant J., 30, 1-10.

202. Wang H.L.J., Bostock R.M., Gilchrist D.G. (1996) Apoptosis: a functional paradigm for programmed plant cell death induced by a host-selective phytotoxin and invoked during development. Plant Cell, 8, 375-391.

203. White S., Mclntyre M., Beny., McNeil B. (2002) The autolysis of industrial filamentous fungi. Crit. Rev. Biotechnol., 22, 1-14.

204. Wildermuth M.C., Dewdney Ju., Wu G., Ausubel F.M. (2001) Isochorismate synthase is required to synthesize salicylic acid for plant defence. Nature, 414, 562-565.

205. Winterbourn, C.C. (2008) Reconciling the chemistry and biology of reactive oxygen species. Nature Chem. Biol., 4, 278-286.

206. Wollman F.-A. (2001) State transitions reveal the dynamics and flexibility of the photosynthetic apparatus. EMBOJ., 20, 3623-3630.

207. Woltering E.J., van der Bent A., Hoeberichts F.A. (2002) Do plant caspases exist7 Plant Physio!., 130, 1764-1769.

208. Wong H.L., Pinontoan R., Hayashi K., Tabata R., Yaeno T., Hasegawa K., Kojima C., Yoshioka H., Iba K., Kawasaki T., Shimamoto K. (2007) Regulation of rice NADPH oxidase by Rac GTPase to its N-terminal extension. Plant Cell., 19, 4022-4034.

209. Wu H. and Cheung A.Y. (2000) Programmed cell death in plant reproduction. Plant Mol. Biol., 44, 267-281.

210. Xing T. Higgins V.J. and Blumwald E. (1997) Race specific elicitors of CJadosporium fulvum promote translocation of cytosolic components of NADPH oxidase to the plasma membrane of tomato cells. Plant Cell., 9, 249-259.

211. Yaeno T., Matsuda O. and Iba K. (2004) Role of chloroplast trienoic fatty acids in plant disease defense responses. Plant J., 40, 931-941.

212. Yamazaki, I. and Yokota, K. (1973) Oxidation states of peroxidase. Mol. Cell Biochem., 2, 39-52.

213. Yao N., Eisfelder B.J., Marvin J. and Greenberg J.T. (2004) The mitochondrion—an organelle commonly involved in programmed cell death in Arabidopsis thaliana. Plant J., 40, 596-610.

214. Yokota, K. and Yamazaki, I. (1977) Analysis and computer simulation of aerobic oxidation of reduced nicotinamide adenine dinucleotide catalyzed by horseradish peroxidase. Biochemistry, 16, 1913-1920.

215. Yoshimori T., Yamamoto A., Moriyama Y., Futai M. and Tashiro Y. (1991) Bafilomycin Al, a specific inhibitor of vacuolar-type H+-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells. J. Biol Chem., 266, 17707-17712.

216. Выражаю глубокую признательность моему руководителю Самуилову В.Д. за помощь в выборе темы исследования, планирование экспериментов и обсуждение полученных результатов.

Информация о работе

Несов, Артем Владимирович
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.01.05

Диссертация

Активные формы кислорода в гибели клеток растений - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы