Усовершенствование диагностики копытной гнили овец с помощью молекулярно-генетических методов

Алексеева, Светлана Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Усовершенствование диагностики копытной гнили овец с помощью молекулярно-генетических методов
ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование диагностики копытной гнили овец с помощью молекулярно-генетических методов"

АЛЕКСЕЕВА Светлана Викторовна

На правах рукописи.

Усовершенствование диагностики копытной гнили овец с помощью молекулярно - генетических методов

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 9 МАЙ 2011

Москва-2011

4846888

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени

К.И.Скрябина»

Научные руководители: Лауреат премии Совета Министров СССР,

доктор ветеринарных наук, профессор Сидорчук Александр Андреевич

доктор биологических наук, профессор Забережный Алексей Дмитриевич

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, доцент

Гнездилова Лариса Александровна

кандидат биологических наук Шмаров Максим Михайлович

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Московский

государственный университет прикладной биотехнологии»

Защита состоится « 2011 г. в «/¡О» часов

на заседании диссертационного совета Д.220.042.01 при ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина» по адресу: 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина»

Автореферат разослан « ЛеО^ 2011 г. и размещен

на сайте http://mgavm.ru

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Копытная гниль овец - это известная с 18-го

столетия инфекционная болезнь, которая с тех времен и по сей день

продолжает наносить ущерб овцеводческой отрасли во всём мире (Abbott

К.А., 2005; Buller Р., 2010).

Из-за культуральных особенностей Dichelobacter nodosus стандартная

бактериологическая методика идентификации возбудителя представляет

собой трудный, длительный и не всегда эффективный процесс. В

австралийских лабораториях процент проб патологического материала из

которых удается выделить первичные культуры D. nodosus, составляет всего

25-65% (Graham В., 2003).

Развитие молекулярных методик существенно облегчило и ускорило

(с 3 - 4 недель до одного дня) лабораторную диагностику D.nodosus.

Выявление и идентификацию D.nodosus проводят по гену 16S pPHK. (La

Fontaine S., 1993). Главное преимущество молекулярных методик, в том

числе ПЦР - чувствительность, специфичность, устранение от трудоемких,

длительных и не всегда успешных процедур выделения возбудителя (Petti

C.А., 2006; Woo P.C., 2008).

В настоящее время, все 10 известных серологических групп возбудителя можно идентифицировать с помощью ПЦР - амплификации гена фимбриальной субъединицы FimA (Dhungyel O.P., 2002; Wani S.A., 2006; Zhou H., 2001).

Для России актуальность разработки молекулярно-генетических методик несомненна. Российские лаборатории не обладают возможностями для проведения бактериологического и серологического исследования

D.nodosus, болезнь часто проходит под диагнозом некробактериоз. Современных методов диагностики копытной гнили овец в нашей стране нет.

Таким образом, усовершенствование диагностики копытной гнили овец с использованием молекулярно-генетических методов является своевременным и необходимым.

Цель работы: биологическая и молекулярно - генетическая характеристика штаммов £>.ио£?оли5 и разработка методик ПЦР для осуществления видовой идентификации и типирования возбудителя копытной гнили овец.

Задачи исследований:

1. Разработать методику ПЦР - анализа на основе амплификации гена 16Б рРНК йкИеЬЬаМег пойохт для видовой идентификации возбудителя из культуры.

2. Разработать методику ПЦР - анализа на основе амплификации гена /тА для типирования штаммов возбудителя.

3. Охарактеризовать молекулярно - генетически штаммы £)гс/ге/о6ас/ег

из коллекции ВИЭВ им. Я.И.Коваленко в сравнении с основными биологическими свойствами этих культур.

4. Разработать способы подготовки проб патологического материала для проведения ПЦР на основе амплификации гена 16Б рРНК для выявления и идентификации £НсИе1оЬааег пойозт без проведения культуральных исследований.

5. Оценить корреляцию данных филогенетического анализа ВккеЬЬаМег поэзия по гену /гтА и серологического метода РА (реакция агглютинации).

Научная новизна.

Охарактеризованы биологические и молекулярно - генетические свойства 17 штаммов БгсИеЬЬаМег пойо$т.

Проведена видовая идентификация реактивированных штаммов ОгсИеЬЬаМег пойо$т по гену 16Б рРНК и их типирование по гену/гтА.

Разработана новая методика пробоподготовки патологического материала, позволяющая выявлять и идентифицировать ЮккеЬЬаЫег по<1овш без проведения культуральных исследований на основе ПЦР -амплификации фрагмента гена 16Б рРНК.

Предложен новый фрагмент гена /тА, на основе которого проведен филогенетический анализ 15-ти штаммов Ллог&мг« и обнаружена корреляция генотипов с серотипами возбудителя.

Практическая значимость.

Охарактеризован молекулярно - генетически производственный штамм ПП 82/90 D¡c/гe/o¿acíer логйми$, применяемый для производства вакцины «Овикон».

Проведена реактивация штаммов после 20-ти летнего

хранения в лиофилизированном виде, изучена их жизнеспособность, сохранение морфологических, тинкториальных и культуральных свойств.

Разработана методика ПЦР, позволяющая с помощью амплификации фрагмента гена 16Б рРНК с высокой специфичностью и чувствительностью осуществлять видовую идентификацию возбудителя - В.пос1овш в лабораторных условиях без предварительного культивирования.

Разработаны «Методические указания по идентификации возбудителя копытной гнили овец с помощью амплификациии фрагмента гена 16Б рРНК методом ПЦР», утвержденные Научно - методическим советом МГАВМиБ 1 апреля 2011 г. и предназначенные для использования в научно -исследовательских учреждениях, проводящих работы по изучению О.посЬйш и молекулярной диагностике копытной гнили овец, а также для диагностических (или производственных) ветеринарных лабораторий.

Личный вклад соискателя.

Личный вклад соискателя заключается в организации и проведении бактериологических, молекулярно-генетических исследований, а также анализе и обобщении результатов работы.

Апробация работы.

Материалы работы доложены на Международной научно -практической конференции по современным методам диагностики, профилактики и терапии заразных и незаразных болезней животных (г. Ставрополь, 2009 г.), Международной научно - практической конференции,

посвященной 90-летию МГАВМиБ (г. Москва, 2009 г.) Результаты работы включены в годовые отчеты по НИР кафедры эпизоотологии и инфекционных болезней МГАВМиБ в 2008-2010 гг.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 7 научных статей, в том числе в 3-х изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации.

Материалы диссертации изложены на 147 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных результатов и их обсуждения, выводов, приложения и списка использованной литературы, включающего 228 источников (в т.ч. 188 иностранных). Работа содержит 12 таблиц и 23 рисунка.

Основные положения выносимые на защиту:

1. Методика видовой идентификации Dichelobacter nodosus с помощью амплификации фрагмента гена 16S рРНК методом ПЦР в культуре или патологическом материале,

2. Методика типирования штаммов Dichelobacter nodosus с помощью амплификациии фрагмента гена fimA.

3. Реактивация и исследование биологических и молекулярно -генетических свойств штаммов Dichelobacter nodosus из коллекции ВИЭВ им. Я.И.Коваленко.

4. Разработка способа подготовки проб патологического материала для проведения ПЦР на основе амплификации гена 16S рРНК для выявления и идентификации Dichelobacter nodosus без проведения культуральных исследований.

5. Филогенетический анализ штаммов Dichelobacter nodosus на основе нуклеотидной последовательности вариабельного фрагмента гена fimA и сравнение с результатами серологического метода РА.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на кафедре эпизоотологии и инфекционных болезней Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина», ПЦР и секвенирование проводились в лаборатории молекулярной диагностики Государственного учреждения "Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского», а реактивация коллекции штаммов D.nodosus - в лаборатории микробиологии Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (ВИЭВ).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Бактерии. В работе использовались 27 штаммов Dichelobacter nodosus из коллекции бактерий лаборатории инфекционных болезней овец ВИЭВ им. Я.И.Коваленко, выделенных в 1970-80-е гг. на территории бывшего СССР (И.Н. Семенова, A.A. Сидорчук, A.M. Бектемиров). Также в исследованиях применяли производственный штамм ПП 82/90, использующийся на Ставропольской биофабрике для изготовления вакцины «Овикон» (депонированный во ВГНКИ). Все исследуемые штаммы хранились в лиофилизированном виде в запаянных (под вакуумом) ампулах.

Для определения специфичности ПЦР применялись 10 штаммов различных видов бактерий (E.coli, S.aureus, B.subtilis, C.perfringens, C.septicum, P.aeuroginosa, A.pyogenes, S.zooepidermicus, F.necrophorum, F.nucleatum).

Для генетических исследований использовались нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК и fimA референтных штаммов D.nodosus из Международного банка генов NCBI (США), всего 61 штамм.

Патологический материал. Доставлялся из неблагополучного хозяйства Ставропольского края.

Олигонуклеотидные праймеры. Для амплификации фрагмента гена 16S рРНК D.nodosus применялись праймеры, сконструированные S.L. Fontaine (1993).

Для амплификации фрагмента гена FimA D.nodosus применялись праймеры, сконструированные Н. Zhou (2000).

Культивирование D.nodosus. Ампулы со штаммами бактерий вскрывали в условиях бокса или ламинарного бокса и делали посевы на полужидкую тиогликолевую среду (Хаймедиа, Индия, кат. № М009-500), инкубировали при температуре 37°С в течение 3-4 суток.

С полужидкой среды колонии D.nodosus пересевали на плотную питательную среду (2,5% кровяной агар на тиогликолевой основе, содержащий 10% дефибринированной крови лошади) в чашки Петри, инкубировали при 37°С в течение 4-6 суток в анаэробных условиях.

Амплификация ДНК. ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (ДНК-Технология, Россия) в конечном объеме 25 мкл, содержащем: 10 пМ каждого праймера, 0,25 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 1,25 ед. Taq-полимеразы, 10 мМ трис-HCl (pH 9,0), 50 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl2, 0,1% тритон Х-100 и 5 мкл исследуемого препарата ДНК. Для амплификации фрагмента гена 16S рРНК (длиной 783 н.п.) и фрагмента гена FimA (длиной около 440 н.п.) D.nodosus использовали одинаковые температурно - временные режимы (1-й цикл: 95°С - 2 минуты, 56°С - 25 секунд; 72°С - 1 минута (xl); 2-й цикл: 94°С - 30 секунд, 56°С - 25 секунд, 72°С - 50 секунд (><35)).

Детекция результатов ПЦР. Осуществлялась методом горизонтального электрофореза в 1% агарозном геле в трис - ацетатном буфере (pH 8.5), содержащем бромистый этидий в концентрации 0,4 - 0,5 мкг/мл. Гели просматривали с помощью трансиллюминатора. Размеры амплифицированных фрагментов оценивали в сравнении с ДНК-маркером GeneRulertra 100 bp DNA Ladder Plus (Fermentas, Литва).

Секвенирование. Амплифицированные фрагменты вырезали из геля и выделяли ДНК с использованием набора «DNA Extraction Kit» (Fermentas, Литва) по методике производителя. Для секвенирования ДНК по двум цепям использовали те же праймеры, что и для проведения ПЦР. Нуклеотидную последовательность определяли по методу Сэнгера при помощи секвенирования ПЦР - продукта с использованием набора «Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit» (Applied Biosystems, США) согласно инструкции изготовителя.

Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей и построение филогенетических дендрограмм. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакетов программ BioEdit (version 7.0.0. Copyright © 1997-2004, Ibis Biosciences, США) и программы SeqMan из пакета программ Lasergene (version 7.1.0. (44) Copyright © 1993-2006, DNASTAR, Inc., США). Филогенетические дендрограммы были построены при помощи программы MegAlign из пакета программ Lasergene (version 7.1.0.(44) Copyright © 1993-2006, DNASTAR, Inc., США). Сравнительный компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей и праймеров осуществляли с помощью программы BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Разработка метода ПЦР - амплификации фрагментов гена 16S рРНК для идентификации возбудителя копытной гнили овец D.nodosus

Ген 16S рРНК бактерий достаточно консервативен, однако имеет видоспецифические фрагменты, в мировом опыте он используется для видовой идентификации (Petti С.А., 2006; Woo P.C., 2008). В геноме D.nodosus ген 16S рРНК представлен тремя копиями, что позволяет значительно увеличить чувствительность ПЦР (Fontaine S.L., 1993).

Разработку метода ПЦР - амплификации гена 16Б рРНК осуществляли на производственном штамме Лиоя'ап«' ПП 82/90. Штамм культивировали в полужидкой питательной среде и на плотной питательной среде.

Этап выделения нуклеиновых кислот важен для успешного проведения ПЦР. Универсальным способом экстракции ДНК £>. пос1о.%-т явился фенольно - хлороформный способ, который позволял получить препарат высокой чистоты и концентрации, пригодный для проведения ПЦР из культур в полужидкой питательной среде, с плотной питательной среды, а также из штаммов в лиофилизированном виде.

Высокая специфичность выбранных олигонуклеотидов для амплификации видоспецифичного для ЛиогАиг« фрагмента гена 16Б рРНК была подтверждена теоретически - сравнительным компьютерным анализом, и экспериментально (Рис.1).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 13 14 М

^— 1400

ЁЯн^Н^^^^^^^Н^^^^^^^НН^^^Ш4— 1000

783 н.п.-► В !

Рис.1. Электрофореграмма результатов определения специфичности ПЦР для амплификации фрагмента гена 16S рРНК D.nodosus длиной 783 н.п. с использованием праймеров NOD F и NOD R. Треки: 1 - положительный контроль (ДНК D.nodosus производственного штамма ГШ 82/90); 2 -ДНК D.nodosus в патматериале; 3 -ДНК здорового копытного рога; 4 - ДНК E.coli; 5 - ДНК S.aureus\ 6 - ДНК B.subtilis\ 1 -ДНК C.perfringens\ 8 - ДНК C.septicum\ 9 - ДНК P.aeuroginosa; 10 - ДНК A.pyogenes; 11 -ДЬЖ S.zooepidermicus; 12 - ДНК F,necrophorum\ 13 - ДНК F. nucleatum; 14 -отрицательный контроль (НгО); М -ДНК-маркер (от 100 до 1400 н.п.). Треки 3-14 -отрицательный результат.

При оптимизации условий проведения ПЦР для получения надежной работы праймеров тестировали следующие параметры: концентрация ионов магния, температура отжига праймеров, временные режимы проведения ПЦР. Было установлено, что разработанные праймеры работают

специфически в реакционной смеси со стандартной концентрацией Г^СЬ (1,5 мМ), а положительные результаты амплификации получены в диапазоне температур от 52°С до 57°С.

Определение чувствительности разработанной ПЦР проводилось путем титрования культуры О.подохив, определения количества бактериальных клеток (геномных копий) в пробе, выделения ДНК из проб фенольно-хлороформным методом и использования её в качестве матрицы для проведения ПЦР.

1 2 3 4 5 6 7 M

-1400 н.п.

_ • 1000 н.п.

783 н.п.

500 н.п. 100 н.п.

Рис.2. Электрофореграмма результатов определения чувствительности ПЦР для амплификации фрагмента гена 16S рРНК D.nodosus длиной 783 н.п. с использованием праймеров NOD F и NOD R. Матрица - ДНК D.nodosus штамма ПП 82/90. Треки: 1-6) серийные разведения ДНК D.nodosus; 1) 29х 106 копий в пробе; 2) 29*105 копий в пробе; 3) 29><104 копий в пробе; 4) 29*103 копий в пробе; 5) 29х102 копий в пробе; 6) 29x10 копий в пробе; 7) 29 копий в пробе; M - ДНК-маркер (от 100 до 1400 н.п).

По результатам этого исследования, можно заключить, что чувствительность метода ПЦР с использованием праймеров NOD F и NOD R составляет 290 бактерий в пробе (геномных копий) (Рис. 2).

В ходе исследований разработанной ПЦР был подтвержден вид производственного штамма ПП 82/90, как D.nodosus.

Разработка метода ПЦР - амплификации вариабельного фрагмента гена fimA D.nodosus для типирования штаммов

Современные программы по ликвидации копытной гнили овец

основаны на применении моноштаммовых вакцин, специфичных серологической группе эпизоотического штамма D.nodosus, что требует её точного определения (Dhungyel O.P., 2008). Стандартным методом

определения серологической группы является РА (реакция агглютинации), которая основана на агглютинации фимбрий бактерии. Однако, кроме выделения культуры возбудителя для проведения этой серологической реакции необходим полный набор специфических сывороток, которых сейчас нет в России. Выходом из этой ситуации является разработка генотипирования, основанного на ПЦР - амплификации гена /¡тА, кодирующего фимбриальные субъединицы.

Исследования по разработке метода ПЦР — амплификации гена /¡тА для типирования Имойовиз также проводились на производственном штамме ПП 82/90. Подготовка диагностического материала путем наращивания бактериальной массы и метод выделения ДНК были такими же, как в предыдущем разделе.

Подобранные нами праймеры охватывали все десять известных серогрупп возбудителя и после амплификации предполагали севенирование полученных ампликонов с проведением дальнейшего сравнительного компьютерного анализа полученных нуклеотидных последовательностей с референтными последовательностями гена /¡тА, размещенными в Международном банке генов (ЫСВ1, США). Для данных праймеров была проверена теоретическая специфичность с помощью сравнительного компьютерного анализа. Было установлено, что праймеры не гибридизуются с неспецифическими нуклеотидными последовательностяхми других микроорганизмов.

При оптимизации условий проведения ПЦР для получения надежной работы праймеров подбирались следующие параметры: концентрация ионов магния, температура отжига праймеров, временные режимы проведения ПЦР. Было установлено, что праймеры работают специфически в реакционной смеси со стандартной концентрацией М§С12 (1,5 мМ). Оптимальной для отжига этих праймеров явилась температура в 56 - 62°С.

— 1400 н.п.

— 1000 н.п.

— 100 н.п.

Рис.3. Электрофореграмма результатов определения чувствительности ПЦР с праймерами FimA-DH-F и FimA-DH-R для амплификации фрагмента гена FimA D.nodosus длиной 440 н.п. на матрице ДНК D.nodosus штамма ПП 82/90. Треки: 1-6) серийные разведения ДНК D.nodosus; 1) 29х 106 копий в пробе; 2) 29х 105 копий в пробе; 3) 29x104 копий в пробе; 4) 29><103 копий в пробе; 5) 29x102 копий в пробе; 6) 29x10 копий в пробе; M - ДНК-маркер (от 100 до 1400 н.п).

По результатам оценки чувствительности ПЦР для амплификации фрагмента гена FimA D.nodosus было установлено, что чувствительность метода составляет 2900 геномных копии бактерии в пробе (Рис.3).

В ходе проведения разработки ПЦР для генотипирования производственного штамма D.nodosus ПП 82/90 была определена его серогруппа - Н, и серовариант - Hi.

Реактивирование, изучение жизнеспособности, сохранности морфологических, тинкториальных и культуральных свойств, а также молекулярно - генетическое исследование 27 штаммов Dichelobacter nodosus из коллекции ВИЭВ им. Я.И.Коваленко

Единственная в России коллекция содержит 27 штаммов D.nodosus,

которые были лиофилизированы в 1988 - 91 гг. Серотипирование этих штаммов в РА было проведено однократно, с помощью сывороток фирмы Coopers Animal Health N.Z. ltd. (Сидорчук A.A., Семенова И.Н., 1987). Реактивацию штаммов мы начинали с наиболее поздней сушки, а в случае неудачи проводили посевы более ранних сушек. Следует отметить, что проведение реактивации настолько старых лиофилизированных культур D.nodosus проводилось впервые, данных по жизнеспособности таких штаммов не было ни в отечественной, ни в зарубежной литературе.

Первичные посевы проводили на полужидкую тиогликолевую среду. Эти культуры росли в виде комочков ваты, часто с точечными вкраплениями различной величины и количества в разных частях пробирки, накопление культуры было слабое. При микроскопии таких культур в основном наблюдалось сохранение морфологических и тинкториальных свойств возбудителя, но часть клеток всё же были деформированными, плохо прокрашенными, изъеденными, овальными. Повторный пассаж таких культур значительно усиливали рост возбудителя, а также улучшал морфологические и тинкториальные свойства. Интересно, что на начальных этапах реактивации нами не наблюдался характерный для D.nodosus рост в виде ярко выраженных штрихов или «комет». При подтверждении хорошего роста и наличии характерного возбудителя, культуры пересевали на плотную питательную среду для определения культуральных свойств возбудителя на ней, а также наращивания биомассы возбудителя для дальнейшего проведения молекулярно-генетических исследований. Оценка роста проводилась визуально и микроскопией мазков. Рост культур чаще всего был в виде беловатых росинчатых колоний гладкого типа, довольно слабый, некоторые штаммы не удалось вырастить именно на этом этапе. Были штаммы, дававшие шероховатый тип колоний (Р-86, Войтик, Каз-9). После микроскопии характерных колоний и подтверждения наличия грамотрицательных палочек с утолщениями на концах, колонии использовались для молекулярно - генетического исследования. Если штамм давал хороший рост на плотной среде, выделение ДНК D.nodosus осуществлялось с помощью триреагента (Molecular Reasearch Center, Ins.Cincinnati, США) по методике производителя. При отсутствии роста на плотной среде и наличии роста на полужидкой среде, ДНК получали прямым внесением 5 мкл этой среды в ПЦР-смесь, а в случае неудачи осуществляли выделение фенольно-хлороформным способом.

Идентификацию вида возбудителя проводили с помощью пары праймеров NOD F и NOD R для амплификации участка гена 16S рРНК. Все

жизнеспособные штаммы в этом исследовании были идентифицированы как £).иос?о5М5 с использованием разработанной ПЦР (таблица 1).

После ПЦР - амплификации вариабельного фрагмента гена /ипА, секвенирования полученных ДНК - фрагментов и сравнения их нуклеотидных последовательностей с референтными последовательностями Международного банка генов (ЫСВ1, США) удалось получить 17 нуклеотидных последовательностей вариабельных участков гена $тА и осуществить типирование штаммов й.п ос1о$ш.

Таблица 1.

Результаты амплификации методом ПЦР фрагментов генов 16Б рРНК и ___ /1тА у штаммов _

№ п/п Название штамма Идентифика ция по 168 рРНК (видовая) Серогруппа в РА Генотипирование по р^тА (группоспецифичное)

1 Л-83 + В, В,

2 СМ-6884 + в4 н,

3 О?-6858 + В4 н,

4 Знамя труда + - В,

5 Войтик + не определена В,

6 Каз-9 + в4 Е

7 А-86 + не определена в2

8 Э-1 + в Е

9 Б-82 + В4 н,

10 Львов + не определена н,

11 Р - 86 + не определена В,

12 Б - 7 + в4,н н,

13 КЯ-82 + в4 В

14 Т - 80 + в4 н,

15 Яг + не определена В,

16 К- 8 + в4 н,

17 КЧ-82 + Н н,

Примечание: «+» - положительный результат.

По результатам молекулярно-генетической экспертизы удалось идентифицировать как Л/гогЛмш1 все 17 штаммов (100%), взятых в анализ, генотипировать - также 17 штаммов (100%), в том числе те, которые не были серотипированы ранее в РА. Было установлено, что 8 штаммов принадлежат к генотипу Н (47%), 7 - к генотипу В (41,2%) и 2 штамма к генотипу Е (11,8%). При этом только один штамм полностью совпадает по серогруппе и

сероварианту с генотипом (Л-83). У 3-х штаммов (Б-7, КЯ-82, КЧ-82) наблюдалось частичное совпадение, только по серогруппе. У 6-ти штаммов типирование в РА не проводилось и наши данные были получены впервые. У 7-ми штаммов не совпадают ни серогруппа, ни соответственно, серовариант с установленным генотипом (таблица 1).

Анализ результатов серологического и генетического типирования имеющихся у нас штаммов не показал высокой корреляции. О причинах расхождения этих методов можно дискутировать. Генотипирование предполагает более детальную характеристику амплифицированных участков генома и их оценку с помощью большего количества различных методик, по сравнению с серологическим методом, используемым для характеристики данных штаммов.

Разработка способов подготовки проб патологического материала для выявления ДНК D.nodosus методом ПЦР

В случае копытной гнили овец поражения локализуются

исключительно на копытцах животного. Из нескольких вариантов пробоподготовки патологического материала после проведения ПЦР с видоспецифичными праймерами NOD F и NOD R наилучшие результаты были получены из проб пораженных копытец вынужденно убитых больных овец. Для взятия патологического материала после вынужденного убоя больной копытной гнилью овцы отрезали копытце животного, помещали в стерильный полиэтиленовый пакет и ставили в лед. В таком виде материал доставляли в лабораторию в течение 24 часов. Если время доставки было 1-2 суток, копытце замораживали и везли во льду. В асептических условиях в стерильной ступке, отдельной для каждой пробы, пораженные ткани растирали в 0,9% растворе NaCl до получения непрозрачной суспензии. В работу брали жидкую часть этой суспензии, крупные частицы оставляли в ступке. В полученные таким образом пробы добавляли лизоцим в количестве 4 мг/мл и инкубировали при 4°С 2 часа для лизиса.

Выделение ДНК из всех проб проводили фенольно-хлороформным способом. Классическим методом постановки диагноза служило подтверждение клинического заболевания результатами микроскопии с нахождением феномена «Бевериджа». Положительный результат ПЦР подтверждали секвенированием ПЦР - фрагмента и сравнительным компьютерным анализом его нуклеотидной последовательности.

Таким образом, у 10-ти образцов патологического материала взятых и обработанных нашим способом после проведения ПЦР с видоспецифичными праймерами NOD F и NOD R был идентифицирован вид возбудителя -D.nodosus, что во всех случаях коррелировало с классическим методом постановки диагноза и было подтверждено секвенированием полученных ПЦР - фрагментов.

Проведение филогенетического анализа штаммов Dichelobacter по Jos us

по гену fimA

Для изучения эволюционной истории, установления родственных связей нами были исследованы фрагменты гена fimA 15-ти штаммов D.nodosus. Было установлено, что предложенный нами участок ДНК в виде вариабельного фрагмента гена fimA D.nodosus, отграниченного в начале прямыми праймерами, а в конце стоп - кодоном, позволяет точно распределять генотипы возбудителя в пределах образующихся кластеров.

Для соблюдения точной кластерной топологии дендрограммы, а также определения эволюционных связей с изолятами из других стран, в анализ были добавлены еще 23 референтные нуклеотидные последовательности гена fimA всех 10 серогрупп возбудителя из базы данных Международного банка генов (NCBI, США). Все добавленные последовательности были выровнены соответственно выбранному нами анализируемому фрагменту.

Обнаруживается значительная эволюционная дистанция между кластерами под номерами 1-8 и кластерами 9,10, что совпадает с подразделением всех серогрупп D.nodosus на два больших класса -1 и II (Рис.

ки_к-вв_(В1).гв[1 Яи_КУАгВ2_{В2).ввд

_Г АР145218 (В).зва

Г"— Еи88444О (В)звч

АР145222 СВ).веч •- 45217 СА).з«ч

- АУ835827(А)8вд <4-254743(1 >.684 АУ835837 {Ц.зеч АР14В887(Е).геа М32230 (Е).ввч яи Е-1 (Е) геч

АУВ35833(Е).зеч

АР146888 СРУэея Х52408 (р) зеч - АР148389 (Щавя АР038920 (М).зея _(- АЛ 46884 (О зеч АУ835829 (С).зея АР14688в(С)8ВЧ '— АУ83583а (С).звд рги_В-7_гН1).5есз рги_1.УОУ_(Н1).зед - С1М-6858 (Н1),зея С\-6984 {Н"1 ).8ер Ии_В-82_СН1).5ея

ни_рр_В2-эа (Н1).зеч 1 (ги_Т-80_{Н1).®ея

АР146В90 (Н).«еч Х52390 СН).евц

- Еи884441 (Н).зеч

г- АР316610 (0) 384 ' Х52389 (О).гед

нуклеотидные замены (хЮО)

Рис.4. Дендрограмма, на основе анализа нуклеотидной последовательности вариабельного фрагмента гена ПтА (длиной около 400 н.п.), показывающая степень филогенетического родства 15-ти депонированных в РФ штаммов (обозначены названия и серовариант) и 23-х референтных штаммов О.по<1о$и$ из Международного банка генов (N081, США) (обозначены номера доступа в базе данных). Цифры в узлах дендрограммы обозначают кластеры (серогруппу и генотип): 1) В; 2) А; 3) I; 4) Е; 5) Б; б) М; 7) С; 8) О; 9) Н; 10) Г).

Наименьшие эволюционные дистанции наблюдаются внутри кластеров, между штаммами одной серогруппы, и тем более сероварианта. К генетически гетерогенным группам можно отнести кластеры В, Н и в некоторой степени - Е. Литературные данные и результаты наших исследований подтверждают преобладание возбудителей данных серогрупп в мире, все они выделены из эпизоотических очагов болезни. Есть на дендрограмме и кластеры скорее энзоотических штаммов, чем вызывающих активные эпизоотические очаги. Так, кластеры А, I, О, в, С являются генетически устойчивыми и менее эпизоотически значимыми.

ВЫВОДЫ

1. Разработана методика ПЦР на основе амплификации фрагмента гена 16Б рРНК, которая позволяет с высокой специфичностью и чувствительностью проводить видовую диагностику культуры возбудителя копытной гнили овец - ВгсЬе\оЬас1ег пойовив.

2. Разработана методика на основе ПЦР - амплификации, последующего секвенирования и сравнительного компьютерного анализа вариабельного фрагмента гена/1тА, для типирования штаммов на 10 групп и 19 вариантов £>гс/ге/о6ас/ег повода без использования серологических методов.

3. Показана возможность реактивации штаммов ЮккеЬЪа^ег пос1о5ш после 20-летнего хранения в лиофилизированном виде с сохранением культурально - морфологических свойств и определения их вида и генотипа с помощью молекулярно - генетических методов.

4. Разработан способ подготовки проб патологического материала, для проведения ПЦР на основе амплификации гена 16Б рРНК для выявления и идентификации ОгсИеЬЬ^ег пойоть без проведения культуральных исследований.

5. Проведен филогенетический анализ на основе нового предложенного фрагмента гена _/?тА ВкИе1оЬас1ег пойоът, который показал корреляцию между серогруппами и генотипами возбудителя.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

На основании проведенных исследований разработана для практического использования методика ПЦР, позволяющая с высокой специфичностью и чувствительностью осуществлять видовую идентификацию возбудителя - О.пойойш без проведения культуральных исследований.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

Для использования способа в научно - исследовательских учреждениях, проводящих работы по изучению О.пойовиз и молекулярной диагностике

копытной гнили овец, а также для диагностических (или производственных) ветеринарных лабораторий разработаны «Методические указания по идентификации возбудителя копытной гнили овец с помощью амплификации фрагмента гена 16S рРНК методом ПЦР», утвержденные Научно -методическим советом МГАВМиБ 1 апреля 2011 г.

ОПИСОК ОПУБ1ЛИКОВ АННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Алексеева C.B. Выбор вектора для синтеза рекомбинантного белка пилина Dichelobacter nodosus / Вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии: Сборник научных трудов молодых ученых. - М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ. -2009.-Вып. 5.-С. 115-119.

2. Сидорчук A.A., Забережный А.Д., Алексеева C.B. Молекулярная эпизоотология: возможности и перспективы / Актуальные проблемы ветеринарной медицины: Сб. науч. тр. - М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ. -2009. - С. 223 - 229.

3. Молекулярное типирование и филогенетический анализ возбудителя копытной гнили овец / Панасюк С.Д., Алексеева C.B., Сидорчук A.A. и др. / Современные методы диагностики, профилактики и терапии заразных и незаразных болезней животных: сборник научных статей по материалам Международной научно-практической конференции. - Ставрополь: - 2009. -С. 8-13.

4. Структурные и функциональные особенности пилей Dichelobacter nodosus. Синтез белка пилина D.nodosus в различных рекомбинантных штаммах бактерий / Забережный А.Д., Грабовецкий В.В., Панасюк С.Д., Алексеева C.B. / Молекулярная генетика, вирусология и микробиология. -2009. - № 4. - С. 3 - 6.

5. Изучение жизнеспособности лиофилизированных штаммов Dichelobacter nodosus / Соколов М.Н., Соколова H.A., Сидорчук A.A., Панасюк С.Д., Алексеева C.B. / Труды ВИЭВ. - 2010. - Т.76. - С. 109 -111.

6. Ассоциированные вакцины «Нековак» и «Овикон» в системе мероприятий по профилактике и борьбе с инфекционными болезнями конечностей крупного и мелкого рогатого скота / Панасюк, С.Д., Сидорчук A.A., Алексеева C.B. и др. / Ветеринария. - 2010. - № 8. - С. 7 -10.

7. Типирование Dichelobacter nodosus по гену fimA / Алексеева C.B., Панасюк С.Д., Забережный А.Д. и др. / Ветеринария. - 2011. - № 5. - С. 27 -29.

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25.09.2000 г. Подписано в печать 04.05.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,0 Печать авторефератов (495)730-47-74,778-45-60

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Алексеева, Светлана Викторовна

Список сокращений.

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Копытная гниль овец.

1.1.1. Общие сведения, распространение, экономическое значение.

1.1.2. Этиология.

1.1.3. Патогенез.

1.2. ОгскеЬЬаМег пойовш.

1.2.1. Номенклатура и таксономия.

1.2.2. Факторы вирулентности.

1.3. Диагностика копытной гнили овец.

1.3.1. Эпизоотологические данные.

1.3.2. Клинический диагноз.

1.3.3. Патологоанатомические признаки.

1.3.4. Лабораторный диагиоз.

1.3.5. Дифференциальный диагноз.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Усовершенствование диагностики копытной гнили овец с помощью молекулярно-генетических методов"

Актуальность темы. Копытная гниль овец — это известная с 18-го столетия инфекционная болезнь, которая с тех времен и по сей день продолжает наносить ущерб овцеводческой отрасли во всём мире. Со временем специалистами был накоплен большой опыт по лечению и проведению противоэпизоотических мероприятий, но, несмотря на все усилия, копытная гниль до сих пор остается наиболее распространенной и экономически значимой среди других болезней овец (45, 213).

Причины сложности борьбы с копытной гнилью многогранны и кроются, прежде всего, в сложности взаимодействия триады составляющих: возбудитель - окружающая среда - хозяин (82).

Другой проблемой, вплоть до наступления молекулярной эры, являлась бактериологическая диагностика возбудителя. Из-за культуральных особенностей В1ске1оЬа&ег пснЗояш стандартная методика представляла собой трудный, длительный и не всегда эффективный процесс, что тормозило изучение этиопатогенеза болезни и как следствие, создание эффективных мер борьбы. Так, до сих пор, в австралийских лабораториях процент проб патологического материала из которых удается выделить первичные культуры 0.пос1о8иБ, составляет всего 25-65% (115).

Последние десятилетия В.пос1о8т был центром обширного исследования во многих частях мира и, особенно, в Австралии, Новой Зеландии, Великобритании, Непале, Малайзии и Индии. В нашей стране период активного плодотворного изучения копытной гнили овец пришелся на 1970-90-е годы, центром которых был ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко. Наиболее значимыми результатами явились: создание коллекции штаммов В.пойоБт в ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко; выпуск первой вакцины, а затем ассоциированной инактивированной вакцины «Овикон»; разработка методик бактериологического и серологического исследований, способов лечения и схем ликвидации, отраженных в методических указаниях по лабораторной диагностике копытной гнили овец и инструкции о мероприятиях по борьбе с копытной гнилыо овец (18, 25).

Большинство развитых овцеводческих стран имеют программы по контролю и/или ликвидации копытной гнили овец при финансовой поддержке государства и производителей. Наиболее глобальный проект по изучению копытной гнили осуществляется под эгидой Австралийского Центра Международных Сельскохозяйственных Исследований (АС1А11) (75). Проект состоит из нескольких программ и срок его действия намечен с 1993 по 2022 год. В результате совместных усилий между непальскими, австралийскими и британскими учеными при участии в проектах АС1АЯ уже ликвидирована злокачественная форма копытной гнили в Непале и Бутане. С учетом достигнутых успехов и инвестиций в 1,5 миллиона австралийских долларов за весь срок существования проекта, экономическая выгода составит 2,8 миллиона австралийских долларов. С научной точки зрения проект доказал преимущество применения фимбриальных одно двуштаммовых вакцин, специфичных (аутогенных) для данной местности. Это означает, что для осуществления любых программ по ликвидации обязательно требуется знание серогрупповой принадлежности возбудителя и его вирулентности (т.к. промежуточные и авирулентные штаммы пока не нуждаются в контроле и ликвидации). Для осуществления этих целей в рамках проекта были показаны несомненные перспективы применения новых молекулярно-генетических методов для диагностики копытной гнили овец. Так, кроме уже распространенной ПЦР, была успешно опробована ИФА, которая может использоваться с целью выявления переболевших животных -бактерионосителей для предотвращения ввоза в благополучные местности.

В настоящее время разработка новых подходов к идентификации микроорганизмов связана с достижениями в области молекулярной генетики. Молекулярно-генетические методы, от стандартных бактериологических, отличаются высокой чувствительностью, быстротой выполнения и сравнительно низкой трудоемкостью, а применение полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяет получать положительные результаты при наличии в исследуемом материале единичных клеток возбудителя (157). Для диагностики копытной гнили овец молекулярно - генетические методы на сегодняшний день признаны наиболее точными и удобными для видовой идентификации и типирования возбудителя (117, 214, 154, 228).

Развитие ПЦР для амплификации видоспецифичных фрагментов 16S рРНК сделало процедуру выделения возбудителя ненужной для идентификации D.nodosus, укорачивая время лабораторной диагностики с 3 -4 недель до одного дня (140). Ген рибосомальной РНК (рРНК) — один из наиболее консервативных генов, значительную его часть занимают области, имеющие практически одинаковый нуклеотидный состав у различных микроорганизмов. Однако ген содержит и видоспецифичные вариабельные участки, амплификация которых с помощью ПЦР служит для идентификации микроорганизмов (166, 202).

С доступностью информации о последовательности гена фимбриальной субъединицы D.nodosus — fimA, традиционный метод определения серогруппы - РА, был замещен более эффективными молекулярно - генетическими диагностическими методами, такими как ПЦР с использованием группоспецифичных праймеров и проведение филогенетического анализа полученных нуклеотидных последовательностей. Главное преимущество этих разработок - быстрота, чувствительность, специфичность, устранение от трудоемких, длительных и не всегда успешных процедур выделения возбудителя (152, 228).

По мнению некоторых исследователей, борьба с копытной гнилью в дальнейшем также представляется проблематичной из-за вероятности появления изменений в геноме возбудителя. Доказана возможность трансформации in vitro штаммов D.nodosus из одной серологической группы в другую. Если в дальнейших исследованиях будет подтверждена такая конверсия в естественных условиях у пораженных копытной гнилыо овец, это объяснит встречающиеся неудачи при применении пилевых серогруппоспецифичных вакцин и еще более упрочит понимание в необходимости проведения постоянных молекулярно-генетических исследований эпизоотических штаммов Э.пойозиз (211).

Резюмируя вышесказанное, можно заключить, что основными направлениями в современном исследовании копытной гнили будут: изучение генетических основ вирулентности и на этой основе разработка ПЦР - систем для вытеснения ими стандартных тестов по определению вирулентности; создание и усовершенствование мультиплексных тест -систем ПЦР для проведения серогруппового анализа прямо из патологического материала, желательно непосредственно «в поле»; исследование возможностей для естественной трансформации генов В.пос1о8и8\ усовершенствование методики производства и применения аутогенных фимбриальных вакцин в различных регионах мира.

Для России актуальность разработки молекулярно-генетических методик несомненна. Российские лаборатории не обладают возможностями для видовой и серогрупповой диагностики копытной гнили овец, по многим причинам не проводится даже стандартное бактериологическое исследование. Болезнь до сих пор часто проходит под диагнозом некробактериоз. На фоне исторически достаточно сильной заболеваемости копытной гнилью в овцеводческих регионах, таких как Ставропольский край, Дагестан, Башкирия и других, нет возможностей для проведения эпизоотологического мониторинга болезни в стране. За весь период изучения болезни в России из молекулярных методов был разработан всего один — типирование с помощью ИФА (3). Он имел недостатки и распространения не получил, поэтому можно констатировать, что современные методы диагностики копытной гнили овец в нашей стране не применяют.

В связи с вышеописанными проблемами в диагностике копытной гнили овец, и, как следствие, в борьбе с этой болезнью, разработка молекулярно-генетических методов выявления, идентификации и типирования П.пскЛобш является чрезвычайно необходимой.

Цель работы: биологическая и молекулярно - генетическая характеристика штаммов ОгскеЬЬаМег пос1о$ш и разработка методик ПЦР для осуществления видовой идентификации и типирования возбудителя копытной гнили овец.

Задачи исследования:

1. Разработать методику ПЦР - анализа на основе амплификации гена 16Б рРНК 01ске1оЬас1ег поЖжиб для видовой идентификации возбудителя из культуры.

2. Разработать методику ПЦР - анализа на основе амплификации гена АтА для типирования штаммов возбудителя.

3. Охарактеризовать молекулярно - генетически штаммы 01ске1оЬа^ег пойозт из коллекции ВИЭВ им. Я.И.Коваленко в сравнении с основными биологическими свойствами этих культур.

4. Разработать способы подготовки проб патологического материала для проведения ПЦР на основе амплификации гена 16Б рРНК для выявления и идентификации ОюкеЬЬаМег пойозиз без проведения культуральных исследований.

5. Оценить корреляцию данных филогенетического анализа ОгсИеЬЬаМег пос1о8№ по гену АтА и серологического метода РА (реакция агглютинации).

Научная новизна.

Охарактеризованы биологические и молекулярно-генетические свойства 17 штаммов 01ске1оЬа&ег пойохт.

Проведена видовая идентификация реактивированных штаммов Вшке1оЬаМег по(1оят по гену 16Б рРНК и их типирование по гену АтА.

Разработана новая методика пробоподготовки патологического материала, позволяющая выявлять и идентифицировать 01ске1оЬас1ег пос1о$и8 без проведения культуральных исследований на основе ПЦР -амплификации фрагмента гена 16Б рРНК.

Предложен новый фрагмент гена ДтА, на основе которого проведен филогенетический анализ 15—ти штаммов 01ске1оЬаМег пос1о5т и обнаружена корреляция генотипов с серотипами возбудителя.

Практическая значимость.

Охарактеризован молекулярно - генетически производственный штамм ПП 82/90 Оюке1оЬа&ег пойозт, применяемый для производства вакцины «Овикон».

Проведена реактивация штаммов 01ске1оЬас1ег пойозш после 20-ти летнего хранения в лиофилизированном виде, изучена их жизнеспособность, сохранение морфологических, тинкториальных и культуральных свойств.

Разработана методика ПНР, позволяющая с помощью амплификации фрагмента гена 16Э рРНК с высокой специфичностью и чувствительностью осуществлять видовую идентификацию возбудителя - В1ске1оЬа&ег пос1ояш в лабораторных условиях без предварительного культивирования.

Разработаны «Методические указания по идентификации возбудителя копытной гнили овец с помощью амплификациии фрагмента гена 168 рРНК методом ПЦР» (Приложение А), утвержденные Научно - методическим советом МГАВМиБ 1 апреля 2011 г. и предназначенные для использования в научно - исследовательских учреждениях, проводящих работы по изучению Оюке1оЬа&ег по(1ози8 и молекулярной диагностике копытной гнили овец, а ч также для диагностических (или производственных) ветеринарных лабораторий.

Личный вклад соискателя.

Личный вклад соискателя заключается в организации и проведении бактериологических, молекулярно-генегических исследований, а также анализе и обобщении результатов работы.

Апробация работы.

Материалы работы доложены на Международной научно практической конференции по современным методам диагностики, профилактики и терапии заразных и незаразных болезней животных (г.

Ставрополь, 2009 г.), Международной научно - практической конференции, посвященной 90-летию МГАВМиБ (г. Москва, 2009 г.) Результаты работы включены в годовые отчеты по НИР кафедры эпизоотологии и инфекционных болезней МГАВМиБ в 2008-2010 гг.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 7 научных статей, в том числе в 3-х изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации.

Материалы диссертации изложены на 143 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных результатов и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы, включающего 260 источников (в т.ч. 213 иностранных) и приложения. Работа содержит 13 таблиц и 37 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов", Алексеева, Светлана Викторовна

4. ВЫВОДЫ

1. Разработана методика ПЦР на основе амплификации фрагмента гена 16S рРНК, которая позволяет с высокой специфичностью и чувствительностью проводить видовую диагностику культуры возбудителя копытной гнили овец - Dichelobacter nodosus.

2. Разработана методика на основе ПЦР — амплификации, последующего секвенирования и сравнительного компьютерного анализа вариабельного фрагмента гена fimA, для типирования штаммов на 10 групп и 19 вариантов Dichelobacter nodosus без использования серологических методов.

3. Показана возможность реактивации штаммов Dichelobacter nodosus после 20-летнего хранения в лиофилизированном виде с сохранением культурально - морфологических свойств и определения их вида и генотипа с помощью молекулярно — генетических методов.

4. Разработан способ подготовки проб патологического материала, для проведения ПЦР на основе амплификации гена 16S рРНК для выявления и идентификации Dichelobacter nodosus без проведения культуральных исследований.

5. Проведен филогенетический анализ на основе нового предложенного фрагмента гена fimA Dichelobacter nodosus, который показал корреляцию между серогруппами и генотипами возбудителя.

5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

ИССЛЕДОВАНИЯ

На основании проведенных исследований разработана для практического использования методика ПЦР, позволяющая с высокой специфичностью и чувствительностью осуществлять видовую идентификацию возбудителя - D.nodosus без проведения культуральных исследований.

6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

Для использования способа в научно - исследовательских учреждениях, проводящих работы по изучению D.nodosus и молекулярной диагностике копытной гнили овец, а также для диагностических (или производственных) ветеринарных лабораторий разработаны «Методические указания по идентификации возбудителя копытной гнили овец с помощью амплификации фрагмента гена 16S рРНК методом ПЦР», утвержденные Научно -методическим советом МГАВМиБ 1 апреля 2011 г.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Алексеева, Светлана Викторовна, Москва

1. Абдурагимов, Х.А. Экономический ущерб от копытной болезни / Х.А. Абдуратимов // Ветеринария. 1968. - № 6. — С. 33-34.

2. Артюшина, И.А. Гомология ДНК у разных штаммов Bacteroides nodosus / И.А. Артюшина, Ю.Д. Караваев, С.К. Артюшин // Тр. ВИЭВ. -М., 1987.-Т. 64.-С. 95-97.

3. Артюшина, И.А. Применение иммуноферментного метода для дифференциации штаммов возбудителя копытной гнили овец / И.А. Артюшина, Ю.Д. Караваев, И.Н. Семенова // Бюлл. ВИЭВ. 1988. - Т. 65.-С. 66-68.

4. Артюшина, И.А. Создание банка генов Bacteroides nodosus / И.А. Артюшина, С.К. Артюшин, С.Д Панасюк // Тр. ВИЭВ. М., 1988. - Т. 64.-С. 21-23.

5. Архангельский, И.И. Копытная гниль овец / И.И. Архангельский, A.A. Сидорчук, Ю.Д. Караваев. М.: Агропромиздат. - 1986. - 95 с.

6. Бектемиров, М.А. Диагностика копытной гнили овец / М.А. Бектемиров // Ветеринария. 1979. - № 1. - С. 46 -48.

7. Бектемиров, М.А. Копытная гниль овец / М.А. Бектемиров // Ветеринария. 1983. - № 2. - С. 40-42.

8. Бектемиров, М.А. Разработка методов диагностики копытной гнили овец, выделение и изучение биологии возбудителя: автореф. дис. . канд. вет. наук: 16.00.03 / М.А. Бектемиров. М., ВИЭВ. - 1978. - 19 с.

9. Бектемиров, М.А. Серологические методы диагностики копытной гнили овец / М.А. Бектемиров // Сб. Профилактические и лечебные мероприятия в условиях отгонного животноводства. — Махачкала, 1981.-Т. 12.-С. 119-122.

10. Биологические свойства возбудителя копытной гнили овец / И.И. Архангельский, Ю.Д. Караваев, A.B. Ляушкин и др. // Тр. ВИЭВ. -1979.-Т. 49.-С. 76-80.

11. П.Волкова, A.A. Некробактериоз овец / A.A. Волкова, P.C. Галлиев, В.И. Овчаренко. Фрунзе, 1965. — 184 с.

12. Генодиагностика бактериальных менингитов и генотипирование их возбудителей / А.Е. Платонов, Г.А. Шипулин, E.H. Тютюнник и др. // Пособие для врачей. ЦНИИЭ. М.,2001. -37 с.

13. Гришаев, Н.Е. Некоторые свойства протеаз F. nodosus / Н.Е. Гришаев // Доклады ВАСХНИЛ. 1972. - № 7. - С. 40-42.

14. Гришаев, Н.Е. Об этиологии копытной гнили овец / Н.Е. Гришаев // Доклады ВАСХНИЛ. 1969. - № 11. - С. 31-34.

15. Егошин, И.С. Итоги изучения патоморфологических изменений при копытной гнили у овец / И.С. Егошин, Д. Раимбеков // Патоморф. патогенез диагн. бол. с-х жив-х. М., 1980. - С. 143-146.

16. Жолмагамбетов, С.М. Эпизоотология и клинические признаки копытной гнили овец / С.М. Жолмагамбетов // Сб. трудов MBA. М., 1979.-Т. 108. -С.91-93.

17. Жолмагамбетов, С.М. Эпизоотология и клинические признаки копытной гнили овец / С.М. Жолмагамбетов, С. Нуйкин // Новые методы диагн., лечения и проф. не инфекцион. и инфекц заб-ний с-х жив-х. М., 1979. - С.91-93.

18. Инструкция о мероприятиях по борьбе с копытной гнилыо овец: утв. гл. упр. ветеринарии Минсельхоза СССР 30.12.85. -М., 1986. 5 с.

19. Кузнецов, Г.С. Лечение и ликвидация копытной гнили у овец / Г.С Кузнецов // Ветеринария. 1961. - № 10. - С. 44-48.

20. Лукашов В.В. Молекулярная эволюция и филогенетический анализ / В.В. Лукашов // Уч. пособие. М.:БИНОМ. - 2009. - 256 с.

21. Люминесцентный метод диагностики копытной гнили овец / И.И. Архангельский, A.B. Ляушкин, Ю.Д. Караваев и др. // Ветеринария. -1976. -№ 6.-С. 51-53.

22. Ляушкин, A.B. Копытная гниль овец / A.B. Ляушкин // Болезни овец и коз. М.: Колос. - 1973. - С. 108-114.

23. Мельникова, K.B. К изучению патогенеза копытной гнили овец / К.В. Мельникова, С.Н. Кулаченко, А.Т. Добродомов // Болезни овец и меры борьбы с ними. Чита, 1980. - С. 72-73.

24. Мельникова, К.В. Терапевтическое действие различных форм медного купороса на копытную гниль зимой / К.В. Мельникова // Болезни овец и меры борьбы с ними. Чита, 1980. - С. 72-73.

25. Раимбеков, Д. Опыты по лечению копытной овец / Д. Раимбеков, И.С. Егошин // Инфекционные болезни овец. Фрунзе, 1976. - С. 197-201.

26. Раимбеков, Д.Р. Копытная гниль овец и меры борьбы с ней / Д.Р. Раимбеков. Фрунзе, 1979. - 12 с.

27. Саттаров, A.C. Эпизоотология копытной гнили овец на башкирском южном Урале и опыт оздоровления благополучных хозяйств от этой инфекции / A.C. Саттаров, У.М. Акчурин // Инф. бол. овец. Фрунзе, 1976. — С.195-197.

28. Семенова, H.H. Реакция агглютинации при копытной гнили овец / И.Н. Семенова // Разработка, апробация и государственный контроль ветеринарных препаратов. М., 1981. - С. 138-139.

29. Семенова, И.Н. Реакция непрямой гемагглютинации для диагностики копытной гнили овец / И.Н. Семенова // Бюл. ВИЭВ. 1985. - Вып. 59. - С. 26-29.

30. Семенова, И.Н. Серологическая типизация штаммов возбудителя копытной гнили овец / И.Н. Семенова, А.А.Сидорчук, Ю.Д. Караваев // Бюл. ВИЭВ. 1988. - Вып. 65. - С. 38/

31. Сидоров, М.А. Некоторые вопросы эпизоотологии заболеваний конечностей овец / М.А. Сидоров, A.B. Ляушкин // Бюлл. ВИЭВ. -1973.-Вып. 16.-С. 20-23.

32. Сидорчук, A.A. Копытная гниль овец: иммунитет, специфическая профилактика и терапия: дис. . докт. вет. наук: 16.00.03 / Александр Андреевич Сидорчук. -М.: ВИЭВ. 1991. - 396 с.

33. Сукеев, Ш.С. Вопросы дифференциальной диагностики и взаимосвязи некробактериоза, контагиозной эктимы и копытной гнили / Ш.С. Сукеев, J1.T. Майгулакова, М. Абышев // Сб. Болезни овец и меры борьбы с ними. Чита, 1980. - С. 112-114.

34. Сукеев, Ш.С. К вопросу дифференциальной диагностики копытной гнили овец / Ш.С. Сукеев, И.С. Егошин // Проф. и меры борьбы с бол. овец. Махачкала, 1973. - С. 48-49.

35. Сукеев, Ш.С. К эпизоотологии копытной гнили мелкого и крупного рогатого скота / Ш.С. Сукеев // Сб. Болезни овец и меры борьбы с ними.-Чита, 1980.-С. 110-112.

36. Сукеев, Ш.С. О копытной гнили в Киргизии / Ш.С. Сукеев, И.С. Егошин, Д. Раимбеков // Ветеринария. 1974. - № 3. - С. 50-59.

37. Черкасский, Б.Л. Руководство по эпидемиологии инфекционных болезней / Под. ред. В.И.Покровского. М.: Медицина. - 1993. - Т.1 — 464с.

38. А multiple site-specific DNA-inversion model for the control of Ompl phase and antigenic variation in Dichelobacter nodosus / E.K. Moses, R.T.

39. Good, M. Sinistaj et.al. // Mol. Microbiol. 1995. - Vol. 17. - № 1. - P. 183196.

40. A retrospective study of clinical and laboratory characteristics of ovine footrot / D. Liu, C. Roycroft, J. Samuel et.al. // Vet. Microbiol. 1994. -Vol. 42,-№4. - P. 373-381.

41. A single amino-acid change between the antigenically different extracellular serine proteases V2 and B2 from Dichelobacter nodosus / M.C. Riffkin, L. Wang, A.A. Kortt et all. // Gene. 1995. - Vol. 167. - P. 279-283.

42. A survey of the control and financial impact of footrot in the New Zealand Merino industry / J.G.H. Hickford, S. Davies, H. Zhou et al. // Proceedings of the New Zealand Society of Animal Production. 2005. - Vol. 65. — P. 117-122.

43. Abbott, K.A. Current approaches to the management of ovine footrot / K.A. Abbott, CJ. Lewis // The Veterinary Journal. 2005. - Vol. 169 - P. 28-41.

44. Activities and partial purification of extracellular proteases of Bacteroides nodosus from virulent and benign foot-rot / A.A. Kortt, I.J. O'Donell, D.J. Stewart et al. // Austral. J. Biol. Sci. 1982. - Vol. 35. - P. 481-489.

45. Aetiology of ovine footrot in the Portuguese region of Alto Alentejo / R. Jimenez, S. iriz, P. Martin-Palomino et al. // J. Vet. Med. B. 2003. - Vol. 50. - P. 118-120.

46. Antigenic stability of fimbriae of Bacteroides nodosus / L.J. Moor, A.T. Crowe, M. Norman et all. // Austr. Vet. J. 1990. - Vol. 67. - P. 219-223.

47. Bacteriological study of footrot in pigs: a preliminary note / S. Piriz, M. A. Hurtado, J. Valle et al. // Vet. Rec. 1996. - Vol. 139. - P. 17-19.

48. Barber, D.M.L. Foot rot in sheep / D.M.L. Barber // Vet. Rec. 1979. - Vol. 104.-P. 194-195.

49. Benito, M. Etiologie et pathogenie du pietin chez les ovins et les bovine / M.

50. Benito // Rev.med.veter. 1974. - Vol. 125. - № 5. - P. 611-620.th

51. Bergey's Manual of systematic bacteriology 9 Edd., - 1986. - Vol. 2.

52. Beweridge, W.I.B. Disease caused by non-sporing anaerobes:ovine footrot necrobacillosis / W.I.B. Beweridge // Bull. OIE. 1967. - Vol. 67. - P. 1597-1601.

53. Beweridge, W.I.B. Foot-rot in sheep: a transmissible disease due to infection with Fusiformis nodosus / W.I.B. Beweridge // Bull. Counc. Sci. Industr. Res.-1941.-Vol. 140,№ 1.-P.32-38.

54. Billington, S.J. Virulence regions and virulence factors of ovine footrot pathogen Dichelobacter nodosus / S.J. Billington, J.L. Johnston, J.I. Rood // Ferns. Microb.letters. 1996. - Vol. 145. - P. 147-156.

55. Broad, Т.Е. Partial purification and propertiens of extracellular proteolytic activy of Bacteroides nodosus / Т.Е. Broad, T.M. Skerman // N.Z.J. Agric. Res. 1976. - Vol. 19. - № 3. - P. 317-322.

56. Бинев, К. Рентгенова картинана усложненията при копитният гнилец поовцете / К. Бинев, Ж. Филипов // Вет.сб. 1980. - вып. 78. - № 7. - С. 18—19.

57. Cagatay, I.T. Characterization of footrot bacteria Dichelobacter nodosus using PCR amplification and DNA sequence analysis / I.T. Cagatay, J.G.H. Hickford // Turk. J. Vet. Anim. Sci. 2006. - Vol. 30. - P. 53-59.

58. Cagatay, I.T. Update on ovine footrot in New Zealand: isolation, identification, and characterization of Dichelobacter nodosus strains / I.T. Cagatay, J.G.H. Hickford // Vet. Microbiol. 2005. - Vol. 111 - P. 171-180.

59. Characterisation of virulent and benign strains of Bacteroides nodosus / L.J. Depiazzi, R.B. Richards, J. Henderson et al. // Vet. Microbiol. 1991. -Vol. 26.-№2.-P. 151-160.

60. Chetwin, D.H. The recognition and prevalence of Bacteroides nodosus serotype M in Australia and New Zealand / D.H. Chetwin, L.C. Whitehead, U.S.E. Thorley // Austr.Vet. J. 1991. - Vol. 68. - № 4 - P. 154-155.

61. Claxton, P.D. Classification of Bacteroides nodosus by agglutination tests / P.D. Claxton, L.A. Ribeiro, J.R. Egerton // Austr. Vet. J. 1983. - Vol. 60. -№ 11.-P. 331-334.

62. Claxton, P.D. Footrot in goats and characterization of caprine isolates of Bacteroides nodosus: Footrot in Ruminants / P.D. Claxton, K.C. O'Grady // CSIRO.-Australia, 1986.-P. 119-123.

63. Claxton, P.D. Serogrouping of Bacteroides nodosus isolates: Footrot in ruminants / P.D. Claxton // CSIRO. Australia, 1986. - P. 131 - 134.

64. Clinical and laboratory diagnosis of benign, intermediate and virulent strains of Bacteroides nodosus: Footrot of ruminants / DJ. Stewart, J.E. Peterson, J.A. Vaughan et al. // CSIRO. Australia, 1986. - P. 81-91.

65. Clinical footscald and footrot in a New Zealand Romney flock: phenotypic and genetic parameters / T.M. Skerman, D.L. Jolmson, D.W. Kane et al. // Aust. J. Agric. Res. 1988. - Vol. 39. - P. 907 - 916.

66. Cloning and expression in Escherichia coli of the gene encoding the structural subunit of Bacteroides nodosus fimbriae / B.J. Anderson, M.M. Bills, J.R. Egerton et al. // J. of Bacteriol. 1984. - Vol. 160. - № 2. - P. 748-754.

67. Cloning and Sequencing of a Moraxella bovis Pilin Gene / C.F. Marrs, G. Schoolnik, J.M. Koomey et al. // J.of Bact. 1988. - Vol. 163. - № 1. - P. 132-139.

68. Cloning, sequencing and expression of the gene (aprV5) encoding extracellular serine acidic protease V5 from Dichelobacter nododus / M.C. Riffkin, A. Focareta, R. Edwards et al. // Gene. 1993. - Vol. 137. - P. 259264.

69. Comparison of gene probe and conventional methods for the differentiation of ovine footrot isolates of Dichelobacter nodosus / J.I. Rood, P.M. Howarth, V. Haring et al. // Vet. Microbiol. 1996. - Vol. 52 - P. 127-141.

70. Contagious fot rot. / W.P. Deweese, T. Clay, D.G. Ely et at. / Sheep breeder.- 1982.-Vol. 102.-№9.-P. 134, 136, 138.

71. Control of footrot in small ruminants in Nepal. ACIAR Projects AS2/1991/017 and AS2/1996/021. ACIAR, Canberra, 2001. - Режим доступа: http: //www.aciar.gov.au/node/12737.

72. Cooper, B.S. Differences in morphology of Bacteroides nodosus attributable to the culture media / B.S. Cooper // New Zealand Vet. J. 1977. - Vol. 25.- № 1-2. P. 16-20.

73. Cooper, B.S. Differences in morphology of Bacteroides nodosus attributable to the culture media / B.S. Cooper // New Zealand Vet. J. 1977. - Vol. 25.- № 1-2. P. 16-20.

74. Cygan, Z. Niektore zagadnienia zwiazane z immunoprofilaktyka w zanokcicy owiec / Z. Cygan, J. Barcz, D. Deptula // Medicina Wet. 1978. -t. 34.-№4.-S. 196-199.

75. Day, S.E.J. Serotyping of Bacteroides nodosus: proposal for 9 further serotypes (J-R) and a study of the antigenic complexity of B. nodosus pili: Footrot in ruminants / S.E.J. Day, C.M. Thorley, J.E. Beesley // CSIRO. -Australia, 1986.-P. 147-159.

76. Dean, H.M. The pathology of contagious footrot in sheep/ H.M. Deane, R. Jensen//Am. j. vet.res. 1955.-Vol. 59. -№ 16. - 203-208.

77. Delineation of the virulence-related locus (vrl) of Dichelobacter nodosus / V. Haring, S.J. Billington, C.L. Wright et al. // Microbiology. 1995. - Vol. 141. - P. 2031-2089.

78. Depazzi, L. Footbathing, footrot ecology and dominance in mixed Dichelobacter nodosus infections / L. Depazzi // Proceedings of the National Workshop on Footrot. Perth, 2003 - P. 59-63.

79. Depazzi, L.J. A degrading proteinase test to distinguish benign and virulent ovine isolates of Bacteroides nodosus / L.J. Depiazzi, R.B. Richards // Austral Vet. J. 1979. - Vol. 55. - № 1. - P. 25-28.

80. Diagnosis of footrot in goats: application of ELISA tests for response to antigens of Dichelobacter nodosus / S.C. Ghimire, R.J. Whittington, O.P. Dhungyel et al. // Vet. Microbiol. 2002. - Vol. 87. - P. 237-251.

81. Differentiation of Bacteroides nodosus biotypes and colony variants in relation to their virulence and immunoprotective properties in sheep / T.M. Skerman, S.K. Erasmuson, D. Every et all. // Infection and immunity — 1981.-Vol. 13.-№4.-P. 788-795.

82. Egerton, J.R. Benign foot-rot. A specific interdigital dermatitis of sheep associated with infection by less proteolytic strains of Fusiformis nodosus / J.R. Egerton, I.M. Parsonson // Aust. Vet. J. 1969. - Vol. 45. - P. 345-349.

83. Egerton, J.R. Breeding sheep for resistance to footrot / J.R. Egerton, H.W. Raadsma // CAB International. Oxon, 1991. - P.347 - 370.

84. Egerton, J.R. Characteristics of Bacteroides nodosus isolated from cattle / J.R. Egerton, E.A. Laing // Vet. Microbiol. 1978. - Vol. 3. - P. 269-279.

85. Egerton, J.R. Comparison of oil adjuvant and alum precipitated Bacteroides nodosus vaccines in treatment of foot-rot / J.R. Egerton, J.J. Thomson, G.C. Merritt // Veter. Ree. 1979. - Vol. 104. - № 5. - P. 98-100.

86. Egerton, J.R. Control and eradication of footrot at the farm level the role of veterinarians / J.R. Egerton // New Zealand Veterinary Association. - New Zealand, 1989. - P. 215-218.

87. Egerton, J.R. Control and eradication of ovine footrot. Footrot in ruminants / J.R. Egerton // CSIRO. Australia, 1986. - P. 35-41.

88. Egerton, J.R. Foot-rot in vaccinated and unvaccinated sheep / J.R. Egerton, I.R. Morgan, D.H. Burrell // Vet. Ree. 1972. - Vol. 91. - P. 447-453.

89. Egerton, J.R. Management of footrot. In: Proceedings of the Seminar on Foofrot Eradication Programme in sheep and Goats in Nepal / J.R. Egerton, O.P. DhungyeL, S.C. Ghimire // Lumle-Agricultural-Centre. 1994. - Vol. 94.-P. 13-17.

90. Egerton, J.R. Serology of foot-rot: antibodies against Fusiformis nodosus in normal, affected, vaccinated and passively immunized sheep / J.R. Egerton, G.C. Merritt // Aust. Vet. J. 1973. - Vol. 49. - P. 139-145.

91. Egerton, J.R. Significance of Fusiformis nodosus serotypes in resistence of vaccinated sheep to experimental ovine foot-rot / J.R. Egerton // Aust. Vet. J. 1974. - Vol. 50. - № 2. - P. 59-62.

92. Egerton, J.R. Surface and somatic antigens of Fusiformis nodosus / J.R. Egerton // J.Comp.Pathol. 1973. - Vol. 83. - P. 151-159.

93. Egerton, J.R. The aetiology and pathogenesis of ovine foot-rot /1/ A histological study of the bacterial invasion / J.R. Egerton, D.S. Roberts, I.M. Parsonson // J. Comp. Path 1969. - Vol. 79. - P. 207-219.

94. Electron microscopic study of Bacteroides nodosus pilli and associated structures / J.L. Gradin, A.E. Sonn, D.E. Bearwood et al. // American Journal of Veterinary Research. 1991. - Vol. 52. - P. 206-211.

95. Elleman, T.C. Pilins of Bacteroides nodosus: molecular basis of serotypic variation and relationships to other bacterial pilins / T.C. Elleman // Microbiological Reviews. 1988. - Vol. 52. - № 2. - P. 233-247.

96. Every, D. Proteinase isoenzyme patterns of Bacteroides nodosus: distinction between ovine virulent, ovine benign isolates and bovine isolates /D. Every//J.gen.microb. 1982. - Vol.128. - P. 809-812.

97. Every, D. Purification of pili from Bacteroides nodosus and an examination of their chemical, physical and serological properties / D. Every // J. of General. Microbiol. 1979. - Vol. 115. - № 2. - P. 309-316.

98. Firth, N. A protein family assosiated with filament biogenesis in bacteria / N. Firth, R.A. Skurray // Molecular Microbiology. 1995. - Vol. 17.-P. 1218-1219.

99. Genetic-associated resistance to foot rot in selected Targhee sheep / M.S. Bulgin, S.D. Lincoln, C.F. Parker et al. // JAVMA. 1988. - Vol. 192. -№4. - P. 512-515.

100. Genome sequence and identification of candidate vaccine antigens from the animal pathogen Dichelobacter nodosus / G.S.A. Myers, D. Parker, K. Al-Hasani et. al. // Nature Biotechnology. 2007. -Vol. 25. - № 5. - P. 569-575.

101. Genomics, genetics and pathogenesis of dichelobacter nodosus / J.I. Rood, R.M. Kennan, D. Parker et al. // Department of Agriculture. Perth, 2004. - P.26-27.

102. Ghimire, S.C. PCR-RFLP of outer membrane proteins gene of Dichelobacter nodosus: a new tool in the epidemiology of footro / S.C. Ghimire, J.R. Egerton // Epidemiol. Infect. 1999. - Vol. 122. - № 3. - P. 521-528.

103. Ghimire, S.C. Characterization of Dichelobacter nodosus isolated from footrot in sheep and goats in Nepal / S.C. Ghimire, J.R. Egerton, O.P. Dhungyel // Small Ruminant Res. 1996. - Vol. 23. - P. 59 - 67.

104. Gradin, J. L. Selective medium for isolation of bacteroides nodosus / J.L. Gradin, J.A. Schmitz // J.Clin.Microbiol. 1977. - Vol. 6. - №. 3. - P. 298-302.

105. Gradin, J.L. Serogrouping of Bacteroides nodosus isolates from 62 sources in the United States / J.L. Gradin, A.E. Sonn, L. Petrovska // Am. J. Vet. Res. 1993. - Vol. 54. - P. 1069-1073.

106. Graham, B. Routine laboratory testing for footrot in Australia / B. Graham // Proceedings of the National Workshop on Footrot. Perth, 2003 -P. 71-72.

107. Graham, N.P.H. Pathogenesis of ovine foot-rot: the role of some environmental factors / N.P.H. Graham, J.R. Egerton // Aust.Vet.J. 1968. -Vol. 44. - P. 235-240.

108. Green, R.S. A method to differentiate between virulent and benign isolates of Bacteroides nodosus based on the thermal stability of their extracellular proteinases // N.Z.Vet.J. 1985. - Vol. 33. - P. 11-13.

109. Green, R.S. Characterisation of certain proteinase isoenzymes produced by benign and virulent strains of Bacteroides nodosus / R.S Green // J. Gen. Microbiol. 1985. - Vol. 131. - P. 2871 -2876.

110. Hart Isolation and characterisation of a novel spirochaete from severe virulent ovine foot rot / I. Demirkan, S.D. Carter, C. Winstanley et al. // J. Med. Microbiol.-2001.-Vol. 50.-P. 1061 1068.

111. Hindmarsh, F. Serogroups of Bacteroides nodosus isolated from ovine footrot in Britain / F. Hindmarsh, J. Fraser // Vet Ree. 1985. - Vol. 116.-P. 187-188.

112. Hine, P.M. Ovine footrot: histopathology of a synergic disease, in Models of Anaerobic Infections / P.M. Hine, M.J. Hill // Ed. Martinus Nijhoff. The Hague, 1984. - 5 p.

113. Identification and grouping of Dichelobacter nodosus, using PCR and sequence analysis // G.H. John, R. Smith, K.J. Abraham et.al. // Molecular and Cellular Probes. 1999. - Vol. 13. - P. 61-65.

114. Identification of three gene regions associated with virulence in Dichelobacter Bacteroides. nodosus, the causative agent of ovine footrot / M.E. Katz, P.M. Howarth, W.K. Yong et al. // Journal of General Microbiology. 1991.-Vol. 137. - P. 2117-2124.

115. Improved diagnosis of virulent ovine footrot using the intA gene / B.F. Cheetham, L.R. Tanjung, M. Sutherland et al. // Vet. Microbiol. 2006. -Vol. 116-P. 166-174.

116. Irevors, J. Gene transfer among bacteria in soil and aquatic environments: a review / J. Irevors, T. Batkay, W Boutquin // Canadian Journal of Microbiology. 1987. - Vol. 33. - P. 191-198.

117. Isolation and characterisation of Bacteroides nodosus from foot lesions of cattle in Western Australia / R.B. Richards, L.J. Depiazzi, J.R. Edwards et al. // Austr. Vet. J. 1980. - Vol. 56. - P. 517-521.

118. Isolation and characterization of Bacteroides nodosus fimbriae: structural subunit and basal protein antigens / J.S. Mattik, B.J. Anderson, M.R. Mott et al. // J. Bact. 1984. - Vol. 160. - № 2. - P. 740-747.

119. Isolation and identification of anaerobic bacteria from ovine foot rot in Spain / S. Piriz, R. Cuenca, J. Valle et al // Research in Veterinary Science. -1990.-Vol. 9.-P. 245-247.

120. Isolation of spirochaetes from an incident of severe virulent ovine footrot / R. Naylor, P. Martin, J. Jones et al. // Vet. Rec. 1998. - Vol. 143. -P. 690-691.

121. Jessen, P. Baquiloprim/sulfadimidine in calves and young cattle. Oral treatment of enzootic pneumonia and infectious pododermatitis / P. Jessen, O. Kristiansen, F.O. Madsen // Dansk-Veterinaertidsskrift. 1993. - Vol. 76. - P. 796-798.

122. Johnson, J.L. Ribosomal ribonucleic acid homology among species of the genus Bacteroides / J.L. Johnson, B. Harich // Int. J. Syst. Bacteriol. -1986. Vol. 36. - №. 1. - P. 71-79.

123. Katie, R. Resultati nasih ispitavania etiopatogeneze epizootskog oboljenja papaka / R. Katie // Vet. Glasnik. 1976. -1. 30. - № 6. - P. 507514.

124. Katitch, R.V. Les problèmes de l'etiologie et de imunolo-prrophylaxie dans le pietin du mouton / R.V. Katitch // Comp.immun.microb.inf.dis. -1979.-t.2.-22-59.

125. Katitch, R.V. Role des microbes anaerobies dan» la patogenic du pietin du mouton / R.V. Katitch // Rec.med.vet. 1971. - t. 147. - № 2. - P. 179-186.

126. Kerry, J.B. Vaccination against foot-rot / J.B. Kerry // Irish. Vet. J. -1971. -№ 12.-P. 229-230.

127. Kingsley, D.F. Distribution of serogroups of Bacteroides nodosus with particular reference to New Zealand and the United Kingdom : Footrot in Ruminants / F.H. Hindmarsh, D.M. Liardet, D.H. Chetwin // CSIRO. -NSW, 1986.-P. 143-146.

128. Kümper, H. Moderhinke als Tierschutzproblem / H. Kümper, H. Stumpf // Tagung Schaf- und Ziegenkrankheiten, Gießen. 2000. - Vol. 7. -P. 1 -5.

129. La Fontaine, S. Detection of Dichelobacter nodosus using species-specific oligonucleotides as PCR primes / S.L. Fontaine, J.R. Egerton, J.I. Rood // Vet. Microb. 1993. - Vol. 35. - P. 101-117.

130. Lai, M.M. RNA recombination in animal and plant viruses / M.M. Lai // Microbiology Reviews. 1992. - Vol. 56. - P. 61-79.

131. Liu, D. A polymerase chain reaction assay for improved determination of virulence of Dichelobacter nodosus, the specific caCLLLAtive pathogen for ovine footrot / D. Liu , J. Webber // Vet. Microbiol. 1995. - Vol. 43 - P. 197-207.

132. Liu, D. Development of gene probes of Dichelobacter nodosus for differentiating strains causing virulent, intermediate or benign ovine footrot / D. Liu // British Vet. J. 1994. - Vol. 150. - P. 451-462.

133. Liu, D. Improved laboratory diagnosis of ovine footrot: an update / D. Liu, W.K. Yong // The Vet. J. 1997. - Vol. 153. - P. 99-105.

134. Marsh, H. Foot-rot and other diseases of the feet of sheep / H. Marsh // JAVMA. 1954. - Vol. 124. - № 9. - P. 1-4.

135. Martain, L. Le pietin estai de synthese / L. Martain, A.L. Banting, M.Y. Soyeux // Dossieures L'Elevage. 1978. - Vol. 2. - № 5. - P. 55-67.

136. Mayr, A. Grundlagen der Allgemeinen Medizinischen Mikrobiologie, Infektions- und Seuchenlehre. In: Mayr, A. (Hrsg.): Medizinische Mikrobiologie, Infektions- und Seuchenlehre // 7. Aufl., Enke Verlag. -Stuttgart, 2002. P. 1 - 62.

137. Microbiological study of foot-rot in lambs: isolation, elastolytic activity and antimicrobial susceptibility / S. Piriz, J. Valle, R. De La Fuente et al. // Zentralbl. Veterinärmed. 1992. - Vol. 39. - № 3. - P. 181-186.

138. Molecular analysis of Dichelobacter nodosus isolated from footrot in sheep in Malaysia / Z. Zakaria, S. Radu, A.R. Sheikhomar et al. // Vet. Microb. 1998. - Vol. 62. - P. 243-250.

139. Molecular characterization of a genomic region associated with virulence in Dichelobacter nodosus // M.E. Katz, R.A. Strugnell, J.I. Rood et al. // Infection and Immunity. 1992. - Vol. 60. - P. 4586-4592.

140. Molecular detection and characterization of Dichelobacter nodosus in ovine footrot in India / S.A. Wani, I. Samanta, M.A. Bhat et al. // Molecular and Cellular Probes. 2004. - Vol. 18. - P. 289-291.

141. Moore, L.J. The occurrence of treponemes in contagious ovine digital dermatitis and the characterisation of associated Dichelobacier nodosus / L.J. Moore, M.J. Woodward, R. Grogono -Thomas // Vet. Microbiol. 2005. -Vol. Ill -P. 199-209.

142. Mraz, O.J. Nomina und Synonyma der pathogenen und saprophytären Mikroben, isoliert aus den wirtschaftlich oder epidemiologisch bedeutenden Wirbeltieren und Lebensmitteln tierischer Herkunft / O.J. Mraz, J. Tesarcik,

143. F. Varejka // VEB Gustav Fischer Verlag. Iena, 1963.-488 p.

144. Mullis, K. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-2catalyzed chaine reaction / К. Mullis, F.Falona // Meth. Enzymol. 1991. -Vol.155.-P. 335-350.

145. Маринов, Е.Някои биохимични изследования на кръвни серуме при овце, болни от копитен гнилец / Е. Маринов, Е.Арнаудова // Вет.сб. 1982.-t. 80. -№ 8.-Р. 15-20.

146. Масалски, Н.М. Експериментално предиэвмкване на копытен гнилец по овцете / Н.М. Масалски // Вет.мед.науки. 1980. - т. 17. - № 8.-Р. 14-18.

147. Nieuwhof, G.J. Costs of the major endemic diseases of sheep in great Britain and the potentialbenefits of reduction in disease impacts / G.J. Nieuwhof, S.C. Bishop // Animal Science. 2005. - Vol. 81. - P. 57-67.

148. Nucleotide and deduced protein sequence of the extracellular, serine basic protease gene (bprB) from Dichelobacter nodosus strain 305: comparison with the basic protease gene (bprV) from virulent strain 198 /

149. G.G. Lilley, M.C. Riffkin, D.J. Stewart et al. // Biochemistry and Molecular Biology International 1995. - Vol. 36. - P. 101-111.

150. Nucleotide sequence of the gene encoding the two-subunit pilin of Bacteroides nodosus 265 / T.C. Elleman, P.A. Hoyne, N.M. McKern et al. // J. of Bacteriol. 1986. - Vol. 167. - № 1. - P. 243-250.

151. Organization of the fimbrial gene region of Bacteroides nodosus: class I and class II strains / M. Hobbs, B.P. Dalrymple, P.T. Cox et all. // Molecular Microbiology. 1991. - Vol. 5. - № 3. - P. 543-560.

152. Palmer, M.A. A gelatin test to detect activity and stability of proteases produced by Dichelobacter (Bacteroides) nodosus / M.A. Palmer // Vet. Microbiol. 1993. - Vol. 36. - № 1-2. - P. 113-122.

153. Parsonson, I.M. Ovine Interdigital Dermatitis / I. M. Parsonson, J.R. Egerton, D.S. Roberts // J. Comp. Pathol. 1967. - Vol. 77. -№ 3. - P. 309313.

154. Petti, C.A. The role of 16S rRNA gene sequencing in identification of microorganisms misidentified by conventional methods / C.A. Petti, C.R. Polage, P. Schreckenberger // J. Clin. Microbiol. 2006. - Vol. 44. - № 9. -P. 3469-3470.

155. Pilins from the B serogroup of Bacteroides nodosus: characterization, expression, and cross-protection / T.C. Elleman, D.J. Stewart, K.G. Finney et all. // Infection and immunity. 1990. - Vol. 58. - № 6. - P.1545-1551.

156. Pilus ELISA and an anamnestic test for the diagnosis of virulent ovine footrot and its application in a disease control program in Nepal / O.P. Dhungyel, R.J. Whittington, S.C. Ghimire et. al. // Vet. Microbiol. 2001. -Vol. 79.-P. 31-45.

157. Pitman, D.R. The laboratory culture of Dichelobacter nodosus in a footrot eradication program / D.R. Pitman, M.A. Palmer, L.J. Depiazzi // Austr. Vet. J. 1994.-Vol. 71.-P. 109-112.

158. Polymerase chain reaction amplification of the constant and variable regions of the Bacteroides nodosus fimbrial gene // G.H. John, J.O. Carlson, C.V. Kimberling et.al. // J. Of Clinical Microbiology. 1990. - Vol. 28. - № 11.-P. 2456-2461.

159. Popoff, M.R. Causal agent of foot rot: description, pathogenicity, vaccination / M.R. Popoff // Revue-de-Medecine-Veterinaire. 1991. - Vol. 142. - P. 453-462.

160. Protection of sheep against foot-rot with a recombinant DNA-based fimbrial vaccine / J.R. Egerton, R.T. Cox, B.J. Anderson et al. // Vet. Microbiol. 1987. - Vol. 14. - № 4. - P. 393-409.

161. Purification of the extracellular acidic proteases of Dichelobacter nodosus / A.A. Kortt, J.E. Burns, J.A. Vaughan et all. // Biochemistry and Molecular Biology International. 1994. - Vol. 34. - P. 1157-1166.

162. Пейчев, Б. Ваксино профилактиката в комплексната борба с копитния гнилец по овцете / Б. Пейчев, Н. Найденова // Вет. Сбирка. -1976. т. 74. - № 4. - С. 13-14.

163. Resultati ispitanja prakticne primene vaccine protivu oboljenja uraca ovaca / R.V. Katitche, Z. Vukicevic, T. Petrov et al. // Vet.Glas. / 1973. -t.ll.-P. 809-812.

164. Reuss, U. Neue verfahren zur bekampfung der Moderhinke beim schaf / U. Reuss // Kleineviehzuchter. 1975. -1. 23. - № 25. - S. 888-890.

165. Roberts, D.S. Fluorescent-labelled antibody for the diagnosis of footrot / D. Roberts, P. Walker // Vet.Rec. 1973. - Vol. 92. - № 3. - P. 70-71.

166. Saitou, N. The neigbou-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees // Mol.Biol.Evol.-1987. Vol.4. -P.406-425.

167. Seifert, H.S. Qestions about gonococcal pilus phase- and antigenic variation / H.S. Seifert // Molecular microbiology. 1996. - Vol. 212. - P. 433-440.

168. Serological classification and virulence determination of Dichelobacter nodosus isolated from Alberta and British Columbia sheep / M.E. Olson, S. Gard, D.W. Morck et al. // Can. J. Vet. Res. 1998. - Vol. 62. - P. 33-37.

169. Severity and persistence of footrot in Merino sheep experimentally infected with a protease thermostable strain of Dichelobacter nodosus at five sites / L.J. Depiazzi, W.D. Roberts, C.D. Hawkins et al. // Aust.Vet.J. -1998.-Vol. 76. -№ l.-P. 32-38.

170. Short, J.A. An electron microscope study of Bacteroides nodosus: ultrastructure of organisms from primary isolated and different colony types / J.A. Short, C.M. Thorley, P.D. Walker // J. Appl. Bacterial. 1976. - Vol. 40. — P. 311-315.

171. Skerman, T.M. Bacteroides nodosus the caCIIIAtive agent of contagious foot-rot in sheep / T.M. Skerman // Actual data biol. pathol. anaer. bact. Bucharest. - 1977. - P. 327-333.

172. Skerman, T.M. Determination of some in vitro growth requirements of Bacteroides nodosus / T.M. Skerman // J. Gen. Microbiol. 1975. - Vol. 87. -P. 107-119.

173. Stewart, D J. The role of elastase in the differentiation of Bacteroides nodosus infections in sheep and cattle / D.J. Stewart // Res. Vet. Sci. 1979. -Vol. 27.-P. 99-105.

174. Stewart, D.J. An electron microscopic study of Fusiformis nodosus / D.J. Stewart // Res. Vet. Sci. 1973. - Vol. 14.-№ 1.-P. 132-134.

175. Stewart, D.J. Biochemical and biological studies on the lipopolysaccharide of Bacteroides nodosus / D.J. Stewart // Res. Vet. Sci. -1977.-Vol. 23.-P. 319-325.

176. Stewart, D.J. Differences between strains of Bacteroides nodosus in their effects on the severity of foot-rot,bodyweight and wool growth in Merino sheep / D.J. Stewart, B.L. Clark, R.G. Jarrett // Aust. Vet. J. 1984. -Vol. 61.-P. 348-352.

177. Stewart, D.J. Footrot of Sheep. In: Egerton J.R., W.K. Yong, G.G. Riffkin (Hrsg.): Footrot and Foot abscess of ruminants / D.J. Stewart // CRC press, Boca Raton. Florida, 1989. - P.5-45.

178. Stewart, D.J. New approaches to footrot vaccination and diagnosis utilising the proteases of Bacteroides nodosus / D.J. Stewart // Advances in Veterinary Dermatology. Bailliere Tindall, 1990. - P. 359-369.

179. Stewart, D.J. Observations on strains of Bacteroides nodosus of intermediate virulence to sheep / D.J. Stewart // Australian Veterinary Association. Sydney, 1982. - P. 219-222.

180. Stewart, D.J. Review of Footrot diagnosis and the role of vaccination / Stewart D.J. // Sheep prod, and prev. med. Sydney, 1983. - P. 487-490.

181. Stewart, D.J. The role of elastase in the differentiation of Bacteroides nodosus infections in sheep and cattle / D.J. Stewart // Res. Vet. Sci. 1979. -Vol. 27.-P. 99-105.

182. Stewart, D.J. The role of various antigenic fractions of Bacteroides nodosus in eliciting protection against foot-rot in vaccinated sheep / D.J. Stewart//Res. Vet. Sci. 1978. - Vol. 24. - № 1.-P.14-19.

183. Strom, M. S.Structure-function and biogenesis of the type IV pili / M.S. Strom, U.S. Lory // Annu. Rev. Microbiol. 1993. - Vol. 47. - P. 565596.

184. The effect of footrot on body weight and wool growth of sheep / D.J. Marshall, R.I. Walker, B.R. Cullis et al. / Austr. Vet. J. 1991. - Vol. 68. -№ 2. - P. 45-49.

185. The fine structure of Fusiformis nodosus with special refence to the location of antigens associated with immunogenisity / P.D. Walker, J. Short, R.O. Thomson et all. // J. General. Microbiol. 1973. - Vol. 77. - P. 351361.

186. The patogenicity and cultural characteristics of virulent, intermediate and benign strains of B. nodosus causing ovine footrot / D.J. Stewart, J.E. Peterson, J.A. Vaughan et al. // Austral.vet.j. 1986. - Vol. 63. - P. 317-326.

187. The type IV fimbrial subunit gene (fimA) of Dichelobacter nodosus is essential for virulence, protease secretion, and natural competence / R.M. Kennan, O.P. Dhungyel, RJ. Whittington et al. // J. of Bacteriol. 2001. -Vol. 183.-№ 15.-P. 4451-4458.

188. The type IV fimbtial subunit gene (fimA) of Dihelobacter nodosus is essential for virulence, protease secretion, and natural competence / R.M. Herman, O.I. Dhungyel, R.J. Whittington et al. // Journal of Bacteriology. -2001. Vol. 183. - P. 4451-4455.

189. Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories / P.C. Woo, S.K. Lau, J.L. Teng et al. // Clin. Microbiol. Infect. 2008. -Vol. 14. - № 10. - P. 908-934.

190. Thomas, J.H. Prioteolytic enzymes produced in liquid media by Fusiformis nodosus / J.H. Thomas // Austr. J. Agr. Res. — 1964. — Vol. 15. -№3,-P. 417-426.

191. Thomas, J.H. The bacteriology and histopathology of foot-rot in sheep / J.H. Thomas // Austr. J. Agr. Res. 1962. - Vol. 13. - № 4. - P. 725-739.

192. Thomas, J.H. The pathogenesis of footrot in sheep with reference to proteases of Fusiformis nodosus / J.H. Thomas // Austr. J. Agr. Res. 1964. -Vol. 15.-P. 1001-1016.

193. Thorley, C.M. A simplified method for the isolation of Bacteroides nodosus from ovine foot-rot and studies on it's colony morphology and serology / C.M. Thorley // J. Appl. Bact. 1976. - Vol. 40. - P. 301-309.

194. Thorley, C.M. Serotyping survey of 1296 strains of Bacteroides nodosus isolated from sheep and cattle in Great Britain and western Europe.

195. C.M. Thorley, S.E.J. Day // CSIRO Division of Animal Health and Australian Wool Corporation. Glebe, NSW, 1986. - P. 135-142.

196. Toussaint, E.R. The specific contagious inflammation of the interdigital skin of cattle / E.R. Toussaint, J.L. Cornelisse // Vet. Med. Rev. -1971.-№2-3.-P. 223.

197. Transformation-mediated serogroup conversion of Dichelobacter nodosus / R.M. Kennan, O.P. Dhungyel, R.J. Whittington et al. // Vet. Microbiol. 2003. - Vol. 92. - P.169-178.

198. Treatment of foot rot in free-ranging mouflon (Ovis gmelini musimon) populations—does it make sense? / K. Volmer, W. Hecht, R. Weiß et al. // Eur. J. Wildl. Res. 2008. - Vol. 54. - P. 657-665.

199. Understanding the molecular epidemiology of the footrot pathogen Dichelobacter nodosus to support control and eradication programs / P. Buller, M. Ashley, D. Palmer et al. // J. of Clin. Microb. 2010. - Vol. 48. -№ 3. - P. 877-882.

200. Wani, S.A. Current understanding of the aetiology and laboratory diagnosis of footrot / S.A. Wani, I. Samanta // The Veterinary Journal. -2006.-Vol. 171.-P. 421^428.

201. Werff, C.D. van der. Bestrijding en therapie van rotkreupel bi j echapen in Friesland / C.D. van der Werff // Versl.Land.Onderz. 1968. -Vol. 704.-P. 90-100.

202. Whittington, R J. Epidemiological issues in the evaluation of footrot diagnostic tests / R.J. Whittington // Australian college of veterinary scientists. Sydney, 1995.

203. Whittington, R.J. Antigens for serological diagnosis of virulent ovine footrot / R.J. Whittington, V.F. Saunders, E.K. Moses // Vet. Microbiol. -1997.-Vol. 54.-P. 255-274.

204. Whittington, R.J. Application of ELISA to the serological diagnosis of virulent ovine footrot / R.J. Whittington, J.R. Egerton // Vet. Microbiol. -1994. Vol.41. -№ 1-2.-P. 147-161.

205. Whittington, R.J. Grading the lesions of ovine footrot / R.J. Whittington, P.J. Nicholls // Res. Vet. Sci. 1995. - Vol. 58. - № 1. - P. 2634.

206. Whittington, R.J. Humoral immune responses in ovine footrot / R.J. Whittington // The University of Sydney. Australia, 1994.

207. Williams, K. A simple and sensitive method for detecting bacterial elastase production / K. Williams, K.D. Phillips, A.T. Willis // Letters in Applied Microbiology. 1988. - Vol. 7. - P. 173-176.

208. Winter, A.C. Lameness in sheep / A.C. Winter // Small Ruminant Research. 2008. - Vol. 76. - P. 149-153.

209. Winter, A.C. Lameness in sheep 1. Diagnosis / A. Winter // In Practice. 2004. - Vol. 26. - P. 58 - 63.

210. Younan, M. Update on footrot in south-west Germany / M. Younan, H. Both, W. Muller // Dtsch. tierarztl. Wochenschrift. 1999. -Vol. 106. -№ 2. - P. 66-67.

211. Zhou H. Dichelobacter nodosus serotype M fimbrial subunit gene: implications for serological classification / IT. Zhou, J.G.H. Hickford // Vet. Microb. 2001. - Vol. 79. - P. 367-374.

212. Zhou, H. Extensive diversity in New Zealand Dichelobacter nodosus streins from infected sheep and goats / PI. Zhou, J.G.H. Hickford // Vet. Microb. 2000. - Vol. 71. - P. 113-123.

213. Zhou, H. Novel fimbrial subunit genes of Dichelobacter nodosus: recombination in vivo or in vitro? / H. Zhou, J.G.H. Hickford // Vet. Microbiol. 2000. - Vol. 76. - P. 163-174.

214. Zhou, H. Rapid and accurate typing of Dichelobacter nodosus using PCR amplification and reverse dot-blot hybridization / H. Zhou, J. Hickford, K. Armstrong // Vet. Microb. 2001. - Vol. 80. - P. 149-162.

Информация о работе

Алексеева, Светлана Викторовна
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 06.02.02

Диссертация

Усовершенствование диагностики копытной гнили овец с помощью молекулярно-генетических методов - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы