Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ОСМОУСТОЙЧИВЫХ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ И ИХ ВЛИЯНИЕ НА СТРУКТУРУ УРОЖАЯ, ВОДОПОТРЕБЛЕНИЕ И АНДРОГЕНЕЗ РАСТЕНИЙ СОИ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ОСМОУСТОЙЧИВЫХ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ И ИХ ВЛИЯНИЕ НА СТРУКТУРУ УРОЖАЯ, ВОДОПОТРЕБЛЕНИЕ И АНДРОГЕНЕЗ РАСТЕНИЙ СОИ"

На правах рукописи

СОЛОВЬЕВ Владимир Петрович

получение рекомбинантных осмоустойчивых клубеньковых бактерий и их влияние на структуру урожая, водопотребление и андрогенез растений сои

03.00.23 — биотехнология

/

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

МОСКВА 1996

Работа выполнена в отделе молек\лярнои генетики растений Института молекхлярнои генетики Р\Н и лаборатории селекции и физиологии сои ВНИИ сои Р \СХН

Иаччные р\ководит^ли доктор биологических лачк, про фессор Э. С. Пирузян, кандидат биологических иа\к Л. В. Не-умывакин.

Научный коис\льтант кащидат биологических иачк Л. К. Малыш.

Официальные оппоненты академик Р \С\Н В. С. Шевелу-ха, доктор биологических нахк профессор Н. И. Шевякэва.

Вед\щая организация ВНИИ сельскохозяйственной бпо технологии Р \СХН

в «/у» часов на заседании диссертационного чченого совета Л 120.53 07 в Л\осков1_кои сельскохозяйственной академии имени К \ Тимирязева по адрес\ 127550 \л Тимирязевская, -49, сектор защиты диссертации ТСХ \

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХ \

Автореферат разосл ш « » л^г^г1996 г

Учагыи секретарь диссертационно!о совета—

1997 I

кандидат биологических наук

Лосева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследований. В условиях Дальнего Востока нашей страны одной из основных высокобелковых культур является соя. На Дальнем Востоке в настоящее время районировано 1* сортов сои с продолжительностью вегетации 96-120 дней и средним урожаем 20-23 ц/га.- Однако колебания урожая сои по годам в регионе составляют 10-15 ц/га. Причиной этого являются низкие температуры в отдельные периоды развития сои, а также недостаток влаги и/или переувлажнение почвы (т.е. осмотические факторы).

Изучение симбиоза растений с осмоустойчивыми ризобиальными бактериями сои имеет большое теоретическое и практическое значение. Их результаты способствуют пониманию механизмов осмоустойчи-вости как бактериальной, так и растительной клетки. Многолетние исследования с использованием клеток растений не дали пока еще убедительных объяснений работы генетического аппарата в условиях осмотического стресса. Только после того, как в 70-х годах было обнаружено, что клетки бактерий и растений одинаковым образом реагируют на повышение осмолярности среды, молекулярные механизмы осмотолерантности бактерий стали использовать в качестве модельной системы. . ■

Создание рекоибинантных бактерий-симбионтов сои, способных х повышенному синтезу пролина, который является осмопротектором, может 'положительно повлиять на целый £яд физиологических функций .инокулированных ими растений сои. Это, возможно, позволит снизить энергетические затраты растения на азотфиксацию и жизнеобеспечение -и увеличить урожайность. Кроме того, такие бактерии, вероятно, ■способны повысить устойчивость растений к таким стрессовым воздействиям окружающей среды как засоление, засуха или переувлажнение.

Цель 'исследований. Цель исследований - изучение влияния ри-зобиальных бактерий-суперпродуцентов пролина на эффективность симбиоза с растениями сои.

)

ЦЕНТРАЛЬНАЯ НАУЧЧ'Я БИБЛИОТЕКА Моек... .о. охоз академии

^ЖЗША

Для достижения цели исследования необходимо было решить следующие задачи

1 Перенести мутантный оперон Escherichia coli proBosrproA в бактерии-симбионты сои Rhizobium fredil, и изучить влияние его экспрессии на жизнеспособность данных бактерий

2 Изучить жизнеспособность и осмоустойчивость рекомбинант-ных ризобиальных бактерий.

3. Установить вирулентность полученных рекомбинантных бактерий

4 Определить влияние рекомбинантных ризобиальных бактерий на различные физиологические характеристики растения водопотреб-леиие, урожайность, структуру урожая, эффективность инокуляции

5 Оценить влияние данных бактерий иа эффективность формирования каллуса сои андрогенного происхождения.

Л*]гчкая новнэна. Получены новые данные о результатах симбиоза соевых рекомбинантных бактерий R.fredii с растениями сои. Их влияние на недопотребление, изменение структуры урожая и формирование каллуса из пыльников сои

Практическая яивчиность. Перенос кутантиого гена proB0sm в клетки бактерий - окибиокгов сои Rhizobium fredil BD-12 привел к уяучшеиию тк-тКйЭМееткмбиости и осмоустойчивости

8*(«гзулътаТе переноса путантного гена ргоВ,9П. в R.fredii Ьолу^ен рекомбинантный штамм BD-32/PNSAR, клетки которого обладают большей жизнеспособностью за счет повышенного синтеза пролина Инокуляция растений сои штаммом BD-32/PNSAR приводит к уменьшению расхода воды на единицу урожая и повышению урожая семян по сравнению с инокуляцией исходным штаммом

Выявлены сортовые особенности реакции растении сои на инокуляцию рекомбинантными бактериями R.fredii, несущими оперон рго-в0згаргоА, в условиях Амурской области

Разработан метод получения каллуса из пыльников сои, позволяющий получить до 70SÉ каллусов Метод защищен 3 патентами России

Для обработки статистических данных разработан способ расчета средней модальной оценки для выборки с распределением не соответствующим нормальному (Гауссовому) закону распределения

Автор приносит благодарность Андрианову В М , Бегун С А , Аронштамму A3., Епифанцеву В. В , Кобец НС., Малышеву К С ,

Малыш Л.К./. Синеговской В.Т., Посыпанову Г.С.,} Тильба В.А., Чернину Л.С., Ясевич Н.В., Яскевич И.Д. за помощь в работе и моральную поддержку.

Апробация работы. Основные положения диссертации изложены в

9 опубликованных работах. Материалы диссертации докладывались на Конференции молодых ученых Сибири и Дальнего Востока, (Омск, 1989г.), Научно-практической конференции Южного Отделения ВАСХНИЛ (Винница, 1990г.), IV Всесоюзной научной конференции "Микробиология сельскому хозяйству" (Пущино -, на - Оке, 20-24 января 1992г.), V конференции Российской Федерации "Микробиология -сельскому хозяйству" (Пущино - на - Оке, 18-22 мая 1992г.), Научной сессии ' общего собрания ДВО РАСХН.- "Научное обеспечение АПК Дальнего Востока" (Уссурийск, 1993г.), Президиуме ДВО РАСХН "Проблемы биотехнологии" (Хабаровск, 1993г.)

Структура ■ объем диссертации. Диссертация изложена на №7 страницах машинописного текста, включает 16 таблиц, 10 рисунков,

10 приложений. Список литературы включает наименования отечественной и зарубежной литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ,

Объект исследований. В работе использованы штаммы E.coli: КК 2036 (получен из музея ВНИИ генетики); HB 101 (получен из музея ИМГ РАН); HB 101/pNSAR, HB 101/PLVAR (получены в данной работе);

Штанны бактерий Rhizobium fredii: BD-32, МА-46, AS-171, TS-196, 648a, OS-26. 8725, MID-10 (получены из ВНИИ сои ДВО РАСХН); BD-32/pNSAR, BD-32/PLVAR (получены в данной работе).

. Плазмиды: pBR 322 (Bolivar F. et al.); pCV 16 (Таняшин В.И. и др.): pVA 12-2 (Денисова Т.е.,и др.); рВ1-37 (получена от Хур-геса EM); pNLM,' pNS, pLV, pNSAR, pLVAR (получены в данной работе); pRK 2013 (Helinskl D.K.)

Сорта сои: Взлет и 0ктябрь-70 (получены из коллекции ВНИИ сои ДВО РАСХН).

Среды: В качестве полноценной жидкой и твердой (1,5% агара) среды для выращивания клеток E.coli использовали L-среду, для R.fredii - среду Pl. ЛВ качестве минимальной среды для E.coli использовали среду М9, для R.fredii - среду МС-Р1. Для культивирования пыльников сои использовали среду N6. '

Антибиотики ампициллин (Ар) - 100 мкг/мл. тетрациклин (TcJ - 10 мкг/мл, канамицин (Km) - 50 мкг/мл

Определение солеустойчивости и осмоустойчивости бактериальных клеток проводили путем измерения скорости роста бактерий (генерация в час) на среде с различной концентрацией NaCl.

Конъюгативный перенос плазмид проводили по Миллеру (Миллер.1976)

Выделение плазмидной ДНК проводили по методу Birnboim (Birn-boim Н С , Doly J 1979)

Выделение небольших количеств плазмидной ДНК проводили по методу, описанному в методическом пособии (Мазин и др , 1990)

Обработка рестриктазами Рестриктазы, использованные в работе, получены из НПО "Fermentas' г Вильнюс Для работы каждого фермента рестрикции использовали условия, предлагаемые фирмой-изготовителем (состав буфферной смеси, температура, pH)

Обработка ДНК полинуклеотидчигаэой Полинуклеотидлигаза фага Т4 была получена из НПО Fermentas" г.Вильнюс Для лигирования использовали условия, рекомендуемые фирмой-изготовителем

Электрофорез ДНК в агарозном геле проводили в горизонтальном аппарате, как описано в методическом пособии (Маниатис Т. и др., 1984)

Элюирование Фрагментов ДНК из агарозы элюцию ДНК из агароз-ного геля осуществляли центрифугированием с помощь» микроколонки С фильтровальной бумагой, (Наниатис Т. и др ,1984)

Трансформация клеток Е col i проводили по модифицированному методу Cohen (Cohen SN et al , 1972)

Трехродительское скрещивание проводили как описано в книге (Симаров и др., 1990)

ПРедгибридизация и ДНК-ДНК гибридизации перенос ДНК на нит-роцеллюлозные фильтры и блоттинг-гибридизацию проводили по методу Саузерна (Маниатис Т и др , 1984)

ной среде осуществляли по нетоду Бэйтеса (Bates L.S., 1973)

Количество пролина в биомассе сои определяли на Америка-но-Советско-Индийскон ИФК-Фурье анализатора PSCO/ISI IBM-PC 4250 совместного производства фирм Pacific Scientific (США), "М.Т. Экспор" (Индия) и Научно-методический центр по ИФК-спектроскопии ВИУА, НПК -як-Луч" (Россия)

в клетках Е coli и питатель-

Условия проведения вегетационного опыта: Описаны метеорологические особенности климата Амурской области и погодные условия в годы проведения исследований.

Проведение полевого опыта: мелкоделяночные опыты закладывалась в селекционном севообороте (предшественник ячмень, агротехника проводилась согласно рекомендациям для южной зоны) при площади питания растений - 45.10 см (согласно методике ВИР). Наблюдения и оценки проводили в соответствии с "Широким унифицированным классификатором СЭВ рода Glycine"(1981) и методическими указаниями по селекции и семеноводству сои (Корсаков н.И. и др. ■ 1975).

Проведение вегетационного опыта: опыт закладывали и проводили наблюдения за развитием растений и ..водопотреблением как описано в книгах (Журбицкий З.И., 1968; Посыпанов Г.С., 1991).

Определение вирулентности реконбинантных штаммов R.fredll осуществляли в микровегетационном опыте по методике, изложенной в статье (Бегун С.А. и др., 1973).

Контроль успешности инокуляции'осуществляли путем выделения клубеньковых бактерии у растений в фазу цветения."Бактерии проверяли на устойчивость к антибиотикам и способность расти на селективных средах. Выросшие колонии риэобий проверяли на наличие плазмиды соответствующей молекулярной массы.

Определение водопотребления растений сои: водопотребление определяли взвешивая сосуды каждые .3' суток и доводя водой их вес до постоянного,' что на момент полива соответствовало влажности 70-80Х от полной почвенной влагоемкости (ППВ).

Определение показателей продуктивности растений сои:

Оценку урожайности осуществляли взвешиванием семян и надземной части растения на весах ВЛКТ-500.

Структуру урожая оценивали по следующим параметрам: масса растения, масса бобов, количество бобов в узле, масса семян, количество семян, отношение зерно/солома, количество узлов на главной стебле и на растении. Массу определяли в граммах, количество плодов, семян, узлов в единицах штук.

Определение способности пролиферировать каллус у пыльников £ои: осуществляли с помощью разработанного в данной работе метода (Соловьев В.П., Малыш Л.К., 1992)

а -

Методика выделения пыльников пыльники выделяли у растений сои по методике, разработанной в данной работе (Соловьев В П., Патент N 1790877 от 14 05 90 МКИ А01Н 1/4, Патент N 1746951 от 09 01 90 МКИ А01Н 1/4)

Проведение математической обработки результатов опыта Статистическую обработку данных проводили на микро-ЭВМ - ' Электроника" КК-52 по Доспехову Б А (1985)

Подсчет средней доли образовавшихся каллусов эмбриоидов и растений осуществляли по формуле Ван дер Вардена (Ван дер Варден, 1960)

т*1

Р • х 100»

П+2

где р - средняя частота события в

т - число случаев наблюдаемых событий в опыте, п - количество произведенных наблюдений.

Доверительный интервал рассчитывали по формуле, приведенной в книге (Варфоломеев С Д, и др 1990)

/ р q. t m - */ n ♦ J 05

P

где p - средняя частота события в 5£,

q - определяется выражением. q»l00-p, п - количество произведенных наблюдений.

Для преобразования к нормальному закону распределения полученных в опыте значений мы использовали эмпирически подобранные нами логарифмические функции (1,2)

V- ctg (100 lg (1000 (х*1)). (1)

Y- 100 lg (1000 (х+1)). (2)

После проведения дисперсионного анализа преобразованных данных полученные значения средней и границ доверительного интервала

преобразовывали по формулам им.физического.содержания.

(3,4), соответственно, для придания

-2tg<Y>

, . 10

К- 10"3 10 -1; (3)

' -2Y -3 10 .

К. 10 10-1; (4)

Для оценки достоверности полученных данных рассчитывался коэффициент (критерий) достоверности F Фишера при р-0.95. После математической обработки с помощью вышеуказанных программ производили обратное преобразование полученного значения средней.и границ доверительного интервала.

Полученные результаты использовали для построения математических иоделей.

* • / ■."'■' РЕЗУЛЬТАТЫ

1. ПЕРЕНОС И ЭКСПРЕССИЯ 0ПЕР0НА РГоВ03тРГОА

ESHERICHIfr COLI В КЛЕТКАХ'БАКТЕРИЙ - СИМБИОНТОВ СОИ - . RHIZOBIUM FREDII

: 1.1. Отбор наиболее чувствительного к NaCl штамма R.fredil и определение его устойчивости к антибиотикам.

Среди изучаемых штаммов R.fredii наиболее чувствительным к соли оказался штамм BD-32. Он растет на минимальной среде PI без NaCirсо скоростью 0,02 генерации" в час,и со скоростью 0,001 генерации в час в- минимальной среде PI, содержащей 0,4 М NaCl. В минимальной среде t>l,содержащей 0,8 и 1,0 М NaCl, клетки штамма R-.fredii BD-32 не растут совсемг Клетки данного штамма устойчивы к концентрации канамицина 50мкг/мл, тетрациклина 10 мкг/мл н чувствительны-к концентрации ампициллина юо' мкг/мл.

I 2 Клонирование оперона proB,s„proA в составе вектора рУА 12-2

Для введения в клетки R fredil BD-32 оперон proB0STproA рек-лонировали из гибридной плаэмиды pNLM, имеющей репликон плаэмиды pSC 101. в вектор с широким кругом хозяев - pVA 12-2 Схема клонирования приведена на рисунке 1

Получили фрагмент ДНК Eco R1 - Bgl II плаэмиды pNLM и фрагмент ДНК Eco R1 - Bam H I векторной плаэмиды pVA 12-2

Гибридная плазмида, полученная в результате лигирования данных фрагментов - имеет размер 9,а т п н , содержит фрагмент хромосомы Е coll. кодирующий оперон proBosnproA (размер 3041 п н ). детерминанту устойчивости к канамицину Вставка ограничена сайтами рестрикции Pst I и содержит расположенные вне оперона proBosri_ proA сайты узнавания рестриктаэ Eco R I, Bgl II, Eco 1051 и гибридный сайт Bgl Il/Вал H I плохо узнаваемый каждой из рестриктаэ (см рис 1)

В начале экспериментов по клонированию мы определили. что клетки R fredii BD-32 обладают большой устойчивостью к канамицину (до 100 мкг/мл) и относительно меньшей устойчивостью х ампициллину (до 50 Mír/fcn) В связи с этим, после переноса в хлетхи R fredii работа с' шпгэмидой pNS. имеющей только один наркерный ген устойчивости к канамицину была вы сопряжена со значительными трудностями Для того, чтобы их набежать ны клонировали в составе плаэмиды pNS ген устойчивости * атпШциллину (bla) из плаэмиды pCV 16 (см рис 1) Гей bib вырезали с помощью рестриктазы Eco RI и лигмровали 'с ДНК плаэмиды pNS, расщепленной с помощь» той же рестриктазы ПЛаэнида pNSAR имеет размер 11 6 т П.н , содержит детерминанты устойчивости к канамицину и ампициллину и оперон ргоВ03тргоА (см рис I )

Аналогичным образом была получена плазмида pLVAR, содержащая нативный оперон ргоВА Данный оперон получили с помощью рестрикции плаэмиды pLMpro Плазмиду pLVAR использовали в качестве контроля

Мобилизационный перенос плазмид pNSAR и pLVAR осуществляли методом трехродительского скрещивания. В качестве плазмиды-помощ-ника использовали плазмиду pRK 2013.

и -

6м*|

ееош

Рис. 1. Клонирование оперона ргоВовтргоА на векторе с широким кругом хозяев рУА 12-2.

1 3 Характеристика плазмиды PNSAR после ее мобилизационного переноса в Rhizobium fredii

После мобилизационного переноса плазмиды pNSAR в клетки R fredil BD 32 отобрали несколько клонов Арг и выделили из них плазмидную ЯНК Клетки R fredii содержат только 1 плазмиду длиной около 12 т п н Плаэмида pNSAR после трансформации в R.fredii сохраняет сайты узнавания рестриктаз Eco 1051 и Eco RI Анализ плазмид pNSAR и pLVAR, после их переноса в клетки R fredii. показал, что они сохраняют нативную структуру в этой бактерии

1 4 Влияние различной концентрации NaCl на скорость роста рекомбинантных бактерии Rhizobiuro fredn BD-32

Данные о скорости роста бактерии R fredii BD 32 дикого типа, а также содержащих плазмиды pNSAR и pLVAR, приведены в таблице 1 Бактерии выращивали в жидкой богатой и минимальной среде Р1 с различной концентрацией NaCl

Таблица 1

Скорость роста (гекерация/час) клеток R fredil _таммов

BD-32, BD-32/PLVAR, BD-32/pNSAR в богатой и минимальной среде Р1 с различной концентрацией NaCl

Штамм Концентрация NaCl

Богатая среда Р1 "иничальна среда Р1

без NaCl 0 4 H 0 6 M 0 8 M без NaCl 0 4 M 0 6 M 0 8 M

BD-32 0 062 0 02 не растет не растет 0 02 0.001 не растет не растет

BD-32/PLVAR 1 0 0 8 0 4 0 145 0 076 0 025 не растет не растет

BD-32/pNSAR 1 0 0 8 0 4 0 15 0 09 0 125 0 06 0 01

Из таблицы 1 видно, что в богатой среде скорость роста обоих рекоибинантных штаммов и устойчивость к N801 значительно выше, чем у исходного штамма. Однако в минимальной среде клетки, содержащие плаэмиду РЫБАК, обладают большей скоростью роста и большей солеустойчивостыо, чем клетки, содержащие плаэмиду рГЛ/АЙ.

Таблица 2

Содержание пролина в клетках К.Гге<111 (нМ/мг белка) ' на среде Р1

штамм без NaCl С 0.4М NaCl X к исходному штамму

BD-32 4.5±0.3 5.8±0 6 100

BD-32/PLVAR 5.7*0.5 17.7±2 1 305.2

BD-32/pNSAR 7.110.4 64.4—4 5 1110.3

Содержание пролина в клетках рекоибинантных штаммов R.fredii выше, чем в в клетках исходного штамма BD-32.. Наибольшим содержанием свободного пролина отличаются клетки рекомбинантного штамма - BD-32/pNSAR - 64.4 i 4.5 (нМ/мг белка), что превышает этот показатель у исходного штамма на 1110.3 %.

1.5. Вирулентность рекоибинантных бактерий Rhizoblum fredil

В результате проверки полученных рекоибинантных штАммов Rhi-zobium fredii BD-32/PLVAR и BD-32/pNSAR нами было установлено, что их вирулентность и способность формировать клубеньки на корнях растений сои, несмотря на произведенные•генетические перестройки, осталась на уровне исходного штамма - BD-32.

Полученная рекомбинантная плазмида - pNSAR содержит оперон proB0smproA' и стабильно наследуется в^ клетках R. fredii. Это подтверждает данные по гибридизации плаэмидной ДНК, выделенной иэ риэобиальных клеток.

1.6.

.бактериями

Наблюдения за изменением физиологических функций инокулированных растений сортов Октябрь-7О и Взлет провопили в процессе всего периода роста. Обнаружили, что у растений обоих сортов.

потребления воды в период созревания и в период, предшествующий цветению. Результаты этих экспериментов для сорта Октябрь-70 приведены на Рис. 2. Аналогичная зависимость была получена для растений сорта Взлет. Сравнение ванных на графике показывает, что с 18 по 42 день от начала вегетации, т.е. в период,препшествуюший цветению, потребление вода растениями,инокулированными бактериями ВО-32/рН8А11, значительно нижа, чем у растений, инокулированных штаммами ВО-32 и ВО-32/р1.УАК. однако в период цветения и до начала созревания семян потребление воды у растений, инокулированных бактериями ВО-Зг/р^АЯ, несколько выше, чем у инокулированных бактериями штаммов ВП-32 и во-32/р1ЛГДя..

Нами было установлено, что суммарный расход воды на единицу урожая у растений, инокулированных бактериями ВО-3 2 / рЬ'Б АК, у сорта Взлет на 13.8%, а у сорта 0ктябрь-70 на 10.36% ниже. Чем у растений, инокулированных бактериями ВИ-32 и ЭО-32/рХ.7АК.

иноку пиров&нных штаммом ВО- 32/ рЫБАЯ

происходит снижение

1

т

< < >1 ч и гг и а к »» штамм Ш>-32 —•— стадо Ш-Эй/рнвАЯ -*'

I» <1

пггвмм ВО-за/'рПГАИ

44

47 И

Рис.2. График водопотребления растений сои сорта Октябрь 70

инокулированных штаммами И.£ге<:111 ВО-32, ВО-32/Р1Л/АК ВО-32/рЛ8АВ.

1 Зтачние иночу"чции р чтении_сои еор-св__а

ОК-*чбяь--'0 рехочбинтн-нъ-и Р1'305цз 'ьдь ч и _6.\ ч^е^и « -_и л

структуру УСОЛДЧ

В таблицах 3 и 4 приведены реэульта~ы апрелеЧения урохаинос-ти растении сои сортов 0ктябрь-"0 и Взле" а зависимости от инокуляции различными .^ачмами й

Как видно из таблиц, оба сорта дзот значите 1ьн>ю "Р1б1вку урожая после инокуляции растении бактериями „гамма 30-32 р%ЬАЙ 4г семян на сосуд и Ог вегетативной массы

Различия г"ежду сортами менее заметны. но достаточно достоверны Инокуляция растений бактериями с огазмидои ВЭ-32'р1ЛАЙ на дает им преимуществ по сравнению с бактериями 30-52 „ жо-о типа

Данные Таб"и1, 3.4 показывают, что "О критерию 5и_ера раа и-чия между показателями урожайности осмоустоичивого сорта Ок-тябрь-70 несущественны, тогда как для относите "ьньх значен , пораженных в проаентах к среднему, -эти разгибч достоверны, го каждому варианту 5~изки для урожая семян и надземной массы

Таблица 1

Урожаи с сосуда у осмоустойчивого сорта сои 0хтя6рь-?0 в зависимости от симбиоза с рекомбинантнъти -такиапи риэобиа1ььых бактерия

Штамм Урожаи семян в сос\де Уро>аи надзе^но ^ »1асеы

N Г к К СР«-ПН г !". к ссе-не-у

1 ВО - 32 21,2410,87 98.2ь 15.72 \ 35,1511,55 98,21 17,03 |

2 во-эг/рь.'Ал 20•10—0,56 93,03 16,73 32.^511.36 43,03 16,73 ]

3 ВО-32/рЯЬАЙ 23,0212,58 106.2814,ч2 38,6915,30 107,7915,92

^ табл 3,5 3,5 3,5 3,5

Гфакт 2,1 5,4 2,3 6,3

НСР 2,70 8,50 5,17 7,58

Для сорта Взлет, обладающего пониженной устойчивостью-расте-ний к осмотическому стрессу, урожай семян и воздушно-сухой биомассы растений, полученные с сосуда, различаются достоверно по вариантам опыта. А в процентном отношении к среднему значению эти различия еще более существенны. Прибавка урожая семян с сосуда после инокуляции штаммом BD-32/pNSAR составила 30,3% (110,99-80,68%) или 6,07 г/сосуд (20,53-14,46 г/сосуд), к штамму-аналогу - BD- 32/pLVAR И 3.7S5 (110,99-97,28%) или 2,52г/сосуд (20,53-18.01г/сосуд) в среднем по сравнению с исходным штаммом BD-32. Для урожая воэдушно-сухой массы с сосуда наблюдали несколько иную картину : штамм BD-32/pNSAR превзошел исходный штамм на 4,26 грамм и BD-32/pLVAR на 9,92 г.

Таким образом инокуляция растений сои рекомбинантным штаммом R.fredii BD-32/pNSAR достоверно повышает урожай у неустойчивого к осмотическим стрессам copra Взлет. Для осмоустойчивого сорта Октябрь 70 эта тенденция не наблюдается.

Таблица 4

Влияние симбиоза растений с рекомбинантными штаммами ризобиальных бактерий на урожай семян и вегетативной массы с сосуда у осмонеустойчивого сорта сои Взлет

г N Штамм Масса семян Вегетативная масса

г 1% к сюеян. г X к среднему

2 . BD-32 3 BD-32/pLVAR 4 BD-32/oNSAR 18,0111,78 97,28—5,36 14,4612,75 80,68±2,60 20.5312.49 110.99i5.98 29,5613,35 98,50+5,08 23.90+3,21 79,58+3,68 33.8213.08 112.79i8.54

Гтабл. - F<t>aKT. НСР . 4.1 8,21 51,0 2,88 6,21 4,1 4,1 3,7 28,4 6,34 8,62

По структуре урожая было проведено сравнение растений иноку-лированных различными штаммами бактерий. Сравнение проводили по 9 параметрам (см. методы). Результаты этих исследований приведены в таблицах 5-8. В соответствии с оценкой полученных данных по кри-

терию Фишера можно считать дос~оаернъ,ми различия не*.д> рлс-ени-чи по следующим показателям по ьо^ичес-зу бобов го массе сечьн .1 их количеству у растении сорта Октябрь-"^ го массе растения количеству бобов, количеству семян, количеству уз/"Ов у сорта Вз ь-

По структуре урожая растении сорта Ол-ябрь 70 (-аб- 5 ь) мы наблюдали результаты, годобные результатам го >рсжао семян и г оз-ду.шо-сухои биомассы с растения у сорта Вз1е~ (табт 3) Различия полученные при оценке влияния разных -гачпот К íred.i, исо "ьзо-ванных для иноку1Яции сорта Октябрь "*0, и оцененные с помощью критерия <?ииера не могут быть признаны достоверными

Ятя осмочувствительного сорта Взлет (-абл "".в) су_ествен-ность различии а соответствии с критерием Си_ера возрастет Лос-товерное превышение гоказате,~еи растении инокугироэанных _тамюм BD-32/pNSAR получено по массе растения - l^.-'Sr и 15.30Г у BD-32. массе бобов и массе семян с растения - 14,1нГ и 12,22г. 10,2ьг и 9,00г, соответственно, количеству бобов на растении - 2t.2j_r и 20,50шт Рост урожая происходил а гервую очередь за счет увеличения числа семян, образующихся на растении - 46,00 и 33,25 -- , что в основном происходит за счет большего количества бобов в узле - с l.lSiiT до 1,24шт и увеличения количества уэтов на растении - с 17,50шт ДО 19,63 JT

Таблица 5

Структура урожая сои сорта Октябрь 70 в зависимости от симбиоза с рекомбинантными штаммами R fredil

Элемент структуры урожая одного растения и»тамм Критерий Сисера FfcaKT.

BD-32 BD-32/pLVAR BD-32/p*!SAR

Масса растения (г) бобов (г) семян (г) Отношение зерно/солома 18,47£1.90 17,05—2,60 20,33£3,0б 1,607 14,11—1•72 13.70il.97 15,67£1,8б 1,233 10 62—1,18 10,05—1,51 11,51—1,62 0,952 1,54 10,12 1.59 £0.09 1,48 £0.07 1,570

Таблица б

Влияние симбиоза с реконбннангными штаммами К.ГгеаП на биометрические показатели сои сорта Октябрь 70

Элемент структуры урожая одного растения Штамм Критерий Фишера Гфакт.

BD-32 BD-32/pLVAR BD-32/pNSAR

Количество бобов (шт.) бобов в узле (шт.) семян (шт.) узлов (шт.) 22,2512,35 21,7513,36 25,1313,93 1,536 1,26 ±0,13 1,28 ±0,18 1,35 10,08 0,544 44,3817,07 42,2516,57 49,1316,96 1.246 18,1311,75 17,1312,16 18,6312,44 0,705'

Таблица Структура урожая сои сорта Взлет в зависимости от симбиоза с рекомбинантными штаммами R.fredii

Элемент структуры урожая одного растения Штамм Критерий Фишера Гфакт.

BD-32 BD-32/pLVAR BD-32/pNSAR

Масса растения (г) бобов (г) семян (г) Отношение зерно/солома 15,3011.80 12,2911,60 17,75+3,05 10,033 12,2211,48 9.48 ±1,39 14,1412,50 9,915 9,00 11,00 7,12 11.08 10,2611,74 8,821 1,54 10,12 1,59 ±0,09 ,1,48 10,07 1,569

?»б"ица 8

Влияние симбиоза с рекочбинан*гнь.ги „тамр^ри г( ?гес1* 1 на биометрические показатели сои сор~а Вз~ет

Элемент структуры урожая одного растения

ВО-3 2

80-32/р!ЛАК| ЗЭ-зг/р^А*

Критерии| О[ Г£ак- !

Количество бобов (шт ) бобов в узле (=т ) семян (ст ) узлов (шт )

20.50i2.8t. 15,3312,Б4

1,18 10,15 1.04 10.13

38,2515,12 29,251-.,37

17,5011,41 14,8811,30

;51Ь,06

-ь , 3-.

IV ьз12 ь:

3 |

10.5""> I ь,81 3 |

Повышение урожая у растении сои, иноху"ироаанных -тамком ри-зобиальных бактерий ВО-Зг/р^АЙ. происходит за сче- , валичения числа семян на растении, числа бобов в узте и количества узлов на растении

1 8 Содержание "родина в чорн°х р-\стени I

Определенные нами различия в урожайности иноку.-ированных различными цтаммами ризобии растений сои. вероя-но, ног/т бы~ь связаны с бочь-им накоплением свободного про-ина в корнях В связи с этим мы определили концентрацию гро^ина в корнях (вместе с клубеньками) у иноку-ированных разными „¡таммачи растении сои го двум изучаемым сортам Однако мы не обнаружили различий по содержанию пролина между растениями, инокулированнычи атаммом ВО-32, ВО-32/рСЛ/АЙ, ВО-Зг/р^АЛ. сортов Взлет и 0ктябрь-70. Концентрация пролина составила около в мг/кг сухой массы

1.9. Влияние инокуляции растений сортов Октябрь - 70 и Взлет ризобиальныни бактериями штамма ВР-зг/рМБАЯ на Формирование андрогенного каллуса

Одним из признаков, свидетельствующих о жизнеспособности растения, является жизнеспособность его семян и генеративных ор-. ганов.. Если предположить, что растение меньше затрачивает энергии на поддержание жизнеобеспечения, то оно будет уделять больше усилий формированию генеративных органов. В связи с этим мы изучили формирование андрогенных каллусов из пыльников сои исследуемых сортов» инокулированных штаммом ВЭ-32 и рекомбинантными штаммами. Результаты исследований показаны в таблицах 9,10. Из приведенных данных видно, что растения обоих сортов дают значительно больше пыльников, способных формировать каллус после инокуляции штаммом ВВ-зг/рЫЗАИ. Однако у осмоустойчивого сорта 0ктябрь-70 процент, пыльников, которые формируют каллус, больший чем у сорта Взлет.

Таблица 9

Зависимость доли пыльников сои сорта Октябрь 70, сформировавших каллус, от симбиоза растений с - ' различными штаммами й.ГгесН!

Штамм Высажено пыльников шт. В том числе с<| Ьоомиоовало каллус

шт. %

BD-32 BD-32/pLVAR BD-32/pNSAR 265 23 8,90 ¿3,40 231 ' 42 18,40±5,00 167 38 - 23,08±6,40

Таким образом нами обнаружено влияние штамма R. fredii BD-32/pNSAR, после, инокуляции им-растений сои, на увеличение способности пыльников пролиферировать каллус в культуре изолирован. , . ■ , .

ных органов.

Таб 1 !._J 10

Зависимость до"и пьпьников сорта Вэ ет сформировавших кал"УС от симбиоза р~\с~ении с различными _-аммачи R írecil*

цтамм Высажено | В -ом чисте слог )" _1 i_1

ПЬПЬНИКОВ 1 - 1 1

BD-32 251 ЗЬ 1"> ■,СГ4.Ъ0

BD-32/pLVAR 268 43 1 ъ 3014 -0

BD-32/pNSAR 330 ь7 20 5014 ,С

1-1-

Обсуждение

Увеличение скорости роста рекочбинантных'Ьантьрии В freuet, содержащих ген ргоВоч~, как в бога-сл TY сре^е, так и в минимл'ь-ной среде PI с NaCl, вероятно связано с деградацией избытка гро-■шна в глутамат, который, как известно, являете? осчопротек-сром ризобии и хорошим источником азота для рас~енли {таб ища 1) О том, что рекокбинантные бактерии R íredi.. BD-12/pNSA сгособны к сверхсинтезу гролина говорят данные, приведенные в таЫиье 2 Имеется прямая зависимость между количеством про-ина, синтезир>о-мого бактерией, и ее осмоустойчивостью Это совпадает с данными, полученными Le Rudulier et al (198ч)

Наличие реконбинантнои плазкиды pNSA в клетках R fvredli BD-32 никак не сказалось на их способности инфицировать растения сои Однако! инокуляция растении бактериями R. fred^.1 BD-32/pLVAR приводила к некоторому снижению образования клубеньков и отставанию в росте на ранних фазах развития растений Причина этого но-жет заключаться в неэффективной экспрессии оперола дикого типа ргоВА E.coli в бактероидах Однако более конкретные выводы можно будет сделать после проведения дополнительных экспериментов

В последние годы ведется интенсивный поиск взаимосвязи между потреблением воды растениеп и синтезом пролина. Обнаруженное нами снижение потребления воды растениями сои в результате инокуляции бактериями R. fredil BD-32/pNSAR является несколько неожиданным и

очень интересным (рис.1). Эти данные, безусловно, требуют еще дополнительной статистической проверки, но выявленная тенденция может иметь далеко идущие практические последствия.

Можно предположить. что симбиоз и образование бактероидов требует дополнительного потребления воды растением, а повышенный синтез пролина симбиотическими бактериями компенсирует дополнительное водопотребление.

Эти предположения согласуются с данными, полученными De Fre-yter R. и Gabriel D.W., которые показали, что заражение растений хлопчатника некоторыми вирулентными штаммами Xanthomonas compes-tis приводит к повышению водопотребления (Хвостова В., 1973).

Также о тенденции к повышению урожайности растений сои, ино-кулированных штаммом R. fredii BD-32/pNSAR, можно говорить на основании данных, приведенных в таблицах NN 3-8. Эта тенденция подтверждается статистической обработкой данных. Обнаруженное уже в первых экспериментах влияние ризобиальных бактерий - суперпродуцентов пролина на урожайность растения симбионта может служить косвенным подтверждением гипотезы о том, что повышенный синтез пролина в бактероидах может приводить кэкономии энергетических затрат растения и увеличению его продуктивности..

Согласно модели Kohl et al. (1988) растения сои затрачивают большое количество энергии на синтез пролина, который переносится в бактероиды, где расходуется на синтез НАДФ. Эта модель симбиоза хорошо объясняет полученные нами данные.

Полученные результаты позволяют предположить, преимущество симбиоза растений сои с рекомбинантным штаммом R.fredii BD-32/PNSAR, по сравнению со штаммом дикого типа. Обнаружено влияние штамма BD-32/PNSAR на увеличение урожая семян и массы над- . земной части растения. Превышение составляет от 9; до 14% (габл.3,4).

Кроме того, можно предположить положительный эффект влияния штамма BD-32/pNSAR на целый ряд физиологических функций инокули-рованных растений. Причем у сорта Взлет они более заметны по большему числу параметров.

Возможно это связано с.тем, что для осмоустойчивого сорта, каким является Октябрь 70, повышение устойчивости к засухе не дает существенных преимуществ в условиях достаточного увлажнения вегетационного опыта. Но для полевого опыта следует ожидать заметной

прибавки урожая от симбиоза с осчо,со»1чиаыпи „гачмани и д тя ос-ноустойчивых сортов за счет ботьи-^и эффективности использования фотосинтетически активной радиации (ОАР) »е го-ько в гер юц весенне-летней засухи, но и в дни с высокой среднесуточно i -ек-ррi-турой и пониженной влажностью воздуха

Такир* образом на основе изучения структуры урожай ocmovc^oh-чивого сорта Октябрь-"^ и осмочувствите-.ьного сср-а 8з/-ьг чо*но с большоЛ достовернос-ью утверждать, что использование ре^омбинанг-ньос риэобиальных бактерии с опероном ргоЗ^, . ргсА "риводн- л говы-^еишо урожая При этом наблюдаемое повышение >рож\я гроисходи- за счет увеличения чиста зерен, бобов 3 уз~е и "оэы-ения чиста >з"оа на растении Однако, д~я осмоус—оичибого сорта в условных ог-и-иалького увлажнения значения прибавки урожая по ее1иi ihp loioctj-вимы со значениями размаха изменчивости этого признака Тэ^да как для неустойчивого к осмотическому стрессу сорта значения прибавки урожая достоверны

Относительно отсутствия различии s содерж. 1нии ~ро~ина в корнях растении сои, инохулированных различными _тачнами ризобии, мы полагаем, что интенсивная деградация пролина в бактероидах не приводит к накоплению заметного пу,га данной аминокислоты в клубеньках, которую определяли, используя метод ИОК-спектроеко-ии

Различия в количестве гьльников, сформировавших ка^^-ус в культуре изолированных пыльников, чы полагаем связаны с тег, ч-э имея более мощную систему осчоустсичивости, чем сор**" Зз е- растения сорта 0ктябрь-70, с помощью риэобий - суперпрсдуцентоз гро-лина, способны создать больший запас полноценных питате-ьных веществ в пыльниках, что способствует их большей низнаснособности

Полученные нами результаты подтверждают важную роль "ро~ина в генеративных органах растений, описанную в литературе (Хохгов и другие, 1970Г . Russo S. , 1974, Cuha S., et al., 196^) применительно к растениям культурной сои

Роль повышенной концентрации эндогенного гролина в бактероидах до настоящего времени не исследована во всех аспектах

Chien С I. et al показали, что повышенный синтез эндогенного пролина в R.leguminosarum не приводит к повышению эффективности инокуляции растений (Chien С.Т., et al., 1991). Результаты наших экспериментов подтверждают эти данные, но мы показали. что повышенный синтез пролина в бактериях-симбионтах благоприятно

влияет на ряд физиологических функций растительного организма в процессе его развития.

ВЫВОДЫ

■1. Оперон proB0S„proA Eschtrichia coli в составе плазмиды pNSAR экспрессируется в клетках Rhizobium fredii и не оказывает влияния на вирулентность и способность формировать клубеньки на корнях сои у рекомбинантных штаммов.

2. Рекомбинантные бактерии R. fredii BD-32/pNSAR осуществляют повышенный синтез пролина и обладают повышенной осмоустойчи-востью.

3. Плазмида pNSAR стабильно поддерживается в клетках как свободноживущих ризобий так и в бактероидах.

4. Экспрессия оперона proBosmproA Eschtrichia coii в составе плазмиды pNSAR в клетках Rhizobium fredii не оказывает влияния на вирулентность и способность формировать клубеньки на корнях сои у рекомбинантных штаммов. ■ ч

5. Внесение бактерий R. fredii BD-32/pNSAR в почву одновременно с семенами сои приводит к снижению потребления растениями воды в начале вегетации и снижению расхода воды на единицу урожая..

6. Повышение урожая у растений сои, инокулированных штаммом риэобиальных бактерий BD-32/pNSAR, происходит за счет увеличения числа семян на растении, увеличения числа завязавшихся бобов в узле и количества узлов на растении. '. i

7. Не обнаружено ожидаемых различий по содержанию пролина в корнях между растениями сои, инокулированныни штаммами BD-32, BD-32/pLVAR, BD-32/pNSAR, сортов Взлет и 0ктябрь-70.

8. Обнаружено влияние штамма R. fredii BD-32/pNSAR, после инокуляции им растений сои, на увеличение способности, пыльников пролиферировать каллус в культуре изолированных органов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ И РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Плазмида pNSAR может быть рекомендована для повышения жизнеспособности различных риэобиальных бактерий и, возможно, других промышленно важных бактерий в стрессовых условиях.

2 Бактерии R fredi„ .тач^а BD-32/p"-bAR гогут быть рекомендованы в качестве бактериального удобрения

3 Штамм R fredli BD-32/pNbAR может быть рекогендован для использования в селекционной грактихе с целью повышения ^то^са-ности пролиферировать каллус у пыльников в культуре изолированных органов

Основные материалы диссертации опублкованы в работах

1 Соловьев В П Получение андрогенного чал"уса у со i Винница,тезисы докладов конф Винница 15-1? авг 1990г /ВАСХУ/Л ЮО Укр.НИИ кормов , 1990 - С 86-S7

2 Соловьев В П , Тришин М К Влияние течгераг>гхои -редоб-работки растении сои на андрогенез и его моделирование Новосибирск Приемы говышения продуктивности в соеводстве сб на/ч гр / РАСХН СО, ВНИИ СОИ, 1991 -С 17-24

3 Неумывакин Л В , Соловьев В П , Дегчсоаа Т С Чернен Л С , Пирузян Э С Экспрессия оперона proBosr proA Е coll в клетках Rhizodiim fredii. Пудино, Тезисы док-адов IV Всесоюзной науч.конф , Рувмно 20-24 янв 1992т ,С 14S

4 Неумывакин Л В , Соловьев В П Денисова ТС, Чернин Л С , Пирузян Э С Повышение жизнеспособности балгерии-симбионтов сои RhizobiUT fredu с помощью гетерологичнои экспрессии к>тант-ного оперона proBosr proA Escher»cMa coll Пу-,ино, Тезисы док-адов V конф Российской Федерации Пу-.ино, 18-22 чая, 19Э2Г ,С 32

5 Неумывакин Л В , Пирузян Э С , Соловьев В П По~>чение новой osm-мутации гена proB Escherichia coll го'учение, клонирование и использование гена ргоВ03- Тезисы докладов VI съезда ЗО-ГИС им. Н И Вавилова Минск, ноябрь 1992г

6. Соловьев В П , "алыш Л К Андрогенез у нехоторых сортов сои Амурской селекции. Новосибирск.'Проблемы соеводства на Дальнем Востоке"*Сб науч тр РАСХН Дальневост отд-ние ВНИИ сои -1992 - С 8-12

7. Соловьев В П Способ выделения пыльников растений. Патент N 1790877 от 14 05 90г МКИ А01Н 1/4

8 Соловьев В.П Способ выделения пыльников сои. Патент N 1746951 от 09 01.90Г МКИ А01Н 1/4

9 L V Neumivakln, W.P Soloviev, L.S СПегп1п, М Е Casparian,

N.A.Moseico, R.V.Shahbazjan, E.S.Piruzian. The increase of the viability of simbiotic soy-bean bacteria Rhizobium fredii by heterologous expression of mutant operon proB0S!BproA. Monreal Can.-1994.- p.282.-7lлInt.Symp. on the Genetics of Industrial Microorganisms (GDM94).

10. Соловьев В.П. Способ выделения пыльников сои. Патент N 2043016 от 15.11.96 г. МКИ AOIH 1/4. . , .

11. Неуиывакин Л.В., Соловьев В.П., Радюкина Н.Л., Мосейко Н.А., Шахбазян Р.В., Чернин Л.С., Пирузян Э.С, Клонирование му-тантного оперона proBosm proA Escerichia coll и его гетерологич-ная экспрессия в бактериях-симбионтах сои Rhizobium fredii.-ж."Молекулярная генетика микробиология и вирусология".- N 1, 1995Г.. с.14-21.

12. L.V.Neumivakin, W.P.Soloviev. ' A. Sokhansanj, V.A.Tilba, N.A.Moseico, R.V.Shahbazjan & E.S.Piruiian. Increase in osmotole-rance of Rhizobium fredii soy-bean isolate BD32 by the proB proA operon of Escherichia coli. Biochemical znd Biophysical Reserch Communications, Acad. Press, Inc.

Объем 1 п т

Заказ 1009

Тираж 100

Типография Плате, льства М( \ \ иТ^О Чоскна Тичнря кискам \ т }4