Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Симбиотическая азотфиксация при инокуляции сои смешанными культурами микроорганизмов

ВАК РФ 06.01.04, Агрохимия

Автореферат диссертации по теме "Симбиотическая азотфиксация при инокуляции сои смешанными культурами микроорганизмов"

На правах рукописи

СМОЛИН ВЛАДИМИР ЮРЬЕВИЧ

СИМБИОТИЧЕСКАЯ АЗОТФИКСАЦИЯ ПРИ ИНОКУЛЯЦИИ СОИ СМЕШАННЫМИ КУЛЬТУРАМИ МИКРООРГАНИЗМОВ

06.01.04 - агрохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1996

Работа "выполнена в Институте почвоведения и фотосинтеза РАН

(г. Пущипо)

Научный руководитель - кандидат биологических наук, старший

научный сотрудник В.II. Шабаев.

Официальные оппоненты - доктор сельскохозяйственных наук

С.А. Шафран. - кандидат биологических наук О.Б. Глаголева.

Ведущее учреждение - Московская сельскохозяйственная

академия имени К.А. Тимирязева.

Защита диссертации состоится в 15 час. 30 мин. в аудитории -М-2 на заседании диссертационного Совета по микробиологии и агрохимии К 053.05.86 в МГУ им. М.В. Ломоносова на Факультете почвоведения.

Адрес: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ. Факультет почвоведения.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Факультета почвоведения МГУ.

Автореферат разослан "'*>*" Г.

Приглашаем Вас принять участие в обсуждении диссертации на заседании диссертационного Совета по микробиологии и агрохимии в МГУ или прислать отзывы на автореферат в двух экземплярах, заверенные печатью по адресу: 119899, ГСП, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Факультет почвоведения. Ученый совет.

Ученый секретарь диссертационного совета

к.б.н. И.И.Бабьева

Актуальность темы. Создание новых систем землепользования, которые основаны на снижении воздействия на окружающую среду, предполагает расширение посевного клина бобовых культур для снабжения севооборотов азотом; Повышение урожаев бобовых, как показала мировая практика, во многом определяется успехом инокуляции семян препаратами клубеньковых бактерий.

В последнее время особого внимания заслуживают эксперименты, в которых обнаружена высокая эффективность инокуляции бобовых растений смешанными культурами клубеньковых бактерий с эндомикориз-НЫМИ грибами (Вагеа et al., 1987) или С бактериями родов Azotobao-ter, (Maurya, Sanoria, 1986), Azoepiriiium (Иванов с соавт., 1992; Андреева С соавт., 1993), Arthrobacter (Иванов с соавт., 1992) и РвеиЛотопав (Meyer, Linderman, 1986). Из перечисленных микроорганизмов особый интерес представляют ризосферные псевдомонады благодаря их быстрому росту, способности к выживанию и воспроизводству в ризосфере и. ризоплане большую часть вегетационного периода. Вместе с тем, следует отметить, что недостаточно изучено влияние ризосферных псевдомонад ,на симбиотическую азотфиксацию, минеральное питание и рост бобовых растений, в том числе и ценной продовольственной культуры сои.

Для стимуляции роста бобовых культур установлена целесообразность применения небольших "стартовых" доз минеральных азотных удобрений. Наряду с многочисленными исследованиями, свидетельствующими о высокой эффективности локального способа внесения под различные небобовые растения азотных удобрений, в особенности, в аммонийных и амидных формах (Трапезников, 1983; Гамзиков с соавт., 1985), имеются данные о положительном влиянии локализации минерального азота на рост бобовых культур, в том числе и сои (Минеев, Атрашкова, 1985; Шелевой, Волох, 1986). Однако не исследовано влияние этого приема на формирование и азотфиксируицую активность бобово-ризобиального симбиоза.

- г -

Цель работы. Изучение влияния инокуляции сои смешанной культурой клубеньковых бактерий B.Japontcum С бактериями рода Pseudо-топав и локального внесения в почву "стартового" минерального азота в аммонийной форме на симбиотическую азотфиксадию и рост растений.

Задачи исследований:

1. Изучить влияние инокуляции сои смешанными культурами

B.Japontcum С рИЗОСферНЫМИ бактериями Peeudomcmae fluoreecens 20

или p.fiuareecons 21 на клубвнькообразование и симбиотическую азотфиксадию в сравнении с применением одних клубеньковых бактерий ИЛИ клубеньковых бактерий совместно С эндомикоризным грибом Glomus

mosseae.

2. Определить интенсивность фотосинтеза растений сои при инокуляции смешанными культурами микроорганизмов.

3. Провести оценку локального способа внесения "стартового" минерального азота на клубенькообразование и симбиотическую азот-фиксацию.

4. Исследовать влияние инокуляции сои смешанными культурами микроорганизмов и локального способа внесения "стартового" азота на урожай сои.

Ь. Оценить влияние инокуляции сои смешанными культурами микроорганизмов и локального способа внесения "стартового" азота на вынос макро- и микроэлементов растениями.

6. Исследовать эффективность инокуляции сои клубеньковыми бактериями и ризосферными псевдомонадами в зависимости от уровня фосфорного питания растений.

Научная новизна. Впервые изучено влияние инокуляции сои клубеньковыми баКТерИЯМИ С рИЗОСферНЫМИ баКТерИЯМИ рода Pseudomoiuxa на серой лосной почве на симбиотическую азотфиксацига и рост растений. Установлено, что применение смешанной культуры клубеньковых бактерий с ризосферными псевдомонадами увеличивает массу растений вследствие улучшения клубенькообразования, усиления симбиотической азотфиксации и интенсивности фотосинтеза, повышения в растениях количества "биологического" азота, выноса ими азота удобрения и почвы, а также других макро- и микроэлементов. Установлен одинаковый эффект инокуляции сои клубеньковыми бактериями как с ризосферными псевдомонадами, так и с эндомикоризным грибом а.товвеав. Эффективность смешанной культуры B.Japontcum ПО с бактериями рода Peoudomonaa в значительной степени зависит от уровня фосфорного питания растений и возрастает с увеличением дозы фосфора. Впервые показано, что локальное внесение "стартового" минерального азота в

аммонийной форме на глубину 15 см повышает массу инокулированных клубеньковыми бактериями растений сои в результате лучшего формирования бобово-ризобиального симбиоза, .усиления симбиотической ■азотфиксации и увеличения в растениях количества "биологического" азота, а также азота удобрения.

Практическое значение. Инокуляция сои клубеньковыми бактериями с ризосферными псевдомонадами может быть использована для повышения урожая растений. Применение смешанной бактериальной культуры повышает эффективность фосфорного удобрения. Локальное внесение "стартового" минерального азота в аммонийной форме может быть рекомендовано для повышения урожая сои и эффективности азотного удобрения. Применение "стартового" минерального азота под сою при отсутствии клубеньковых бактерий в почве нецелесообразно вследствие усиления его потерь.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на Республиканской конференции молодых ученых и специалистов "Пути рационального использования удобрений и повышения плодородия почв" (Минск, 1986), Республиканской конференции "Симбиотрофные азотфик-саторы и их использование в сельском хозяйстве" (Чернигов, 1987), Всесоюзной конференции "Преобразование световой энергии в фотосин-тезирующих системах" (Пущино, 1989), II Всесоюзной конференции по биологической роли микроэлементов и их применению в сельском хозяйстве и медицине" (Самарканд, 1990), Республиканской конференции "Биологическая фиксация молекулярного азота и азотный метаболизм бобовых растений" (Гернополь, 1991), VI Европейском конгрессе по биотехнологии (Флоренция, Италия, 1993), V Всесоюзной конференции "Интродукция микроорганизмов в окружающую среду (Москва, 1994), IX Баховском коллоквиуме по азотфиксации (Москва, 1995).

Публикации. Но материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, списка литературы и приложения. Общий объем работы составляет 137 страниц машинописного текста. Работа иллюстрирована 23 таблицами и 5 рисунками. Список литературы содержит 207 источников, из них 135 иностранных.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Вегетационные опыты в климатокамере. В климатокамере KB-2FII ггри температуре 20-25° С и влажности воздуха 70-80 % в сосудах диаметром 9 см и высотой 15 см, вмещающих I кг воздушно-сухой

ночвы, выращивали но 2 растения сои сорта "нadeon". В почву вносили меченный 1rn азотнокислый кальций (изб.ат.% I5N - 17%) на фоне фосфорно-кашйного удобрения в дозах по 8 мг д.в. на 100 г почвы. В течение вегетационного иериода в динамике измеряли интенсивность фотосинтеза растений:

9.ÍÜLLJ.- Двухдневные всходы инокулировали в одном варианте суспензией клубеньковых бактерий B.Japonlcum ПО, в другом -смешанной культурой B.Japonlc ит ПО И Р.fluoreecene 20. lIOBTOp-ность опыта - четырехкратная.

Опыт 2. В дополнение к двум вариантам первого опыта в третьем варианте применяли смешанную культуру B.Japonlcum ПО С P.fluorée-cena 21, в четвертом - клубеньковые бактерии совместно с эндомико-ризинм грибом с,.таивесш. 'Повторность ошта - шестикратная.

Вегетационные опыты. В сосудах диаметром 9 см и высотой 30 см выращивали по 3 растения сои сорта "Магева".

0пъ1т I. В почву вносили "меченный 16N сернокислый аммоний (изб.ат.% 15N - 12,5%) из расчета 4 мг N/I00 г почвы на фоне РК из расчета по 8 мг д.в./100 г почвы. В одном варианте азот перемешивали с верхним 15 см слоем почвы, в другом - всю дозу азота помещали на глубину 15 см в виде ленты. Семена при посеве инокулировали суспензией производственного штамма клубеньковых бактерий B.japonicum 6436 (ВНИИСХМ). В динамике в течение вегетационного периода определяли активность симбиотической азотфиксации на интактных растениях. Повторность опыта - четырехкратная.

Опыт 2. Растения выращивали на субстрате, состоящем из смеси почвы и песка (1:1 по объему), при внесении фосфора из расчета О, Б, 10, 20 и 40 мг д.в. на фоне NK в дозах по 4 и 20 мг д.в./100 г субстрата соответственно. Азотное удобрение применяли в виде сульфата аммония, меченного 15n (изб.ат.% 15ы - 24,3%). В одной серии' опыта семена инокулировали суспензией B.Japonlcum ПО, в другой -смешанной культурой B.Japonlcum ПО С F .fluoreecene 21. ВО ВСеХ вариантах после уборки растений (в фазу начала образования плодов) измеряли ацетилепредукцию отделенных от корней свежих клубеньков. В вариантах без добавления фосфора и его внесении в дозе 20 мг д.в./100 г субстрата в динамике определяли активность симбиотической азотфиксации tu aitu. Повторность опыта - пятикратная.

Микрополевой опыт проводили в сетчатом павильоне ИПФС РАН. В сосудах без дна площадью 0,1 м2, вмещающих 30 кг воздушно-сухой почвы, выращивали по 11 растений сои сорта "Магева";. В верхний 0-15 см слой почвы вносили меченный 15N сульфат аммония (изб.ат.% I5N - 11,4 %) в количестве 400 мг N/сосуд на фоне РК по 800 мг

д.в./ сосуд. Кромо того, азотное удобрение вносили локально на глубину 15 см в виде лентн в междурядье. После уборки определяли винос растениями макро- и микроэлементов. Повторность опыта -четирехратная.

В опытах использовали серую лесную среднесуглинистую почву. Фосфорные и калийные удобрения вносили в почву в виде однозамещен-ного фосфорнокислого и сернокислого калия. Во всех опытах определяли массу растений, вынос азота урожаем и изб.ат.Ж 15н в растениях.

Микроорганизмы. В исследованиях были использованы 2 штамма флуоресцирующих псевдомонад Р.fluareeccna 20 и P.fluorescene 21, выделенные из ризосферы овса в группе "Симбиотическая и ассоциативная азотфиксация" ИПФС РАН совместно с сотрудниками лаборатории биологии нлазмид ИВФМ РАН. Бактерии были мечены транснозоном Тп5 и обладали устойчивостью к канамицнну (МИК > 0,2 мг/мл) и стрептомицину (МИК > 0,2 мг/мл). Проращенные семена или всходы сои при посеве инокулировали чистыми и смешанными культурами бактерий. Клубеньковые бактерии п.japaniсип применяли из расчета 10е клеток на растение. Соотношение клубеньковых бактерий и псевдомонад в -смешанных культурах составляло 5:1. Плотность клубеньковых бактерий при ЭТОМ не менялась, G.moeeeае вносили в почву на глубину 3-5 см ниже семян в виде смеси песка и корней овса (5 г в вегетационных и 30 г в микрополевом опытах), выращиваемого в песчаной культуре и инфицированного данным микроорганизмом. В варианте без инокуляции применяли автоклавированные культуры бактерий и эквивалентные количества песка с немикоризованными корнями.

Микробиологический анализ приживаемости псевдомонад на поверхности корней проводили но Гузевой-Звягинцеву (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991) с использованием среды Кинга Б для флуоресцирующих нсевдомонад с добавлением канамицина и стрептомицина. Частоту встречаемости микоризной инфекции на корнях сои определяли общепринятым методой (Селиванов, 1980).

А?™Ш19.5.ть симбиотической азотфиксации на интактных растениях сои измеряли ацетиленовым методом в модификации кафедры биологии почв МГУ с применением пропана в качестве внутреннего стандарта (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991). Азотфшссирумцую активность клубеньков определяли после их экспозиции в атмосфере ацетилена (10% v/v).

Интенсивность фотосинтеза. со2-газообмен целых растений измеряли с помощью оптикоакустического газоанализатора "Infralyt" (Германия) (Мудрик, Мудрик, 1986).

Химический анализ растений и почвы. Содержание азота в растительном материале и почве определяли феноловым методом (Кудеяров, 1972). Изотопный состав азота в пробах измеряли на эмиссионном спектрометре N01 - 5. Содержание других макро-, а также микроэлементов в растениях сои определяли общепринятыми методами.

Долю атмосферного азота, фиксированного клубеньковыми бактериями и включенного в растения, рассчитывали по формуле изотопного разбавления (Rennie et al., 1978).

Статистическую обработку урожайных данных и результатов аналитических определений проводили методом дисперсионного анализа (Доспехов, 1973) с использованием программы DSPRIF, реализованной на ЭВМ IBM - PC.

ГКЗУЛЬТЛ'Ш ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние совместной инокуляции сои клубеньковыми бактериями и бактериями рода Pseudomonas ипи эндомикоризным грибом G. mosseae локального способа внесения "стартового" минерального азота на симбиотическую азотфиксацию, минеральное питание и рост растений

Инокуляция сои B.japanioum ПО совместно с каждым из испытанных штаммов Г.fluoresceпа ИЛИ а.товвеое ЗНЭЧИТеЛЬНО СТИМуЛИрувТ рост растений и повышает урожай в сравнении с одними клубеньковыми бактериями. При применении смешанных культур микроорганизмов масса зерна сои r вегетационных опытах в климатокамере повышается на 1017%, а в микроиолевом - на 18-28% (табл. I, 2). При этом масса общей надземной части растений соответственно имела тенденцию к росту или достоверно возрастала. Влияние штаммов p.fiuoreacene и а.таввеае на урожай било примерно одинаковым.

Наши исследования показали высокую эффективность применения B.japonicum вследствие их отсутствия^ данной почве. Это позволило использовать в качестве культуры сравнения неинокулированные растения, не имеющие корневых клубеньков, для расчета количества атмосферного азота в инокулированных растениях. На долю "биологического" азота в урожае при применении микроорганизмов приходилось до 60-70%, а на азот удобрения - всего 5-7%, что было в 5 раз меньше количества азота почвы в растениях.

Инокуляция сои смешанными культурами микроорганизмов увеличивает вынос азота растершими во всех опытах. Прибавки урожая сои

Урожай и вынос азота растениями сои. Вегетационные опыты в климатокамере

В а р и а н т ы Масса растений (сухое вещество) Вынос азота растениями

гюрно общая масса клубеньки общий атмосферы

г/сосуд мг/сосуд

0 И Ы Т 1

I-. Без инокуляции 2,09 5,02 — 97 —

2. В .japonlcum 11(1 3,18 6,28 1,24 236 116

3. B.Japonlcum 110 •

Р. fluoreuccna 20 3,73 6,45 1,45 266 148

Iicrüb 0,49 0,58 0,13 27 12

0 II Ы Т 2

I. Без инокуляции 1,86 3,29 — 86 —

2. B.Japonlcuт 110 2,21 3,99 1,03 101 27

3. B.Japonlcum 110 +

Р.fluoreecena 20 2,57 4,40 1,18 126 34

4. B.Japonlcum 110 4

Р.fluoreecens 21 2,59 4,44 1,20 129 33

5. B.Japonlcum 110 1

G .moeeeae 2,51 4,21 1,15 119 35

UC,0b 0,27 0,41 0,08 16 « 6

при применении псевдомонад или эндомикоризного гриба происходят в результате улучшения клубенькообразования и увеличения в растениях количества атмосферного азота. Под влиянием смешанных культур микроорганизмов на 12-17% повышалась масса корневых клубеньков по сравнению С инокуляцией СОИ ТОЛЬКО В^ароп1сит ПО (табл. 1). В растениях, инокулированных смешанными культурами микроорганизмов, значительно (до 40%) нозросло количество азота атмосферного происхождения, а также азота удобрения (на 8-15%) и азота почвы (на 1429%) (табл. 2). Причем наибольшее повышение выноса почвенного азота с урожаем было обнаружено в варианте с р./гиогеасепа 21.

Микробиологические- исследования показали высокую степень при-

Урожай и вынос азота растениями сои. Микрополевой опыт

Способ внесения асота Масса растений (сухое вещество) Вынос азота растениями

Варианты зерно общая масса общий атмосферы удобрения почвы

г/сосуд мг/сосуд

1 -Без инокуляции В СЛОЙ 18,7 48 ,1 1001 — 156 845

2 • В. ,Japontсит 110 почвы 0-15 СМ 49,1 94 ,4 3345 2195 183 967

3 .в. р. ,Japonlcum 1 10í .fluoreacene 20 58,0 ПО ,7 3789 2473 210 II0G

4 • В. р. .Japonlсит I10+ .fluoreacena 21 59; 5 117 ,9 3044 2399 198 1247

b .в. G. .Japonlcum. llOf .moaoeae 62,9 117 ,2 4364 3059 207 1098

К • В. .Japonlcum 110 Локально 57,4 109 ,2 3740 — 268 —

7 • В. G. ,Japonlcum 110+ , топ яеае на глубину 15 СМ 59,7 115 ,7 4080 — 274 —

5,7 14 ,6 137 120 15 100

Примечание: при локальном внесении азотного удобрения количество азота атмосферы и почвы в растениях не рассчитывали вследствие отсутствия варианта без инокуляции.

жипаемости микроорганизмов на корнях. Численность р./1иогеасепа 20 на корнях сои составила 1,5 х Ю4 и 3,5 х Ю4 клеток, а р./1иогев-сена 21 ■ 4,ь х 10^ и 2,3 х 10^ клеток на 1 г сухих корней соответственно в вегетационных и микрополевом опытах. Частота встречаемости микоризной инфекции нри применении а.лювосае достигала 3536% в микрополовом и 47% в вегетационном опыте в сравнении с 10 и 17% на контроле соответственно.

Локальное внесение "стартового" минерального азота в аммонийной форме ниже зоны расположения основной массы корневых клубеньков в сравнении с его перемешиванием с верхним слоем почвы значительно- повышало массу растений, в том числе и зерна сои при ее инокуляции только клубеньковыми бактериями как в микрополевом, так и в вегетационном опытах (табл. 2, 3). Прибавки урожая при локали-

Урожай и вшюс азота растениями сои. Вегетационный опыт I

Способ внесения .азота Масса растений (сухое в-во) Вынос азота растениями

Варианты зерно *) клу- ' беньки общий атмосферы удобрения почвы

г/сосуд мг/сосуд

Без инокуляции В слой почвы 0-15 см 6,80 — 177 — 90 87

Локально 7,75 на глубину 15 см 195 108 87

В.}ароп1сшп. 6436 В СЛОЙ почвы 0-15 см 8,33 190±20 226 56 82 77

Локально 9,40 на глубину 15 см 250-40 292 99 98 80

Н0Р05 0,81 20 15 12 9

среднее из четырех повторений - стандартное отклонение

зации азота были обусловлены положительным ее влиянием на формирование и азотфиксирующую активность бобово-ризобиального симбиоза (табл. 3, рис. 1) и увеличением в растениях количества атмосферного азота, а также выноса ими азота удобрения (табл. 2, 3). Потребление растениями азота из почвенных запасов при этом практически не изменялось.

Локализация "стартового" минерального азота обеспечивает получение примерно одинаковых прибавок урожая сои, инокулированной одними клубеньковыми бактериями, как и применение смешанных культур микроорганизмов с одновременным внесением азотного удобрения в верхний 15 см слой почвы.

Добавление с.шзаше к в^арст1сит. ПО в микрополевом опыте на фоне локального внесения минерального азота практически не влияло на урожай сои, несмотря на некоторое увеличение выноса азота растениями, и не изменяло количество удобрения в урожае

(табл. 2). В то же время локализация азотного удобрения в сравнении с его перемешиванием с верхним слоем почвы при инокуляции сои

fi M CjH^/сосуд Ачас

601

40"

50-

20"

зо-

10"

0

30

40

50

во

70 сутки

Рис. 1. Активность симбиотической азотфиксации (in situ). Вегетационный опыт 1.

1 - N в слой почвы 0 - 15 см, 2 - N локально на глубину 15 см

данной смешанной культурой микроорганизмов приводила к уменьшению накопления азота растениями.

Под влиянием смешанных культур микроорганизмов резко возросли площадь листьев (рис. 2) и интенсивность фотосинтеза целых растений (рис. 3) после месяца их роста в сравнении с применением одних клубеньковых бактерий. В среднем за вегетационный период со2-газо-Обмен СОИ, инокулированной В .ja.ponlcu.vl ПО с Р./1иогевсепв 20 ИЛИ р./гиогевсеш» 21, усилился на 16-18%, а в варианте с внесением о.таввеае - на 10%. Интенсивность фотосинтеза в расчете на единицу листовой поверхности при комплексной инокуляции сои всеми испытанными микроорганизмами не изменялась.

• При совместной инокуляции сои В^ароп1ыт ПО с Р./1 иогевсепв 20 в сравнении с применением одних клубеньковых бактерий в микро-иолевом опыте повышался вынос зерном сои Р, к, Са, Mg, Ре, Ъп, Си, Мп, Мо и Со, а также количество в общей надземной массе практически всех, кроме железа, питательных элементов. Добавление к клубеньковым бактериям р./гиогевсепв 21 или а. товвеав также увеличивает вынос зерном большинства элементов минерального питания. При инокуляции сои смешанными культурами микроорганизмов, особенно клубеньковыми бактериями с нсевдомонадами, обнаружено снижение выноса железа общей биомассой растений за счет резкого уменьшения

Рис 2. Площадь листьев растений сои. Вегетационный опыт 2 в климатокамере.

1- без инокуляции, 2 - B.japonicum 110,3 - B.japonicum 110 + PJluo -rescens 20.4 - B.japonicum 110 + P.fluorescens 21,5 -B.japonicum 110 + G.mosseae.

мг СС^ / сосуд / час

сутки

Рис 3. Интенсивность фотосинтеза растений сои. Вегетационный опыт 2 в климатокамере.

1 - без инокуляции, 2 - В^аропгсит 110,3 - В.^аротсит 110 + Р./!ио-гезеет 20.4 - В.]аротсит 110 + Р.Яиогезсет 21.5- В^аротсит 110 + О.тонеае.

его количества в соломо, что, вероятно, связано со снижением доступности данного элемента в результате образования бактериями си-дерофоров (НеПапак, Ьеогщ, 1986).

Локализация "стартового" минерального азота по сравнению с его вносонием в весь верхний слой почвы как при инокуляции сои чистой культурой в.,1ароп1сит 110, так и при совместном применении клубеньковых бактерий с о. товвеае также повышает вынос практически всех перечисленных выше элементов зерном сои и общей надземной частью растений.

Увеличение количества элементов минерального питания в урожае сои.при комплексной инокуляции и локализации азота было обусловлено ростом биомассы без существенных изменений их концентраций.

Применение смешанной культуры в.,!арап1сит ПО с каздой из нсевдомонад по сравнению с инокуляцией сои чистой культурой клубеньковых бактерий снижает потери "стартового" азота удобрения (на 15-30%) вследствие большего вынбса его растениями, а в варианте с р./гиогевеепс 21 кроме того и в результате усиления закрепления в почве (табл. 4). Внесете а.товвеае в почву увеличивает использование растениями меченого азота в результате уменьшения его иммобилизации в почве, не влияя на его потери. При отсутствии в почве клубеньковых бактерий происходят значительные потери "стартового" минерального азота, а также уменьшение размеров его использования

Таблица 4

Баланс удобрения в системе "почва-растение" после выращивания сои. Мшсрополевой опыт

В Способ удобрения, % от внесенного

а р и а н т ы внесения количества

азота в растениях в почве не учтено

I. Без инокуляции В слой 39 14 47

2. В.Jароп1 сит 110 почвы 46 21 33

3. „ , , , ТГ1. 0 15 см B.Japonlcum 11U+

Р./"luorescime 20 53 20 27

4. В. Japonlcum I l(Jt

P.fluoreecene 21 49 28 23

5. B.Japonlcum IlUl

G .тонвеае 52 17 31

6. B.Japonlcum IIC) Локально 67 14 19

7. B.Japonlcum I lüf На ГЛубИ-

G.moeeeae ну 15 см 69 17 14

растениями и иммобилизации.

При локализации азота и инокуляции сои как чистой культурой B_.fapon.tcum 110, так и'совместно с а. товвеае были обнаружены максимальное использование азота удобрения растениями - 67-69% от внесенного количества и минимальные размеры иммобилизации в почве и потерь - 14-19%.

Таким образом, наши исследования показывают, что инокуляция сои смешанными культурами микроорганизмов значительно стимулирует рост растений и повышает урожай. Увеличение массы растений при применении ризосфорних псевдомонад, также как и эндомикоризного гриба в.товвеае происходит вследствие усиления активности симбио-тической фиксации молекулярного азота и интенсивности фотосинтеза, а также улучшения минерального питания растений. Усиление симбио-тической азотфиксации иод влиянием смешанных культур микроорганизмов, вероятно, связано с повышением интенсивности фотосинтеза и притока фотоассимилятов в корневые клубеньки. В основе положительного ВЛИЯНИЯ бактерий рода ТвеиЛотапав И а.товвеао на фОТОСИНТез лежит увеличение площади листьев, вызванное, по-видимому, кроме того и образованием микроорганизмами фитогормонов (Селиванов, 1981; Уапгига, 1909). Однако нельзя исключить и обратной последовательности этих процессов: в силу указанных выше свойств псевдомонада и эндомшсоризннй гриб улучшили клубенькообразование и нит-рогеназную активность корневых клубеньков, что, вероятно, и привело к усилению фотосинтеза, улучшению азотного питания и стимуляции роста растений.

Положительное влияние на симбиотическую азотфиксацию локального способа внесения "стартового" минерального азота на глубину 15 см наряду с улучшением ми ьного питания растений макро- и

•но, тем, что при этом не происходит увеличения концентрации подвижного минерального азота в зоне расположения основной массы корневых клубеньков вследствие иммобилизации и более длительного сохранения аммонийного азота в очаге его внесения (Гамзиков с соавт., 1985).

2. Симбиотическая азотфиксация при инокуляции сои смешанной культурой клубеньковых бактерий С бактериями рода РзеиОптапаз в зависимости от уровня фосфорного питания

микроэлементами, в том числе

удобрения, обусловлено, вероят-

Фосфорное удобрение оказывает положительное влияние на формирование и азотфиксирующую активность бобово-ризобиального симбиоза

гсак при применении чистой культуры в^арап1сш» 110, так и смешанной культуры клубеш.коних бактерий С Р .Пиогевсепв 21 (табл. Ь). Эффективность фосфора возраставт с увеличением его дозы.

В условиях дефицита фосфора (контроль) в обоих вариантах с микроорганизмами иитрогоназнал активность корневых клубеньков имела крайне низкие значения, несмотря на то, что их масса по сравнению с клубеньками растений, выращенных при внесении этого элемента, отличалась не столь существенно.

Значительные прибавки массы растений и выноса ими азота при

Таблица 5

Количество, масса клубеньков сои и их азотфиксиругацая активность в фазе начала образования бобов (уборка). Вегетационный опыт 2

Дозы Р?о5, мг/100 г субстрата Варианты Количество клубеньков шт. Масса сырых клубеньков г АФА клубеньков, цМ СоН.хШ-1 в час '

на сосуд

)-контроль В.Japanicvm 110 45 3,1 0,1 + 0,1

B.japanlcum I10+' Р. fluoreaceixa 21 38 3,1 0,1 + 0,0

5 B.japanlcum 110 56 3,2 1,6 + 0,3

13 .Ja.panlcum 1 10< P.fluorcnccna 21 56 3,6 16,0 + 4,4

10 13 . Japon leum I 1 0 59 3,2 11,2 £ 1.5

В. Japonlси.m 110+ }'. fltioronocnn 21 58 4,0 15,0 t 1,3

20 B.Japonlcum 110 69 3,8 11,0 ± 2,7

B. Japónleum. lIOl P.fluoreaoena 21 106 4,5 16,5 + 2,5

40 13. Japmi l cuvi 1 10 55 3,9 58,5 + 6,8

В. J apon l сим 1 1 0 f P.fluarcaoono 21 66 4,1 33,2 + 21,1

,iüP05 10 0,4

среднее из пяти измерений - стандартное отклонение

Урожай, вынос азота и фосфора растениями сои (уборка в фазе начала образования бобов). Вегетационный опыт 2

Лозы Р2о5, мг/100 г субстрата

О-контроль 5 10 20 40

О 5 10 20 40

Масса *) растении (сухое вещество)

г/с:ос:.уд

14.5

15.0

14.1 15,3 1С,,2

Вынос азота Изб.ат.% ■ Вынос фосфора растениями

растениями в растениях**^ целое растение клубеньки

мг/сосуд мг/сосуд

В.Jnpon1 сит 110

317 3,09 ± 0,33 75 5

408 3,52 - 0,29 84 6

389 3,62 - 0,30 117 6

378 3,45 i 0,17 154 411 3,50 - 0,40 209

1}. .1 а.роп1сит I 10 + Р. ?1иогевсепа 21

3,47 ± 0,18 3,22 ± 0,37 2,77 ± 0,33 3,01 - 0,22 2,81 ± 0,21

13,У "ШГ

16.3

109

16,0

ПЕГ

17.4

ПТ~

18,3

п:г

381 Т2П

425 104

447 115

448 ГГЗ

483 ПБ

2,1

49

86 ТТТ)

91 "ГШ

122 ТЩ

148

236 IТ2

22

8 9

5 9 8 9 9 3

Под чертой: % к соответствующей дозе фосфора с в..1ароп1сит 110

- в массу растений входят масса надземной части, корней и клубеньков.

среднее из трех измерений стандартное отклонение

инокуляции сои смешанной культурой бактерий при внесении минимальной дозы фосфора (табл. 6) обусловлены увеличением массы клубеньков и резким усилением их азотфиксирующей активности. Столь су-

ществешшя стимуляция нитрогеназной активности клубеньков и прибавка массы растений при комплексной инокуляции сои на фоне этого уровня фосфора связаны с повышением количества данного элемента в клубеньках, а не с увеличением его выноса общей биомассой растений.

Последовательное удвоение доз фосфора до 20 мг д.в. на 100 г субстрата при инокуляции сои смешанной бактериальной культурой, несмотря на повышение массы корневых клубеньков, практически не изменило их нитрогеназную активность. Вследствие этого не было обнаружено дальнейшего существенного роста выноса азота соей и урожая.

Иитрогеназная активность клубеньков достигала максимальных значений на фоне самой высокой дозы фосфорного удобрения как при инокуляции сои чистой культурой в^ароЫсит ПО, так и смешанной бактериальной культурой и не имела существенных различий между этими вариантами. В то же время следует отметить, что массы корневых клубеньков соответственно при применении чистой и смешанной культуры бактерий на фоне этой и предыдущей дозы фосфора не отличались, а их численность даже снижалась, в то время как уровень нитрогеназной активности клубеньков при применении 40 мг Р2оГ) возрос (до 5 раз) в обоих вариантах опыта. При внесении этой дозы фосфорного удобрения отмечен максимальный урожай и вынос азота биомассой сои, инокулированной смешанной бактериальной культурой, что было обусловлено резким усилением фосфорного питания растений и увеличением выноса ими фосфора (табл. 6).

Прибавки массы сои при инокуляции В^ароп1си.т 110 И Р.fluo-геесепв 21 по сравнению с применением одних клубеньковых бактерий на фоне средних (10 и 20 мг Г?0&) доз фосфорного удобрения не связаны с улучшением фосфорного питания растений, а происходят в результате усиления симбиотической азотфиксации. Повышение урожая сои на фоне максимальной дозы фосфора при применении смешанной бактериальной культуры в сравнении с одними клубеньковыми бактериями, наоборот, обусловлено увеличением выноса фосфора растениями, а не с симбиотической азотфиксацией.

Увеличение .урожая сои, инокулированной смешанной бактериальной культурой, обусловлено, вероятно, также и образованием ризо-сферными исевдомонадами ростактивирукщих веществ (Уапеига, 1989). В пользу этого также свидетельствует факт увеличения площади листьев, обнаруженный ранее при инокуляции сои смешанными культурами микроорганизмов в вегетационных опытах в климатокамере.

Динамика активности симбиотической азотфиксации ({п. вИи). Вегетационный опыт 2

Дозы г?о5,

мг/ши г субстрата

Варианты

цМ о2н4/сосуд/час'

Т

24 суток

47 суток

69 суток

О-контроль В. Japonlcum 110 389 - 60

В. ,1 арап I сит 110 V Р.ГХиогспсспп 21 417 - 129

101 - 20

93 - 9

I ± О

I ± О

20 п..1ароп1Пит I 10 373 ± 43 132 - 14

В. Jnpcm^oum 1104

Р.Ггиогеасспп 21 432 - 9 142 ± 2

8 ± I

19 ± 9

среднее из трех измерений ^'стандартное отклонение

Положительное влияние фосфорного удобрения на симбиотическую азотфиксацию при добавлении Р.Г1иогеосепв 21 К В.3арап1сит ПО обнаружено и при измерении ацетиленредукции на интактных растениях сои в динамике в течение вегетационного периода (табл. 7).

Меньшие величины изб. ат.% в биомассе растений, инокули-ровашшх смешанной бактериальной культурой, в фосфорных вариантах, в том числе в сравнении с соответствующими вариантами с применением чистой культуры клубеньковых бактерий (табл. 6), подтверждают данные по определению активности симбиотической азотфиксации и свидетельстнуют о том, что большие значения биомассы сои и выноса ею азота при комплексной инокуляции обусловлены увеличением в растениях количества "биологического" азота, а также о положительном влиянии фосфорного удобрения в этом процессе.

Таким образом, эффективность инокуляции сои смешанной культурой В. ,1ароп1сит 110 И Р. Пиогевсепв 21 В ЗНЭЧИТеЛЬНОЙ степени зависит от уровня фосфорного питания растений, возрастая с его увеличением. Повышение урожая сои при применении смешанной бактериальной культуры в сравнении с одними клубеньковыми бактериями на низких дозах фосфорного удобрения связано не с усилением потребления фосфора растениями, а со значительной стимуляцией симбиотической азотфиксации вследствие повышения его количества в клубеньках, а на высоких дозах фосфора - с увеличением выноса этого элемента

растениями. Применение ризосферных псевдомонад повышает эффективность низких, доз фосфорного удобрения в результате лучшей стимуляции клубенысообразования и усиления симбиотической азотфиксации.

выводы

1. Применение клубеньковых бактерий в^ароп1сит 110 с ризо-сферными псевдомонадами Р./1иогеесепв 20 ИЛИ р./гиогезсепа 21, также как и с эндомикоризным грибом а.тоаавае на серой лесной почве оказывает положительное влияние на клубенькообразование, симби-отическую азотфиксацию и рост растений сои и увеличивает урожай вследствие повышения в растениях количества "биологического" азота, а также азота удобрения и почвы в сравнении с чистой культурой

В.Jароп{сит 110.

2. Совместная инокуляция сои клубеньковыми бактериями с каждой из псевдомонад или с эндомикоризным грибом усиливает фотосинтез в результате увеличения площади листьев. Смешанные культуры микроорганизмов не влияют на интенсивность фотосинтеза в пересчете на единицу листовой поверхности.

3. Локальное внесение в почву "стартового" минерального азота в аммонийной форме на глубину 15 см улучшает клубенькообразование, усиливает симбиотическую азотфиксацию, повышает количество "биологического" азота в растениях, а также вынос ими азота удобрения. Локализация азотного удобрения при инокуляции сои одними клубеньковыми бактериями оказывает одинаковое влияние на урожай, как и инокуляция смешанными культурами микроорганизмов при перемешивании азота с верхним (15 см) слоем почвы. При локальном внесении азотного удобрения не обнаружено положительного эффекта смешанной культуры клубеньковых бактерий с эндомикоризным грибом.

4. Фосфорное удобрение усиливает положительное влияние инокуляции СОИ смешанной культурой В^ароп1сит 110 и Р. /1иогевсепз 21 на бобово-ризобиалышй симбиоз и рост растений, повышая массу, азотфиксирующую активность корневых клубеньков и вынос азота растениями, включая и "биологический" азот. Эффективность фосфорного удобрения возрастает с увеличением его доз. Применение смешанной культуры бактерий без достаточного обеспечения фосфором не эффективно.

5. Комплексная инокуляция сои смешанной культурой клубеньковых бактерий и ризосферных псевдомонад значительно стимулирует симбиотическую азотфиксацию и повышает массу растений при низком

уровне фосфорного питания вследствие увеличения его содержания в клубеньках, не влияя на вшюс этого элемента растениями.

6. Инокуляция сои клубеньковыми бактериями с каждой из псевдомонад или с эндомикоризным грибом, а также локальное внесение "стартового" азота значительно повышает вынос макро- и микроэлементов зерном сои и большинства питательных элементов (кроме железа) общей надземной биомассой, не влияя на их концентрации в зерне и соломо. При применении смешанных культур микроорганизмов, в особенности состоящих из ризосферных псевдомонад, установлено резкое снижение выноса железа общей надземной частью растений в результате уменьшения концентрации этого элемента в соломе.

7. Установлено снижение потерь "стартового" азота удобрения из почвы при выращивании сои, шокулированной смешанной культурой В.Japonlcum 110 С P./Iuoresoena 20 ИЛИ Р.fluoreecene 21, ВСЛвДСТ-

вие увеличения выноса азота растениями. Минимальные потери "стартового" азота из почвы обнаружены при его локализации в результате увеличения использования растениями и уменьшения размеров иммобилизации в ризосфере.

Но материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Влияние минеральных азотных удобрений на симбиотическую фиксацию азота и урожай бобовых культур // Тез. докл. Республиканской конференции молодых ученых и специалистов "Пути рационального использования удобрений и повышения плодородия почв" - Минск -1986. - С. 88-OU. (в соавторстве).

2. Количественная оценка и способы повышения симбиотической азотфиксации // 'l'en. докл. Республиканской конференции "Симбио-трофпне азотфиксаторы и их использование в сельском хозяйстве" (Чернигов). - Киев 1У07. - 0. 29-30 (в соавторстве).

3. Влияние ризосферных микроорганизмов на фотосинтетическую активность растений сои и симбиотичекую азотфиксацию // Тез.докл. Всесоюзной конференции "Преобразование световой энергии в фотосин-тезирующих системах" - Иущино - 1989. - С. 181-102 (в соавторстве ).

4. Влияние различных микроорганизмов на использование микроэлементов растениями н урожай сои // Тез. докл. II Всесоюзной конференции по биологической роли микроэлементов и их применению в сельском хозяйстве и медицине т. II - Самарканд - 1990. - С. 137138 (в соавторстве).

b. Влияние бакторий рода РаеиЛатапсш на симбиотическую азотфиксацию в зависимости от уровня фосфорного питания растений сои // Тез. докл. Республиканской конференции "Биологическая фиксация молекулярного азота и азотный метаболизм бобовых растений" ('Герно-поль) - Киев -- 1991. - 0. 6 (в соавторстве).

6. Урожай сои и содержание в растениях "биологического" азота при применении клубеньковых бактерий с ризосферными псевдомонадами или эндомикоризными грибами и локальном внесении азотного удобрения // Агрохимия -- 1992. N 10. - С. 9-17 (в соавторстве).

7. Химический состав растений сои при применении клубеньковых бактерий с ризосферными псевдомонадами или эндомикоризными грибами и локальном внесении азотного удобрения // Агрохимия - 1992. - N 11. - С. 84-90 (в соавторстве).

8. Влияние двойной инокуляции сои клубеньковыми бактериями и ризосферными псевдомонадами на симбиотическую азотфиксацию // Физиология и биохимия культурных растений - 1992. - 'Г.24, N 4. -0. 360-367 (в соавторстве).

9. Симбиотическая азотфиксация при инокуляции сои клубеньковыми бактериями с ризосферными псевдомонадами в зависимости от уровня фосфорного питания // Агрохимия - 1993. - N 6. - С. 21-28 (в соавторстве).

10. The effect of Paeudamonae genus baoteria on red beet and soybean growth and miorobiologioal nitrogen fixation // Abstract book of 6th European Congress on Biotechnology - Firenze -1993. - v. II. - TU. 116 (в соавторстве).

11. Роль микроорганизмов - стимуляторов роста растений в повышении урожайности // Тез. докл. V Всесоюзной конференции "Интродукция микроорганизмов в окружающую среду" - Москва - 1994. - С. 115-116 (в соавторстве).

12. Микробиологическая азотфиксация и рост растений при применении азотфиксаторов // Тез. докл. IX Баховского коллоквиума по азотфиксации (Москва) - Нущино: ОНТИ ППЦ РАН - 1995. - С. 98 (в соавторстве).

13. Влияние локального способа применения аммонийного азота на симбиотическую азотфиксацию и урожай сои // Доклады РАСХН -1995. - N 4. - С. 18-20 (в соавторстве).

14. со2-газообмен растений сои и симбиотическая азотфиксация при двойной инокуляции клубеньковыми бактериями с ризосферными псевдомонадами или эндомикоризными грибами // Известия РАН, серия биологическая - 1995. - и 6. - С. 693-701 (в соавторстве).