Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ОБРАЗОВАНИЕ И ЛОКАЛИЗАЦИЯ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В РАСТЕНИЯХ ТИССА {TAXUS BACCATA L., TAXUS CANADENSIS MARSH.) И В ИНИЦИИРОВАННЫХ ИЗ НИХ КАЛЛУ СНЫХ КУЛЬТУРАХ

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "ОБРАЗОВАНИЕ И ЛОКАЛИЗАЦИЯ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В РАСТЕНИЯХ ТИССА {TAXUS BACCATA L., TAXUS CANADENSIS MARSH.) И В ИНИЦИИРОВАННЫХ ИЗ НИХ КАЛЛУ СНЫХ КУЛЬТУРАХ"



На правах рукописи

ЗАЙЦЕВА Светлана Михайловна

ОБРАЗОВАНИЕ И ЛОКАЛИЗАЦИЯ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В РАСТЕНИЯХ ТИССА {Taxus baccata L., Taxus canadensis Marsh.) И В ИНИЦИИРОВАННЫХ ИЗ НИХ КАЛЛУСНЫХ КУЛЬТУРАХ

03.00.23 - Биотехнология, 03.00.12 - Физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2007

Работа выполнена в чабораторип лшшдного п фенольного четабочнзма Института физиологии растений им К. А. Тимирязева РАН, г. Москва

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Гчавный Ботанический Сад им НВ ЦнцинаРАН

Защита состоится 25 мая 2007; в 13 часов на заседании Диссертаци Д 220 043 10 при Российском Государственном Аграрном Университете - ^ К А Тимирязева по адресу 1375^0 г Москва ут Тимирязеве^ каг!оу.а Ишасас! ги тет/факс 477 44

С диссертацией можно ознакомиться в биб шотеке РГАУ-М1 4 Тимирязева по адресу 137550, г Москва ул Тимирязевская 49

Автореферат разосчан '_ апретя 2007г и размещен на саше •

www tunacad ru

Ученый секретарь

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ.

доктор биологических на\тс

Загоскина Наталья Викторовна

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ.

доктор био тоги чес ких наук профессор кандидат биологических наук

Калашникова Етена Анатольевна Сочовченхо Алексей Евгеньевич

Диссертационного совета, кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Для высших растений характерно образование так называемых "вторичных" соединений, к которым относятся фенольные соединения, синтезирующиеся практически во всех клетках (Harborne, 1980; Запрометов, 1993). Установлено участие этих веществ в формировании клеточных стенок, дыхании, фотосинтезе, аллелопатии, а также защите растений от стрессовых воздействий (Лукнер, 1979; Запрометов, 1996). Они имеют и важное практическое значение. На окислительных превращениях фенольных соединений основаны технологические процессы в пищевой и легкой промышленности. В медицине широко применяются лекарственные препараты, изготовленные на их основе, которые обладают капилляроукрепляющим, противовоспалительным, антисклеротическим, противолучевым и противоопухолевым действием (Барабой, 1976, 2001; Запрометов, 1993; Куркин, 1996; Тюкавкина, 2004; Плотников, 2005).

В последнее время большое внимание исследователей обращено на растения тисса (род Taxus), обладающие способностью к синтезу уникального соединения - таксола (таксоидов), успешно используемого в терапии онкологических заболеваний (Guy, Scott 1996; Guillemard, 1999; Borekdohalska 2000; Huang, 2000; Lee, Kim 2001). Фармо-кинетические особенности таксола проявляются в способности блокировать анафазу митотического деления, связываясь с цитоскелетом раковой клетки (Bicamumpaka, 1998; Pradier, 1999, Miller, 1999; Барабой, 2001). Таксокды представляют собой дагерпеноиды, в структуре которых присутствует 3-(М-метиламино)-3-фенилпропаноиловая структура, являющаяся производным фенольной природы. Следовательно, их биосинтез осуществляется при участии как изопреноидного, так и фенольного метаболизма. Взаимосвязь этих метаболических путей уже отмечалась в литературе (Пасешниченко, 1995). Однако данных о фенольных соединениях и их образовании в растениях тисса крайне мало (Орлова, 1977; El Moclafor, 1996; Das, 1993; Kawamura, 2000).

Поскольку растения тисса относятся к реликтовым видам и имеют ограниченный и труднодоступный ареал распространения в природе (Гумбатов 1989; Александрова, 1999), большое практическое значение приобретает инициация из них каллусных и суспензионных культур, как возможных источников биологически активных и лекарственных препаратов.

Целью настоящей работы являлось изучение фенольного метаболизма у двух предст

канадского

физиологическим характеристикам, а также у инициированных из них каллусных культур

В связи с этим были поставлены следующие задачи

1 Изучить образование и состав фенольных соединений листьев стеблей и корней тисса ягодного и тисса канадского

2 Исследовать изменения в образовании мономерных и полимерных форм фенольных соединений и активности ¿-фенилаланинаммиак-тиазы (ФАЛ) в процессе вегетации побегов тисса ягодного и тисса канадского

3 Выяснить внутритканевую и внутриклеточную локализацию фенольных соединений в различных органах тисса

4 Получить каллусные кучьтуры тисса ягодного и тисса канадского и изучить их способность к синтезу фенольных соединений

5 Исследовать изменения в содержании составе и локализации фенольных соединений в процессе пассирования клеток тисса ягодного и тисса канадского в усчовиях т vitro

Научная новизна. Впервые проведено изучение фенольного метаболизма растений тисса (Т baccata L и Т canadensis Marsh ) значительно отличающихся по морфо-физиологическим характеристикам, и его изменений в условиях m vitro

Показано, что тисс ягодный характеризуется более высокой способностью к накоплению фенольных соединений (особенно флавоноидов) по сравнению с тиссом канадским При этом в обоих случаях содержание полифенов было выше в тистьях и стеблях растений, чем в корнях

Фенольные соединения тисса представлены фенилпропаноидами и флавоноидами - флаванами (катехинами и проантоцианидинами), а также флавонолами В надземных органах растений состав фенольного комплекса более разнообразен, чем в подземных, преимущественно за счет образования флавонолов, которые не синтезируются в корнях

Показано, что образование суммы растворимых фенольных соединений, флавонолов, флаванов, проантоцинидинов и лигнина меняется по мере роста растений тисса, что в большей степени выражено в побегах первого года вегетации При этом активность ФАЛ, «ключевого» фермента биосинтеза полифенолов, не является критерием биосингетической способности тканей

Выяснено, что инициация каллусных культур тисса зависит от онтогенетического состояния эксплантов и от содержания в них фенольных соединений Формирование каллусных клеток более интенсивно происходит

на эксплантах зимнего периода вегетации, по сравнению с таковыми летнего периода вегетации.

Показано, что в условиях in vitro фенольный метаболизм клеток тисса меняется. Это проявляется и на количественном их уровне и на качественном составе. Во время первых циклов культивирования содержание фенольных соединений в каллусных культурах значительно выше, чем в тканях интактного растения (особенно у культур тисса ягодного). По мере дальнейшего пассирования уровень фенольных соединений либо продолжает увеличиваться, что характерно для культур тисса ягодного, или может снижаться, что отмечалось у культур тисса канадского. При этом значительное содержание фенольных соединений в каллусных клетках приводит к их гибели (каллусы тисса ягодного).

Установлено, что накопление фенольных соединений в каллусных культурах тисса обусловлено активацией ФАЛ, уровень которой во всех случаях был в 3-7 раз выше, чем в исходных тканях.

Показано, что растворимые фенольные соединения (флавоноиды и фенилпропаноиды) накапливаются в вакуолях, а также в специализированных клетках - вместилищах (фенол-запасающие клетки) как в тканях интактного растения, так и в каллусных культурах. Иногда они обнаруживаются и в межклетниках. Полимерные формы фенольных соединений (лигнин) откладываются в клеточных стенках. В каллусных культурах прослеживается прямая взаимосвязь между их способностью к синтез фенольных соединений и числом клеток-вместилищ.

Научно-практическое значение. Полученные данные вносят значительный вклад в понимание особенностей образования фенольных соединений в растениях, в частности у представителей рода Тахт и инициированных из них каллусных культурах. Установление высокой способности молодых тканей тисса (побеги первого года вегетации) к накоплению фенольных соединений может быть использовано в оценке качества растительного сырья. Важное значение принадлежит и результатам о том, что высокий уровень фенольных соединений в культурах in vitro приводит к их гибели. Это еще раз свидетельствуя о разнообразной роли этих представителей вторичного метаболизма в жизни растений.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международной ботанической конференции "Botanicgarden"(Freiburg, 2002), на V и VI Международных симпозиумах «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Москва-Пущино, 2003, 2005), V съезде

Общества физиологов растений России (Пеюа 2003) VI Симпозиуме по фенолышм соединениям (Москва, 2004), региональной конференции ОФР (Орел, 2006) расширенном семинаре лаборатории липидного и фенольного метаболизма ИФР РАН (Москва, 2006)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 2 статьи

Структура и объем диссертации Диссертация состоит го введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования результатов и их обсуждения заключения, выводов и списка литературы Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, включает 7 таблиц и 44 рисунка Список литературы содержит 361 источник, из которых 251 на иностранных языках

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объектом исследований служили растения тисса ягодного (Taxus baccata L ) и тисса канадского (Taxus canadensis Marsh ), произрастающие на территории Главного ботанического сада РАН (Москва), а также инициированные га них каллусные культуры

Инициация каллусных культур и условия субкультнвирования Для инициации каллусных культур использовали однолетние побеги тисса летнего и зимнего периодов вегеташш (июль и январь) Материал стерилизовали и помещали на модифицированную питательную среду Мурасиге-Скуга, содержащую НУК (0,5 мг/л), 2,4-Д (2 мг/т), кинетин (0,5 мг/т), бензиламинопурин (1,5 мг/л) а также сахарозу (25 г/л) и агар (7%) Каллусные культуры выращивали в темноте при температуре 26°С и относительной влажности воздуха 70% Продолжительность цикла культивирования составляла 28 дней

Определение содержания суммы растворимых фенольных соединений, флаванов, флавонолов, проднтоцнанидннов и лигнина осуществляли спектрофотометрическими методами Растительный материал экстрагировали горячим 70% или 96%-ным этанолом Содержание суммы растворимых фенольных соединений в этанольных экстрактах определяли с реактивом Фолина-Дениса, содержание флаванов - с 1%-ным раствором ванилина в 70% H2SO4 (попощение при 725 и 500 нм, соответственно) (Запрометов, 1971) Калибровочные кривые строили по (-)-эпикатехину Содержание флавонолов определяли с 0,5%-ным водным раствором AlCb (при 415 нм) Калибровочная кривая - по рутину (Gage, Wendei, 1950)

Содержание проантоцианидинов определили в этанольных экстрактах по реакции с бутанольным реактивом (при 550 нм) (Запрометов, 1974).

Для определения содержания лигнина материал последовательно экстрагировали этанолом, смесью этанол + бензол (1:2), эфиром и горячей водой (Запрометов, 1979; Загоскина и др., 1993). Свободный от экстрактивных веществ остаток гидролизовали 0,5н NaOH (36 ч, при 80°С). Охлажденный гидролизат центрифугировали (3000 об/мин., 10 мин.) и в надосадочной фракции проводили спектофотометрическое (при 610 нм) определение содержания лигнина по реакции с 2,6-дихлорхинонхлоримидом (Carceller et al., 1971). Калибровочную кривую строили по феруловой кислоте.

Определение активности ФАЛ. Для выделения фермента использовали Na-борэтный буфер (рН 8,8), содержащий ЭДТА (0,5мМ), дитиотреитол (ЗмМ) и поливинилпирролидон (Шипилова, Запрометов, 1977). Активность фермента определяли по методике Цукера (Zuker, 1965) проводя спектрометрическое определение образования транс-коричной кислоты га L-фенилаланина (поглощение при 290 нм).

Содержание белка определяли по методу Бредфорд (Bradford, 1976).

Определение содержания хлорофилла а и Ь проводили спектрофотометрическим методом (поглощение при 665 и 649 нм, соответственно) в этанольных экстрактах, с использованием коэффициентов, найденных Смитом и Бенитезом (Шлык, 1971).

Изучение состава феиольиых соединений. Для разделения фенольных соединений этанольные экстракты упаривали и использовали для одномерной и двумерной хроматографии в тонком слое (0,25мм) микрокристаллической целлюлозы (растворители: 1-й — н-бутанол — уксусная кислота - вода, 40:12:28; 2-й - 10%-ная уксусная кислота). Идентификацию веществ проводили на основании данных специфической флуоресценции в УФ-свете, по значениям Rf сравнительно с метчиками-стандартами и по качественным реакциям со специфическими реагентами (Шталь, 1965; Запрометов 1971; Мийдла, 1975; Запрометов, Загоскина, 1987).

Определение тканевой и внутриклеточной локализации фенольных соединений проводили на срезах тканей интактных растений тисса (25 мкм) и на временных давленных препаратах, приготовленных из свежих тканей каллусных культур. Для выяснения локализации фенольных соединений использовали 0,008% раствор реактива "Fast Blue" - на все классы полифенолов (Soukurova, 2000), 0,01% ванилиновый реактив — на флаваны и флорглюцин - на лигнин (Приступа и др., 1970, Запрометов и др., 1996).

Препараты просматривали и фотографировали с помощью светового микроскопа Erganall ( KarlZtess ' Германия)

Для электронно-микроскопических исследований раститечьный материал фиксировали глютаровым альдегидом (2,5%) в натрий-фосфатном буфере (pH 6,8) (Muller, Greenwood 1978) и в завершение заключали в Эпон Узьтрамикротомные срезы подкрашивали водным раствором уранилаиетата и цитратом свинца, а затем просматривали на микроскопе JEM - 100В (" JeoP\ Япония)

Статистическая обработка результатов. Эксперименты проводили в трех биологических и 2-3 аналитических повторностях Все результаты обработаны статистически На графиках и в таблицах представлены средние арифметические значения определений и их стандартные отклонения

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Содержание фенольных соединений в различных органах тисса

Первостепенной задачей являлось выяснение особенностей накопления соединений фенольной природы в различных органах растений тисса Определение их суммарного содержания показало более высокую биосинтетическую способность тисса ягодного по сравнению с тиссом канадским (рис 1) Наиболее ярко эти различия проявлялись в хвое, где их уровень был выше О высокой способности надземных тканей растений к накоплению потифенолов неоднократно сообщалось в литературе (Волынец Прохорчик,1983, Wagner, 2003) В стебле содержание фенольных соединений шоке (на 38% и 20% в тиссе ягодном и тиссе канадском, соответственно) Наименьшее их накопление характерно для корня Отчичия в содержании фенольных соединешш в различных органах и видах растений отмечались и другими исследователями (Запрометов, 1964, Juntheikki, 2000, Wagner, 2003)

Как швестно, одними из наиболее распространенных в зеленых тканях растений полифенолами являются флавонолы (Запрометов, 1993) В тиссе ягодном их количество было больше (на 20-30%), чем в тиссе канадском (рис 1 Б) Как и в стучае суммарного содержания полифенолов, в хвое уровень флавонолов был выше, чем в стебле В корнях образования этих веществ не происходило, что, по-видимому, обусловлено отсутствием в них хлоропластов - одного го основных мест их синтеза (Запрометов, Николаева 2003)

Ранее было показано, что для растений тисса характерна способность к синтезу флаванов (Das, 1993, Chattopadhyay, 1999, 2000) Их содержание у двух видов тисса было практически одинаковым и наиболее высоким в хвое

Значительное накопление флаванов характерно и для корней, где на их долю приходилось 60% и 80% от суммарного содержания фенольных соединений (для тисса ягодного и тисса канадского, соответственно), что возможно, связано с образованием таких их производных, как проантоцианилины. Наименьшее же накопление флаванов отмечено в стебле. Все это еще раз подтверждает различия в путях метаболизма фенольных соединений не только в различных органах растений, но и их видах, о чем сообщалось в литературе (Запрометов, 1964; ЬЫкига, 1976; 1ипШе1к1а, 2000).

Рис. 1. Содержание суммы растворимых фенольных соединений (А), флавонолов (Б) и флаванов (В) в различных органах растений тисса ягодного и тисса канадского.

Фенольный комплекс растений тисса. Поскольку состав фенольных соединений в растениях тисса практически не исследован, то представлялось важным его изучение. В побегах тисса ягодного обнаружено 37 соединений фенольной природы, тогда как у тисса канадского лишь 26. Как показали наши данные, основными компонентами фенольного комплекса растений тисса являлись флавоноиды. Наиболее разнообразный их состав характерен для хвои и стеблей тисса по сравнению с корнями. В значительной степени это связано с образованием флавонолов, биосинтез которых обусловлен функционированием в надземных органах хлоропластов.

На основании данных качественных реакций, кислотного гидролиза и сравнения с метчиками-стандартами в составе фенольного комплекса растений тисса предварительно идентифицированы нарингенин, рутин, моно-

и ди- гликозиды ксмпферола и кверцетина, (+)-катехин, (-)-эпикатехин, а также оксибензойная, гентизиновая, ванилиновая, феруловая и члорогеновая кислоты

Изменение фенольного метаболизма в процессе вегетации растений тисса. Одним из процессов, обуславливающих рост растений, является фотосинтез, стужащий основой как трофического так и энергетического его обеспечения (Головко, 1999) Определение содержания хлорофилла а и Ь показало, что у тисса ягодного уровень этих пигментов во всех случаях был выше, чем у тисса канадского (табл 1) При этом динамика их накопления в процессе вегетации была довольна близка

Таблица 1

Содержание хлорофилла (мг/г свежей массы) в побегах тисса ягодного и тисса канадского в различные периоды вегетации_

Период вегетации поиег Тисе ягодный Тисе канадский

Хюрофилл а Хлорофилл b а/Ь Хлорофилл а Хлорофиы b ab

весна первого года вегетации 96 3±2 1 75 6±1 6 1 26 39Ь*0 6 17 6*0 3 2 25

второго года вегетации 3^6 1*4,9 271 6*2 6 1 3 57 2±0 8 23 1±0 3 2 47

гето первого года вегетации 312 8±4 3 172 8±2,1 1 8 144 9*1 9 80 4±0 9 1

второго <.ода вегетации 316 1±4 4 178 4± 2 2 1 71 148 2± 108 4±1 7 1 36

осень первого года вегетации 264 3±3 6 104 1±18 25 188 0±2 2 78 4±0 8 2 39

второго юда вегетации 205 2±1 1 142 8±1 9 I 43 1*56 9±2 1 92 4±0 9 1 7

Известно, что образование фенольных соединений происходит практически во всех растительных тканях, хотя и зависит от вида и органа растения, а также фазы его развития (Запрометов 1993) Как уже отмечалось выше, растения тисса ягодного и тисса канадского значительно отличаются по морфо-физиологическим характеристикам, поэтому для понимания особенностей их фенольного метаболизма важно было изучить динамику образования полифенолов в течение вегетационного периода Исследования проводились на побегах тисса первого и второго года вегетации

Основным показателем биосшггетической способности тканей растений в отношении синтеза фенольных соединений является определение суммарного содержания растворимых фенольных соединений (Запрометов, 1975) Как

следует из представленных на рис. 2 А данных, содержание суммы растворимых фенольных соединений в побегах тисса значительно менялось по мере вегетации. Весной их накопление как в тиссе ягодном, так и в тиссе канадском было наименьшим. В летний период оно увеличивалось, а к осени - снижалось (в большей степени у тисса ягодного). Все эти изменения наиболее ярко проявлялись в побегах первого года вегетации (молодые активно растущие органы), тогда как в побегах второго года вегетации (зрелые ткани) они были незначительны.

Содержание флавонолов. доминирующих компонентов фенольного комплекса побегов тисса, было выше у тисса ягодного, по сравнению с тиссом канадским. В обоих случаях оно менялось по мере вегетации (рис.2 Б). При этом весной их было меньше, чем летом и осенью. В большей степени эти различия проявлялись в молодых активно растущих тканях (побеги первого года вегетации). Следует также подчеркнуть, что побеги второго года вегетации накапливали больше флавонолов, чем побеги первого года, особенно на начальных этапах роста (весна).

Что касается флаванов. которые являются частью флавоноидного комплекса растений, то динамика их накопления значительно отличалась от приведенных выше (рис. 2 В). Можно отметить, что растения тисса канадского накапливали гораздо больше веществ флавановой природы (особенно в осенний период), в отличие от тисса ягодного. При этом побеги второго года вегетации характеризовались наибольшим их накоплением.

В состав флаванов, входят также проантоцианидины, являющиеся олигомерами флавановой природы. Содержание тооантоцианидинов в побегах тисса канадского было выше, чем в побегах тисса ягодного (рис. 2 Г). Оно менялось по мере их роста и во всех случаях снижалось к концу вегетации (осень) у тисса ягодного.

Помимо так называемых растворимых, то есть мономерных, фенольных соединений в растениях образуется фенольный полимер лигнин, являющийся обязательным компонентом клеточных стенок растений (Запрометов, 1996; Войску 2000; Горшкова, 2004). Определение его содержания не выявило особых различий в способности побегов тисса ягодного и тисса канадского к его образованию (рис. 2 Д). В то же время в побегах первого года вегетации количество лигнина было несколько выше, чем в побегах второго года.

Ферментом, занимающим ключевую позицию между первичным и вторичным метаболизмом, является ФАЛ, катализирующая дезаминирование Ь-фенилаланина с образованием /яранс-коричной кислоты, которая служит

предшественником подавляющего большинства соединения фенольной природы, в том числе фенилпропаноидов, флавоноидов и лигнина (Jones, 1984, Запрометов, 1996, Boudet, 2000)

весна лето осень побег первого года

е-мес ягодшмй

весна лето осем> побег второго года | а ТИСС аанадский

чобата ооогога а тмес канадский

лобаг параого гада ■ пкеятлшл

побаг атоосго года а 1шх «внадсмй

Рис 2 Содержание суммы растворимых фенольных соединений (А) флавонолов (Б) флаванов (В) проантоцианидииов (Г) и лигнина (Д) а также активность ФАЛ (Б) в побегах тисса ягодного и тисса канадского разных периодов вегетации

Определение активности ФАЛ показало ее отличие у тисса ягодного и тисса канадского (Рис 2 Е) Так, в побегах первого года вегетации ее активность изменялась наиболее значительно у тисса ягодного, по сравнению с тиссом канадским В побегах второго года вегетации активность ФАЛ была значитетьно выше у тисса канадского, особенно осенью

Ряду авторов удалось показать существование прямой взаимосвязи между активностью ФАЛ и накоплением в тканях растений фенольных соединений (Сатш, Towers, 1973, Запрометов, 1996, Загоскина, 1990, Boudet, 2000) Для тисса во многих случаях эта корретяция не простеживается Так, наибольшая

активность ФАЛ характерна для молодых только что начавших свой рост однолетних побегов тисса ягодного, где накопление полифенолов минимально Это согласуется с предположениями исследователей о том, что высокая активность ФАЛ не всегда обуславливает большое накопление полифенолов (Шипилова, Запрометов 1977, Мидла 1977, Teramoto, Ishikura, 1985, Олениченко, 2006)

Таким образом, растения тисса обладают высокой способностью к синтезу веществ фенольной природы (особенно тисс ягодный) Эти соединения представлены как мономерными (фенилпропаноиды и флавоноиды), так и полимерными (лигнин) формами При этом наибольшее накопление фенольных соединений отмечается в молодых тканях тисса Это может быть следствием активных метаболических процессов, характерных для данного периода их развития Что же касается снижения уровня полифенолов к концу вегетации, особенно у тисса ягодного, то это может быть стедствием их катаболизма, о чем сообщалось в литературе (Запрометов, 1993, Жанаева, 1998) В случае же тисса канадского, накапливающего значительное количество фенольных соединений (особенно флавановой природы) в осенний период, то это вероятно обуставливает его высокую зимостойкость поскольку эти вещества выполняют антиоксидантную и криопротекторную функцию (Olsson, 1998, Blokhma, 2003)

Локализация фенольных соединений в растениях тисса. Как следует из выше изложенного, во всех органах растений тисса происходит образование полифенолов В связи с этим следующей нашей задачей являлось изучение их локализации

Фенольные соединения были обнаружены в эпидермальных, паренхимных и проводящих тканях растений тисса Они локализовались в специализированных фенол-запасаюших клетках-вместилшцах (эпибластах) (рис 3 Д Ж 3), клеточных стенках (рис 3 А, В) и иногда в межклетниках (рис 3 В, Г)

В корне фенольные соединения обнаружены в эпидермальных тканях (в клеточных стенках), а также в клетках паренхимы и в некоторых клетках флоэмы (рис 3 А, Б) Реакция на флаваны (с ванилиновым реактивом) совпадала с окрашиванием на сумму растворимых фенольных соединений (реакция с Fast Blue) Что касается лигнина, то он откладывался в клеточных стенках эпидермы и сосудах ксилемы (рис 3 В)

Рис. 3. Локализация фенольных соединений в корне (А-В); стебле (Г-Е) и листе (Ж,3) тисса (увеличение 3,2x16; 7x20).

А — реакция на флаваны; Б, Г, Д, Ж, 3 - реакция на сумму фенольных соединений; В, Е, - реакция на лигнин.

ЭП - эпидерма, П - паренхима, ЭНД - эндодерма, ФЛ - флоэма, КС - ксилема, СЦ -сердцевина, ГМ - губчатый мезофилл.

В стебле фенольные соединения присутствуют во всех клетках эпидермы, как в клеточных стенках, так и в вакуолях (в виде аморфного и гранулированного материала; рис. 3 Г, Д). Они также встречаются в клетках паренхимы и флоэмы. Единичные фенол-запасающие клетки обнаружены в сердцевине. Лигнин локализован в наружных клеточных стенках эпидермы и сосудах ксилемы (рис. 3 Е).

В листе фенольные соединения локализованы в эпидермальных клетках (в клеточных стенках и вакуолях) и в замыкающих клетках устьиц. В клетках губчатого мезофилла они присутствуют в виде гранулированных включепий в клетках-вместилищах (рис. 3 3). Фенольные соединения обнаружены также в

паренхимной обкладке проводящего пучка и флоэмы (рис 3 Ж) Лигнин был в замыкающих клетках устьиц и смолоходах, иногда в нижнем слое кутикулы, а также в сосудах ксилемы Такая локализация тигнина в растительных тканях характерна для многих растений (Ооге11коуа, 2000 ЯапосЬа, 2002)

Использование метода электронной микроскопии показало, что эпибласты имеют большую центральную вакуоль, в полости которой сосредоточены фенольные соединения в виде гранулированных включений (рис 4 А) Наряду с этим в тиссе было отмечено образование и таких клеток, где полнфенолы находились в млкровакуолях цитоплазмы (рис 4 Б)

Рис 4 Внутриклеточная локализация фенольных соединений в клетках тисса (В-вакуоль МкВ - микровакуоли Ц - цитоплазма)

Образование фенольных соединений в каллусиых культурах тисса ягодного и тисса канадского. Поскольку растения тисса относятся к редким реликтовым видам и имеют ограниченный ареал распространения в природе (Гумбатов, 1989, Александрова, 1999), то перспективным направлением является получение из них культур in vitro, как возможных источников биологически активных и текарственных препаратов Многими исследователями отмечались трудности при введении этих растений в культуру и низкая жизнеспособность полученных каллусов (Уразбахтина, 2000, Das, 2002) Известно, что фенольные соединения влияют на каллусообразование Поэтому мы использовали летние и зимние экспланты тисса, значительно отличающиеся по содержанию фенольных соединений (см рис 2 и 6)

Процесс каллусообразования на летних эксплантах двух видов тисса начинался на 21-27 дни культивирования, что сопровождалось потемнением питательной среды (рис 5) Аналогичная тенденция отмечалась и другими авторами при введении в культуру тканей с высоким содержанием полифенолов (Compton, Preece, 1986, Raghuvashi, 1995) Первичные каллусы, инициированные га летних эксплантов тисса имели плотную консистенцию, коричневый цвет и низкую скорость роста (рис 5 А) Перенесение их на

свежую питательную среду (через 30-35 дней) не приводило к улучшению роста культур и после двух пассажей они становились темно коричневыми и погибали.

A Б

Рис. 5. Инициация каллусных клеток на эксплантах тисса летнего (А) и зимнего (Б) периодов вегетации.

При использовании зимних эксплантов процесс дедифференцировки каллусных клеток происходил быстрее — на 10 - 16-й дни культивирования (рис. 5 Б). Возможно, это связано с более низким содержанием в них фенольных соединений. К седьмому пассажу наблюдалось потемнение клеток и снижение темпов роста культур. При этом каллусы тисса ягодного погибали, тогда как каллусы тисса канадского продолжали расти еще достаточно длительное время (более 20 пассажей), но с очень маленьким приростом. Все это свидетельствует об адаптации клеток тисса канадского к росту в условиях in vitro, чего не наблюдалось для клеток тисса ягодного.

Введение тканей молодых побегов тисса в культуру in vitro приводило к изменениям в фенольном метаболизме. Накопление фенольных соединений в клетках увеличивалось, особенно у культуры тисса ягодного (рис. 6). К седьмому пассажу содержание в нем растворимых фенольных соединений превышало таковое интактного растения почти в три раза. В тоже время накопление флаванов в каллусных культурах в большинстве случаев было несколько ниже, чем в исходных эксплантах. Следствием этого являлось уменьшение их доли в суммарном содержании фенольных соединений (до 16% у культур, инициированных из летних эксплантов, и до 34% у культур, инициированных из зимних эксплантов).

У каллусных культур тисса канадского во время первых пассажей накопление растворимых фенольных соединений также превышало таковое исходных эксплантов (в 3-м пассаже — в полтора раза, а в 7-м более чем в два раза), хотя к 7-му пассажу их уровень резко снижался (рис. 6 Б). Низкая биосинтетическая способность характерна и для длительно пассируемого каллуса.

I 50 + • 40 +

• 10 j-

т

- г

*•№« voMd

_□ ФС

I 1ШССЯЖ тисе ншдский

тисе мтдепа)

Рис 6 Содержание растворимых фенольных соединений (ФС) и флаванов (ФЛ) в летних (А) зимних (Б) чкеплантах тисса ягодного и гисса канадского а также в инициированных из них калл\ сных кучьтурах

Уровень активности ФАЛ в каллусных культурах тисса также значительно отличался от такового исходных эксплантов (рис 7) Во время 7-го пассажа, в каллусах тисса канадского он был в 3 раза выше, чем в интактных тканях, а в каллусах тисса ягодного - в 7 раз Это согласуется и с высоким содержанием в них фенольных соединений (см рис 6) О корреляции между активностью ФАЛ и усилением накопления полифенолов сообщалось в читературе (Camm Towers, 1973, Загоскина, 1990, Запрометов, 1996, Boudet2000)

•wee ягодный

тисе канадский

Рис 7 Активность ФАЛ в жеплантах и каллусных культурах тисса »годного и тисса канадского

Все это свидетельствует о том, что в условиях т vitro у каллусных культур тисса происходят не только морфологические, но и фшиолого-биохимические изменения

Исследование фенольного комплекса каллусных культур выявило его отличия от такового т vno Он становился значительно проще и содержал 15 соединений фенольной природы Основными его компонентами, также как и у интактных растений тисса, являлись флаваны - (+)-катечин, (-)-эпикатехин и проантоцианидины Образования флавонолов в каллусах не происходило и это естественно поскольку культуры выращивали в отсутствии света (в гетеротрофных условиях), а, судя по имеющимся к настоящему времени

данным, основным местом синтеза этих представителей фенольного метаболизма являются хлоропласты (Запрометов, 1994; Запрометов, Николаева, 2003). Среди фенолкарбоновых кислот были гентизиновая, ванилиновая и кофейная кислоты.

Следует также отметить, что по мере пассирования каллусных культур тисса ягодного состав флавановых компонентов менялся, за счет более разнообразного «набора» проантоцианидинов. У каллусных культур тисса канадского тенденция была иной, а к 21-му пассажу в составе фенольного комплекса было лишь три соединения фенольной природы.

Локализация фенольных соединений в каллусных культурах тисса.

Использование гистохимических методов позволило выяснить локализацию фенольных соединений, в том числе и флаванов, уже на раннем этапе инициации каллусов из сегментов побегов тисса, где они локализовались в цитоплазме паренхимных клеток и межклетниках. При этом на границе экспланта и каллуса формировался слой клеток с полифенолами, который как бы отделял их друг от друга (рис. 8 А). Такой «защитный слой» с полифенолами был замечен и в апогеотропных корнях саговниковых растений, отделяющих зону симбиотических бактерий (Лобакова и др, 2004).

Цитологические исследования показали, что культуры тисса ягодного и тисса канадского, как и большинство растительных культур in vitro, состояли из клеток паренхимного типа, разной величины, формы и степени вакуолизации (рис.8). Изредка среди них встречались меристематические очаги, представленные мелкими клетками с крупными ядрами. В каллусных культурах тисса на начальных этапах культивирования фенольные соединения обнаруживались иногда в цитоплазме и клеточных стенках паренхимных клеток, а также в межклетниках (рис.8 А).

Рис. 8. Локализация фенольных соединений в каллусных культурах тисса первого (А) и третьего (Б) пассажей.

А - реакция на флаваны (увеличение 3,2x16 ); Б - реакция на сумму фенольных соединений (увеличение 7x20).

У каллусных культур тисса третьего пассажа наблюдалось образование специализированных фенол-запасающих клеток (клеток-вместилищ) Первоначально фенольные соединения в этих клетках накапливались в цитоплазме (микровакуолях) а затем в центральной вакуоле в виде аморфного и гранулированного материала (рис 8 Б)

К седьмому пассажу число клеток, дающих реакцию на фенольные соединения, значительно увеличивалось и было максимальным, особенно у каллуса тисса ягодного что согласуется и с данными по содержанию в нем фенольных соединений Полифенолы локализовались в основном в клетках-вместилишах расположенных в виде небольших групп (по 3-8 клеток) Эти клетки (эпибласты) размерам превышали паренхимные в 2-3 раза (рис 9) У каллуса тисса канадского в этот период отмечается меньшее количество клеток-вместилищ чем у тисса ягодного Для него характерно формирование фенол-запасающих клеток сильно-вытянутой формы, длина которых превышала ширину в 5-7 раз К 15-му пассажу они встречались крайне редко Реакция на фенольные соединения изредка обнаруживалась в цитоплазме (в вакуолях в виде гранулированных включений)

Рис 9 Локализация фенольных соединений и флаванов в каллусных культурах тисса ягодного (А, Б) и тисса канадского (В-Е) 7-й пассаж Увеличение 7x20

А Б Г, Д - реакция на сумму фенольных соединений В Е - реакция на флаваны

Г

Таким образом, введение тканей молодых побегов тисса в культуру in vitro приводило к повышению их способности к синтезу фенолъных соединений. Это проявлялось как на уровне накопления полифенолов в каллусных культурах, так и на уровне их локализации, когда формировалось значительное количество клеток-вместилищ, содержащих эти вещества. При этом фенольные соединения являются одним из факторов, оказывающим влияние на жизнеспособность клеточных культур. Высокое содержание фенольных соединений в клетках вызывало гибель культур, что наблюдалось после двух циклов пассирования каллусов этих видов тисса, инициированных га летних эксплантов, и семи циклов пассирования каллусов тисса ягодного, инициированного из зимних эксплантов. В тоже время каллусная культура тисса канадского сохраняла жизнеспособность, по-видимому за счет отбора клеток с низкой способностью к синтезу фенольных соединений. Низкая биосинтетическая способность длительно-пассированного каллуса тисса канадского согласуется и с крайне бедным спектром синтезируемых в нем фенольных соединений.

ВЫВОДЫ

1. Впервые изучен фенольный метаболизм двух представителей рода Taxus -тисса ягодного (Г. baccata L.) и тисса канадского (Т. canadensis Marsh).

2. Показано, что в большинстве случаев тисс ягодный характеризуется более высокой способностью к синтезу фенольных соединений, чем тисс канадский. Это проявляется как на уровне накопления фенольных соединений, так и на их качественном составе.

3. Наибольшее содержание фенольных соединений, в том числе флавонолов, флаванов, проантоцианидинов и лигнина, отмечено в побегах тисса (особенно хвое), а наименьшее — в корнях. Аналогичная тенденция прослеживается и на уровне их качественного состава, который наиболее разнообразен в хвое, а проще всего в корнях.

4. Образование фенольных соединений меняется по мере вегетации растений тисса. Наибольшее содержание суммы растворимых фенольных соединений и флавоноидов отмечено летом, тогда как содержание флаванов и, в некоторых случаях, лигнина - осенью.

5. Активность L-фенилаланинаммиак-лиазы, являющейся одним из основных («ключевых») ферментов фенольного метаболизма, в большинстве случаев не является критерием способности тканей тисса к накоплению фенольных соединений.

6 Фенольные соединения в побегах тисса локализуются в эпидермальных и паренхимных тканях, а также в клетках сосудисто-проводящих пучков где они находятся в клетках-вместилищах, клеточных стенках и иногда в межклетниках

7 Инициация каллусных культур из эксплантов однолетних побегов тисса сопровождается значительным повышением их способности к синтезу фенольных соединений, в том числе и флаванов, что наиболее ярко проявляется у каллусов гисса ягодного

8. Показана твисимость процесса каллусоообразования н последующего роста культур тисса от содержания фенольных соединений в клетках чем оно выше, тем более вероятна их гибель

Список публикации по материалам диссертации.

1 Зайцева С.М , Александрова М С , Загоскина Н В Сезонные изменения содержания полифенолов в двух видах тисса (Taxus baccata and Taxus canadensis) // Abst ' Botanicgarden Freiburg 2002 p 307

2 Зайцева С.М, Загоскина H В, Александрова MC Об образовании фенольных соединений в растениях тисса // Сборник тезисов IV Международного симпозиума «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» Пущино — Москва 2003 с 191

3 Зайцева С.М, Загоскина Н В Каллусные ткани тисса ягодного и гисса канадского и образование в них фенольных соединений // Сборник тезисов V Съезда Общества фюиологов растений России, Пенза 2003 г С 509510

4 Зайцева С.М., Дубравина Г А , Загоскина Н В Каллусные культуры тисса ягодного и образование в них феночьных соединений// Тезисы докладов VI Симпозиума по фенольным соединениям Москва 2004 с 37

5 Дубравина Г А, Зайцева С.М., Загоскина Н В Изменения в образовании и локализации фенольных соединений при дедифференциации тканей тисса ягодного и тисса канадского в условиях ш vitro // Физиология растений 2005 Т 52 С 755-762

6 Зайцева С.М., Дубравина Г А Высокое содержание растворимых фенольных соединений как возможная причина апоптоза каллусных культур тисса // Сборник тезисов VI Международного симпозиума «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» Москва -Пущино 2005 Т 3 303-306

7 Зайцева С.М, Загоскина Н В Фенольные соединения тисса канадского и изменения в их образовании во время вегетации // Сборник

статей региональной конференции ОФР посвященной памяти Ефремова С.И. Орел. 2006. С. 119

8. Загоскина Н.В., Зайцева С.М., Александрова М.С. Изменения в образовании фенольных соединений при введении клеток тисса ягодного (Taxus baccata) и тисса канадского (Taxus canadensis) в культуру in vitro И Биотехнология . 2007. №1. С 29-34.

Выражаю признательность своему научному руководителю д.б.н. Н.В. Загоскиной, а также н.с. Г.А. Дубравиной, д.б.н., проф. В.Б. Иванову, д.б.н O.A. Гореловой, к.б.н. М.С. Александровой и всем сотрудникам лаборатории липидного и фенольного метаболизма ИФР РАН за консультации и помощь в проведении исследований.

1,25 печ. л.

Зак. 368.

Тир. 100 экз.

Центр оперативной полиграфии ФГОУ ВПО РГАУ - МСХА им. К.А. Тимирязева 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44