Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение in vitro клеточных и тканевых культур подсолнечника (Helianthus Annus L.), устойчивых к Sclerotinia sclerotiorum

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Получение in vitro клеточных и тканевых культур подсолнечника (Helianthus Annus L.), устойчивых к Sclerotinia sclerotiorum"

На правах рукописи

НГУЕН Тхань Хай

ПОЛУЧЕНИЕ IN VITRO КЛЕТОЧНЫХ И ТКАНЕВЫХ КУЛЬТУР ПОДСОЛНЕЧНИКА (HELIANTHUS ANNUS L), УСТОЙЧИВЫХ К SCLEROTINIA SCLEROTIORUM

Специальность 03 00 23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2008

ООЗ

003168600

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии Российского государственного аграрного университета - МСХА имени К А Тимирязева

I,

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Е.А. Калашникова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Н.В. Загоскина

кандидат сельскохозяйственных наук, С.Н. Кирсанова

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии (ВНИИСХБ)

Защита состоится " 24 " /щЯ, 2008г в часов на заседании Диссертационного совета Д 220 043 10 при Российском Государственном Аграрном Университете - МСХА имени К.А Тимирязева, по адресу 127550, г Москва, ул Тимирязевская, 49, Ученый совет РГАУ-МСХА имени К А Тимирязева, тел /факс (495) 976-04-28

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им НИ Железнова РГАУ-МСХА имени К А Тимирязева

Автореферат разослан "¿$1" n>.*ififj£< 2008г и размещен на сайте http //www timacad ru

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор сельскохозяйственных наук сРЗ^ги* Н Б Пронина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В связи с ведущей ролью подсолнечника, как важнейшей масличной культуры в России, а также большими потерями его урожая от вредных организмов, первостепенное значение приобретает повышение устойчивости растений к особо опасным патогенам, а также разработка защитных мероприятий по защите растений от - белой, серой, пепельной гнилей, фузариоза, эмбелдизии, ложно - мучнистой росы и других болезней Большую опасность для культуры подсолнечника представляют эпифитотии белой гнили (Sclerotinia sclerotiorum), а в последние годы и фомопсиса (Phomopsis hehanthi), являющихся основной причиной значительного недобора урожая и снижения товарных и посевных качеств семян

Данную проблему трудно решить, используя отдельно традиционные способы защиты растений и посевов агротехнические, химические и биологические, так как ни один из них не обладает достаточной эффективностью

Радикальным средством защиты подсолнечника от фитопатогенов является селекция, создание комплексно устойчивых сортов и гибридов, прежде всего, с использованием отдаленной гибридизации Этим методом созданы ценные формы, сорта и гибриды подсолнечника Однако продолжительность такой селекции достигает 15-20 и более лет, а степень устойчивости растений к вредным организмам является недостаточной и далеко не всегда отвечает требованиям производства

Одним из перспективных путей повышения устойчивости подсолнечника к биотическим факторам является использование современных методов биотехнологии, позволяющих расширить спектр генетического разнообразия (со-маклональная вариабельность, соматическая гибридизация, индуцированный мутагенез, генетическая инженерия) и сократить сроки проведения селекции Значительное место в решении этих задач занимает клеточная селекция, основанная на отборе клеточных популяций, устойчивых к селективному фактору, и регенерации из них целых растений (Калашникова, 2003, Шевелуха и др,

Поиск генотипов подсолнечника устойчивых к различным патогенам (в частности к Sclerotinia sclerotiorum) возможен в культуре in vitro при культивировании дедифференцированных клеток на питательных средах, содержащих экзометаболиты патогенов

Цель работы получение и изучение клеточных и тканевых культур подсолнечника, устойчивых к склеротиниозу

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи

2008)

1 Получить каллусные культуры трех генотипов подсолнечника Кубанский 93, ВК 580, ВК 653,

2 Изучить зависимость процесса каллусогенеза от генотипа, вида первичного экспланта и состава питательной среды,

3 Отработать методику по получению культурального фильтрата (КФ) патогена Sclerotinia sclerotiorum и изучить его фитотоксич-ность,

4 Провести селекцию клеток подсолнечника и получить устойчивые к экзометаболитам патогена Sclerotinia sclerotiorum клеточные культуры,

5 Изучить влияние КФ патогена на синтез фенольных соединений в каллусной культуре, а также на морфофизиологические и цитохимические характеристики полученных клеток и тканей,

6 Выявить оптимальные условия культивирования изолированных эксплантов, обеспечивающие получение растений-регенерантов непосредственно из первичного экспланта или каллусной ткани,

7 Разработать экспресс-метод оценки устойчивости растений подсолнечника к белой гнили {Sclerotinia sclerotiorum)

Научная новизна. Разработана технология получения культурального фильтрата гриба Sclerotinia sclerotiorum, технология селекции т vitro на каллусной культуре подсолнечника по устойчивости клеток к действию экзомета-болитов указанного патогена. Впервые получены и охарактеризованы популяции клеток подсолнечника, обладающие устойчивостью к КФ патогена Установлена зависимость способности клеток суспензионных культур к синтезу фенольных соединений от генотипа, времени и условий их культивирования in vitro Показана роль фенольных соединений и полифенолоксидазы в адаптации клеток к действию стресс-фактора Более высокое их накопление характерно для устойчивых к экзометаболитам клеточных культур, по сравнению с неустойчивыми Установлено, что стресс-фактор приводит к изменению как количественного, так и качественного состава растворимых фенольных соединений Впервые оптимизированы условия культивирования изолированных эксплентов и получены растения-регенеранты непосредственно из первичного экспланта или каллусной ткани Разработан экспресс-биологический метод для оценки устойчивости различных генотипов подсолнечника к склеротиниозу (Sclerotinia sclerotiorum), который может быть рекомендован для применения в селекции растений ''

Практическая значимость. Показана возможность проведения селекции т vitro каллусной ткани подсолнечника на устойчивость к склеротинии с помощью КФ патогена Предложенная технология клеточной селекции, которая

может быть рекомендована для других высших растений при отборе клеток и тканей толерантных к Sclerotinia sclerotiorum Устойчивые клеточные линии сельскохозяйственных растений могут применяться как исходный материал для получения растений-регенерантов, обладающих устойчивостью к склеротинии, которые могут быть включены в схему классической селекции по созданию новых сортов и гибридов сельскохозяйственных растений Разработанный и предложенный экспресс-метод для оценки устойчивости различных генотипов подсолнечника к склеротиниозу (Sclerotinia ¡с1егопогит)может быть рекомендован для применения в селекции растений

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международной научной конференции молодых ученых «Приоритетный национальный проект «Развитие АПК» - новые возможности для молодых ученых» (Москва, 2006), на Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира» (Волгоград, 2006), на Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 120 - летию академика НИ Вавилова (Москва, 2007), на Международной научно-практической конференции «Агротехнологии XXI века» (Москва, 2007), на Международной конференции «Научное наследие Н И Вавилова-фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйства» (Москва, 2007), на VIII молодежной научной конфереция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2008) Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы Работа изложена на 128 страницах машинописного текста, включает 11 таблиц и 48 рисунков Список литературы содержит 176 источника, из которых 65 на иностранных языках

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследований служили семена подсолнечника трех генотипов (ВК 580, ВК 653, Кубанский 93), получены из Краснодарского НИИ масличных культур, обладающих различной степенной устойчивости к склеротинии (JIВ Маслиенко)

Стерилизацию растительного материала и условия их культивирования, а также определение прироста каллусной ткани проводили по ранее разработанной на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии РГАУ-МСХА методике (Калашникова, Кочиева, Миронова, 2006)

Питательные среды Для получения первичного каллуса использовали агаризованную питательную среду с минеральными солями по рецепту Мура-

сига и Скуга (Murashige and Skoog, 1962) с добавлением витаминов, сахарозы и фитогормонов в различных концентрациях и соотношениях pH среды находился в пределах 5,6-5,8 В качестве ауксинов изучали действие НУК (0,5-3,0 мг/л), а в качестве цитокининов - кинетин (0,5-3,0 мг/л), БАП (6 мг/л), эпин (1 мг/л), 2 ip (1 мг/л), цетодеф (2 мг/л)

Получение культурального фильтрата патогена гриба Sclerotinia sclerotiorum Выращивание чистой культуры гриба Sclerotinia sclerotiorum проводили на агаризованной питательной среде, содержащей минеральные соли по Vi рецепту Мурасига и Скуга с добавлением витаминов, сахарозы 2% Культу-ральный фильтрат (КФ) патогена получали путем выращивания изолятор гриба в 300 мл колбах в 200 мл объеме жидкой питательной среды на качалке со скоростью вращения 100 об/мин В каждую колбу вносили по 108 шт. конидий гриба Культуральный фильтрат получали путем фильтрования суспензии гриба через фильтровальную бумагу с последующим его автоклавированием Фито-токсичность КФ и его активность проверяли на различных эксплантах семенах (при этом оценивали длину корневой системы и надземной части проростков), гипокотильных сегментах, изолированных с 5-дневных проростков, а также на каллусной культуре Для определения фитотоксичности КФ патогена Sclerotinia sclerotiorum применяли следующие концентрации 1) для семян 25%, 50%, 75% и 100%, 2) для сегментов гипокотилей и каллусной ткани - 5%, 15%, 25%, 35% от конечного объема питательной среды Фитотоксичность КФ определяли по методике О А Берестецкого (1973)

Схема клеточной селекции 1) получение хорошо пролиферирующей каллусной тканей из гипокотильных сегментов (2 пассажа), 2) культивирование каллусной ткани на селективной среде (5 пассажей), 3) культивирование каллусной ткани на среде для регенерации растений без селективного фактора (1 пассаж) При клеточной селекции в качестве селективного фактора применяли КФ патогена в концентрациях- 5%, 15%, 25%, 35% от конечного объема питательной среды, который добавляли в питательную среду перед автоклавированием

Определение количественного и качественного содержания растворимых фенольных соединений проводили в каллусных культурах и первичных эксплантах по методике М Н. Запрометова (1985)

Определение полифенолоксидазы проводили в каллусных культурах и первичных эксплантах по методике Н Б Прониной (2004)

Морфофизиологические исследования каллусной ткани проводили на давленных и временных препаратах Клетки окрашивали синькой Эванса и просматривали в микроскопе KP 12 и фотодокументировали с помощью цифрового фотоаппарата Sony

Статистическая обработка результатов Эксперименты проводили в трех биологических и 2-3 аналитических повторностях Все результаты обработаны статистически (Доспехов, 1985, Смиряев, Кильчевский, 2007) На графиках и в таблицах представлены средние арифметические значения определений и их стандартные отклонения

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Оптимизация условий получения хорошо растущей стерильной культуры подсолнечника. В первой серии эксперимента необходимо оптимизировать условия стерилизации семян с целью получения хорошо растущих стерильных проростков Стерилизация необходима для удаления с поверхности семян инфекции, которая может развиваться при дальнейшем культивировании эксплантов in vitro и вызывать поражение и гибель растительного материала

В качестве стерилизующих препаратов использовали сулему (хлорид ртути) в концентрации 0,1% и гипохлорит натрия в концентрации 1% Экспозиция воздействия стерилизующих веществ составляла от 4 до 16 мин Полученные результаты представлены в табл 1

Таблица 1

Влияние стерилизующего вещества и его временной экспозиции на получение хорошо растущей стерильной культуры (%)

Генотип Стерилизующее вещество

Сулема 0,1% Гипохлорит натрия 1%

Экспозиция стерилизации, мин Экспозиция стерилизации, мин

4 8 16 4 8 16

Кубанский 93 41,67±7,12 83,33±5,38 12,50±4,77 12,24±4,67 20,41± 5,76 30,61± 6,58

ВК 580 35,19±6,50 79,62±5,48 9,26± 3,94 9,80 ±4,16 21,56± 5,77 27,45± 6,25

ВК 653 42,59±6,73 87,03±4,58 16,67±5,07 13,46±4,73 17,31± 5,25 25,00±6,00

Из табл 1 следует, что применение гипохлорита натрия, для стерилизации семян подсолнечника, не является оптимальным, так как в этом случае получение хорошо растущей стерильной культуры составляет всего 9,8 - 30,6 % и этот показатель не зависит от экспозиции стерилизации Причем, при 16-минутном выдерживании семян в гипохлорите натрия, степень инфицированных проростков была максимальной и составляла 70-75% При выдерживании семян в растворе сулемы в течение 8 мин было получено максимальное количество хорошо растущих стерильных проростков (79,6 - 83,0%), которые характеризовались интенсивным ростом 1

2. Зависимость каллусогенеза и морфогенеза от первичного экспланта В качестве первичного экспланта использовали сегменты гипокотилей и семядольных листьев, изолированные с 5-дневных проростков подсолнечника, а также зрелые зародыши Все исследуемые экспланты культивировали на пита-

тельной среде Мурасига и Скуга, содержащей НУК в концентрации 2,0 мг/л и кинетин 1,5 мг/л. Установлено, каллусная ткань формировалась по всей поверхности первичного экспланта, интенсивность которой находилась в четкой зависимости от исследуемого первичного экспланта. Так, наибольшей способностью к каллусогенезу обладали гипокотильные сегменты, а наименьшей -семядольные листья. Изолированные зародыши занимали промежуточное положение (рис.1). Данная ответная реакция различных эксплантов была характерна для всех исследуемых генотипов._

Д-

iL.. ... rt SS .....

ji- II —

т -- i (ff

1 ES^in"

□ Кубанский 93

□ ВК - 653

□ ВК - 580

зародыш гипокотиль семядоль Первичные э

Рис. 1. Зависимость процесса каллусо^е-_неза от первичного экспланта_

ВК - 580

Генотип

Рис. 2. Зависимость процесса каллусоге-_неза от исследуемого генотипа_

З.Зависимость каллусогенеза и морфогенеза от исследуемого генотипа.

Экспериментально установлено, что экспланты всех изучаемых образцов (см. методику) при культивировании на среде MC, содержащей НУК (2,0 мг/л) и кинетин (1,5 мг/л) были способны формировать каллусную ткань. Как правило, этот процесс начинался с дедифференцировки клеток, находящихся в местах среза (в случае семядолей и гипокотилей) или в нижних клеточных слоях изолированных зародышей, которые находились в непосредственном контакте с питательной средой. Спустя 10-14 дней клетки полностью дедифференциро-вались и во всех исследуемых вариантах образовывалась каллусная ткань. Следует отметить, что способность первичных эксплантов к каллусогенезу была различной и находилась в зависимости от исследуемого генотипа. Наибольшей пролиферативной способностью обладали экспланты сорта Кубанский 93, а наименьшей - ВК 580. Генотип ВК 653 занимал промежуточное положение (рис. 2). Полученные результаты свидетельствуют, что процесс каллусогенеза генетически детерменирован.

4. Зависимость каллусогенеза и морфогенеза от гормонального состава питательной среды. Одним из наиболее мощных индукторов морфогенеза, который принято называть стимулирующим фактором или сигналом морфогенеза, является изменение соотношения между цитокининами и ауксинами, входящими в состав питательных сред (Бутенко, 1999). Поэтому следующим этапом работы было изучение влияния соотношения экзогенных регуляторов роста

на процесс каллусогенеза При этом важным моментом для определения наиболее эффективной среды были не только интенсивность каллусогенеза, но и достаточная выравненность этого процесса

Первоначально изучали влияние различных концентраций НУК (0,5-3,0 мг/л) на процесс каллусогенеза на фоне постоянной концентрации кинетина

А Б

В

Рис 3 Зависимость каллусогенеза от концентрации НУК в среде MC- А- изолированные зародыши; Б- изолированные семядольные экспланты; В- изолированные гипоко-

тильные сегменты

Как видно из рис 3, каллусогенез - сложный процесс, который находится в непосредственной зависимости от применяемых гормонов, их концентрации, исследуемого генотипа и вида первичного экспланта Так, при использовании в качестве первичного экспланта изолированных зародышей наблюдается обратно пропорциональная зависимость между интенсивностью каллусогенеза и концентрации ауксина в питательной среде, при использовании сегментов семядольных листьев - прямая зависимость, а при использовании гипокотильных сегментов интенсивность каллусогенеза не зависит от концентрации НУК в питательной среде Данная ответная реакция наиболее четко проявляется для сорта Кубанский 93 и линии ВК 653, в то время как для линии ВК 580 независимо от вида первичного экспланта изучаемый процесс имеет в пределах ошибки константную величину

Определив экспериментально оптимальную концентрацию НУК (1 мг/л), при которой наблюдается максимальная пролиферативная активность клеток, нами была проведена следующая серия экспериментов Изучали влияние различных концентраций кинетина (0,5-3,0 мг/л) на процесс каллусогенеза на фоне постоянной концентрации НУК (1 мг/л) Основные результаты представлены на рис 4

Рис 4 Зависимость каллусогенеза от концентрации кинетина в среде МС.

А- изолированные зародыши; Б- изолированные семядольные экспланты, В- изолированные гипокотильные сегменты

Исследования показали, что увеличение концентрации кинетина в питательной среде приводит к значительному усилению пролиферативной активности каллусной ткани, которая проявлялась в увеличении интенсивности каллусогенеза Причем, максимальный прирост каллусной ткани отмечался для всех изучаемых генотипов и видов первичных эксплантов в варианте, где кинетин присутствовал в питательной среде в концентрации 1,0-1,5 мг/л Увеличение его концентрации до 3,0 мг/л приводило к ингибированию процессов каллусогенеза Это проявлялось, прежде всего, в неполной дедифференцировке клеток первичного экспланта

Представляло интерес изучейие морфофизиологических характеристик клеток каллусной ткани Нами установлено, что ткань состоит из гетерогенных по форме и размерам клеток Преимущественно это крупные клетки, овальной или сильно вытянутой формы, с большой вакуолью и маленьким ядром, как это

характерно для большинства клеточных суспензионных, но не каллусных культур растений (рис.5).

Увеличение концентрации как ауксина (НУК 3,0 мг/л), так и цитокинина (кинетин 3,0 мг/л) в среде приводило к изменению морфофизиологии каллусных клеток. Как правило, ткань в этих вариантах состояла из сильно вакуоли-зированных и вытянутых по форме клеток, и эти характеристики не зависели от исследуемого генотипа и типа первичного экспланта (рис.бА). Уменьшение концентрации гормонов в питательной среде, особенно ауксинов, приводило к формированию каллусной ткани, которая в основном состояла из мелких клеток округлой формы, способных в дальнейшем к морфогенезу (рис.бБ).

Рис. 5. Клетки каллусной ткани подсолнечника (Кубанский 93), увеличение х 160

А Б Рис. 6. Морфофизиологичсские характеристики каллусных клеток: А - среда, содержащая НУК 3,0 мг/л и кинетин 3,0 мг/л; Б - среда, содержащая НУК 1,0 мг/л _и кинетин 1,0 мг/л, увеличение х 80_

5. Влияние биологически активных веществ на морфогенез подсолнечника in vitro. Исхода из ранее полученных нами результатов по регенерации растений подсолнечника из первичного экспланта или каллусной ткани было установлено, что данный объект исследований является слишком консервативной культурой, для которой регенерационный потенциал не превышает 10%. Поэтому выявление новых факторов, повышающих морфогенетические потенции культивируемых клеток и тканей in vitro является актуальной проблемой. В связи с этим было изучено влияние биологически активных веществ (эпин, цетодеф, нитрат серебра), а также гормонов (БАП, 2ip) на прямой морфогенез в культуре изолированных гипокотильных сегментов. Полученные результаты приведены в таблице 2.

Как следует из таблицы 2 культивирование гипокотильных сегментов на всех вариантах питательных средах, приводило к индукции морфогенеза, который выражался в дифференциации меристематических очагов непосредственно на первичном экспланте (варианты 3, 4, 6) либо в первичной каллусной ткани (варианты 1, 2, 5). Причем, независимо от состава питательной среды, среднее количество адвентивных почек во всех испытанных вариантах было не высо-

ким и составляло 1,3 - 1,8 шт на один эксплант Следует отметить, что в вариантах, где наблюдали прямую регенерацию растений, образование меристема-тических зон и формирование микропобегов нередко сопровождалось образованием витрифицированных тканей, которые ингибировали дальнейший рост дифференцированных частей побегав В вариантах, где началу морфогенеза сопутствовал процесс каллусогенеза, как правило, число адвентивных почек, формирующихся в каллусной ткани не превышал в среднем 1,3 - 1,5 шт Исключение составил лишь один вариант, где в качестве стимуляторов морфогенеза в питательной среде присутствовали кинетин 1,5 мг/л и НУК 1 мг/л В этих условиях культивирования в первичной каллусной ткани образовывалось максимальной количество меристематических зон, из которых в дальнейшем развивались нормальные по морфологии растения

Таблица 2

Влияние факторов гормональной и негормональной природы на морфогенез

подсолнечника in vitro

№ п/п Гормональный состав питательной среды Число гипоко-тильпых сегментов, способных к регенерации, % Среднее число побегов на 1 эксплант, шт. Каллусогенез

1 НУК 1 мг/nj кинетин 1,5 мг/л 10,20 (10,05-10,35) 1,80 ±0,75 +

2 НУК 1 мг/л, кинетин 1,5 мг/л, AgN03 10 мг/л 7,84 (7,61-7,92) 1,50 ±0,5 +

3 НУК 1 мг/л, Эпин 1 мг/л 9,26 (9,07-9,41) 1,60 ±0,49 -

4 НУК 1 мг/л, 2ip 1 мг/л 6,38 (6,25 - 6,50) 1,67 ±0,47 -

5 НУК 1 мг/л, цетодеф 2 мг/л 5,55 (5,45 - 5,63) 1,33 ±0,47 +

б НУК 1 мг/л, БАЛ 6 мг/л 6,00 (5,86-6,14) 1,67 ±0,47

Таким образом, в результате многоплановых экспериментов установлено, что наиболее оптимальной питательной средой для получения хорошо проли-ферирующей каллусной ткани, способной впоследствии к морфогенезу, является среда, содержащая НУК 1,0 мг/л и кинетин 1,5 мг/л Оптимизированные условия культивирования каллусной культуры были нами применены в последующих экспериментах по клеточной селекции.

6. Получение культурального фильтрата гриба Sclerotinia sclerotiorum. В первой серии эксперимента необходимо определить длину волны спектрофотометра, при которой наблюдается максимальная оптическая плотность культурального фильтрата (КФ) КФ был получен при выращивании гифов гриба в жидкой питательной среде в течение 60 дней, в результате чего

мицелий приобретал бурую окраску, что свидетельствовало о его старении и гибели Оптическую плотность КФ определяли при длине волны спектрофотометра от 300 до 400 нм (рис 7) Из рисунка следует, что при длине волны 320 нм КФ имеет максимальную оптическую плотность, равную 0,750 ед , поэтому данная длина волны была выбрана нами за основу и применялась в дальнейших экспериментах

Рис 7. Зависимость оптической плотности Рис 8 Зависимость оптической плотно-КФ от длины волны ста КФ от длительности культивирова-

нии патогена в питательной среде (при).

=320 нм)

Во второй серии эксперимента определяли время выращивания патогена в жидкой питательной среде, с целью получения культурального фильтрата, обладающего максимальной фитотоксичностью Измерения оптической плотности проводили в динамике и определяли каждые 5 дней Из полученных результатов (рис 8) следует, что начало активного выделения экзометаболитов в питательную среду приходится на 20 сутки с начала культивирования потогена В этом случае оптическая плотность жидкости составила 0,345 ед При дальнейшем культивировании гриба наблюдалось значительное повышение оптической плотности культуральной жидкости, которое достигло максимума на 45 день культивирования патогена в среде, и составила 0,750 ед. Однако, начиная с 35 суток, повышение оптической плотности существенно не изменялось Данные результаты свидетельствуют о том, что после 35 дней выращивания патогена в среде замедляется или останавливается синтез экзометаболитов, который проявляется в сохранении оптической плотности раствора на протяжении последующих дней культивирования патогена т vitro, что говорит о нецелесообразности дальнейшего культивирования гриба в данных условиях

7. Фитотоксичность культурального фильтрата гриба Sclerotinia sclerotiorum. Для доказательства фитотоксичности КФ, его активность проверяли на различных эксплантах семенах, гипокотильных сегментах, изолированных с 5-дневных проростков, а также на каллусной культуре

Исследования показали, что КФ гриба Sclerotinia sclerotiorum в различных концентрациях оказывает в той или иной степени влияние на прорастание

семян подсолнечника, способность гипокотильных сегментов формировать кал-лусную ткань и на ее прирост Установлено, что культуральный фильтрат патогена в концентрациях 25% и 5% оказывает стимулирующее влияние на прорастание семян и дальнейшее формирование проростков, а также на прирост кал-лусной ткани соответственно При более высоких концентрациях проявляет ин-гибирующий эффект, который для отдельных генотипов выражается в полной гибели каллусной ткани Поэтому клеточную селекцию подсолнечника целесообразно проводить в присутствии КФ патогена в концентрации 5%-25% от конечного объема питательной среды

8. Клеточная селекция подсолнечника. Работа по клеточной селекции была нами проведена на каллусной ткани В качестве стресс-фактора использовали КФ патогена полученного по выше изложенной методике В питательную среду КФ патогена добавляли в концентрации 5%, 15%,25% и 35% конечного объема

Результаты исследований представлены на рис 9, из которых следует, что для всех изучаемых генотипов характерна общая закономерность в поведении каллусных тканей в стрессовых условиях Так, с увеличением концентрации КФ в питательной среде уменьшался прирост каллусной ткани При длительном культивировании прирост каллусной ткани сначала заметно уменьшался, а начиная с IV-oro пассажа наблюдали процесс стабилизации по приросту

Для выяснения различий в ответной реакции клеток на стресс, нами были проведены исследования по изучению морфофизиологических характеристик каллусных клеток, культивируемых в контрольном и опытном вариантах Исследования показали, что каллусные ткани изучаемых генотипов, состояли из гетерогенных клеток по форме и размеру В процессе длительного культивирования эти характеристика менялись В контрольном варианте, как правило, ткань состояла из крупных клеток овальной формы или слегка продолговатой, содержащих большую вакуоль и маленькое ядро В вариантах присутствия стресс-фактора на ранних этапах культивирования клетки не существенно отличались от контрольного варианта Однако при длительном выращивании каллусной ткани в стрессовых условиях морфофизиологические характеристики клеток менялись Так в стрессовых условиях клетки, как правило, сохраняли овальную форму, однако значительно уменьшались в размере Такие изменения были характерны для сорта Кубанский 93 и генотипа ВК 653, а для генотипа ВК 580 клетки в процессе культивирования в стрессовых условиях не меняли свою структуру

Исходя из полученных результатов, было сделано предположение, что уменьшение размера клеток под действием стресс фактора происходит, вероятно, из-за изменения строения клеточной стенки. Одной из причин, вызывающих

такие ответные реакции клеток на стресс, может быть изменение метаболизма фенольных соединений (Раскалиева, 2001, Калашникова, 2003), в состав которых входит и лигнин, выполняющий определенную защитную роль в растениях при воздействии фитопатогенов (Загоскина и др , 1994, Запрометов, 1996, Зайцева, 2007, Lofty, Fleuriet, 1989, Valluri, Treat, 1991) Для доказательства данного предположения необходимо провести изучение фенольного комплекса в клетках, культивируемых в стандартных и стрессовых условиях

-•—Контроль I, I -О— КФ 5% j] ]-*-КФ15% I ' —*— КФ25% I — КФ35% 'i

I

А

Коктро/ъ 1 I -о- КФ 5% I | КФ 15% | ' КФ 25% j1 '-*-КФ35% ,

I

0 25 50 75 100 128 150 ITS

(I) CI) (HI) (IV) (V) (VI) (мае* ж)

Количество дм*й

Б

В

Рис 9 Прирост каллусной ткани, культивируемой в присутствии КФ гриба Sclerotinia sclerotiorum : А-генотип Кубанский 93; Б- генотип ВК 580, В- генотип ВК 653

(Г) (II) (111) (IV) (V) (VI) (пасеаж)

9. Роль фенольных соединений в адаптации каллусных кулыур подсолнечники in vitro к действию экзометаболитов гриба Sclerotinia sclerotiorum. Важным моментом в исследованиях по клеточной селекции на устойчивость к биотическим факторам является изучение изменений в метаболизме фенольных соединений в каллусных культурах, подвергшихся стрессовым воздействиям Учитывая роль фенольных веществ в защите клеток от стрессового фактора, нами были проведены исследования по изучению изменений количественного и качественного состава фенольных соединений в каллусной ткани различных генотипов подсолнечникк, культивируемой в стандартных и стрессовых условиях

Исследования показали, что у изучаемых генотипов суммарное содержание растворимых фенольных соединений (ФС) в первичном экспланте различно Причем, среди всех исследуемых генотипов заметно выделялся генотип ВК 580 (15,86 мг/г сырой массы), в клетках которого синтезировалось полифенолов на 30% больше, по сравнению с генотипами Кубанским 93 и ВК 653 Исследования показали, что при культивировании каллусной ткани в условиях in vitro, количество суммарных растворимых ФС у всех генотипов подсолнечника снижается в 2-4 раза по сравнению с его количеством в первичном экспланте

Ранее было показано, что биосинтез ФС в присутствии стрессового фактора изменяется (Раскалиева, 2001, Калашникова, 2003, Олениченко, 2006) Нами также было отмечено, что при1 культивировании каллусной ткани в стрессовых условиях (присутствие КФ патогена в различных концентрациях) наблюдается изменение учитываемого показателя, которое проявлялось в увеличении биосинтетической активности каллусной ткани всех изучаемых генотипов (рис 10) Вероятно, длительное культивирование каллусной ткани подсолнечника в стрессовых условиях приводит к «запуску» повышенной программируемой защитной реакции, проявляющейся в увеличении синтеза соединений фе-нольной природы, как это неоднократно отмечалось в литературе (Загоскина и др, 1994; Запрометов, 1996; Калашникова, 2003, Гончарук и др , 2007)

Для понимания процессов изменения биосинтеза растворимых фенольных соединений, происходящих в клетках первичных эксплантов, представлялось важным изучение качественного состава фенольного комплекса Поэтому в следующей серии экспериментов Нами были предприняты некоторые биохимические приемы, позволяющие исследовать состав растворимых фенольных соединений в подсолнечнике В результате изучения этанольных экстрактов с использованием одномерной тонкослойной хроматографии нами было показано, что в гипокотильных сегментах подсолнечника синтезируются как фенил-пропаноиды, представленные фенолкарбоновыми кислотами, так и флавонои-ды, в том числе и флавонолы (рис 11,1) Причем в клетках гипокотильных сег-

ментов сорта Кубанский 93 фенольный комплекс представлен 5 соединениями, ВК 580 - 6 соединениями, а ВК 653 - 4 соединениями

| —•— Контроль 1_о_КФ 5% — КФ 15%

КФ 25% \ н- КФ 35% I

О 25 50 75 100 125 150

(I паооаж) <11 паоаж) (III пассаж) (IV пассаж) (V паосаж) Крличестао дней

16 14 12 10 8 6 4 2 0

- Контроль

- КФ 5%

- КФ 15% I

- КФ 25%

- КФ 35% !,

(I пассаж) (II паоаж) (III паооаж) (IV паосаж) (V пассаж) Количество дней

- Контроль

- КФ 5% -КФ 15%

- КФ 25%

- КФ 35%

25 50 75 100 125 150

(I пассаж) (II пасаж) (III пассаж) (IV пассаж) (V пассаж) Количество дней

В

Рис 10. Содержание фенольных соединений в каллусных тканей при длительной культивировании. А- генотипа Кубанский 93; Б- генотипа ВК 580; В- генотипа ВК 653

--goiü>

<Й>-з —<ц>—

О-

I

Ку«М«шЛя ik«o вк«вэ С^'-ФЯМао»

о о ^—^—1

<£е>——<ЙЭ>— <ДиГс.- ■ CD -

II

1 —■—• о«о

о '«^-1;—о-

г »-C5 . ,

eftn erb

и

С±5—

&-S

——I

у

А

■<й>-<ц>- сЪ

¡21>з<Й5>

> О11 <£> ~

I ^—|—

1 <гв> ср>

dfc> -с£>-

in

IV

Рис.11. Схема хроматограммы этапольных экстрактов фенольных соединений I- различных гипокотильных сегментах, II- различных тканей подсолнечника генотипа Кубанский 93; III- различных тканей подсолнечника генотипа ВК 580, IV- различных тканей подсолнечника генотипа ВК 653, А - контроль, Б - присутствие КФ патогена Sclerotinia sclerotiorum в питательной среде в концентрации 15% (а - гипокотиль, b -1 пассаж, с - III пассаж, d - V пассаж)

Для более детального изучения процессов изменения биосинтеза растворимых фенольных соединений, происходящих в клетках длительно культивируемых каллусных культур на селективных средах и в контрольном варианте, представлялось важным изучение качественного состава фенольного комплекса в процессе культивирования т vitro Данные исследования проводили на кал-лусной ткани различных генотипов подсолнечника на I, III и V пассажах цикла клеточной селекции В качестве селективного фактора нами был выбран вари-

ант присутствия культурального фильтрата патогена в среде в концентрации 15% Полученные результаты представлены на рисунках 11,II,III,IV

Как следует из приведенных на рисунках данных, состав фенольного комплекса изменяется в процессе культивирования каллусной ткани опытного и контрольного вариантов Причем, установленные нами изменения характерны для всех изучаемых генотипов

При культивировании каллусной ткани в стрессовых условиях нами было показано значительное изменение в разнообразии фенольного комплекса (рис 11,II,III,IV) Во всех исследуемых генотипах наблюдалось обогащение спектра синтезируемых веществ фенольной природы за счет биосинтеза de novo соединений фенилпропаноидов и флавоноидов Так для генотипа Кубанский 93 отмечалось наличие 15 соединений, для ВК 580 - 18 соединений, а для ВК 653 - 10 соединений фенольной природы

10. Изучение полифенолоксидазы в первичном экспланте и каллусной ткани, культивируемой в стрессовых и стандартных условиях. Поли-фенолоксидаза выполняют определенную функцию в растении участвует в фе-нолпропаноидном пути (Kojima, Takeuchi, 1989), регулирует транспорт электронов (Trebst, Depka, 1995), отвечает за окраску цветков (.Nakayama et al, 2000), участвует в постороении клеточной стенки, защищает растения от механических повреждений, от действия патогенов (Li, Steffens, 2002, Wang, Consta-bel, 2004, Mah, Morohashi, 2006), à также выступает в качестве сигнальных компонентов при взаимодействии с микроорганизмами (Запрометов, 1993, Philips, 1992, Harborne, 2000)

Изучение активности полифенолоксидазы проводили как в первичном экспланте (гипокотильные сегменты, изолированные с 5-дневных проростков), так и в каллусной ткани, культивируемой в стандартных (контрольный вариант) и опытных (присутствие КФ патогена в питательной среде в концентрации 15%) условиях Исследования показали, что у изучаемых генотипов активность полифенолоксидазы в первичном экспланте различно Причем, среди всех исследуемых генотипов заметно выделялся генотип ВК 580 (229,2 отно ед/г сыр масса.мин), для которого активность фермента превышала таковой других генотипов в среднем на 25-28% (рис 12,А)

При выращивании каллусной'ткани в стандартных условиях (в течение пяти пассажей) нами было показано, что активность полифенолоксидазы возрастает и этот показатель изменяется не существенно от пассажа к пассажу (рис 12,Б,В,Д) Однако при длительном культивировании каллусной ткани на питательных средах, содержащих КФ патогена Sclerotinia sclerotiorum активность полифенолоксидазы увеличивалась и своего максимума достигала к IV пассажу Данная закономерность была отмечена для всех изучаемых генотипов

Именно к этому времени каллусная ткань во всех вариантах проявляла одинаковую ответную реакцию на стресс-фактор, что выражалось в стабилизации пролиферативной активности каллусной ткани. Дальнейшее выращивание ткани на селективных средах не оказывало существенного влияния на прирост каллусной ткани, что, вероятно, свидетельствует об ее адаптивной способности.

Рис.12. Активность полифенолоксидазы: А-в гипокотильных сегментах 5-дневных проростков подсолнечника; Б- в каллусной ткани, культивируемой в стандартных и стрессовых условиях (ВК 580); В- в каллусной ткани, культивируемой в стандартных и стрессовых условиях (Кубанский 93); Д- в каллусной ткани, культивируемой в стандартных и стрессовых условиях (ВК 653).

11. Экспресс-биологический метод и его применение для оценки устойчивости различных генотипов подсолнечника к Sclerotinia sclerotiorum

Для ускорения селекционного процесса возникает необходимость тестирования генотипов на устойчивость к абиотическим или биотическим факторам окружающей среды на уровне первичных эксплантов или семян. Для такого тестирования в практике широко применяется экспресс-метод, позволяющий экономить время и площади, необходимые для исследований, а также за короткий промежуток времени, возможно тестировать большое количество исследуемых образцов.

Объектом наших исследований служили семена 7 сортов подсолнечника -Кубанский 930, Кубанский 86, Триумф, Юпитер, ВК 653, ВК 580 и Кубанский

93 Учет результатов проводили на 7-дневных проростках, при этом оценивали следующие показатели длина корневой системы, высота надземной части, число проросших семян На основании полученных результатов нами была рассчитана фитотоксичность КФ для исследуемых генотипов Полученные результаты представлены в таблице 3

Таблица 3

Содержание растворимых фенольных соединений в проростках различных геноти-

пов подсолнечника, культивируемых в стандартных и стрессовых условиях

Генотип Содержание растворимых фенольных соединений, мг/г сырой массы Фитотоксичность КФ, %

Контроль (К) КФ патогена (КФ)

ВК 653 12,03 ± 0,34 18,97 ±0,57 0,58 74,2 ±4,1

Кубанский 93 12,8 ± 0,80 26,33 ± 0,46 1,06 34,3 ± 2,3

ВК 580 15,78 ±0,41 61,74 ±0,46 2,91 27,4 ±3,1

Кубанский 930 11,73 ±0,37 19,45 ±0,41 0,66 70,1 ±4,2

Юпитер 8,08 ±0,31 33,21 ±0,57 3,11 31,9 ±4,6

Кубанский 86 16,27 ±0,56 45,81 ±0,82 1,82 49,4 ±3,7

Триумф 12,69 ±0,67 42,97 ±0,71 2,39 42,7 ± 2,5

Примечание- * во сколько раз изменяется содержание растворимых фенольных соединений в тканях проростков опытного варианта (КФ) по отношению к контролю (К)

Данная таблица 3 свидетельствует о том, что исследуемые генотипы обладают различной ответной реакцией на действие экзометаболитов гриба Sclerotinia sclerotiorum Можно предположить, что чем меньше фитотоксичность, вызываемая КФ патогена, тем большей устойчивостью обладают данные генотипы к действию КФ, а следовательно и к самому патогену Наши исследования подтверждают данные, полученные другими авторами (Ткачева, 2007, Pontaroli et al, 2000)

Суммируя полученные данные, расчитанные по методике определения устойчивости растений к действию стрессовых факторов (Удовенко, 1973), все исследуемые генотипы можно разбить на 4 группы по устойчивости к КФ патогена (Sclerotinia sclerotiorum) Значение групп будет следующим I - свыше 62,5% - неустойчивые (Кубанский 930, ВК 653), П - 50,8-62,5% - слабо устойчивые (не выявлены), Ш- 39,1 -50,8% - средне устойчивые (Триумф, Кубанский 86), IV - 27,4 - 39,1%- более устойчивые (Кубанский 93, Юпитер, ВК 580) На основании полученных результатов нами была установлена обратная корреляция между значением во сколько раз изменяется содержание растворимых фенольных соединений в тканях проростков опытного варианта (КФ) по отношению к контролю (К) с фитотоксичностью (значение корреляции равен 0,8) Эти данные еще раз подтверждают, что фенольные соединения играют защитную роль в растениях при воздействии факторов биотической природы

ВЫВОДЫ

1 Впервые для подсолнечника разработан метод получения клеточных и тканевых культур, обладающих относительной устойчивостью к воздействию эк-зометаболита фитопатогенного гриба Sclerotinia sclerotiorum Метод основан на сравнительной оценке темпов роста устойчивых и неустойчивых клеток и каллусных тканей культивируемых на питательных средах, содержащих селективный фактор - культуральный фильтрат патогена (КФ) Впервые разработана технология получения высокотоксичного КФ фитопатогенного гриба Sclerotinia sclerotiorum в условиях in vitro.

2 Установлено, что культуральный фильтрат патогена Sclerotinia sclerotiorum в концентрациях 5% и 25% оказывает стимулирующее влияние на прирост каллусной ткани и рост интактных растений соответственно, а при более высоких концентрациях проявляет кнгибирующий эффект Установлено, что клеточную селекцию подсолнечника целесообразно проводить в присутствии КФ патогена в концентрации 5%-25% от объема питательной среды

3 Выявлено положительное влияние фенольных соединений на адаптацию клеток и каллусных тканей к действию селективного фактора Они в большем количестве накапливаются в клетках, устойчивых к действию селективного фактора, что обусловлено изменением фенольного метаболизма, проявляющегося в изменении как количественного, так и качественного состава растворимых фенольных соединений, а также полифенолоксидазы

4 Впервые оптимизированы условия культивирования изолированных экс-плантов, обеспечивающие получение растений-регенерантов непосредственно из первичного экспланта или каллусной ткани

5 Установлены морфофизиологические различия клеток, культивируемых в контрольном и опытном вариантах в зависимости от исследуемого генотипа, гормонального состава питательной среды и присутствия стресс-фактора

6 Разработан экспресс-биологический метод для оценки устойчивости различных генотипов подсолнечника к Sclerotinia sclerotiorum, который может быть рекомендован для применения в селекции растений По устойчивости к патогену Sclerotinia sclerotiorum изучаемые генотипы располагаются в следующем возрастающем порядке ВК 653, Кубанский 930, Кубанский 86, Триумф, Кубанский 93, Юпитер, ВК 580

Список публикаций по материалам диссертации

1 Нгуен Тхань Хай. Эксперимёнтальный морфогенез в культуре изолированных клеток и тканей подсолнечника (Helianthus annuus L) II Известия

ТСХА Москва 2007 - №2 - С 116-124

2 Нгуен Т.Х., Калашникова Е А Ответная реакция различных генотипов подсолнечника на действие экзометаболитов Sclerotinia sclerotiorum II Сборник статей международной научной конференции молодых ученых «Приоритетный национальный проект «Развитие АПК» - новые возможности для молодых ученых», Москва, 2006.-С 371-374

3 Нгуен Тхань Хай, Калашникова Е А Зависимость морфогенетического потенциала изолированных органов растений подсолнечника от исходного генотипа и первичного экспланта1 // Материалы всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира», Волгоград, 2006 -С 109-112

4 Нгуен Т.Х., Калашникова Е А , Хоанг Т 3 , Нгуен Т Т Получение куль-турального фильтрата гриба Sclerotinia sclerotiorum и изучение влияния его экзометаболитов на различные экспланты подсолнечника (Hehanthus annuus L) II Сборник статей международной научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 120 -летию академика НИ Вавилова Москва, 2007 -С 265-267

5 Калашникова Е А, Нгуен Тхань Хай Роль вторичных метаболитов в адаптации клеточных культур т vitro к действию экзометаболитов патогенных грибов // Сборник трудов международной научно-практической конференции «Ахротехнологии XXI века» Москва 2007 -С 68-70

6 Калашникова Е А, Нгуен Т.Х Применение клеточных технологий в селекции растений // Доклады ТСХА Москва 2007 -Выпуск 279, Часть 1 - С 326330.

7 Нгуен Т.Х., Динь С Т, Доан Т Т Фенольные соединения и адаптация каллусных культур подсолнечника in vitro к действию экзометаболитов гриба Sclerotinia sclerotiorum II Материалы международной конференции «Научное наследие Н И Вавилова-фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйства». Москва 2007 -С 177-178

8 Нгуен Т.Х, Калашникова Е А Влияние биологически активных веществ на морфогенез подсолнечника in vitro II Материалы VIII молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» Москва 2008 -С.25-27

1,25 печ. л

Зак. 228.

Тир 100 экз.

Центр оперативной полиграфин ФГОУ ВПО РГАУ - МСХА имени К А Тимирязева 127550, Москва, ул Тимирязевская, 44

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Нгуен Тхань Хай

Введение

ГЛАВА I. Литературный обзор

1.1. Подсолнечник как объект хозяйственного использования

1.1.1. Ботаническая характеристика подсолнечника (Helianthus annus L.)

1.1.2. Народнохозяйственное значение подсолнечника

1.1.3. Основные болезни подсолнечника

1.2. Культура ткани подсолнечник in vitro

1.3. Клеточная селекция растений на устойчивость к болезням

1.3.1. Использование патогенов в клеточной селекции растений на устойчивость к болезням

1.3.2. Использование культурального фильтрата патогена при клеточной селекции растений на устойчивость к болезням

1.4. Механизм устойчивости растительных клеток к действию 33 биотических факторов

ГЛАВА II. Объект и методы исследований

2.1. Объекты исследований

2.2. Методы исследований

2.2.1. Условия культивирования

2.2.2. Клеточная селекция подсолнечника in vitro

2.2.3. Биохимические и морфофизиологические исследования

2.2.4. Статическая обработка результатов исследований

ЭКСПЕРЕМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА III. Экспериментальный морфогенез в культуре изолированных тканей и органов подсолнечника in vitro

3.1. Оптимизация условий получения хорошо растущей стерильной культуры подсолнечника

3.2. Зависимость каллусогенеза и морфогенеза от первичного экспланта

3.3. Зависимость каллусогенеза и морфогенеза от исследуемого генотипа

3.4. Зависимость каллусогенеза и морфогенеза от гормонального состава 53 питательной среды

3.5. Морфофизиологические характеристики каллусных культур

3.6. Влияние гормонального состава питательной среды на морфогенез каллусной ткани подсолнечника различных генеотипов

ГЛАВА IV. Клеточная селекция подсолнечника на устойчивость к 67 патогену Sclerotinia sclerotiorum

4.1. Получение культурального фильтрата гриба Sclerotinia sclerotiorum

4.2. Фитотоксичность культурального фильтрата гриба Sclerotinia sclerotiorum

4.3. Клеточная селекция подсолнечника

ГЛАВА V. Роль фенольных соединений в адаптации каллусных культур подсолнечники in vitro к действию экзометаболитов гриба Sclerotinia sclerotiorum

5.1. Количественный состав фенольных соединений в первичном экспланте и каллусной ткани подсолнечника культивируемой в стандарных и стрессовых условиях

5.2. Качественный состав фенольных соединений в первичном экспланте и каллусной ткани подсолнечника культивируемой в стандарных и стрессовых условиях

5.3. Изменение полифенолоксидазы в первичном экспланте и каллусной ткани, культивируемой в стрессовых и стандартных условиях in vitro

ГЛАВА VI. Экспресс-биологический метод и его применение для оценки устойчивости различных генотипов подсолнечника к белой гнили {Sclerotinia sclerotiorum)

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение in vitro клеточных и тканевых культур подсолнечника (Helianthus Annus L.), устойчивых к Sclerotinia sclerotiorum"

Одной из основных задач сельскохозяйственного производства является создание новых эффективных сортов культурных растений. В работе селекционеров особое внимание уделяется созданию генотипов, сочетающих в себе, как высокую продуктивность, так и устойчивость к болезням, а также к другими биотическим стрессовым факторам.

Подсолнечник (Helianthus), одна из основных масличных культур в России, занимающая площадь 3,7 миллионов гектаров, относится к основным источникам получения растительного масла. Белок семян подсолнечника -высококачественный пищевой продукт, а шрот - ценный корм для животных (Дьяков, 2004).

В связи с возрастанием роли подсолнечника, как > ценной продовольственной и кормовой культуры, первостепенное значение приобретает разработка защитных мероприятий от комплекса болезней -белой, серой, пепельной гнилей, фузариоза, эмбелдизии ложно - мучнистой росы. Особую опасность для культуры подсолнечника представляют эпифитотии белой гнили (Sclerotinia sclerotiorum), а в последние годы фомопсиса (Phomopsis helianthi), являющиеся одними из основных причин значительного недобора урожая и снижений товарных и посевных качеств семян (Якуткин, 2003). Так, белая гниль ежегодно поражает подсолнечник на площади 1,5-2 миллионов гектаров, снижая урожай на 4 -5 центнера с гектара. В годы эпифитотии урожай погибает почти полностью, а масло в собранных семенах не пригодно для пищевых целей. Новая грибная болезнь подсолнечника - фомопсис, может снижать урожайность на 50-87 %, а масличность семянок - до 35-37%.

Данную проблему трудно решить, используя только традиционные способы защиты растений и посевов: агротехнические, химические и биологические, так как ни один из них в отдельности не обладает достаточной эффективностью.

Радикальным средством защиты растений от фитопатогенов является селекция, создание комплексно устойчивых сельскохозяйственных культур, и прежде всего, с использованием отдаленной гибридизации. Этим методом созданы многие ценные формы, сорта и гибриды сельскохозяйственных растений. Однако продолжительность такой селекции достигает 15-20 и более лет, а степень устойчивости растений к вредным организмам является недостаточной и далеко не всегда отвечает требованиям производства.

Одним из новых, перспективных путей повышения эффективности селекционного процесса является использование современных методов биотехнологии, позволяющих расширить спектр генетического разнообразия (сомаклональная вариабельность, соматическая гибридизация, индуцированный мутагенез, генетическая инженерия) и сократить сроки проведения селекции. Значительное место в решении этих задач занимает клеточная селекция, основанная на отборе клеточных популяций, устойчивых к селективному фактору, и регенерации из них целых растений (Калашникова, 2003).

Поиск генотипов подсолнечника устойчивых к различным патогенам (в частности к Sclerotinia sclerotiorum) возможен в культуре in vitro при культивировании эксплантов на питательных средах, содержащих продуцирующие токсины патогенов.

Исходя из выше изложенного, работа по получению in vitro клеточных и тканевых культур подсолнечника, а также ратений-регенерантов, устойчивых к склеротиниозу, является своевременной и актуальной.

Цель работы: - получение и изучение клеточных тканевых культур подсолнечника, устойчивых к склеротиниозу.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Получить каллусные культуры трех генотипов подсолнечника: Кубанский 93, ВК 580, ВК 653;

2. Изучить зависимость процесса каллусогенеза от типа первичного экспланта исходного генотипа и состава питательной среды;

3. Отработать методику по получению культурального фильтрата патогена Sclerotinia sclerotiorum\

4. Провести клеточную селекцию и получить устойчивые клеточные культуры подсолнечника к экзометаболитам патогена Sclerotinia sclerotiorum',

5. Изучить влияние культурального фильтраты патогена на синтез фенольных соединений в каллусной культуре, а также на морфофизиологические и цитохимические характеристики полученных тканей.

Научная новизна. Разработана схема получение культурального фильтрата гриба Sclerotinia sclerotiorum. Разработана схема селекции в in vitro на каллусной культуре подсолнечника по устойчивости клеток к действию экзометаболитов патогена Sclerotinia sclerotiorum. Впервые получены и охарактеризованы популяции клеток подсолнечника, обладающие устойчивостью к КФ патогена Sclerotinia sclerotiorum. .

Изучена зависимость способности клеток суспензионных культур к синтезу фенольных соединений от генотипа, времени и условий их культивирования in vitro. Показана роль фенольных соединений и полифенолоксидазы в адаптации клеток к действию стресс-фактора. Более высокое их накопление характерно для устойчивых к экзометаболитам клеточных культур, по сравнению с неустойчивыми. Установлено, что стресс-фактор приводит к изменению как количественного, так и качественного состава растворимых фенольных соединений.

Впервые оптимизированы условия культивирования изолированных эксплентов, обеспечивающие получение растений-регенерантов непосредственно из первичного экспланта или каллусной ткани.

Разработан экспресс-биологический метод для оценки устойчивости различных генотипов подсолнечника к склеротиниозу (Sclerotinia sclerotiorum), который может быть рекомендован для применения в селекции растений.

Практическая значимость. Показана возможность селекции in vitro каллусной ткани к склеротинии с помощью КФ патогена. Предложенная технология клеточной селекции может быть использована на каллусной культуре других высших растений для отбора клеток и тканей толерантных к Sclerotinia sclerotiorum. Устойчивые клеточные линии сельскохозяйственных растений могут применяться как исходный материал для получения растений-регенерантов, обладающих устойчивостью к склеротинии, которые могут быть включены в схему классической селекции по созданию новых сортов и гибридов сельскохозяйственных растений. Разработанный и предложенный экспресс-метод для оценки устойчивости различных генотипов подсолнечника к склеротиниозу (Sclerotinia sclerotiorum)woyKQT быть рекомендован для применения в селекции растений.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Нгуен Тхань Хай

ВЫВОДЫ

1. Впервые для подсолнечника разработан метод получения клеточных и тканевых культур, обладающих относительной устойчивостью к воздействию экзометаболита фитопатогенного гриба Sclerotinia sclerotiorum. Метод основан на культивировании каллусных тканей на питательных средах, содержащих селективный фактор - культуральный фильтрат патогена (КФ). Впервые разработана технология получения высокотоксичного КФ фитопатогенного гриба Sclerotinia sclerotiorum в условиях in vitro.

2. Установлено, что культуральный фильтрат патогена Sclerotinia sclerotiorum в концентрациях 5% и 25% оказывает стимулирующее влияние на прирост каллусной ткани и рост интактных растений соответственно, а при более высоких концентрациях проявляет ингибирующий эффект. Установлено, что клеточную селекцию подсолнечника целесообразно проводить в присутствии КФ патогена в концентрации 5%-25% от объема питательной среды.

3. Выявлено положительное влияние фенольных соединений на адаптацию клеток и каллусной ткани к действию селективного фактора. Они в большем количестве накапливаются в клетках, устойчивых к действию селективного фактора, что обусловлено изменением фенольного метаболизма, проявляющегося в изменении как количественного, так и качественного состава растворимых фенольных соединений, а также полифенолоксидазы.

4. Впервые оптимизированы условия культивирования изолированных эксплентов, обеспечивающие получение растений-регенерантов непосредственно из первичного экспланта или каллусной ткани.

5. Установлены морфофизиологические различия клеток, культивируемых в контрольном и опытном вариантах в зависимости от исследуемого t генотипа, гормонального состава питательной среды и присутствия стресс-фактора.

6. Разработан экспресс-биологический метод для оценки устойчивости различных генотипов подсолнечника к Sclerotinia sclerotiorum, который может быть рекомендован для применения в селекции растений. По устойчивости к патогену Sclerotinia sclerotiorum изучаемые генотипы располагаются в следующем возрастающем порядке: ВК 653, Кубанский 930, Кубанский 86, Триумф, Кубанский 93, Юпитер, ВК 580.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Нгуен Тхань Хай, Москва

1. Аветисов В. А. Биотехнологические основы расширения генетического разнообразия картофеля: Автореф. дис.д-ра биол. наук: 03.00.23.-М., 1997.- 46с.

2. Аврова А.О. Физиолого-биохимические особенности взаимодействия томатов с Alternaria solani и селекция in vitro на устойчивость к альтернариозу: Автореф. дис. канд. биол. наук: 03.00.23. -ВИЗР., 1994.- 18 с.

3. Активация мелафеном роста и накопления фенольных соединений в каллусной культуре чайного растения не связана с его возможной цитокининовой активностью / Н.В. Загоскина, А.С. Пинаев, А.К. Алявина и др. // Докл.АН/РАН.-2007.-Т.413; № 6.- С. 841-844.

4. Андреев Л.Н., Талиева М.Н. Физиологически активные вещества во взаимоотношениях растения-хозяина и патогенного гриба // Физиол. растений.- 1996.- Том 43; № 5. -С. 661-666.

5. Андреев Л.Н.; Талиева М.Н. Физиология взаимоотношений растения-хозяина и патогена: роль физиологически активных веществ Устойчивость растений к грибным болезням. // Бюл.Гл.ботан.сада.-1995 .-Вып. 171 .-С.61-68.

6. Балов В.К.; Шибзухов М.Н. Влияние азотно-фосфорных удобрений на продуктивность и качество семян подсолнечника и устойчивость его к болезням в условиях вертикальной зональности КБР // Зерн.хоз-во.- 2006.- № 6. С. 24-26.

7. Биологические основы клеточной селекции растений (Селекция на устойчивость к патогенам и стрессовым факторам) / Е.А. Калашникова // Докл.ТСХА/Моск.с.-х.акад., 2003.- Вып.275. С. 110112.

8. Васильев Д.С. Подсолнечник.-М.:Агропролиздат, 1990.-174 с.

9. Влияние экзометаболитов гриба Rhizoctonia solani на клеточныеIкультуры различных генотипов картофеля / Н.В.Загоскина, Е.А. Гончарук, Г.А. Дубравина, Е.А. Калашникова // Биотехнология.- 2006.-№ 5. С. 19-22.

10. Возбудитель фитофтороза Phytophtora infestans (Mont) De Вагу вмешивается в функционирование рострегулирующей системы клеток картофеля / М.А.Проценко, Э.П.Ладыженская, Н.П. Кораблева и др. // Физиол. растений,- 1993.-Том 40.-С. 225-229.

11. Волотович А. А. Защита растений от патогена Sclerotinia1sclerotiorum II Весщ Нац.ДН Беларусь Сер.б1ял.навук.- 2005'.- № 4. С. 112-116

12. Волощук А.Д, Волощук С.И., Гирко B.C. Оценка устойчивости к Fusarium graminearum по параметрам роста суспензионной культуры в присутствии культурального фильтрата // Докл. РАСХН.- 2001.- № 2. -С. 9-10.

13. Волынец А.П., Кароза С.Э., Манжелесова Н.Е. О природе нарушения ауксиногово обмена растений ячменя гельминто-спориозной инфекцией // Докл. АН Беларуси. -1993.-Том 37; № 2. -С. 166-168.

14. Волынец А.П., Кароза С.Э., Сухова JI.C. Абсцизовая кислота как возможный фактор защиты ячменя при грибной инфекции // Докл.АН /Рос.АН. -1993.-Том 39; № 3. -С. 380-382.

15. Вольф В .Г. Соняшник,- К.:Урожай, 1972.-228с.

16. Гирко B.C., Волощук К.Г., Оценка устойчивости к действию КФ грибного патогена в культуре незрелых зародышей // С.-х. биология. Сер. "Биология растений". 1993.-№ 9.- С. 62-70.

17. Гормональный баланс ИУК/АБК в растениях пшеницы при инфицировании септориозом / И.В.Максимов, Ф.М.Шакирова, Р.М.Хайруллин, М.В.Безрукова // Микология и фитопат.- 1996; Том 30; Вып. 3.-С.75-83.

18. Дмитриев А.П. Фитоалексины и их роль в устойчивости растений. Киев, 1999. - 207 с.

19. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. — М.: Агропромиздат, 1985.-351 с.

20. Дьяков А.Б. Физиология подсолнечника.-Краснодар: ВНИИМК, 2004. -76с.

21. Дьяков Ю.Т. Молекулярно-генетические основы взаимоотношений растений с грибными и бактериальными инфекциями.// Успехи совр. Генетика.- 1994.-Вып. 19.- С. 25-48.

22. Загоскина Н.В., Зайцева С.М.; Александрова М.С. Изменения в образовании фенольных соединений при введении клеток тисса ягодного (Taxus baccata L.) и тисса канадского (Taxus canadensis Marsh.) в культуру in vitro // Биотехнология.-2007.- № 1. -С.29-34.

23. Зайцева С.М. Образование и локализация фенольных соединений в растениях тисса {taxus baccata L, taxus canadensis marsh.) и в инициированных из них каллусных культурах: Автореф. дис.канд. биол. наук: 03.00.12.- М.,2007.- 21с.

24. Запрометов М.Н. Фенольные соединения и их роль в жизни растения. LVI Тимирязевские чтения. М.: Наука, 1996.- 45с.

25. Запрометов М.Н. Фенольные соединения и их роль в жизни растения.-М.:Наука, 1996.-45с.

26. Запрометов М.Н. Фенольные соединения; распространение, метаболизм и функции.-М.: наука, 1993.-272 с.

27. Защиты растений от болезней / Шкаликов В.А., Белошапкина О.О., Букреев Д.Д. и др. : М.: КолосС, 2004. 255с.

28. Зезуль Т.Г., Горбатенко Э.В., Ралдугина Г.Н. Регенерация in vitro растений подсолнечника {Helianthus annuus L.) через соматический эмбриогенез // Генетика. 1995.- Т.31; № 2.-С. 228-233.

29. Иммуномодуляторы фитопатогенов и их соучастие во взаимоотношениях с растениями / Ю.Т. Дьяков // Индуцированный иммунитет сельскохозяйственных культур важное направление в защите растений.- Всерос. науч.-исслед. ин-т защиты растений, 2006. -С. 15.

30. Исследовали возможность культивирования различных тканей подсолнечника на искусственных питательных средах и перспективы получения растений-регенерантов. Центр экологической физиологии растений, Буэнос-Айрес. 1986 Bibliogr, с. 137

31. Калашникова Е.А. Клеточная селекция растений на устойчивость к грибным болезням: А^тореф.дис. д-ра биол. наук: 03.00.23. -М., 2003.-53 с.

32. Калашникова Е.А., Нгуен T.J1.A. Морфо-физиологические особенности пробирочных растений, каллусной ткани и суспензионной культуры картофеля, обусловленные действием экзометаболитов гриба Rhioclonia solani II Биотехнология.- 2003.- № 3. С. 36-41.

33. Клеточная селекция клевера и люцерны на устойчивость к фузариозному увяданию / В.М.Плащев //Гаметофитная и защитная селекция растений.- Кишенев, 1987.- С.176-178.

34. Клеточная селекция клевера лугового на устойчивость к возбудителям корневых .гнилей (<Sclerotinia trifolium, Fusarium sp.) /

35. В.В. Мазин, JI.A. Солодкая, И.Г. Кирьян и др. // Молек. и генет. механизмы взаимодействия микроорганизмов с растениями. -Пущино, 1989.-С. 164-167. |

36. Клеточная селекция на устойчивость к кольцевой гнилиIкартофеля / Г.В. Рассадина, JI.M. Хромова, Р.Г. Бутенко // Тез. Междунородной конференции «Биология культивирования клеток и биотехнология».-Новосибирск, 1988.- Ч. 1.- С. 167-168.

37. Кнорре Д.Г., Мазина С.Д. Биологическая химия. М.:Высшая школа, 2002.- 325 с.

38. Комарницкий И.А. Ботаника (Систематика). М.: Просвещение,I1975.-608 с. 1

39. Комплексная защита подсолнечника от болезней / В.И.1 Якуткин // Тез. докл. «Современные системы защиты растений от болезней и перспективы использования достижений биотехнологии и генной инженерии».- Голицыно., 2003.- С.239-240.

40. Кретович В.Л. Биохимия растений. -М.:Высшая школа, 1986.-420с.1

41. Культра пыльников как способ создания высокопродуктивных геноисточников льна (Linum usitatissimum L.) методами биотехнологии

42. А.В.Поляков, Н.В.Пролетова // Материалы научно-производственной конф. по льну (Вологда, 26 марта 2000).- Вологда., 2000,- С. 354-357.

43. Лети Джое, Калашникова Е.А. Клеточная селекция пшеницы на устойчивость к септориозу. //Сельскохозяйственная биотехнология. Избранные работы. 2000, Том. 1, С.61-71.

44. Лихачев А.Н. Использование жидких питательных сред для получения моноспоровых культур грибов // Микология иVфитопатология.-1994.-Том 28; Вып. 5.- С. 14-16.I

45. Лутова Л.А. Биотехнология высших растений: Учебник.-СПб.: Изд-во С.-Петерб.ун-та, 2003.-228 с.

46. Масленников С.Е. Методы культуры каллусов и клеток в создании форм люцерны, устойчивых к фузариозу: Автореф.дис. канд.биол.наук: 03.00.23.- М.:ТСХА, 1994.- 15 с.

47. Мезенцева О.Ю. Создание исходного селекционного материала люцерны и пшеницы, устойчивого к фузариозу, методом' клеточнойселекции: Автореф.дис. канд. биол. наук: 03.00.23.- М., 1992.- 21 с.v

48. Ментюков Н.С., Пивень В.Т. Товарные и посевные качества семян подсолнечника в зависимости от степени поражения белой гнилью

49. Науч.-техн. бюл. Всерос. науч.-исслед. ин-та маслич. .культур. -Краснодар, 2004. Вып. 2(131). - С. 58-61.

50. Методические указания по определению солеустойчивостинекоторых злаковых культур (ячмень, кукуруза, кормовые травы) / Г.В.I

51. Удовенко, Л.А. Семушина, А.Г. Морозова. — ВИР., 1973.-14с|.

52. Методы создания форм клевера лугового с повышенной устойчивостью к раку / Л.А.Солодкая, Е.Ю.Новоселова // Сборник науч.трудов. -ВНИИкормов., 1989.- Вып. 42, С.57-65.

53. Молекулярные и генетические механизмы взаимодействия фитопатогенных грибов с растениями / Ю.Т. Дьяков // Молекуляр. иI

54. Морфогенетический потенциал различных эксплантов подсолнечника в условиях in vitro / В.Н. Попов, JI.JI. Юшкина, Я.Ю. Шарыпина // Твер. гос. с.-х. акад: Научное обеспечение национального проекта "Развитие АПК". -Тверь, 2006. С. 152-155. ;

55. На рынке растительного масла // БИКИ.- 25.08.2000.0Ф

56. Нгуен T.JI.A. Повышение устойчивости яровой пшеницы к абиотическим стрессам методами биотехнологии: Автореф.дис.канд.биол.наук: 03.00.23. -М., 1995.-22с.1

57. Нгуен Хонг Минь Селекция in vitro на устойчивость к Fusarium oxysporum f. Sp. Lycopersici у томатов: Автореф.дис. канд.биол.наук:03.00.15.-Минск, 1991.-21 с.

58. Никитчин Д-И. Масличные культуры.-Запорожье.: ВПК «Запор1жжя», 1996. 336 с.

59. Общая и молекулярная фитопатология / Ю.Т.Дьяков, О.Л.Озерецковская, В.Г.Джавахия и др. -М; Общество фитопатологов, 2001. -302 с.

60. Озигит И.И., Гозукирмизи Н., Семиз Б.Д. Индукция каллуса и регенерация растений из зрелых зародышей подсолнечника // Физиология растений.- 2006.- Т. 53; № 4. С. 621-624.

61. Олениченко Н.А., Осипов В.И., Загоскина Н.В. Фенольный комплекс листьев озимой пшеницы и его изменение в процессе низкотемпературной адаптации растений // Физиология , растений.-2006.- Т.53; № 4. С. 554-559.

62. Определение фитотоксической активности культурмикроскопических грибов / О.А.Берестецкий // Конфереция «Методыэкспериментальногой микологии». -Киев, 1973. -С. 165-175. '

63. Отбор клеточных линий клевера лугового, устойчивых к КФ Fusarium oxysporum / С.Т.Германович // Материалы конф. молодых ученых и аспирантов «Новые идеи в растениеводстве, и пути их реализации».- М., 1991.- С. 90-91.

64. Пасешниченко В. А. Растения продуценты биологически активных веществ // Соросовский образовательный журнал. - 200l.-Том 7;№ 8.-С. 13-19. ,

65. Петренкова В.П. Интергированные методы защиты подсолнечника от белой гнили // Вестник аграрной науки1997. №101. С.34-37. ;I

66. Полевой В.В. Физиология растений.-М.:Высшая школа, 1989.-464с.

67. Получение устойчивых к корневым гнилям растений люцерны с использованием методов культуры каллусов и клеток / С.Е.Масленников // Соврем. Достижения биотехнологии.-Ставрополь, 1995.- С. 24-25.

68. Пушкаренко А.Я.; Игнатова С.А.; Лукьянюк С.Ф. Регенерация растений подсолнечника из незрелых зародышей // Науч.угехн. бюл. Всесоюз. селекц.-генет. ин-та.- 1990. Том 2. С. 46-50.

69. Разработка селективного фактора для проведения клеточной селекции на устойчивость к Corynebanium sepedorium / Н.Г.Иванова // Использование клеточной технологии в селекции картофеля. -М., 1987.-С. 26-28.

70. Раскалиева В.А. использование методов биотехнологии в получении исходных форм моркови, устойчивых к патогенному грибу Alternaria radicina : Дис.канд биол. наук: 03.00.23.- М.,2001.- 91с.

71. Раскалиева В.А., Калашникова Е.А. Использование методов биотехнологии в получении форм моркови, устойчивых к альтернариозу. //Сельскохозяйственная биотехнология. Избранные работы. 2001, том. 2, с.81-91.

72. Растеневодство / Г.С.Посыпанов, В. Е. Долго дворов, Г.В.Коренев и др. -М.: Колос, 1997.-448с.I

73. Родева В., Станчева И. Биологичен эфект на културални филтрати от различии изопати на Alternaria solani върху растение доматени растение in vitro II Биотехнология.- 1990.- Том 4; № 3/4. -С.27-30.

74. Савич И.М. Пероксидазы — стрессовые белки растений // Успехи соврем. Биол. 1989.-Том 107. -С. 406-417.

75. Селекция моркови с применением биотехнологических методов / Угарова С.В., Тесля А.А. // Тез. докл. «Пробл. Совета порастениеводству, селекции, семеноводству с/х культур Сибири», Новосибирск, 1994, с.23-24.

76. Сельскохозяйственная биотехнология: Учебник, 2-ое изд., перераб. и доп. / Шевелуха B.C., Калашникова Е.А., Воронин Е.С. и др. -М.:Высшая школа, 2003.- 469 с.

77. Сельскохозяйственная биотехнология: Учебник, 3-е изд., перераб. и доп. / Шевелуха B.C., Калашникова Е.А., Кочнева Е.З и др. -М.:Высшая школа, 2008.- 710 с.

78. Сидоров В.А. Биотехнология растений. Клеточная селекция.-Киев; Наук.думка, 1990. <

79. Сидоров Н.В., Моргун В.В., Логвиненко В.Ф. Особенности каллусо- и морфогенезза в культуре незрелых зародышей разных генотипов мягкой озимой пшеницы // Физиология и биохимия культурных растений. -1988. -№ 4.- С. 349-353.

80. Смиряев А.В., Кильчевский А.В. Генетика популяций и количественных признаков.- М.: КолосС, 2007.-272 с.

81. Сорокатая Е.И. Использование биотехнологических методов для получения устойчивых к корневым гнилям форм ярового ячменя: Автореф.дис. канд. биол. Наук: 03.00.23.- Красноярск., 2001.- 18 с.

82. Способность различных сортов пшеницы (Triticum aestivum L.) к образованию фенольных соединений / Н.В.Загоскина, Н.А.Олениченко, Чжоу Юньвэй, Е.А. Живухина // Прикл.биохимия и микробиология.-2005.- Т.41; № 1.-С. 113-116.

83. Стройков Ю.М., Шкаликов В.А. Защита сельскохозяйственных культур от болезней. М.:МСХА, 1998. - 264с.

84. Таккель Э.А.; Грязева В.И. Фитосанитарная оценка сортов и гибридов подсолнечника (Оценка на устойчивость к белой и серой гнили, а также насекомым-вредителям) // Зерн.хоз-во.- 2006.- № 5. С. 9-11.

85. Талиева М.Н., Филимонова М.В. О паразитической специализации видов род$ Botrytis в свете новых экспериментальных данных.//Ж. общей биол.- 1992.-Том 53.-С.225-231.

86. Тарчевский И.А. Сигнальные системы клеток растений.-М.:Наука, 2002. -294 с.

87. Тарчевский И.А. Элиситор-индуцируемые сигнальные системы и взаимодействие // Физиол. растений.- 2000.-Том 47;№ 2. С. 321-331.

88. Ткачева А.А. Методы in vitro в селекции огурца (Cucumis sativus L.) на устойчивость к фузариозу: Автореф. дис. канд. с.-х. наук: 06.01.05; 03.00.23.-М., 2007.-19с.

89. Ткаченко О.О. "Новая" старая болезнь декоративного подсолнечника (Белая гниль) // Цветоводство.- 2006; № 4. С. 50.

90. Токсичность КФ грибов, вызывающих пятнистость на хлопчатнике / Г.А.Белякова, Б.С.Ермолинский, С.И.Свиридов и др. // Вестник МГУ. Сер. 16.- 1991.- № 4.- С.56-61.

91. Участие фенольных соединений в адаптации клеточных культур к действию экзометаболитов патогенных грибов при селекции in vitro /

92. Е.А.Калашникова, Е.А.Гончарук // Тез. Докл. «VI симпозиум по фенольным соединениями ».- М., 2004,- С.42.

93. Физиологические , аспекты иммунитета растений / Л.Н.Андреев, М.Н.Талиева // Облигатный паразитизм. Цитофизиологические аспекты. -М., 1991. С. 5-12.

94. Физиология и биохимия сельскохозяйственных растений / Н.Н.Третьяков, Е.И.Кошкин, Н.М.Макрушин и др. -М.: Колос, 2000.-640с.

95. Хотин Ю.А., Полякова Т.М. Сохранение инфекционных свойств возбудителя ризоктониоза риса при культивировании наIискусственных питательных средах // Микология и фитопатология.-1991.- Том 25; Вып. 1.- С.80-84.

96. Частная селекция полевых культур / В.В. Пыльнев, Ю.Б. Коновалов, Т.И. Хупацария и др. М.: КолосС, 2005.- 552с.

97. Частная селекция полевых культур / Ю.Б. Коновалов, Л.И. Долгодворова, Л.В. Степанова и др. -М; Агропроомиздат, 1990.- 543 с.

98. Чигрин В.В. Физиолого-биохимическая регуляция совместимости клеток высшего растения и биотрофного патогенна на примере взаимодействия пшеницы и возбудителя стеблевой ржавчины. // Ж.общей биол.- 1986,- XLVII.- С. 310 327.

99. Чкаников Д.И. Использование различий химического состава фитопатогенных грибов и растений при изучении их взаимоотношений // Физиол. Растений.- 1996.-Том 43;№ 5. С. 671-678.1.I t

100. Чкаников Д.И., Артеменко E.H., Гринченко С.Г. О роли инолил -3-уксусной кислоты в патогенезе стеблевой и бурной ржавчивы // Физиол. Растений.- 1990.- № 37,- С.591-595.

101. Шаяхметов И.Ф. Культура клеток и тканей пшеницы in vitro и соматический эмбриогенез: Автореф.дис. д-ра биол. наук: 03.00.23.-С.-Петерб., 2001.- 45 с.I

102. Шевченко Д.Н. Изменчивость линий-регенерантов ячменя попризнакам устойчивости к болезням, морфологии и продуктивности:I

103. Автореф.дис. канд. биол. наук: 06.01.11. -Всерос.НИИ., 1994.- 18 с.I

104. ABA accumulation нт wheat heads inoculated with Septoria nordorum in the field condition / J.F.Bousqet, G.Touraud, M.T.Piollat, i U.Bosch // J.Agron. Crop.Sci.- 1990. Vol. 165.-P. 297-300.

105. Amadioha A.C. Production of cellulolytic enzymes by Rhizopus oryzae in culture and Rhizopus-infected tissues of potato tubers // Mycologia.- 1993.- Vol. 85;№ 4. P. 574-578.

106. Aureusidin Synthase: A Polyphenol Oxidase Homolog Responsible for Flower Coloration // T. Nakayama, K. Yonekura-Sakakibara, T. Sato et al. // Science.- 2000. -№ 290. -P 1163-1166.

107. Bohorova N.E.,v. Punia M.S., lossiftcheva C. Morfogenetic ability of tissue and protoplast culture of wild diploid species of sunflower (.Helianthus L.) // Helia.- 1990.- T. 13, p. 35-40.

108. Chawla H.S., Wenzel G. In vitro selection for fusaric acid resistanc barley plants // Plant Breed.- 1987.- No 2.- P. 159-163.

109. Chawla H.S., Wenzel G. In vitro selection of barley and wheat for resistance against Helminthosporium sativum II Theoritical and applied Genetics.- 1987.- Vol. 74; No 6.- P. 841-845.

110. Combining ability of sunflower inbred lines for in vitro traits / G. Nestares, M. L. Mayor, R. Zorzoli, et al. // Helia. -Novi Sad.- 2001; Vol. 24; №35.-P. 17-23.

111. Daub M.E. Tissue culture and the selection of resistance to patogens // Ann. Rev. Phitopathol.- 1986.- Vol. 24.- P. 156-186.j

112. Deadon W.R., Keyes G.J., Collins G.B. Expressed resistance to blackIshankamong tobacco callus cultures // Theoretical and Applied Genetics.-1982.-Vol. 63.-P. 65-70. . j

113. Deluc L., Barrieu F. Characterization of grapevine R2R3-MYB transcription factor that regulates the phenylpropanoid pathway // Plant physiology preview.-2006.-Vol. 140.-P.-499-511.

114. Differential sensitivity of wheat embryos against extracts containing toxins of Septoria nodorum / Keller В., Winzeler H., Wunzeler M., Fried P. // Phytopathology.- 1994.- Vol. 141; № 3.- P. 233-240.

115. Dixon R.A.; Palva N.L. Stress-induced phenylpropanoid metabolism//

116. Plan Cell.- 1995.- Vol. 7. P. 1085-1097.

117. Effect of cytokinin' on the accumulation of pathogenesis related proteins (PR la protein) in vitro propagated Nicotiana tabacum shoots / A.Poupet, L.Cardin, B.Bettachini, D.Beck // Physiol. Veget.- I990.-Vol. 311. -P. 239-246.

118. Flavonoids: Plant signal to soil microbes / D.A. Philips // Phenolic metabolism in plant. -N.Y.: Plenum press.-1992.-P. 201-231.

119. Freyssinet M., Freyssinet G. Fertile plant regeneration from sunflower (Helianthus annuus L.) immature embryos // Plant Sc. — 1988.- T. 56; № 2. -P. 177-181.i

120. Friedman, M. Chemistry, biochemistry, and dietary role of potatoipolyphenols // Agric. Food Chem. -1997.-№ 45. P.-1523-1540. ji

121. Hammerschlag F. A. Resistance responses of plants regenerated from peach callus cultures to Xaythomonas campestris pv. pruni // J. Amer. Soc. Hortic, Sci. 1990. -Vol. 115; No 6.- P. 1034-1037. ,

122. Hammond-Kosack K.E., Gones J.D.G. Resistance gene dependent plant defence responses // Plant Cell. -1996,- Vol. 8. -P. 1773-1791.

123. Hanson L.E., Howell C.R. Elicitors of plant defense responses from biocontrol strains of Trichoderma virens II Phytopathology.- 2004. Vol. 94; №2. -P. 171-176.

124. Harborne J.B. Arsenal for survival secondary plant-products // Taxon.-2000.-Vol. 49; I. 3.-P.435-449.

125. Harborne J.B. Do natural plant phenols play a role in ecology ? // Acta Hort. -1994. -No 381.- P.36-43.137. http:// www.fao.org/apps.fao.org

126. Hughes R.K., Dickerson A.G. Auxin regulation of Phaseolus vulgaris to a fungal elicitor // Plant Cell Physiol.- I990.-Vol. 31. -P. 667-675.

127. Induction of plant defense response by exoenzymes of Erwinia carotovora subsp. carotovora / T.K.Palva, K.O.Holmstrom, P.Heino, E.T.

128. Palva // Molec.Plant-Microbe Interact.- 1993.- Vol. 6; № 2. P. 190-196 .j

129. Influence of genotype and gelling agents on in vitro regeneration by organogenesis in sunflower,/ E. F. Berrios, L. Gentzbittel, H. Serieys et al. // Plant Cell Tissue Organ Cult.- 1999.- Vol.59; № 1. P. 65-69.

130. Jach Monika, Przywara Leslaw. Somatic embryogenesis and organogenesis induced in immature zygotic embryos of selected sunflower

131. Helianthus annuus L.) genotypes Acta boil // Cracov.Ser.Bot. -2000.-Vol.42, № 2. -P. 83-86. '

132. Kasenberg T.R., Traguair J.A. Effectis of phenolics on growth of Fusurium oxysporum f. Sp. Radicis- Lycopersici in vitro II Can. J. Bot. -1988.- Vol. 66; № 6,- P. 1174-1177.

133. Katiyar R.K., Chopra V.L. Somaclonally induced in a Brassica juncea germplasm accession with field resistance to important diseases // Plant Breed. 1990.- Vol. 104; No 3.- P. 262-264.

134. Knogge W. Fungal infection of plants // Plant Cell.- 1996.-T 8.- P. 1711-1722.

135. Kojima M., Takeuchi W. Detection and characterization of p-Coumaric Acid Hydroxylase in mungbean, vigna mungo, seedlings.J. // Biochem.-1989.-№ 105. -P. 265-270.

136. Krauter R., Friedt W. Propagation and multiplication of sunflower lines {Helianthus annuus L.) by tissue culture in vitro II Iielia. -1991,- T. 14; № 14. P. 117-121.

137. Kurusaki P., Tashiro N., Nishi A. Secretion of chitinasef from cultured carrot cell treated wiht fungal myceliae walls // Physiol. Molec.

138. Plant. Pathol.- 1987,- Vol. 31; № 2.-P. 211-216.1

139. Li A., Heath C. Effect of plant growth regulators on the interactions beween bean plants and rust fungi non-pathogenic on beans // Physiol. Mol. Plant Pathol.- 1990.- Vol 37. P. 245-254.

140. Li L., Steffens J. C. Overexpression of Polyphenol Oxidase in transgenic tomato plants results in enhanced bacterial disease resistance // Planta.- 2002. -№ 275. -P. 239-247.

141. Lofty S., Fleuriet A. Biocinthesis of phenolic compounds in Vitis vinifera cell suspension cultures: Study on hydroxycinnamoyl Co A: ligase // Plant cell reports.-1989.-Vol.8; I.2.-P.93-96.

142. Maki H., Morohashi Y. Development of olyphenol oxidase activity inithe micropylar endosperm of tomato seeds // Plant Physiol.- 2006.-№163.-P. 1-10.

143. Mauch-Mani В., Metraux J.P. Salicylic acid and systemic acquirediresistance to pathogen attack. //Annals Bot. -1998.-Vol. 82.-P. 535-540.

144. Mayer A. M., Harel E. Phenoloxidases and Their Significance in Fruit and Vegetables. In Food Enzymology; Fox, P. F., Ed. // Elsevier.- New York.- 1991.- p.373-398.

145. Mc Coy T. Tissue culture selection for resistant plants // liowa state j. Res. -1988.- No 4.- P. 503-521.

146. Miklas P.N., Grafton K.F., Secor G.A. Use of patho gen filtrate to differentiale physiological resistance of dry bean to white molddisease // Crop. Sc.- 1992.- Vol. 32; № 2.- P. 310-312. j

147. Pajevic S., Vasic D., Sekulic P. Biochemical characteristics and nutrient content of the callus of sunflower inbred lines // Helia. -Novi Sad.-2004.- Vol. 27; № 41. P. 143-149.

148. Pathophysiological aspects of plants disease resistance / Z.Kiraly, T.Ersek, B.Barna et al. // Acta Phytophath. Entomol. Hungarica.- 1991.-Vol. 26.-P. 233-250.

149. Plant regeneration from cotyledons derived from mature sunflowerseeds / G. Nestares, R. Zorzoli, L. Mroginski, L. Picardi //

150. Helia. -Novi Sad.- 1996.- Vol.19; № 24. P. 107-112. !i

151. Plantlet formation from callus and shoot-tip culture of Helianthus annuus L. / Lupi M.C., Bennici A., Locci F., Gennai D. // Plant: Cell Tissue Organ Cult. -1987.- Т. 11; No 1. P. 47-55.

152. Responses of Asparagus officinalis pollen to the culture filtrate of Fusarium oxysporum f. sp. asparagi / A.C. Pontaroli, E.L. Camadro, F.J. Babinec, A. Ridao // Sc.hortic.- 2000.- Vol.84; № 3/4. P. 349-356.

153. Sacristan M. Resistance responses to Phoma lingam of plants regenerated from selected cell and embruogenic cultures of haploid Brassica napus И Theoretical and Applied Genetics.- 1982.- Vol. 61; No 3.- P. 193200.

154. Schmitz P., Schnabl H. Regeneration and evacuolation of protoplastsfrom mesophyll, hypocotyl and petioles from Helianthus annuus L II J. Plant Physiol. 1989.- T. 135; No 2. - P. 223-227. 1993. -Том 18; № 4. -С. 15-20.

155. Screening hibrid poplars in vitro for resistanse to leaf spot caused by Septoria musiva / Michal E., Ronald E., Kathleen Т., Robert R // Plant disease.- 1988,- Vol. 72; № 6.- P. 491-499.

156. Semal J., Viseur J., Anceau C. In vitro cultures of producingpathogen-free plants and selecting disease resistant genotupes //'Bull. Rech.

157. Agron. Gembroux.- 1988.- Vol. 23; № 3.- P. 261-269.1

158. Sjodin C., Glimelius K. Transfer of resistance against Phoma lingam. . . '

159. Brassica napus by asymmetric somatic hybridization combined with toxinselection // Theoretical and Applied Genetics.- 1989.- Vol. 78; No 4.- P. 513-520.1

160. Somaclonal variation in celery and selection by coculturing toward resistance to Septoria apicola / Evenar D., Pressman E., Benyephet Y., Rappaport L. // Plant Cell tissue and organ culture.- 1994.- No 39.- P. 203210.

161. Sunflower tissue culture and use in selection for resistance to Phomavmacdonaldii and white mold (Sclerotinia sclerotiorum) / Hartman C.L.; Donald P.A.; Secor G.A.; Miller J.F. //Proc.-1988.- Vol. 2; S.l. P. 347-351.

162. Surface signalling in pathogenesis / P.E.Kolattukudy, L.M.Rogers,

163. D.Li et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA .-1995.-Vol. 92.-P. 4080-4087.iiculture filtrate of Fusarium oxysporum f. sp. dianthi //i

164. Plant Cell Rep.- 2002.- Vol. 20; № 9. P. 825-828.

165. Thanutong P., Furusava I., Ymamoto M. Resistance tobacco plants from protoplasts derived calluses selected for their resistance to Pseudomonas and Alternaria toxins // Theoretical and Applied Genetics.-1983.-Vol. 66; No 34.-P. 209-215.i

166. Toyoda H. Selection of disease resistant plant through tissue culture // Karaky to scibucu.- 1990.- Vol. 28; No 1.- P. 12-19.i

167. Trebst A., Depka B. Polyphenol Oxidase and Photosynthesis Research // Photosynth.Res.-1995. -№ 46. P. 41-44.

168. Tylkowska K. Toxinogenicity of Alternaria alternana isolates from carrot seeds and seedlings // Seed Sc. Technol.- 1995.- Vol. 23; № 3.- P. 877-879.

169. Valluri J., Treat W. Bioreactor culture of heterotrophic sandalwood cell suspensions utilizing a cell-lift imperller // Plant cell report.-1991.1. Vol.l0;I.6.-P.-366-370. ii

170. Van Becelaere G., Miller J.F. Methods of inoculation of sunflower heads with Sclerotinia sclerotiorum II Helia. -Novi Sad.- 2004.-1 Vol. 27; № 41.-P. 137-142.

171. Vasic D., Alibert G., Skoric D. In vitro screening of sunflower for resistance to Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary // Helia. -Novi Sad., 1999.- Vol.22; № 31. P. 95-103.

172. Wang J., Constabel C. P. Polyphenol Oxidase Overexpression intransgenic populus enhances resistance to Herbivory by forest tenticaterpillar (Malacosoma disstria) // Planta. 2004. -№ 220. - P. 87-96.