Белоксинтетическая способность и стабильность двух штаммов культуры ткани Polyscias filicifolia при стрессе

Спасенков, Александр Игоревич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Белоксинтетическая способность и стабильность двух штаммов культуры ткани Polyscias filicifolia при стрессе
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Белоксинтетическая способность и стабильность двух штаммов культуры ткани Polyscias filicifolia при стрессе"

На правах рукописи

СПАСЕНКОВ АЛЕКСАНДР ИГОРЕВИЧ

БЕЛОКСИНТЕТИЧЕСКАЯ СПОСОБНОСТЬ И СТАБИЛЬНОСТЬ ДВУХ ШТАММОВ КУЛЬТУРЫ ТКАНИ РОЬУБСЫЯ ПЫС1Р011А

ПРИ СТРЕССЕ

03,00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2006 год

Работа выполнена в Санкт-Петербургской Государственной Химико-Фармацевтической Академии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ

Научный руководитель

Доктор биологических наук, профессор Кириллова Надежда Васильевна

Научный консультант

Кандидат биологических наук СлепянЛариса Ивановна

Официальные оппоненты Доктор медицинских наук, профессор

Дубинина Елена Ефимовна

Доктор биологических наук, профессор /Тучкова Людмила Валентиновна

Ведущая организаций

Ботанический институт Российской Академии Наук

Защита диссертации состоится

2006 г. в

часов на

заседании Диссертационного совета К 208.088.01 при ГОУ ВПО Санкт-Петербургская Государственная Химико-Фармацевтическая академия по адресу: 197376 Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, д. 34.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Санкт-Петербургской Государственной Химико-Фармацевтической Академии по адресу: 197376 Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, д.4/6.

Автореферат разослан " " 2006 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета К 208.088.01

кандидат биологических наук

Караваева А.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Штамм тропического растения Polyscias filicifolia был введен от интактного оранжерейного растения в культуру изолированных тканей in vitro в Санкт-Петербургской Государственной Химико-Фармацевтической академии в 1972 году (Слепян Л.И. и соавт., 1975). Полученный в СПХФА штамм далисциас Polyscias filicifolia был зарегистрирован во ВСККК-ВР под номером 24, как обладающий адаптогенным, ащистрессорным и иммуномодулирукицим эффектами (Михайлова Н.В., 1981; Трилис Я.Г. и соавт.,1995; Рябков Л.Н. и соавт., 2004).

В последние годы исследования германийорганических соединений, обладающих низкой токсичностью и широким спектром биологической активности, являются одним из перспективных направлений в современной химии элементорганических соединений. Эти соединения не только повышают эффективность применяемых лекарственных средств, но и снижают токсичность или побочные эффекты лекарственных препаратов (ГарТ.К., Миронов В.Ф.,1982, Хромова Н.Ю., Гар Т.К., Миронов В.Ф., 1985).

Селективный штамм Polyscias filicifolia LX-5 был введен в культуру в 2003 году при выращивании исходного штамма полисциас на среде, содержащей германийорганическое соединение (LX-5).

В настоящее время культуры растительных тканей становятся объектом промышленной биотехнологии для получения биологически активных соединений для медицины, косметики, пищевой и ряда других промышленностей. В то же время, для более широкого внедрения в промышленность целевых продуктов на основе культур растительных тканей создаваемые биотехнологические производства должны быть способными выдерживать конкуренцию с альтернативными системами получения данных продуктов. Однако перевод клеток растений в культуру в значительной степени меняет морфологию, биохимические особенности, а также генотип клетки, поэтому многие аспекты ее существования и развития требуют детального самостоятельного изучения. Таким образом, основные трудности, которые тормозят внедрение растительных культур в промышленное производство, связаны с недостаточным знанием как общей биохимической картины изменений, происходящих в культивируемых in vitro клетках, так и контрольных механизмов биосинтеза вторичных продуктов растительного происхождения и рядом других проблем (Бутенко Р.Г., 1991; Бурьянов Я.И., 1999). Поэтому в последние годы во всем мире ведутся интенсивные биохимические иссдедования на модели культур растительных клеток, которые открывают большие перспективы в изучении молекулярных механизмов метаболических процессов, протекающих в клетке, с целью их практического применения (Носов А.М., 1999). В частности, культуры растительных тканей используются в настоящее время в качестве адекватной модели для изучения на клеточном уровне адаптации растений к различным неблагоприятным воздействиям окружающей среды.

Цель и задачи исследования. Основной целью диссертационной работы является сравнительное исследование основных биохимических и фиI«химических показателей в процессе культивирования клеток исходного и селективного штаммов Polyscias filiciiilia (Moore ex Fourntcr) Bailey (сем. Araliaceae), Изучение влияния температурного шока н низких температур на белоксинтетическую способность и стабильность культур клеток растения нолисцкас.

В соответствии с целью работы непосредственными задачами работы я клялись:

1. Характеристика динамики прироста биомассы, содержания ДНК и РНК, а также белоксинтезируюшей способности клеток исходного полисцнас и селективно! о лолнсциас LX-5 штаммов

2 Изучение динамики уровня активности фсрментов-адтюксидашов (пероксилази. катализы и СОД) в процессе роста культивируемых растительных клеток двух штаммов полисцнас

3. Определение основных фитохимнчееккх показателей биомассы клеток исходного и селективного штаммов полисниае

-I Оценка влияния различных температур на пролиферативную активность, бслоксиптетруютую способность и состояние трех исследуемых ферментов-ант иоксидашов в культурах растительных клеток

5. Исследование элементного состава и внутриклеточного распределения германия в культуре селективного шгамма полисцнас

Научная новизна работы. Основным достижением данной работы представляется проведенное впервые в сравнительном аспекте комплексное исследование основных биохимических и фитохимических показателей в процессе выращивания исходного и селективного штаммов тропического растения полисцчас

Получены новые данные, расширяющие и углубляющие современные представления о метаболизме белков в растительных клетках при экстремальных температурных воздействиях. В результате проведенных исследований впервые была оценена белоксинтезирующая способность и рассчитаны параметры кругооборота внутриклеточного белка в культивируемых клетках лолисциас и полисцнас LX-5.

Установлена тбирательная чувствигельность важнейших ферментов антиоксидантной системы - СОД, каталазы и пероксидазы - к воздействию различных температур, что проявляется в усилении или ослаблении уровня их каталитической активности Отмеченный колебательный характер изменения активности трех основных ферментов антноксидантной системы коррелировал с ростовыми процессами (накопление биомассы и внутриклеточного белка) и с изменением митотической активности (по содержанию ДНК).

В диссертационной работе впервые изучена динамика содержания ДНК и РНК в клетках двух штаммов культуры полисциас в процессе их

культивирования. Установлено, что характер изменения содержания РНК сходен с таковым для ДНК. Впервые были получены новые данные о пролиферативной активности культивируемых клеток полисциас при высоко- и низкотемпературных воздействиях, а также изучена пролиферативная активность клеток in vitro при воздействии активных форм кислорода.

При опенке влияния германийорганических соединений на метаболизм белков было установлено, что выращивание культуры полисциас на селективных средах не» только увеличивает содержание нуклеиновых кислот и внутриклеточного белка, но и повышает в исследуемых клетках уровень активности ферментов-антиоксидантов по сравнению с исходным штаммом.

Кроме того, в работе был проведен фотохимический анализ содержания основных биологически активных соединений (суммы гликозидов, углеводов и микроэлементов), а также изучено внутриклеточное распределение германия в клетках селективного штамма. Установлено, что максимальное содержание германия (до 54-55%) локализовано в водорастворимой фракции культивируемых клеток, а примерно 30% обшего количества данного элемента остается в шроте, после извлечения липофильных веществ и суммы гликозидов.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные в работе данные расширяют и углубляют наши представления о биохимическом состоянии, переведенных в культуру растительных клеток. Полученные результаты дополняют уже известную информацию о биологической роли германия, в частности, о возможном участии германийорганических соединений в биологических процессах в растительной клетке.

Работа носит экспериментально-теоретический характер. Однако полученные результаты характеризуются практической направленностью для биотехнологии и медицины. В частности, в работе было установлено, что добавление в питательную среду германийорганического соединения, оказываю положительное влияние на основные ростовые и биохимические показатели культуры ткани полисциас. Учитывая высокую биологическую активность германийорганических соединений (Хромова Н.Ю.. 1983), можно полагать, что препараты (настойки, экстракты и т.п.), из биомассы модифицированного штамма полисциас, будут иметь более широкий спектр фармакологического действия по сравнению с исходной культурой полисциас, что открывает большие перспективы в использовании германийорганических соединений в биотехнологии растительных тканей.

Полученные результаты будут использованы при оформлении паспортов на исходный и селективный штаммы культуры Polyscias filicifolia. Материалы данного исследования используются в учебном процессе на кафедре биохимии для студентов Санкт-Петербургской Государственной химико-фармацевтической академии.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Биохимические исследования влияния германийорганического соединения на основные ростовые и биохимические показатели культуры ткани полисциас.

2. Радиоизотопные исследования скорости биосинтеза и времени функционирования общего белка, а также биохимические исследования активности ферментов-антиоксидантов (СОД, каталазы и пероксидазы) в растительных клетках, выращенных в стандартных условиях я при воздействии неблагоприятных температур.

3. Изучение пролиферагивной активности культивируемых клеток полисциас при высоко- и низкотемпературных воздействиях, а также при воздействии in vitro активных форм кислорода.

Апробация работы. Материалы работы были апробированы на научной конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2005), IX Международном съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (Санкт - Петербург, 2005), Юбилейной конференции «Подготовка кадров для фармацевтической промышленности» (Санкт -Петербург, 2005), 61-ой региональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2006), IX Международной конференции молодых ботаников (Санкт - Петербург, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Личный вклад автора. Культивирование биомассы, анализ ее ростовых и фотохимических (содержания гликозидов, полисахаридов, распределение германия) показателей. Изучение обмела внутриклеточного белка, про- и антиоксидантного статуса, количественная оценка нуклеиновых кислот культивируемых клеток. Электрофоретические методы, изучение влияния температурного воздействия и прооксидантов на белоксинтезирующую способность, клеточную пролиферацию и активность ферментов антиоксидантов. Элементный состав в пробах биомассы клеток двух штаммов определяли на коммерческой основе в Городской санэпидстанции. Автор принимал активное участие в написании научных публикаций по теме диссертационной работы.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 128 страницах, содержит 5 таблиц и 25 рисунков. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов их обсуждения, выводов и списка использованной литературы, которая включает 201 наименование на русском и английском языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служила культура ткани полисциас Polyscias fílicifolia (Moore ex Foumter) Bailey (ссм. Araliaceae) (Слепян JI.А. и соавт., 1975), в процессе ее длительного культивирования на стандартной агаризованной среде Мурасиге и Скуга, модифицированной Н.Ф. Писецкой (Писецкая Н.Ф., 1970). Биомассу полисциас Polyscias fílicifolia LX-5 (Moore ex Foumter) Bailey (сем. Araliaceae) выращивали на вышеуказанной среде, обогащенной 1-гидроксигерматран моногидратом (LX-5) в концентрации 0,1 г/л. Используемое

при культивировании германийорганическое соединение 1-гидроксигерматран моногидрат имеет условное обозначение "LX-5" (номер государственной регистрации 2044278). Общая химическая формула HOGe(OCH2OCH2)N Н20 (М„=235) (Хромова Н.Ю и др., 1985).

Для выделения цитозольной фракции клеток в работе использовали биомассу из 5-6 пассажей каждые 5-7 суток культивирования. Навески ткани гомогенизировали в ступке на холоду с 0,05 М фосфатным буфером рН=7,8 (0,5:1, v/w). Полученный гомогенат оставляли в течении 30 минут при 4°С, затем центрифугировали на микрофуге Beckman (США) в течение 3 мин при 12000 g. Осадок отбрасывали, а в супернатанте определяли содержание белка по методу Лоури (Lowry О.Н. et al., 1951). Активность каталазы определяли перманганатометрическим методом (Комов В.П., Шмелев В.К., 1975), СОД-по методу (Misra Y. P., Fridovich I., 1972) и пероксидазы - (Bovaird J.H., et al., 1982).

Элементный состав биомассы определяли методом атомно-адсорбционного анализа с использованием установки «Квант АФА». Кроме того, определение микроэлементов в биомассе проводили с помощью рентгеноспектрального анализа на приборах с охлажденным полупроводниковым детектором и на кристаллодифрактометре АР-113.

Содержание германия в клетках биомассы полисциас LX-5 определяли по методу (ФСП 42, 2000). С целью изучения распределения германия между водорастворимыми и липофильными компонентами использовали метод (Захарова И.Я., Косенко Л.В., 1982). Содержание суммарной гликозидной фракции (СГФ) определяли по методу (Антан И.С. и соавт., 1995).

Количественное определение ДНК и суммарного пула РНК в ткани полисциас проводили по ранее описанному методу (Ермаков А.И., 1972; Вечера А.С., 1986).

Обмен внутриклеточного белка оценивали на 1-7сутки после введения в каллусные культуры С|4-лейцина (уд. радиоактивность 157 мКи / моль), го расчета 150 мкКи на 10 г ткани. Уровень радиоактивности определяли на сцинтилляционном счетчике («Mark-Ш», США). Используя полученные кривые деградации внутриклеточного белка, рассчитывали константы скорости синтеза и распада, а также время его полуобновления (Arias I.M. et all., 1969; Schimke R.T. et all., 1975).

Электрофоретическое разделение внутриклеточных белков проводили методом вертикального электрофореза в 3% и 10% ПААГ с DS-Na (Laemly U., 1970) с использованием наборов маркерных белков (Sigma, США; Serva, Швеция).

Культуру ткани полисциас различного возраста подвергали высоко- (3 часа при 45°С) и низкотемпературной (при 7°С в течение 24 часов) обработке.

Перекись водорода в концентрациях от 5 до 500 мк моль или стерильные растворы феназин метасульфата в концентрации от 1 до 16 мкмоль вносили в асептических условиях в среду культивирования ткани 20-ти суточного возраста. Через 24 часа оценивали уровень пролиферации ткани, рассчитанный по увеличению/снижению содержания ДНК в клетках по сравнению с контрольными образцами.

Статистическая обработка данных проведена по ГОСТ 11.004-74.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Длительность культивирования тканей растений, как известно, может вызывать заметные изменения как в росте и морфологии клеток, так и их биохимических показателях. Нами было установлено, что рост культуры ткани полисциас после многократных пассажей идет по обычной S-образной кривой с 5-ти дневной "лаг-фазой. При культивировании клеток на среде, содержащей германнйорганическое соединение наблюдали увеличение прироста сырой биомассы каллусной культуры на 10-15%, а суховоздушной — на 20-25%. Содержание внутриклеточного белка в исследуемой каллусной культуре полисциас, выращенной на стандартной и модифицированной средах, менялось на протяжении роста ткани незначительно. Ранее другие авторы также отмечали достаточно стабильный уровень концентрации внутриклеточного белка в процессе культивирования различных видов растительных тканей (Раймерс, Хавкин, 1970). Характерно, что селективный штамм полисциас LX-5 в значительной степени отличался от соответствующего исходного штамма полисциас не только по относительному приросту сырой и суховоздушной биомассы, но и уровню содержания и динамики накопления внутриклеточного белка. Полученные данные, по-видимому, обусловлены влиянием германий органических соединений на геном растительных клеток, которые выращивались на селективных средах. (Гар Т.К., Миронов В.Ф., 1982).

Известно, что белоксинтезирующая способность клеток опосредованно влияет на все стороны обмена веществ. Расчет скорости биосинтеза внутриклеточного белка показал, что время функционирования внутриклеточного белка в культивируемых клетках исходного штамма равнялось 6,86 суток, а в селективном штамме, - 6,42 суток (табл. 1). Сходные параметры скорости обновления внутриклеточных белков были получены ранее в культивируемых in vitro суспензионных и каллусиых растительных тканях (Kemp J., Sutton D.W., 1972; Trewavas A., 1972; Хавкин Э.В., 1977). Установлено, что скорости накопления внутриклеточного белка в клетках изученной нами культуры ткани Polyscias filicifolia и Polyscias filicifolia LX-5 составляли, соответственно, 0.42% и 0.45% в час. Из данных литературы известно, что скорость обновления белка в растительных тканях in vitro лежит в пределах от 0,1% до 2% белка в час (HuffakerR.C., Peterson L.W., 1974; Хавкин Э.В, 1977).

Таблица 1.

Индексы К«], сут'1 ^1/2» сут Е, мкг/г ткани Кя, мкг/сут на г ткани

Контроль

Ро1у«С1а« ПИс(ГоНа 0,101 6,86 4500 454,5

РоК^а'а« ПНоГоНа ЬХ-5 0,108 6,42 4600 496,8

Воздействие высоких температур

Ро1у$с1а$ ЛИстПа 0,121 5,63 3634,1 439,7

Ро1у»1а$ АИыСШа ЬХ-5 | 0,110 6,30 4630,2 509,3

Воздействие низких температур

Ро1у$с1а$ ШкШНа 0,058 11,95 2930,4 I 170,0

Ро1у$аа$ АНсШНа ЬХ-5 0,098 7,07 3639,8 1 356,7

Примечание: Кс! - константа скорости распада, Кл - константа скорости синтеза, Хщ*- время "полужизни"/ время функционирования, Е - концентрация внутриклеточного белка.

Учитывая ведушую роль нуклеиновых кислот в жизнедеятельности культивируемых клеток, была проведена сравнительная оценка содержания ДНК и суммарного пула РНК в биомассе культур исходного и селективного штаммов полисциас. Известно, что по содержанию ДНК в клетке можно косвенно судить о митотической активности культивируемых клеток.

I -•-ДНК

| ---•-•■РНК

.*/= *

I '.

* \ Е *

Сутки роста

0.18 - Т ^

_ »»] Й I \

£ |

I 3 5 Т 1« И 17 20 23 2? 30 33 №

С утюг роста

Рисунок 1. Содержание РНК (1) и ДНК (2) в процессе роста клеток Ро!у$с1а$ ПИ^оПа

Рисунок 2. Содержание РНК (1) и ДНК (2) в процессе роста клеток Ро1у$с1а$ ПМоГоИа ЬХ-5

По-видимому, высокий уровень ДНК, выявленный после 20-х суток роста ткани, связан с повышением митотической активности клеток культур, находящихся в экспоненциальной фазе роста, характеризующейся ростом с ускорением (рис. 1, 2). При анализе полученных данных выявляется определенная корреляция между фазными изменениями в содержании белка и РНК в культивируемых клетках, в частности, на 5, 14-15, 27 и 30-35 сутки роста биомассы тканей. Вполне закономерно, что усиление синтеза всех трех типов РНК и является причиной количественных изменений в биосинтезе внутриклеточного белка на эти сроки роста культивируемых клеток. Некоторое понижение содержания ДНК на последних сроках культивирования клеток, по-видимому, связано с повышением активности ДНКаз. Ранее на модели каллуса табака (Tan B.C., Liang H.G., 1991) было показано, что снижение содержания ДНК в клетках при старении тканей соответствовало повышению активности ДНКаз Известно, что в процессе метаболизма кислорода у аэробов происходит генерирование свободных радикалов кислорода и устойчивость к окислительному стрессу определяется состоянием ферментов специализированной антиоксидантной защиты и активно пролиферирующие in vitro клетки характеризуются высоким уровнем их активности (Tolmasofï J.M. et al., 1980; Kendall E.J., McKersie B.D., 1989). Поэтому активность ферментов антиоксидантной системы, по нашему мнению, может быть хорошим маркерным показателем физиологического состояния клеток.

1 3 5 10 15 17 20 25 27 30 35 40

Супя роста

1 3 5 10 15 17 20 25 27 30 35 40 Сутки роста

Рисунок 3. Активность катал азы (1),Рисунок 4. Активность каталазы (1), СОД (2) и пероксилазы (3) в СОД (2) и пероксилазы (3) в

процессе роста ткани процессе роста ткани

Ро1у$с1я$ ЛНиСоНа Ро1узс1ая ПИоСоНа Х-5

Как видно из представленных данных (рис. 3 и 4), кривые уровней активности изучаемых ферментов в клетках исходного и селективного штаммов полисциас, в основном имели максимумы на 4-6, 14-15, 20 и 35 сутки роста. Колебательный характер изменения каталитической активности трех изучаемых ферментов антиоксидантной системы в основном, коррелировал с ростовыми процессами (накопление биомассы и внутриклеточного белка) и с изменением митотической активности клеток (по содержанию ДНК).

Изучаемые нами растительные СОД, каталаза и пероксидаза являются индуцибильными ферментами, поэтому можно полагать, что повышение активности ферментов происходит за счет индукции их биосинтеза и определяется интенсификацией окислительно-восстановительных процессов, которые сопровождают активно протекающие митотические циклы. Высокая активность исследуемых ферментов непосредственно после пересадки инокулюма на новую питательную среду, по-видимому, связана с реакцией этих клеток на механическое повреждение при их пересадке, а также адаптацией ткани к свежей питательной среде. Уровень активности СОД, катал азы и пероксидазы остается на достаточно высоком уровне и на последних этапах культивирования исследуемых культур, что, по-видимому, может быть связано с накоплением активных форм кислорода, в частности, перекиси водорода, в стареющей ткани каллуса. Как видно из представленных данных, при переводе культуры ткани полисциас на селективную среду, активность исследуемых ферментов в клетках каллуса увеличивается в среднем на 11% (СОД), 18,6% (пероксидаза) и 26,5% (каталаза). Полученные результаты могут быть объяснены перестройкой метаболических процессов, связанных с потреблением энергии и усилением поглощения кислорода растительными клетками, что, в конечном итоге, и приводит к активации антиоксидантной ферментной системы и, в частности, фермента - пероксидазы. Наши предположения подтверждаются данными литературы, в частности, ранее было показано, что низкие концентрации органических соединений германия стимулируют поглощение тканями животных кислорода (Гар Т.К., Миронов В.Ф., 1982).

Оценка протеинового спектра внутриклеточных белков в клетках культур ткани Ро1узс1а5 ПНаПэНа и Р^увмав ПНаГоНа ЬХ-5 показала (Ьаеш1у и., 1970),, что основная масса идентифицированных белковых полос имела молекулярные массы от 70 кДа до 16 кДа. Однако, как видно из рисунков 5-6, в клетках исходного штамма были наиболее выражены белковые зоны с молекулярными массами 50, 35-37 и 14 кДа, а у селективного штамма превалировали внутриклеточные белки с молекулярными массами равными 60, 45, 35-37, 14 и 10-12 кДа.

Известно, что на рост биомассы и накопление вторичных метаболитов в культивируемых клетках значительное влияние оказывает химический состав питательной среды. Функционирование живых организмов обеспечивается рядом химических элементов (биомикроэлементов), которые содержатся в клет-

1 : ! > ? о 6 : Рис. 5. Электрофорез внутриклеточных белков культуры ткани Ро1у$с1а$ ПНиГоНа Примечание:

1,2,3,4,5 -1-е, 14-е, 20-е, 27,-е и 35-е, 6,7,8,9 - 5-е, 16-е, 23-е н 30-е сутки роста ткани.

1« 18 19 21 Сутки роста Рис. 6. Электрофорез внутриклеточных белков культуры тканн Ро1у$с1а$ ПКс1й>На ЬХ-5

ках в незначительных количествах. Однако, применение биомассы культур растительных тканей в биотехнологии, с целью получения лекарственных средств или для приготовления биологически активных добавок, возможно только при отсутствии в ней фитогормонов, тяжелых металлов и ряда других нежелательных соединений, которые используются при приготовлении питательных сред. Исследование элементного состава культивируемых клеток полисциас показало, что они практически не содержат тяжелых металлов. Анализ клеток биомассы не выявил в них присутствия свинца, а содержание кадмия было более чем в 5 раз ниже предельно допустимой концентрации. В то же время биомасса полисциас содержит такие жизненно важные элементы, как железо, марганец, медь, цинк, которые, как известно необходимы для проявления каталитической активности ряда ферментов-антиоксидантов.

Выявлено, что в 1 г клеточной и суховоздушной биомассы содержится, соответственно, 0,00005 и 0,0015 г германия. Таким образом, установлено, что в процессе выращивания биомассы селективного штамма культуры полисциас 3940% внесенного в питательную среду германийорганического соединения усваивается культивируемыми клетками. Данные по распределению германия в клетках селективного штамма полисциас ЬХ-5 показали, что максимальное

содержание германия отмечено в водорастворимой фракции (54,7%), при этом до 12% германия было связано с полисахаридами. Некоторое количество германия ассоциировано с гликозидной фракцией, до 3%. В липидной фракции обнаружены лишь следовые количества германия, а более 30% общего количества данного элемента остается в шроте, после извлечения липофильных веществ, суммы гликозидов и водорастворимых веществ.

Таким образом, нами было показано, что добавление в питательную срсду германий органического соединения, оказывало положительное влияние на основные ростовые и биохимические показатели культуры ткани полисциас. Учитывая высокую биологическую активность германийорганических соединений (Миронов, Гар, 1967; Гар, Миронов, 1982), можно полагать, что полученные результаты открывают большие перспективы в использовании германийорганических соединений в биотехнологии растительных тканей.

В настоящее время известно, что устойчивость растений к различным неблагоприятным факторам является генетически детерминированным признаком, однако это свойство изменяется в онтогенезе, а также под влиянием изменяющихся условий окружающей среды. В связи с этим, для определения способности к адаптации растение или растительные клетки должны быть подвергнуты повреждающему воздействию и достоверные сведения об устойчивости растительного организма к повреждающему фактору, можно получить только изучая характер его ответных реакций (Parsell D.A., Libdquik S., 1994; Ellis R.J., 1994; Dice J.F. et al, 1994). Среди механизмов адаптации растений к неблагоприятным условиям среды особое место занимают ответные реакции растительных клеток на температурный стресс.

В данной работе изучали влияние высоких и низких положительных температур на пролиферативную активность, белоксинтезирующую способность и антиоксидантный статус в культивируемых растительных клетках исходного и селективного штамма полисциас. Установлено, что при действии высоких температур наблюдается достоверное снижение концентрации общего белка в клетках исходного штамма полисциас, в селективном штамме данной культуры, понижение содержания белка было выявлено только у клеток 30-и и 40-а суточного возраста. При воздействии низких положительных температур достоверное снижение содержания белка в культивируемых клетках было обнаружено в обоих исследуемых штаммах. Однако и в этом случае наибольшие изменения данного параметра были характерны для исходного штамма полисциас.

При воздействии теплового шока (при 45°С в течение 3-х часов) на культуру исходного штамма полисциас наблюдали снижение скорости биосинтеза белка (на 3%), при этом скорость распада внутриклеточного белка увеличивалась на 19,8% (табл. 1). В результате этого происходило падение общего белка в клетках почти на 20% на фоне снижения времени его

функционирования на 17,9%. Наименьший эффект высокие температуры оказывали на белоксинтезирующую способность клеток селективного штамма полисциас LX-5.

Полученные данные не противоречат литературным данным, согласно которым тепловой шок практически у всех исследованных организмов от бактерий до человека вызывает изменение в активности генов, при этом синтезируются, главным образом, стрессовые белки и прекращается или сильно замедляется биосинтез всех остальных белков (Parsell D.A., Libdquik S., 1994; Ellis R.J., 1994; Dice J.F. et al, 1994; Panniers R., 1994). При помощи седиментационного анализа цитоплазматических экстрактов го зародышей пшеницы, было доказано, что ингибирование биосинтеза внутриклеточных белков при тепловом шоке обусловлено обратимой деградацией полирибосом (Айтхожин М.А. и соавт., 1989). Следует отметить, что температурной шок сопровождался усилением протеолитических процессов. Одним из возможных механизмов такого усиления связан с изменением проницаемости тонопласта и выходом из вакуоли клетки в цитозоль протеолитических ферментов. (Matile Р., 1982). Кроме того, известно, что ген, кодирующий убиквитин, входит в число генов БТШ, и его транскрипция активизируется при повышенной температуре окружающей среды (Gausing К., Barkardottir R., 1986; Vierstra R.D. et al., 1993).

Воздействие низких положительных температур приводило к более резкому падению биосинтеза внутриклеточного белка в культивируемых клетках исследуемых штаммов полисциас на фоне компенсаторного снижения скорости его распада (табл.1). Но и в этом случае при действии низких температур нарушения в метаболизме общего белка в клетках культуры исходного штамма были более значительны по сравнению с селективным штаммом. Анализ данных литературы позволяет сделать заключение о том, что гипотермия вызывает сильное замедление вплоть до остановки образования большинства белков (Карасев Г.С. и соавт., 1994; Arora R., Wisniewski М.Е., 1994; Ступникова И.В. и соавт., 1998; Бабенко JI.M., Мусатенко Л.И., 1998). Так, изучение биосинтеза белка с использованием радиоактивно меченой аминокислоты показало, что в условиях холодового закаливания растений огурца и пшеницы происходит новообразование белков, однако интенсивность их биосинтеза ниже, чем при физиологически нормальной температуре (Кригенко С.П. и соавт., 1986). В работах ряда авторов установлено, что охлаждение снижает репликативную и метаболическую активность хроматина, а также подавляет его способность поддерживать биосинтез РНК даже в присутствии РНК-полимеразы. Ингибирование транскрипции при снижении температуры, как полагают авторы, связано с уменьшением доступности матрицы ДНК для полимераз (Колесничепко А.В., Войников В.К., 2003).

Для более четкой интерпретации, полученных нами результатов по влиянию неблагоприятных температур на синтез и распад общего белка в

культивируемых растительных клетках, нами были проведены дополнительные исследования протеиновых спектров последних (рис. 7).

Установлено, что при воздействии высоких температур в клетках исходного штамма нами была идентифицирована дополнительная белковая зона с молекулярной массой около 19-20 кДа, а также увеличение доли белков с молекулярными массами примерно 25 и 43 кДа на фоне снижения доли белков с молекулярными массами 50, 67-70 кДа. При действии высоких температур на клетки селективного штамма в основном повышалась доля белков с молекулярными массами 43-70 кДа на фоне снижения доли белков с другими молекулярными массами. При воздействии низких положительных температур наблюдали значительное снижение доли белков с молекулярной массой около 90, 70-50 кДа (селективный штамм) и 90, 70-50, 40-45 и 25 кДа (исходный штамм).

1 2 3 0 4 5 6

Рисунок 7. Электрофорез внутриклеточных белков культуры ткани Polyscias filicifolia (4-6) и Polyscias filicifolia LX-5 (1-3) Примечание: 0 -белки маркеры;

1-контроль, 2-низкие положительные температуры, 3-температурный шок;

4-низкие положительные температуры, 5-контроль, 6-температурный шок.

Полученные нами данные, хотя и не позволяют сделать однозначного заключения о том, что все новые белковые зоны, отмеченные на электрофореграммах суммарной фракции белков клеток исследуемых штаммов полисциас, являются результатом синтеза белков de novo. Так как причиной появления новых полипептидов может быть не только их новообразование, но и спонтанный распад нативных внутриклеточных белков. Однако совокупность имеющихся в нашем распоряжении данных, полученных при изучении

параметров кругооборота внутриклеточного белка, а также многочисленные литературные данные, позволяют говорить о синтезе специфических белков в период адаптации растительных клеток на воздействие высоких температур и гипотермии.

Имеющиеся литературные данные позволяют считать, что при воздействии высоких и низких температур на организм в клетках последнего развивается окислительный стресс (Колесниченко A.B., Войников В.К.,2003). Исходя го этого, целесообразным являлось исследование каталитической активности ферментов-антиоксидантов при действии высоких и низких положительных температур.

Сутки роста Сутки роста:

Рисунок. 8. Влияние высоких температур на активность каталазы, СОД и пероксидазы в процессе культивирования ткани Ро1у,чс1а$ ПНыКШа

Рисунок 9. Влияние низких положительных температур на уровень активности каталазы, СОД и пероксидазы в процессе роста культуры Ро1у«с«а5 ПНнГоНа ЬХ-5

Как видно из рисунков 8, 9, при действии высоких температур наблюдали повышение активности каталазы на начальных сроках культивирования клеток и снижение ее активности в клетках более старшего возраста исходного штамма полисциас. Активность СОД и пероксидазы, наоборот, были снижены по сравнению с контролем в клетках культуры исходного штамма на конечных сроках культивирования. При воздействии низких температур на клетки штамма полисциас падение активности ферментов в культивируемых клетках

было более значительным по сравнению с действием высокотемпературного шока. В этом случае наблюдали резкое падение активности каталазы и СОД на фоне менее значительного снижения активности пероксидазы.

Полученные в нашей работе результаты не противоречат данным, полученным ранее другими авторами. Так, рядом авторов было установлено, что активность каталазы в растительных клетках снижается при воздействии, как высоких, так и низких температур. Анализируя полученные результаты и данные литературы, авторы пришли к заключению, что тепловой шок снижает активность каталазы за счет снижения синтеза молекул фермента de novo (Feierabend J„ Dehne S., 1996; Foyer C.H. et al., 1997; Dat J.F. et al., 1998). В работе H.B. Кирилловой на модели культур тканей нескольких штаммов раувольфии змеиной и разных штаммах двух видов женьшеня было установлено, что снижение активности ферментов-антиоксидантов является следствием резкого падения скоростей биосинтеза каталазы и СОД в результате теплового и низкотемпературног о воздействий (Кириллова Н.В., 2000).

В настоящее время антиоксидантная система, главным образом ферментативная, рассматривается как система, принимающая непосредственное участие в молекулярных механизмах неспсцифической резистентности организма к воздействию факторов внешней среды. (Соколовский В.В., 1988; Тарчевский И.А, 1993; Кириллова Н.В., 2000).

Воздействие на организм комплекса неблагоприятных факторов приводит к избыточному образованию кислородных радикалов и адаптация организма к такому воздействию потребует использования им всех резервов антиоксид антной защиты. Поэтому продолжительное и интенсивное образование кислородных радикалов приводит к усиленному расходованию эндогенных антиоксидантов и даже ингибированию антиоксидантных ферментов, таких как СОД, каталаза, пероксидаза и др. (Соколовский В.В., 1988, 1993; Колупаев Ю.Е. и соавт., 2005).

Особый интерес представляло изучение в данной работе содержания ДНК и общего пула РНК при воздействии различных температур. Было установлено (рис. 10), что воздействие теплового шока (3 часа при 45°С) приводило к снижению клеточной пролиферации (содержание ДНК падала на 21%, а общего пула РНК - на 31%). Продолжительное тепловое воздействие (24 часа при 45°С) сопровождалось более резким снижением концентрации ДНК на 30,6% и общего пула РНК - на 41%; при воздействии низких положительных температур (24 часа при 7°С) на клеточную культуру наблюдали еще более резкое снижение концентрации ДНК на 34,2% и общего пула РНК - на 48%.

В последние годы многими учеными высказывается мнение о том, что механизмы, связанные с повреждающим действием активных форм кислорода, эволюционно закреплены (Foyer C.H. et al., 1997, Лю Б.Н., 2001). Были найдены гены, имеющие отношения к регуляции редокс-состояния клетки, балансу

Рисунок 10. Влияние температурных шоков на пролиферацию клеток полисциас Ро1уБс1а5 ПНсМоНа

1,1а- контроль;

2,2а - тепловой шок (3 часа при 45°С); 3,3а - тепловой шок (24 часа при при 45°С);

4,4а - холодовой шок (24 часа при 7°С).

генераторов кислородных радикалов и антиоксидантных защитных механизмов. Предполагают, что в условиях окислительного сдвига в редокс-состоянии клетки, активированная клетка, даже вступившая в клеточный цикл, может не подвергаться пролиферации. (Новиков B.C. и соавт., 1996; Kamata Н., et al., 1999). По мнению ряда авторов, неповрежденная клетка реагирует даже на незначительные количества многих экзогенных продуктов деградации биомолекул, как на «сигнал тревоги», идущий от разрушенных или находящихся в состоянии сильного стресса соседних клеток. (Одум Ю., 1986; Северин E.G., 1991; Тарчевский И.А., 1993). Однако особенности деградации ДНК в растительных клетках при стрессе к настоящему времени практически не изучены. Также в доступной нам литературе практически отсутствуют сведения о возможной регудяторной роли, постоянно образующихся олигинуклеотидных фрагментов ДНК у растений при воздействии неблагоприятных факторов внешней среды. Гораздо больше работ посвящено изучению особенностей деградации различных классов РНК в ходе развития и старения клеток и тканей, а также при воздействии на растения различных неблагоприятных факторов Установлено, что стрессиндуцированные мРНК отличаются относительно малым временем функционирования. (Neumann D. et al., 1989; Tan B.C., Liang H.G., 1991; Тарчевский И.А., 1993). Кроме того, показано, что олигонуклеотидные антисмысловые РНК могут вмешиваться в транскрипцию за счет образования трехспиральных блоков на ДНК, за счет гибридизации с одной из нитей ДНК, за счет гибридизации с молекулой РНК, находящейся в процессе элонгации, а также за счет создания препятствия скольжения рибосомы вдоль молекулы мРНК. (Helene С., Toulme J.J., 1990).

loo

908070

¡г и

® 50

I 40'

§ 30 о i <-> 20 j

10f

0 *

■i

I ;ti

I -

РНК

1 7Ё»

la 2з 3a 4a ДНК

В настоящее время известно, что абиотические стрессы, в том числе и экстремальные температуры, в живых клетках, приводят к повышенной генерации активных форм кислорода, особенно перекиси водорода, что, является частью сигнального каскада, ведущего к развитию антистрессовых защитных механизмов в этих клетках. (Bowler С. et al., 1992). Прямое доказательство взаимосвязи между окислительным и тепловым стрессом было получено при использовании комбинированного светового и теплового шоков (Bowler С. et al., 1992; Курганов JI.H. и соавт., 1997). В ряде работ было также установлено, что уже через несколько минут после воздействия низких температур в темноте на проростки и котиледоны различных растений (маиса, кукурузы, пшеницы и др.), уровень перекиси водорода в клетках повышался в 3 и более раз (Prasad Т.К. et al., 1994).

В связи с этим в данной работе были поставлены эксперименты по изучению влияния активных форм кислорода на содержание/биосинтез ДНК в клетках культуры ткани полисциас.

П*р«кись водорода, мкМолы

Рисунок 11. Влияние перекиси водорода на пролиферацию клеток Polyscias filicifolia

160-г

140-К

120 ' 100 ' 8060 j 40 f:

20 }"

0 2 4 8 10 12 16

Концентрация феназинмета-сульфата, мкМоль

Рисунок 12.Влияние феназин

мсгасульфага на пролиферацию клеток Polyscias filicifolia

Исследовали влияние различных концентраций перекиси водорода и феназин метасульфата (генератор супероксидных радикалов) на пролиферацию культивируемых in vitro растительных клеток. Как видно из представленных данных (рис. 11, 12), при культивировании клеток полисциас в среде,

содержащей перекись водорода в концентрации 5 мкМоль, содержание ДНК в клетках повышалось на 22%. При концентрации перекиси водорода в 10 мкМоль содержание ДНК в клетках оставалось на уровне контрольных значений. Дальнейшее увеличение концентрации перекиси водорода до 20 - 500 мкМоль приводило к снижению пролиферативной активности клеток на 1820%. Присутствие в среде культивирования ткани полисциас феназин метасульфата в концентрации 2, 4 и 8 мкМоль увеличивало пролиферацию клеток in vitro, соответственно, на 18%, 20% и 58%. При повышении концентрации феназин метасульфата, наоборот, пролиферативная активность клеток снижалась. Так, содержание ДНК в клетках при концентрации препарата 10 мкМоль не отличалась от нормы, а при концентрациях 12-16 мкМоль была ниже контрольных значений на 45%.

Определение активности ферментов-антиоксидантов выявило следующую картину: внесение перекиси водорода приводило к достоверному увеличению активности СОД на фоне снижения уровня активности каталазы (рис. 13); внесение феназин метасульфата в низких концентрация повышало активность СОД (10 - 12 мкМоль) и каталазы (6-8 мкМоль). Присутствие высоких концентраций этого соединения в среде культивирования, наоборот, приводили к падению уровня активности, как СОД, так и в большей степени каталазы (рис. 14).

(Г

о X

есод

Перекись водорода,

МКМОЛЬ

Рисунок 13. Влияние различных концентраций Н2Ог на активность СОД и каталазы

0 6 8 10 12 14 16 Фенизин метасульфат, мкмоль

Рисунок 14. Влияние различных концентраций феназин метасульфата на активность СОД и каталазы

Долгое время в биохимии доминировало мнение, что активные формы кислорода действуют лишь как разрушители и не имеют никаких регуляторных функций в организме. Однако в настоящее время физиологическое значение сдвига тканевого баланса антиоксидантов и прооксидантов в сторону последних является у биохимиков предметом острой дискуссии. Считают, что активные формы кислорода играют значительную роль в обеспечении нормальной физиологической активности клеток, участвуют в синтезе ряда биологически активных метаболитов, являются активаторами мнгогенеза, клеточной пролиферации, дифференциации и эмбриогенеза. (Stadtman Е. R., 1990; Осипов А.Н. и соавт., 1990; Дубинина Е.Е., Шугалей И.В., 1993; Burdon R.N., 1994; Пескин А.В. и соавт., 1997).

Таким образом, активные формы кислорода в низких физиологических концентрациях могут являться важными сигнальными молекулами в регуляции различных клеточных процессов, что мы и наблюдали при внесении в среду культивирования перекиси водорода (5-10 мкМоль) и феназин метасульфата (28 мкМоль).

При повышении концентрации перекиси водорода и феназин метасульфата наблюдали падение клеточной пролиферации in vitro на фоне резкого снижения активности каталазы и менее значительного снижения по сравнению с контрольными значениями активности СОД. Последнее, как известно, свидетельствует о развитии в культивируемых клетках окислительного стресса Избыточное количество активных радикалов кислорода может легко взаимодействовать с различными биомолекулами и нарушать их структуру и функции, что будет приводить к возрастанию окислительного стресса в клетках. И, как следствие, вызывать множественные первичные нарушения в живых системах, в том числе и нарушение структуры ДНК. Известно также, что при окислительном повреждении ДНК происходит остановка деления клеток (Пескин А.В., 1997). Таким образом, развитие окислительного стресса на фоне истощения антиоксидантной системы защиты клеток может приводить к временному прекращению клеточной пролиферации. (Burdon R.H. et al., 1990; Ono К, et al., 2000; Kamata H., et al., 1999;KimB.Y. et al., 2001).

ВЫВОДЫ

1. Добавление в питательную среду германий^органического соединения увеличивало прирост сырой биомассы каллусной культуры полисциас на 1015%, а суховоздушной - на 20-25%; содержание ДНК в 1,3-1,5 раза, РНК в 1,82,5 раза; скорость обновления общего белка на 10%.

фазными изменениями содержания белка, нуклеиновых кислот и степенью окислительной модификации внутриклеточного белка.

3. Установлено, что в 1 г клеточной и суховоздушной биомассы содержится, соответственно, 0,00005 и 0,0015 г германия. Максимальное содержание германия в ткани селективного штамма отмечено в водорастворимой фракции клеток (54,7%) и более 30% общего количества данного элемента в шроте.

4. При воздействии высоких и низких положительных температур нарушения в метаболизме внутриклеточного белка (снижение скорости биосинтеза общего белка от 3%-тепловой до 57%-низкотемпературный шок) и состоянии антиоксидантного статуса в клетках культуры исходного штамма были более значительны по сравнению с селективным штаммом.

5. Установлено, что при воздействии теплового шока (3 часа при 45°С) содержание нуклеиновых кислот в клетках культуры полисциас достоверно снижалось (ДНК на 21%, общий пул РНК - на 31%). При увеличении времени воздействия температуры на растительные клетки (24 часа при 45°С) понижение концентрации ДНК и РНК были более значительные, соответственно, на 30,6 и 41%. Низкие положительные температуры (24 часа при 7°С) вызывали еще более резкое снижение концентрации ДНК на 34,2% и общего пула РНК - на 48%.

6. Присутствие перекиси водорода и феназин метасульфата в среде культивирования биомассы полисциас приводило к дозозависимому и разнонаправленному воздействию на клеточную пролиферацию. Низкие концентрации этих соединений увеличивали (от 18 до 58%), а высокие концентрации снижали (от 18 до 45%) пролиферативную активность культивируемых клеток.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Изучение некоторых биохимических показателей Polyscias filicifolia Bailey семейства Аралиевые Н IX Международный съезд «Актульные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения». Фитофарм: Санкт- Петербург, 2005. С. 28-31. (в соавторстве).

2. Изучение продуктивности и стабильности культуры ткани полисциас -. Polyscias filicifolia (Moore ex Foumter) Bailey (сем. Araliaceae) // Сборник научн. трудов конф. «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции», Пятигорск: Пятигорская государственная фармацевтическая академия, 2005. Выпуск 60. С. 53-56. (в соавторстве).

3. Обмен внутриклеточного белка в культуре ткани полисциас Polyscias filicifolia (Moore ex Fournter) Bailey (сем. Araliaceae), выращенной на стандартной и обогащенной германийорганическим соединением средах // Сборник научных трудов Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 60-летию создания технологического факультета СПХФА

(ЛХФИ) «Подготовка кадров для фармацевтической промышленности». СПб.: СПХФА, 2005. С. 95-96.

4. Некоторые биохимические показатели культуры ткани полисциас POLYSCIAS FILICIFOLLA (Moore ex Foumter) BALLEY (сем. ARALIACEAE), выращенной на стандартной и обогащенной германийорганическим соединением среде // Растительные ресурсы. 2006. Т. 42. Вып. 3. С. 101-112

(в соавторстве)

5. Исследование элементарного состава биомассы штаммов полисциас Poliscias filicifolia (Voore ex Fourter) Bailey (сем. Araliaceae) // Материалы IX Международной конференции молодых ботаников в Санкт-Петербурге: СПб., 2006. С. 201.

6. Фотохимический анализ культуры ткани Полисциас Polyscias filicifolia (Moore ex Fournter) Bailey ' (сем. Araliaceae)// Сборник трудов 61-ой региональной конференции по фармации и фармакологии. Пятигорск: Пятигорская государственная фармацевтическая академия, 2006. С. 54-55. (в соавторстве).

Юля Заметок-

Юля Заметок

На правах рукописи

Спасенков Александр Игоревич

БЕЛОКСИНТЕТИЧЕСКАЯ СПОСОБНОСТЬ И СТАБИЛЬНОСТЬ ДВУХ ШТАММОВ КУЛЬТУРЫ ТКАНИ РОЬУвСХАЭ ПЫСТГОЫА ПРИ СТРЕССЕ

Специальность 03.00.04 — биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени , кандидата биологических наук

Печать Н.В. Андриановой

Подписано к печати 16.05.2006. Формат 60 х 90/16. Бумага тип. Печать ризограф.

_Гарнитура «Тайме». Печ. л.1,5. Тираж 100 экз. Заказ 611_

Санкт-Петербург 2006

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Спасенков, Александр Игоревич

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Перспективы использования культуры тканей растений в биохимии и биотехнологии

1.2. Введение в культуру тканей Polyscias filicifolia

1.3. Германийорганические соединения: биологическая активность, применение в медицине

1.4. Метаболизм белка в растениях

1.4.1. Обмен белка в растительных клетках

1.4.2. Кругооборот белка у растений при температурном воздействии 32 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объект исследования и метод культивирования ткани

2.2. Выделение цитозольной фракции из культивируемых клеток

2.3. Энзиматические методы 45 2.3.1 Определение активности каталазы

2.3.2. Определение активности пероксидазы

2.3.3. Определение активности супероксиддисмутазы (СОД)

2.4. Определение германия в клетках полисциас LX

2.5. Количественный анализ нуклеиновых кислот

2.6. Определение содержания карбонильных групп в белках

2.7. Оценка степени фрагментации окисленных белков

2.8. Определение железо-зависимого образования битирозина

2.9. Электрофоретические методы

2.9.1. Диск-электрофорез в ПААГ

2.9.2. Электрофорез в 10 % ПААГ с DS-Na

2.10. Радиоизотопные методы 52 2.10.1.Определение параметров обмена общего белка в клетках культуры ткани, выращенной на стандартной и обогащенной германийорганическим соединением средах 52 2.10.2. Изучение влияния температурного шока на обмен общего белка

2.11. Аналитические методы

2.12. Статистическая обработка результатов эксперимента

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ

3.1. Обмен внутриклеточного белка в культурах ткани полисциас Polyscias fllicifolia и Polyscias fllicifolia LX-5, выращенных в стандартных условиях культивирования

3.1.1. Динамика прироста биомассы и общего белка в культуре ткани Polyscias fllicifolia и Polyscias fllicifolia LX

3.1.2. Параметры кругооборота внутриклеточного белка в культуре ткани Polyscias fllicifolia и Polyscias fllicifolia LX

3.1.3.Количественное содержание нуклеиновых кислот в культуре ткани Polyscias fllicifolia и Polyscias fllicifolia LX

3.1.4. Оценка антиоксидантного и прооксидантного статуса культуры ткани Polyscias fllicifolia и Polyscias fllicifolia LX

3.1.5. Оценка протеинового спектра внутриклеточных белков в клетках культур ткани Polyscias fllicifolia и Polyscias fllicifolia LX

3.1.6. Фотохимический анализ культуры ткани Полисциас

3.2. Биохимическая оценка метаболизма общего белка в культуры ткани полисциас Polyscias fllicifolia и Polyscias fllicifolia LX-5 в условиях высоко- и низкотемпературного шоков

3.2.1. Динамика содержания общего белка и параметры кругооборота в культуре ткани исходного и селективного штаммов полисциас при воздействии теплового шока и низких температур

3.2.2. Исследование протеиновых спектров внутриклеточных белков в клетках культуры ткани полисциас при воздействии теплового шока и низких положительных температур

3.2.3. Антиоксидантный статус культуры ткани полисциас Polyscias filicifolia Bailey и Polyscias filicifolia LX-5 Bailey в условиях темппературного шока и воздействии низких положительных температур

3.2.4. Пролиферативная активность культивируемых клеток полисциас при высоко- и низко температурных воздействиях

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Белоксинтетическая способность и стабильность двух штаммов культуры ткани Polyscias filicifolia при стрессе"

Актуальность темы. Растения вида Poliscias folicifolia (полисциас папоротниколистный) произрастают в тропических странах, где издавна используются как ценное лекарственное сырье. Штамм тропического растения Polyscias filicifolia был введен от интактного оранжерейного растения в культуру изолированных тканей in vitro в Санкт-Петербургской Государственной химико-фармацевтической академии в 1972 году (Слепян Л.И. и соавт., 1975). Полученный в СПХФА штамм полисциас Polyscias filicifolia был зарегистрирован во ВСККК-ВР под номером 24, как обладающий адапгогенным и иммуномодулирующим эффектами (Михайлова Н.В., 1981) .Дальнейшие исследования показали, что фармакологические препараты, полученные из биомассы данной культуры ткани, обладают высокой биологической активностью, в частности, тонизирующей, иммуномодулирующей и стресспротекторной. (Трилис Я.Г. и соавт., 1995; Рябков А.Н. и соавт., 2004).

В последние годы исследования германийорганических соединений, обладающих широким спектром биологической активности, являются одним из перспективных направлений в современной химии элементорганических соединений. Известно, что германийорганические комплексы характеризуются низкой токсичностью и высокой биологической активностью. Эти соединения не только повышают эффективность применяемых лекарственных средств, но и снижают токсичность или побочные эффекты препаратов (ГарТ.К., Миронов В.Ф.,1982). Германийорганические соединения оказывают специфическое действие на сердечно-сосудистую и центральную нервную системы, вызывают индукцию интерферона, а также обладают иммуномодулирующим, противоопухолевым и антивирусным действиями (Хромова Н.Ю., Гар Т.К., Миронов В.Ф., 1985).

В настоящее время культуры растительных тканей становятся объектом промышленной биотехнологии для получения биологически активных соединений для медицины, косметики, пищевой и ряда других промышленностей. В то же время, для более широкого внедрения в промышленность целевых продуктов на основе культур растительных тканей создаваемые биотехнологические производства должны быть способными выдерживать конкуренцию с альтернативными системами получения данных продуктов. Однако перевод клеток растений в культуру может в значительной степени менять морфологию, биохимические особенности, а также генотип клетки, поэтому многие аспекты ее существования и развития требуют детального самостоятельного изучения. Таким образом, основные трудности, которые тормозят внедрение растительных культур в промышленное производство, связаны с недостаточным знанием как общей картины изменений, происходящих в культивируемых in vitro клетках, так и контрольных механизмов биосинтеза вторичных продуктов растительного происхождения и рядом других проблем (Бутенко Р.Г., 1991; Бурьянов Я.И., 1999). Поэтому в последние годы во всем мире ведутся интенсивные биохимические исследования на модели культур растительных клеток, которые открывают большие перспективы в изучении молекулярных механизмов метаболических процессов, протекающих в клетке, с целью их практического применения (Носов A.M., 1999). В частности, культуры растительных тканей используются в настоящее время в качестве адекватной модели для изучения на клеточном уровне адаптации растений к различным неблагоприятным воздействиям окружающей среды.

Цель и задачи исследования. Основной целью диссертационной работы является сравнительное исследование основных биохимических и фотохимических показателей в процессе культивирования клеток исходного и селективного штаммов Polyscias filicifilia (Moore ex Fournter) Bailey (сем. Araliaceae). Изучение влияния температурного шока и низких температур на белоксинтетическую способность и стабильность культур клеток растения полисциас.

В соответствии с целью работы непосредственными задачами работы являлись:

1. Характеристика динамики прироста биомассы, содержания ДНК и РНК, а также белоксинтезирующей способности клеток исходного полисциас и селективного полисциас LX-5 штаммов

2. Изучение динамики уровня активности ферментов-антиоксидантов (пероксидазы, каталазы и СОД) в процессе роста культивируемых растительных клеток двух штаммов полисциас

3. Определение основных фотохимических показателей биомассы клеток исходного и селективного штаммов полисциас

4. Оценка влияния различных температур на пролиферативную активность, белоксинтезирующую способность и состояние трех исследуемых ферментов-антиоксидантов в культурах растительных клеток

5. Исследование элементного состава и внутриклеточного распределения германия в культуре селективного штамма полисциас

Научная новнзна работы. Основным достижением данной работы представляется проведенное впервые в сравнительном аспекте комплексное исследование основных биохимических и фотохимических показателей в процессе выращивания исходного и селективного штаммов тропического растения полисциас.

Установлена избирательная чувствительность важнейших ферментов антиоксидантной системы - СОД, каталазы и пероксидазы - к воздействию различных температур, что проявляется в усилении или ослаблении уровня их каталитической активности. Отмеченный колебательный характер изменения активности трех основных ферментов антиоксидантной системы коррелировал с ростовыми процессами (накопление биомассы и внутриклеточного белка) и с изменением митотической активности (по содержанию ДНК).

В диссертационной работе впервые изучена динамика содержания ДНК и РНК в клетках двух штаммов культуры полисциас в процессе их культивирования. Установлено, что характер изменения содержания РНК сходен с таковым для ДНК. Впервые были получены новые данные о пролиферативной активности культивируемых клеток полисциас при высоко- и низкотемпературных воздействиях, а также изучена пролиферативная активность клеток in vitro при воздействии активных форм кислорода.

При оценке влияния германийорганических соединений на метаболизм белков было установлено, что выращивание культуры полисциас на селективных средах не только увеличивает содержание нуклеиновых кислот и внутриклеточного белка, но и повышает в исследуемых клетках уровень активности ферментов-антиоксидантов по сравнению с исходным штаммом.

Кроме того, в работе был проведен фитохимический анализ содержания основных биологически активных соединений (суммы гликозидов, углеводов и микроэлементов), а также изучено внутриклеточное распределение германия в клетках селективного штамма. Установлено, что максимальное содержание германия (до 54-55%) локализовано в водорастворимой фракции культивируемых клеток, а примерно 30% общего количества данного элемента остается в шроте, после извлечения липофильных веществ и суммы гликозидов.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные в работе данные расширяют и углубляют наши представления о биохимическом состоянии переведенных в культуру растительных клеток. Полученные результаты дополняют уже известную информацию о биологической роли германия, в частности, о возможном участии германийорганических соединешш в биологических процессах в растительной клетке.

Работа носит экспериментально-теоретический характер. Однако полученные результаты характеризуются практической направленностью для биотехнологии и медицины. В частности, в работе было установлено, что добавление в питательную среду германийорганического соединения, оказывало положительное влияние на основные ростовые и биохимические показатели культуры ткани полисциас. Учитывая высокую биологическую активность германийорганических соединений (Хромова Н.Ю., 1983), можно полагать, что препараты (настойки, экстракты и т.п.) из биомассы модифицированного штамма полисциас будут иметь более широкий спектр фармакологического действия по сравнению с исходной культурой полисциас, что открывает большие перспективы в использовании германийорганических соединений в биотехнологии растительных тканей.

Основные положения, выносимые на защиту.

2. Радиоизотопные исследования скорости биосинтеза и времени функционирования общего белка, а также биохимические исследования активности ферментов-антиоксидантов (СОД, каталазы и пероксидазы) в растительных клетках, выращенных в стандартных условиях и при воздействии неблагоприятных температур.

3. Изучение пролиферативной активности культивируемых клеток полисциас при высоко- и низкотемпературных воздействиях, а также при воздействии in vitro активных форм кислорода.

Апробация работы. Материалы работы были апробированы на 60-ой региональной конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2005), IX Международном съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (Санкт - Петербург, 2005), Юбилейной конференции «Подготовка кадров для фармацевтической промышленности » (Санкт - Петербург, 2005), 61-ой региональной конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2006), IX Международной конференции молодых ботаников (Санкт -Петербург, 2006).

Публи1сацпи. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 128 страницах, содержит 5 таблиц и 25 рисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы, которая включает 201 наименование на русском и английском языках.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Спасенков, Александр Игоревич

ВЫВОДЫ

1. Добавление в питательную среду германийорганического соединения увеличивало прирост сырой биомассы каллусной культуры полисциас на 1015%, а суховоздушной - на 20-25%; содержание ДНК в 1,3-1,5 раза, РНК в 1,8-2,5 раза; скорость обновления общего белка на 10%.

2. При переводе культуры ткани полисциас на селективную среду, активность ферментов в клетках каллуса увеличивалась в среднем на 11% (СОД), 18,6% (пероксидаза) и 26,5% (каталаза) и, в основном, коррелировала с фазными изменениями содержания бежа, нуклеиновых кислот и степенью окислительной модификации внутриклеточного белка.

4. При воздействии высоких и низких положительных температур нарушения в метаболизме внутриклеточного бежа (снижение скорости биосинтеза общего бежа от 3%-тепловой до 57%-низкотемпературный шок) и состоянии антиоксидантного статуса в клетках культуры исходного штамма были более значительны по сравнению с селективным штаммом.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Спасенков, Александр Игоревич, Санкт-Петербург

1. Аверьянов А. А. Активные формы кислорода и иммунитет растений // Успехи совр. биол. -1991. Т.111, вып. 5. С. 722-737.

2. Айтхожин М.А., Бельгибаев С.А., Токарев А.А. Регуляция синтеза стрессовых белков на ранних стадиях прорастания семян // Стрессовые белки растений. Новосибирск: Наука. Сибирское отд., 1989. - С.20-43.

3. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте Л., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки. М.: Мир, 1994. Т. 2. - С. 93-253.

4. Антан И.С., Слепян Л.И., Минина С.А., Шиков А.Н. Разработка метода количественного спектрофотометрического определения основных действующих веществ в препаратах селективного штамма женьшеня //Хим.-фармац. журн. 1995.Т. 29, вып.6. - С.57-61.

5. Бабенко Л.М., Мусатенко Л.И. Белковый синтез при нарушении покоя в семенах клена татарского // Физиология растений. 1998. Т.45., №1. -С. 112-116.

6. Беспалов В.Г., Лимаренко А.Ю., Давыдов В.В. и др. Антиканцерогенные и противоопухолевые свойства препаратов из биомассы Panax ginseng С.А.Меу и его германий-селективных штаммов // Растительные ресурсы. 1993. Т. 29, вып. 4. - С. 1-13.

7. Блейделис Я.Я., Кемме А.А. Кристаллографические параметры 1-органилгерматранов // Химия гетероциклических соединений. 1970. № 3. -С. 332-334.

8. Боровский Г.Б., Ступникова И.В. Антипина А.И., Войников В.К. Накопление дегидринов и Rab-белков в проростках пшеницы при низкотемпературной адаптации // Физиология растений. 2002. Т. 49, № 2. -С.257-263.

9. Браун Г.Н. Механизм белкового синтеза в связи с морозостойкостью растений // Холодостойкость растений. М.: Колос, 1983. -С. 124-131.

10. Браун Г.Н., Моженок Т.П. Неспецифический адаптационный синдром клеточной системы. Л.: Наука. Лен.отд., 1987. - С. 113-127.

11. И. Бурьянов Я.И. Успехи и перспективы генно-инженерной биотехнологии растений // Физиол. растений. 1999. Т. 46, № 6. - С. 930-944.

12. Бутенко Р.Г. Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М.: Наука, 1991. - 280 с.

13. Бутенко Р.Г. Клеточные технологии для получения экономически важных веществ растительного происхождения // Культура клеток растений и биотехнология. М.: Наука, 1986. - С. 3-20.

14. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Наука, 1964. - 272 с.

15. Войников В.К., Колесниченко А.В., Побежимова Т.П., Варакина Н.Н. Первая и шестая хромосомы D-генома озимой мягкой пшеницы контролируют экспрессию белка холодового шока с молекулярной массой 310 кД // Физиология растений. 1998. Т. 45, № 5. - С. 688-692.

16. Войников В.К., Боровский Г.Б. Роль стрессовых бежов в клетках при гипертермии // Успехи совр. биологии. 1994. Т. 114., вып. 1. - С. 85-95.

17. Воллосович А.Г. Культура ткани раувольфии как продуцент противоаритмических ажалоидов: Автореф. дис. докт. биол. наук. С-Пб., 1992.-38 с.

18. Воллосович Н.Е., Воллосович А.Г., Ковалева Т.А., Бутенко Р.Г. Штаммы культуры ткани Rauwolfia serpentina и их продуктивность // Раст. ресурсы. 1976. Т. 12, №4. - с. 578-583.9 20. Воронков М.Г., Дьяков В.И. Силатраны. Новосибирск: Наука,1978.-208 с.

19. Воронков М.Г., Мирсков Р.Г. Четвертое рождение германия // Химия и жизнь. 1982. № 3. - С. 54-56

20. Гар Т.К., Миронов В.Ф. Биологическая активность соединений германия. Обзорн. инф.(серия Элементоорганические соединения и их применение) ГНИИХТЭОС. М.: НИИТЭХИМ, 1982. - 26 с.

21. Гар Т.К., Хромова Н.Ю., Сонина Н.В., Никитин B.C., Полякова Н.В., Миронов В.Ф. Синтез, химические свойства и ИК-спектры Ge-замещенных герматранов // Журнал общая химия. 1979. Т. 49, № 7. - С. 1516-1522.

22. Гималов Ф.Р., Баймиев А.Х., Матниязов Р.Т., Чемерис А.В.,

23. Ф Вахитов В.А. Начальные этапы низкотемпературной индукции экспрессии гена бежа холодового шока капусты // Биохимия. 2004. Т. 69, вып. 5. - С. 706-711.

24. Гималов Ф.Р., Вахитов В.А., Черемис А.В. Индукция белков холодового шока у пшеницы // Генетические механизмы устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды: Тез. докл. Всесоюз. науч. конф., Иркутск. 8-12 июля, 1991. Новосибирск, 1991. - С. 90.

25. Гусев Н.Б., Букач О.В., Марстон С.Б. Структура, свойства и возможная физиологическая роль малого бежа теплового шока с молекулярной массой 20 кДа. // Биохимия. 2005. Т. 70, вып. 6. С. - 762-772.

26. Дубинина Е.Е., Гавровская С.В., Кузмшшч Е.В., Леонова Н.В.

27. Окислительная модификация бежов: окисление триптофана и образованиебитирозина в очищенных бежах с использованием системы Фентона // Биохимия. 2002. Т. 67, вып. 3. - С. 413-421.

28. Емец А.И., Блюм Я.Б. Устойчивость растений к гербецидам с антимикротрубочковым механимзом действия: от природных мутантов до переноски генов // Физиол. растений. 1999. Т.46, № 6. - С. 899-907.

29. Жеребцов Ф.Ф., Мещерякова Н.И., Чуниковская В.Н., Свешниковащ Т.В. Использование методов биотехнологии для оздоровления и• интенсивного размножения розы эфиромаслячной: Тез. докл. обл. научн.-практ. конф. Симферополь, 1990. - С. 99-100.

30. Журавлев Ю.Н., Коляда А.С. Araliaceae: женьшень и другие. -Владивосток: Дальнаука, 1996. 279 с.

31. Захарова И.Я., Косенко Л.В. Методы изучения микробных полисахаридов. Киев: Наукова думка, 1982. - С.36-37

32. Карасев Г.С., Красавцев О.А., Трунова Т.И. Роль белков в адаптации растений к морозу // 3 съезд Всерос. общества физиологоврастений (24-29 июня, 1993 г., Санкт-Петербург): Тез. докл. 6.СП6,1993. С. 601.

33. Карасев Г.С., Нарлева Г.И., Ященко И.А., Кузнецов В.В., Трунова Т.И. Динамика синтеза белков при адаптации озимой пшеницы к морозу // Прикл. биохим. и микробиология. 1994. Т.30., №4-5. - С.667-671.

34. Карлов С.С. Функциональнозамещенные герматраны и азагерматраны. Синтез, строение и реакционная способность.: Автореф. дис. . канд. хим. наук. М., 2000. 26 с.

35. Кириллова Н.В. Изменение активности супероксиддисмутазы в каллусной культуре Rauwolfia serpentina Benth., выращенной в стандартных условиях и при температурном шоке // Прикладная биохимия и микробиология. 2004. Т. 40, №1. - С. 89-93.

36. Кириллова Н.В. Ферменты антиоксидантной системы культивируемых растительных клеток // Авт. . докт. биол. наук. СПб.: СПХФА, 2000.-30 с.

37. Колесниченко А.В., Войников В.К. Белки низкотемпературного стресса. Иркутск: Арт-Пресс, 2003. - 196 с.

38. Колесниченко А.В., Таусон Е.Л., Зыкова В.В., .Клименко Е.С., Грабельных О.И., Побежимова Т.П. Природа лиганда, связанного с разобщающим белком БХШ 310 // Физиология растений. 2005. Т.52, № 2. -С.216-220.

39. Колесникова М.П., Тузова М.Н., Кудиева О.Т. и др. Механизмы иммуномодулирующего эффекта германийорганических соединений // Иммунология. 1995. № 1. - С.27-31.

40. Колоша О.И., Костенко И.И. Морозостойкость озимых зерновых культур в связи с водным режимом и ходом метаболических процессов // Устойчивость растений к неблагоприятным температурным условиям среды. Киев: Наук, думка, 1976. - С.5-19.

41. Колупаев Ю.Е., Акинина Г.Е., Мокроусов А.В. Индукция теплоустойчивости колеоптилей пшеницы ионами кальция и ее связь с окислительным стрессом // Физиология растений. 2005. Т.52, №2. - С.227-232.

42. Комов В.П., Шмелев В.К. О некоторых особенностях кинетики ферментативных реакций на примере каталазы // Биохимия 1975. Т.40, вып 4.-С 21-24.

43. Комов В.П., Кириллова Н.В., Алексейчук Н.В. Выделенние и очистка альдолазы из культуры ткани Rauwolfia serpentina Benth. // Биохимия. 1986. Т. 51, вып.7. - С. 1180-1185.

44. Критенко С.П., Титов А.Ф., Акимова Т.В. Влияние ингибиторов биосинтеза белка на физиологические процессы у растений при низких и высоких закаливающих температурах // Термоадаптация и продуктивность растений. Петрозаводск, 1986. - С.45-58.

45. Курганов JI.H., Веселов А.П., Гончарова Т.А., Синицына Ю.В. Перекисное окисление липидов и антиоксидантная система защиты в хлоропластах гороха при тепловом шоке // Физиология растений. -1997. Т.44, №5. С.725-730.

46. Лукевиц Э.Я., Гар Т.К., Игнатович Л.М., Миронов В.Ф. -Биологическая активность соединений германия. Рига: Зинатне, 1990. -191с.

47. Лукевиц Э.Я., Германе С.К., Зидермане А.А.и др. Синтез,нейротропная и противоопухолевая активность ряда герматранов,гермсесквиоксанов и их органических аналогов // Химико-фармацевтический журнал. 1984. Т. 18, № 2. - С. 154-159.

48. Лю Б.И. Кислородно-перекисная концепция апоптоза и возможные варианты его механизма // Успехи совр. биологии. 2001. Т. 121, №5. -С.488-501.

49. Максютова Н.Н. Белковый обмен растений при стрессе // Автореф. дис.докт. биол. наук. М. 1998. 38 с.

50. Методы биохимического исследования растений. / Под ред. А.И. Ермакова Л., 1972. - С.325-327

51. Михайлова Н.В. Полисциас папоротниколистный Polyscias fllicifolia (Moore ex Fournier) Bailey в культуре in vitro: Автореф. дис. канд. фарм. наук Л., 1981. - 26 с.

52. Носов A.M., Пауков В.Н., Бутенко Р.Г. Физиологическая регуляция синтеза стероидов культурой клеток диоскореи дельтовидной -Культура клеток растений и биотехнология. М.:, 1986. С. 76-79.

53. Одум Ю. Экология. -М.: Мир, 1986. Т.1.-328 с.

54. ОсиповаЕ.А., Цибулько Н.С., ШаминаЗ.Б. Вариабельность клеточных клонов // Физиол. растений. 1999 Т. 6, № 6. - С. 908-914.

55. Пескин А.В. Взаимодействие активного кислорода с ДНК // Биохимия. -1997. Т.62, вып.12. С.1571-1578.

56. Писецкая Н.Ф. К вопросу о подборе питальной среды длякультуры ткани женьшеня // Раст. ресурсы. 1970. Т.6, вып.4. - С. 516-522.

57. Раймерс Ф.Э., Хавкин Э.Е. Новообразование белков в растущей клетке // Физиология растений. 1970.Т. 17, вып. 2. - С. 337* 347.

58. Рябков А.Н., Хвойницкая Л.Г. Экспериментальная оценка стресспротективного эффекта препарата из биомассы полисциаса папоротниколистного в условиях мерказолиловой интоксикащш:Тез. докл.

59. Российского национального конгресса «Человек и лекарство» (Москва, 1923 апреля 2004г.). -М, 2004. С. 623-624.

60. Северин Е.С. Избирательная регуляция клеточного метаболизма. -М.: Наука, 1991.-63 с.

61. Скулачев В.П. Апоптоз: запрограммированная смерть организма // Биохимия. 1999. Т.64, вып. 12. - С. 1679-1688.

62. Слепян Л.И., Арнаутов Н.И., Грушвицкий И.В. Культура тканей некоторых видов рода Polyscias filicifolia J. R. et G. Frost (Araliaceae) // Раст. ресурсы. 1975. Т. 11, вып. 2. - С. 198-204.

63. Слепян Л.И., Минина С. А., Старцев Ф.Н. и др.// Способ культивирования тканей и клеток растений-продуцентов БАВ // АС №1531488 от 11.04.88.

64. Слепян Л.И. Женьшень, адаптогены и биотехнология для превентивной медицины // From research to prevention managing occupational and environmental health Hazards: Тез. докл. Междунар. конф. Хельсинки, 1995. - 85 с.

65. Слепян Л.И. Женьшень, адаптогены и 21 век: от штаммов к конечным продуктам // Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда: Тез. докл. 12 Междунар.конф. М., 1997. - С. 507

66. Смолов А.П. Функционирование растительной клетки в культуре in vitro (физиологичекие исследования) // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1990.• № 6. С. 805-820.

67. Соколовский В.В. Тиоловые антиоксиданты в молекулярных механизмах неспецифических реакций организма на экстремальные воздействия // Вопр.мед.химии. 1988. №6. - С.2-11.

68. Соколовский В.В. Антиоксиданты в профилактике и терапии заболеваний // Международные медицинские обзоры. 1993. №1. - С.11-14.

69. Ступникова И.В., Боровский Г.Б., Войников В.К. Накопление термостабильных белков в проростках озимой пшеницы при гипотермии //

70. Физиология растений. 1998. Т.45., №6. - С, 859-864.

71. Тарчевский И. А. Катаболизм и стресс у растений. М.: Наука, 1993.-80 с.

72. Трилис Я.Г., Давыдов В.В. Новые сведения о механизмах адаптогенного действия препаратов культуры тканей Panax Ginseng С.А. Меу и Polyscias filicifolia Bailey (Araliaceae) // Раст.ресурсы. 1995. вып.З. - С. 1935.

73. Турпаев К.Т. Активные формы кислорода и регуляция экспрессии генов // Биохимия. 2002. Т.67., №3. - С.339-352.

74. Тэрумаккуки К.К. Способ культивирования женьшеня на питательной среде, содержащей минеральное соединение германия. С. А. № 54-67598,1972 (Япония) //РЖХ. 1973.Т. 5, № 10. - 1518п.

75. Фармакопейная статья предприятия // Биомасса «Панаксел^), Biomassa "Panaxel11", ФСП42,2000.

76. Фельдман Л.Н., Денько Е.И., Каменцева И.Е., Константинова М.Ф. Теплоустойчивость клеточных функций и белков двух сортов пшеницы с разной агро-биологической характеристикой // Цитология. -1981. Т.21, № 11. С.1275-1283.

77. Фельдман Л.Н., Каменцева И.Е. Роль пероксидаз в изменении активности пероксидазы из закаленных нагревом листьев пшеницы при хранении неочищенного экстракта // Цитология. 1984. Т.26., № 5. - С.583-587.

78. Хавкин Э.Е. Формирование метаболических систем в растущих клетках растений. Новосибирск: Наука. Сибирское отд., 1977. -221 с.

79. Хавкин Э.Е., Токарева Э.В., Обручева Н.В. Скорость синтеза бежа в зонах роста корней проростков кукурузы // Физиология растений. -1967. Т. 14, No 6. С. 997-1005.

80. Хромова Н.Ю. Гар Т.К., Миронов В.Ф. Герматраны и их аналоги. Обзорн. инф. (серия Элементоорганические соединения и их применение) ГНИИХТЭОС. М.: НИИТЭХИМ, 1985. - 34 с.

81. Хромова Н.Ю. Синтез и свойства герматранов и их аналогов: Дис. . канд.хим.наук. М., 1983. 124 с.

82. Чернядьев И.И. Влияние водного стресса на фотосинтетический аппарат растений и защитная роль цитокининов // Прикладная биохимия и микробиология. 2005. Т.41, № 2. - С. 133-147.

83. Шамина З.Б., Савина Т.А., Осипова Е.А., Попов Ю.Г. Повышение продуктивности клеток стефании гладкой Stephania glabra (Roxb) Miers. // Физиол. растений. -1994. Т.41. - С. 885-890.

84. Шинкоренко Н.В. Химическая основа поведения синглетного кислорода в организме человека // Вопр. мед химии. 1986. - Т.32, вып.5. -С.2-7.

85. Яковлев Г.П., Челомбитько В.А. Ботаника. -М: Высшая школа, 1990. 367с.

86. Янковский О.Ю. Токсичность кислорода и биологические системы. СПб.: Игра, 2000. - 295 с.

87. Allen G.C., Hall G., Micchaalowski S., Newman W., Spiker S., Weissinger A.K., Thompson W.F. High level transsgene expression in plant cells: effects of a strong scaffold attachment region from tobacco // Plant Cell. 1996. -Vol. 8.-P. 899-913.

88. Altschler M., Mascarenhas J.P. Heat shock proteins and the effect of head shock in plants // Plant Mol. Biol. 1982. - Vol. 1. - P. 103-115.

89. Anderson M.D., Prasad Т.К., Stewart C. Changes in isozyme profiles of catalase, peroxidase and glutathione reductase during acclimation to chilling in mesocotyls of maze seedlings // Plant Physiol. 1995. - Vol. 109, No 4. - P. 12471257.

90. Arias I.M., Dogle D., Schimke R.T. Studies on the synthesis and degradation of the endoplasmic reticulum of rat liver // J. Biol. Chem. 1969. Vol. 244, No 12. P.-3303-3315.

91. Asai K., Makabe K. Organogermanium compounds. Pat. № 46-2964 Gpn. 1971 // C. A. -1971. Vol. 74. - 125852 p.

92. Bar-Peled M., Raikhel N.V. Characterization of AtSAC12 and AtSaRl. Proyeins likly involved in endoplasmic reticulum and Golgi transport // Plan Physiol. 1997. - Vol. 114. - P. 315-324.

93. Bovaird J. H., Ngo T.T., Jenhott Y.M. Optimizing the o-phenilendiamine assay for horseradish peroxidase : effect of phosphate and pH, substrate and enzyme concentrations and stopping reagents // Clin. Chem. 1982. -Vol. 28.-P.2423

94. Bowler C., Montagu M.V., Inze D.Superoxide dismutase and stress tolerance // Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol. 1992. - Vol. 43. - P. 83-116.

95. Burdon R.H. Free radicals and cell proliferation // Free radicals damage and its control (Ed. by C.A. Rise-Evans, R.N.Burdon ).Amsterdam e.a.: Elsevier.-1994.-P. 155-185.

96. Burdon R.H., Gill V., Rice-Evans C. Oxidation stress and tumour cell proliferation // Free Radic.Res.Commun. 1990. - V. 11. - P.65-76.

97. Cervantes E., Perez P., Martinez-Carrasco R. Dry weight accumulation and starch synthesis enzymes in grain of cultured ears of three winter wheat varieties // Physiol, plant. 1989. - V. 77, No 1. - P. 52-58.

98. Chen P.M., Li P.H. Induction of frost hardiness in stemcortial tissues of Comus stolonifera Michx. by water stress // Plant Physiol. 1977. - Vol. 59, No 2. -P.240-243.

99. Close T.J. Dehydrins: emergence of a biochemical role of a family of plant dehydratation proteins // Physiologia Plantarum. 1996. - Vol. 97, № 5. - P. 795-803.

100. Close T.J. Dehydrins: A commonality in the response of plants to dehydration and low temperature// Physiologia Plantarum. 1997. - Vol. 100, № 2. - P.291-296.

101. Considine M.J., Daley D.O., Whelan J. The expression of alternative oxidase and uncoupling protein during fruit ripening in mango// Plant Physiol. -2001.-Vol.126,№4.-P. 1619-1629.

102. Cooper P., Но Т. H. D. Heat shock proteins in maize // Plant Physiol. - 1983. -V. 71. - P. 214-222.

103. Dat J.F., Lopez-Delgado H., Foyer Ch.H., Scott I.M. Parallel changes in H2O2 and catalase during thermotolerance induced by salicylic acid or heat accumulation in mustard seedlings // Plant Physiol. 1998. - V. 116. - P. 13511357.

104. Davis В.J.Method and application to human serum proteins // In: Disk electrophoresis.Ann.N.Y.Acad. Sci. 1964. - Vol. 121. -P. 404-427.

105. Davies K.J.A., Delsignore M.E., Lin S.W.Protein Damage and Degradation by Oxygen Radicals // J.Biol.Chem. 1987. - Vol. 262, № 20. -P.9902-9907.

106. Davis D.D. Physiological aspects of protein turnover // Encyclopedia of Plant Physiology .Nucleic acids and protein in plants LD.Boulter and B.Parthier (eds.). Springer Berlin, Heidelberg, N. Y, 1982. - Vol. 14A. - P. 189 - 228.

107. Delmer D.P. Studies on the nature of the adaptations of the monkey flower, Mimulus guttatus, to a termophilic environment // Can. J. Bot 1974. -Vol. 52, №7.-P. 1590-1614.

108. Dice J.F., Hess E.J., Goldberg A.L. Studies on the relationship between the degradation rates of proteins in vivo and their isoelectric points // Biochem. J. -1979. -V. 178. P. 305-312.

109. Ekman P., Hermansson U., Bergstrom G., Engstrom L. Rapid proteolytic removal of phosphopeptides and phosphorylatable sites from protein in rat liver cell // FEBS lett. 1978. - Vol. 86. - P. 250-254.

110. Ellis R.J. Role of molecular chaperones in protein folding // Curr.Opinion Struct. Biol. 1994. - Vol. 4, № 1. - р. 117-122.

111. Ericson M.C., Alfinito S.C.H. Proteins produced during salt stress in Tobacco cell culture // Plant Physiol. 1984. - Vol. 74. - P. 506-509.

112. Feder M.E., Hoftnann G.E. Heat-shock proteins, molecular chaperones and the stress response: Evolutionary and ecological physiology // Ann. Rev. Physiol. -1999. Vol. 61. - P. 243-282.

113. Feierabend J., Dehne S. Fate of the porphyrin cofactors during the light-dependent turnover of catalase and of the photosystem 2 reaction-center D1 in matyre rye leaves // Planta. 1996. - Vol. 1 98. - P. 413-422.

114. Flachmann R. Funktionelle bedentung von transit peptiden // Naturwiss. Rdsch. 1991. - Vol. 44, No 5. - S. 180-181.

115. Foyer C.H., Lopez-Delgado H., Dat J.F., Scott I.M. Hydrogen peroxide- and glutathione-associated mechanisms of acclimatory stress tolerance and signaling // Physiol.Plant. 1997. - Vol. 100. - P. 241-254.

116. Griffith M., Ala P., Yang D.S.C., Hon Wai-Ching, Moffat B.A. Antifreeze protein produced endogenously in winter rye leaves // Plant Physiol. -1992. Vol. 100, No 2. - P. 593-596.

117. Griffith M., Marentes E., Mlynerz A., Brush R.A., Knight C,A. The role of apoplastic protein sin frost tolerance of winter rye: Jt. Annu. meet.Amer.

118. Soc. Plant Physiol., Can. Soc. Plant Physiol., Minneapolis, Minn., July 31-Aug.4, 1993: Sci. program, Abstr. Pap. // Plant Physiol. 1993. - Vol. 102, No 1. - P.9.

119. Guy C. Cold acclimation and freezing stress tolerance: role of protein metabolism // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1990. - Vol .41. - P. 187-223.

120. Haberlandt G. Kulturversuche mit izolierten Pflanzenzellen// Sitz. Akad. Wiss. Wien. 1902. - Vol. 111. - P. 69-92.

121. Halliwell B. Free radicals, antioxidants and human disease: curiosity, cause or consequence // Lancet. 1994. - Vol. 344. - P. 721-724.

122. Hamilton C.M., Frary A., Lewis C., Tranksley S.D. Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - Vol. 93. - P. 9975-9979.

123. Harrington H.M., Aim D.M. Interaction of Heat and Salt Schock in cultured Tobacco cells // Plant Physiol. 1988. - Vol. 88, № 3. - P. 618-625.

124. Helene C., Toulme J.J. Specific regulation of gene expression by antisense sense and antigene nucleic acids // Biochem. et biophys. acta. 1990. -Vol. 1049, №2.-P. 99-125.

125. Huffaker R.C., Peterson L.W. Protein turnover in plants and possible means of its regulation // Annual. Rev. Plant Physiol. 1974. - Vol. 25. - P.363 -381.

126. Humphreys D.T., Carver J.A., Easterbrook-Smith S.B., Wilson M.R. Clusterin has chapirone-like activity similar to that of small heat schock proteins // J.Biol.Chem. 1999.-Vol 274. - P. 6875-6881.

127. Ikebuchi Y., Masumoto N., Tasaka K. et al. Superoxide anion increases intracellular pH, intracellular free calcium and arachidonate release in human amnion cells //J. Biol. Chem. 1991. - Vol. 266. -P. 13233-13237.

128. Ishiwata Y., Yokochi S., Hashimoto H., Ninomiya F. and Suzuki T.Protection against concanavalin A-induced Murine liver injuri by the organic germanium compound, Progermanium // Scand J. Immunol. 1998. - No 48. - P. 605-614.

129. Jezek P., Garlid K.D. Mammalian mitochondrial uncoupling proteins // Int. J. of Biochemistry and Cell Biology. 1998. - Vol. 30. - P. 1163-1168.

130. Jones R.L., Robinson D.G. Protein secretion in plants // New Phytol. -1989. Vol. 111, No 4. - P. 567-597.

131. Ф 147. Josu-Estanuol M., Puigdomunech P. Developmental and hormonalregulation of genes coding for proline-rich proteins in Female Inflorencebces and Kernels of Maizel// Plant Physiol. 1998. - Vol. 116. - P. 485-494.

132. Kahl G. Mechanismen des intrazellularren enzymabbaus // Naturwissenschaftliche Rundschau. -1981. Vol.32, No7. - P. 273-289.

133. Kamata H., Hirata H. Redox regulation of cellular signalling // Cell.Signal. 1999.-Vol. 11.-P. 1-14.

134. Kaul В., Staba E.F. Visnagis: biosynthesis and isolation from Ammi visnagi suspension culture // Science. 1965. - Vol. 150, № 24. - P. 1731-1732.

135. Kemp J., Sutton D.W. Protein metabolism in culture plant tissue.

136. Changes in the rate of protein synthesis, accumulation, and degradation in culturedpith tissue. // Plant. Physiol. 1972. - Vol. 49, No 4. - P. 596-601.

137. Kendall E.J., McKersie B.D. Free radical and freezing injury to cell membranes of winter wheat//Physiol. Plant. 1989. - Vol. 76. - P. 86-94.

138. Kim B-Y, Han M-J, Chung A-S. Effects of reactive oxygen species on proliferation of chineze hamster lung fibroblast (V79) cells // Free radical biology. -2001. Vol. 30, № 6. -P. 686-697.m

139. Kishor P.B.Kavi, Mehta A.R. Growth and metabolism in cotton and tobacco callus cultures //Proc. Indian. Acad. Sci. Plant Sci. 1988. - Vol. 98, No 4. - P. 277-282.

140. Komov V.P., Kirillova N.V., Samolin Yu.A., Vollosovich A.G. Biosynthesis and stability of some enzymes in the dynamics of the growth of R. serpentina // 20-th Meeting of FEBS. Hungary, 1990. - P. 285.

141. Laemlu U.K. Cleavage of structural proteins during the assembley of the head of the bacteriophage T4 //Nature. 1970. - Vol. 227. - P. 680-682.

142. Leski M.L., Bao F., Wu L. et al. Protein and DNA oxidation in spinal injury: neurofilaments-an oxidation target // Free radical biology. 2001. - Vol.30, № 6. - P.613-624.

143. Levine R.L., Garland D., Oliver C.N., Amici A., Climent J., Lenz A., Ahn В., Shaltiel S., Stadtman E.R. Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins // Meth. Enzymol. -1990. Vol. 186. - P. 464-478.

144. Leung S.M., Hightower L.E. A 16-kDa protein functions as a new regulatory protein for Hsp 70 molecular chaperone and is identified as a member of the Nm/23 nucleoside diphasphate kinase family// J. Biol. Chem. 1997. - Vol. 272.-P. 2607-2614.

145. Limam F., Chanhed K., Ouelhazi N., Grrir R., Ouelhazi L. Phytohormone regulation of isoperoxidases in Catharantus roseus suspention cultures // Phytochemistry. 1998. - Vol. 49, No 5. - P. 1219-1225.

146. Lowry O.H., Rosenhrough J., Farr A., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. -1951. Vol. 193, No 1.-P. 268-275.

147. Lu Y.T., Dharmasiri M.A., Harrington H.M. Characterization of a cDNA encoding a novel heat-shock protein that binds to calmodulin // Plant Physiol. 1995. - Vol. 108. - P. 1197-1202.

148. Maliga P. Plastid transformation in flowering plants // Trends biotechnol. 1993. - Vol. 11. - P. 101-106.

149. Misra H.P., Fridovich I. The univalent reduction of oxygen by reduced flevins and quinones // J. Biol.Chem. 1972. - Vol. 247, № 1. - P 188-192

150. Mohan Kumar G.N., Houtz R.L., Knowles N.R. Age-induced protein modification and increased proteolysis in Potato Seed-Tubers 1 // Plant Physiol. -1999.-Vol. 119.-P. 89-100.

151. Monroy A.F., Labbe E., Dhindsa RS. Low temperature perception in plants: Effects of cold on protein phosphorylation in cell-free extracts // FEBS Letters. 1997. - Vol. 410, No 2-3. - P. 206-209.

152. Morel G. La culture in vitro du meristeme apical de certaines Orchidees// C.R. Ac. Sc. -1963. Vol. 256. - P. 4955-4957.

153. Muriyasy Y. Examination of the contribution of vacuolar proteases to intracellular protein degradation in Chara corallina // Plant Physiol. 1995. - Vol. 109.-P. 1309-1315.

154. Nagai H., HasegawaK., Shimpo K. Reproductive study of rats intraperitoneally treated with carboxyethylgermanium sesquioxide (Ge-132) // Oyo Yacuri. 1980. Vol. 20, № 2. - P. 271-280.

155. Nover L., Hellmunnd D., Neuman D., Scharf K.-D., Serfling E. Heat shock response of eucaryotic cell // Biol. Zentrablatt. Band. 1984. - Vol. 103. -P. 357-435.

156. Ono K., Han J. The p38 signal transduction pathway: activation and function // Cell, signal. 2000. - Vol. 12. - P.l-13.

157. Panniers R.Translational control during heat shock // Biochemie. -1994. Vol. 76, № 8. - P. 737-747.

158. Parsell D.A., Lindquik S. Heat shock protein and stress tolerance// Biol. Heat Shock Proteins and Mol. Chaperones. Cold. Spring. Yarbobor. N.-Y., 1994.-P.457-494.

159. Pihakaskimaunsbach K., Griffith M., Antikainen M., Maunsbach A.B. Immunogold localization of glucanase-like antifreeze protein in cold acclimated winter rye // Protoplasma. 1996. - Vol. 191, No 3-4. - P. 115-125.

160. Pobezhimova Т., Grabelnych О., Kolesnichenko A., Voinikov V. The comparison of uncoupling activity of constituently synthesized and stress-induced forms of winter rye stress uncoupling protein CSP 310 // J. Therm. Biol. 2001. -Vol. 26,No 2.-P. 95-101.

161. Pool M.R., Lypez-Huertas E., Baker A. Characterization of intermediates in the process of plant peroxisomal protein import // EMBO J. -1998.-Vol. 17.-P. 6854-6862

162. Prassad Т.К., Anderson M.D., Martin B.A., Stewart C.R. Evidence for chilling-induced oxidative stress in maize seedlings and a regulatory role for hydrogen peroxide // Plant Cell. -1994. Vol. 6. - P.65-74.

163. Rechinger C. Untersuchungen uber die Grenzen der Teilbarkeit im Pflanzenreich // Abh. d. Zool. Bot. Ges. Wien. 1893. - Vol. 43. - S. 310-334.

164. Ryynanen L. Effect of abscisic acid, cold hardening and photoperiod on recovery of cryopreserved in vitro shoot tips of silver birch // Cryobiology. -1998.-Vol. 36, No 1. -P.32-39.

165. Sabehat A., Weiss D., Lurie S. The correlation between heat-schock protein accumulation and persistence and chilling tolerance in tomato fruit// Plant Cell. 1996. - Vol. 1. - P. 793-803.

166. Santos Ph., Chupeau Y. Penicillins and activity of nitrogen metabolism enzymes in plant tissue culture // Plant. Sci. 1989. - Vol. 59. No 1. -P. 119-125.

167. Sato T. Organic Germanium polymers as therapeutic agents. Pat. 55.167222 Jpn.(1980) // C.A. 1981. Vol. 94. - 185729 b.

168. Scandalios J.G. Molecular genetics of superoxide dismutase in plants // J.Scandalios, ed., Oxidative stress and the Molecular Biology of Antioxidant

169. Defenses. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. N,-Y., 1997. -P.527-568.

170. Soto A., Allono I., Collada C., Guevara M.-A. et al. Heterologous expression of a plant small heat-schok protein enhances E. coli viability under heat and cold stress // Plant Physiol. 1999. - Vol. 120. - P.521-528.

171. Struglics A., Hakansson G. Purification of serine and histidine phosphorylated mitochondrial nucleoside diphosphate kinase from Pisum sativum // Eur. J. Biochem. -1999. Vol. 262. - P. 765-773.

172. Sun Y., Carnero N., Clore A.M., Moro G.L., Habben J.E., Larkins B.A. Characterization of maize elongation factor 1A and its relationship to protein quality in the endosperm // Plant Physiol. 1997. - Vol. 115. - P. 1101-1107.

173. Suzuki F., Aso H., Kobayashi H., Ohnishi Т., Ishida N. Antiviral effects of carboxyethylgermanium sesquioxide (Ge-132) in mice infected with a lethal dose of influenza virus // Chemotherapy. 1986. - V.34, № 6. - P. 488-494.

174. Tan B.C., Liang H.G. Changes in the metabolism of nucleic acidsЩduring the growth and senescence Tobacco callus // Plant. Physiol. -1991. Vol. 81, № 1. -P.121-126.

175. Teeri Т., Tormala T. Biotekniikka kasvinjalostuksessa ja kasvien lisayksessa // Luonnon. Futkija. 1990. - Vol. 94, No 1-2. - P. 43-49.

176. Tolmasoff J.M., Ono Т., Cutler R.G. Superoxide dismutase: correlation with life-span and specific metabolic rate in primate species // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. - Vol. 77, № 5. - P. 2777-2781.

177. Trewavas A. Determination of the rates of protein synthesis anddegradation in Lemna minor // Plant. Physiol. 1972. - Vol.49, No 1. - P. 4046.

178. Vierling E. The role of heat shock proteins in plants // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. -1991. Vol. 42. - P. 579-620.

179. Willekens H., Inze D., Van Montagu M., Van Camp W. Catalase in plants // Molecular Breeding. 1995. - Vol. 1. - P.207-228.

180. Yamashita Y., Ashihara H. Characterization of hexokinase from suspensioncultured Catharanthus roseus cells //Z. Naturforsch. 1988. - Vol. 43, No 11-12.-P. 827-834.

181. Young M.E., Keegstra K., Frochlich J.E. GTF promoters the formation of early-import intermediates but is not required during the translocation step of protein import into chloroplastsl // Plant Physiol. 1999. - Vol. 121. -P.237-244.

182. Zenk M.H., El-Shagi H., Arens H. et al. Formation of the ondole alkaloides serpentine and ajmalicine in cell suspension cultures of Catharanthus roseus // Plant tissue culture and its Bio-technological application. В.: N.-Y., 1977.-P.27-43.

Информация о работе

Спасенков, Александр Игоревич
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2006
ВАК 03.00.04

Диссертация

Белоксинтетическая способность и стабильность двух штаммов культуры ткани Polyscias filicifolia при стрессе - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы