Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиологические характеристики суспензионных культур клеток Polyscias filicifolia, Panax japonicus и Dioscorea deltoidea при масштабировании процесса выращивания

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Физиологические характеристики суспензионных культур клеток Polyscias filicifolia, Panax japonicus и Dioscorea deltoidea при масштабировании процесса выращивания"

На правах рукописи

Титова Мария Владимировна

Физиологические характеристики суспензионных культур клеток Ро1у5СШ$/\Ucifolia, Рапах¡аротсия и Вюясогеа йеИо'1йеа при масштабировании процесса выращивания.

03.01.05 - физиология и биохимия растений 03.01.06 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

18 АПР 2013

Москва-2013

005057617

Работа выполнена в лаборатории физиологии культивируемых клеток Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева Российской академии наук, Москва

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

профессор Носов Александр Михайлович

Официальные оппоненты:

*

Лобакова Елена Сергеевна,

доктор биологических наук, профессор

кафедра биоинженерии биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова, Москва, профессор.

Цоглин Лев Наумович,

доктор биологических наук

лаборатория управляемого фотобиосинтеза Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва, ведущий научный сотрудник

Ведущая организация:

ОАО «БИОХИММАШ» Институт прикладной биохимии и машиностроения, Москва

Защита состоится 23 апреля 2013 г. в 13 часов на заседании Совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, па соискание ученой степени доктора наук Д 002.210.01 по специальностям 03.01.05 - "Физиология и биохимия растений" и 03.01.06 - «Биотехнология» (Биологические науки) при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35. Факс: (495) 977 8018, электронпая почта: m-azarkovich@,ippras.ru; ifr@ippras.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук.

Автореферат разослан «22» марта 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук

Актуальность проблемы. Культура клеток высших растений - это экспериментально созданная популяция соматических клеток, нуждающаяся в тщательнейшем изучении. Помимо теоретического интереса к исследованию поведения растительных клеток вне организма, культура клеток имеет прямое практическое значение. Известно, что в настоящее время значительное количество лекарственных препаратов создаются на базе растительного сырья. Между тем возможности их получения сильно ограничены сокращающимися ресурсами дикорастущих растений. В связи с этим культуры клеток лекарственных растений представляют собой перспективный источник биологически активных веществ для нужд косметической, фармацевтической и пищевой промышленности. (Ramachandra et al., 2002; Bourgaud et al., 2001; Collin et al., 2001) Однако успешных примеров масштабного промышленного использования клеток высших растений in vitro немного. Это связано, прежде всего, с трудностью получения штаммов-продуцентов, трудоемкостью работ по оптимизации их выращивания и, наконец, сложностью масштабирования процессов культивирования. Кроме того, известно, что культуры клеток высших растений часто характеризуются нестабильностью процессов роста и синтеза целевых вторичных метаболитов при длительном выращивании. Для решения этих проблем и создания эффективных биотехнологий на основе растительных клеток in vitro необходим комплекс как фундаментальных, так и прикладных работ, в том числе исследование общих закономерностей роста, первичного и вторичного метаболизма клеток растений in vitro; особенностей выращивания в различных системах культивирования; создание оптимальных схем промышленного выращивания. (Verpoorte et al., 2002)

Тем не менее, подобное комплексное изучение культур клеток - продуцентов биологически-активных веществ с учетом как продуктивности и индивидуальных физиологических особенностей клеток in vitro, так и технологических характеристик используемого оборудования до сих пор не получило широкого распространения.

Большой интерес с практической точки зрения представляют работы по исследованию культур клеток лекарственных растений, синтезирующих тритерпеноиды с высокой биологической активностью - женьшеня Panax japonicus (продуцент ппгзе-нозидов), полисциаса Polyscias filicifolia (комплекс биологически-активных соединений, в том числе тритерпеновых гликозидов на основе олеаноловой кислоты) и дио-скореи Dioscorea deltoidea (продуцент фуростаноловых гликозидов). Как было пока-

зано многочисленными исследованиями, суспензионные культуры клеток Polyscias filicifolia, Panax japonicus и Dioscorea deltoidea обладают достаточно высокими ростовыми и биосинтетическими характеристиками для проведения исследований по изучению возможностей аппаратного выращивания для рентабельного получения клеточной биомассы. (Липский и др., 1985; Орешников и др., 1994; Клюшин и др., 2000) В связи с этим комплексный анализ изменения их физиологических показателей при масштабировании процесса культивирования с учетом технологических ограничений, обусловленных особенностями аппаратурного оформления, представляется актуальной фундаментальной и прикладной задачей.

Цель работы. Исследовать особенности физиологических характеристик суспензионных культур клеток Polyscias filicifolia, Panax japonicus и Dioscorea deltoidea при длительном выращивании в различпых системах (колбах и биореакторах различного типа), провести масштабирование процесса выращивания и отработать эффективную технологию получения клеточной биомассы в аппаратах полупромышленного объема (630 л).

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Охарактеризовать по физиологическим показателям суспензионные культуры клеток Polyscias filicifolia, Panax japonicus и Dioscorea deltoidea при стандартных условиях выращивания (в колбах)

2. Провести сравнительное исследование физиологических и продукционных (по биомассе и целевым продуктам вторичного метаболизма) характеристик суспензионных культур клеток Polyscias filicifolia, Panax japonicus и Dioscorea deltoidea при периодическом и полупроточном режимах выращивания в биореакторах различного типа и объема.

3. Исследовать возможность длительного непрерывного аппаратурного выращивания суспензионных культур клеток Polyscias filicifolia, Panax japonicus и Dioscorea deltoidea при сохранении максимальной продуктивности по клеточной биомассе и целевым продуктам вторичного метаболизма.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование ростовых и биосинтетических характеристик суспензиопных культур клеток Polyscias filicifolia, Panax japonicus и Dioscorea deltoidea при полу проточном выращивании в биореакго-рах различного типа и объема. Показано влияние характеристик биореакторов (интен-

сивность аэрации и перемешивания, конструктивных особенностей) на физиологические показатели штаммов-продуцентов. Впервые осуществлено длительное непрерывное полупроточное выращивание суспензионных культур клеток Polyscias filicifo-lia, Panax japonicus и Dioscorea deltoidea в полупромышленных аппаратах при сохранении продуктивности по клеточной биомассе и синтезируемым вторичным метаболитам. Показана воспроизводимость основных ростовых и биосинтетических характеристик при использовании предлагаемой схемы масштабирования процесса культивирования.

Практическая значимость работы. Отработанная в результате проведенных исследований технология является основой создания технологических регламентов получения биомассы культур клеток Polyscias filicifolia, Panax japonicus и Dioscorea deltoidea глубинным способом в пилотных и промышленных установках. Основные ростовые и физиологические показатели исследованных штаммов, полученные при выращивашш в различных системах культивирования, не уступают мировым аналогам разработанных технологий получения биомассы культур клеток высших растений. Полученная в результате проведенных работ биомасса клеток была использована НПК «Биофармтокс» (Санкт-Петербург) при производстве пищевых добавок, обладающих тонизирующими и адаитогенными свойствами.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на VIII и IX Международных конференциях «Биология растительных клеток in vitro и биотехнология» (Саратов, 2003; Звенигород, 2008), Международной конференции 1st Workshop on Molecular Biotechnology / XV Biotechnology Summer School (Gdansk, Poland, 2009), Международной конференции «Перспективы фитобиотехнологии для улучшения качества жизни на севере» (Якутск, 2010)

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 19 печатных работ в отечественных и зарубежных научных журналах, материалах конференций и научных сборниках (в том числе 7 в журналах ВАК), а также получено 2 авторских свидетельства.

Структура и обьем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертациоиная работа изложена на

138 страницах машинописного текста, содержит 22 рисунка и 15 таблиц. Список цитируемой литературы включает 210 наименований.

Автор выражает особую благодарность за помощь в проведении аппаратного культивирования сотрудникам Отдела Шумило Николаю Анатольевичу и к.б.н. Орешникову Александру Викторовичу.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В качестве объектов исследования использовали следующие суспензионные культуры клеток, депонированные в ВЬСКК BP ИФР РАН: Dioscorea deltoidea Wall -штамм ИФР ДМ-05 - сверхпродуцент фуростаноловых гликозидов (коллекционный № 6); Polyscias filicifolia Bailey - штамм BFT-001-95 (коллекционный № 58); Panax japonicus С. A. Mey. var. repens Maxim - штамм-продуцент гинзенозидов (коллекционный № 62). Культуры выращивали на модифицированных питательных средах с минеральной основой по Мурасиге-Скуга (Murashige, Skoog, 1962) и с добавлением источников углеводов, витаминов и регуляторов роста (в соответствии с коллекционными паспортами).

Культивирование проводили в колбах и в биореакторах. Культивирование в колбах на круговой качалке осуществляли в темноте при температуре 26-27°С, влажности 70-75 % и частоте оборотов 95-100 об/мин. Для аппаратного выращивания использовали биореакторы 3-х типов: 1) барботажный ферментер (разработка Отдела биологии клетки и биотехнологии РАН); точечное аэрирующее устройство; общий объем 20 л; рабочий объем 15 л.; 2) аппарат с барботажем и механическим перемешиванием (фирма "Electrolux", Швеция); общий объем 75 л; рабочий объем 50 л; точечное аэрирующее устройство; тип перемешивающего устройства "морской винт"; 3) барботажный аппарат (1Т, ОКБА, Йошкар-Ола); кольцевое аэрирующее устройство; общий объем 630 л; рабочий объем 550 л. В зависимости от типа биореактора и фазы ростового цикла расход воздуха на барботаж составлял 0,1-1,0 л/л/мин. Концентрацию растворенного кислорода р02 поддерживали на уровне 10-30% от насыщения при отсутствии интенсивного ценообразования.

Для характеристики роста и физиологического состояния культур использовали сухую и сырую массы клеток, степень агрегированности культур, жизнеспособность и концентрацию клеток, которые определяли по общепринятым методикам. (Бутенко,

1964; Носов, 2008) По первичным результатам, характеризующим рост культуры, рассчитывали индекс роста I, удельную скорость роста в экспоненте ц, время удвоения Т, продуктивность по сухой биомассе Р. (Носов, 2008)

Количественное определение общего содержания фуростаноловых гликозидов в клеточной биомассе проводили спектрофотометрическим методом с использованием реактива Эрлиха. (совместно с н.с. Куличенко И.Е.) (Васильева и др., 1987)

Количественное содержание и качественный состав гинзенозидов определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления (совместно с с.н.с., к.ф.н. Рсшетняк О.В.). (Решетняк и др., 2008)

Определение доли различных путей дыхательного обмена в общем процессе поглощения кислорода клетками исследуемых штаммов производили полярографическим методом на полярографической установке с ячейкой открытого типа и электродом Кларка с применением ингибиторного анализа. (Kapulnik et al., 1992)

Для оценки коэффициента массопередачи по кислороду (К,м) в бесклеточиой среде использовали оригинальную методику, примененную ранее для оценки массопередачи при выращивании культур клеток животных, и адаптированную в дальнейшем для культур растительных клеток. (Алеева и др., 1977; Данилов, Зайцева и др., 1981)

Статистическую обработку результатов проводили по стандартным методикам (Рокицкий, 1964). На графиках и в таблицах представлены средние арифметические значения из 3 биологических повторностей (по 3 колбы или по 3 фиксированных объема клеточной суспензии (при отборе проб из биореакторов) на точку) для каждого срока, пассажа и варианта культивирования. Стандартные отклонения менее 10% от величин средних значений на графиках не отображали.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ. 1. Изучение ростовых и биосинтетических характеристик суспензионных культур клеток Pofyscias filicifolia, Panax japonicus и Dioscorea deltoidea при выращиванин в колбах в стандартных условиях. Для разработки успешной технологии аппаратного культивирования необходимо знать особенности физиологии используемых культур клеток. В связи с этим на первом этапе работы проводили изучение ростовых и биосинтетических характеристик исследуемых штаммов поли-

сциаса папортниколистного, женьшеня японского и диоскореи дельтовидной при стандартном периодическом выращивании в колбах на качалке. Данный способ выращивания является основным для поддержания суспензионных культур растительных клеток в лабораторных коллекциях, и физиологические показатели штаммов, полученные в процессе такого культивирования, обычно принимают в качестве контрольных.

Для всех штаммов были исследованы ростовые характеристики и построены кривые роста по всем изученным параметрам (сырой и сухой массе и числу клеток) (рис.1). Рассчитанные по полученным данным основные ростовые показатели представлены в табл.1. Проведенный комплексный анализ полученных результатов позволил выявить характерные физиологические особенности исследуемых культур клеток.

Все штаммы были представлены двумя типами клеток - меристемоидными и паренхимоподобными. Причем число последних увеличивалось к концу стационарной фазы цикла субкультивирования у всех вариантов. Для суспензионной культуры клеток PJilicifolia отмечено присутствие незначительного количества клеток удлиненной изогнутой формы, что, по-видимому, является специфической особенностью данного штамма (Клюшин и др., 2000)

По степени агрегированное™ клеток в суспешии отличаются от остальных штаммы D.deltoidea: они являются относительно мелкоагрегировапными — более 80 % агрегатов в суспензии составляют кластеры, состоящие из 10-50 клеток. Штаммы Polyscias filicifolia и Panax japonicus крупноагрегированные — более 50% приходится на агрегаты, размером >50 клеток. Количество жизнеспособных единичных клеток и мелких агрегатов (до 5 клеток) незначительно для всех вариантов.

Для исследуемых культур (при контрольной начальной плотности посадки около 1.5-2.0 г/л по сухой биомассе клеток и жизнеспособности около 88-92 %) цикл субкультивирования при определении ростовых характеристик составлял 21-22 суток, продолжительность лаг-фазы роста находилась в пределах 3-5 суток, фазы экспоненциального роста -7 — 9 суток. Характерная особенность роста штамма культуры клеток D.deltoidea - короткая фаза стационара (около 2-3 суток), что является специфическим признаком этой культуры клеток. (Носов, 1992) Стационарная фаза для культур клеток P.filicifolia и P.japonicus наступала довольно поздно (на 16-18-е су-

тки), в течение эксперимента для этих штаммов фазу деградации зафиксировать не удалось.

Polyscias filicifolia

время культивирования, [еуг.]

-Згсырая масса, 1пХ/Хо -♦-сухая масса, 1п Х/Хо -О-число клеток, 1п Х/Хо

Dioscorea deltoidea

время кулыиеирования, суг.

-*-сырая масса, 1пХ/Хо -«-сухая масса, 1пХ/Хо -О- число клеток, 1п Х/Хо

Panax japonicus

время культивирования, [сут.] -К-сырая масса, 1п Х/Хо -*-суияиааа,1пХ/Хо ■О-число клеток, 1п Х/Хо

Рис. 1. Динамика роста суспензионных культур клеток Яо/у5С)я.у/ШЫ/оНа, Рапах ]аротст и В'юасогеа с1е!1о1(1еа в полулогарифмической системе координат при стандартном выращивании в колбах объемом 250 мл

Таблица 1. Ростовые характеристики суспензионных культур клеток Яо/ухс/ау А\icifolia, Рапахуаротсш и Оюзсогеа (1е1Шс1еа

Культура Мти.Ап г/л v, % Hdw, сут"1 'dw

Dioscorea deltoidea 9.31 -10.81 89-95 0.15-0.20 4.75-6.35

Polyscias filicifolia 11.60-12.80 96-98 0.15-0.22 5.53-7.20

Panax japonicus 7.56 - 8.78 92-97 0.11-0.17 3.63-4.21

где Мтж_<ьт- максимальное значение концентрации биомассы клеток по сухому весу; V-жизнеспособность клеток; ц - удельная скорость роста; I - индекс роста.

Как следует из представленных результатов, исследуемые штаммы обладают достаточно высокими характеристиками роста (табл.1). Наиболее высокие ростовые показатели наблюдали для суспензионной культуры Polyscias filicifolia, для которой были получены максимальные значения Mmm_d„., ц и I. (12.80 г/л, 0.22 сут"1 и 7.20 соответственно).

Отмечена характерная для культур растительных клеток несбалансированность роста по различным критериям, связанная с растяжением клеток в заключительные стадии ростового цикла (по сырой массе) и частичной синхронизацией деления клеток (по числу клеток).

Известно, что измерение общей скорости поглощения кислорода является информативным методом контроля метаболической активности растительных клеток in vitro при культивировании в колбах или биореакторах и может адекватно отражать их реакцию на изменение условий выращивания. Также представляет интерес сравнение доли цианидрезистентного дыхания (активности альтернативной оксидазы, АО) для штаммов культур клеток высших растений, принадлежащих к разным видам, отличающихся механизмами адаптации к стрессовым условиям и по классам синтезируемых вторичных метаболитов.

На рис.2 представлены результаты измерений интенсивности дыхания исследуемых культур в течение ростового цикла при стандартном культивировании в колбах. Все исследуемые штаммы суспензионных культур растительных клеток отличались по общей скорости поглощения кислорода. Наиболее высокий уровень дыхательной активности был получен для клеток Dioscorea deltoidea и Рапах japonicus - на протяжении всего цикла роста общая интенсивность дыхания этих культур-продуцентов была в 3-4 раза выше, чем у Polyscias filicifolia. Также отмечены разли-

9

чия о динамике изменения общей скорости поглощения кислорода для разных штаммов по фазам ростового цикла. Максимальные значения для Dioscorea deltoidea. наблюдали в лаг фазе (161.75±19.19 мг02/ч*г сухой массы) с постепенным снижением общей интенсивности дыхания в последующие фазы роста. Для штамма Polyscias fili-cifolia в лаг-фазе и экспоненциальной фазе общая скорость поглощения кислорода изменялась незначительно, однако в фазе стационара отмечено повышение дыхательной активности - до 52.43±1.46 MrO^/ntr сухой массы. Максимальная интенсивность дыхания для штамма Panax japonicus показана в экспоненциальной и стационарных фазах роста - до 153.59+9.81 мг02/ч«г сухой массы. У исследуемых штаммов также различен вклад альтернативного пути дыхания в общее поглощение кислорода. Дыхательная активность клеток Dioscorea deltoidea на протяжении ростового цикла была обеспечена в основном митохондриальным дыханием, максимальное участие АО наблюдали в экспоненциальной фазе роста (до 35 %). Для культуры клеток Polyscias fili-cifolia высокая активность АО сохранялась в течение всего цикла выращивания (не ниже 43%) и достигала максимальных значений в экспоненциальной фазе (до 52 %). Для Panax japonicus активность АО была максимальна в лаг фазе и постепенно снижалась в процессе последующего роста (от 49 до 21 %).

лаг-фаза зкспонен- фаза

циальная стационара фаза

BD.de/io/ciea ШР.ШШМт

§ P. japonicus

it Pi

n t

0 о

s

1 * и

3 и

4 2 14 л

5 4

о

■ D. deltoidea

1 PJilicifolia Ш P.jsponicus

А.

Б.

Рис. 2. Общая интенсивность дыхания (А) и вклад АО (Б) на разных стадиях роста культур клеток Dioscorea deltoidea, Polyscias filicifolia и Panax japonicus (выращивание в колбах).

60 6С 40 30 20 10 О

лаг-фаза экспонен- фаза

циальная фаза стационара

Важнейшей характеристикой штаммов-продуцентов является содержание в клеточной биомассе целевых продуктов вторичного метаболизма. В связи с этим для культур клеток Dioscorea deltoidea и Panax japonicus была изучена динамика накопления вторичных метаболитов (фуростаноловых гликозидов и гинзенозидов соответственно) в цикле субкультивирования (рис. 3 и 4).

16 14

Рис. 3. Динамика накопления 12 фуростаноловых 10

гликозидов в цикле 8

субкультивирования для в

суспензионной культуры 4

клеток D. deltoidea при 2

стандартном выращивании 0

в колбах объемом 250 мл

L.'1'i содержание фуростаноловых гликозидов в биомассе клеток, [% к сухой массе клеток] сухая масса, [г/л]

время культивирования, [сут.]

А.

Б.

ISRifl iRc

■ ньг

□ ш

□ и 0%1

S 14 21

вреия культкакрозания,сут.

Ш содержание ганзеиозидов в биомассе клеток, (% к сухой

массе) -♦-сухая масса, [rin]

7 8 14 21 23

время культивирования, [сут.]

Рис. 4. Динамика накопления гинзенозидов в цикле субкультивирования для суспензионной культуры клеток P.japonicus при стандартном выращивании в колбах объемом 250 мл: а - общее содержание гинзенозидов; б - содержание индивидуальных гинзенозидов.

Для штамма D. deltoidea активный синтез фуростаноловых гликозидов сохранялся на протяжении всего цикла роста, причем максимум их содержания наблюдали в основном в стационарной фазе роста (12-16 сутки) - до 12.9 % к сухой массе клеток. (рис. 3) У суспензионной культуры Panax japonicus наиболее активный синтез приходился на 12-14 сутки и достигал 1.70 % к сухой массе клеток по общему содержанию гинзенозидов. (рис. 4а) Количественное содержание индивидуальных гинзено-зидов представлено на рис. 46. Показано присутствие основных гинзенозидов дамма-ранового ряда - Rb-группы (агликон протопанаксадиол - Rbl, Rc, Rb2, Rd) и Rg-группы (агликон протопанаксатриол - Rgl, Re, Rf). Из результатов произведенного алализа следует, что мажорными являются Rgl- и Re-гинзенозиды (до 4.0-4.8 и до 11.3 мг/г абс. сухой массы соответственно), что соответствует данным, полученным для P.japonicus раннее. (Чайко и др., 1999; Смоленская и др., 2001)

Таким образом, на первом этапе работы суспензиошше культуры клеток Polyscias filicifolia, Panax japonicus и Dioscorea deltoidea были охарактеризованы по основным физиологическим параметрам при стандартном периодическом культивировании в колбах. Все исследуемые штаммы обладали достаточно высокими ростовыми и биосинтетическими показателями для проведения дальнейших экспериментов по аппаратному выращиванию.

2. Изучение физиологических показателей суспензионных культур клеток Polyscias filicifolia, Panax japonicus и Dioscorea deltoidea при выращивании в биореакторах.

При проведении экспериментов по длительному полупромышленному аппаратурному выращиванию использовали следующий алгоритм:

- предварительные эксперименты в лабораторном и пилотном биореакторах по выращиванию штаммов в периодическом режиме;

- полупроточное выращивание в лабораторном и пилотном биореакторах (режим «отьем суспензии-долив среды»);

- масштабирование выращивания в полупроточном режиме до полупромыш-лешгого биореактора.

Режимы перемешивания и аэрации суспензионных культур клеток подбирали экспериментально с учетом следующих требований:

- изменение расхода воздуха на аэрацию должно происходить с таким расчетом, чтобы концентрация растворенного кислорода (р02) не опускалась ниже 10-15 %;

- скорость вращения мешалки необходимо сочетать с интенсивностью аэрации таким образом, чтобы в биореакторе отсутствовали застойные зоны.

2.1. Культивирование в периодическом режиме.

2.1.1. Культивирование в лабораторном биореакторе объемом 20 л. Проведенные ранее в Отделе биологии клетки и биотехнологии ИФР РАН работы показали, что наименьшее стрессовое воздействие на клетки оказывают барботажные ферментеры V-типа, в которых перемешивание осуществляется за счет потока стерильного воздуха, подаваемого в аппарат под давлением. (Липский, 1992; Клюшин и др., 2000)

Для штаммов Polyscias filicifolia, Panax japonicus и Dioscorea deltoidea было проведено периодическое выращивание в лабораторных барботажных биореакторах (с рабочим объемом 15 л). Для оптимизации плотности инокулюма были выбраны два варианта начальной концентрации клеточных суспензий - 2 г/л и 3 г/л по сухой массе клеток. В процессе культивирования определяли накопление сухой биомассы клеток и изменение жизнеспособности. Полученные в результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2. Ростовые показатели суспензионных культур клеток Polyscias filicifolia, Panax japonicus и Dioscorea deltoidea при периодическом выращивании в 20 л барботажном биореакторе.

Культура Po, Г/Л Мтн-Л» Г/Л v,% I dw Hdw, сут"1

Dioscorea deltoidea 2 г/л 8.12 80-90 4.06 0.10

Зг/л 8.97 82-88 3.00 0.11

Polyscias filicifolia 2 г/л 13.40 88-92 6.68 0.18

Зг/л 15.10 88-90 5.03 0.23

Panax japonicus 2 г/л 9.32 90-92 4.66 0.12

Зг/л 8.20 85-90 2.73 0.14

где Мти_а«_ максимальное значение концентрации биомассы по сухому весу; V - жизнеспособность клеток; ц - удельная скорость роста клеток; I - индекс роста; р - начальная концентрация клеточных суспензий по сухой массе клеток.

Общий характер роста исследуемых культур клеток в аппаратах данного типа при периодическом режиме был сходен с характером их роста в колбах. Установ-

лено, что увеличение начальной плотности до 3 г/л по сухой массе клеток приводило к увеличению удельной скорости роста у штаммов Polyscias filicifolia, Рапса japonicus и Dioscorea deltoidea (на 25, 15 и 10 % соответственно). Однако для клеточной суспензии P.japonicus при этом наблюдали снижение жизнеспособности к концу цикла субкультивирования (до 85%) и уровня максимального накопления клеточной биомассы (на 10 %).

В целом, как показали полученные результаты, увеличение пачальной плотности клеточной суспензии при инокуляции 20л биореактора до 3 г/л по сухому весу оптимально для штаммов D.deltoidea и P.filicifolia, тогда как для штамма Panax japonicus предпочтительней р0 2 г/л.

2.1.2 Культивирование в пилотном биореакторе объемом 75 л.

При использовании аппарата с механическим перемешивающим устройством, для снижения стрессового механического воздействия на начальных фазах роста устанавливали минимальную скорость перемешивания порядка 35-40 об/мин (по отсутствию седиментации клеток). По мере роста культур клеток скорость вращения мешалки увеличивали до максимально возможной, не приводящей к разрушению клеток - 55-60 об/мин. При увеличении скорости вращения выше 75 об/мин наблюдали быстрое падение жизнеспособности и появление в культуральной среде значительного количества разрушенных клеток, (табл.3). Дальнейшие эксперименты проводили при наиболее щадящих условиях механического перемешивания - при скорости вращения мешалки в пределах 35-50 об/мин.

Таблица 3. Влияние скорости вращения перемешивающего устройства на жизнеспособность исследуемых штаммов при периодическом выращивании в 75л биореакторе. _

Культура скорость вращения перемешивающего устройства, об/мин

35-40 55-60 >75

D.deltoidea 79-83% 75-77% <70%

P. filicifolia 79-84% 76-80% < 70 %

P. japonicus 79-83% 79-81% < 70 %

Таблица 4. Ростовые показатели исследуемых штаммов при периодическом выращивании в 75л биореакторе (скорость вращения мешалки 35-50 об/мин).

Культура Мша,..*, Г/Л Hd», сут 1 I dw

D. deltoidea 8.19 0.08 3.80

P. filicifolia 11.80 0.10 4.72

Р. japonicus 9.05 0.09 3.77

Обозначения си. Таблицу 1.

В процессе культивирования также определяли накопление сухой биомассы клеток и изменение жизнеспособности. Полученные в результате проведенных экспериментов ростовые показатели представлены в сводной таблице 4.

Показано, что в сравнении с проведенным ранее периодическим культивированием в колбах и барботажных биореакторах при выращивании в аппарате данного типа происходило значительное снижение ростовых характеристик всех исследуемых штаммов. Наиболее выраженное изменение наблюдали для жизнеспособности и удельной скорости роста — эти показатели снизились в среднем на 15-20 % . Такой характер изменения ростовых параметров обусловлен, по-видимому, повреждающим действием перемешивающего устройства на клетки суспензии (несмотря на выбранный максимально щадящий режим перемешивания), а также особенностями его конструкции.

Полученные на данном этапе работ результаты показывают, что ростовые показатели суспензионных культур клеток Polyscias filicifolia, Panax japonicus и Dioscorea deltoidea в значительной степени зависят от условий культивирования, в частности от технических характеристик аппаратов (интенсивности аэрации и перемешивания, конструктивных особенностей), а также, по видимому, обусловлены различной способностью к адаптации исследованных клеточных штаммов вследствие цитологических различий.

2.2. Культивирование в режиме полупротока (многоцикличная схема).

Для реализации «отьемно-доливного» режима культивирования был использо-вап ряд аппаратов с рабочим объемом от 15 до 550 литров и различной системой перемешивания, причем аппараты меньшего объема использовали как инокуляторы для аппаратов большего объема.

В течение 10 лет для каждого штамма были проведены многократные эксперименты по длительному полупроточному культивированию во всех типах биореакторов. Процесс «отъем суспензии - долив среды» осуществляли при достижении плотности суспензии, соответствующей началу фазы замедления роста. Разбавление средой в каждом цикле проводили до концентрации биомассы, исключающей появление лаг-фазы (не ниже 2.0-2.5 г/л среды по сухому весу). В процессе культивирования определяли физиологические и продукционные (по биомассе и целевым продуктам) показатели исследуемых суспензиошплх культур клеток.

2.2.1. Культивирование в лабораторном биореакторе объемом 20 л. При выращивании исследуемых штаммов «отъемно-доливным» способом в 20 л барботаж-ном биореакторе общая продолжительность мультициклов варьировала в пределах 60150 суток, причем каждый мультицикл состоял из 6-14 циклов субкультивирования. В ряде экспериментов выращивание осуществляли параллельно в 2 — 3 биореакторах.

Полученные типичные кривые роста, а также соответствующие им основные ростовые характеристики приведены на рис.5 и в табл.5. Из представленных результатов следует, что ростовые показатели штаммов соответствуют таковым, полученным раннее при периодическом выращивании в колбах и барботажном биореакторе. Жизнеспособность клеток сохранялась на уровне 80-90% для всех штаммов, максимальное накопление сухой биомассы наблюдали на 11-14 день культивирования (до 12 г/л, 15 г/л и 10 г/л по сухой массе клеток для Dioscorea deltoidea, Polyscias filicifolia и Panax japonicus соответственно), (табл.5.) На том же уровне при длительном полупроточном выращивании сохраняется и скорость прироста клеточной биомассы. Аналогичную картину наблюдали при проведении повторных экспериментов.

Таблица 5. Ростовые показатели суспензионных культур клеток при полупроточном выращивании в 20л барботажном биореакторе.

Культура Mmai_dw, г/л v,% Hdw, cyr"1 Id»

Dioscorea deltoidea 8.50-12.50 80-85 0.11-0.13 2.28-3.98

Polyscias filicifolia 10.00-15.12 85-90 0.16-0.23 6.51-7.10

Panaxjaponicus 8.65-10.78 84-91 0.12-0.14 3.32-4.87

Обозначения см.Таблицу 1.

/

г

О 20 AO GO SO -too 120 140 1GO 1 SO

время культивирования, cyr.

♦ сухия масса, [г/л] жизнеспособностью, [%]

Polyscias filicifolia

ремя культивирования, [сут.]

-»-сухая масса, [г/п] жизнеспособностъ/Ю, [%]

Panax japonicus

время, культивирования, [сут,] -»-сухая масса, [г/л) жизнеспособность/Ю, [%]

Рис. 5. Динамика роста суспензионных культур клеток при полупроточном выращивании в 20 л барботажном биореакторе

2.2.2. Культивирование в пилотном биореакторе объемом 75 л.

При отработке длительного полупроточного культивирования в пилотном 75 л биореакторе для всех штаммов проводили выращивание в режиме «отлива-долива», где каждый мультицикл состоял из 2-4 циклов субкультивирования. Общая продолжительность мультициклов для всех вариантов не превышала 60 суток. Следует отметить, что получить устойчивый рост штаммов с сохранением продуктивности по биомассе и целевым продуктам вторичного метаболизма в течение более длительного времени в 75л биореакторе не удалось.

Режим аэрации и механического перемешивания соответствовал схеме, отработанной при периодическом культивировании в аппарате данного типа.

Полученные основные ростовые характеристики приведены в табл.6.

Таблица 6. Ростовые показатели суспензионных культур клеток при полупроточном выращивании в 75л пилотном биореакторе.

Культура г/л У,% |1<ь», суг'1 1(1»

йюзеогеа с1е1Шс1еа 7.70-8.40 74-79 0.08-0.11 2.11-3.09

Ро^аая АНсг/оНа 10.70-12.10 79-82 0.12-0.14 3.76-5.10

Рапахуаротеш 8.50-9.50 80-85 0.09-0.10 2.62-3.51

Обозначения см. Таблицу 1.

Показано характерное для данного биореактора снижение основных ростовых показателей культур клеток — жизнеспособности и скорости накопления клеточной биомассы (в среднем на 15-20% в сравнении с контрольными). Отмечали появление большого количества разрушенных клеток в среде культивирования, что затрудняло дальнейшее отделение клеток от культуральной жидкости при фильтрации.

2.2.3. Культивирование в полупромышленном барботажном биореакторе объемом 630 л.

Основным этапом исследований были эксперименты по длительному непрерывному полупроточному выращиванию в полупромышленном барботажном биореакторе с кольцевым барботёром и объёмом 630 литров. Алгоритм культивирования и режимы перемешивания соответствовали отработанным ранее в аппаратах меньшего объема. На рис бив табл.7 представлены получешше динамики роста штаммов, а также основные ростовые показатели.

50 TOO ISO

время культивирования, [сут.]

-сухая масса, [г/л] -тк-жизнеспособность/10, [%]

Polyscias fdicifolia

•сухая масса, [г/л J

20 40 SO в!

время культивирования. [сут.Д

-А жизнеспособность/'!О, [%]

Panax japonicus

о Ю 20 ЗО ДО 50 во ТО

время культивирования, [сут.] -«-сухая масса, [г/л] -А- жизнеспособность/10, [%]

Рис. 6. Физиологические показатели суспензионных культур клеток при полупроточном выращивании в 630 л барботажном биореакторе.

Продемонстрировано, что при переходе к непрерывному длительному выращиванию в полупромышленных аппаратах ростовые и биосинтетические показатели исследуемых штаммов также сохраняются на достаточно высоком уровне.

Таблица 7. Ростовые показатели суспензионных культур клеток при полупроточном выращивании в 630л барботажном биореакторе

Культура ^1.11.1 Г/Л v, % Udm СЛТ ' Itiw

Dioscorea deltoidea 8.87-ll.13 79-86 0.11-0.14 2.78-3.93

Polyscias fdicifolia 13.00-16.55 85-90 0.12-0.19 3.21-5.27

Panax japonicus 9.85-8.60 88-92 0.11-0.13 2.54-3.14

Обозначения см. Таблицу 1

2.2.4. Влияние смены системы культивирования на степень агрегированно-сти суспензионных культур растительных клеток.

В процессе масштабирования процесса выращивания определяли изменение степени агрегированное™ клеточных суспензий. Показано, что при переходе к выращиванию в аппарате с механическим перемешиванием вследствие травматического разрушающего воздействия перемешивающего устройства почти в 2 раза снижается число крупных агрегатов с числом клеток >50 у крупноагрегированных суспензий Panax japonicus и Polyscias fdicifolia, а также уменьшается количество одиночных клеток и мелких агрегатов (от 1 до 10 клеток) для всех штаммов. Напротив, при выращивании в 630л барботажном аппарате для всех вариантов отмечено некоторое увеличение степени агрегированное™ (количество крупных клеточных кластеров увеличивается в среднем на 15-20%).

2.2.5. Влияние смены системы культивирования на дыхательную активность суспензионных культур растительных клеток.

При масштабировании аппаратного выращивания культур клеток до промышленных объемов важнейшей задачей является мониторинг физиологического состояния клеток. В работе была оценена возможность использования в качестве подобного-экспресс-теста анализ активности дыхательного метаболизма клеток. Кроме того, поскольку кислород является одним из основных лимитирующих факторов при глубинном выращиваиии растительных клеток in vitro, представлялось актуальным изучить влияние массообменных характеристик используемых систем культивирования на дыхательную активность штаммов. Исследования проводили на примере штамма-

о 20 40 60 80 1 00 120

И цитохромное дыхание, % ШАО, % S3 вклад остаточного дыханий, %

продуцента Оюясогеа с1еИо1с1еа, для которого при полупроточном выращивании в барботажных биореакторах (20 л и 630 л) в экспоненциальной фазе роста измеряли общую скорость поглощения кислорода и долю АО в этом процессе. Полученные результаты представлены на рис. 7.

В Колбы и 20л биореактор ® ВЗОл биореактор

4-5 сут. цикла

4-5 сут. цикла

10-12 сут. цикла 7-8 сут. цикла 4-5 сут. цикла

250

л О

100 50

начало середина

экспоненциальной экспоненциальной

фазы (4-5 фазы (7-8

сут.цикла) сут.цикла)

10-12 сут. цикла 7-8 сут. цикла

20л биореакгор (KLa2.0 -2.4 1/ч)

630л биореактор (KLa 7.1 - ао 1/4)

экспоненциальной фазы (10-12 сут.цикла)

Колбы (KLa 6.4- 7.2 1/ч)

конец

10-12 сут. цикла 7-8 сут. цикла

Рис. 7. Вклад различных путей дыхания (в % от общей интенсивности, Б) в общее поглощение кислорода (А) клетками Dioscorea deltoidea Wall, в экспоненциальной стадии роста при культивировании в различных системах.

Для каждого биореактора измерения проводили на протяжении 3 циклов субкультивирования, начиная со 2-ого цикла от момента инокуляции. Коэффициенты массопередачи по кислороду (К и, ч"1) определяли при оптимальных режимах перемешивания и аэрации.

По представленным данным видно, что максимальная доля цианидрезистентно-го дыхания наблюдалась при выращивании в 20 л барботажном биореакторе с точечным аэрирующим устройством. Для этого же аппарата были получены минимальные значения Ки, а также был отмечен более низкий уровень содержания фуростаноловых гликозидов (см.табл. 8) и более низкая продуктивность по накоплению клеточной биомассы (см.табл. 5). Минимальная активность АО была отмечена для системы с более интенсивным массообменом по кислороду - 630 л барботажного биореактора с кольцевым аэратором. Для этого же биореактора отмечали более высокие ростовые и биосинтетические показатели (см.табл. 8 и 7).

2.2.6. Влияние смены системы культивирования на накопление вторичных метаболитов у штаммов продуцентов Шоъсогса йсИоМеа и Рапах ]аротси$. Для изучения влияния смены условий культивирования на синтез вторичных метаболитов у штаммов-продуцентов проводили исследование изменения содержания фуростаноловых гликозидов и гинзенозидов в биомассе клеток Б'юзсогеа ({еио1с1еа и Рапах уаротсш соответственно при полупроточном выращивании в биореакторах различного типа. Полученные результаты представлены в табл. 8 и 9.

В целом динамика накопления целевых метаболитов соответствовала динамике их накопления при стандартном выращивании штаммов-продуцентов в колбах. Максимальное содержание фуростаноловых гликозидов и гинзенозидов отмечали к концу циклов субкультивирования при достижешга соответствующих значений Показано варьирование уровня максимального накопления целевых метаболитов при переходе к длительному аппаратному культивированию по сравнению с результатами химического анализа, полученными при стандартном выращивании в колбах. При выращивании в 20л биореакторе содержание фуростаноловых гликозидов в биомассе клеток ОАе11о'и1са в среднем не превышало 8.0 % к сухой массе клеток (при 5.6 - 12.0 % к сухой массе клеток при выращивании в колбах). Для культуры клеток Р.]аротси$ наблюдали снижение общего содержания гинзенозидов и изменения в соотношении

индивидуальных гинзенозидов, в частности — в 2.0 раза снизилось содержание Ке гин-зенозидов, в 1.5 раза - Кс1 и КЬ2 гинзенозидов, в 2.5-3 раза - БЫ гинзенозидов.

Таблица 8. Содержание фуростаноловых гликозидов в биомассе клеток £>;о5со-геа с1е1Мс1еа при полупроточном выращивании в различных системах системах (в % к сухой массе клеток в период максимального накоплении биомассы)

Параметр 20л биореагсгор 75л биорсактор "Electrolux" 630л биореастор Колбы (контроль)

Fmn_*v, [% К СуХОЙ массе клеток] 4.2-8.0 3.4-4.7 7.7- 13.9 5.6-12.0

F maxjiw - максимальное содержание фуростаноловых гликозидов в биомассе клеток

Таблица 9. Содержание индивидуальных гинзенозидов в биомассе клеток

Panax japonicus при полупроточном выращивании в различных системах (в мг/г сухой массы клеток в период максимального накоплении биомассы)

Gl mai_dw 20л биореактор 75л биореактор "Electrolux" 630л биореактор Колбы (контроль)

Rbl 0.14-0.36 0.16-027 0.16-0.34 0.41-1.00

Rc 0.07-0.20 0.19-0.24 0.05-0.44 0.12-0.23

Rb2 0.05-0.19 0.05-0.13 0.05-0.11 0.11-0.22

Rd 0.05-0.28 0.08-0.10 0.05-0.08 0.11-0.27

Rf 0.16-0.22 0.22-0.31 0.14-0.42 0.10-0.19

Rgl 2.32-4.26 2.33-4.84 2.31-5.80 227-4.80

Re 2.50-4.29 4.00-10.20 2.00-3.83 6.70-8.91

Gi ша.ч dw — максимальное содержание индивидуальных гинзенозидов в биомассе кле-

ток

При культивировании в 75 л аппарате для D.deltoidea наблюдалось снижение уровня содержания фуростаноловых гликозидов в среднем в 2.0-2.5 раза (до 3.4-4.7 % к сухой массе клеток). Для Panax japonicus не отмечено существенных изменений в содержании гинзенозидов Re, Rc, Rf и Rgl, однако показано уменьшение уровня содержания Rbl гинзенозидов - в среднем в 2.5-3.0 раза, а также Rd и Rb2 гинзенозидов — в 2.0 раза. Аналогичный эффект для Panax japonicus наблюдали при масштабировании выращивания до 630 л биореактора, однако для клеток D.deltoidea уменьшения уровня накопления фуростаноловых гликозидов в этом аппарате не отмечено.

На основании представленных данных можно предположить, что уменьшение уровня накопления Rbl, Rd и Rb2 гинзенозидов является специфической стрессовой реакцией клеток Panax japonicus на изменение условий культивирования при переходе к аппаратному выращиванию.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При масштабировании аппаратного глубинного культивирования растительных клеток, как правило, достаточно сложно точно предсказать адаптационные изменения поведения используемых штаммов, т.к. сложно точно выдержать геометрическое и технологическое подобие используемого оборудования. Мы рассмотрели эту проблему при помощи поэтапного анализа наиболее существешгых физиологических параметров культур растительных клеток на всех стадиях процесса масштабирования - от колб до биореакторов полупромышленного объема.

Были выявлены характерные отличия исследуемых культур по динамике роста и накопления вторичных метаболитов. Полученные результаты показали, что отобранные штаммы являются лабильными системами, достаточно чувствительным к смене условий культивирования и претерпевающими определенные перестройки в результате изменений условий выращивания. Представленные данные также позволяют сделать вывод, что дыхательная активность клеток штаммов-продуцентов является информативной характеристикой физиологического состояния культуры и может быть использована для мониторинга и оптимизации роста клеток при масштабировании процесса выращивания. При анализе получешшх результатов отмечена определенная корреляция между изменением интенсивности дыхания и динамикой накопления вторичных метаболитов для культур-продуцентов Dioscorea deltoidea и Panax japonicus. Кроме того, на примере Dioscorea deltoidea показана зависимость активности АО от условий выращивания, в частности - от массообменных характеристик систем культивирования.

Подтверждено, что для проведения длительного аппаратного культивирования штаммов-продуцентов предпочтительной системой является барботажный биореактор. При использовании аппаратов этого типа (20 л и 630 л биореакторы) для исследуемых штаммов наблюдали паиболее высокие ростовые и биосинтетические характеристики. Выращивание «отъемно-доливным» способом в данном случае в целом

было более продуктивно как по выходу клеточной биомассы, так и по целевым продуктам вторичного метаболизма. Анализ полученных данных также показывает, что для создания наиболее оптимальных условий массообмена и предотвращения лимитирования роста скоростью переноса кислорода в аппаратах различной емкости предпочтительно использовать не точечные, а кольцевые аэраторы. Пилотный аппарат с механическим перемешиванием, для которого были получены более низкие физиологические показатели, может быть рекомендован для краткосрочного культивирования в качестве промежуточного звена при переходе к промышленным аппаратам.

Важно отметить воспроизводимость основных ростовых и биосинтетических характеристик для всех выбранных штаммов при переходе к длительному аппаратному культивированию. Масштабирование выращивания суспензионных культур клеток Dioscorea deltoidea, Polyscias fdicifolia и Panax japonicus по представленной схеме с использованием «отьемно-доливного» метода повторяли неоднократно при сохранении удовлетворительных физиологических показателей штаммов. Эту же схему успешно использовали для аппаратного глубинного культивирования клеток высших растений других видов (Stephania glabra, Polyscias fruticosa).

На основе отработанных в результате проведенных работ технологий составлены проекты опытно-промышленных технологических регламентов получения биомассы культур растительных клеток в полупромышленных установках.

ВЫВОДЫ.

1. Проведено комплексное исследование осповных закономерности роста, а также дыхательной и биосинтетической активности суспензионных культур клеток P. filici-folia, P. japonicus и D. deltoidea при стандартном выращивании в колбах. Все штаммы обладали достаточно высокими физиологическими характеристиками для проведения аппаратного выращивания - жизнеспособность в пределах 90-97%, удельная скорость роста в среднем в пределах 0,15-0,20 сут."1, индекс роста в среднем в пределах 4,006,00.

2. Проведено масштабирование и впервые осуществлено длительное (до 8-12 циклов субкультивирования) непрерывное выращивание суспензионных культур клеток P. japonicus и D. deltoidea «отьемно-доливным» методом в пилотных и полупромышленных аппаратах при сохранении высокой продуктивности штаммов по биомассе

клеток и целевым вторичным метаболитам. Показана стабильность и воспроизводимость основных показателей штаммов при выращивании по предложенной схеме.

3. Отработана и усовершенствована технология длительного непрерывного выращивания суспензионной культуры клеток Polyscias fllicifolia «отьсмно-доливным» методом в полупромышленных аппаратах объемом 630 л при сохранении высокой продуктивности по клеточной биомассе.

4. На примере аппаратного культивирования клеток D. deltoidea показана зависимость активности цианидрезистентного дыхания от условий выращивания, в частности - от массообменных характеристик систем культивирования. Показана возможность использования этого показателя для мониторинга физиологического состояния культуры при масштабировании процесса выращивания.

5. Показано, что предпочтительной системой для длительного непрерывного глубинного культивирования клеток Dioscorea deltoidea, Polyscias fllicifolia и Panax japonic-its являются барботажные биореакторы с кольцевыми аэраторами — для аппаратов именно этого типа получены наиболее высокие ростовые и биосинтетические показатели отобранных штаммов.

6. С использованием трех культур клеток высших растений, относящихся к различным таксономическим группам, показано, что переход к аппаратурному выращиванию можно проводить по единой технологической схеме с учетом индивидуальных особенностей штаммов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ В журналах, рекомендованных ВАК:

Титова М.В., Шумило H.A., Куличенко И.Е., Коростелев В.В., Орешников A.B., Носов А.М. (2006) Длительное аппаратурное выращивание суспензионной культуры Dioscorea deltoidea Wall в полупроточном режиме. Биотехнология, № 2, с. 28-31

Титова М.В., Шумило H.A., Черняк Н.Д., Кривохарченко A.C., Орешников A.B., Носов A.M. (2007) Использование криосохранения для поддержания стабильности штамма при аппаратном культивировании суспензии клеток Polyscias fllicifolia Bailey: 1.Оценка ростовых характеристик возобновленной культуры. Биотехнология, № 5, с. 60-65

Титова М.В., Решетняк О.В., Осипова Е.А., Осипьянц А.И., Шумило H.A., Орешников A.B., Носов A.M. (2011) Выращивание суспензионной культуры клеток Stephania glabra (Roxb. ) Miers в различных системах: особенности роста и накопления алкалоида стефарина. Биотехнология, № 4, с. 40-46

Титова М.В., Беркович Е.А., Решетняк О.В., Куличенко И.Е., Орешников A.B., Носов A.M. (2011) Дыхательная активность суспензионных культур клеток Рolyscias füicifoia Bailey, Stephania glabra (Roxb.) Miers и Dioscorea deltoidea Wall. Прикладная биохимия и микробиология, том 47, № 1, с. 95-101

Титова М.В., Решетняк О.В., Осипова Е.А., Суханова Е.С., Осипьянц А.И., Шумило H.A., Орешников A.B., Носов A.M. (2012) Глубинное культивирование клеток Stephania glabra (Roxb) Miers: оптимизация гормонального состава питательных сред. Вестник Марийского Государственного Технического Университета, № 1 (14), с. 101107

Кочкин Д.В., Зайцев Г.П., Качала В.В., Чижов А.О., Демидова Е.В., Титова М.В., Чирва В.Я., Носов A.M., Кузнецов Вл В. (2012) Обнаружение гипенозида XVII в суспензионной культуре клеток женьшеня Panax japonicus var. repens. Доклады РАН, том 442, с. 705-708

Сухапова Е.С., Кочкин Д.В., Титова М.В., Носов А.М. (2012) Ростовые и биосинге-тические характеристики разных штаммов культур клеток растений рода Polyscias. Вестник ГТГТУ, №2

В прочих изданиях:

Титова М.В., Шумило H.A., Куличенко И.Е., Орешников A.B., Носов А.М. (2003) Длительное культивирование суспензионной культуры Dioscorea deltoidea Wall в полупроточном режиме. Сборник тезисов докладов VIII Международной конференции «Биологиярастительных клеток in vitro и биотехнология», с. 167-167

Титова М.В., Коростелев В.В., Орешников A.B., Носов A.M. (2003) Культивирование клеток Polyscias filicifolia Bailey в пилотном аппарате отьемно-доливным методом. Сборник тезисов докладов VIII Международной конференции «Биология растительных клеток in vitro и биотехнология», с. 317-317

Tomczyk A., Kropczynska D., Ptak A., Titova M.V., Shumilo N., Oreshnikov A., Nosov A., Furmanova M. (2007) Effect at Polyscias filicifolia extracts on the behavior of the Liaf minor Camereria ohridella Deschka and Dimic on horse chestnut trees. Acta Biologica Cra-coviensia Series Botanica, том 49, № 1, с. 50-60

Титова M.B., Шумило Н.Ан, Куличенко И.Е., Беркович Е.А., Орешников A.B., Носов A.M. (2008) Аппаратное культивирование суспензионной культуры Dioscorea deltoidea Wall. Сборник тезисов докладов Материалы IX конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология», 8-12 сентября 2008 г., Звенигород, Россия, с. 400400

Демидова Е.В., Решетняк О.В., Орешников A.B., Титова М.В., Шумило H.A., Носов A.M. (2008) Выращивание суспензионной культуры клеток Panax japonicus var.repens с использованием сахарозы разной степени очистки в аппарате полупромышленного объема. Сборник тезисов докладов Материалы IX конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология», 8-12 сентября 2008 г., Звенигород, Россия, с. 106106

Решетняк О.В., Титова М.В., Осипова Е.А., Шумило Н.Ан, Коростелев В.В., Осипьянц А.И., Орешников A.B., Носов A.M. (2008) Изучение ростовых и биосинтетических характеристик трех штаммов суспензионной культуры STEPHANIA GLABRA (ROXB.) MIERS. при выращивании в колбах и биореакгорах. Сборник тезисов докла-

дов Материалы IX конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология», 8-12 сентября 2008 г., Звенигород, Россия, с. 322-322

Беркович Е.А., Титова М.В., Куличепко И.Е., Орешников A.B., Носов A.M. (2008) Особенности процесса дыхатм в культивируемых in vitro клетках Dioscorea deltoidea Wall. Сборник тезисов докладов Материалы IX конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология», 8-12 сентября 2008 г., Звенигород, Россия, с. 46-46

Титова М.В., Шумило H.A., Куличенко И.Е., Орешников A.B., Носов A.M. (2009) Оптимизация выращивания суспензионных культур клеток Dioscorea deltoidea Wall и Polyscias filicifolia Bailey в полупроточном режиме в биореакторах различного объема. Труды Никитского Ботанического Сада, том 131, с. 68-73

Titova M.V. (2009) Scale-up of plant cell suspension culture growth for biomass and secondary metabolites production. Сборник Materials of the 1st Worbhop on Molecular Biotechnology /XVBiotechnology Summer School (Gdansk, Poland), c. 58-58

Титова M.B., Суханова E.C., Куличенко И.Е., Решетняк О.В., Носов A.M. (2010) Влияние ингибиторов мевинолина и фомидомицина на биосинтез стероидных глико-зидов в суспензионной культуре клеток Dioscorea deltoidea Wall. Сборник Материалы Международной конференции «Перспективы фитобиотехнологии для улучшения качества жизни на севере», с. 121-125

Суханова Е.С., Титова М.В., Носов A.M. (2010) Исследование суспензионных культур клеток Polyscias fruticosa (L.) Harms и Polyscias filicifolia Bailey. Сборник Материалы Международной конференции «Перспективы фитобиотехнологии для улучшения качества жизни на севере», с. 117-121

Кочкин Д.В., Демидова Е.В., Титова М.В., Носов А.М. (2012) Влияние степени очистки сахарозы на накопление гинзенозидов в культуре клеток PANAX JAPONICUS VAR. REPENS при выращивании в аппаратуре полупромышлешюго объема. Сборник тезисов докладов Материалы Международной конференции "Биология - наука XXI века". Москва, 24 мая 2012, с. 422-423

Подписано в печать:

20.03.2013

Заказ № 8275 Тираж - 150 экз. Печать трафаретная. Объем: 1,5усл.п.л. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Титова, Мария Владимировна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ I ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ ИМ. К.А. ТИМИРЯЗЕВА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

ТИТОВА Мария Владимировна

Физиологические характеристики суспензионных культур клеток Polyscias filicifolia, Рапах japonicus и Dioscorea deltoidea при масштабировании процесса

выращивания.

03.01.05 - физиология и биохимия растений 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

i

h-CN

Диссертация на соискание ученой степени

со m

кандидата биологических наук

со §

Ю

О Р

Научный руководитель:

N

доктор биологических наук, профессор

Носов Александр Михайлович

Москва-2013

СОДЕРЖАНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ 4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8

1.1. Культура растительных клеток in vitro как источник 8 биологически активных соединений

1.2. Глубинное культивирование растительных клеток 11

1.2.1. Особенности физиологического состояния растительных 11 клеток при глубинном культивировании

1.2.2. Вторичный метаболизм в суспензионных культурах 14 растительных клеток

1.3. Технологические аспекты глубинного культивирования 16 растительных клеток.

1.3.1. Оптимизация условий культивирования суспензионных 16 культур растительных клеток

1.3.1.1. Питательные среды 16

1.3.1.2. Физические условия (свет, температура, рН) 21

1.3.1.3. Плотность и возраст инокулята, частота 23 субкулътивирования.

1.3.1.4. Агрегированность и вязкость суспензий 24

1.3.2. Особенности аппаратного глубинного культивирования 26 растительных клеток

1.3.2.1. Типы биореакторов 26

1.3.2.2. Выбор реэ1сима культивирования (периодический, 31 полупроточный, проточный)

1.3.2.3. Стратегия масштабирования процесса культивирования 39

1.4. Краткая характеристика суспензионных культур клеток 47 Dioscorea deltoidea Wall, Polyscias filicifolia В. и Panax japonicus

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 54

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 62

3.1. Изучение ростовых и биосинтетических характеристик 62 суспензионных культур клеток Р./Шы/оНа, Р.}аротсж и В.(1е1Ш(1еа при выращивании в колбах в стандартных условиях

3.2. Изучение физиологических показателей суспензионных 72 культур клеток Р./ИШ/оНа, Р.}аротс№ и В.(1еИо'к1еа при выращивании в биореакторах.

3.2.1. Культивирование штаммов в периодическом режиме. 72

3.2.1.1. Культивирование в лабораторном барботажном 72 биореакторе объемом 20 л.

3.2.1.2. Культивирование в биореакторе с механическим 74 перемешиванием объемом 75 л

3.2.2. Культивирование штаммов в режиме полупротока 76 «отъемно-доливным» способом (многоцикличная схема)

3.2.2.1. Культивирование в лабораторном барботаэююм 11 биореакторе объемом 20 л.

3.2.2.2. Культивирование в биореакторе с механическим 80 перемешиванием объемом 75 л

3.2.2.3. Культивирование в полупромыитенном барботажном 82 биореакторе объемом 630 л

3.2.2.4. Влияние смены систем культивирования на степень 82 агрегированности исследуемых штаммов.

3.2.2.5. Влияние смены систем культивирования на дыхательную 84 активность исследуемых штаммов

3.3.2.6. Влияние смены систем культивирования на накопление 86 вторичных метаболитов у штаммов-продуцентов Р.]аротси8 а О.с1е11о1с1еа

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ. 91

ВЫВОДЫ 98

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ 100

ДИССЕРТАЦИИ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ 104

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Культура клеток высших растений - это экспериментально созданная популяция соматических клеток, нуждающаяся в тщательнейшем изучении. Помимо теоретического интереса к исследованию поведения растительных клеток вне организма, культура клеток имеет прямое практическое значение. Известно, что в настоящее время значительное количество лекарственных препаратов создаются на базе растительного сырья. Между тем возможности их получения сильно ограничены сокращающимися ресурсами дикорастущих растений. В связи с этим культуры клеток лекарственных растений представляют собой перспективный источник биологически активных веществ для нужд косметической, фармацевтической и пищевой промышленности. (Ramachandra et al., 2002; Bourgaud et al., 2001; Collin et al., 2001) Однако успешных примеров масштабного промышленного использования клеток высших растений in vitro немного. Это связано, прежде всего, с трудностью получения штаммов-продуцентов, трудоемкостью работ по оптимизации их выращивания и, наконец, сложностью масштабирования процессов культивирования. Кроме того, известно, что культуры клеток высших растений часто характеризуются нестабильностью процессов роста и синтеза целевых вторичных метаболитов при длительном выращивании. Для решения этих проблем и создания эффективных биотехнологий на основе растительных клеток in vitro необходим комплекс как фундаментальных, так и прикладных работ, в том числе исследование общих закономерностей роста, первичного и вторичного метаболизма клеток растений in vitro; особенностей выращивания в различных системах культивирования; создание оптимальных схем промышленного выращивания. (Verpoorte et al., 2002)

Тем не менее, подобное комплексное изучение культур клеток -продуцентов биологически-активных веществ с учетом как продуктивности и индивидуальных физиологических особенностей клеток in vitro, так и

технологических характеристик используемого оборудования до сих пор не получило широкого распространения.

Большой интерес с практической точки зрения представляют работы по исследованию культур клеток лекарственных растений, синтезирующих тритерпеноиды с высокой биологической активностью - женьшеня Panax japonicus (продуцент гинзенозидов), полисциаса Polyscias Jllicifolia (комплекс биологически-активных соединений, в том числе тритерпеновых гликозидов на основе олеаноловой кислоты) и диоскореи Dioscorea deltoidea (продуцент фуростаноловых гликозидов). Как было показано многочисленными исследованиями, суспензионные культуры клеток Polyscias filicifolia, Panax japonicus и Dioscorea deltoidea обладают достаточно высокими ростовыми и биосинтетическими характеристиками для проведения исследований по изучению возможностей аппаратного выращивания для рентабельного получения клеточной биомассы. (Липский и др., 1985; Орешников и др., 1994; Клюшин и др., 2000) В связи с этим комплексный анализ изменения их физиологических показателей при масштабировании процесса культивирования с учетом технологических ограничений, обусловленных особенностями аппаратурного оформления, представляется актуальной фундаментальной и прикладной задачей.

Цель работы.

Исследовать особенности физиологических характеристик суспензионных культур клеток Polyscias filicifolia, Panax japonicus и Dioscorea deltoidea при длительном выращивании в различных системах (колбах и биореакторах различного типа), провести масштабирование процесса выращивания и отработать эффективную технологию получения клеточной биомассы в аппаратах полупромышленного объема (630 л).

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Охарактеризовать по физиологическим показателям суспензионные культуры клеток Polyscias filicifolia, Panax japonicus и Dioscorea deltoidea при стандартных условиях выращивания (в колбах)

2. Провести сравнительное исследование физиологических и продукционных (по биомассе и целевым продуктам вторичного метаболизма) характеристик суспензионных культур клеток Polyscias filicifolia, Panax japonicus и Dioscorea deltoidea при периодическом и полупроточном режимах выращивания в биореакторах различного типа и объема.

3. Исследовать возможность длительного непрерывного аппаратурного выращивания суспензионных культур клеток Polyscias filicifolia, Panax japonicus и Dioscorea deltoidea при сохранении максимальной продуктивности по клеточной биомассе и целевым продуктам вторичного метаболизма.

Научная новизна.

Впервые проведено комплексное исследование ростовых и биосинтетических характеристик суспензионных культур клеток Polyscias filicifolia, Panax japonicus и Dioscorea deltoidea при полупроточном выращивании в биореакторах различного типа и объема. Показано влияние характеристик биореакторов (интенсивность аэрации и перемешивания, конструктивных особенностей) на физиологические показатели штаммов-продуцентов. Впервые осуществлено длительное непрерывное полупроточное выращивание суспензионных культур клеток Polyscias filicifolia, Panax japonicus и Dioscorea deltoidea в полупромышленных аппаратах при сохранении продуктивности по клеточной биомассе и синтезируемым вторичным метаболитам. Показана воспроизводимость основных ростовых и биосинтетических характеристик при использовании предлагаемой схемы масштабирования процесса культивирования.

Практическая значимость работы.

Отработанная в результате проведенных исследований технология является основой создания технологических регламентов получения биомассы культур клеток Polyscias filicifolia, Panax japonicus и Dioscorea deltoidea глубинным способом в пилотных и промышленных установках. Основные ростовые и физиологические показатели исследованных штаммов, полученные при выращивании в различных системах культивирования, не уступают мировым аналогам разработанных технологий получения биомассы культур клеток высших растений. Полученная в результате проведенных работ биомасса клеток была использована НПК «Биофармтокс» (Санкт-Петербург) при производстве пищевых добавок, обладающих тонизирующими и адаптогенными свойствами.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Культура растительных клеток in vitro как источник биологически активных соединений.

В настоящее время известно более 100 ООО индивидуальных вторичных метаболитов, продуцируемых растениями, и ежедневно продолжается идентификация новых соединений. Это вещества широкого спектра действия с чрезвычайно разнообразным химическим строением. На данный момент наиболее изучены алкалоиды, изопреноиды (терпеноиды) и фенольные соединения, причем каждая из этих групп подразделяется на многочисленные подгруппы и в свою очередь содержит тысячи соединений. Менее изучены растительные амины, небелковые аминокислоты, цианогенные гликозиды, глюкозинолаты, полиацетилены, беталины, алкиламиды, тиофены и др. (Harnischfeger, 2000; Misra, 2009).

Многие из идентифицированных вторичных метаболитов являются экономически важными продуктами и широко используются в фармакологической, косметической и пищевой промышленности, ветеринарии и сельском хозяйстве. Наибольшим спросом пользуются противоопухолевые препараты, адаптогены, иммуностимуляторы и противомикробные препараты. (Harnischfeger, 2000; Kieran, 2001; Kolowe at al., 2008; Newman et al., 2003; Crag et al., 2009; Misra, 2009) Поскольку процессы разработки и внедрения новых синтетических препаратов могут обходиться примерно в 100 млн. американских долларов и занимать около 10 лет, практический интерес к растениям как природному сырью для получения целевых продуктов вполне оправдан.(М18га, 2009)

Постоянно растущий спрос на биологически активные вещества (БАВ) растительного происхождения ведет к возникновению проблемы сохранения дикорастущих видов высших растений-продуцентов и как следствие - к поиску альтернативных возобновляемых источников ценных вторичных метаболитов. Плантационное выращивание позволяет частично решить эти вопросы, однако

получение растительного сырья плантационным способом требует значительных денежных затрат, применения различных гербицидов и инсектицидов, наличия обширных земельных площадей, определенных климатических условий и т.п.. Кроме того, для многих видов плантационных растений показано изменение состава и количества синтезируемых вторичных соедииений по сравнению с дикорастущими видами. Принципиально иные возможности для получения растительных БАВ дает использование культур клеток высших растений.(\\^и et al., 1999; Smetanska, 2008; Vasil, 2008; Baldi et al., 2008; Georgiev et al., 2009)

Клеточные биотехнологии для получения физиологически активных веществ имеют ряд преимуществ по сравнению с использованием традиционного растительного сырья in vivo (Memelink et al., 2001; Kieran, 2001; Chattopadhyay et al., 2002; Georgiev et al., 2009):

• независимость от сезонных, политических, климатических и почвенных условий;

• экологическая чистота производства на основе культуры клеток;

• возможность получения значительного количества биомассы клеток редких и исчезающих видов растений, а также относительно высокие скорости получения биомассы;

• возможность использования для получения клеточной биомассы стандартного оборудования микробиологических производств (биореакторов, постферментационных систем и др.);

• при наличии эффективного промышленного штамма-продуцента -возможность получения более высокого выхода целевого продукта, чем в интактном растении. На основании анализа литературных данных можно отметить следующие способы практического использования культур растительных клеток и тканей:

• получение уже известных соединений вторичного метаболизма; изучение и применение новых путей синтеза уже известных соединений;

• использование культур растительных клеток в качестве систем для биотрансформации как для непосредственного получения конечного продукта (трансформация В-метилдигитоксина в В-метилдигоксин), так и в качестве промежуточного звена химического процесса (синтез дигоксина и т.д.).

Таким образом, существующие методы субкультивирования изолированных растительных клеток и тканей позволяют широко использовать их как для фундаментальных исследований, так и для практического применения. (Fulzele et al., 1992; Chattopadhyay et al., 2002 ; Zhong, 2001; Smetanska, 2008; Huang et al., 2009).

1.2. Глубинное культивирование растительных клеток.

1.2.1. Особенности физиологического состояния растительных клеток при глубинном культивировании.

При глубинном культивировании клеток высших растений используют основные методические приемы глубинного культивирования микроорганизмов. (Перт, 1978; Mustafa et al., 2011)

Большинство суспензионных культур клеток получают путем переноса в жидкую среду каллусной ткани рыхлого типа, которая при постоянном перемешивании в дальнейшем относительно легко фрагментируется на отдельные клетки и небольшие агрегаты. Облегчает суспендирование исключение из питательных сред или уменьшение концентрации ионов кальция и цитокининов, увеличение содержания ауксинов, а также добавление в среду пектиназы, разрушающей пектат кальция. Для некоторых исследований используют суспензии, полученные напрямую из листовых эксплантов (Dixon, 1985; Chattopadhyay et al., 2001; Mustafa et al., 2011)

Потенциально при помощи указанных методов можно получать большое количество клеток, содержащихся в относительно одинаковых контролируемых условиях и удобных для отбора, причем соотношение отдельных клеток и клеточных агрегатов в суспензии зависит от видовой принадлежности растения и условий культивирования. (Chattopadhyay et al., 2001; Mustafa et al., 2011) Важным их преимуществом при выделении и очистке целевых продуктов метаболизма является отсутствие у большинства суспензионных культур клеток хлорофилла и каротиноидных пигментов.

Клетки растений в суспензионных культурах имеют тенденцию к агрегации, что приводит к неоднородности их метаболического состояния, часто в клетках наблюдают полиплоидию и другие хромосомные изменения. (Dixon, 1985; Mustafa et al., 2011) Подобная гетерогенность системы частично обусловлена межклеточными взаимодействиями, кроме того при глубинном культивировании невозможно достичь полной синхронности деления и дифференцировки клеток, так

как в суспензии обычно содержатся клетки, различающиеся по времени вхождения в митоз. В зависимости от целей исследования условия культивирования и состав питательных сред подбирают так, чтобы в суспензии преобладала определенная фракция клеток. (Ayaydin et al., 2011)

Несмотря на морфологическую и физиологическую гетерогенность внутри клеточной популяции, показано, что рост суспензионных культур растительных клеток однозначно описывается типичной S-образной кривой. (Бутенко, 1964; Mustafa et al., 2011; Носов, 2012) Формы реальных ростовых кривых отличаются продолжительностью фаз роста и определяются генетикой популяций, количеством инокулюма и составом питательных сред. (Носов, 2012)

Для суспензионных культур растительных клеток выделяют следующие типичные фазы ростового цикла: (Носов, 2012)

• Латентная фаза (лаг-фаза). В этот период клетки не размножаются, отсутствует их видимый рост, но происходит активный процесс поглощения воды и питательных веществ.

• Экспоненциальная (логарифмическая) фаза роста. Это ограниченный период в ростовом цикле периодической (накопительной) культуры, в ходе которого происходит экспоненциальное (логарифмическое) увеличение количества клеток за счет их интенсивного деления, и как следствие -увеличение сухого вещества.

Различают раннюю и позднюю экспоненциальные фазы. В течение ранней экспоненциальной фазы наблюдается ряд цитологических изменений: в клетках исчезает большая вакуоль, происходит увеличение объема цитоплазмы, увеличивается число полирибосом и митохондрий. Наряду с цитологическими изменениями имеет место и активация клеточного метаболизма: увеличивается содержание РНК, �