Антимутагенный потенциал биокомплексов растительного и животного происхождения в микробных тест-системах

Фатыхова, Диана Газинуровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Антимутагенный потенциал биокомплексов растительного и животного происхождения в микробных тест-системах
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Антимутагенный потенциал биокомплексов растительного и животного происхождения в микробных тест-системах"

ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

005009667

ФАТЫХОВА ДИАНА ГАЗИНУРОВНА

АНТИМУТАГЕННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ БИОКОМПЛЕКСОВ РАСТИТЕЛЬНОГО И ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ В МИКРОБНЫХ

ТЕСТ-СИСТЕМАХ

03.02.03 - микробиология

2 С Я г! 3 2012

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань-2012

005009667

Работа выполнена на кафедре микробиологии биолого-почвенного факультета ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет».

Научный руководитель: Доктор биологических наук, профессор академик АН РТ Ильинская Ольга Николаевна

Официальные оппоненты: Доктор ветеринарных наук, профессор Госманов Рауис Госманович

Защита диссертации состоится «22» февраля 2012 г. в 13-00 часов на заседании диссертационного совета Д.212.081.08 при ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18, главное здание, ауд. 211.

Факс 8(843)238-71-21,233-7840. E-mail: fadi@bk.ru

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского Казанского федерального университета

Кандидат биологических наук, доцент Кипенская Лариса Викторовна

Ведущая организация: Инсппуг биологии Уфимского научного центра РАН, г.Уфа

Автореферат разослан «_» января 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

3. И. Абрамова

Актуальность. В настоящее время в биосфере идёт прогрессивное накопление химических соединений антропогенного происхождения, многие из которых обладают мутагенными свойствами. Известно, что химические вещества могут индуцировать генные, хромосомные и геномные мутации, обладая высокой специфичностью действия [Болтина, 2009]. Поэтому поиск антимутагенов -веществ, защищающих генетический аппарат соматических и половых клеток человека от повреждения - является необходимым. Открытие новых веществ, снижающих частоту индуцированных мутаций, быстро растет, и к настоящему времени их насчитывается более 300 природных и синтетических антимутагенных соединений: витаминов, аминокислот, естественных метаболитов, пищевых добавок, лекарств и некоторых других соединений органической и неорганической природы [Бентхен, 1986; Arriaga-Alba, 2000].

Особую актуальность и значимость приобретает проведение профилактики мутагенеза на основе применения природных соединений растительного и животного происхождения. В последние годы возрос интерес к исследованию антимугагенной активности растительных и животных компонентов в свете возможности использования их для профилактики и лечения онкологических, а также ряда других заболеваний, сопровождающихся повышенной чувствительностью генома к повреждениям. Растения являются источниками разнообразных биоактивных соединений (витамины, полисахариды, гликопептиды, аминокислоты, сульфиды, сапонины, полифенолы, терпеноиды, изофлавоны, индолы и др.), обладающих антиоксидантными, антимутагенными, антиканцерогенными и иммуномодулирующими свойствами [Santos-Cervantes et al., 2007]. Перспективность использования растительных препаратов в медицине обусловлена также возможной минимизацией их токсических эффектов в млекопитающих, что объясняется сходным химическим составом биологически активных веществ живых организмов, а также определенным сродством метаболизма растительной и животной клетки [Коломиец, Ефимов, 2005]. Биокомплексы животного происхождения также обладают антиоксидантной и иммуностимулирующей активностью, проявляют антисептическое действие и используются в качестве лекарственных средств и биологически активных комплексов. Пчелиная перга обладает выраженными антитоксическими свойствами, способствует повышению содержания в крови эритроцитов, ретикулоцитов и гемоглобина, обеспечивает нормализацию количества лейкоцитов и лейкоцитарной формулы [Хисматуллина, 2005]. Роговое вещество копытных животных издавна является привлекательным материалом как источник биологически активных веществ. Экстракты из рогов сайгака используют для лечения нервных заболеваний, а также как жаропонижающее и гипотензивное средства [Романов, 2005; Романов, Лебедева, 2003]. Однако природа и спектр биологической активности препаратов растительного и животного происхождения изучены недостаточно.

В связи с вышеизложенным целью настоящей работы явился сравнительный анализ антимутагенных свойств биокомплексов, полученных из пчел, парнокопытных млекопитающих и растений для оценки потенциала их практического использования.

В связи с поставленной целью решались следующие задачи: 1.Определить токсические, генотоксические и антимутагенные эффекты биокомплекса пчелиной перги в бактериальных тест-системах (тест Эймса, SOS-хромотест).

2.Выявить токсические свойства лекарственных соков и экстрактов растений (Plantage major, Tussilage farfara, Dioscorea deltoidea, Polyscias filicifolia, Panax japonicus, Hyssopus officinalis) по отношению к грамположительным и грачотрицатсльным бактериям.

3.Усгановить возможность модуляции уровня индуцированных мутаций различными растительными соками и экстрактами (Aloe arborescens, Callisia jragrans, Chelidonium majus, Plantago major, Âegopodium podagraria, Tussilage faijara, Dioscorea deltoidea, Polyscias fruticosa, Polyscias filicifolia, Panax japonicus). Охарактеризовать антимутагенные свойства экстрактов рогов сайгака Saiga tatarica L. до и после периода гома животных.

5.Проанализировать антимутагенные эффекты и оценить потенциал практического использования биокомплексов, полученных из пчёл, растений и парнокопытных млекопитающих.

Научная новизна. Впервые установлены десмутагенные, биоантимутагенные и биостимулирующие эффекты биокомплекса пчелиной перги для исследуемых концентраций 1, 10 и 100 мкг/мл в бактериальных тест-системах на штаммах Salmonella typhimurium ТА100 и Escherichia coli PQ37. Для исследуемых соков и экстрактов растений Callisia jragrans, Tussilage farfara, Chelidonium majus, Dioscorea deltoidea, Polyscias filicifolia и Panax japonicus впервые получены данные об антимутагенных свойствах, выявленных в различных микробных тест-системах (тест Эймса, SOS-хромотест, Rec тест). Впервые получены свидетельства о наличии десмутагенных эффектов у экстракта рогов сайгака возрастом 19 месяцев до периода гона в отношении известных мутагенов N-Meran-N'-Hinpo-N-нитрозогуанидина (МННГ) и Ы4-аминоцитидина (Ац) в тесте Эймса на штамме Salmonella typhimurium ТА100. В данной работе исследуемые биокомплексы растительного и животного происхождения впервые предложены к разработке как антимутагенные препараты.

Практическая значимость. Основным практическим достижением настоящей работы является обнаружение и характеристика антимутагенных эффектов биокомплексов, полученных из пчёл, растений и парнокопытных млекопитающих. Установленные результаты в совокупности с данными, свидетельствующими об отсутствии у исследованных биокомплексов токсических и мутагенных свойств, открывают очевидную перспективу их использования для профилактики индуцированного мутагенеза у человека. Таким образом, биокомплексы растительного и животного происхождения могут быть рекомендованы к разработке как антимутагенные препараты. Учитывая полученные нами данные уже существующие лекарства и биологически активные добавки, содержащие в своем составе биокомплексы, полученные из пчёл, растений и парнокопытных млекопитающих, также могут рассматриваться в качестве антигенотоксических и генопротекторных препаратов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Биокомплекс пчелиной перги обладает десмутагенными, биоаитимутагенными и биостимулирующими свойствами, снижая частоту индуцированных мутаций на 78%.

2.Из десяти исследуемых растений наибольшей антимутагенной активностью обладали соки Callisia fragrans, Chelidönium majus, Tussilago /arfara и экстракты Dioscorea deltoidea, Polyscias fllicifolia, Panax japotiicus. Максимальная антимутагенность снижения частоты мутаций до 88% продемонстрирована для сока чистотела большого.

3.Среди экстрактов рогов сайгака Saiga tatarica L., исследуемых в возрасте животных от 19 до 43 месяцев, десмутагенную активность в отношении аналогов азотистых оснований проявил экстракт рогов 19-месячного сайгака до периода гона, уменьшающий мутагенный эффект на 31%.

4.Биокомплексы растительного и животного происхождения являются перспективной основой для разработки антимутагенных препаратов, эффективность которых зависит от физиологических и биохимических характеристик биообъекта.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования.

Работа выполнена в соответствии с тематическим планом КФУ, регистрационный номер 01200955076, «Механизмы регуляции функциональной активности клеток» при поддержке AB ЦП «Развитие научного потенциала высшей школы» (2.1.1/920), государственного контракта №02.740.11.0391, совместного гранта Министерства образования и науки Российской Федерации. Биохимический анализ биокомплекса пчелиной перги проводили на базе института фармакологической аналитики г. Бремен, Германия. Биохимический анализ биокомплекса экстрактов рогов сайгака Saiga tatarica L. проводили на базе Калмыцкого государственного университета, г. Элиста Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на 79-ой всероссийской студенческой конференции, (Казань, 2005), XLIII Международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс" (Новосибирск, 2005), итоговой конференции КГУ (Казань, 2006), П-ой Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008), Международной конференции "Развитие междисциплинарных исследований: перспективные направления и вклад DAAD" (Казань,2009), научной школе-конференции XIII симпозиума студентов и аспирантов - биологов Европы «SymBioSE - 2009» (Казань,

2009), Международной научно-практической конференции "Научное обеспечение устойчивого ведения сельскохозяйственного производства в условиях глобального изменения климата" (Казань,2010), 1П Всероссийского конгресса с международным участием студентов и аспирантов-биологов "Симбиоз-Россия" (Нижний Новгород,

2010), Всероссийской научно-практической конференции "Инновационные разработки молодых ученых - АПК России" (Казань,2010), а также на Первой Всероссийской молодёжной научной конференции "Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии" (Томск, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 научных работ, из них 2 статьи в центральных отечественных рецензируемых журналах: Экологическая генетика; Ученые записки Казанского университета. Секция Естественные науки.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела экспериментальных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 125 страницах машинописного текста, включает 10 таблиц, 28 рисунков. Библиография содержит 133 наименований, в т.ч. 57 -зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1.1. Тсстсрные штаммы

Бактериальные штаммы, использованные в работе, перечислены в таблице 1.

Таблица 1.

№ Штамм Генотип Источник

1 Salmonella tvphimurium ТА 100 his G46, rfa, юг, bio, pkm 101 НИИ по БИХС г. Купавна

2 Escherichia coli PQ37 sfi A: :mud (Ap lac) eis, lac A 0169, mal*, uvr A, gal Y, pho C, rfa Институт общей генетики, г. Москва

X Micrococcus lute us дикий тип Коллекция кафедры микробиологии КГУ

4. Escherichia coli WP2 trpE65 НИИ экологии микроорганизмов УНЦ РАН, г. Пермь

5. Escherichia coli polA trpE6S, su!, malB, pol A НИИ экологии микроорганизмов УНЦ РАН, г. Пермь

6. Escherichia coli uvrA trpE65, sal, wrA155 НИИ экологии микроорганизмов УНЦ РАН, г. Пермь

7. Escherichia coli recA trpE65, recA НИИ экологии микроорганизмов УНЦ РАН, г. Пермь

12. Биологические объекты

1.2.1. Растительный материал. В работе использованы сока лекарственных растений алоэ древовидного (Aloe arborescens), золотого уса (Callista fragrans), чистотела большого (Chelidonium majus), подорожника большого (Plantago major), мать-и-мачехи обыкновенной (Tussilago farfaro), сныти обыкновенной (Aegopodium podagrariá) и экстракты диоскореи дельтовидной (Dioscorea deltoideá), полисциаса кустарникого (Polyscias fruticosa), полисциаса папоротниколистного (Polyscias filicifolia), женьшеня японского (Panax japonicus), любезно предоставленные доцентом кафедры физиологии и биотехнологии растений Казанского государственного университета Абдрахимовой Й.Р. Перед исследованием соки растений разводили стерильной дистиллированной водой до концентрации 1:10 и 1:100. Экстракты исследуемых растений разводили в стерильной дистиллированной воде до концентраций 1; 0,1 и 0,01 мг/мл.

1.2.2. Экстракты рогов, сайгака Saiga talarica L. В работе использовали экстракты, полученные из рогов сайгаков, любезно предоставленные Романовым

Олегом Ермолаевичем, к.х.н., доцентом кафедры химии Калмыцкого госуниверситета. Оценивали антимутагенную активность следующих биокомплексов животного происхождения: 1.7ДГВ - экстракт верхней трети рогов сайгака, отобранных у животных возрастом 1 год и 7 месяцев до гона; 3.7ДГВ □ экстракт верхней трети рогов сайгака, отобранных у животных возрастом 3 год и 7 месяцев до гона; 1.7ПГВ - экстракт верхней трети рогов сайгака, отобранных у животных возрастом 1 год и 7 месяцев после гона

1.2.3. Приготовление образцов пчелиной перги. Образцы биокомплекса пчелиной перги были любезно предоставлены ООО "АНТ". Образцы разводили в стерильной дистиллированной воде. В работе были исследованы следующие концентрации 1; 10; 100; 1000 мкг/мл.

1J. Бактериальные тест-системы для определения токсических и мутагенных эффектов соединений природного происхождения

1.3.1. Тест на токсичность по отношению к грамотрицателъным и грамположителъным микроорганизмам. О силе токсического действия исследуемых биокомплексов судили по выживаемости тестерных штаммов. В тесте использовали штамм Salmonella typhimurium ТА 100 и Micrococcus luteus. Согласно рекомендациям по проведению теста Эймса максимальная доза исследуемых соединений не должна подавлять рост тестерных бактерий более чем на 50% [Дурнев с соавт., 2003].

1.3.2. Полуколичественный метод учета генных мутаций (тест Эймса). Мутагенную активность- учитывали по кратности превышения числа-индуцированных реверташов над спонтанным фоном мутирования [Maron, Ames, 1983]. Для исключения артефактов в тесте Эймса в образцах определяли количественное содержание гистидина по методу, разработанному Ильинской и др. [Ильинская с соавт., 2001].

1.3.3. SOS-хромотест. Проведение эксперимента и приготовление сред вели по методике, описанной в работе Миллера [Миллер, 1976] и Килардье [Quillardet et al., 1982]. Фактор индукции SOS-ответа (IF) исследуемого вещества определяли по соотношению активности конститутивной щелочной фосфатазы и индуцибельной |J-галактозидазы. Если IF < 2 - вещество негенотоксично, IF > 2 — вещество генотоксично [Mersch-Sundermann et al., 1991; Bouhlel et al., 2007].

1.4. Бактериальные тест-системы для определения антимутагенных эффектов соединений природного происхождения

1.4.1. Модификации теста Эймса. Дги изучения антимутагенных свойств соединений растительного и животного происхождения использовали модификации теста Эймса: 1. Тестерные бактерии предварительно инкубировали с разными концентрациями биокомплексов в течение 2 часов, а затем в верхний агар добавляли один из мутагенов для оценки биоантимутагенного эффекта. 2. Исследуемые концентрации биокомплексов и один из мутагенов добавляли непосредственно в верхний агар без предварительной инкубации с тестерным штаммом для оценки возможных десмутагенных свойств. Ангимутагенный эффект исследуемого соединения оценивали, сравнивая число колоний прототрофов, индуцированных мутагеном без обработки клеток раствором исследуемых соединений, и после преинкубации клеток с раствором и мутагеном. Согласно Negi [Negi et al., 2003] ингибирование мутагенного эффекта менее чем на 25% свидетельствует о слабой, от 25% до 40% о средней, выше 40% - о сильном антимутагеном эффекте.

1.4.2. Модификации SOS-хромотеста. 1. Клетки Е. coli PQ37 были обработаны исследуемыми биокомплексами в течение 2 часов с последующим добавлением мутагена для исследования на биоантимутагенную активность. 2. Исследуемые биокомплексы и мутаген были одновременно добавлены к культуре клеток К coli PQ37. Антигенотоксический эффект растительных соков в SOS-хромотесте оценивали согласно формуле [Bouhlel et al., 2007]: сравнивали фактор индукции SOS-ответа в присутствии мутагена и исследуемых образцов,: и фактор индукции SOS-ответа при действии только мутагена

1.4.3. Ree тест. На чашки Петри с полноценной агаризованной средой засевали газоном культуры тестерных бактерий. В середину чашки на поверхность газона помещали стерильный бумажный диск (d = 2 см). Для оценки десмутагенного действия на диски одновременно наносили мутаген и исследуемые образцы в различных разведениях. Чашки Петри инкубировали 24 часа при температуре 37°С. Антигенотоксический эффект оценивали, сравнивая размеры зон ингибирования роста штамма вокруг диска при совместном действии мутагена и исследуемых

• биокомплексов и при действии только мутагена.

13. Статистический анализ данных

Статистическую обработку результатов проводили в стандартной компьютерной программе Microsoft Office Excel 2007. Данные представлены в виде среднего значения, + среднеквадратическое отклонение. Для оценки достоверности различий между результатами в вариантах опыта использовали t-критерий Стьюдента для множественных сравнений. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез был принят за р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Антимутагенные эффекты биокомплекса, полученного из пчел

Перед исследованием антимутагенных свойств биокомплексов растительного и животного происхождения нами была проведена оценка токсического эффекта образцов биокомплексов в отношении тестерных бактерий, а также генотоксического потенциала образцов в бактериальных тест-системах.

2.1.1. Токсический эффект пчелиной перги по отношению к тестерному штамму Salmonella typhimurium TAI00

Во всех исследованных концентрациях процент выживаемости тестерного штамма составил более 100% (табл.1). Полученные данные свидетельствуют о том, что биокомплекс, полученный из пчел, не только не проявил токсических эффектов на штамме S. typhimurium ТА100 в исследованном спектре концентраций, но и стимулировал рост бактерий.

Таблица 1.

Влияние пчелиной перги на рост штамма S. typhimurium ТА 100

Концентрация вещества, мкг/мл 1 10 100 1000 Контроль

Количество КОЕ на чашку 40±2 44±3 41±1 43±5 39±6

Выживаемость,% 102 113 105 110 100

2.1.2. Мутагенные и генотоксические эффекты бнокомплскса пчелиной перги в тесте Эймса н 808-хромотесте

При исследовании пчелиной перги в тесте Эймса было" показано, что число индуцируемых пчелиной пергой в концентрациях 1, 10, 100, мкг/мл Шв+ревертантов, не превышало спонтанный фон мутирования (рис.1). Так как число колоний-ревертантов в опыте и контроле различаются менее чем в 2.5 раза, то можно считать, что исследованные образцы перги не обладают мутагенной активностью в тесте Эймса. В 508-хромотесте пчелиная перга ни в одной из исследуемых концентраций не проявила активности и не индуцировала значительный ЗОЭ-отвст в клетках тестерного штамма Е. соН Р()37, что указывает на отсутствие генотоксических свойств исследуемого биокомплекса животного происхождения (рис.2).

Таким образом, на основании результатов, полученных в различных бактериальных тест-системах (тест Эймса, ЗОБ-хромотест), исследованный биокомплекс пчелиной перги можно охарактеризовать как нетоксичный и немутагенпый в широком диапазоне концентраций (1-100 мкг/мл).

1800 3? |<*0 ■

?. 1-Й)

е.120

11040 & 8» 3 >«п ¡? 400 200

10 8

Ь"4

2 О

-гт

НК I I» К«) ПК

Пкля|г.1япфга,мкг/мч

Рис 1. Оценка мутагенного эффекта пчелиной перги в тесте Эймса. ПК - позитивный контроль 01-Мстил-Ы >-нитро-Ы-нитрозог7анидин -МННГ, 50 мкг/мл), НК - негативный контроль (спонтанный фон ревертантов), на данном и последующих рисунках: * - достоверно отличается от позитивного контроля, р<0,05.

1 10 100. ПК Пчелиная перга, мкг/мл

Рис.2. ЗОЭ-индуцирующий потенциал пчелиной перги. ПК - позитивный контроль: митомицин С (МС) - 100 мкг/мл, НК (пунктирная линия) - негативный контроль (спонтанный фон индукции БОЗ-ответа).

2.13. Антимутагенное действие биокомплекса, полученного из пчел, в тесте Эймса

А) Биоантимутагенное действие

Б) Десмутагенный эффект

„• 400 ч = 3

3 3 300

I "а

| е 200

* я

§ Е 100 н 51 о

НК 1 10 100 ПК Пчелиная перга, мкг/мл

Л 3

X « X Т И «

400

200

НК 1 10 100 ПК

Пчелиная перга, мкг/мл

Рис. З.Влияние пчелиной перги на мутагенную активность МННГ в тесте Эймса: А) вариант предварительной инкубации тестерных бактерий с исследуемым биокомплексом с последующим добавлением МННГ; Б) вариант одновременного действия пчелиной перги и МННГ на клетки тестерных бактерий. ПК - позитивный контроль (МННГ, 50 мкг/мл), НК - негативный контроль (спонтанный фон ревертантов).

Биокомплекс, полученный из пчел, обладает статистически достоверным выраженным биоантимутагенным эффектом, снижая число колоний-ревертантов, индуцированных М-Метил-]М'-нтро-М-нитрозогуанидином (МННГ) на 67-73% (рис.ЗА). Во второй модификации теста биокомплекс пчелиной перги показал десмугагенную активность, снижая число колоний-ревертантов, индуцированных мутагеном на 55-57% (рис.ЗБ).

2.1.4. Антигенотоксическое действие пчелиной перги в SOS-хромотесте

В целях определения предположительного механизма антигенотоксических эффектов пчелиной перги SOS-хромотест проводился в различных модификациях (вариантах). Инкубация культуры клеток Er coli PQ37 с бикомплексом пчелиной перги в течение 2 ч. приводила к практически полному исчезновению мутагенного действия классического индуктора SOS-отвега клеток митомицина С (MC). Фактор индукции SOS-ответа MC при предварительной инкубации культуры клеток с 100 мкг/мл исследуемого биокомплекса составлял 0.8 ед., в то время как IF для позитивного контроля достигал 4.5 ед. (рис.4А). Результаты экспериментов при одновременном внесении MC и пчелиной перги (рис.4Б) подтверждают наличие у исследуемого биокомплекса десмутагенного эффекта, показанного нами ранее во второй модификации теста Эймса (рис. ЗБ). При одновременном добавлении перги и MC к культуре клеток Е. coli PQ37 наблюдалось статистически достоверное снижение фактора индукции SOS -ответа на 62-68%.

А) Биоантимутагенное действие' Б) Десмутагенный эффект

щ W

т Ы

-нк

1 10 100 Пчелиная перга, мкг/мл

1 100 Пчглипая перга, мкг/мл

Рис.4. Влияние пчелиной перги на SOS-ивдуцирующую активность МС: А) вариант предварительной инкубации тестерных бактерий Е. coli PQ37 с исследуемым биокомплексом с последующим добавлением МС; Б) вариант одновременного действия пчелиной перги и МС на клетки Е. coli PQ37. ПК - позотивный контроль: митомицин С (МС) - 100 мкг/мл, НК (пунктирная линия) - негативный контполь (спонтанный Лон инлукпии SOS-ответаУ

2.2. Антимутагснное действие биокомплекса, полученного нз парнокопытных млекопитающих

2.2.1. Токсическое действие экстрактов рогов сайгака Saiga Marica L.

Выживаемость тестерного штамма S. typhimurium ТА100 при действии исследуемых экстрактов в концентрациях 10, 100, 500 мкг/чашку лишь незначительно отличалась от такового в контрольном варианте и составила 95 %, 92.5 %, 91 % для 1.7 ДГВ; 97 %, 95%, 93.5 % для 1.7 ПГВ, соответственно, что свидетельствуют о возможности тестирования экстрактов в данных концентрациях на антимутагенную активность в тесте Эймса (рис.5).

г? 105

I 100 i

<я а.

1 95 ^

® 90

И 1.7 ПГВ 01.7ДГВ И3.7ДГВ

Рис.5. Токсичность экстрактов рогов сайгака Saiga laiarica L. в возрасте 19 месяцев до и после периода гона и в возрасте 43 месяцев до периода гона животных по отношению к Salmonella typhimurium ТА100

Юмкг/ил 100мкг/мл 500мкг/мл

2.2.2. Биоантимутагенное действие исследуемых экстрактов

Концентрация свободного гистидина в исследованных образцах ниже критической и, следовательно, не может быть причиной артефактов в тесте Эймса. При тестировании экстрактов 1.7 ДГВ и 1.7 ПГВ в тесте Эймса с преинкубацией установлено, что экстракты во всем диапазоне исследованных концентраций ингибируют мутагенный эффект МННГ менее чем на 25 %, что свидетельствует об отсутствии биоантимутагенного эффекта.

2.2.4. Десмутагенное действие исследуемых экстрактов

I-

Рис. 6. Десмутагенный эффект экстракта 1.7 I в отношении МННГ (5 мкг/чашку) в тесте Эймса - негативный контроль (спонтанный фон 1рования). 1 - МННГ+1.7 ДГВ 10 мкг/чашку, 2 -НГ+1.7 ДГВ 100 мкг/чашку, 3 - МННГ+1.7 ДГВ мкг/чашку. % - Антимутагенный эффект.

Рис. 7. Десмутагенный эффект экстракта 1.7 ДГВ в отношении Ац (1 мкг/чашку) в тесте Эймса. НК - негативный контроль (спонтанный фон мутирования). 1 - Ац+1.7 ДГВ 10 мкг/чашку, 2 -Ац+1.7 ДГВ 100 мкг/чашку, 3- Ад+1-7 ДГВ 500 мкг/чашку.

Как видно из результатов, представленных на рис. 6, экстракт 1.7 ДГВ статистически достоверно снижает мутагенный эффект МННГ в клетках тестерного штамма S. typhimurium ТА100 на 23%, 27%, 31 % в концентрации 10 мкг/чашку, 100 мкг/чашку и 500 мкг/чашку соответственно. При совместном действии N4-аминоцитидина (Ац) и экстракта 1.7 ДГВ на тестерные бактерии мы также наблюдали заметное уменьшение числа колоний индуцированных мутантов (рис.7). Экстракт 1.7 ДГВ снижает мутагенный эффект Ац в концентрации 10 мкг/чашку на 24%, а в наивысшей из исследованных концентраций 500 мкг/чашку - до 39%. Второй исследованный нами экстракт - 1.7 ПГВ - не оказывал существенного влияния на уровень мутагенеза, индуцированного МННГ и Ац в клетках тестерных

бактерий. Таким образом, анализ полученных результатов показывает, что из двух исследованных экстрактов только экстракт 1.7 ДГВ демонстрирует средний десмутагенный эффект, до 39% снижая мутагенную активность известных мутагенов МННГ и Ац. Следует отметить, что обнаруженный нами эффект носит дозо-зависимый характер.

23. Антимутагениые эффекты биокомплексов растительных соков и экстрактов

23.1.Токсическое действие экстрактов и соков лекарственных растений по отношенню к грамотрицательным и грамположнтельным микроорганизмам

Соки и экстракты биокомплексов растительного происхождения проявили различные эффекты по отношению к штамму S. typhimurium ТА100. Сок мать-и-мачехи обыкновенной (Т. farfaro) оказал стимулирующее действие на рост бактерий, разница с контролем составила 26.4% (табл. 2). Сок подорожника большого (Р. major), проявил бактерицидные свойства, выживаемость тестерного штамма сократилась на 30.7%. Экстракты диоскореи дельтовидной (D. deltoidea), иссопа лекарственного (Я. officinalis),женьшеня японского (P. japonicus) и полисциаса папоротниколистного (P. filicifolia) не оказали значительного влияния на выживаемость тестерного штамма.

Таблица 2.

Выживаемость штамма S. typhimurium ТА100 под действием соков и экстрактов лекарственных растений

Таблица

Выживаемость М. luteus п действием экстрактов и соков лекарственн

расген

Вариант Среднее кол-во колоний/чашку Выживаемость, %

Контроль 400.25±13.9 100

Plantago major 277.25±15.3 69.3

Dioscorea deltoidea 382±14 95.4

Tussilagp farfaro 506±8.5 126.4

Polyscias filicifolia 395.5±15.6 98.8

Panax japonicus 404.25±7 100.9

Hyssopus officinalis 422.25±8.6 105.4

Вариант Среднее кол-во колоний'чашку Выживаемосп %

Контроль 1257.75±31.2 100

Plantago major 1337.5±31,5 106.3

Dioscorea deltoidea 1155.25±17 91.9

Tussilago farfara 1132.75±16.4 90

Polysciasfilicifolia 1289.5±13.3 102.4

Panax japonicus 1264.75±2023 100.5

Hyssopus officinalis 1272.25±22.4 101.2

В результате токсикологического анализа исследуемых соков и экстрактов лекарственных растений на грамположительном штамме М. luteus было выявлено, что сок мать-и-мачехи обыкновенной (Т. far far а) проявил бактерицидные свойства, разница с контролем составила 10% (табл.3). Экстракт диоскореи дельтовидной (D. deltoidea) оказал ингибирукнцее действие на рост бактерий, выживаемость сократилась на 8.1%. Подорожник большой (P. major), полисциас папоротниколистный {P. filicifolia), иссоп лекарственный (Я. officinalis) и женьшень японский (P. japonicus) не оказали существенного влияния на рост М. luteus.

23.2. Генотоксические эффекты соков исследуемых растений

Из результатов, представленных на рис.8 видно, что во всех случаях фактор индукции SOS-ответа соков растений алоэ древовидного (Aloe arborescens) и золотого уса (Callisia fragrans) не превышал 2, что свидетельствует об отсутствии генотоксических эффектов у исследованных биокомплексов.

Hin

ffc

-------Я-нк

A A1:1QA1:100 У У1:10У1:10 ПК

Рис. 8. Оценка генотоксического эффекта соков растений в ЭОЗ-хромотесте. ПК - позитивный контроль (налидиксовая кислота □ НС, 60 мкг/мл), НК (пунктирная линия) - негативный контроль (спонтанный уровень БОВ-ответа), А - сок алоэ древовидного, А1:10, А1:100 - сок алоэ древ, в соответствующих разведениях, У - сок золотого уса, У 1:10, У1:100 - сок з. уса в соответствующих разведениях* - Достоверно отличается от позитивного контроля - НС, р<0.05.

233. Антигенотоксические эффекты растительных соков и экстрактов

После предварительной инкубации исследуемых соков лекарственных растений с бактериями Е. coli PQ37, максимальный аптимутагенный эффект был установлен для соков А. arborescens и С. fragrans в разведении 1:10, который выразился в снижении фактора индукции SOS-ответа на 60 и 62% соответственно (рис.9А). При одновременном же добавлении исследуемых соков лекарственных растений и НС наблюдалось снижение уровня индукции SOS-ответа в разведении 1:10 соков А. arborescens (59%) и С. fragrans (62%) (рис.9Б).

5 45 3 5 2 1,5

А) Биоантимутагенное действие

Б) Десмутагенный эффект

■НК

6 5

3 4

Й 3" "" 2

rfl

•НК

А А1:10А1:100 У У1:10У1:100 ПК

IC.9. Влияние соков растений Aloe arborescens и Callisia fragrans на SOS-индуцирующий потенциал НС i: при предварительной обработке клеток Е. coli PQ37 соками растении в течение 2 ч.; Б: при иовременном действии растительных соков и НС на клетки Е. coli PQ37); А - Сок алоэ древовидного и С, А1:10, А1:100 - сок алоэ древ, в соответствующих разведениях и НС; У - сок золотого уса и НС, 1:10,У1:100 - сок з. уса в соответствующих разведениях и НС. ПК - позитивный контроль (НС, 60 кг/мл), НК (пунктирная линия) - негативный контроль (спонтанный уровень SOS-ответа).

Максимальное биоантимутагенное действие было показано для сныти обыкновенной (Aegopodium podagraria) в разведении 1:100 (65%) и чистотела большого (Chelidonium majus) в разведении 1:10 (66%) (рис.ЮА). Эффективность антигенотоксического действия сока чистотела и его разведений 1:10 и 1:100 в SOS хромогесте составляет 79 %, 76 % и 79 % соответственно (рис.1 ОБ). В отличие от С. majus сок растения A. podagraria не показал выраженного десмутагенного действия.

Из результатов, представленных в таблице 4 видно, что сок чистотела большого проявляет десмутагенное действие в Ree тесте. Наивысший эффект наблюдался при совместном действии фурацилина и сока чистотела на штамм polA, дефектный по ДНК-полимеразе I, что выражалось в существенном снижении генотоксического действия фурацилина (90 %). В то же время, нам не удалось обнаружить выраженного десмутагенного эффекта сока чистотела большого при тестировании на штаммах uvrA и гесА (табл. 4).

3,5 -3

.2,5 -

S 2J

fc" 1,5 -10,5 • 0

А) Биоантимутагенное действие

Г*!*

ё3 2

Б) Десмутагенный эффект

fíl

П1

С С1:10С1:100 Ч 41:1041:100 ПК

С С1:10С1:100 Ч Ч1:1СН1:100 ПК

Рис.10. Влияние соков растений Aegopodim podagraria и Chelidonium majus на SOS-индуцирующий потенциал НС (А: при предварительной обработке клеток Е. coli PQ37 соками растений в течение 2 ч.; Б: при одновременном действии растительных соков и НС на клетки Е. coli PQ37); где С - Сок сныти обыкновенной и НС, С1:10,С1:100 - сок сныти обыкн. в соответствующих разведениях и НС). Ч - сок чистотела большого и НС, 41:10,41:100 - сок чистотела бол. в соответствующих разведениях и НС. ПК - позитивный контроль - НС (60 мкг/мл), НК (пунктирная линия) - негативный контроль (спонтанный уровень SOS-ответа).

Таблица 4.

Результаты оценки аетигенотоксического эффекта сока чистотела большого в Ree тесте

Исследуемые соединения Зона ингибирования роста штаммов, мм

WP2 гесА polA uvrA

Фуращшш 1.5±0.10 6.5±0.52 5.5±0.35 6.0±0.54

Сок чистотела и фурацилин 1.0±0.08 5.5±0.45(10%) 1.5±0.12(88%)» 4.5±0.38(23%)

Сок чистотела 1:10 и фурацилин 1.3±0.12 5.0±0.37(26%) 1.7*0.09(90%)* 3.2±0.30(58%)*

Сок чистотела 1:100 и фурацилин 0.5±0.03 3.7±0.21(36%)* 1.3±O.ll(S0%)» 3.0±0.22(45%)*

* - Статистически достоверно отличается от позитивного контроля, Р < 0,05. В скобках приведены показатели эффективности антигенотоксического действия, %.

Из результатов, представленных на рис. НА, видно, что предварительная инкубация клеток тестерных бактерий с соком растений подорожника большого (Plantago major) снижала фактор индукции SOS-ответа в 1,6-2 раза Антигенотоксический эффект сока данного растения, как неразбавленного, так и в разведениях 1:10 и 1:100 составил 55 %, 36 % и 39 %, соответственно. При исследовании сока растений мать-и-мачехи (Tussilago farfara) установлено, что разведение сока приводит к повышению его биоашимутагенной активности, эффективность антигенотоксического действия достигала 86 %. Одновременное добавление сока растений P. major к культуре клеток Е. coli PQ37 не вызывал заметного снижения генотоксического эффекта НС (рис.ИБ). Сок растений Т. farfara проявил десмутагенный эффект, что выразилось в снижении фактора индукции SOS-ответа клеток £ coli PQ37 в 2 раза. При последующем разведении сока мы не обнаружили выраженного десмутагенного эффекта —16 % и 13 % для разведений сока 1:10 и 1:100, соответственно (рис.11Б).

При одновременном действии растительных P. major, Т. farfara и фурацилина на тестерные штаммы Е. coli в Ree тесте различия между размерами зон

ингибирования на чашках с нормальными и дефектными по репарации бактериями были незначительными.

12 10

ч8 а? £6

2 О

А) Биоантнмутагенное действие

М М1:1(М1:100 П П1:10П1:100 ПК

6 5

Э4

Й*3 2 1 О

Б) Десмутагенный эффект

гь

П П1:10П1:100 М М1:10М1:100 ПК

Рис. 11. Влияние соков растений Tussilago farfara и Plantago major на SOS-индуцирующий потенциал НС (А: при предварительной обработке клеток Е. coli PQ37 соками растений в течение 2 ч.; Б: при одновременном действии растительных соков и НС на клетки Е. coli PQ37); ПК -позитивный контроль - НС, НК (пунктирная линия) - негативный контроль (спонтанный уровень SOS-ответа), М - сок мать-и-мачехи обыкн. и НС, М1:10,М1:100 - сок мать-и-мачехи обыкн. в соответствующих разведениях и НС; П - сок подорожника бол. и НС, 111:10, П1:100 - сок подорожника бол. в соответствующих разведениях и НС.

А) Биоантнмутагенное действие

Б) Десмутагенный эффект

¿¿Q

0,1

0,01

P. fruticosa

гЬ

0,1

0,01

D. deltoidea

НК

6 5

п4

лз

ПК

0,1 0,07

D. deltoidea Сонценграция

экстрактов, мг/мл

1 \o,i\o,oi

P. fruticosa НК ПК

Концентрация растительных экстрактов, мг/мл

Рис 12. Влияние экстрактов растений Polyscias fruticosa и Dioscorea deltoidea на SOS-индуцирующий потенциал НС: А) при предварительной обработке клеток Е. coli PQ37 экстрактами растений в течение 2 ч. и с последующим добавлением НС; Б) при одновременном добавлении исследуемых экстрактов и НС к клеткам Е. coli PQ37. ПК - позитивный контроль-НС, НК -негативный контроль (спонтанный уровень SOS-ответа).* - Достоверно отличается от позитивного контроля - НС, р<0.05.

Максимальный биоантимутагенный эффект показали экстракты полисциаса кустарникого (Polyscias fruticosa) в концентрации 1 мг/мл (73%) и диоскореи дельтовидной (Dioscorea deltoidea) в концентрации 0,1 мг/мл (62%) (рис.12А). При одновременном добавлении экстрактов исследуемых растений и известного мутагена к культуре клеток Е. coli PQ37 для экстракта Р. fruticosa в концентрациях 0,1 и 0,01 мг/мл наблюдалось снижение фактора индукции SOS-ответа на 49 и 32% соответственно (рис. 12Б). Экстракт D. deltoidea не проявил антимутагенного эффекта ни в одной из исследованных концентраций.

А) Биоантимутагенное действие

Б) Десмутагенный эффект

П П П ri п

Р. Mäfolia

экстрактов, мг/мл

1 I 0,1 10,01

P. japonicus НК ПК

3,5 -i . 3 ■ 32,5 Bí 2 "'1,5 1

0,5 0

ñ'ñ ñ'ñ'ñ.rl п

1 ! о,1 }о,о1

Р. fíiáfdia

1 0,1 10,01 Р. japónicas

НК\ ПК

Кокцентрапия экпрастов растений, мг/мл

Рис.13. Влияние экстрактов растений Polyscias filicifolia и Panax japonicus на SOS-индуцирующий потенциал НС: А) при предварительной обработке клеток Е. coli PQ37 соками растений в течение 2 ч. с последующим добавлением НС; Б) при одновременном добавлении исследуемых экстрактов и НС к клеткам Е. coli PQ37. ПК - позитивный контроль-НС, НК - негативный контроль (спонтанный уровень SOS-ответа).

Экстракты лекарственных растений полисциаса папоротниколистного (.Polyscias filicifolia) и женьшеня японского (Panax japonicus) после предварительной обработки клеток Е. coli PQ37 приводили к практически полному исчезновению мутагенного действия НС. Для. экстракта Р. filicifolia антимутагенный эффект составил 27-52%, а для Р. japonicus - 43-64% (рисЛЗА). Одновременное добавление экстрактов растений Р. filicifolia и Р. japonicus к культуре клеток Е. coli PQ37 привело к практическому полному исчезновению генотоксических эффектов НС, снижая фактор индукции на 63% для концентрации 0,1 мг/мл экстракта Р. filicifolia и на 81% для концентрации 1 мг/мл экстракта Р. japonicus (рис. 13Б).

2-3.4. Антимутагенное действие соков и экстрактов растений

Данные о десмутагенном эффекте сока мать-и-мачехи обыкновенной, показанные в SOS-хромотесте подтверждаются также и в тесте Эймса. Исследуемый сок Т. farfara снижал количество колоний-ревертантов, индуцированных мутагеном азидом натрия, на 67% (рис.14). В отличие от SOS-хромотеста экстракт растения D. deltoidea нейтрализовал действие мутагена азида натрия в тесте Эймса, приводя к снижению количества колоний-ревертантов на 61% (рис.15). Таким образом, нами выявлен дифференциальный десмутагенный эффект экстракта растения D. deltoidea. Десмутагенный эффект также подтвердился в тесте Эймса для экстракта женьшеня японского. Экстракт Р. japonicus снижал мутагенное действие азида натрия в 2 раза (рис.16).

É* 400 5 *

I! зоо

§1

* Í 200

с.

100 о

НК Tussilagofarfaro ПК

Рис.14. Влияние сока Тшхйago /афта на мутагенную активность азида натрия (1 мкт/чашку) в тесте Эймса при одновременном добавлении исследуемого сока и мутагена в верхний агар. ПК - позитивный контроль с азидом натрия. НК - негативный контроль (спонтанный фон мутирования). * - р<0.05, достоверно отличается от позитивного контроля.

Рис.15. Влияние экстракта Оюасогеа ¿е1шс!еа на мутагенную активность азида натрия. ПК • позитивный контроль - азид натрия (1 мкг/чаипсу), НК - негативный контроль (спонтанный фон мутирования).

§1 * й

I' в- *

зоо 250 200 150 100 50 0

НК Dioscorea deltoidea ПК

^ зоо

I 2X1"

е- 200г

150 „ *

5 100 I

^ Ролах]аротсих

обсуждение результатов

3.1. Антимутагенное действие биокомплекса нчелиной перги

Биостимулирующие свойства биокомплекса пчелиной перги объясняются наличием в его составе аминокислот, витаминов и ферментов, обладающих биологической ценностью для пчёл. В ходе работы биокомплекс, полученный из пчел, не проявил мутагенного и генотоксического действия ни в одной из исследованных концентраций в тесте Эймса и БОЭ-хромотесте (рис.1,2). Отсутствие токсичности, мутагенности, канцерогенности и тератогенности на микробных тест-системах было также выявлено у препарата «Талидомид», представляющий собой многокомпетентную смесь на основе аминокислот и обладающего сходным действием с препаратом «Винибис» на основе пчелиной перги [Поройков, Филимонов, 2000].

Таблица 5.

Компонентный состав пчелиной перги

ВИТАМИНЫ МИКРО-и МАКРОЭЛЕМЕНТЫ АМИНОКИСЛОТЫ

Витамин А 2001.Е. Фосфор 24 мг Аргинин 200 мг

Витамин В] 33 мкг Калий 44 мг Изолейцин 204 мг

Витамин В2 71 мкг Кальций 45 мг Лейцин 252 мг

Витамин Вз 76 мкг Натрий 1,6 мг Лизин 260 мг

Витамин В6 22 мкг Магний 14 мг Метионин 84 мг

Витамин В,2 5 мкг Медь 0,06 мг Фенилаланин 164мг

Фолиевая к-та 24 мкг Железо 10 мг Треонин 128 мг

Витамин С 70 мкг Марганец 5,6 мг Валин 232 мг

Витамин О 64 мкг Сера 40 мг Гистидин 112 мг

Витамин РР 15 мкг Хлор 3,2 мг Триптофан 56 мг

Витамин (Н) 2,4 мкг Кремний 5 мг Еще 9 аминокислот и более

Витамин Е 3,6 мг Еще 16 микроэлементов 40 ферментов

Витамин Р 2,4 мг

Г Рис. 16. Влияние экстракта Panax japonicvs на мутагенную активность азида натрия. ПК - позитивный контроль - азцд натрия (1 мкг/чашку), НК - негативный контроль (спонтанный пк фон мутирования).

Данные предоставлены Институтом Фармакологической Аналитики (Бремен).

Антимутагенные эффекты биокомплекса пчелиной перги, выявленные нами в тесте Эймса и SOS-хромотесте, ранее были обнаружены и у других продуктов пчеловодства: прополиса и мёда Прополис обладает уникальными противоопухолевыми и антиоксидантными свойствами [Türkez, 2009]; участвует в локализации (ограничении) опухолевого процесса, очищении клеточных мембран, нормализации процессов дыхания клеток, контроле процессов размножения клеток в организме. Мёд также показал антиканцерогенные свойства в отношении известного канцерогена Тгр-Р-1(3-амино-1,4-диметил-5Н-пиридо[4,3-6]индол)в тесте Эймса, максимально снижая его мутагенные свойства в концентрациях 10 и 20 мкг/мл [Wang, 2002].

Полученные результаты характеризуют биокомплекс пчелиной перги как биологически активный препарат, обладающий определенным антимутагенным потенциалом. Его ангимугагенное и ростостимулирующее действие может бьггь объяснено тем, что в составе биокомплекса содержится широкий спектр витаминов-антиоксидантов, аминокислот, ферментов, макро- и микроэлементов (табл.5) [Фарм. статья, 2001]. Известно, что витамины А, С, Е [Ramel et al., 1986], атакже некоторые аминокислоты обладают ярко выраженными антимутагенными свойствами и поэтому вполне обоснованным представляется предположение о связи антимугагенных свойств пчелиной перги с наличием в его составе данных соединений. Таким образом, биокомплекс пчелиной перги может быть рекомендован к разработке как перспективный антимутагенный, безопасный в области малых доз (1-100 мкг/мл) препарат.

32. Десмутагенный эффект экстракта рогов 19-месячного сайгака Saiga tatarica L. до периода гона в тесте Эймса

Установлено, что во всем диапазоне исследованных концентраций ни один из экстрактов рогов сайгака Saiga tatarica L. не обладал выраженным биоантимутагенным эффектом. Мы предполагаем, что инкубация с различными концентрациями экстрактов рогов сайгака не приводит к активации систем, задействованных в процессе антимутагенеза. Десмутагенные свойства экстрактов рогового вещества сайгака 1.7 ДГВ и 1.7111 В, т.е. способность снижать активность мутагенов до их взаимодействия с различными системами организма были обнаружены у экстракта 1.7 ДГВ (рис.6,7). Разные эффекты экстрактов 1.7 ДГВ и 1.7 ПГВ, возможно, объясняются изменением состава биологически активных веществ в рогах в зависимости от физиологического состояния животных. Десмутагенное действие экстракта рогов сайгака 1.7 ДГВ в тесте Эймса в отношении Ац и МННГ, может быть обусловлено: а) связыванием молекулы мутагена, что в свою очередь препятствует его воздействию на клетки тестерных бактерий; б) модификацией молекулы мутагена при его взаимодействии с компонентами исследованного экстракта Установлено, что в состав рогов любых копытных животных входят кератин, аминокислоты, пептиды, липиды, остатки нуклеиновых кислот, микроэлемента: кальций, алюминий, хром, медь, железо, марганец и цинк Романов, 2005]. Основными составляющими элементами являются аминокислоты -от 30% до 90% (табл. 6) и белки - до 52% [Брызгалова и Михайлова, 1998]. Отмечается, что возможно именно присутствием пептидов обусловлены некоторые физиологические эффекты препаратов на основе экстрактов рогов [Поляков с соавт, 2002]. Антимутагенная активность показана для ряда аминокислот. По данным Osawa et al. цистеин обладает выраженным антимутагенным эффектом против мутагенных компонентов, образующихся в пище в процессе приготовления [Osawa

е/ а!., 1980]. При оценке эффекта аминокислот в отношении МННГ в тесте Эймса была установлена высокая антимутагенная активность цистеина, глицина, триптофана, лизина и аргинина [Лоу е/ а!., 2002]. Учитывая данные о химическом составе рогов сайгака, вполне можно допустить, что обнаруженный десмутагенный эффект экстракта 1.7 ДГВ обусловлен присутствующими в нем аминокислотами и пептидами.

Таблица 6.

Аминокислотный состав (мкмоль/ЮОг) чехла рогов сайги и сайтарина____

Аминокислота Мука из рогов сайги Экстракт из рогов сайги

Полный аминокислотный состав Содержание свободных аминокислот, мкмоль/ЮОг, при значениях рН экстракции Полный аминокислотный состав Содержание свободных аминокислот

Мкмоль/ 100г % от суммы ам.к-т 3- 6 9 Мкмоль/ 100мл. % Мкмсшь/ 100 мл %

Лизин 58000 6,4 5 2 9 10,0 3,4 «2,0 « 1,7

Гистидин 16000 1,6 Сл. Сл. 1,3 0,4 0 -

Аргинин 71000 7,8 5 12 Сл. 10,9 3,7 2,6 2,2

Аспарг. к-та »64000 «7,2 - - 9 30,9 10,5 2,5 2,1

Треонин 72000 8,1 . - 30 18,4 6,2 2,1 1,8

Серин ■ 80000 9,0 100 97 58 27,1 9,2 9,3 7,9

Глутамин 135000 15,0 21 39 8 42,7 14,5 3,1 2,6

Пролин 37000 4,2 55 30 23 22,8 7,7 6,1 5,2

Глицин 84000 9,3 100 120 49 33,1 11,2 30,8 26,1

Алании 65300 7,2 69 57 31 «20,0 »6,8 10,6 9,0

Валин 54500 6,0 53 31 20 17,1 5,8 13,5 11,4

Изолейцин 37000 4,1 36 24 14 10,1 3,4 7,5 6,3

Лейцин 87600 10,0 64 38 19 28,3 9,6 15,6 13,2

Тирозин 23900 2,6 81 52 33 12,5 4,2 «7,0 «5,9

Фенялаланин 25300 2,7 54 33 20 9,2 3,1 «5,0 «4,2

Всего 910600 101,2 723 585 333 294,4 99,7 115,7 99,6

33. Антимутагенные и антигенотоксические эффекты биокомплексов растений в микробных тест-системах

Проведенное исследование позволяет сделать вывод о дифференциальном токсическом действии растительных биокомплексов в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов (табл.2,3). Нами показано, что сок Plantaso major обладал антибактериальной активностью в отношении грамотрицательных бактерий S. typhimurium, причем бактерицидное действие данного сока в отношении грамположительных микроорганизмов М. luteus отсутствовало. Экстракт Dioscorea deltoidea и сок Tussilaso farfara избирательно подавляли рост и развитие грамположительных бактерий, в то же время комплекс БАВ Т. farfara проявлял ростостимулирующую активность в отношении S. typhimurium. По всей видимости, такое неодинаковое действие соков и экстрактов лекарственных растений на грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы объясняется разницей химического состава комплекса БАВ, а также разницей в составе клеточных стенок бактерий.

Имеется ряд исследований, свидетельствующих об антиканцерогенных, антимутагенных и противоопухолевых эффектах соков и экстрактов различных

растений [Ogunjobi, 2007]. Биоантимутагенные и десмутагенные свойства Aloe arborescens. выявленные нами в SOS-хромотесте на штамме £ coli PQ37 харжгеризуют данное растение как перспективный антимутагенный - препарат (рис.9А,Б). В составе растения Callisia frasrans содержатся гликозиды, фитостериды, пектины, флавоноиды, микроэлементы (железо, медь, никель, хром и др.), витамины группы В, провитамин А, дубильные вещества, аскорбиновая кислота, кверцетин, который владеет противоопухолевой и Р-витаминной активностью, антиоксидантным и спазмолитическим действием. С. fragrans, оказывая противоопухолевым действием и обладая иммуномодулирующим эффектом, используется в гинекологии при лечении миом [Булатова, 2009]. Антигенотоксические свойства сока С. fragrans, выявленные нами в SOS-хромотесте, наиболее эффективно проявились в разведений 1:10 (рис.9А,Б).

Известно, что Chelidonium malus содержит значительное количество биологически активных веществ: дубильные вещества, флавоноиды, сапонины, витамины А и С, органические кислоты и алкалоиды (около 27 видов), оказывающих селективное цитостатическое действие на опухолевые клетки человека в условиях in vitro. Результаты, полученные нами при исследовании сока растений чистотела большого в SOS-хромотесте (рис.10А,Б) и Ree тесте (табл.4), свидетельствуют о том, что антиканцерогенные, антикластогенные и антимутагенные эффекты сока данного растения могут бьпъ обусловлены десмутагешшм действием его биоактивных компонентов. На основании данных о биоантимутагенном эффекте сока чистотела большого в SOS-хромотесте с преинкубацией мы можем предположить, что протекторное действие биологически активных веществ растения связано также с влиянием на процессы репарации ДНК. Aeeopodium podagraria обладает значительным целебным потенциалом [Сокольская, 2010]. В липофильной фракции содержится хлорофилл (1,6%), ненасыщенные и насыщенные жирные кислоты (пальмитиновая, стеариновая и др.); органические кислоты - яблочная и лимонная, углеводы (глюкоза и фруктоза); фенолкарбоновые кислоты - хлорогеновая и кофейная; флавоноиды - кверцетин, кемпферол; холин. Инкубация сока сныти обыкновенной с клетками бактерий Е. coli PQ37 приводила к стимуляции защитных систем клетки, что приводило к проявлению данным соком биоантимутагенных свойств (рис.10А).

Нам не удалось обнаружить значительный антимутагенный эффект для сока Plantaso major как в SOS-хромотесте (рис. 11 А,Б), так и Ree тесте. В литературе имеются данные о том, что экстракты данного растения могут оказывать генотоксическое действие. В работе Басаран с соавт. [Basaran et al., 1996] установлено, что экстракты P. major вызывают повреждения в лимфоцитах человека (метод ДНК-комет), хотя и не обладают мутагенной активностью в тесте Эймса на штаммах S. typhimurium ТА98 и TAI 00. Возможно, что генотоксические эффекты обусловлены входящими в состав растения токсичными соединениями, такими как нитраты, щавелевая и эруковая кислоты [Guil et al, 1997]. При исследовании биоантимутагенных свойств сока растений Tussilago farfaro нами установлен значительный ингибирующий эффект сока этого растения на развитие SOS-ответа, индуцируемого НС в клетках £ coli PQ37 (рис.IIA). Интересно отметить, что биоантимутагенное действие сока проявляется при его разведении. Увеличение эффективности биопротекгорного действия с уменьшением дозы показано при изучении некоторых биологически активных веществ, в частности, антиоксидаятов {Савина с соавт., 2009]. Сок растения Т. farfaro проявил десмутагенный эффект в

тесте Эймса по отношению к азиду натрия, снижая количество колоний-ревертантов, индуцированных мутагеном на 67% (рис.14). Эти данные объясняются различием механизма действия известных мутагенов. Так, НС ингибирует синтез нуклеиновой кислоты, предотвращая ее полимеризацию, а азид натрия, являясь прямым мутагеном, вызывает мутации замены пар оснований у бактерий. Таким образом, нами выявлен дифференциальный десмутагенный эффект сока растения Т. /arfara.

Dioscorea deltoidea проявила антигенотоксичекие свойства в SOS-хромотесте в варианте с предварительной инкубацией исследуемого экстракта с клетками бактерий £. coli PQ37 (рис. 12А). У стероидных сапогенинов, содержащихся в D. deltoidea, была обнаружена способность тормозить рост некоторых форм злокачественных образований; снижать уровень холестерина в крови и стимулировать овуляторные процессы у животных, а также антигрибковая, антимикробная и антивирусная активности [Васильева, 2000]. В отличие от SOS-хромотеста, экстракт растения D. deltoidea нейтрализовал действие известного мутагена азида натрия в тесте Эймса, приводя к снижению количества колоний-ревертантов на 61% (рис.15). Таким образом, нами выявлен дифференциальный десмутагенный эффект экстракта растения D. deltoidea.

Антимутагенные эффекты Polyscias filicifolia, выявленные нами в SOS-хромотесте (рис.13А,Б), возможно объясняются наличием в его составе гликозидов, которые также присутствуют в экстрактах растения Panax ginseng, показавшие антиканцерогенные и противоопухолевые свойства в исследовании Юнг-Жуна [Young-Joon et al., 2001]. Главными действующими веществами Panax japonicus считаются тритерпеновые гликозиды - гинзенозиды (А, В, С, D, Е, F, G, Н, I-K), пептиды, полисахариды и эфирные масла (сесквитерпены и др.), обладающие высокой биологической активностью. Данные литературы свидетельствуют о значительном антиканцерогенном действии экстрактов растений женьшеня японского [Общие сведения о женьшене, 2010]. В последние годы появился интерес к женьшеню как к средству для профилактики рака. В опытах на клеточных культурах женьшень и его гинзенозиды тормозили рост клеток рака печени и толстой кишки [Оздоровительные продукты для снижения онкологического риска, 2005]. Таким образом, биоантимутагенные и десмутагенные свойства женьшеня японского могут быть объяснены наличием в его составе тритерпеновых гликозидов, продукция которых в данном растении на порядок выше, чем в растении женьшеня настоящего [Смирнова, 2008].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследуемые биокомплексы растительного и животного происхождения проявили антимутагенные эффекты различной степени в бактериальных тест-системах. Биокомплекс пчелиной перги приводил к снижению частоты индуцированных мутаций на 53-78% в тесте Эймса, а также к практическому полному исчезновению генотоксического эффекта митомицина С в SOS-хромотесте. Результаты по исследованию биокомплекса, полученного из пчел, характеризуют пчелиную пергу как биологически активный препарат, обладающий определенным антимутагенным потенциалом. Его биоантимутагенное, десмутагенное и ростостимулирующее действие может быть объяснено тем, что в составе биокомплекса содержится широкий спектр витаминов-антиоксидантов,

аминокислот, ферментов, макро- и микроэлементов. Десмутагенный эффект биокомплекса рогов сайгака возраста 19 месяцев до периода гона приводил к снижению мутагенной активности известных мутагенов N-MeTffii-N'-rarrpo-N-нитрозогуанидина и N''-а.миноцитидина на 31% в тесте Эймса на тестерном штамме Salmonella typhimurium ТА100. Учитывая данные о химическом составе биокомплекса, полученного из парнокопытных млекопитающих, можно допустить, что обнаруженный десмутагенный эффект экстракта рогов сайгака Saiga tatarica L. 1.7 ДГВ обусловлен присутствующими в нем аминокислотами (аналогичными составляющим пчелиной перги). Таким образом, антимутагенная активность биокомплексов, полученных из пчел и парнокопытных млекопитающих, может быть объяснена ангиоксидантным эффектом компонентов экстракта рогов сайгака и пчелиной перги, который вносит значительный вклад в лечебные свойства препаратов, основанных на биокомплексах животного происхождения. Данные литературы говорят о прямой связи между проявлением антиоксидантных и антимутагенных эффектах, а также о том, что основным механизмом действия антимутагенных соединений являются их антиоксидантные свойства. На основании данных, полученных при изучении биоантимутагенной и десмутагенной активности растительных соков растений чистотела большого Chelidonium majus, мать-и-мачехи обыкновенной Tussilago farfaro, золотого уса Callisia fragrans, а также экстрактов диоскореи дельтовидной Dioscorea deltoidea, полисциаса папоротниколистного Polyscias ßlicifolia и женьшеня японского Panax japonicus мы можем предположить, что антимутагенная активность биокомплексов растений скорее всего объясняется наличием в их составе биологически активных вторичных метаболитов (флавоноиды, терпеноиды, гликозиды, сапонины и др.), которые способствуют блокированию процесса индукции SOS сигнала, либо активируют иные системы репарации, способствующие безошибочному исправлению, повреждений ДНК.

Дальнейшие исследования, направленные на выяснение конкретных компонентов и механизмов, обусловливающих антимутагенные эффекты биокомплексов животного и растительного происхождения, помогут разработать стратегию их рационального использования для создания антимутагенных препаратов.

ВЫВОДЫ

1. Биокомплекс пчелиной перги в диапазоне исследуемых концентраций (1-100 мкг/мл) проявил десмутагенные, биоантимутагенные и биостимулирующие эффекты в бактериальных тест-системах на штаммах Salmonella typhimurium ТА100 и Escherichia coli PQ37, снижая частоту индуцированных мутаций на 78%.

2. Из шести исследованных растений сок Plantago major проявил бактерицидные свойства, снижая выживаемость S. typhimurium ТА100 на 30,7% и соки Dioscorea deltoidea и Tussilago fárfara, снижая выживаемость штамма М. luteus на 10% и 9.1% соответственно.

3. Соки растений Callisia fragrans, Tussilago farfaro, Chelidonium majus и экстракты растений Dioscorea deltoidea, Polyscias filicifolia и Panax japonicus проявили десмутагенные и биоантимутагенные свойства; максимальным эффектом обладал сок Chelidonium majus (90%) и экстракт Panax japonicus (81%).

4. Установлен десмутагенный эффект экстракта рогов сайгака Saiga tatarica L. возраста 19 месяцев до периода гона в отношении известных мутагенов N-Meran-N'-

нитро-Ы-нитрозогуанидина и Ы4-аминоцитидина в тесте Эймса на тсстерном штамме Salmonella typhimurium ТА100 (снижение мутагенности на 31%). 5. Биокомплексы, полученные из пчел, лекарственных растений и парнокопытных млекопитающих могут быть рекомендованы к разработке как антимутагенные препараты, эффективность которых зависит от физиологических и биохимических характеристик биообъекта.

Публикации по теме диссертации в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Карамова, Н.С. Исследование антигенотоксических свойств соков растений Chelidonium majus L., Plantago major L. and Tussilago farfara L. / H.C. Карамова, Д.Г.Фатыхова, Й.РЛбдрахимова, О.Н.Ильинская // Экологическая генетика. - 2010. - Т. VIII. - Ns2. - С.56-65.

2. Карамова, Н.С. Антимугагенная активность экстрактов рогового вещества Saiga tatarica L. / Н.С.Карамова, П.В.Зеленихин, Д.Г.Фатыхова, ДР.Сафиуллина, О.Н.Ильинская, О.Е.Романов // Ученые записки Казанского Государственного университета. Секция «Естественные науки». - 2011. - Т-.153. - Кн. 1. - С.127-135.

Другие публикации по теме диссертации:

3. Фатыхова, Д.Г. Полезные свойства растений: возможность снятия мутагенной на1рузки на организм человека / Д.Г.Фатыхова, О.Н.Ильинская, Й.Р.Абдрахимова, И.ВЛархимович // Журнал Агротехнологии Поволжья. - 2009. - №1. - С.48-50.

4. Фатыхова, Д.Г. Токсическая и генетическая безопасность препарата «Винибис» / Д.Г.Фатыхова, В.Г.Евтюгин, ОЛ.Ильинская // Материалы тезисов 79-ой Всероссийской научной студенческой конференции. - Казань, 2005. - С.200.

5. Евтюгин, В.Г. Оценка токсических и мутагенных эффектов биокомплекса пчелиной перги / В.Г.Евтюгин, Д.Г.Фатыхова, О.Н.Ильинская // Материалы тезисов 79-ой Всероссийской научной студенческой конференции. - Казань, 2005. -С.201.

6. Евтюгин, В.Г. Генотоксические эффекты пчелиной перги / ВГ.Евтюгин, Д.Г.Фатыхова, О.Н.Илыгаская // Материалы Х1ЛП международной научной студенческой конференции «Студенты и научно-технический прогресс». - Казань, 2005. - С.88-89.

7. Фатыхова, Д.Г. Антимутагенная активность препарата «Винибис» / Д.Г.Фатыхова, О.Н. Ильинская // Материалы финальной конференции Казанского Государственного Университета. - 2006. - С.48-49.

8. Fatykhova, D.G. Evaluation of antimutagenic potential of Aloe arborescens, Callisia fragrans, Chelidonium majus and Aegopodium podagraria plants / D.G. Fatykhova, N.S.Karamova, I.V.Parchimovich, AA.Bajazitova, J.RAbdrakhimova, O.N.IHnskaya // Abstracts of XTV Internat.Confer. devoted to the 20th anniv. of partnership between Kazan State University and Justus_liebig Giessen University "Microbial Enzymes in biotechnology and medicine". - Kazan, 2009. - P.22-23.

9. Fatykhova, D.G. Antimutagenic effects of "Vinibis" preparation / D.G.Fatykhova, V.GJEvtugin, L.T-Akhmetova, O.N.Ilinskaya // Abstracts of the 13th annual Symposium for Biology Students of Europe «SymBioSE 2009» «Biology: Expansion of Borders». -2009.-P. 50.

10. Fatykhova, D.G. Evaluation of Antimutagenic potential of Aloe arborescens, Callisia fragrans, Chelidonium majus and Tussilago farfara plants / D.G.Fatykhova,

N.S.Karamova, I.V.Parchimovich, A.A.Bajazitova, O.N.Ilitiskaya // Abstracts of the 13th annual Symposium for Biology Students of Europe «SymBioSE 2009» «Biology: Expansion of Borders». - 2009. - P.49.

11. Parkhimovich, I.V. Antimutagenic activities of cellular juices from various medicinal plants / l.V.Parkhimovich, D.GJatykhova, Y.R.Abdrakhimova, O.N.Ilinskaya // Abstracts of the 13th annual Symposium for Biology Students of Europe «SymBioSE 2009» «Biology: Expansion of Borders». -2009. - P.91.

12. Мвапе, И. Сок растения Chelidonium majus L. понижает токсический эффект фурацилина / И.Мвапе, С.Катема, Н.С.Карамова, Д.Г.Фатыхова, Й.Р.Абдрахимова, О.Н.Ильинская // Материалы Российской научно-практической конференции «Инновационные разработки молодых ученых - АПК Россия». - Казань: Фолиант, 2010. - С.253-257.

13. Гафиятова, Е.И. Оценка биологической активности и содержания вторичных метаболитов комнатно- и дикорастущих растений / Е.И.Гафиятова, И.В.Пархимович, Д.Г.Фатыхова, Й.Р.Абдрахимова, О.Н.Ильинская // Тезисы ЗВсероссийского конгресса с участием международных студентов и молодых ученых «Симбиоз-Россия». - Нижний Новгород, 2010. - С.49.

14.Фатыхова, Д.Г. Антимутагенные эффекты соков лечебных растений / Д.Г.Фатыхова, Я.В.Хшшнская, Н.С.Карамова, Й.Р.Абдрахимова, О.Н.Ильинская // Тезисы Шсероссийской научной конференции «Основы и прикладные аспекты биологии». -Томск, 2010. - С.77-78.

15.Фатыхова, Д.Г. Антимутагенные эффекты экстрактов лекарственных растений / Д.Г.Фатыхова, Н.С.Карамова, Й.РАбдрахимова, О.Н.Ильинская // Материалы Международной научно-практической конференции «Научное обеспечение устойчивого сельско-хозяйсгвенного производства в условиях глобального изменения климата». - Казань, 2010. - С.367-372.

16. Karamova, N.S. Assessment of antigenotoxic potential of juices of plants Chelidonium majus L., Plantago major L. and Tussilago farfara L. in bacterial tests / N.S.Karamova, Y.RAbdrakhimova, D.G.Fatykhova, T.V.Bagaeva, O.N.Ilinskaya // Abstr. of the Chinese confer, on Modern Genetics. - 2011. - P. 353.

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю профессору, д б.н., академику АН РТ О.Н. Ильинской за постановку проблемы, внимательное отношение к работе и плодотворную помощь в обсуждении результатов. К.б.н., доц. Й.Р. Абдрахимовой (каф. Физиологии растений) за предоставленные исследуемые соки и экстракты растений. JCm.h., лауреату Гос. премии РТ в области науки и техники Ж.Ж. Сибгатуллину (ООО «АНТ») за предоставление пчелиной перги. К.х.н. ЯТ. Ахматовой (ООО «АНТ») за предоставление данных химического анализа препарата «Винибис» на основе пчелиной перги. К.х.к., доц. О.Е. Романову (Калмыцкий государственный университет, г. Элиста) за предоставленные экстракты рогов сайгака Saiga tatarica L. К-б.н. доц. НС. Карамовой, к.б.н., доц. П.В. Зеленихину, к.б.н., доц. АБ.Мартулис, кб.н., ст. препод. ДР. Яруллиной за постоянное внимание, помощь в проведении, обсуждении работы и экспериментов, консультации. Особая благодарность АИ. Колпакову и всем сотрудникам кафедры за всестороннюю помощь и доброжелательную рабочую атмосферу.

Отзывы на автореферат просим высылать по адресу: Казань, 420008, ул. Кремлевская, 18, Казанский университет, отдел аспирантуры, Ученому секретарю Диссертационного совета Д 212.081.08 Абрамовой Зинаиде Ивановне и по факсу: (843)238-76-01

Подписано в печать 11.01.12г. Форм. бум. 60x80 1/16. Печ. л. 1,5. Тираж 100. Заказ №1101/1. Отпечатано с готового оригинал - макета в типографии «Вестфалика» (ИП Колесов В.Н.) г. Казань, ул. Московская, 22. Тел.: 292-98-92

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фатыхова, Диана Газинуровна, Казань

61 12-3/669

Министерство образования и науки Российской Федерации

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ

УНИВЕРСИТЕТ»

На правах рукописи

ФАТЫХОВА ДИАНА ГАЗИНУРОВНА

АНТИМУТАГЕННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ БИОКОМПЛЕКСОВ РАСТИТЕЛЬНОГО И ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ В МИКРОБНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМАХ

03.02.03 - микробиология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, академик АН РТ О.Н.Ильинская

Казань-2012

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений 5

ВВЕДЕНИЕ 6

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13

1. Антимутагенез. Основные механизмы действия 13 антимутагенов

1.1. Десмутагены 17

1.2. Биоантимутагены 18 1.3 .Пищевые ингибиторы мутагенеза 21 1.4. Перспективы практического применения антимутагенов 23

2. Характеристика пчелиной перги 25

3.Характеристика экстрактов рогов парнокопытных 29 млекопитающих

4. Характеристика биокомплексов растительного 32 происхождения

Заключение 39

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 40

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 40

Характеристика тестерных штаммов 40

Инкубационные среды, буферные растворы, химические агенты 41

Исследуемые биокомплексы растительного и животного 44 происхождения

Растительный материал 44

Экстракты рогов сайгака Saiga tatarica L. 45

Приготовление образцов пчелиной перги 46

Бактериальные тест-системы для определения токсических и 46 мутагенных эффектов соединений природного происхождения

Тест на токсичность по отношению к грамотрицательным и 46 грамположительным микроорганизмам

Полуколичественный метод учета генных мутаций (тест Эймса) 47

SOS-хромотест 48

Бактериальные тест-системы для определения антимутагенных 51 свойств соединений природного происхождения

Модификации теста Эймса ^ *

Модификации SOS-хромотеста 51

Ree тест 52

Определение свободного гистидина методом тонкослойной 53

хроматографии (ТСХ)

Статистическая обработка данных 54

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 55

1. Антимутагенные эффекты биокомплекса, полученного из пчел 55

1.1.Токсический эффект пчелиной перги по отношению к 55 тестерному штамму Salmonella typhimurium ТА 100

1.2. Мутагенные эффекты биокомплекса пчелиной перги в тесте 55 Эймса

1.3. Генотоксические эффекты пчелиной перги в SOS- 56 хромотесте

1.4.Антимутагенное действие биокомплекса, полученного из 57 пчел, в тесте Эймса

1.4.1 .Биоантимутагенное действие пчелиной перги 57

1.4.2. Десмутагенный эффект пчелиной перги 5 8

1.5.Антигенотоксическое действие пчелиной перги в SOS- 59 хромотесте

1.5.1 .Биоантимутагенное действие пчелиной перги 59

1.5.2. Десмутагенный эффект исследуемого биокомплекса, 60

полученного из пчел

2. Антимутагенное действие биокомплекса, полученного из 61 парнокопытных млекопитающих

2.1. Токсическое действие экстрактов рогов сайгака Saiga 61 tatarica L.

2.2. Определение свободного гистидина в экстарктах 1.7. ДГВ и 62 1.7. ПГВ методом тонкослойной хроматографии (ТСХ)

2.3. Антимутагенное действие экстрактов рогов сайгака в тесте

Эймса

2.3.1. Биоантимутагенное действие исследуемых экстрактов 63

2.3.2. Десмутагенное действие исследуемых экстрактов 64 3. Антимутагенное эффекты биокомплексов растительных соков 67

и экстрактов

3.1.Токсическое действие экстрактов и соков лекарственных 68 растений по отношению к грамотрицательным и грамположительным микроорганизмам

3.2. Генотоксические эффекты соков исследуемых растений 70 3.3 .Антимутагенные эффекты биокомплексов растительного

происхождения

3.3.1. Биоантимутагенное действие растительных соков и ^ экстрактов

3.3.2. Десмутагенное действие соков и экстрактов растений 75

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 84

1. Антимутагенное действие биокомплекса пчелиной перги 84

2. Десмутагенный эффект экстракта 19-месячного сайгака Saiga 87 tatarica L. до периода гона в тесте Эймса

3. Антимутагенные и антигенотоксические эффекты ^ биокомплексов растений в микробных тест-системах

Заключение Ю7

ВЫВОДЫ 109

Список литературы 110

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФК - активные формы кислорода

КОЕ - колониеобразующие единицы

МС - митомицин С

НК - негативный контроль

онДНК - однонитевая ДНК

ОРВИ - острая респираторно-вирусная инфекция

ПК - позитивный контроль

1Б - фактор индукции 808-ответа

ЗББ - додецилсульфат натрия

В А - верхний агар

Ь-а - Ь-агар

Ь-Ь - Ь-бульон

НА - нижний агар

1.7ДГВ - экстракт, полученный при гидролизе тканей верхней трети рога

сайгака возрастом 1 год и 7 месяцев, отобранного у животного до гона;

3.7ДГВ - экстракт, полученный при гидролизе тканей верхней трети рога

сайгака возрастом 3 года и 7 месяцев, отобранного у животного до гона;

1.7ПГВ - экстракт, полученный при гидролизе тканей верхней трети рога

сайгака возрастом 1 год и 7 месяцев отобранного у животного после гона.

НС - налидиксовая кислота

БАВ - биологически активные вещества

МННГ - К-Метил-1чГ'-нитро-]Ч-нитрозогуанидин

Ац - Ъ^-аминоцитидин

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. В настоящее время в биосфере идёт прогрессивное накопление химических соединений антропогенного происхождения, многие из которых обладают мутагенными свойствами. Известно, что химические вещества могут индуцировать генные, хромосомные и геномные мутации, обладая высокой специфичностью действия [Болтина, 2009]. Поэтому поиск антимутагенов - веществ, защищающих генетический аппарат соматических и половых клеток человека от повреждения -является необходимым. Открытие новых веществ, снижающих частоту индуцированных мутаций, быстро растёт, и к настоящему времени насчитывается более 300 природных и синтетических антимутагенных соединений: витаминов, аминокислот, естественных метаболитов, пищевых добавок, лекарств и некоторых других соединений органической и неорганической природы [Бентхен, 1986; Arriaga-Alba, 2000].

Особую актуальность и значимость приобретает проведение профилактики мутагенеза на основе применения природных соединений растительного и животного происхождения.

В последние годы возрос интерес к исследованию антимутагенной активности растительных и животных компонентов в свете возможности использования их для профилактики и лечения онкологических, а также ряда других заболеваний, сопровождающихся повышенной чувствительностью генома к повреждениям. Растения являются источниками разнообразных биоактивных соединений (витамины, полисахариды, гликопептиды, аминокислоты, сульфиды, сапонины, полифенолы, терпеноиды, изофлавоны, индолы и др.), обладающих антиоксидантными, антимутагенными, антиканцерогенными и иммуномодулирующими свойствами [Santos-Cervantes et al., 2007]. Перспективность использования растительных препаратов в медицине обусловлена также возможной минимизацией их токсических эффектов в

млекопитающих, что объясняется сходным химическим составом биологически активных веществ живых организмов, а также определенным сродством метаболизма растительной и животной клетки [Коломиец, Ефимов, 2005].

Биокомплексы животного происхождения также обладают антиоксидантной, тонизирующей, иммуномодулирующей и иммуностимулирующей активностью, проявляют антисептическое действие и используются в качестве лекарственных средств и биологически активных комплексов. Пчелиная перга обладает выраженными антитоксическими свойствами, способствует повышению содержания в крови эритроцитов, ретикулоцитов и гемоглобина, обеспечивает нормализацию количества лейкоцитов и лейкоцитарной формулы [Хисматулина, 2005]. Роговое вещество копытных животных издавна является привлекательным материалом как источник биологически активных веществ. Экстракты из рогов сайгака используют для лечения нервных заболеваний, а также как жаропонижающее и гипотензивное средства [Романов, 2005; Романов, Лебедева, 2003]. Однако природа и спектр биологической активности препаратов растительного и животного происхождения изучены недостаточно.

В связи с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Определить токсические, генотоксические и антимутагенные эффекты биокомплекса пчелиной перги в бактериальных тест-системах (тест Эймса, SOS-хромотест).

2. Выявить токсические свойства лекарственных соков и экстрактов растений (Plantago major, Tussilago farfara, Dioscorea deltoidea, Polyscias

filicifolia, Panax japonicus, Hyssopus officinalis) по отношению к грамположительным и грамотрицательным бактериям.

3. Установить возможность модуляции уровня индуцированных мутаций различными растительными соками и экстрактами {Aloe arborescens, Callisia fragrans, Chelidonium majus, Plantago major, Aegopodium podagraria, Tussilago farfara, Dioscorea deltoidea, Polyscias fruticosa, Polyscias filicifolia, Panax japonicus).

4. Охарактеризовать антимутагенные свойства экстрактов рогов сайгака Saiga tatarica L. до и после периода гона животных.

5. Проанализировать антимутагенные эффекты и оценить потенциал практического использования биокомплексов, полученных из пчёл, растений и парнокопытных млекопитающих.

Для исследуемых соков и экстрактов растений Callisia fragrans, Tussilago farfara, Chelidonium majus, Dioscorea deltoidea, Polyscias filicifolia и Panax japonicus впервые получены данные об антимутагенных свойствах, выявленных в различных микробных тест-системах (тест Эймса, SOS-хромотест, Ree тест).

Впервые получены свидетельства о наличии десмутагенных эффектов у экстракта рогов сайгака возрастом 19 месяцев до периода гона в отношении известных мутагенов К-метил-Ы'-нитро-Ы-нитрозогуанидина и 1\14-аминоцитидина в тесте Эймса на штамме Salmonella typhimurium TAI00.

В данной работе исследуемые биокомплексы растительного и животного происхождения впервые предложены к разработке как антимутагенные препараты.

Практическая значимость. Основным практическим достижением настоящей работы является обнаружение и характеристика антимутагенных эффектов биокомплексов, полученных из пчёл, растений и парнокопытных млекопитающих. Установленные результаты в совокупности с данными, свидетельствующими об отсутствии у исследованных биокомплексов токсических и мутагенных свойств, открывают очевидную перспективу их использования для профилактики индуцированного мутагенеза у человека. Таким образом, биокомплексы растительного и животного происхождения могут быть рекомендованы к разработке как антимутагенные препараты. Учитывая уже полученные нами данные, существующие лекарства и биологически активные добавки, содержащие в своем составе биокомплексы, полученные из пчёл, растений и парнокопытных млекопитающих, также могут рассматриваться в качестве антигенотоксических и генопротекторных препаратов. Положения, выносимые на защиту:

1. Биокомплекс пчелиной перги обладает десмутагенными, биоантимутагенными и биостимулирующими свойствами, снижая частоту индуцированных мутаций на 78%.

2. Из десяти исследуемых растений наибольшей антимутагенной активностью обладали соки Callisia fragrans, Chelidonium majus, Tussilago farfara и экстракты Dioscorea deltoidea, Polyscias filicifolia, Panax japonicus. Максимальная антимутагенность продемонстрирована для сока чистотела большого (снижение частоты мутаций до 88%).

3. Среди экстрактов рогов сайгака Saiga tatarica L., исследуемых в возрасте животных от 19 до 43 месяцев, десмутагенную активность в отношении аналогов азотистых оснований проявил экстракт рогов 19-месячного сайгака до периода гона, уменьшающий мутагенный эффект на 31%.

4. Биокомплексы растительного и животного происхождения являются

перспективной основой для разработки антимутагенных препаратов,

эффективность которых зависит от физиологических и биохимических характеристик биообъекта.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования.

Работа выполнена в соответствии с тематическим планом КФУ, регистрационный номер 01200955076, «Механизмы регуляции функциональной активности клеток» при поддержке АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы» (2.1.1/920), государственного контракта №02.740.11.0391, совместного гранта Министерства образования и науки Российской Федерации.

Биохимический анализ биокомплекса пчелиной перги проводили на базе института фармакологической аналитики г. Бремен, Германия.

Биохимический анализ биокомплекса экстрактов рогов сайгака Saiga tatarica L. проводили на базе Калмыцкого государственного университета, г. Элиста.

Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены

на 79-ой всероссийской студенческой конференции, посвященной 1000-

летию Казани (Казань, 2005), XLIII Международной научной студенческой

конференции "Студент и научно-технический прогресс" (Новосибирск,

2005), итоговой конференции КГУ (2006), П-ой Международной научно-

практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы

биотехнологии» (Казань, 2008), Международной конференции "Развитие

междисциплинарных исследований: перспективные направления и вклад

DAAD", посвященной 20-летию партнерства между Казанским

государственным университетом и Гиссенским университетом им. Ю.

Либиха (Казань,2009), научной школе-конференции XIII симпозиума

студентов и аспирантов - биологов Европы «SymBioSE - 2009» (Казань,

2009), Международной научно-практической конференции "Научное

обеспечение устойчивого ведения сельскохозяйственного производства в условиях глобального изменения климата" (Казань,2010), III Всероссийского конгресса с международным участием студентов и аспирантов-биологов "Симбиоз-Россия" (Нижний Новгород, 2010), Всероссийской научно-практической конференции "Инновационные разработки молодых ученых - АПК России" (Казань,2010), а также на Первой Всероссийской молодёжной научной конференции "Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии", посвящённой 125-летию биологических исследований в Томском государственном университете (Томск, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 научных работ, из них 2 статьи в центральных отечественных рецензируемых журналах: Экологическая генетика, г. Санкт-Петербург; Ученые записки Казанского университета. Секция Естественные науки, г. Казань.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела экспериментальных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, включает 10 таблиц, 28 рисунков. Библиография содержит 177 наименований, в т.ч. 89- зарубежных авторов.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность своему

научному руководителю профессору, д.б.н., академику АН РТ О.Н.

Ильинской за постановку проблемы, внимательное отношение к работе и

плодотворную помощь в обсуждении результатов. К.б.н., доц. Й.Р.

Абдрахимовой (каф. Физиологии растений) за предоставленные

исследуемые соки и экстракты растений. К.м.н., лауреату Гос. премии РТ в

области науки и техники Ж.Ж. Сибгатуллину (ООО «АНТ») за

предоставление пчелиной перги. К.х.н. JI.T. Ахметовой (ООО «АНТ») за

предоставление данных химического анализа препарата «Винибис» на

основе пчелиной перги. К.х.н., доц. O.E. Романову (Калмыцкий

государственный университет, г. Элиста) за предоставленные экстракты рогов сайгака Saiga tatarica L. К.б.н. доц. Н.С. Карамовой, к.б.н., доц. П.В. Зеленихину, к.б.н., доц. А.Б.Маргулис, к.б.н., ст. препод. Д.Р. Яруллиной за постоянное внимание, помощь в проведении, обсуждении работы и экспериментов, консультации. Особая благодарность А.И. Колпакову и всем сотрудникам кафедры за всестороннюю помощь и доброжелательную рабочую атмосферу.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1. Антимутагенез. Основные механизмы действия антимутагенов

В настоящее время в биосфере идёт прогрессивное накопление химических соединений антропогенного происхождения, многие из которых обладают мутагенными свойствами. Известно, что химические вещества могут индуцировать генные, хромосомные и геномные изменения и давать при этом высокую специфичность в отношении тех или иных типов мутаций [Болтина, 2009]. Поэтому в этих условиях поиск антимутагенов - веществ, защищающих генетический аппарат соматических и половых клеток человека от повреждений, является необходимым. Особую актуальность и значимость придает поиск профилактики мутагенеза на основе применения природных соединений различного происхождения с безвредным механизмом действия.

Во время эволюции живые организмы сформировали различные адаптивные механизмы, которые позволили им сохранить постоянство видов и некоторые видоспецифичные признаки, а также противостоять действию мута�

Информация о работе

Фатыхова, Диана Газинуровна
кандидата биологических наук
Казань, 2012
ВАК 03.02.03

Диссертация

Антимутагенный потенциал биокомплексов растительного и животного происхождения в микробных тест-системах - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы