Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимосвязь фотосинтеза и дыхания у хлорофильных мутантов гороха

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Взаимосвязь фотосинтеза и дыхания у хлорофильных мутантов гороха"

С{ШКГ-ПЕГЕгеУРГСКШ ГОСУДАРСТВЕННИК УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи УДК 581.132:581.12

вайшля ольга борис оша взаимосвязь фотосинтеза и дыхания

у хлорогилльных ыутангов пороха

специальность 03.00.1^ - физмювогия раствнкй

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на сокекакие учёной степени кандидата биологических наук

санкт -петербург - 1992

Работа выполнена в лаборатории фотосинтеза научно-исследовательского. института биологии и биофизики Томского государственного университета

Научныа руководителя: кандидат биологических паук,ст.и.с.

Т.П.АСТЛФУРОВА

кандидат биологических наук,ст.н.с. В.А.СОКОЛОВ

С^щнальные оппоненты: доктор биологических наук

0. Д. БУКОВ

кандидат биологических наук,ст.и.с. Н.С.МАМУШНА

Ведущее учрезденка: Институт почвоведения и фотосинтеза Российской Лкадешш Наук

^Защита диссертации состоится 1992 года в

4а— час. на заседании специализированного совета К.063.57. 12 по защите диссертаций на соискание учёной степени кандидата биологических: наук в Санкт-Петербургском государст-пеином университете ( 19Э164, Санкт-Петербург, Университетская набережная, 7/9). "

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского университета

Автореферат разослан

года.

Учёный•секретарь специализированного совета

кдндидат биологических наук Е.В.Ермилова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Среди работ по изучению физиологов биохимических аспектов продукгивности растений вопрос о взаимосвязи фотосинтеза и дахания в ассимилирующей клетке остаётся слабо изученным.Ревенке данной проблемы осложняется тем,что до конца не ясно,как работапт отдельные этапы дахания в освещении* листьях растений.Бели функционирование цикла Кребса считается доказанным (Еерхотурова, 1977;Koat,1979; Заленский и др.,19РП,то вопрос о работе других этапов дыхательного метаболизма-гликолиза,окислительного пентозофосфатного пути.электронтранспортной цепи остаётся дискуссионным CLaator , I9ö7j3aehia et al. , IS6Ö; Bancer, ар Пиев. 1989;Мамушина к др., 1991) .Исследования пеоледикх ле>т показали многообразие в>гутриклеточньгх механизмов регуляции дмханил как на уровне метабоянзш, так и взаимодействия органелл а условиях,оптя-далькых для фотосинтеза.Интересным является открытие явления в ohlororeapiratioa и&ааЬега , 1983) ,регудирущего действия фрукто-зо-2,6-бисфосфата01аск et al. ,1987),доказательство кодирования иктсхондркальной ДНК болъаоЯ оубъедткцы РуБ4-карбогснлазу( Douce, îîauburgsr f ¡969) и переноса генов из глоропластов в митохондрии, а аз митохондрий-э ядроОЛюпагого.Дударзза, 1990),а таете обнаруза-нке а пластидах »гнэгих фзр.-ентоэ глкяолаэа я ОПИИ Kelly,Latako, 1979; Саяр,Douglas , I9£ö; ßtitt.sp Rees, 1969,.

Одазяо кахспявкных s настоял: et <y вреыэкн фактов недостаточно, чтобы сфоруух;тровпть ,сбауг> концепция*о гэганизм» взаимосвязи фотосинтеза a дое&нмя в пссикклирусцей клетке я оценить вклад eçsnt прсцйссоэ з конечнуэ. продуктивность.Псэтсуу необходим поиск ноьих подхода ддя ревемкк данной проблемы на, рзэличных уровня.; о; raiui- -заврт рас?«ннЗ.Перспективным з этом плане является изучение т.зпно-гибркдоого гетерозиса,полученного на основе нормальных :i мутант-кст растсмкЯ,посполъку изучение нэханнзмоя компенсаторных реакция со ст. реггу дыхания на недостатоя хлорофилла у цутантов и негодования ïts у гкбрндов позволяем приблизктъсй,с одной стороны,к пони- . !.:гн::п взаимосвязи фотосинтеза и :'яалил,а с другой стороны-к вн~ " лененив физнояого-бнояаллоехзз причли высокой продуктивное?« гибриднмх растений.

Цель и зад,",ти иссяедозан'ия. Цель настоя... Я ря.боты-изучениз реакция .пкзеател.'-наго метаболизма у растений с изменённым фотосин-тстгсескнц аппаратом и механизмов взаимосвязи данных процессов с фотосинтезом.В соответствии с этим были поставлены задачи*

Î.Описать стрултурно-функ^ональные изменения фотосинтетк-

чесяого аппарата разнопродуктивных растений гороха.

2.Научить активность ключевых ферментов отдельных этапов дыхательного метаболизма.

3.Определить содержание основных метаболитов.

4,Выявить особенности взаимосвязи фотосинтеза и дыхания У нормальных,кутантных и гибридных растений.

5.Разработать принципы отбора родительских пар на гетерозис-ное пот мство по физиолого-биохимическим тестам.

Научная новизна.В отличие от предыдущих исследований,которые основывались на использовании меченых субстратов,ингибигорного анализа,газообмена,изменении физиологических условий,в данной работе впервые применён единый комплексный физиолого-генетический подход к изучению причин различной фотосинтетической и дыхательной активности,а также взаимосвязи этих процессов у гибридных и цутантных растений гороха.

Впервые проанализировано влияние структурно-функциональных изменений фотосинтетического аппарата на отдельные этапы темново-го дыхания у растений,различающихся по продуктивности.

Установлено,что низкопродуктивный мутант 2014 характеризуется низкоэнергетическим типом обмена,а высокопродуктивный гибрид ■2004ХТ-максимальными скоростями первичных реакций фотосинтеза и высокой активностью ключевых ферментов не только фотосинтетического, но и дыхательного метаболизма.

Принципиально важным для понимания механизмов саморегулирования жизнедеятельности растений является заключение о том, что взаимообусловленность донорно-акцепторных отношений фотосинтеза и дыхания в ассимилирующей клетке мутангньк растений меняется таким образом,что в условиях пониженной фотосинтетической функции дыхание становится дополнительным" источником АТФ.СОз,восстановителя и низкомолекулярных соединений,необходимых для биосинтетических процессов.

Практическая значимость.Подученные результаты могут быть использованы в качестве разработки тестов по прогнозированию гетеро-зисного эффекта на ранних стадиях развития растений.Существование качественных компенсаторных изменений в дыхательном метаболизме у М 2004 и наследование их гибридами позволяет рекомендовать для получения продуктивных форм подбирать родительские пары таким образом,чтобы в гибрвдных клетках высокие фотосинтетическая и дыхательная активности соотносились как 1:1.

'Тпробация работы.Материалы диссертации докладывались и обсуж-

дались на научных семинарах отдела молекулярной биологии НИИ биологии н биофизики Томского госуниверситета,отдела фотобиотехнологии Института почвоведения и фотосинтеза РАН (г.Пущино), на заседании кафедры физиологии растений Санкт-Петербургского госуниверситета; на региональной (Уфа,1987) и III,1У Всесоюзных конференциях молодых учёных (Петрозаводск,1988;Минск,1990); на I Всесоюзном совещании "Использование изогенных линий в селекционно-генетических экспериментах" (Новосибирск,1990); на У Международной школе-конференции "Регуляция метаболизма в растениях" (Варна,-1990) ; на II съезде ВОФР (Минск,1990); на Международной конференции "Фотосинтез и фотобиотехнология" (Пущино,1991).

Публикации.По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Структуре и объём диссертации.Диссертация состоит из введения, четырёх глав, обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 300 наименований, приложения. Работа представлена на 205 страницах машинописного текста, включает 23 таблицы и 22 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава I представляет собой обзор литературы, обобщающий данные по функционировании и регуляции гликолиза, ОПФП, цикла КреСса н электрснтранспортной' цепи в зелёных листьях растений, а также рассмотрены флзколого-биохимкческие к молекуяярно-генетическне аспекты взаимосвязи фотосинтеза и дыхания.

Глава II содержит описание материала и методик исследования. В работе использовали хлорофилльиые мутанты из коллекции К.К.Сидоровой (г.Новосибирск), .индуцированные под действием этиленими-ка из гороха сорта Торсдаг. Гибрида М2004ХТ получали, опыляя кастрированные цветки мутанта пыльцой нормальных растений. Урожай зерна составлял *у M 2014 3-5% от'контроля, у M 2004 '- 20-30^, у гибрида - 120-140$, Полевые опыты проводили на экспериментальном yçacTico Сибирского Ботанического сада в 1988-91 гг. согласно arpo- • тоагсксекм требования:« при закладке сеяэкционно-ген*. ических cscnc?:;r'-::aon. В лабораторная условиях растения выращивали в поч- . гзнной гг/яьчуро при ютеисивности освещения 40 • Ю^эрг« ciT^c-* с Ю-'-асогт' .'отсперцйдсм.' Дяя анализа брали одновозрастные развер- • нугзпсся лпз^я'кррзтэго мездоузлия в 10 часов утра.

Содеряак:.а ""срсфияла определял» в 100$ ацетоне ( Mcbtenthe-aors'foiiburn ,IS83), разделение каротиноидов-иетодом тонкослойной грог,атогргф:г;| ( Рлвлзвуни, 1978). Флуоресценция хлорофилла она- ■ визировали на установке 3Hí-2 (Ладыгин, 1986), спектры 8ПР - на

радиоспектрометре РЭ-1306" (Четвериков,1983). Скорость цик-

лического, нециклического фотофосфорилирования и реакции Хилла регистрировали потенциометрически (Hlehimura,I962; Заботин,1970).

Меэоструктуру листьев изучали при микроскопировании мацератов (Мокроносов и др.,1980). СО^-газообмен измеряли на газоанализаторе "lnfralit-4", О^-газообмен - на полярографе (ЗакржевскиЙ и др., 1967). Выделение клеточных структур проводили из свежих листьев при +4°С методом дифференциального центрифугирования (Hat hm an, Edwards ,1975), чистоту фракций контролировали на фаэово-контраст-лом микроскопе МББАУ-42.

Активность карбоксидирующих ферментов и анаэробных дегидроге-наз определяли без специальной очистки (Сарсенбаев,1988) по изменению оптической плотности при длине волны 340 нм (Астафурова, 1932;Юьбеков,1990). Содержание Сахаров измеряли микроматодом (Ермаков, 1972), аминокислот-на автоматическом анализаторе Т-339, бел-ка-по Брэдфорду, малата, лактата, шфувата - энзиматически( Свок, lampreoht,497Ci^ohorBt ,1970). Результаты исследования обработаны статистически с использованием критерия Стьюдента, Достоверными приняты различия при величине Р, не превышапцей 0,05.

Глава III содержит результаты экспериментальной работы и включает два раздела. Раздел III Л посвящен списанию структурно-функциональных изменений фотосинтетического аппарата нормальных, цу-тантных и гибридных растений гороха.

Измерение содержания пигментов показало, что светло-зелёная окраска листьев мутантов обусловлена снижением содержания как суи~ ш хлорофиллов айв, так и каротиноидов (табл.1).

Таблица I.

Содержание Пигментов в листьях гороха

Показатели Хл(а+в) Каротиноиды мг на 1г сырой массы ß-каротин Виолак-___сангин____ от суму.'

Торсдаг 1,88+0,03 0,597-0,04 32,9 18,7

Мута.. 2004 ' 1,45+0,01 0,44+0,02 15,5 30,8

Мутант 20т4 ' 1,01)+0,03 0,3Ii0,^I 22,7 21,7

ГЫрид М2004ХТ 1,67+0,02. 0,59+0,01 26 J .22,6

Более дета, ное изучение пигментного фонда выявило наличие у изучаемых вариантов всех известных спектральных форм хлорофиллов пигмент-белковых комплексов. Результаты исследования низкотекпера-

-б-

I

-0¡ 1

йяусресценцкя, отн.ед.

Эяусресценцкя, отн.ед.

Флуоресценция, отн.ед.

&

■го1

о

i

а fi

M

о о

-з

о

я £

1 4 _ 3 I 3 4

Рис.2. Схематическое

&Ч ;•• ''ö'-'Vv^-O ^"'ViU'* изображение попереч-г.-"г, С? vß'^3 срезов листьев

2 £ ~ 5 1-верхний эпидермис;

^ j ö МУТАЯТ 2004 2-нижний эпидермис;

1 з _ 3 4 3-устьица;

sfy Ъ&^'ГУЪ?^1?- *' 4-столбчатая паренхи-

,-v'-' ^-'л CTV1- "'?) О'-' -Ii; f.; .ГЬ - .

b^Pit^.'-'V'i.-^ ^/X iX ov;-" 5-губчатая паренхима;

. Щ 6-тжкпвттт

2 6 5 iOTAHT20I4 ¿T^^S

нсаению к исходной форме. На основании этих 'фактов можно предполагать специфическое нарушение в структуре СС I в хлоропластах М 2004, несмотря на то, что методом гель-электрофореза было установлено наличие полного спектра хлорофилл-содержащих полос у всех вариантов. Спектр излучения флуоресценции формы 2014 почти не отличается от контроля, за исключением увеличения свечения полос 686 ни и 697 нм, принадлежащих фсгосистеме II. Это может бить вызвано резким снижением содержания хлорофилла, а также нарушением взаимодействия светосборпика и реакционных центров.

Несмотря на сохранение всех пигмент-белковых комплексов в хлоропластах мутантов, число реакционных центров у них значительно снижено по отношению к контролю, что коррелирует с уменьшением содержания ^-каротина (табл.1,2). Гибридные растения хярактеризупт-сп тенденцией к увеличению числа центров обеих фотосистем и наиболее сбалансированным соотношением их числа. Уменьшение числа ре-. . лишенных центров SC I и СС П у мутантов вызвало изменение в скорости первичных реакций фотосинтеза. Так,оказалось, что в изолированных хлоропластах цутантов скорость переноса электронов по циклическое путл (ЦФФ) снижается по сравнения с контролем, но при этом дефицит фотосинтетического АТ5 частично компенсируется за счёт увеличения скорости нециклического фотофосфорюшровения(НЦМ), Отношение Р/25 в хлоропластах М 2014, превышающее единицу, даёт оснозание предполагать у него существование дополнительных сопря-гащих центров фосфорилирования.

Сравнительное изучение мезоструктуры листа показало, что у ?.утантов число хлорофиллоносных клеток и число хлоропластов в единице площади листа ниже контроля (твбл.2;рис.2). По-видимому, это

Таблица 2.

Структурно-функциональная характеристика фотосинтетического аппарата листьев гороха.

¡Ьлазатель Торсдаг Мутант 2004 Мутант 2014 ' о0о!х?

Число реакц.цжроа £С ЫО14 на 1г сь-р. массы 11,00 3,78 3,80 11,88

Число реакц.цектрсз <& ШЮ1^ -" -и -н 9,24 5,29 2,47 11,05

Циклическое фотсф-иа, жоль АТФ-нг Хл^"1 359,4+18,3 111,2+17,8 125,3+9,8- 450,4+12,1

Нециклическое фотсф~ие, -и -» -» 329,1+8,1 580,4714,7 686,9+19,4 388,7+11,8

Реакция Хилла, мкмоль Фц.мг 571,4+21,3 634,8+18,5 628,5+17,3 835,1+22,4

Отношение Р/23 . 0,58 0,91 1,10 0,48

о •

Число клеток,тыс.« см палисадная ткань 53,2+2,1 33,7+0,9 36,8+2,9 54,4+3,5

губчатая ткань 81,4*3,9 58,3+2,7 58,1+2,2 100,9+5,1

Объём клетки,тыс.мхм^ палисадная ткань 21,4+1,3 13,3+0,2 ' 24,1+1,4 17,6+1,5

губчатая ткань 8,350,5 10,1ТО,6 • 9,8+0,7 10,0+0,8

Число хлоропластов в клетке палисаднзя ткань 18,0+0,5 29,0+1,9 15,1+0,4 20,2+0,5

губчатая ткань 9,9+0,2" 15,0+0,8 9,6+0,2 13,1+0,2 Число-хлоропластов в единице площади листа, млн «см-*^

. палисадная ткань 9,5+0,4 10,1+0,5 ■ 5,3+0,1 ' 11,2+0,5

губчатая ткань 7,5«),2 8,6ТО,4 4,5+0,1 13,3+0,6

Активность РуБФ-карбоксилазы,Е на 1г сыр.массы 5,54+0,24 10,19+0,33 8,87+0,43 6,1+0,19

_» _» гафд-надш2 -я 24,2+1,4 - 72,9+2,5 9,8+1,8 38,4+4,5

_я _н $ЕП-яарбоксилазы ~в 1,15+0,08 ' 2,44+0,13 1,83+0,09 _

_» _» _пцдг„над®г -» 2,1+0,08 9,ото,ii 4,4+0,02 * 3,2т0,06

является основной причиной снижения содержания хлорофилла. Увеличение числа реакционных центров у гибридов, максимальные скорости первичных реакций фотосинтеза,вероятно, можно объяснить большей насыщенность!), по сравнению с контролем, хлоропластами единицы ассимилирующей поверхности. Это достигается наследованием со стороны исходного сорта нормального числа клеток, а от мутанта 2004 - повышенного количества хлоропластов в них. Полученные данные о степени насыщенности хлоропластами единицы поверхности листа хорошо согласуются с повышением у гибрида и понижением у мутантов плато световой кривой фотосинтеза (рис.3). Следует отметить, что уже при низком уровне освещённости у гибрида начинается поглощение СО.? Это может быть связано с активной работой ферментов фотосинтетического метаболизма (табл.2). У мутантов, по-видимому, потенциальная карбок-силирующая активность высока, но у М 2014 она не может быть реализована из-за дефицита фотопродуктов. У М 2004 активную работу ГАФД и МДГ, вероятно, можно объяснить существованием дополнительных механизмов, поставляющих АТФ и НАД1'Н.

Высокая карбоксидирующая активность РуБ1^карбоксилапы в листьях мутантных растений находится в противоречии с пониженными значениями основных фотосинтетипеских параметров. Возникает вопрос: каг ч образом поддерживается активность этого ключевого фермента цикла Кальвина?.По-видимому, для поддержания работы РуБФ-карбокси-лазы включаются различные механизмы регуляции, обеспечивающие подачу к центрам карбоксилирования. В свете идей о донорно-ак-цепторных взаимоотношениях фотосинтеза и дыхания логично предположить, что наиболее вероятным источником, поставляющим СО^, АТФ и восстановитель в цикл Кальвина, являются реакции дыхательного

Рис.3.Световые кривые фотосинтеза листьев

нормальных, мутантных и гибридных растений гороха

-Ю-

метаболизма.

Раздел II 1.2 посвящен изучению дыхательного -мотаболиэмл в листьях нормальных, мутантных и гнбридных растений гороха.

О функционировании того или иного пути метаболизма судят «о многим показателям, в том числе по содержании субстратов и активности ключевых ферментов, по локализации энзима в определенном клеточном кокпартменте, где наблюдается его максимальная активность. Специальные исследования показали, что к числу маркёров гликолиза относятся фосфофруктокииаза, глнцеральдегидфосфатдегидрогснапа (ГАФД)'и пнруватккназа (ПК) ^ окислительного пентозофосфатного пути -глгкозо-б-фосфатдегидрогеназа (Р5ДП и б-фосфоглгкендтдег^ярсгеия-за; цикла Кребея-изоцитратдегидрогсназа , 11ДГ) .сукцинатдегидрогена-за и малатдегидрогенаэа (МДГ).

Изучение активности ферментов дыхательного метаболизма показало высокую активность ПДГ в листьях мутантных и гибридна растений, что свидетельствует о возможности функционирования 0П5Л при одновременно идущем фстссинтеэо (табл.З). Что касается гликолиза, то, судя по активности ГАЗД и ПК, он активно работает у У 2004 и гибрида. В листьях М 2014,несмотря на го,что ГА2Д активнее, чем з контроле, функционирование ПК, епределяязей скорость потока углерода на терминальном участке гликолктической цепи, ниже. Повмзенио скорости работы лактатдегидрогеназы у !1 20.4 и алкогольдегидрогена-эи у гибрида коррелирует с активным протеканием промежуточных этапов гликолиза, что обеспечивается за счёт регенерирования НАД в реакциях превращения пирувата в этанол и лактат. Следует отметить, что у низкопродуктивной формы 2014 регенерация НАД идёт, вероятно, по более короткому, лактатдегкдрогеназному пути.

Исследование активности ИДГ, являкзейся первш пунктом контроля скорости работы ЦТК,показало актиннуп работу как НАД-, так и НАД1>-эавиС1гыогр .фермента у И 2004 (табл.З). Существование в цикле Кребса двух аллсстерическкх ферментов, катализирующих одну и -у же реакцию, связано с их взаимозвменяемостьп. Так, снижение пропускной способности ЦГК, судя по падения активности ИДГ-НАД у М 2014, частично компенсируется за счёт повышения активности ИДГ-ИАП5. Детальное исследование активности этого фермента выявило, что у Ь* 2004 и гибрида увеличение скорости работы ИД '-11АДФ в гомогенате коррелирует с ирвьггением активности в митохондриальной, ядерной и цитоплазматической фракциях (табл.4). У М 2014 это увеличение происходит в основном за счёт цитоплазматической фракции.Вынос цитрата из митохондрии в цитоплазму и его декарбоксилирование является

Таблица 3.

Активность ферментов дыхательного метаболизма в . листьях растений гороха, Е на I г сырой массы

Фермент Торсдаг Мутант ' Мутант Гибрид

2004 2014 2004ХТ

Глюкоз о-6-фосфатде гид-рогеназ" 3,9+0,2

Гяицеральдегидфосфат-дегидрогеназа ' 1,5+0,03

Пкруваткиназа 0,62+0,02

Лактатдегидрогенаэа 0,84+0,02

Алкогольдегидрогеназа 9,2+0,3

Изоцитратдегидрогеназа,

НАД 4,3+0,08

Иао^итратдегидрогеназа, ^ ^ ^

Ыалатдегидрогеназа,

НАД • .55,0+1,8

Малатдегидрогеназа,

НАДН 78,1+0,86

Ыалкн-энзкм.НАДО 0,91+0,03

11,8+0,3 18,2+0,4 6,3+0,1

2,9+0,07 4,1+0,1 2,2ТО,09

1,06+0,03 0,4270.01 0,84+0,02

0,89+0,02 1,38+0,04 0,62+0,01

8,1+0,02 7,6+0,2 10,8+0,4

20,3+0,92 2,7+0,09 19,6+0,84

50,9+1;84 24,5+0,59 41,4+1,13

44,5+1,7 22,1+0,9 55,7+1,3

149,1+5,9 270,4+9,3 97,6+1,7

1,08+0,04 4,10+0,09 0,69+0,02

Таблица 4. •

Активность изоцитратдегидрогеназы-НАДФ в субклеточных фракциях листьев гороха, Е ни I г сырой кассы

Варианты Митохондрии . Хлоропластн" Ядра • Цитоплазма

Торсдаг 7,5ТО,2 5,2+0,2 4,1+0,1 17,3+0,4

Цутант 2004 16,1+0,5 ' 5,8+0,2 10,8+0,3 '35,8+1,2

Мутант 2014 7,0+0,1 ■ . 4,3+0,1 3,5+0,1 . 26,7+0,9

Гибрид 2004ХТ 10,2+0,2 8,8+0,2 . 7,6+0,2 33,5+0,8.

дополнительным источником СО2 и НАДФН и имеет важное значение для поддержания работы цикла Кальвина у мутантов. У гибридных растений наблюдается также активация этого фермента во фракции хлороплас-тов, что облегчает доступ экзогенного СО^ к центрам карбоксилиро-вания. Другой ключевой фермент в ЦГК - НАД-зависимая малатдегидро-генаэа, определяющая работу цикла на последней стадии. Система МДГ является уникальной для изучения связи между органеллами, п.ос-

кольку различные и высокоспецифичиые формы этого фермента находятся почти в каждом клеточном компартменте. Сравнительное исследование активности МДГ-НАД показало значительное снижение у М 2014«что соответствует показанному ранее падению активности ИДГ-НАД(табл.3). У М 2004 и гибрида ЭДГ-НЛД остаётся на уровне контроля.Вероятно,на терминальном участке цикла поддерживается определённый уровень ок-салоацетата для конденсации с ацетил-Ко Л, избыток которого регулируется с помощью ВДГ-НЛДН, восстанавливающей 1Щ до малата. Кроме того, существует конкуренция за малат между МДГ-НАД и'малик-энзимом (МЭ), декарбоксилирущим яблочную кислоту с образованием пирувата. Изучение активности этих ферментов п гомогенате показало существенное превышение активности МДГ-НАДН и МЭ у »мутантов, у гибридных растений ВДГ-НАДН незначительно превышает уровень контроля, а для МЗ характерно падение активности. Анализ ВДГ-]ВД1 в клеточных фракциях показал, что в митохондриальном компартменте стабильная работа цикла Кребса обеспечивается за счёт повышения активности МДГ-НЛД[1, причём у нии и и 2014 обращение конечной реакции цикла протекает наиболее интенсивно. Активация МДГ-НДДД у М 2014, по-видимому, обеспечивает накопление малата, который активирует работу анаплсротипеского фермента МЭ, восполняющего недостаток глнко-литического пирувата в' цитоплазме этоП линии.

Активность изученных ферментов коррелирует с содержанием гслю-певьк' метаболитов. Так, уменьшение количества Сахаров в листьях цутантных и гибридных растений мояет быть .связано с их активной утилизацией в ОГЙП и гликолизе (табл.5).

. ._ ' . ' Таблица 5. ____

Содержание некоторых метаболитов в листьях растений гороха

Метаболит Торсдаг Мутант 2004 Мутант 2014 Гибрид

Редуцирующие сахара, кг на I г сырой маеси

10,3+0,27 9,7+0,16 9,170,31 7,1+0,23

9,8+0,33 6,1+0,25. 5,470,11 6,270,29

Пирувят, : л ! г.оль на 1 г енрой массы

0,67+0,02 1,27+0,04 0,53+0,01 1,6070,03 -

Лпггтат, 0,1270,005 0,09+0,003 0,28+0,004 0,0870,002

Малат, 13 37+0,04 1,23+0,05 2,15+0,08 0,7870,02

Лспартат, -г' 19,9+0,61 25,8+0,75 39,1+1,42 ■ 10,8+0,36'

Алании, /2,7+1,61 10,0+0,47 12,6+0,98 10,1+0,97

Серии, 26,8+1,1 9,6+0,38 54,2+2,1 18,670,88

ГЛИЦКН, 1,2870,07 1,95+0,09 0,79+0,034 1,2470,08

Пролин, 1,09+0,06 3,28+0,15 3,55+0,16 4,43+0,11

Активная работа лактатдегидрогенаэы у М 2014 соответствует .повышенному содержанию лактата, накопление пирувата в листьях М 2004 и гибрида может быть связано, с одной стороны, с активацией ПК,с другой стороны, это коррелирует с уменьшением количества аминокислот семейства пирувята - аланина и валина. Высокое содержание пролина, являющегося конечной аминокислотой в цепочке превращений ¿¿-кетоглу-тарата, можно объяснить повышенной активностью ИДГ-КАДФ у изученных форм гороха. С ферментами малатной шстемы хорошо коррелирует содержание яблочной кислоты.Так, М 2014 характеризуется повышенным содержанием малата как в гомогенате,. так и в митохондриях,наряду с увеличением активности МДГ-НАДН и МЭ.Причиной снижения содержания малата у гибрида может быть ускоренное выведение из ЦГК и вовлечение его в биосинтетические процессы. Повышение количества ас-партата в листьях М 2QI4 согласуется с высоким содержанием малата, процесс взаимопревращения которых характеризует уровень восстанов-лениости в клетке.Снижение содержания других аминокислот семейства аспартата у М 2014 - лизина и треонина свидетельствует о преимущественном превращении аспартата и малата. В листьях гибрида наблюдается противоположная тенденция. Увеличение содержания серина при уменьшении глицина у М 2014, скорее всего, связано с реакциями фотодыхания и может являться дополнительным источником COg в клетке.

Изучение О^-газообмена выявило незначительное увеличение скорости поглощен*.! 0^ у мутантных растений по сравнению с контрольными, однако скорость поглощения Og изолированными митохсьдриямк мутанта 2004 существенно превышает контроль, что хорошо согласуется с высокой скоростью работы ЦГК, Интересно отметить, что у Ы 2004 оценка интенсивности дыхания по выделению COg находится в противоречии с данными по 0^'-газообмену:замедление скорости выделения COg свидетельствует о торможении дыхательных процессов, тем не менее активация ЦГК и большая скорость поглощения 0^ митохондриями говорит об обратном. Вероятно, в листьях линии 2004 происходит рагге»-миляция СО2 дыхательного происхождения в цикле Кальвина.

Таким образом,полученные результаты показывают, с;о и листьях муп тов и гибридов дыхательный метаболизм в целом протекает интенсивно. Но если у М 2014 значительная чг^.ть сахаров отвлекается б 0ПФЛ, то у М 2004 это происходит с меньшей скоростью. Гликолиз работает у обоих мутантов также интенсивно, но у формы 2014 'заключительный его этап заторможен. Цикл Кребса у М 2004 функционирует с большой скоростью, а у линии 2014 его пропускная способность ограничена. Для гибрида характерно ускорение дыхательного метаболизма

i s a

сазы онтогенеза.

'I в и

фазы OHTorsweia

'i s

фазы онтогенеза

i и к

фагы онтог=нага

F;:o.4.Дтшш:-(а некоторая фотостгееткчесхкх и дгаательта па-ранетроз лдстьез гороха а онтогенезе: -Торсдаг; -нутант 2004; - с.утант 2014

на уровне, промежуточном между исходной формой и Ы 2004.

Глава 1У содержит результаты исследования динамики некоторых показателей фотосинтетической й дыхательной деятельности листьев гороха в процессе онтогенеза. Изучение проводили на трёх стадиях развития: 1-ювенильной, П-цветения, Ш-плодоношения.

Оказалось, что такие фотос*нтетические параметры, как содержание хлорофилла, сахарозы, активность ГАфЦ, чистая продуктивность фотосинтеза (ЧПФ), скорость фотофосфорилирования-сохраняют закономерность отличия мутантов от контроля в течение всего вегетационного периода (рис.4; на рисунке приводятся лишь некоторые из них). Для большинства изученных параметров характерен пара.тающий ход кривых с максимумом в фазе цветения, падение скорости ЦФ5 ко II фазе связано, вероятно, с активацией реакций, идуцих с образованием восстановителя. Это, в свою очередь, может являться причиной увеличения содержания сахарозы и повышения активности ГАФД при переходе в генеративную фазу. Несмотря на то, что динамика кривых ЦФФ и ЧШ находится в противогазах, тем не менее эти показатели чётко коррелируют на всех стадиях онтогенеза.

Сравнительный анализ некоторых реакций дыхательного метаболизма показал, по содержание редуцирующих Сахаров и малата возрастает к фазе цветения, в то время как активность катаболических ферментов, в частности, ГФДГ и ВДГ-НАД - падает. Однако высокая активность на этой стадии ферментов палатной системы свидетельствует о возможности активации реакций темнового дыхания. Высокое содержание малата у Ы 2014 соответствует повышенной активности МДГ-НАДН и МЭ, а снижение малата у Ы 2004 объясняет низкую активность МЭ на всех стадиях онтогенеза. ' ..

Таким образом, выявленная корреляция урожая семян с' отдельными физиологическими параметрами на данной конкретной модели позволяет рзкомендовать их в качестве тестов ранней диагностики потен-ч-гальной продукт явности растений. Условная оценка физиологического состояния растений даёт возможность в целом оценить картину обмана веществ у исследуемых объектов (табл.6).Скорость функционирования фотосинтеза и дыхания у исходной формы принимали за единицу и по- отношению к ней проводили сравнение других вариантов.

В листьях мутантньк растений уменьшение "К" связано с окислительной направленностью метаболизма. У Ы 2004 повревдэдее действие мутации частично компенсируется за счёт увеличения числа хло-ропластов в клетке и компенсаторного повышения.скорости реакций дыхательного метаболизма, однако возможности фотосинтеза ограни-

Таблица 6.

Условная оценка физиологического состояния растений

Варианты Фотосинтетическая активность Дыхательная активность К* Зерновая продуктивность

Торсдаг + + + + + + I 1005?

Мутант 2004 + +■ + +' + '+ 0,5 20-30%

Мутант 2014 + + + + 0,3 3-5%

Гибрид 2004ХТ + + + + + + + + I 120-1405?

ЙК - соотношение фотосинтетической и дыхательной активности; "+"- оценка в баллах

чены вследствие мутации, и продуктивность снижается (К<1). У М 2014 подобный компенсаторный эффект отсутствует, поэтому низкая фотосинтетическая активность, наряду с окислительной направленностью метаболизма, приводит к резкое падению урожая семян (К«1). У гибрида "К" также, как и у исходной формы, равен единице, однако это достигается более высоким стационарным уровнем фотосинтеза и дыхания. В клетке гибридного растения, видимо, создаётся новый . уровень обмена веществ-, определяемый нормальной структурой фотосинтетического аппарата контрольных растений и снятием ограничения со стороны дыхания, наследуемым от мутанта 2004. Высокая урожайность гкбрвда обеспечивается за счёт полной реализации всех возможностей фотосинтетического аппарата, определяемой усилением запроса со стороны дыхания. 3 итого, путём максимального использования продуктов фотосинтеза в метаболических процессах,у гибрида увеличивается доля репродуктивных органов по сравнению с вегетативными. .

ВЫВОДЫ'

I.Сравните льнов изучение фотосинтетйческого аппарата мутант-иьпс к гибридны* растений позволило обнаружить особенности его организации, обеспечивающие различную функциональную активность. У 11 2014 сшкено содержание пигментов, число реакционных центров 2С I и $С II, зймздяейа скорость Щ5Ф и поглощения С0£, но увели- . чена скорость и реакции Хилла при повышении отношения Р/2®. У И 2004 также сажено содержание пигментов, уменьшено' число реакционных центров преимущественно I ®С, замедлена скорость ЦФ5 и поглощения С02, увеличена скорость НЦФЗ. Гибрид характеризуется содерюшием пигментов на уровне контроля, увеличением числа реакционных центров обеих фотосистем, а такие максимальной ско-

ростью поглощения COg и первичных реакций фотосинтеза.

2. Снижение функциональной активности у М 2014 коррелирует с уменьшением числа хлоропластов в единице ассимилирующей поверхности. УМ 2004 снижение числа хлоропластов сопровождается качественными изменениями в структуре ФС I, о чём можно судить по смещению полосы флуоресценции 735 нм в коротковолновую область и по нарушению агранальных тилакоидов. У гибрида функциональная способность фотосинтетического аппарата обеспечивается большим, по сравнению с контролем, насыщением хлоропластами единицы площади листа.

3. Отличия в фотосинтетической активности приводят к изменению в дыхании у изученных форм гороха. Б ответ га депрессирующее влияние хлорофилльной мутации в листьях цутантных и гибридных растений включаются компенсаторные реакции, основанные на донорно-акцепторных отношениях фотосинтеза и дыхания.

4. У М 2014 активируется ОГШ и начальные этапы гликолиза,но угнетаются пируваткиназа и ферменты цикла lipeöca. У М 2004 и гибрида увеличивается скорость всех этапов темнового дыхательного метаболизма.

5. Активация дыхательного обмена, наследуемая гибридом от Ы 2004, снимает ограничивающие составляйте потенциальных возыокнос-тей фотосинтеза и выводит обмен гибридных растений на более высокий, по сравнению с контролем, уровень.

б.Основнн!? различия между мутантньыи и гибридными растениями, выявленные на первой стадии развития, сохраняются в терние всего онтогенеза.

7. Изучение фотосинтеза и дыхания у мутантных и гибридных растений, механизмов их взаимосвязи позволяет разработать физнояого-биохимические тесты условной оценки потенциальной продуктивнееv.i растений на ранних стадиях развития. Существование качественных компенсаторных изменений в дыхательном метаболизме у М 2004 и наследование их гибридом позволяет рекомендовать для получения продуктивных форм подбирать родительские пары таким образом, чтобы в гибридных клетках высокие фотосинтетическая и дьдап.льная активное 'л соотносились как 1:1.

Список публикаций по теме диссертации.

1.Ьайшля О.Б.Соотношение фотосинтеза и да .сания у нормальные

и мутаитных растений гороха/Дезисы докл.III Всесоюзной к'окф.молодых учёных по фглиологии раст.клетки.-Петрозаводск,1988.-С.62.

2.Вайшля 0.Б.Изучение компенсаторных реакций метаболизма у ну-тантных растений гороха/Дезисы докл. 1У Всесоюзной конф.молода:

учёных по физиологии раст.клетки.-Минск,1990.-С.40.

3.АсТафурова Т.П.,Вайшля 0.В.,Ладыгин В.Г..Соколов В.А. Физиологические особенности мутантов гороха, различающихся по продукт« вности//Материалы I Всесоюзного совещания "Использование изо-генных линий в селекционно-генетических экспериментах",Новосибирск. -1990, -С. I2I-I23.

4.Вайшля О.Б. ,Астаг'урова Т.П.,Зайцева.Т.Д. .Соколов В.А.Метаболические изменения в листьях нормальных и мутантиня растений гороха при действии экстремальных факторов/материалы I Всесоюзного совещания "Использование изогеннык линий в селекционно-генетических экспериментах",Новосибирск.-1990.-С.118-120.

5.Ладыгин В.Г.,Вайшля О.В,,Семёнова Г.А..Астафуроэа Т.П.,Со-колов В.А.Характеристика фотосистем и структуры хлоропластов хло-рофилльных мутантов гороха/Дам яе. -С Л24-125.

6. Vayshla О.В. Tha physiological study of poa heterosis // Vth International youth nyfflpoaium on plant metabolion regulation. Abstracts» 0-13 Ootober, Varna»—199^.—P.1?.

7.Ва!!1зля О.Б. .Ладыгин В.Г. .Соколов В.А. .Астефурова Т.П.Меэо-ультраструктура и функциональные особенности фотосинтзтического аппарата хлсрофиллышх мутантов fopoxa/Дезиси докл.Мевдунар.конфу "Фотосинтез и фотобиотехнология".-Цутцино,1991.-С. 88-В9.

6.Астафурова Т.П.,Вайшяя 0.Б.Влияние гипоксического стресса на метаболизм хлсрофилльных мутантов гороха/Дёзисы докл.Меящутгар. конф. "Фотосинтез и фотобиотехнология".-Пущино,1991.-С.87-88.

Э.Калашников D.E..Вайшля О.Б.,Балахнина Т.Н..Закржевский Д. А.Фотосинтетические реакции и ферменты защиты у пигментных мутантов гороха при аэрагии и гипоксии//Цитология.-1991.-Т.33, $5.-С. 104.