Влияние ксенобиотиков и тяжелых металлов на систему микроорганизм-растение

Колесников, Олег Васильевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние ксенобиотиков и тяжелых металлов на систему микроорганизм-растение
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние ксенобиотиков и тяжелых металлов на систему микроорганизм-растение"

005008139

Колесников Олег Васильевич

ВЛИЯНИЕ КСЕНОБИОТИКОВ И ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ НА СИСТЕМУ МИКРООРГАНИЗМ-РАСТЕНИЕ

Специальность 03.02.03 - микробиология

1 9 ЯНВ 2672

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2012

005008139

Диссертация выполнена на кафедре микробиологии и иммунологии ФГБОУ ВПО Российского государственного аграрного университета-МСХА имени К.А.Тимирязева

Научный руководитель: Доктор биологических наук, профессор

Емцев Всеволод Тихонович Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Васильева Лина Васильевна

кандидат биологических наук Благовещенская Генриетта Германовна

Ведущая организация:

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт кормов имени В.Р.Вильямса Россельхозакадемии

Защита диссертации состоится «15» февраля 2012 г. В 16 час 30 мин на заседании диссертационного совета Д 220.043.03 при Российском государственном аграрном университете - МСХА имени К. А. Тимирязева.

Адрес: 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 49. Ученый совет РГАУ -МСХА имени К.А. Тимирязева.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Российского государственного аграрного университета - МСХА имени К.А. Тимирязева

Автореферат разослан «/¿?.» января 2011 г.,

размещён на сайте университета www.timacad.ru и направлен по адресу

referat_vak@mon.gov.ru

Отзывы на автореферат (в 2-х экземплярах заверенных печатью), просим направлять по адресу: 127550 г. Москва, ул. Тимирязевская, 49; тел. факс: 8(499) 976-24-92

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

О.В. Селицкая

Актуальность исследования. В настоящее время, в связи с развитием цивилизации, значительно увеличивается антропогенная нагрузка на экосистемы. В частности, растет количество тяжелых металлов (ТМ), выбрасываемых в окружающую среду. В частности, одним из источников ТМ является автотранспорт, причем это не только свинец, содержащийся в бензине, но и множество других металлов и соединений. Этот источник загрязнения отличается еще и тем, что действует в непосредственной близости к человеческому жилью, в отличие от различных промышленных объектов, таких как заводы, электростанции, свалки и другие поставщики ТМ в биосферу. При этом количество автомобилей в последние годы только увеличивается, технологий же, позволяющих радикально снизить их негативное воздействие на окружающую среду не предвидится. Первыми под удар попадают зеленые насаждения вдоль дорог, поглощающие значительную часть вредных веществ из дорожных стоков, задерживающих аэрозоли, снижающих шумовое воздействие транспортного потока и вообще играющих важную гигиеническую роль в городских условиях. Таким образом, важной задачей становится повышение устойчивости зеленых насаждений к неблагоприятным факторам.

В последние десятилетия наблюдается рост интереса к различным биологическим технологиям защиты растений и восстановления загрязненных почв. В частности, известно, что обработка растений некоторыми микроорганизмами-симбионтами способна значительно увеличить их устойчивость к самым различным неблагоприятным факторам, начиная от засухи или пониженной температуры до засоления почвы или загрязнения ее ТМ. При этом значительный интерес представляет более глубокое понимание механизмов работы этого симбиоза и поиск путей для повышения его эффективности.

Еще одним способом использования растений в защите окружающей среды является так называемая фиторемедиация — очистка различных сред от загрязнителей с помощью растений. Фактически при этом работают сим-биотические микробно-растательные комплексы. Увеличение их устойчивости к ТМ и другим неблагоприятным факторам — важная задача, способная повысить эффективность их работы. Еще одним важным для фиторемедиа-ции свойством симбиотических микроорганизмов является усиления способность растений накапливать тяжелые металлы. В данный момент данные о подобном воздействии микроорганизмов достаточно противоречивы, однако более подробное изучение механизма, вызывающего подобный эффект, может значительно повысить эффективность работы растений-гипераккумуляторов или позволит использовать для фиторемедиации обычные декоративные виды, не имеющие в норме выраженных гипераккумуляторных свойств.

Цель работы: изучить влияние токсикантов на систему микроорганизм-растение.

Задачи исследования. Для достижения вышеозначенной цели были поставлены следующие задачи:

1-7

(

1. Исследовать влияние солей тяжелых металлов на численность симбиотических микроорганизмов в эндосфере корней и листьев растений, а так же динамику ее изменения.

2. Исследовать влияние загрязнения почвы ТМ на интродуциро-ванную популяцию R. planticola в системе почва-растение

3. Изучить влияние бактерии Klebsiella (Raoultella) planticola на рост и развитие различных видов газонных трав в условиях загрязнения почвы смесями солей тяжелых металлов.

4. Исследовать протекторное действие R. planticola в условиях загрязнения несколькими тяжелыми металлами и сформулировать рекомендации по ее применению в составе биопрепаратов.

Научная новизна исследования. В работе впервые исследовано протекторное действие R. planticola на растения при загрязнении почвы смесью нескольких тяжелых металлов, характерных для выбросов автотранспорта. Выявлено, что инокуляция в данных условиях оказывает заметное положительное воздействие на различные параметры растительных организмов. Так же отмечены различия в воздействии микроорганизмов на разные виды растений. Исследованы некоторые аспекты изменения численности микроорганизмов и динамики их миграции в ткани растения в зависимости от условий внешней среды (наличия или отсутствия ксенобиотика). Обнаружены различия в эффективности различных методов инокуляции. Отмечено увеличение накопления меди и цинка в тканях растений, инокулированных R. planticola.

Практическая значимость. Результаты данного исследования свидетельствуют, что инокуляция R. planticola может в значительной степени ней-трализовывать негативный эффект, оказываемый различными тяжелыми металлами на газонные травы. Таким образом, биопрепараты на основе R. planticola могут быть использованы для защиты растений от действия ТМ. Так же было показано, что инокуляция методом полива взвесью микроорганизмов эффективнее, чем инокуляция замачиванием семян. Это позволяет рекомендовать данный метод инокуляции для практического использования. Кроме того было обнаружено, что инокуляция овсяницы красной сорта "Золушка" R, planticola заметно усилила накопление ТМ в тканях растения. С одной стороны, это накладывает определенные ограничения на использование R. planticola для защиты растений, используемых в пищу животных или человеку. С другой — открывает широкие перспективы использования в фитореме-диации почв, загрязненных тяжелыми металлами.

Апробация.

Результаты исследований были представлены на международной научной конференции молодых ученых РГАУ-МСХА (Москва, 2010), на II международной заочной научно-практической конференции "Информационное пространство современной науки" (Чебоксары, 2010), а так же молодежном научном экологическом форуме "Экологические последствия засухи и пожаров 2010 года" (Москва, 2011).............

Публикации. По результатам исследований опубликовано 3 работы, в том числе одна статья в рецензируемом издании, рекомендованном ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы; описания объектов, методов и условий экспериментов; результатов экспериментов и их обсуждения; выводов. Объём диссертационной работы составляет /00с., из них / с. приложений. Работа включает -fp) таблиц, рисунков, список литературы из ¿LOO наименований (в том числе на иностранных языках).

Объекты и методы исследований Микроорганизмы

В работе использовался ассоциативный азотфиксатор RaoulteHa planti-cola, штамм ТСХА-91 AmpR, входящий в состав биопрепарата "Биоплант -К". Штамм Raouhella planticola ТСХА-91 AmpR был выделен в лаборатории микробиологии РГАУ-МСХА имени К. А. Тимирязева из ризопланы огурца (Емцевидр., 1995).

Растения

В качестве модельных растений были использованы несколько видов овсяницы (Festuca rubra, F. rubra commutata, F. ovina), райграс пастбищный (Lolium perenne) и полевица собачья (Agróstis canina).

Загрязнители

Смесь №1 — ZnS04, CuS04 и РЬС03 в количествах, соответствующих 2300 мг Zn на килограмм грунта, 300 мг/кг Си и 3200 мг/кг РЬ, что в 100 раз превосходит предельно допустимую концентрацию этих металлов в почве.

Смесь №2 — ZnS04, CuS04 и РЬ(СНзСОО)2 в количествах, соответствующих 2300 мг Zn на килограмм грунта, 300 мг/кг Си и 3200 мг/кг РЬ, что в 100 раз превосходит предельно допустимую концентрацию этих металлов в почве.

Смесь №3 — Zn(CH3COO)2, Cu(CH3COO)2 и Pb(CH3COO)2 в количествах, соответствующих 2300 мг Zn на килограмм грунта, 300 мг/кг Си и 3200 мг/кг РЬ, что в 100 раз превосходит предельно допустимую концентрацию этих металлов в почве.

Смесь №4 — NiS04, Cd(CH3COO)2, СоС12 в количествах, соответствующих 400 мг Ni на килограмм грунта, 500 мг/кг Cd и 500 мг/кг Со, что в 100 раз превосходит предельно допустимую концентрацию этих металлов в почве.

Инсектицид "Фуфанон" — коммерческое название для О,О-Диметил-8-(1,2-дикарбэтоксиэтил)дитиофосфата, он же малатион, карбофос. Достаточно эффективный и популярный фосфорорганический инсектицид, в настоящее время несколько устаревший. Вносился в количестве 200 мг/кг грунта, что так же в 100 раз превосходит его ПДК.

Субстраты

Для культивирования растений в опытах использовалось 3 типа субстратов: дерново-подзолистая почва, речной песок и низинный торф.

Дерново-подзолистая тяжелосуглинистая почва, характерная для средней полосы России, отбиралась на опытном поле ГНУ ВИК имени В.Р. Вильямса. Некоторые характеристики данной почвы приведены в таблице 1.

Таблица 1. Характеристики дерново-подзолистой почвы, использованной в опытах

Содержание гумуса по Тюрину, % рНкс1 Нг, мг-экв. на 100 г почвы N общ., % Подвижного Р, мгна кг почвы Калий мг/кг почвы

1,68 4,88 2,68 0,156 427,4 148,5

Речной песок

В данный тип грунта для улучшения питания растений была добавлена

доломитовая мука, а так же смесь Прянишникова.

_Таблица 2. Характеристики речного песка, использованного в опытах

Общий углерод, % рН кс! Нг (мг-экв. на 100 г почвы N общ., % Фосфор мг/100 г почвы Калий Мг/100 г почвы

0,37 7,93 0,23 0,114 27,40 9,03

Низинный торф — нении территории. часто применяется при создании газонов и озеле-

Таблица 3. Характеристики низинного торфа, использованного в опытах

Общий углерод, % рНш Нг (мг-экв. на 100 г почвы N общ., % Фосфор мг/100 г почвы Калий Мг/100 г почвы

11,14 6,05 3,82 0,495 2,34 6,21

Методика проведения вегетационных опытов

Использованные методики и технологии

Обработка растений бактериями Я. р1апНсо1а осуществлялась двумя способами. При инокуляции первым способом (инокуляция замачиванием семян) семена растений замачивались непосредственно перед высевом в суспензии суточной культуры А р!апИсо1а на среде Кг, разведенной стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:50 в течение 30 минут (как показали исследования, это оптимальный режим инокуляции замачиванием).

При инокуляции вторым способом (инокуляция поливом) семена высевались в почву, а сразу после их прорастания производился полив растений суспензией суточной культуры К р!апйсо1а на среде К2, разведенной стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:50 (60 мл на сосуд емкостью 0,5 л).

Для оценки состояния растений производился учет их основных биометрических параметров. В частности определялась средняя длина листьев, проективное покрытие (визуально, с шагом 10%) (Методические указания по проведению полевых опытов с кормовыми культурами). Так же определялась сырая масса листьев и корней — для этого растения извлекались из почвы, листья и корни отделялись, отмывались, высушивались и взвешивались.

Для осуществления микробиологического исследования корни и листья извлеченные из почвы, тщательно промывались, их поверхность дезинфицировалась раствором гипохлорита натрия в течение 3 минут для уничтожения эпифитных микроорганизмов. После этого они растирались в ступке, а полученная суспензия разбавлялась стерильным физиологическим раствором. Разведения полученного материала высевались в трех повторностях до 12-го разведения на полужидкую среду Федорова-Калиниской (Калининская и др., 1981) с сахарозой для определения общей численности азотфиксирующих микроорганизмов в тканях растений. Точная численность определялась методом предельных разведений по таблицам Мак-Креди. Численность ампи-циллинрезистентной К р1апНсо1а, штамм ТСХА-91 определялась путем посева на плотную питательную среду ЬВ (Миллер, 1976) с ампициллином (200 мкг/мл).

Для исследования растительной массы на содержание тяжелых металлов листья и корни тщательно промывались, высушивались до воздушно-сухого состояния и озолялись по методу мокрого озоления в серной кислоте. После этого в полученных вытяжках атомно-адсорбционным методом при помощи спектрофотометра Спектр 5 определялась концентрация тяжелых металлов (меди и цинка).

С целью изучения воздействия ТМ на почвенную микрофлору определялась интенсивность базального и субстратиндуцированного дыхания. Для этого из каждого сосуда отбиралось по 200 граммов почвы, проводилось ее увлажнение и прединкубация в течение 5-7 суток при температуре 22°С.

При определении СИД навеска в 2 грамма почвы помещалась во флаконы известного объема в 4-х кратной повторности и вносили раствор глюкозы из расчета 10 мг на 1 г. почвы. После этого флаконы герметизировали и, после 3,5 часов инкубации при 22°С измеряли на хроматографе Кристалл 5000 количество выделившегося С02.

При определении базального дыхания во флаконы вносилось 2 грамма почвы и 0,1 мл воды, после чего они герметизировались и инкубировались при 22°С в течение суток. После инкубации производилось измерение концентрации СОг во флаконе при помощи хроматографа.

Схемы опытов

Опыт № 1. Первый вегетационный опыт был поставлен в 2008 году и завершен в 2010. Его целью было установить влияние инокуляции растений овсяницы различных видов культурой И р1апПсо!а штамм ТСХА 91, а так же выяснить, как влияют на взаимодействие растения и микроорганизма различные дополнительные условия. В опыте использовались 2 типа растений — травосмесь и овсяница сорта "Золушка". Использовались три разных суб-

страта — торф, речной песок и дерново-подзолистая почва. В качестве загрязнителя использовалась смесь солей тяжелых металлов №1. Инокуляция производилась методом замачивания семян.

Исследуемые растения высевались на каждый тип субстрата по следующей схеме (повторность шестикратная):

1. Почва без ксенобиотиков + растения без инокуляции.

2. Почва без ксенобиотиков + инокулированные растения.

3. Загрязненная почва + растения без инокуляции.

4. Загрязненная почва + инокулированные растения.

Через 20 дней, 40 дней и 9 месяцев после прорастания семян проводились биометрическое и микробиологическое исследования — определялась длина листьев и проективное покрытие, а так же численность Я. р1апйсю1а (на 20-й и 40-й день) и общая численность азотфиксаторов (на 9-й месяц).

Через 10 месяцев после прорастания семян было так же исследовано состояние почвенной микрофлоры. Для этого была определена интенсивность базального и субстратиндуцированного дыхания почвы, после чего на основании этих данных так же была рассчитана общая микробная биомасса и микробный коэффициент.

Опыт № 2. Данный опыт был поставлен в 2009 году. Его целью было подтвердить данные, полученные в первом опыте, выяснить, как влияют на растения различные методы инокуляции микроорганизмами, а также исследовать влияние на систему микроорганизм — растение органического ксенобиотика. Кроме того, было изучено влияние инокуляции на накопление тяжелых металлов в ткани растения. В опыте использовался только один тип субстрата (дерново-подзолистая почва), для ее загрязнения применялась смесь солей тяжелых металлов №2 и инсектицид фуфанон в количестве, в 100 раз превосходящем ПДК. Так же использовалось 2 способа инокуляции: замачиванием семян и поливом. Схема опыта приведена в таблице 4.

Таблица 4. Схема опыта 2

Ксенобиотик Способ обработки

Без инокуляции (БИ) Инокуляция семян (ИС) Инокуляция поливом (ИП)

Без ксенобиотика (БК) БИ+БК ИС+БК ИП+БК

Тяжелые металлы (ТМ) БИ+ТМ ИС+ТМ ИП+ТМ

Инсектицид (И) БИ+И ИС+И ИП+И

Через 40 дней после прорастания семян проводилось микробиологическое и биометрическое исследование. Измерялось проективное покрытие, длина листьев, а так же масса листьев и корней. Кроме того, проводилось ис-

следование растительной массы на содержание в ней тяжелых металлов атомно-адсорбционным методом.

Опыт № 3 был поставлен в 2011 году. Его целью было подтвердить полученные ранее данные, а так же выяснить, как влияет инокуляция на устойчивость различных видов растений к тяжелым металлам. Так же планировалось использовать различные типы смесей ТМ. В опыте использовалась дерново-подзолистая почва и 3 вида растений: райграс пастбищный, овсяница красная (сорт "Сигма") и полевица собачья. Для загрязнения почвы использовалось 2 смеси солей тяжелых металлов — смеси № 3 и № 4. Использовалось 2 метода инокуляции - инокуляция замачиванием семян и инокуляция поливом всходов. Схема загрязнения почвы и инокуляции, применявшаяся для каждого растения, приведена в таблице 5. Каждый вариант применялся в шестикратной повторности для райграса и овсяницы и в трехкратной для полевицы собачьей (в связи с нехваткой посевного материала)

Таблица 5. Схема опыта 3

Ксенобиотик Способ обработки

Без инокуляции (БИ) Инокуляция семян (ИС) Инокуляция поливом (ИП)

Без ксенобиотика (БК) БИ+БК ИС+БК ИП+БК

Тяжелые металлы, смесь № 3 (ТМЗ) БИ+ТМЗ ИС+ ТМЗ ИП+ ТМЗ

Тяжелые металлы, смесь № 4 (ТМ4) БИ+ТМ4 ИС+ТМ4 ИП+ТМ4

Отмечалось время прорастания семян в различных вариантах опыта и динамика развития растений. На 60-й день после прорастания выжившие растения были извлечены из почвы, листья и корни отделены и взвешены, после чего тщательно вымыты. Большая часть биомассы была подготовлена для озоления и исследования с помощью атомно-абсорбционного анализа, меньшая отделена и отобрана для выделения ДНК и выполнения ПЦР-анализа с целью подтвердить наличие Я. р1апИсо!а.

Результаты и обсуждение

1 Изучение воздействия различных факторов на колонизацию растений бактериями ЯаоиНеНа р1апИсо1а и почвенную микрофлору

Целью наших исследований являлось изучение влияния тяжелых металлов на взаимодействие растений и интродуцированных микроороганиз-мов. Для решения поставленной задачи мы исследовали динамику и интенсивность колонизации корней и листьев растений бактериями & р!апНсо1а и

влияния на нее различных факторов, таких как разные типы субстратов, загрязнение тяжелыми металлами и ксенобиотиками.

1.1 Воздействие загрязнения грунта тяжелыми металлами на колонизацию растений бактериями

Данные о численности Я. р1апйсо1а, полученные в первом вегетационном опыте, приведены в таблицах 6,7 и 8.

Таблица 6. Динамика численности бактерий Я. р1апИсо!а штамм ТСХА-91 Атр& в корнях и листьях растений травосмеси на речном песке (КОЕ/г

сырой биомассы

Вариант 20 дней 40 дней

ризоплана филлосфера ризоплана Филлосфера

Контроль 0 0 0 0

бактеризация 1,8*105 0 1*104 5.5* Ю2

тяжелые метал- 0 0 0 0

лы

бактеризация + ТМ 2*104 0 0 2.5* 102

Таблица 7. Динамика численности бактерий Я. р1апНсо1а штамм ТСХА-91 Атр11 в корнях и листьях растений травосмеси на дерново-подзолистой

Вариант 20 дней 40 дней

ризоплана Филлосфера ризоплана филлосфера

Контроль 0 0 0 0

бактеризация 6*104 0 1*104 1.5*10"

тяжелые метал- 0 0 0 0

лы

бактеризация + ТМ 5,5* 104 0 0 0

Таблица 8. Динамика численности бактерий Я р1апПсо1а штамм ТСХА-91 Атрк в корнях и листьях растений травосмеси на низинном торфе (КОЕ/г сырой биомассы)___

Вариант 20 дней 40 дней

ризоплана филлосфера ризоплана филлосфера

контроль 0 0 0 0

бактеризация 1,9*105 0 2*10" 1.5* 10'

тяжелые металлы 0 0 0 0

бактеризация + ТМ 7*10" 0 1,5*104 1*10'

Были исследованы пробы, взятые на 20-й и 40-й день после прорастания семян. Исследования образцов, отобранных на 20-й день, показали наличие бактерий в корнях инокулированных растений во всех вариантах опыта. Однако в листьях Я. р1апйсо1а при этом обнаружена не была. Аналогичное исследование, выполненное через 40 дней после прорастания семян, показало, что бактерии начинают обнаруживаться как в корнях, так и в листьях. При этом их количество в корнях заметно снизилось (в некоторых вариантах почти на порядок), на низинном торфе и речном песке в вариантах с внесением тяжелых металлов они совсем перестали обнаруживаться.

Таким образом, можно сделать вывод, что скорость распространения бактерий в растительном организме достаточно невелика. Кроме того, достаточно невелико количество клеток микроорганизмов, переносимых из корней в листья. При этом на загрязненных ТМ грунтах миграция микроорганизмов в эндосферу корней заметно замедляется.

Полученные во втором опыте данные по численности микроорганизмов представлены на рис. 1. Как видно, численность азотфиксаторов в листьях (рис. 1, А), как и в первом опыте, значительно (на 1 - 2 порядка) меньше, чем в корнях (рис. 1, Б). В тканях растений, культивировавшихся на почве, в

КОЕ/г 4,№+07

3,0ОЕ+О7

2,00Е+07

1.00Е+07

О.ООЕ+ОО

А)

КОЕ/г 1,60£+0В 1А0Е+08 1.20Е+08 1.00Е+0В 8,005+07 в,00£+07 4,00Е+07 2,О0£+07 0.00Е+0Р

Б> ,

Рисунок 1. Влияние различных ксенобиотиков и разных методов инокуляции на обсемененность тканей корней и листьев овсяницы сорта "Золушка" ассоциативными азотфиксирующими микроорганизмами. Дерново-подзолистая почва. А - листья; Б - корни (КОЕ/г сырой биомассы).

Контроль Металлы Фуфанон

Контроль

Металлы

Фуфанон

|Без инокуляции ДИнокуляция семян |Щ] Инокуляция поливом |

которую были внесены соли ТМ, количество микроорганизмов было заметно большим, чем в контрольных вариантах без загрязнения. Несколько менее ярко это проявилось на почве, загрязненной пестицидом (обсемененность корней инокулированных растений относительно контроля при загрязнении тяжелыми металлами была в 100 раз больше, чем без загрязнения). После девяти месяцев культивирования в первом вегетационном опыте было выполнено повторное исследование растений, с целью определить общее содержание ассоциативных азотфиксаторов в тканях. Полученные данные показали, что различия в микробной обсемененности тканей растений между вариантами с различной обработкой грунта и растений в значительной степени сгладились, однако основные тенденции, выявленные при первых измерениях, сохранились. Так же сохранился значительный разрыв в численности азотфиксирующих микроорганизмов между корнями и листьями растений (в некоторых случаях более чем на два порядка).

Таким образом, загрязнение почвы тяжелыми металлами привело к заметному увеличению численности ассоциативных диазотрофов в тканях растений по сравнению с контрольными вариантами без загрязнения.

Возможно, это объясняется тем, что загрязнение грунта ТМ или органическими ксенобиотиками делает его менее благоприятным для развития почвенных микроорганизмов, что, в свою очередь, стимулирует их миграцию из почвы в растения. Значительно большая численность диазотрофов в тканях инокулированных растений на загрязненной почве, вероятно, объясняется тем, что инокуляция оказывает значительный ростостимулирующий эффект, особенно на корневую систему, что в свою очередь стимулирует развитие микрофлоры корней и почвы.

Для точного определения наличия R. planticola в корнях растений в третьем опыте был использован метод ПЦР. При этом разведения растертых корней райграса и овсяницы красной высевались на среду LB с ампициллином, после чего колонии, имеющие признаки, характерные для R. planticola, исследовались методом ПЦР с помощью праймера PAR-C1. В результате было подтверждено, что данные колоний образованы бактериями R. planticola.

1.2 Влияние типа грунта, метода инокуляции и органических ксенобиотиков на колонизацию растений микроорганизмами

Кроме загрязнения ТМ в поставленных опытах имелись и другие факторы, которые могли оказать некоторое влияние на интенсивность колонизации тканей растений микроорганизмами. Это, в частности, разные типы грунта, на которых в первом опыте выращивались растения, использованные во втором опыте разные методы инокуляции, а так же дополнительный загрязнитель — фосфорорганический пестицид (фуфанон).

Тип грунта

Результаты, полученные в первом опыте, позволяют сделать вывод, что количество микроорганизмов в эндосфере корней растений культивировавшихся на разных типах грунтов, может заметно различаться. Как видно из

табл. 6 и 8, численность Я. р1апйсо1а в корнях растений овсяницы, культивируемых на торфе и речном песке, изменяется сходным образом — внесение ТМ вызывает значительное падение численности микроорганизмов в корнях.

Данные об общей численности диазотрофов в эндосфере корней после 9 месяцев культивирования, демонстрируют иную закономерность. На речном песке и торфе количество симбиотических азотфиксаторов в корнях растений, выращенных на загрязненной почве выше, чем в незагрязненной. В то же время, в корнях растений, выращенных на загрязненной ТМ дерново-подзолистой почве, численность диазотрофов оказалась в 7 раз ниже, чем на незагрязненной.

Возможно, это связано с тем, что дерново-подзолистая почва богата глинистыми частицами и имеет в связи с этим большую обменную емкость, что смазывает эффект, оказываемый ТМ.

Органический ксенобиотик.

Совокупная численность азотфиксирующих микроорганизмов в корнях растений, выросших на дерново-подзолистой почве, в которую был внесен фуфанон, возросла в 10 раз относительно незагрязненного контроля при инокуляции замачиванием семян, однако осталась неизменной при инокуляции поливом. Эти результаты заметно отличаются от полученных на почве с ТМ, хотя основные закономерности и сохраняются. Прирост численности азот-фиксаторов при инокуляции замачиванием При этом, однако, численность микроорганизмов в тканях листьев при инокуляции замачиванием отличается от контроля сравнительно слабо, а при инокуляции поливом резко уменьшается.

Разные методы инокуляции.

Во втором опыте были применены разные методы инокуляции (при помощи замачивания семян в бактериальной суспензии перед посевом и полива этой суспензией всходов сразу после прорастания семян). Последующие исследования показали, что влияние этих методов на микробную обсеменен-ность тканей растений заметно различалось.

Как видно из графика (рис. 1), при выращивании на незагрязненной почве численность азотфиксаторов в тканях растений, инокулированных поливом, была значительно больше, чем в тканях растений, инокулированных замачиванием.

Достаточно примечательными оказались результаты на почве, загрязненной смесью солей ТМ. Так, численность микроорганизмов в растениях, инокулированных путем полива всходов бактериальной суспензией была заметно меньше, чем путем замачивания семян. Это особенно интересно, если учесть, что, судя по характеру роста и развития растений, инокуляция поливом значительно эффективнее.

Таким образом, исследования показали, что интенсивность колонизации растений бактериями зависит в том числе от способа их внесения.

1.3. Исследование воздействия бактеризации растений на микрофлору загрязненной ТМ дерново-подзолистой почвы

Изучение состояния почвенной микрофлоры при загрязнении и инокуляции весьма важно для более полного понимания функционирования системы почва-микроорганизмы-растение в условиях загрязнения и при внесении ксенобиотиков.

В первом опыте, на 10-м месяце культивирования были исследованы некоторые показатели, характеризующие состояние микробного сообщества почвы, такие как базальное и субстратиндуцированное дыхание (БД и СИД). Кроме того, на основании этих данных были рассчитаны общая биомасса микроорганизмов (Смик) и микробный коэффициент. Исследовались только варианты, в которых применялась дерново-подзолистая почва.

Полученные при исследовании БД и СИД данные приведены в табл. 9. Интенсивность дыхания почвы, в которую были внесены соли ТМ, оказалась заметно ниже контрольной. При этом интенсивность БД упала гораздо сильнее, чем СИД. Инокуляция растений, высаживаемых в загрязненную почву, заметно улучшила оба этих показателя. При этом, однако, бактеризация растений на незагрязненной почве привела к некоторому снижению показателей микробной активности, хотя и значительно меньшему, чем вызванное ТМ.

Таким образом, внесение ТМ в почву значительно снижает интенсивность дыхания почвенной микрофлоры, а инокуляция культивируемых растений Я. р1ап!1со1а — увеличивает.

Данные, полученные при измерении общей микробной биомассы представлены в таблице 10.

Таблица 9.

Влияние внесения тяжелых металлов и инокуляции растений травосмеси на базальное и субстратиндуцированное дыхание дерново-подзолистой почвы

Вариант обработки БД, мкгС02/г*час СИД, мкгС02/г*час

Контроль 0,242 ± 0,023 4,215 ±0,575

незагрязненная почва + бактерии 0,140 ±0,037 3,884 ±0,382

загрязненная почва 0,003 ±0,0001 2,081 ±0,698

загрязненная почва + бактерии 0,153 ±0,002 2,672 ± 0,208

Как видно, загрязнение почвы солями тяжелых металлов привело к значительному снижению микробной биомассы, а выращивание инокулиро-ванных растений при этом несколько увеличило общую биомассу микроорганизмов.

Таким образом, загрязнение почвы ТМ приводит к снижению общей микробной биомассы, а выращивание на ней растений, инокулированных И,. р1аписо1а позволяет в некоторой степени компенсировать это снижение.

Таблица 10.

Влияние внесения тяжелых металлов и инокуляции растений травосмеси на

Вариант Смик> МКг/гпочвы

контроль 380,22 ±37,41

почва + тяжелые металлы 153,11 ±51,26

почва + биопрепарат 285,47 ±28,01

почва + тяжелые металлы + биопрепарат 196,53 ± 15,30

На основании приведенных выше данных был рассчитан микробный метаболический коэффициент. Высокие значения микробного метаболического коэффициента характерны для молодых или сильно нарушенных экосистем, более низкие — для старых или стабильных. Его значения приведены в таблице 11. Как видно из таблицы, максимальные значение микробного метаболического коэффициента наблюдаются в варианте с загрязнением почвы, но без инокуляции растений, несколько меньшие — в варианте с тяжелыми металлами и инокуляцией, еще меньше — в контрольном варианте без загрязнения и инокуляции. Наконец, самое маленькое значение микробного метаболического коэффициента наблюдается в варианте, в котором на незагрязненной почве культивировались инокулированные растения.

Таблица 11. Влияние загрязнения ТМ и инокулированных растений травосмеси на микробный метаболический коэффициент дерново-подзолистой почвы._

Вариант ЧС02, мкг/мгС*час Он

контроль без биопрепарата и загрязнения 0,628 ±0,190 0,058 ±0,015

почва + тяжелые металлы 0,841 ±0,069 0,002 ±

почва + биопрепарат 0,491 ±0,106 0,038 ±0,009

почва + тяжелые металлы + биопрепарат 0,780 ± 0,062 0,061 ± 0,022

Таким образом, можно сделать вывод, что выращивание инокулированных растений позволяет несколько увеличить биомассу микроорганизмов в почве и интенсифицировать их метаболизм. Вероятно, инокуляция при этом действует опосредованно, через растения. Бактерии Л. р1апИсо1а стимулируют развитие растений, в особенности корневой системы, что, в свою

очередь, оказывает положительное воздействие на ассоциированных с растениями микроорганизмов.

2 Изучение влияния инокуляции на рост и развитие растений овсяницы различных видов на разных субстратах в условиях загрязнения почвы

ТМ

С целью изучения результатов взаимодействия микроорганизмов и растений в различных условиях нами был поставлен ряд опытов. В их ходе было изучено воздействие инокуляции на развитие растений на почвах, загрязненных тяжелыми металлами и органическими ксенобиотиками. Для этого измерялись такие параметры, как длина, проективное покрытие и биомасса листьев и биомасса корней. Влияние на эти параметры инокуляции разными методами на фоне загрязнения разных типов почв различными ксенобиотиками рассмотрено ниже.

2.1 Изучение развития растений при инокуляции Я.р1апНсо1а и загрязнении грунтов тяжелыми металлами

«о

70 60 50 40

за го ю о А)

п то 8 6 4

г о

Торф Дерново- Песок

Б) подзолистая почва

□ Чистая почва |Щ Чистая почва+ препарат

■ Загрязненная почва Щ Загрязненная почва + препарат

Рисунок 2. Влияние типа грунта, наличия ксенобиотика (смесь солей ТМ №1) и инокуляции й. Р1аШ1со1а на развитие смеси растений овсяницы трех сортов (травосмесь). А - проективное покрытие (%); Б - длинна листьев (см).

На рис. 2 показаны результаты измерения основных параметров растений травосмеси в первом опыте, после 9 месяцев культивирования. Как видно из графиков, инокуляция растений, высаженных в загрязненную почву, в большинстве случаев оказала на них заметное положительное воздействие. В большинстве вариантов на загрязненной ТМ почве увеличилось проективное покрытие (рис. 2, Б). Несколько меньшее влияние оказала инокуляция на длину растений (рис. 2, А). Следует так же отметить значительное положительное влияние инокуляции на развитие корневой системы.

Во втором опыте были проведены аналогичные замеры после 40 дней культивирования. При этом в опыте использовалась только дерново-подзолистая почва и овсяница сорта "Золушка". Полученные данные в целом аналогичны приведенным выше результатам первого опыта.

Как видно из рис. 3, на загрязненной ТМ почве инокуляция сравнительно слабо повлияла на длину листьев (рис. 3, А). Значительно большее влияние она оказала на проективное покрытие (рис. 3, Б). Биомасса листьев (рис. 4, А) практически не изменилась и даже несколько уменьшилась. Отдельно следует отметить влияние инокуляции на биомассу корней (рис. 4, Б) — на загрязненной почве при инокуляции замачиванием ее рост относительно неинокулированного контрольного растения составил более 300 процентов.

Таким образом, инокуляция бактериями К р1апНсо1а положительно сказывается на росте и развитии растений, культивируемых на субстратах, загрязненных солями тяжелых металлов. У инокулированных растений по сравнению с неинокулированными увеличивается биомасса корней, проективное покрытие и, в отдельных случаях, длина листьев. При этом максимальное положительное воздействие инокуляция оказывает именно на корневую систему (ее масса может увеличиваться в разы), и именно в грунтах с внесенными ТМ (прирост биомассы превосходит таковой при инокуляции растений в незагрязненном грунте).

2.2 Сравнение эффективности различных методов инокуляции

Очевидно, что методы инокуляции замачиванием семян и поливом всходов отличаются друг от друга коренным образом. В первом случае сравнительно небольшое количество бактерий попадает в почву непосредственно с семенами растений. При этом взаимодействие растений и микроорганизмов начинается фактически еще до прорастания семян. Во втором же значительно большее количество микроорганизмов вносится в почву, в которой уже находятся сформировавшиеся растения, причем они достаточно равномерно распределяются по всему объему корнеобитаемого слоя.

Не удивительно, что такие разные методы инокуляции продемонстрировали достаточно большие различия в воздействии на растения. Наблюдения, проведенные нами во втором опыте, показали, что влияние различных методов инокуляции на рост и развитие растений существенно отличается.

По полученным нами данным, инокуляция поливом всходов дала заметно лучшие результаты. На почве, загрязненной

Контроль

Металлы

Фуфанон

Д|Без инокуляции ЩИнокуляция семян ЦИнокуляция поливом)

Контроль Металлы фуфанон

Рисунок 3. Воздействие различных методов инокуляции и загрязнителей на длину листьев и проективное покрытие растений овсяницы сорта "Золушка". А - средняя длина листьев (см); Б - проективное покрытие (%).

¡Без инокуляции ¡§Ц Инокуляция семян Ц Инокуляция поливом

Д^ Контроль Металлы Фуфанон

Контроль Металлы Фуфанон

Рисунок 4. Воздействие различных методов инокуляции и загрязнителей на биомассу листьев н корней растений овсяницы сорта "Золушка". А - биомасса листьев (г); Б - биомасса корней (г).

как тяжелыми металлами, так и органическим ксенобиотиком, обработанные таким образом растения демонстрируют заметное увеличение всех измеренных параметров параметров как по сравнению с контрольными не-инокулированными растениями, так и по сравнению с растениями, инокули-рованными замачиванием семян.. В частности, на грунте, в который были внесены ТМ, прирост длины по сравнению с растениями, инокулированными замачиванием, составил 13%, проективного покрытия — 50%, а биомассы корней почти 200% (что в абсолютных цифрах является максимальным значением среди всех вариантов, в том числе и на почве без ТМ). Стоит так же отметить, что инокуляция поливом, в отличие от инокуляции замачиванием, не приводит к ухудшению развития листьев у растений на незагрязненной почве. Так, в варианте без загрязнителя, при инокуляции замачиванием длина листьев овсяницы упала на 21% относительно неинокулированного контроля, а проективное покрытие снизилось на 17%. В то же время, при инокуляции замачиванием на том же субстрате длина листьев растений увеличилась на 15% относительно контроля, а их проективное покрытие — на 17%.

Заметно отличалось так же влияние разных методов внесения микроорганизмов на соотношение массы листьев и корней. Как уже отмечалось выше, инокуляция замачиванием семян, стимулируя развитие корневой системы, практически не затрагивала листья. Более того, биомасса листьев в результате инокуляции даже несколько уменьшилась. За счет этого отношение массы листьев к массе корней в данном случае равнялось 0,03. Для сравнения, то же соотношение для неинокулированных растений на загрязненной почве составляло 0,26.

Гораздо лучшие результаты были получены при внесении бактерий методом полива всходов. Обработанные таким образом растения развивались значительно лучше как по абсолютным показателям, так и по соотношению листья/корни — в данном случае оно составило 0,49, в первую очередь за счет значительно лучшего развития листьев.

2.3 Изучение воздействия инокуляции К. р1аШко1а на развитие растений

разных видов

Взаимодействие растений и микроорганизмов — достаточно сложный процесс, особенности которого зависят от множества факторов, в том числе и от видовой принадлежности участвующих в нем организмов. Вероятно, именно с этим были связаны некоторые различия в результатах, полученных при инокуляции разных видов растений в одинаковых условиях.

Так, в наших опытах, в результате инокуляции длина листьев при культивировании на дерново-подзолистой почве падала вне зависимости от наличия ТМ. Единственный вариант, в котором длина листьев "Золушки" при инокуляции увеличилась — незагрязненный речной песок. В то же время, при инокуляции травосмеси на песке и дерново-подзолистой почве наблюдалось увеличение длины листьев, падение отмечалось только на торфе. При этом оно было заметно меньше, чем у "Золушки".

С проективным покрытием ситуация была иной. На торфе оба исследованных типа растений показали практически одинаковые результаты. Однако на дерново-подзолистой почве изменения, вызванные бактеризацией в развитии растений "Золушки" и травосмеси, весьма различались.

Таким образом, можно заключить, что инокуляция несколько по-разному влияет на различные виды растений, однако основные закономерности, такие как стимулирующее действие при загрязнении грунтов тяжелыми металлами, сохраняются.

2.4 Изменение реакции растений на инокуляцию в зависимости от типа

субстрата

На различных субстратах (почва, торф и песок), как загрязненных, так и нет, влияние инокуляции на растения заметно отличатся. В частности, длинна листьев инокулированных растений, выросших на низинном торфе, была меньше, чем у неинокулированных, как в вариантах с тяжелыми металлами, так и без них. Для торфа так же было характерно очень сильное падение проективного покрытая при загрязнении ТМ, как для травосмеси, так и для "Золушки".

Речной песок был единственным типом грунта, на котором инокуляция привела к росту длины листьев и увеличению проективного покрытия на субстрате без ТМ у всех растений, однако в целом он оказался самым неблагоприятным, растения на нем имели минимальную длину листьев и проективное покрытие, а так же наименее развитую корневую систему. Вероятно, причиной этого было малое количество нутриентов в песчаной почве, а так же низкая обменная емкость песка.

Данные по дерново-подзолистой почве оказались весьма неоднозначными. С одной стороны, "Золушка" на данной почве отреагировала на инокуляцию некоторым падением длинны листьев и увеличила проективное покрытие. С другой — травосмесь на той же почве в результате инокуляции несколько увеличила длину листьев, тогда как увеличение проективного покрытия отмечалось только в варианте без ТМ, причем весьма незначительное.

Таким образом, можно сделать вывод, что различные типы грунта, в которых выращиваются растения, так же влияют на последствия инокуляции. При этом, однако, наблюдавшиеся ранее закономерности, как связанные с видовыми особенностями растений (например, падение длины листьев на торфе у травосмеси было меньше, чем у "Золушки"), так и с реакцией растений на внесение тяжелых металлов сохраняются.

3 Изучение влияния бактеризации на распределение ТМ в системе почва-растение

Изучение влияния симбиотических микроорганизмов на поглощение и накопление тяжелых металлов растением весьма важно для практического применения микробных биопрепаратов. Имеющиеся в литературе данные достаточно противоречивы. Разные исследователи наблюдали в результате

Рисунок 5. Влияние загрязнения почвы солями тяжелых металлов и инокуляции различными методами на содержание меди в растениях овсяницы красной сорта "Золушка". А - концентрация меди в листьях (мкг/кг сухой массы); Б - концентрация меди в корнях (мкг/кг сухой массы).

инокуляции симбиотическими микроорганизмами как увеличение (Weinstein, 1995), так и снижение накопления растениями TM (Malcova et al., 2003; Al-Garni, 2005). Относительно R. planticola имеются данные, свидетельствующие, что она способна значительно снижать поступление кадмия в ткани растений (Емцев и др, патент; Соколова, 2006). Для того, чтобы уточнить, как R. planticola влияет на поступление других тяжелых металлов в растениях, нами было изучено влияние инокуляции на накопление меди и цинка в растениях овсяницы сорта "Золушка" на дерново-подзолистой почве.

На рис. 5 показано, как инокуляция влияет на концентрацию меди в корнях и листьях овсяницы, определенную при помощи атомно-абсорбционного анализа. Как видно из рисунка, концентрация Си в растениях на загрязненной почве оказалась более чем на порядок большей, чем на незагрязненной. Концентрация Си в корнях, как на загрязненной, так и на незагрязненной почве так же оказалась выше, чем в листьях почти в 10 раз.

Однако при этом как в корнях, так и в листьях инокуляция в большинстве случаев привела не к уменьшению, а к увеличению количества накопленной в тканях растения меди. Как видно из графика (рис. 7, Б), как инокуляция замачиванием, так и инокуляция поливом привели к весьма заметному увеличению концентрации меди в корнях. При этом и в том и в другом случае прирост был практически одинаков (+76,9% при инокуляции замачивани-

ем, +78,5% при инокуляции поливом). В то же время, динамика накопления Си в листьях (рис. 7, А) оказалась не столь однозначной: инокуляция замачиванием вызвала рост более чем на 100% относительно неинокулированного контрольного варианта, тогда как инокуляция замачиванием — снижение на 22%.

Аналогичные данные были получены и по концентрации цинка. Инокуляция растений привела к росту концентрации цинка в корнях, составившему при инокуляции поливом 73 %.

Таким образом, инокуляция стабильно увеличивала концентрацию Си п Znв корнях, кроме того, инокуляция замачиванием увеличивала концентрацию этих металлов в листьях, тогда как инокуляция поливом снижала.

Возможно, полученные данные объясняются тем, что & р1апНсо!а, стимулируя общее развитие растительного организма, так же стимулирует работу некоторых его защитных систем, функционирование которых приводит к накоплению ТМ в тканях и органах.

Выводы:

1. Установлено, что интродуцированные в ризосферу растений овсяницы различных видов, бактерии ЛаоиНеНа р1апйсо1а, штамм ТСХА-91 Атр могут оказывать ростостимулирующее воздействие, компенсируя негативное влияние загрязнения почвы солями тяжелых металлов (РЬ, Си, Хп) на растения. При этом максимальное стимулирующее воздействие инокуляция оказывает на корневую систему, ее масса на загрязненной почве может увеличиться более чем в 4 раза по сравнению с неинокулированной. Проективное покрытие растений в результате интродукции бактерий так же заметно увеличивается (на 30 -100%).

2. Показано, что внесение в почву тяжелых металлов снижает интенсивность миграции бактерий Л. р!апг1Со1а в корни растений. В то же время, загрязнение тяжелыми металлами и ксенобиотиками стимулирует увеличение общей численности ассоциативных диазотрофов за исключением К. р1ап-йсо1а в тканях корней и листьев растений.

3. Выявлено, что выращивание растений, инокулированных Я. р1апИ-со1а на загрязненной тяжелыми металлами почве, оказывает положительное влияние на почвенную микрофлору, увеличивая интенсивность дыхания (субстратиндуцированного дыхания - на 28% относительно варианта без инокуляции, базального — в 50 раз) и микробную биомассу (+ 28%), а так же нормализуя метаболический коэффициент.

4. Выявлено, что растения овсяницы красной сорта "Золушка", иноку-лированные Я. р1апНсо1а, накапливают в корнях больше меди и цинка, чем неинокулированные. Увеличение концентрации может достигать 73% при инокуляции по 2x1 и 78% по Си.

му, сохраняются на разных типах грунта (песок, торф или почва), при воздействии разных типов загрязнителей (соли ТМ или фосфорорганический пестицид), а так же на растениях разных видов.

б. Таким образом, проведенные исследования позволили установить, что инокуляция бактериями Raoultella planticola, штамм ТСХА-91 AmpR, может обеспечить повышение жизнеспособности газонных трав в условиях загрязнения грунта ТМ и органическими ксенобиотиками, характерного для современного города. При этом инокуляция методом полива всходов более эффективна, чем инокуляция при помощи замачивания семян. Следует, однако, учесть, что инокуляция приводит к повышению концентрации тяжелых металлов в тканях обработанных растений. Это несколько ограничивает применение R. planticola для защиты кормовых и пищевых растений, однако делает данный метод защиты растений весьма перспективным для фитореме-диации почв.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Колесников О.В., Тимохина Т.П. Влияние бактеризации на устойчивость растений к тяжелым металлам // Известия ТСХА, N4, -2011. С. 24-29.

2. Колесников О.В., Тимохина Т.П. Исследование протекторных свойств биопрепарата "Биоплант-К" на почвах, загрязненных тяжелыми металлами // Информационное пространство современной науки. Материалы II международной заочной научно-практической конференции. 18 сентября 2010 года. Отв. ред. Волкова М.В. Чебоксары, НИИ педагогики и психологии, -2010 г, с. 156 - 159.

3. Колесников О.В., Тимохина Т.П. Влияние инокуляции Klebsiella planticola на устойчивость растений к ксенобиотикам // Сборник молодежного научного экологического форума "Анализ причин и последствий засухи и пожаров 2010 года: приоритетные проблемы и пути их решения", М.-2010, с. 10-12.

Отпечатано с готового оригинал-макета

Формат 60х84'/1б. Усл. печ. л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ 10,

Издательство РГАУ - МСХА 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Колесников, Олег Васильевич

Введение.

ГЛАВА I. Обзор литературы.

1.1 Экологические особенности тяжелых металлов.

1.2 Воздействие тяжелых металлов на растения.

1.2.1 Общие механизмы воздействия тяжелых металлов на растительные организмы.

1.2.2 Механизмы токсического действия тяжелых металлов на растение

1.2.3 Механизмы защиты от токсического действия тяжелых металлов на клеточном уровне.

1.2.4 Механизмы защиты растений от токсического действия тяжелых металлов на организменном уровне.

1.3 Воздействие тяжелых металлов на микроорганизмы.

1.3.1 Механизм токсического воздействия тяжелых металлов на микроорганизмов.

1.3.2 Механизмы защиты микроорганизмов от токсического воздействия тяжелых металлов.

1.3.3 Влияние загрязнения тяжелыми металлами на микробное сообщество почвы.

1.4 Влияние тяжелых металлов на систему микроорганизм-растение.

1.5 Использование микроорганизмов для биоремедиации почв.

Глава 2. Объекты и методы исследований.

2.1 Объекты исследований.

2.1.1. Микроорганизмы.

2.1.2. Растения.

2.1.3. Загрязнители.

2.1.4. Субстраты.

2.2 Методика проведения модельного и вегетационных опытов.

2.2.1. Опыт № 1.

2.2.2. Опыт №2.

2.2.3. Опыт №3.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

Раздел 3.1 Изучение воздействия различных факторов на колонизацию растений бактериями КаоикеПа р1ап1:юо1а и почвенную микрофлору.

3.1.1 Воздействие загрязнения грунта тяжелыми металлами на колонизацию растений бактериями.

3.1.2 Влияние типа грунта, метода инокуляции и органических ксенобиотиков на колонизацию растений микроорганизмами.

3.1.3. Исследование воздействия бактеризации растений на микрофлору загрязненной ТМ дерново-подзолистой почвы.

3.2 Изучение влияния инокуляции на рост и развитие растений овсяницы различных видов на разных субстратах в условиях загрязнения почвы ТМ

3.2.1 Изучение развития растений при инокуляции Я р!апИсо1а и загрязнении грунтов тяжелыми металлами.

3.2.2 Сравнение эффективности различных методов инокуляции.

3.2.3 Изучение воздействия инокуляции К р1апйсо1а на развитие растений разных видов.

3.2.4 Изменение реакции растений на инокуляцию в зависимости от типа субстрата.

3.3 Изучение влияния бактеризации на распределение ТМ в системе почварастение.

Выводы:.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние ксенобиотиков и тяжелых металлов на систему микроорганизм-растение"

Актуальность исследования. В настоящее время, в связи с развитием цивилизации, значительно увеличивается антропогенная нагрузка на экосистемы. В частности, растет количество тяжелых металлов (ТМ), выбрасываемых в окружающую среду. Одним из источников ТМ является автотранспорт, причем это не только свинец, содержащийся в бензине, но и множество других металлов и соединений. Этот источник загрязнения отличается еще и тем, что действует в непосредственной близости к человеческому жилью, в отличие от различных промышленных объектов, таких как заводы, электростанции, свалки и другие поставщики ТМ в биосферу. При этом количество автомобилей в последние годы только увеличивается, технологий же, позволяющих радикально снизить их негативное воздействие на окружающую среду не предвидится. Первыми под удар попадают зеленые насаждения вдоль дорог, поглощающие значительную часть вредных веществ из дорожных стоков, задерживающих аэрозоли, снижающих шумовое воздействие транспортного потока и вообще играющих важную гигиеническую роль в городских условиях. Таким образом, важной задачей становится повышение устойчивости зеленых насаждений к неблагоприятным факторам.

Еще одним способом использования растений в защите окружающей среды является так называемая фиторемедиация — очистка различных сред от загрязнителей с помощью растений. Фактически при этом работают симбиотические микробно-растительные комплексы. Увеличение их устойчивости к ТМ и другим неблагоприятным факторам — важная задача, способная повысить эффективность их работы. Еще одним важным для фиторемедиа-ции свойством симбиотических микроорганизмов является усиление способ-ностьи растений накапливать тяжелые металлы. В настоящий момент данные о подобном воздействии микроорагнизмов достаточно противоречивы, однако более подробное изучение механизма, вызывающего подобный эффект, может значительно повысить эффективность работы растений-гипераккумуляторов или позволит использовать для фиторемедиации обычные декоративные виды, не имеющие выраженных гипераккумуляторных свойств.

Цель работы: изучить влияние токсикантов на систему микроорганизм-растение.

Задачи исследования. Для достижения вышеозначенной цели были поставлены следующие задачи:

2. Исследовать влияние загрязнения почвы ТМ на интродуциро-ванную популяцию Raoultella (Klebsiella) planticola в системе почва-растение

3. Изучить влияние бактерии R. planticola на рост и развитие различных видов газонных трав в условиях загрязнения почвы смесями солей тяжелых металлов.

4. Исследовать протекторное действие R. planticola в условиях загрязнения несколькими тяжелыми металлами и сформулировать рекомендации по ее применению для защиты растений.

Выявлено, что инокуляция в данных условиях оказывает заметное положительное воздействие на различные параметры растительных организмов. Так же отмечены различия в воздействии микроорганизмов на разные виды растений. Исследованы некоторые аспекты изменения численности микроорганизмов и динамики их миграции в ткани растения в зависимости от условий внешней среды (наличия или отсутствия ксенобиотика). Обнаружены различия в эффективности различных методов инокуляции. Отмечено увеличение накопления меди и цинка в тканях растений, инокулированных Л. р1апИсо1а.

Практическая значимость. Результаты данного исследования свидетельствуют, что инокуляция /?. р1апИсо1а может в значительной степени ней-трализовывать негативный эффект, оказываемый различными тяжелыми металлами на газонные травы. Таким образом, биопрепараты на основе Я. р1ап-Нсо1а могут быть использованы для защиты растений от действия ТМ. Так же было показано, что инокуляция методом полива взвесью микроорганизмов эффективнее, чем инокуляция замачиванием семян. Это позволяет рекомендовать данный метод инокуляции для практического использования. Кроме того было обнаружено, что инокуляция овсяницы красной сорта "Золушка" Л. р1апИсо1а заметно усилила накопление ТМ в тканях растения. С одной стороны, это накладывает определенные ограничения на использование Л. р1апНсо1а для защиты растений, используемых в пищу животных или человеку. С другой — открывает широкие перспективы использования в фитореме-диации почв, загрязненных тяжелыми металлами.

Апробация.

Результаты исследований были представлены на конференции молодых ученых ТСХА (декабрь 2010 года), на конференции "Информационное пространство современной науки" (2010 год), а так же конференции "Экологические последствия засухи и пожаров 2010 года" (2011 г.)

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Колесников, Олег Васильевич

Выводы:

1. Установлено, что интродуцированные в ризосферу растений овсяницы различных видов, бактерии ЯсюикеПа р1апНсо1а, штамм ТСХА-91 Ашрк могут оказывать ростостимулирующее воздействие, компенсируя негативное влияние загрязнения почвы солями тяжелых металлов (РЬ, Си, Ъх\) на растения. При этом максимальное стимулирующее воздействие инокуляция оказывает на корневую систему, ее масса на загрязненной почве может увеличиться более чем в 4 раза по сравнению с неинокулированной. Проективное покрытие растений в результате интродукции бактерий так же заметно увеличивается (на 30 - 100%).

2. Показано, что внесение в почву тяжелых металлов снижает интенсивность миграции бактерий Я. р1апйсо1а в корни растений. В то же время, загрязнение тяжелыми металлами и ксенобиотиками стимулирует увеличение общей численности ассоциативных диазотрофов за исключением Я. р1ап-1:юо1а в тканях корней и листьев растений.

3. Выявлено, что выращивание растений, инокулированных Я. ркпи-со1а на загрязненной тяжелыми металлами почве, оказывает положительное влияние на почвенную микрофлору, увеличивая интенсивность дыхания (субстратиндуцированного дыхания - на 28% относительно варианта без инокуляции, базального — в 50 раз) и микробную биомассу (+ 28%), а так же нормализуя метаболический коэффициент.

4. Выявлено, что растения овсяницы красной сорта "Золушка", иноку-лированные Я. р1апИсо1а, накапливают в корнях больше меди и цинка, чем неинокулированные. Увеличение концентрации может достигать 73% при инокуляции по Ъи и 78% по Си.

5. Установлено, что основные эффекты бактеризации, такие как общее стимулирующее влияние на растения, культивируемые на загрязненной почве и значительно более сильное стимулирующее влияние на корневую систему, сохраняются на разных типах грунта (песок, торф или почва), при воздействии разных типов загрязнителей (соли ТМ или фосфорорганический пестицид), а так же на растениях разных видов.

6. Таким образом, проведенные исследования позволили установить, что инокуляция бактериями КаоикеНа р1апйсо1а, штамм ТСХА-91 Атрк, может обеспечить повышение жизнеспособности газонных трав в условиях загрязнения грунта ТМ и органическими ксенобиотиками, характерного для современного города. При этом инокуляция методом полива всходов более эффективна, чем инокуляция при помощи замачивания семян. Следует, однако, учесть, что инокуляция приводит к повышению концентрации тяжелых металлов в тканях обработанных растений. Это несколько ограничивает применение Я. р1аШсо1а для защиты кормовых и пищевых растений, однако делает данный метод защиты растений весьма перспективным для фитореме-диации почв.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Колесников, Олег Васильевич, Москва

1. Белимов A.A., Тихонович И.А. Микробиологические аспекты устойчивости и аккумуляции тяжелых металлов у растений // Сельскохозяйственная биология. -2011, № 3, С. 10 15.

2. Биохимия: Учеб. для вузов, Под ред. Е.С. Северина., 2003. 779 с. ISBN 5-9231-0254-4

3. Бирюкова О.В. Эндофитная ризобактерия Klebsiella planticola, взаимодействие с растением и ценозом микромицетов в фитоплане и ризосфере: дисс. .канд. биол. наук. -М., 2001. 164 с.

4. Бондарь П. Н. Штаммы грибов рода Trichoderma Pers( Fr.) как основа для создания препаратов защиты растений и получения кормовых добавок: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Москва, 2011. -22 с.

5. Васенёв В.И. Анализ микробного дыхания и углеродных пулов при функционально-экологической оценке конструктоземов Москвы и Московской области: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Москва, 2011. -24 с.

6. Ваулина Э.Н., Аникеева И.Д., Коган И.Г. Влияние ионов кадмия на деление клеток корневой меристемы Crépis capillaris L. Wallr. // Цитология и генетика. -1978, Т. 12, № 6, С. 497 503.

7. Гуральчук Ж.З. Механизмы устойчивости растений к тяжелым металлам // Физиол. и биохим. культурных растений -1994, Т. 26, № 2, С. 107 118.

8. Давыдова С.Л., Тагасов В.И. Тяжелые металлы как суперотоксиканты XXI века. М.: Издательство Российского университета дружбы народов, 2002.-140 с.

9. Емцев В. Т. Отчёт о научно-исследовательской работе / В. Т. Емцев и др.. -М.: ТСХА, 1995. 58 с.

10. Емцев В. Т. Отчёт о научно-исследовательской работе / В. Т. Емцев, и др..-М.: ТСХА, 1991.69 с.

11. Емцев В.Т., Голубкина H.A., Соколова А.Я., Донцов Н.В., Богданова А.И. Способ снижения накопления кадмия растениями. Патент на изобретение № 2295241, 2007.

12. Емцев В. Т., Соколова А. Я., Селицкая О. В., Защитное действие бактерий рода Klebsiella на газонные травы в условиях засоления почвы // Почвоведение. -2010, № 7, с. 825 830.

13. Иванов В.Б., Быстрова Е.И., Серегин И.В. Сравнение влияния тяжелых металлов на рост корня в связи с проблемой специфичности и избирательности их действия // Физиология растений. 2003. Т. 50, № 3. С. 445 -454.

14. Игошина Т.И., Косицин A.B. Устойчивость к свинцу карбоангидразы Melicia nutans (Poaceae) // Ботан. журн. -1990. Т. 75, № 8. С. 1144-1150.

15. Казнина Н.М. Влияние свинца и кадмия на рост, развитие и некоторые другие физиологические процессы однолетних злаков (ранние этапы онтогенеза): Автореф. дис. .канд. биол. наук. -Петрозаводск, 2003. -23 с.

16. Калининская Т.А., Редькина Т.В., Белов Ю.М. Применение ацетиленового метода для количественного учета разных групп азотфиксаторов методом предельных разведений // Микробиология, 1981, Т. 50, Вып. 5, С. 924 928.

17. Калюжин В.А., Калюжина О.В. Влияние концентрированных растворов солей тяжелых металлов на физиологические и кинетические показатели микроорганизмов // Вестник Томского государственного университета. -2007. №298. С. 218 -222.

18. Кашнер. М. Жизнь микроорганизмов в экстремальных условиях. Под ред. Д. Кашнера. М. Мир: 1981. 521 с.

19. Кидин B.B. Практикум по агрохимии. / В.В. Кидин., И.П. Дерюгин, В.И. Кобзаренко, А.Н. Кулюкин, А.Ф. Слипчик, В.Ф. Волобуева, Д.В. Ладонин. М.: "КолосС", 2008, 599 с.

20. Костяев В.Я. Реакция цианобактерий на некоторые тяжелые металлы // Микробиология. -1980. Т. 49, № 5, с. 821 824.

21. Методические указания по проведению полевых опытов с кормовыми культурами. М.: ВНИИ кормов, 1987. - 200 с.

22. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. М.: "Мир", 1976, -436 с.

23. Новоженов В.А. Введение в неорганическую химию. Барнаул, Издательство Алтайского государственного университета, 2001.

24. Осмоловский А. А. Экология микроорганизмов электронный ресурс. // Фонд знаний "Ломоносов" [сайт] [2011]. URL: http://www.lomonosov-fund.ru/enc/ru/encyclopedia:0129486 (Дата обращения: 05.05.2011)

25. Першин Г. Н., Гвоздева Е. И. Учебник фармакологии. М.: "Медгиз", 1961,-402 с.

26. Проворов Н. А. Генетико-эволюционные основы учения о симбиозе // Журн. общ. биологии, 2001, Т. 62, № 6, С. 472 495.

27. Рупошев А.Р., Гарина К.П. Мутагенное действие солей кадмия // Цитология и генетика. -1976. Т. 10, № 5. С. 437-439.

28. С.В. Левин. Микробиологическая диагностика загрязнения почв тяжелыми металлами, дис. .канд. биол. наук. -М., 1983. -164 с.

29. Серегин И.В., Кожевникова А.Д., Казюмина Е.М., Иванов В.Б. Токсическое действие и распределение никеля в корнях кукурузы // Физиология растений. -2003. Т. 50. С. 793-800.

30. Сиунова Т. В. Плазмидосодержащие ризосферные бактерии рода Pseudomonas, устойчивые к кобальту/никелю и стимулирующие рост растений: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Пущино, 2011. -26 с.

31. Скугорева С.Г. Биоаккумуляция и стрессорные эффекты ртути в растениях: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Сыктывкар, 2007. -24 с.

32. Титов А. Ф., Таланова В. В, Казнина Н. М, Лайдинен Г. Ф. Устойчивость растений к тяжелым металлам. Петрозаводск: Карельский НЦ РАН, 2007. 170 с.

33. Тихонович И. А, Проворов Н. А. Симбиогенетика микробно-растительных взаимодействий // Экологии, генетика, 2003, Т. 1, № 0, С. 36 -46.

34. Феник С.И, Трофимяк Т.Б, Блюм Я.Б. Механизмы формирования устойчивости растений к тяжелым металлам // Усп. соврем, биол. -1995. Т. 115, Вып. 3, С. 261 -275.

35. Хоулт Д. Определитель бактерий Берджи / Д. Хоулт. М.: "Мир", 1980. 1086 с.

36. Хоулт Д. Определитель бактерий Берджи / Д. Хоулт. М.: "Мир", 1980. -1086 с.

37. Юрин В.М. Основы ксенобиологии. Минск: БГУ, 2001, -234 с.

38. Янева О.Д. Механизмы устойчивости бактерий к ионам тяжелых металлов // Мшробюл. журн, 2009, Т. 71, № 6, С. 54- 65.

39. Abskharon R.N.N, Gaad El-Rab S.M.F, Hassan S.H.A, Shoreit A.A.M. Reduction of toxic hexavalent chromium by E. coli // Global journal of biotechnology and biochemistry. -2010, V. 5, N. 2, P. 129 135.

40. Al Gaidi A. Effect of heavy metals on soil microbial processes and population. Al Gaidi. Abdousala // Egypt. Acad. J. biolog. Sci. 2010. V. 2. N. 2. P. 9- 14.

41. Al-Garni S.M.S. Increased heavy metal tolerance of cowpea plants by dual inoculation of an arbuscular mycorrhizal fungi and nitrogen-fixer Rhizobium bacterium // African Journal of Biotechnology. -2006, V. 5, N. 2, P. 133 -142.

42. Andrade S.A.L, Abreu C.A, de Abreu M.F, Silveira A.P.D. In?uence of lead addition on arbuscular mycorrhiza and Rhizobium symbioses under soybean plants. Appl. Soil. Ecol. -2004, V.26, P. 123 131.

43. Arlauskas A., Baker R.S., Bonin A.M., Tandon R.K., Crisp P.T., Ellis J. Mutagenicity of metal ions in bacteria // Environmental Research. -1985, V. 36, N2, P. 379 388.

44. Barkay T., Tripp S.C., Olson B.H. Effect of metal-rich sewage sludge application on the bacterial communities of grasslands // Appl. Environ. Microbiol. -1985, V. 49, N. 2, P. 333 337.

45. Barkay T., Tripp S.C., Olson B.H. Effect of Metal-Rich Sewage Sludge Application on the Bacterial Communities of Grasslands // 1985. Applied and environmental microbiology, V. 49, N. 2, P. 333 337.

46. Blaudez D, Botton B, Chalot M. Cadmium uptake and subcellular compart-mentation in the ectomycorrhizal fungus Paxillus involutus // Microbiology. -2000, V. 146, P. 1109- 1117.

47. Bogomolov D.M., Chen S.K., Parmelee R.W., Subler S., Edwards C.A. An ecosystem approach to soil toxicity testing: A study of copper contamination in laboratory soil microcosms // Applied Soil Ecology. -1996, V. 4, N. 2, P. 95 105.

48. Bringezu K., Lichtenberger O., Leopold I., Neumann D. Heavy metal tolerance of Silene vulgaris // J. Plant Physiol. 1999. V. 154. P. 536 546.

49. Brown N.L., Shih Y.-C., Leang C. et al. Mercury transport and resistance // Biochem. Soc. Trans. 2001. N. 4, P. 715 718.

50. Burd G.I., Dixon D.G., Glick B.R. A plant growth-promoting bacterium that decreases nickel toxicity in seedlings. Appl. Environ. Microbiol. -1998, V. 64, N. 10, P. 3663 -3668.

51. Burzynski M., Klobus G. Changes of photo synthetic parameters in cucumber leaves under Cu, Cd and Pb stress // Photosynthetica. 2004. V. 42, N 4. P. 505-510.

52. Cha J.-S., Cooksey D.A. Copper resistance in Pseudomonas syringae mediated by periplasmic and outer membrane proteins // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. -1991. N. 20, P. 8915 8919.

53. Chardin B., Giudici-Orticoni M.T., De Luca G., Guigliarelli B., Bruschi M. Hydrogenases in sulfate-reducing bacteria function as chromium reductase // Appl. Microbiol. Biotechnol. -2003, V. 63, P. 315 321.

54. Chaudhry T.M., Hayes W.J., Khan A.G., Khoo C.S. Phytoremediation focusing on hyperaccumulator plants that remediate metal-contaminated soils. Aust. J. Ecotoxicol. -1998 V.4, P. 37 - 51.

55. Choi Y.-E., Hadara E., Wada M., Tsudow H., Morita Y., Kusano T., Sano H. Detoxification of cadmium in tobacco plants: formation and active excretion of crystals containing cadmium and calcium through trichomes // Planta. -2001, V. 213, P. 45 50.

56. Chugh, L.K., Sawhney S.K. Effect of cadmium on activities of some enzymes of glycolysis and pentose phosphate pathway in pea. Biol. Plant -1999, V. 42, P. 401 -407.

57. Clemens S., Simm C. Schizosaccharomyces pombe as a model for metal homeostasis in plant cells: the phytochelatin-dependent pathway is the main cadmium detoxification mechanism //New Phytol. 2003. V. 159, P. 323 -330.

58. Colpaert J, van Assche J. Zinc toxicity in ectomycorrhizal Pinus sylvestris. Plant and Soil.-1992, V. 143, P. 201 211.

59. Crang R.E., Pechak D.G. The effects of threshold levels of phenylmercuric acetate (PMA) on the paint mildew Aureobasidum pullulans // Can. J. Bot., 1978, V. 56, N. 9, P. 1177 1185.

60. Dar G.H. Effects of cadmium and sewage sludge on soil microbial biomass and enzymatic activities // Bioresource Technology. -1996 V. 56, N. 2 3, P. 141 - 145.

61. Dar H.G., Mishra M.M. Influence of cadmium on carbon and nitrogen mineralization in sewage sludge amended soils // Environ Pollut. -1994, V.84, N.3, P. 285 -290.

62. Davies M.S., Francis D., Thomas J.D. Rapidly of cellular changes induced by zinc in a zinc tolerant and non-tolerant cultivar of Festuca rubra L. // New Phytol. -1991, V. 117, P. 103 108.

63. De Maio A. Heat shock proteins: facts, thoughts, and dreams // Shock. -1999. V. 11, N 1, P. 1 12.

64. Delhaize E., Jackson P.J., Lujan L.D., Robinson N.J. Poly(?-glutamylcysteinyl)glycine synthesis in Datura innoxia and binding with cadmium // Plant Physiol. -1989, V. 89, P. 700 706.

65. Doelman P., Haanstra L. Short- and long-term effects of heavy metals and phosphatase activity in soils: an ecological dose-response model approach // Biology and fertility of soils. -1989 V. 8, N. 3, P. 235 241.

66. Duffiis J.H. "Heavy metals" a meaningless term? (IUPAC Technical Report) // Pure Appl. Chem. -2002, Vol. 74, No. 5, P. 793 - 807.

67. Duxbury T., Bicknell B. Metal-tolerant bacterial populations from natural and metal-polluted soils // Soil Biology and Biochemistry. -1983, V. 15, N. 3,P. 243 -250.

68. Eger M. Peric N. The tolerance of haploid yeast cells Saccharomyces cere-visiae to the presence of cadmium ions // Acta bot. croat. -1979, V. 38, P. 55 -64.

69. Ehrlich H.L . Microbes and metals // Appl. Microbiol. Biotechnol. -1997, V. 48, N. 6, P. 687-692.

70. El-Helow E.R., Sabry S.A., Amer R.M. Cadmium biosorption by a cadmium resistant strain of Bacillus thuriengiensis: regulation and optimization of cell surface afinity for metal cations // BioMetals. -2000, N 4, P. 273 280.

71. El-Sersy N.A., El-Sharouny E.E. Nickel Biosorption by Free and Immobilized Cells of Marine Bacillus subtilis N10 // Biotechnology. -2007, V. 6, N. 3, P. 316 321.

72. Ernst W.H.O. Evolution of metal hyperaccumulation and phytoremediation hype //New Phytol. -2000. V. 146, P. 357 358.

73. Fude L., Harris B., Urrutia M.M., Beveridge T.J. Reduction of Cr(VI) by a Consortium of Sulfate-Reducing Bacteria (SRB III) // Applied and environmental microbiology. -1994, V. 60, N. 5, P. 1525 1531.

74. Gadd G.M. Heavy metal accumulation by bacteria and other microorganisms // Cell. Mol. Life Sci. 1990. N 8. P.834 - 840.

75. Ghorbani N.R., Salehrastin N., Moenia A. Heavy metals affect the microbial populations and their activities // 17th WCSS 14-21, Thailand. Symposium N. 54, August 2002 P. 2234-1 2234-11.

76. Giller K.E., Witter E., Mcgrath S.P. Toxicity of heavy metals to microorganisms and microbial processes in agricultural soils: a review // Soil Biology and Biochemistry. -1998, V. 30, N. 10 11, P. 1389 - 1414.

77. Gilotra U., Srivastava S. Plasmid-encoded sequestration of copper by Pseudomonas pickettii strain US321 // Curr. Microbiol. -1997, N. 6, P. 378 381.

78. Grill E., Winnacker E.L., Zenk M.H. Phytochelatins: The principal heavy metal complexing peptides of higher plants // Science. -1985, V. 230, P. 674 676.

79. Guo W.-J., Bundithya W., Goldsbrough P.B. Characterization of the Arabi-dopsis metallothionein gene family: tissue-specific expression and induction during senescence and in response to copper // New Phytol. -2003, V. 159, P. 369 381.

80. Haag-Kerwer A., Schafer H.J., Heiss S., Walter C., Rausch Th. Cadmium exposure in Brassica juncea causes a decline in transpiration rate and leaf expansion without effect on photosynthesis // J. Exp. Bot. 1999. V. 50, N 341. P. 1827- 1835.

81. Haanstra L., Doelman P. An ecological dose-response model approach to short- and long-term effects of heavy metals on arylsulphatase activity in soil //Biology and fertility of soils. -1991 V. 11, N. 1, P. 18 23.

82. Hall J.L. Cellular Mechanisms for Heavy Metal Detoxification and Tolerance. J. Exp. Botany. -2002. V. 53. P. 1-11.

83. Harris N.S., Taylor G.J. Remobilization of cadmium in maturing shoots of near isogenic lines of durum wheat that differ in grains cadmium accumulation // J. Exp. Bot. -2001, V. 52, N. 360, P. 1473-1481.

84. Hassen A., Jedidia N., Cherifb M., M'Hirib A., Boudabousc A., van Cleem-putd O. Mineralization of nitrogen in a clayey loamy soil amended with organic wastes enriched with Zn, Cu and Cd // Bioresource Technology. -1998, V. 64, N. 1,P. 39 -45.

85. Hattori H. Influence of cadmium on decomposition of sewage-sludge and microbial activities in soils // Soil Sci. Plant Nutr. -1989, V. 35, P. 289 299.

86. Hattori H. Influence of cadmium on decomposition of sewage-sludge and microbial activities in soils // Soil Sci. Plant Nutr. -1989, V. 35, P. 289 299.

87. Hayano B., Tubaki K. Origin and properties of -glycosidase activity of tomato-field soil // Soil Biol. Biochem. -1985, V. 17, P. 553 557.

88. Haydon M.J, Cobbett C.S. A nowel major facilitator superfamily protein athe tonoplast influences zinc tolerance and accumulation in Arabidopsi// Plant Physiol. -2007. V. 143, P. 1705 1719.

89. Haydon M.J., Cobbett C.S. Transporters of ligands for essential metal ions in plants // New Phytol. -2007. V. 174. P. 499-506.

90. Helmisaari, H.-S., Derome J., Fritze H., Nieminen T., Palmgren K., Salemaa M., Vanha-Majamaa I. Copper in Scots pine forests around a heavy-metal smelter in south-western Finland // Water Air Soil Pollut. -1995, V. 85, N. 3, P. 1727- 1732.

91. Higham D.P., Sadler P.J., Scawen M.D. Cadmium-binding proteins in Pseudomonas putida: pseudothioneins // Environ. Health Perspect. 1986, N. 3, P. 5 - 11.

92. Hiroki M. Effects of heavy metal contamination on soil microbial population //Soil sci. plant, nutr. -1992, V. 38, P. 141 147.

93. Hiroki M. Effects of heavy metal contamination on soil microbial population // Soil sci. plant nutr. -1992, V. 38, N. 1, P. 141 147.

94. Horitsu H., Ito T. Comparisons of characteristics of mercury-tolerant bacterium Pseudomonas olevorans G-l and its mercury-sensitive mutant strain // Agr. and boil. chem. -1980, V.44, N. 10, P. 2317 2322.

95. Howden R, Goldsbrough P.B, Andersen C.S, Cobbett C.S. Cadmium-sensitive, cadi mutants of Arabidopsis thaliana are phytochelatin deficient //Plant Physiol. -1995. V. 107, P. 1059 1066.

96. Howe G, Merchart S. Heavy metal-actived synthesis of peptides in Chla-mydomonas reinhardtii // Plant Physiol. 1992. V. 98, N 1. P. 127-136.

97. Howe G, Merchart S. Heavy metal-actived synthesis of peptides in Chla-mydomonas reinhardtii // Plant Physiol. -1992. V. 98, N. 1, P. 127 136.

98. Howlett N.G, Avery S.V. Induction of Lipid Peroxidation during Heavy Metal Stress in Saccharomyces cerevisiae and In?uence of Plasma Membrane Fatty Acid Unsaturation // Applied and environmental microbiology 1997 V. 63, N. 8

99. Howlett N.G, Avery S.V. Induction of Lipid Peroxidation during Heavy Metal Stress in Saccharomyces cerevisiae and In?uence of Plasma Membrane Fatty Acid Unsaturation // Applied and environmental microbiology. -1997, V. 63, N. 8, P. 2971 2976.

100. Ibrahim Z, Ahmad W.A, Baba A.B. Bioaccumulation of silver and the isolation of metal-binding protein from P. diminuta // Braz. Arch. Biol. Tech-nol.-2001,N. 3,P. 223 -225.

101. Ivanova E.P, Kurilenko V.V, Kurilenko A.V. et al. Tolerance to cadmium of free-living and associated with marine animals and eelgrass marine gamma-proteobacteria // Curr. Microbiol. -2002. N. 4, P. 357 362.

102. Jentschke G, Godbold D.L. Metal toxicity and ectomycorrhizas. Physiolo-gia Plantarum. -2000, V. 109, P. 107 116.

103. Joho M., Matsumoto H., Tohoyama H., Murayama T. Stimulation of dehydrogenase synthesis by cadmium in a cadmium-resistance strain of Sac-charomyces cerevisiae // Biochim. et biophys. acta. -1979. V. 585, N. 3, P. 383 388.

104. Jordan M.J., Lechevalier M.P. Effects of zinc-smelter emissions on forest soil microflora// 1975. Can. J. Microbiol. V. 21 N. 11 P. 1855 1865.

105. Kandeler F., Kampichler C., Horak O. Influence of heavy metals on the functional diversity of soil microbial community // Biology and fertility of soils. -1996, V. 23, N. 3, P. 299 306.

106. Kessler A., Brand M.D. The mechanism of the stimulation of state 4 respiration by cadmium in potato tuber (Solanum tuberosum) mitochondria // Plant Physiol. Biochem. 1995. V. 33. P. 519 - 528.

107. Khan A.G. Role of soil microbes in the rhizospheres of plants growing on trace metal contaminated soils in phytoremediation // Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. -2005, V.18, P. 355 364.

108. Khan M., Scullion J. Effect of soil on microbial responses to metal contamination // Environmental Pollution. -2000 V. 110, N. 1, P. 115 125.

109. Khan M., Scullion J. Effects of metal (Cd, Cu, Ni, Pb or Zn) enrichment of sewage-sludge on soil micro-organisms and their activities // Applied Soil Ecology. -2002, V. 20, P. 145 155.

110. Kneer R., Zenk M.H. Phytochelatins protect plant enzymes from heavy metal poisining // Phytochem. -1992. V. 31, P. 2663 2667.

111. Kovacevic G., Kastori R., Merkulov L.J. Dry matter and leaf structure in young wheat plants as affected by cadmium, lead and nickel // Biol. Plant. -1999. V. 42, N 1. P. 119-123.

112. Kramer U., Cotter-Howells J.D., Charnock J.M., Baker A.J.M., Smith J.A.C. Free histidine as a metal chelator in plants that accumulate nickel. Nature. -1996, V. 379, P. 635 638.

113. Kupper H., Zhao F.J., Mc Grath S.P. Cellular compartmentation of zinc in leaves of the hyperaccumulator Thlaspi caerulescens // Plant Physiol. -1999, V. 119, P. 305 311.

114. Kuroyanagi S., Aoyama M. Effects of Heavy Metal Accumulation Associated with Pesticide Application on the Decomposition of Cellulose and Orchard Grass in Soils // Soil science and plant nutrition, -1996, V. 42, N. 1, P. 121 132.

115. Kuypers G.A.J., Roomans G.M. Mercury-induced loss of K+ from yest cells investigated by electron probe X-ray microanalysis // Journal of General Microbiology. -1979. V. 115, N. 1, P. 13 18.

116. Leita L., De Nobili M., Cesco C., Mondini C. Analysis of intercellular cadmium forms in roots and leaves of bush bean // J. Plant Nutr. -1996. V. 19, P. 527 533.

117. Li X.-Z., Nikaido H., Williams K.E. Silver-resistant mutants of Escherichia coli display active efflux of Ag+ and are deficient in porins // J. Bacterid. -1997. V. 179, N. 19, P. 6127 6132.

118. Liso R., Calabrese G., Bintoni M.B., Arrigoni O. Responship between ascorbic acid and cell division // Exp. Cell Res. -1984. V. 150. P. 314 320.

119. Luptakova A., Kusnierova M. Bioremediation of acid drainage contaminated by SRB // Hydrometallurgy. 2005. N 1-2. P. 97 102.

120. M. Hiroki. Effects of heavy metal contamination on soil microbial population // Soil sci. plant nutr. 1992, V. 38, N. 1, P. 141 - 147.

121. M. Khan. Effects of metals contamination on soil microbial diversity, Enzymatic Activity, organic matter decomposition and nitrogen mineralization (a review) // Pakistan Journal of biological sciences. 2000, V. 11, N. 3, P. 1950- 1956.

122. Ma J.F., Ryan P.R., Delhaize E. Aluminium tolerance in plants and the complexing role of organic acids. Trends in Plant Science. -2001, V. 6, P. 273 278.

123. Malcova R., Vosatka M., Gryndler M. Effects of inoculation with Glomus intraradices on lead uptake by Zea mays L. and Agrostis capillaris L. Appl. Soil Ecol. -2003, V. 23, N. 1, P. 255 267.

124. Maliszewska W., Dec S., Wierzbicka H., Wozniakowska A. The influence of various heavy metal compounds on the development and activity of soil microorganisms // Environ. Pollut. -1985. V. 37, N. 3, P. 195 215.

125. Maliszewska W., Dec S., Wierzbicka H., Wozniakowska A. The influence of various heavy metal compounds on the development and activity of soil microorganisms // Environ. Pollut. -1985, V. 37, N. 3, P. 195 215.

126. McEldowney S. The impact of surface attachment on cadmium accumulation by Pseudomonas fluorescens H2 // FEMS Microbiol. Ecol. -2000. N. 2, P. 121 128.

127. Meharg AA. The role of the plasmalemma in metal tolerance in angio-sperms. Physiologia Plantarum, 1993, V. 88, P. 191-198.

128. Meharg AA. The role of the plasmalemma in metal tolerance in angio-sperms. Physiologia Plantarum -1993, V. 88, P. 191 198.

129. Minnich M.M., McBride M.B. Effect of copper activity on carbon and nitrogen mineralization in field-aged copper-enriched soils // Plant and soil. -1986, V. 91, N. 2, P. 231 -240.

130. Mire C.E., Tourjee J.A., O'Brien W.F. et al. Lead precipitation by Vibrio harveyi: evidence for novel quorum-sensing interactions // Appl. Environ. Microbiol. 2004. V. 70, N. 2, P. 855 - 864.

131. Morel M.A., Ubalde M.C., Brana V., Castro-Sowinski S. Delftia sp. JD2: a potential Cr(VI)-reducing agent with plant growth-promoting activity // Arch Microbiol. -2011, V. 193, P. 63 68.

132. Mukhopadhyay R., Rosen B.P., Phung L.T., Silver S. Microbial arsenic: from geocycles to genes and enzymes // FEMS Micobiol. Rev. -2002. V. 26, N. 3,P. 311 -325.

133. Mukhopadhyay R., Rosen B.P., Phung L.T., Silver S. Microbial arsenic: from geocycles to genes and enzymes // FEMS Micobiol. Rev. 2002. V. 26, N. 3,P. 311 - 325.

134. Mulligan C.N., Young R.N., Gibbs B.F. Remediation technologies for metal-contaminated soils and groundwater: an evaluation. Eng. Geol. -2001, V.60, P. 193 207.

135. Necker U., Kunze C. Incubation experiments and nitrogen mineralization by fungi and bacteria in metal amended soil (in German) // Agnew. Bot., -1986, V. 60, P. 81-94.

136. Neumann D., Lichtenberger O., Gunther D., Tschiersch K., Nover L. Heat-shock proteins induce heavy-metal tolerance in higher plants // Planta. 1994.V. 194. P. 360-367.

137. Neumann D., Nieden U.Z., Lichtenberger O., Leopold I. How does Armeria maritima tolerate high heavy metal concentrations? // J. Plant Physiol. 1995. V. 146. P. 704-717.

138. Nguyen T.H., Elimelech M. Adsorption of plasmid DNA to a natural organic mattercoated silica surface: Kinetics, conformation, and reversibility // Langmuir -2007, V. 23, P. 3273 3279.

139. Nies D.H. Efflux-mediated heavy metal resistance in prokaryotes // FEMS Microbiology Reviews. -2003, V. 27, P. 313 339.

140. Nies D.H. Microbial heavy-metal resistance // Appl. Microbiol. Biotechnol., -1999. V. 51, P. 730 750

141. Nies D.H. The cobalt, zinc, and cadmium efflux system CzcABC from Alca-ligenes eutrophus functions as a cation-proton-antiporter in Escherichia coli // J. Bacteriol. 1995, V. 177, N. 10, P. 2707 - 2712.

142. Nies D.H., Silver S. Ion efflux systems involved in bacterial metal resistances. -1995. J. Indust. Microbiol. V. 14, P. 186 199.

143. Nies D.H., Silver S. Ion efflux systems involved in bacterial metal resistances. 1995. J. Indust. Microbiol. V. 14, P. 186 199.

144. Nies D.H., Silver S. Metal ion uptake by a plasmid-free metal-sensitive Al-caligenes eutrophus strain // J. Bacteriol., 1989. V. 171, N. 7. P. 4073 -4075.

145. Nishioka H. Mutagenic activities of metasl compounds in bacteria // Mutat. res. -1975, V. 31, N. 3, P. 217 189.

146. Nordgren A., Baath E., Soderstrom B. Microfungi and Microbial Activity Along a Heavy Metal Gradient // Applied and environmental microbiology. -1983, V. 45, N. 6, P. 1829 1837.

147. Nordgren A., Kauri T., Baath E., Soderstrom B. Soil microbial activity, mycelial lengths and physiological groups of bacteria in a heavy metal polluted area // Environmental Pollution. -1986, V. 41, N. 1, P. 89 100.

148. Ohya H., Komai Y., Yamaguchi M. Zinc effects on a soil bacterial flora characterized by fatty acid composition of the isolates // Biology and fertility* of soils. -1986, V. 2, N. 2, P. 59 63.

149. Ortiz D.F., Ruscitti T., McCue K.F., Ow D. W. Transport of metal-binding peptides by HMT1, a fission yeast ABC-type vacuolar membrane protein // J. Biol. Chem. -1995, V. 270, P. 4721 4728.

150. Pandey N., Pathak G.C., Pandey D.K., Pandey R. Heavy metals, Co, Ni, Cu, Zn and Cd, produce oxidative damage and evoke differential antioxidant responses in spinach. Braz. J. Plant Physiol. -2009, V. 21, N. 2, P. 103 111.

151. Persans M.W., Yan X., Patnoe J.-M.M.L., Kramer U., Salt D.E. Molecular dissection in the role of histidine in nickel hyperaccumulation in Thlaspi goesingense (Halacsy) // Plant Physiol. -1999. V. 121, P. 1117 1126.

152. Petit C.M, Van de Geijn S.C. In vivo measurement of cadmium transport and accumulations in the stems of intact tomato plants // Planta. -1978, V. 138, N2, P. 137- 143.

153. Pietrini F, Iannelli M.A, Pasqualini S, Massacci A. Interaction of cadmium with glutathione and photosynthesis in developing leaves and chloro-plasts of Phragmites australis (Cav.) Trin. ex Steudel // Plant Physiol. -2003, V. 133, P. 829 -937.

154. Poschenrieder C, Gunse B, Barcelo J. Influence of cadmium on water relations, stomatal resistance and abscisic acid content in expanding bean leaves //Plant Physiol. 1989. V. 90. P. 1365-1371.

155. Powell M.J, Davies M.S., Francis D. The influence of Zinc on the cell cycle in the root meristem of a zinc-tolerant and a non-tolerant cultivar of Festuca rubra L // New Phytol. 1986. V. 102. P. 419-428.

156. Prasad A.D. Bioreduction based bioremediation of hexavalent chromium Cr (VI) through potential indigenous microbes. Department of chemical engineering national institute of technology, Rourkela-769008, Orissa, India, 2009, 74 p.

157. Prasad K.V.S.K, Saradhi P.P., Sharmila P. Concerted action of antioxidant enzymes and curtailed growth under zinc toxicity in Brassica júncea // Env. Exp. Bot. -1999. V. 42, N 1. P. 1 10.

158. Price D, Joshi J.M. Ferritin: a zinc detoxicant and a zinc ion donor // Proc. Natl. Acad. Sci. -1982. V. 79, P. 3116 3119.

159. Rauser W.E. Phytochelatins and related peptides. Structure, biosynthesis and function // Plant Physiol. -1995. V. 109, P. 1141 1149.

160. Rauser W.E. Phytochelatins // Annu. Rev. Biochem. -1990. V. 59, P. 61 -86.

161. Rauser W.E. Structure and function of metal chelators produced by plants // Cell Biochem. Biophys. -1999. V. 31. P. 19 48.

162. Rauser W.E. Structure and function of metal chelators produced by plants // Cell Biochem. Biophys. -1999, V. 31, N. 1, P. 19 48.

163. Richau J.A., Choquenet D., Fialho A.M., Sa-Correia I. Emergence of Cu++-tolerant mutants defective in gellan synthesis in Cu++-stressed cultures of Sphingomonas paucimobilis //Res. Microbiol. 1997, V. 148, N. 3. P. 251 -261.

164. Rogers J.E., Li S.W. Effect of metals and other inorganic ions on soil microbial activity: Soil dehydrogenase assay as a simple toxicity test // Bulletin of environmental contamination and toxicology. -1985, V. 34, N. 1, P. 858 -865.

165. Ruhling A., Tyler G. Heavy metal pollution and decomposition of spruce needle litter // Oikos. 1973. V. 24, P. 402 - 416.

166. Saber N.E., Abdel-Moneim A.M., Barakat S.Y. Role of organic acids in sunflower tolerance to heavy metals // Biol. Plant. -1999. V. 42, N 1. P. 6573.

167. Salt D.E., Prince R.C., Baker A.J.M., Raskin I., Pickering I.J. Zinc ligands in the metal hyperaccumulator Thlaspi caerulescens as determined using X-ray spectroscopy // Environ. Sci. Technol. -1999. V. 33, P. 713 717.

168. Salt D.E., Wagner G.J. Cadmium transport across tonoplast vesicles from oat roots: evidence for Cd2+/ H+ antiport activity // J. Biol. Chem. -1993, V. 268, P. 12297- 12302.

169. Sanita di Toppi L., Gabbrielli R. Response to cadmium in higher plants // Environ. Exp. Bot. 1999. V. 41, P. 105-130.

170. Saxena D., Joshi N., Srivastava S. Mechanism of copper resistance in a copper mine isolate Pseudomonas putida strain S4 // Curr. Microbiol. 2002. N. 6, P. 410-414.

171. Sharma P.K., Balkwill D.L., Frenkel A., Vairavamurthy M.A. A new Klebsiella planticola strain (Cd-1) grows anaerobically at high cadmium concentrations and precipitates cadmium sulide //Appl. Environ. Microbiol. -2000, V. 66, N. 7, P. 3083 3087.

172. Shi W., Becker J., Bischoff M., Turco R.F., Konopka A.E. Association of Microbial Community Composition and Activity with Lead, Chromium, and Hydrocarbon Contamination // Applied and Environmental Microbiology. -2002, V. 68, N. 8, P. 3859-3866.

173. Singh D., Chauhan S. K. Organic acids of crop plants in aluminium detoxification//Current science. -2011. V. 100, N. 10, P. 1509 1515.

174. Singh S.N. Environmental bioremediation technologies. Shree N. Singh, R. D. Tripathi. Springer-Verlag, 2007, 518 p.

175. Slawson R.M., Trevors J.T., Lee H. Silver accumulation and resistance in Pseudomonas stutzeri //Arch. Microbiol. -1992. V. 158, N. 6. P. 398 404.

176. Steffens J.C. The heavy metal-binding peptides of plants // Annu. Rev. Plant Physiol. -1990, V. 41, P. 553 575.

177. Strojan C.L. Forest leaf litter decomposition in the vicinity of a zinc smelter // Oecologia 1978, V. 32, N. 2, P. 203 - 212.

178. Tam P.C.F. Heavy metal tolerance by ectomycorrhizal fungi and metal amelioration by Pisolichus tinctorius // Mycorrhiza. -1995, V. 5, N. 3, P. 181 -187.

179. Teitzel G.M. Parsek M.R. Heavy metal resistance of bioilm and planctonic Pseudomonas aeruginosa // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69, N. 4, P. 2313 -2320.

180. Torsvik V., Goksoyr J., Daae F.L. High diversity in DNA of soil bacteria // Appl Environ Microbiol. -1990, V. 56, N. 3, P. 782 787.

181. Trevors J.T. DNA in soil: adsorbtion, genetic transformation, molecular evolution and genetic microchip. // Antonie van Leeuwenhoek -1996, V. 70, P.1 10.

182. Tyler G. Heavy metal pollution and soil enzymatic activity // Plant and soil. -1974, V. 41, N. 2, P. 303-311.

183. Van Tichelen K.K., Colpaert J.V., Vangronsveld J. Ectomycorrhizal protection of Pinus sylvestris against copper toxicity. New Phytologist. -2001, V. 150, P. 203 -213.

184. Vassilev A., Iordanov I. Reductive analysis of factors limiting growth of cadmium-treated plants: a review // Bulg. J. Plant. Physiol. -1997, V. 23, N. 3 -4, P. 114- 133.

185. Vecchio A., Finoli C., Di Simine D., Andreoni V. 130. Heavy metal biosorption by bacterial cells // Fresenius J. Anal. Chem. 1998. V. 361, N 4, P. 338 - 342.

186. Vogeli-Lange R., Wagner G.J. Subcellular localization of cadmium and cadmium-binding peptides in tobacco leaves: implication of a transport function for cadmium-binding // Plant Physiol. -1990. V. 92, P. 1086-1093.

187. Walter C., Stadelman F. Influence du zinc et du cadmium sur les microorganismes ainsi que sur quelques processus biochimiques du sol // Schweiz Landwrits. Foresch. -1979, V. 18, P. 311 324.

188. Wang C.L., Ozuna S.C., Clark D.S., Keasling J.D. A deep-sea hydrothermal vent isolate, Pseudomonas aeruginosa CW961, requires thiosulfate for Cd2+ tolerance and precipitation // Biotechnol. Lett. -2002. N. 8. P. 637 641.

189. Zhu Y.L., Pilon-Smits E.A.H., Tarun A.S., Jouanin L., Terry N. Overexpression of glutathione synthetase in Indian mustard enhances cadmium accumulation and tolerance // Plant Physiol. -1999, V. 119, P. 73 79.

Информация о работе

Колесников, Олег Васильевич
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.02.03

Диссертация

Влияние ксенобиотиков и тяжелых металлов на систему микроорганизм-растение - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Влияние ксенобиотиков и тяжелых металлов на систему микроорганизм-растение ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние ксенобиотиков и тяжелых металлов на систему микроорганизм-растение"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Колесников, Олег Васильевич

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние ксенобиотиков и тяжелых металлов на систему микроорганизм-растение"

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Колесников, Олег Васильевич

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Колесников, Олег Васильевич, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние ксенобиотиков и тяжелых металлов на систему микроорганизм-растение
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология