Углеводный обмен: механизмы патологических процессов, анализ важнейших метаболитов

Александровский, Яков Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Углеводный обмен: механизмы патологических процессов, анализ важнейших метаболитов
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Углеводный обмен: механизмы патологических процессов, анализ важнейших метаболитов"

На правах рукописи

АЛЕКСАНДРОВСКИЙ Яков Александрович

УГЛЕВОДНЫЙ ОБМЕН: МЕХАНИЗМЫ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ, АНАЛИЗ ВАЖНЕЙШИХ МЕТАБОЛИТОВ

Специальность 03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена в Институте биохимической физики им. Н.М.Эмануэля Российской Академии Наук

Научный консультант

доктор медицинами наук, профессор, академик РАН Л.А.Пнрузян

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

доктор биологических наук, профессор

доктор химических наук, профессор

Н.П.Пальмнна

И.П.Баскова

Б.И.Курганов

Ведущая организация: медицинский факультет Российского • университета дружбы народов

Защита диссертации состоится « »_2006 г.

в часов на заседании Диссертационного Совета Д 002.039.01 при Институте биохимической физики им. Н.М.Эмануэля Российской Академии Наук

по адресу: Москва, ул. Косыгина 4 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики

им. Н.Н.Семенова РАН

Автореферат разослан « » _ 2006 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета капдидат химических наук

МА.Смотряева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Поддержание постоянства концентрации глюкозы in vivo является примером одного из самых совершенных механизмов гомеостаза, в функционировании которого участвуют печень, жировая и мускульная ткани, гормоны. Многочисленные нарушения процессов углеводного обмена чаще всего имеют место при сахарном диабете (СД) и характеризуются множественностью форм проявления таких как поражение глаз, почек, нарушение кровообращение, склонность к тромбозу, снижение иммунорезистентности к бактериальным инфекциям, появление незаживляемых ран. Многие специалисты склонны рассматривать перечисленные нарушения не как осложнения СД, а как естественную форму проявления основного заболевания. Такая точка зрения в основном обусловлена отсутствием единого механизма, позволяющего связать и объяснить весь широкий спектр перечисленных патологий. Поиск такого механизма - одна из актуальнейших современных задач, особенно если принять во внимание неуклонный рост количества больных СД во всем мире.

Многообразие форм нарушений углеводного обмена могут проявляться в явном виде не только при СД, но и некоторых других заболеваниях. Так, например, более чем за 150 лет наблюдений (!) в научной и медицинской литературе накопилось много категоричных и противоречивых утверждений, выражающих два полярных мнения о том, что диабет подавляет или, наоборот, способствует злокачественным пролиферативным процессам. С другой стороны, у онкологических больных нередко наблюдаются признаки, характеризующие сильное влияние основного заболевания на процессы углеводного обмена. Таким образом, представляется очень заманчивым попытаться «поставить точку» в этом затянувшимся споре и идентифицировать молекулярный механизм взаимовлияния названных патологий.

Одним из основных инструментов изучения механизмов патологии является селективный анализ различных метаболитов. В конечном итоге, как правило, цель достигается использованием ферментных или иммуно-ферментных аналитических методик. Разработка и внедрение в практику таких методик невозможно без наличия широкого ассортимента ферментных препаратов, а также фундаментальных знаний механизма их действия. Немаловажным обстоятельством, во многом обеспечивающим успех подобных исследований, является соответствующие конструктивные решения и аппаратурное оформление используемых аналитических методов.

Значения концентраций глюкозы и холестерина безусловно являются базовыми параметрами, адекватно отражающих в целом «согласованность» протекания процессов углеводного обмена in vivo. Мировая потребность в анализах указанных метаболитов обеспечивается аналитическими наборами, тест-полосками или анализаторами, принцип действия которых основан на использовании ферментов глюкозооксидазы и холестериноксидазы. Однако, до сих пор известный набор аналитических методик глюкозы и холестерина не покрывает всех нужд медико-биологаческих исследований. Разработка новых - является актуальнейшей научно-практической задачей. Причем, поскольку за биологической активностью указанных ферментов можно следить с помощью одних и тех же инструментальных методов анализа, разработка, к примеру, анализатора глюкозы, позволяет, в принципе, использовать созданный прибор и для анализа спиртов или холестерина без каких-либо конструктивных изменений.

БИБЛИОТЕКА С.-Петербург ОЭ aooGjKffZ^

(например, холин- или алкогольоксидаза) объединяют в т.н. семейство GMC-(g1ucose-methan0l-ch0line)-0KCMfl0peflyicra3 [Cavener 1992; Sampson 2001]. Среди членов этого семейства алкогольоксидаза, равно как и оксидазы глюкозы или холестерина, являются основным реагентом большинства коммерческих наборов, используемых в микробиологической и виннодельческой промышпенностях, для анализа первичных спиртов. Таким образом, вышеуказанные причины позволяют рассматривать исследования глкжозооксидазы, холестериноксидазы и алкогольоксидазы как актуальную научную задачу с большой практической значимостью. Цели и задачи исследований. Настоящая диссератционная работа посвящена:

1. Изучению GMC-оксидоредуктаз, а именно: а) поиску штаммов-продуцентов алкогольоксидазы и разработке эффективной методики выделения этого фермента; б) изучению физико-химических и каталитических свойств глкжозооксидазы, алкогольоксидазы и холестриноксидазы; а) разработке ферментативных методов анализа глюкозы, спиртов и холестерина с использованием растворимых и иммобилизованных ферментов и г) созданию прототипов ферментных анализаторов субстратов GMC-оксидоредуктаз

2. Теоретическому и экспериментальному обоснованию генерализированного механизма развития диабетических осложнений.

3. Теоретическому обоснованию гипотезы, объясняющей взаимозависимость патологических молекулярных процессов при совместном протекании сахарного диабета и рака

Научная новизна.

е. Изучен механизм действия глкжозооксидазы с искусственными акцепторами ■ электронов. Впервые продемонстрировано, что гпкжозооксидаза может проявлять несколько максимумов рН-активности в зависимости от вида акцептора электронов, используемых в качестве второго субстратра. С кислородом максимум активности наблюдался в области значений рН 5,6-5.8; с одноэлектроннными акцепторами - в области рН 7,6; в случае 2,6-дихлорфенолиндофенола рН-оптимум реакции располагался в области значений < 5,0. Предложен механизм, объясняющий обнаруженное явление.

• Продемонстрирована возможность применения полимерных субстратов на основе red-ox индикаторов для глюкозооксвдазы и НАДН-дегидрогеназы. Это позволило предложить новую конструкцию ферментных электродов.

• Предложена оригинальная кинетическая схема действия холестериноксидазы в водноорганических средах. Продемонстрировано, что каталитические свойства фермента в сильной мере зависят от структурной организации субстрата. Другими словами, хопестериноксидаза является «проявителем» надмолекулярной структуры ассоциатов холестерина. С этих позиций обосновывается возможность использования холестериноксидазы для дигностики состояния клеточных мембран.

• Найден активный дрожжевой продуцент алкогольоксидазы и каталазы Candida boidinil 4д. Разработана оригинальная методика очистки этих ферментов. Изучены основные физико-химические и каталитические свойства алкогольоксидазы.

• Обоснованы и экспериментально определены критерии подбора пористых носителей для иммобилизации ферментов.

• Разработаны различные аналитические методы и устройства для определения некоторых субстратов GMC-оксидоредуктаз и НАД-зависимых дегидрогеназ.

• Впервые продемонстрирована возможность инактивации AT-III и С1-ИНГ под действием метилглиоксаля. Определены значения констант скоростей указанных реакций в условиях, максимально приближенных к условиям in vivo. Проведена оценка возможного влияния этих процессов на развитие диабетических

осложнений. Впервые предложен и обоснован генерализованный механизм развитая диабетических осложнений. В основе этого механизма лежит активация длительной гипергликемией внутриклеточных ферментов, входящих в семейство протеинкиназ С (РКС). В соматических клетках с инсулинозависимым метаболизмом этот процесс ведет к состоянию инсулинорезистентности (ИР). В нейтрофилах - к их активации и выбросу во внеклеточное пространство многочисленных эффекторных молекул, разрушающих стенки кровеносных сосудов и иницирующих нарушения в системах свертывания крови и фибринолиза.

• Исследованы общие и значимые для СД и рака молекулярные процессы. Показано, что внутриклеточные процессы, катализируемые ферментами семейства РКС, лежат не только в основе развития диабетических осложнений, но и контролируют злокачественный опухолевый рост ("РКС-синдром"). Высказана гипотеза, согласно которой изменение статуса РКС под действием гипергликемии или в условиях ИР - наиболее характерных форм проявления СД, способно как "компенсировать", так и "усиливать" дисфункцию ферментов РКС, обусловленную, в свою очередь, процессами канцерогенеза. Результирующий клинический эффект взаимовлияния диабета и рака, по-видимому, в этих случаях будет зависить от степени компенсации СД, вида и стадии онкологического заболевания. В рамках этой гипотезы стало возможным объяснить, почему СД может подавлять, препятствовать или способствовать развитию рака. Структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 339 страницах машинописного текста и состоит из двух разделов. Каждый из разделов содержит обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результатов, обсуждения и выводов. Библиография включает 66 отечественных и 489 зарубежных источников. Текст работы содержит 19 таблиц и 47 иллюстраций.

Список сокращений: AT-III - антитромбин-lll; АО - алкогольоксидаза; ГО -глюкозооксидаза; ИР - инсулинорезистентность ; С1-ИНГ, - С1-ингибитор; IRS - субстрат инсулинового рецептора; МГ - метилглиоксаль; МС - мельдолевый синий; ПАВ -поверхностно-активное вещество: РКС - протеинкиназа С; СД - сахарный диабет; SOD -Cu.Zn-суперсжсиддисмутаза; ФМС - феназинметосульфат; ХО - холестериноксидаза.

УГЛЕВОДНЫЙ ОБМЕН: АНАЛИЗ ВАЖНЕЙШИХ МЕТАБОЛИТОВ Глава 1. Изучение реакции окисления глюкозы под действием глюкозооксидазы

Глюкозооксидаза (КФ 1.1.3.4) синтезируется грибами родов Pénicillium, Aspergillus и катализирует следующую реакцию:

р- D - глюкоза + Ог глюконо-б -лакгон + Н202

Благодаря высокой специфичности, стабильности, отсутствию необходимости в добавлении кофактора для проявления активности, ГО является на сегодняшний день практически незаменимым реагентом, используемым в различных тест-системах для определения глюкозы.

1.1.Изучение кинетических параметров реакции, катализируемой гпюкозооксидазой, в присутствии кислорода. Нами было проведено исследование рН-зависимости кинетических параметров реакции, катализируемой ГО из штамма Pénicillium vitale. Зависимость начальной скорости реакции от рН при фиксированных

концентрациях глюкозы (0,05 М) и кислорода (0,26 мМ) представлена на рис. 1.1. Оптимальные значения рН при указанных концентрациях субстратов составило ~ 5,6-5.8 В двойных обратных координатах зависимость скорости реакции от концентрации кислорода при рН 5,8 и 7,8 при нескольких фиксированных концентрациях глюкозы представляет собой семейство параллельных прямых (рис. 1.2а). Наблюдаемая зависимость соответствует реакции, протекающей без образования тройного фермент-

Рис. 1.1. Зависимость от рН начальной скорости реакции восстановления ГО кислородом - 1, ФМС (1 мМ) - 2, ТМФД (0,1 мМ) - 3, ПВ (1 мМ) - 4, МС (0,1 мМ)- 5 и ДХФИФ (10 мкМ) - 6. Концентрация глюкозы -100 мМ, 25°С.

субстратного комплекса (т. е. реакции с образованием замещенной формы фермента) и описывается уравнением

1/у = 1/У (1 + Ко/[0г] + К^Цв})

(1.1)

где V - начальная скорость реакции, V - максимальная скорость реакции, [02] и [О] -концентрации кислорода и глюкозы, Ко и Кд - константы Михаэлиса для кислорода и глюкозы, соответственно.

Рис. 1.2. Графики Лайнувера-Берка для зависимости скорости реакции от концентрации кислорода (а) при рН 5,8 и 7,8 (концентрации глюкозы: 1- 0,5; 2 -0,1; 3 -0,05; 4 -0,025; 5-0,01; 6 - 0.005М) и зависимости эффективной максимальной скорости от концентрации глюкозы (б), рассчитанные из графиков (а). Значения скоростей реакции в зависимости от концентрации кислорода получены численным дифференцированием полных интегральных кривых.

Значения Кд ГО по глюкозе, определенные из вторичных графиков при рН 5,8 и рН 7,8, оказались равны между собой и составили 20 мМ (рис. 1.26). Соответствующие значения Ко по кислороду при этих же рН, также не отличались друг от друга и при насыщающих концентрациях глюкозы характеризовались величиной 0,3 мМ.

Отношение максимальных скоростей реакции при рН 5,8 и при рН 7,8 составило 2,3. Таким образом, наблюдаемая зависимость скорости реакции от рН при фиксированных концентрациях субстратов (рис. 1.1) была обусловлена изменением каталитической константы, а не констант Михаэлиса.

5 10 15

am, mW"'

Рис. 1.3. Зависимость скорости реакции от концентрации кислорода при 0,05М концентрации глюкозы при pH 6,0; 7,0 и 8,0. Значения скорости реакции рассчитаны численным дифференцированием из интегральных кривых зависимости концентрации кислорода от времени.

Это заключение подтверждается данными, полученными при определении эффективной' константы Михаэлиса для кислорода при рН 6,0,7,0 и 8,0 (рис.1.3) при 0,5М концентрации глюкозы. Как следует из приведенных графиков, мы не наблюдали изменения константы Михаэлиса для кислорода в пределах экспериментальной ошибки, в то время как максимальная скорость реакции при рН 8,0 составляла ~35% от максимальной скорости реакции при рН 6,0.

1.2. Изучение реакций, катализируемых глюкозооксидазой, в присутствии искусственных акцепторов электронов. рН-Зависимость • скорости реакции, катализируемой ГО в присутствии феназинметосульфата (ФМС; 1мМ) и глюкозы (100 мМ), представлена на рис. 1.1. Для данной реакции в отличие от реакции с использованием в качестве акцептора электронов кислорода оптимум рН наблюдался при 7,5-7,6. Во всех последующих экспериментах концентрация ФМС не превышала 1мМ, посколыку при более высокик концентрациях этого акцептора наблюдалось ингибирование реакции. При изменении рН от 8,0 до 7,0 значение константы Михаэлиса для ФМС в пределак экспериментальной ошибки оставалось постоянным и составило 0,2 мМ. При понижении рН наблюдалось увеличение константы Михаэлиса для ФМС. Значение рК, определяющее изменение данной константы, составило 6,5-6,8. Тангенс угла наклона зависимости логарифма константы Михаэлиса для ФМС от рН в пределах экспериментальной ошибки составил 1 (рис. 1.4).

Величина максимальной скорости реакции в исследованной области рН менялась незначительно (не более чем в 2 раза при изменении рН от 5,5 до 7,5). Отношение максимальной скорости реакции в присутствии ФМС при рН 7,5 к максимальной скорости реакции в присутствии 0? при рН 5,6 составило 0,93+0,1.

Рис. 1.4. Зависимость логарифма константы Михаэлиса для ФМС от рН при 0,1 № концентрации глюкозы. Данные получены из графиков зависимости начальных скоростей реакции от концентрации ФМС.

Рис. 1.5. Зависимость от рН логарифма константы Михаэлиса для ДХФИФ и максимальной скорости реакции с данным акцептором электронов. Кинети-ческие параметры рассчитаны из интегральных кривых зависимости концентрации восстановленной формы ДХФИФ от времени.

Оптимум рН при использовании в качестве акцептора электронов мельдолевого синего (МС; рис. 1.1), как и в случае с ФМС, наблюдался при рН 7,5-7,6. Определить константу Михаэлиса и максимальную скорость реакции для данного акцептора при рН 7,0,7,5 и 8,0 не удалось, поскольку в области использованных концентраций МС (40 - 200 мкМ) скорость реакции линейно зависила от концентрации этого индикатора. Использование же более высоких концентраций МС было затруднено из-за образования агрегатов данного соединения при проведении реакции, что приводило к нелинейности кинетической кривой. Таким образом, в экспериментальных условиях для реакции, катализируемой ГО в присутствии МС, стадией, определяющей скорость реакции, является образование комплекса акцептора электронов с восстановленной формой фермента (стадией, характеризующейся константой скорости второго порядка). По-видимому, данная стадия определяет и характер рН-зависимости скорости реакции.

Активность ГО с бензилвиологёном наблюдалась при рН 7,6 и не наблюдалась при рН 5,6. Однако при рН 7,6 скорость реакции была крайне низка - появление окраски восстановленной формы бензилвиологена наблюдалось лишь после 1,5 ч инкубации в анаэробных условиях раствора, содержащего 0,1 М глюкозу, 2 мг/мл ГО и 1 мМ бензилвиологена.

Результаты, полученные при исследовании реакции, протекающей в присутствии 2,6-дихлорфенолиндофенола - ДХФИФ (рис. 1.5), показывают, что характер восстановления данного акцептора ферментом существенно отличается от процесса восстановления переносчиков электронов, рассмотренных выше. При изменении рН от 8,0 до 5,2 происходит увеличение максимальной скорости реакции при параллельном увеличении константы Микаэлиса для ДХФИФ. В случае реакции с ДХФИФ не наблюдалось ярко выраженного максимума скорости реакции в исследованной области рН. Интерпретация результатов, полученных в экспериментах с данным индикатором, осложняется процессом его протонирования, характеризующимся рК 5,7.

гл

■Е.Р

рК 6,8

-Ео«2°2

Е0 + НА

•Wa'

нл

е^д в о»12- е" а

•елв

Рис. 1.6. Схема работы ГО по «пинг-понг» механизму, позволяющая объяснить наличие 2-х максимумов активности фермента в зависимости от рН среды и типа используемого акцептора электронов (пояснения в тексте). Ео, Еш, Е' и Е" - окисленная, восстановленная, депротонированная и семихинонная формы ГО; А - одноэлектронный акцептор; В - восстановленная форма А; Гл - глюкоза; Р - глюконолактон; 02 - кислород и Н202- перекись водорода.

Из шести искусственных акцепторов электронов, которые были использованы в качестве субстратов ГО, три в условиях эксперимента могут восстанавливаться только по одноэлектронному механизму - ЫМЫ'.Ы'-тетраметил-п-фенилендиамин (ТМФД), бензилвиологен (БВ) и полибензилвиологен (ПВ). Для трех данных акцепторов электронов оптимум рН скорости реакции близок к 7,6 и скорость их воздействия с ГО быстро уменьшались с понижением рН. Аналогичная зависимость наблюдалась для двух других окислительно-восстановительных индикаторов - ФМС и МС, которые могут восстанавливаться как по двух-, так и по одноэлектронному механизмам [Chosh & Quayle 1979]. В случае ДХФИФ, процесс восстановления которого включает перенос двух атомов водорода, характер зависимости скорости реакции от рН существенно отличался от аналогичной зависимости для других акцепторов.

рН-Зависимость скорости реакции, катализируемой ГО в присутствии одноэлектронных акцепторов, позволяет предположить, что восстановленный фермент может находиться в двух формах, одна из которых способна окисляться искусственными акцепторами электронов по одноэлектронному механизму, а вторая - неспособна. Первая форма должна преимущественно наблюдаться при рН>6,7, а вторая - при низких значениях рН (рис.1.6).

Отметим, что ранее при интерпретации рН-зависимости кинетических параметров реакции, катализируемой ГО в присутствии кислорода, предполагалось наличие двух форм восстановленного фермента с рК~6,9, отличающихся скоростью окисления кислородом: депротонированная форма окислялась медленнее [Weibel & Bright 1971]. Логично предположить, что две формы восстановленного фермента, существование которых вытекает из данных, полученных при исследовании реакций, катализируемых ГО в присутствии искусственных акцепторов электронов, идентичны формам восстановленного фермента, определяющих рН-зависимость скорости реакции окисления фермента кислородом.

На основании рН-зависимости скорости реакции, катализируемой ГО в присутствии ФМС и МС, можно предположить, что основной механизм восстановления данных акцепторов связан с одноэлекгронным переносом. Не исключено, однако, что при рН < 6,0 восстановление ФМС и МС может происходить по двухэлекгронному механизму, но с меньшими скоростями, чем восстановление по одноэлектронному - при высоких значениях рН.

Максимальная скорость реакции при рН 7,5 с ФМС в пределах экспериментальной ошибки равна максимальной скорости реакции при рН 5,6 с кислородом. По-видимому, и в том и в другом случаях, максимальная скорость реакции обусловлена восстановительной полуреакцией. Если это предположение справедливо, то уменьшение каталитической константы реакции в присутствии кислорода с увеличением рН должно происходить вследствие значительного уменьшения скорости окислительной попуреакции. Из литературы известно, что стадия изомеризации фермент-субстратного комплекса (стадия 2, рис.1.6) для ГО из разных источников не является стадией, определяющей окорость восстановительной полуреакций в целом, при использовании в качестве субстрата глюкозы. Поэтому наиболее вероятно, что максимальная скорость реакции при рН 5,6 в случае использования в качестве акцептора электронов кислорода определяется скоростью распада комплекса фермент-лакгон (стадия 3 на рис. 1.6). При повышении рН, по-видимому, происходит смена скорость определяющей стадии и при рН 7,5 каталитическая константа определяется стадией 8 или 9 окислительной полуреакции (рис. 1.6). Для реакции с ФМС каталитическая константа, по-видимому, определяется восстановительной полуреакцией при рН 7,5 и окислительной полуреакцией при понижении рН. При использовании в качестве субстратов МС, БВ или ПВ скорость реакции определяется образованием комплекса акцептор-восстановленный фермент (стадия 10, рис. 1.6) и характеризуется константой скорости второго порядка.

Возможность проведения реакции с участием искусственных акцепторов электронов представляется весьма важной с точки зрения практического применения ГО. Обнаруженные нами новые свойства фермента позволили разработать оригинальные фотометрические методики определения глюкозы без использования вторичных индикаторных реакций.

Глава 2. Изучение реакции окисления холестрина под действием холестриноксидазы

Процесс ферментативного превращения холестерина под действием холестериноксидазы (КФ 1.1.3.6) протекает по схеме

холестерин + 02 -»Д5-холестен-3-он -> Д4-холестен-3-он + Н202

В качестве промежуточного соединения образуется Д5-холестен-3-он. Фермент, таким образом, проявляет оксидазную и изомеразную активности. Реакция окисления стерина является лимитирующей стадией. ХО характеризуется широкой субстратной специфичностью. Низкая растворимость холестерина в водной среде является основным обстоятельством, обуславливающим особенности проведения данной реакции. Наиболее распространенный способ проведения реакции основан на солюбилизации стерина с помощью ПАВ, способных образовывать мицеллы, в состав которых включаются молекулы холестерина.

Практически не исследован способ проведения реакции окисления холестерина ХО в гомогенных водноорганических средах. В этом случае исключается необходимость в использовании детергентов, способных ингибировать фермент, упрощается методика приготовления раствора субстрата, уменьшается число реагентов, способных оказывать влияние на ферментативный процесс, упрощается интерпретация результатов и появляются дополнительные возможности выявления индивидуальных свойств как белкового катализатора, так и субстрата, затушёванные применением ПАВ.

Цель исследований - изучение влияния реакционной среды: природы солей, органических растворителей и их концентраций, рН, а также процессов старения водно-органических растворов холестерина на реакцию его окисления, катализируемую ХО.

2.1. Кинетические особенности реакции окисления холестерина холестеринок- сидазой в водно-органических средах. Главным результатом предварительных исследований реакции окисления холестерина под действием ХО в водноорганических средах явился вывод о том, что формирование «субстратных» свойств холестрина зависило от очень многих параметров. К таковым следовало отнести не только традиционные и легко контролируемые как рН или состав реакционной среды, природа буферной соли или органического растворителя, но даже такие как процесс приготовления растворов стерина.

На рис. 2.1 приведены полные и линеаризованные интегральные кривые исследуемой реакции, полученные в одинаковой по составу реакционной среде. Исследованные растворы отличались не составом, а способом их приготовления. В первом случае к водноорганической смеси добавляли раствор холестерина ( в том же органическом растворителе), во втором случае к раствору холестерина в растворителе добавляли водноорганическую смесь (рис. 2.1, кривые 1 и 2, соответственно).

Рис. 2.1. Полные кинетические кривые реакции окисления холестерина ХО в регистрируемых и рассчётных координатах, полученных при использовании одинаковых по составу растворов субстрата, но отличающихся между собой только порядком смешения реагентов (пояснение в тексте). Состав среды: 50 мМ Na-фосфэтный буферный раствор, рН 6,85, с 11,8% содержанием изопропанола.

Постоянство тангенса угла наклона линеаризованных интегральных кривых (рис.2.1), определяющее величину константы Михаэлиса, указывало на тот факт, что изменение структуры ассоциатов холестерина вследствие разного способа приготовления растворов не влияло на сродство между ферментом и субстратом, а проявлялось в изменении максимальной скорости реакции. Аналогичные данные были получены при использовании реакционных сред на основе других буферных растворов.

Таким образом, сравнение линеализованных интегральных кривых данной серии экспериментов (рис.2.1), однозначно указывало на тот факт, что даже порядок смешения реагентов каким-то образом отражался в «предистории» водноорганических растворов холестерина и оказывал влияние на ход ферментативных реакций. Причем, достоверное различие кривых сохранялось и в процессе «старения» растворов в течение 18 часов после их приготовления.

На рис. 2.2 изображены линеаризованные интегральные кривые исследуемой реакции, проведенной при разном содержании спирта в реакционной среде на основе TES- или ТЭА буферных растворов. Как следует из представленных графиков в диапазоне исследованных соотношений буферный раствор - органический растворитель можно выделить две области, в одной из которых линеаризация кинетических кривых приводит к получению отрицательных значений константы Михаэписа и максимальной скорости. В теории ферментативного катализа такая ситуация проанализирована и имеет место в случае конкурентного ингибирования продуктом реакции. В нашем случае подобная интерпретация не может дать удовлетворительного объяснения полученным результатам.

Рис. 2.2. Линеаризованные интегральные кривые реакции окисления холестерина ХО при разных концентрациях изопропанола в реакционной среде на основе 50 мМ TES- (рис. слева) или ТЭА-NaOH буферного раствора рН 7,0 (рис. справа).

Действительно, математическая обработка интегральных кривых, отражающих ход реакции при 11,8% концентрации изопропанола в TES-буферном растворе (рис. слева) приводит к получению отрицательнх значений К,., и V, что нельзя объяснить ингибированием фермента или его инактивацией в ходе реакции, поскольку при использовании буферного раствора на основе ТЭА (при той же концентрации изопропанола) кинетическая кривая хорошо описывается уравнением Михаэлиса-Ментен (рис. справа). По данным повторного эксперимента, выполненного через 20 ч после приготовления растворов субстрата в ТЭА-буфере с 11,8°/о изопропанолом, процесс ферментативного окисления холестерина как и в случае с TES- или фосфатным буферами характеризовался отрицательными значениями кинетических параметров.

Представленные результаты свидетельствовали о том, что природа реакционой среды, обусловленная совокупностью свойств компонентов, определяет надмолекулярную структуру субстрата и процесс ферментативной реакции в цепом.

Строение холестерина, равно как и продукта его ферментативного окисления -Д4-холестен-3-она, имеет свои особенности, определенные локализацией двойной связи, конформационным положением как гидроксильной группы, так и четырех конденсированных колец гидрированного циклопентанофенантрена, придающих жесткость структуре молекулы. Находясь в водной среде в ассоциированном состоянии, между этими молекулами имеет место «плоскостное» гидрофобное взаимодействие, прочность которого может регулироваться не только электростатическими силами между гидрофильными частями стеринов, но и комплементарностью их структур. Из химии стероидов хорошо известна такая возможность ассоциации между некоторыми из них, приводящая к образованию устойчивых комплексов.

Полученные нами результаты кинетических исследований позволили предположить, что, по-видимому, в данном случае неспецифическое взаимодействие между холестерином и Д4-холестенон-3-ом, т.е. субстратом и продуктом реакции, несколько превышает обычно реализуемые чисто гидрофобные взаимодействия: наблюдаемый эффект «торможения» ферментативной реакции может быть следствием существенного уменьшения подвижности молекул холестерина за счет «прилипания» к ним молекул А -холестен-3-она. Косвенным подтверждением существования указанных

взаимодействий может служить тот факт, что константа скорости диссоциации холестерина из липосом, приготовленных с применением д4-холестен-3-она, уменьшается в 3,3 раза по сравнению с экспериментами, выполненными при использовании единственного стероида - холестерина, и составляет 0,03 ч"1 [Bruckdorfer & Sheny 1984]. Следует ожидать, что увеличение концентрации органического растворителя в реакционной среде будет способствовать ослаблению сил гидрофобного взаимодействия между молекулами стероидов и экспериментальные данные должны будут описываться классическими кинетическими уравнениями.

Высказанное предположение можно выразить в рамках следующей схемы:

Ki Кг

E+S±;ES Е + Р (2.1)

К-1

Кз

Р+ S t» PS (2.2)

!Сз

где Е-ХО, S -холестерин, Р- Д4-холестен-3-он,

Согласно закону действия масс константа связывания субстрата с продуктом (константа устойчивости комплекса PS) будет определена выражением

Кз [PSJ

Кр =--=--------(2.3)

К-з [Р] х [SJ

В результате математической обработки схем (2.1 - 2.3) зависимость концентрации продукта реакции от времени приобретает следующий вид:

Vt K„(1+Kp[S]o) [S]0

[Р] =----+ --------- In--------------(2.4)

1 - КрК„ КрКм - 1 [S]o - [Р]

Согласно полученному уравнению, тангенс угла наклона кинетической кривой, линеаризованной в координатах ([P]/t; 1/t1n[S]o/[S]o - [Р]) может быть представлен как положительной, так и отрицательной величинами, что согласуется с экспериментальными данными, приведенными на рис. 2.2. Для выполнения условия

Км (1 + Кр [S]0

--->0 (2.5)

Км Кр — 1

необходимо, чтобы знаменатель этой дроби был также величиной положительной, т.е. соблюдалось бы неравентво

КРКЫ > 1

(2.6)

В этом случае определение кинетических параметров ферментативной реакции и величины константы устойчивости комплекса РЭ проводили с использованием метода Фостера - Ниманна. Согласно этому методу прямая, проведенная из начала координат

Рис 2.3. Применение метода Фостера-Ниммана для определения кинетических параметров реакции окисления холестерина ХО и константы устойчивости комплекса холестерин - Д4-холесген-3-он при 2 и 7,4% концентрации изопропанола в реакционной среде на основе 50мМ ТЭА-№ОН-буферного раствора (рН 7,0). Концентрацию холестерина в растворах варьировали от 6 до 18 мкМ. Рис. 2.4. Зависимость кинетических параметров реакции окисления холестерина ХО от концентрации изопропанола в реакционной среде.

<[Р]Л; 1п {[БЬ / [Б]о - [Р]} х Г1) с тангенсом угла наклона, численно равным [3]0, пересекает прямую, описываемую уравненем (2.4), в точке, соответствующей начальному времени реакции ? = 0. В этот момент времени концентрация продукта [Р] = 0 и теоретически взаимодействие между двумя стеринами отсутствует. Результаты этих экспериментов представлены в таблице 2.1 и на рис. 2.3.

Таблица 2.1. Значения кинетических параметров реакции окисления холестерина, катализируемой ХО, и константы устойчивости комплекса холестерин - Д4-холестен-3-он в зависиомсти от концентрации изопропанола в реационной среде на основе ТЭА-буфера.

Изопропанол,% VЮ"8 Мси У0, усл.ед. Км, мкМ кр, м-1

2 9,9 5,1 2,5 3,210"

5,7 11,8 - 6,9 8,5 105

7,4 12,3 2,9 18,7 3,6 105

9,1 12,0 - 41 1,410®

11,8 12,0 1,9 38 -

14,2 9,4 1,9 24 -

16,7 3,6 1,9 11,8 -

21,6 2,6 2,0 2,4 -

При концентрации спирта в реакционной среде (ТЭА-ЫаОН-буферный раствор) выше 10% тангенс угла наклона линеаризованных кинетических кривых характеризуется отрицательными величинами, знак неравества (2.5) изменяется на противоположный, величина КрКы становится много меньше единицы и выражение (2.4) трансформируется в известнуо интегральную форму кинетического уравнения Михаэлиса - Ментен.

Согласно представленным в таблице 2.1 и на рис. 2.4 данным, в области концентраций изопропанола в реакционной среде до 15% максимальная скорость реакции остается постоянной, уменьшаясь в 3-4 раза с увеличением содержания спирта до 22%. Начальная скорость реакции, как уже отмечалось, при повышении концентраци изопропанола примерно до 8-9% уменьшается в 1,5-2 раза, оставаясь неизменной во всем остальном диапазоне исследованных соотношений органический растворитель -буферный раствор. Зги результаты указывают на то, что изопропиловый спирт в концентрации до 20% мало влияет на каталитические свойства ХО. В то же время величина Км ХО по холестерину претерпевает существенные изменения. Наблюдаемое «ухудшение» величины Км в области до 10% концентрации изопропанола может быть следствием как измененного сродства фермента к субстрату, так и определенных структурных перестроек в организации ассоциагов холестерина

Увеличение концетрации органического растворителя в реакционной среде должно ослаблять взаимодействие между молекулами стероидов в ассоциатах. Это влияние нашло свое отражение в уменьшении величины константы устойчивости комплекса PS с увеличением процентного содержания изопропанола (см. табл. 2.1).

Таким образом, показано, что в области исследованных соотношений органический растворитель-буферный раствор основное действие органического растворителя направлено не на белковый катализатор, а на формирование определенных свойств мицеллярных структур холестерина, определяя тем самым его субстратные свойства в реакции, катализируемой ХО.

2.2. Выделение и характеритика комплекса холестрин - Д4-холетен-3-он.

Возможность специфического взаимодействия между холестрином и Д4-холестенон-3-ом помимо фактов, косвенного его подтверждающих, может быть доказана в случае прямой идентификации комплекса между названными стеринами.

Как следует из представленных в таблице 2.2 данных, осадок, полученный совместной кристаллизацией эквимолярных количеств холестерина и Д4-холетен-3-она из горячего метанола, представлял собой комплекс, образованный в стехиометрическом соотношении 1:1. ИК-спектр комплекса свидетельствовал о наличии водородной связи между гидроксилом холетерина и карбонильной группой Д4-холетен-3-она. При растворении комплекса в CCU или хлороформе происходила его диссоциация, вследствие чего ИК-спектр растворенного комплекса, а также угол вращения были идентичны соответствующим характеристикам эквимолярной смеси двух исходных соединений.

Таблица 2.2. Физические свойства комплекса холестерина с Д4-холестенон-3-ом

Вещество Температура плавления ИК-спектр в вазелиновом масле v С=0 см-1 vOH см'1 Угол Вращения (в СНС|3)

Холестерин 149-150 — 3400 -40

Д4-холестен-3-он 82-82 1680 — + 92

Комплекс 102-104 1660 3430,3360 + 25,9

Механическая смесь 1:1 73-74 1680 3400 + 26

2.3. Холестериноксидаза - индикатор стабильности водноорганических растворов холестерина. Растворы холестерина, приготовленные на основе 25 мМ ТЭА-буфера рН 8,0 и содержащие 10%-ный пропанол, стабильны в течение 24 ч с момента приготовления: полные кинетические кривые со свежеприготовленными и «состарившимися» растворами субстрата полностью совпадали между собой. Эти же растворы при рН 6,0 были стабильны только в течение лишь первого часа после приготовления и заметно меняли свои субстратные свойства через сутки (рис.2.5А).

Время, мин. К

Рис. 2.5. Кинетические кривые окисления холестерина холестериноксидазой (А) и спектры поглощения продукта реакции Д4-холестенон-3-она без учета

светорассеяния (Б), полученные при использовании свежеприготовленного раствора субстрата (I), раствора субстрата, приготовленного зп 24 часа до эксперимента (II), и раствора субстрата, приготовленного за 24 часа до эксперимента и обработанного ультразвуком в течение 30 с (III). Растворы холестерина были приготовлены на основе 25 мМ ТЭА-буфера, рН 6,0 и содержали 10% пропанола.

Как следует из представленных на этом рисунке данных, конечные значения оптических плотностей растворов при 240 нм после проведения реакций со свежеприготовленным (0,17 опт. ед., кривая 1) и «состарившимся» за 24 ч (0,055 опт. ед., кривая II) растворами субстрата различались примерно в 3 раза. Это соотношение несколько уменьшалось, если перед началом эксперимента состарившийся раствор субстрата обрабатывали ультразвуком (0,11 опт.ед., кривая III). «Озвучивание» же свежеприготовленного раствора холестерина не влияло на величину конечной оптической плотности раствора после завершения реакции.

На рис. 2.5Б приведены спектры поглощения растворов без учета светорассеяния после проведения названных реакций. Из рисунка видно, что за исключением соответствующих изменений в интенсивности поглощения при 240 нм форма спектра оставалась неизменной. Поскольку Н202 характеризуется низким значением коэффициента молярной экстинкции (Лшко = 230 нм, е = 72,7 М"1см '1), поглощение в этой области спектра определяется исключительно молекулами Д4-холестен-3-она. Количество образовавшейся Н2О2 во всех трех опытах было одинаковым.

Каталитические свойства холсстериноксидазы в зависимости от «возраста» водноорганических растворов холестерина. Несмотря на большое различие в величинах конечной оптической плотности растворов при 240 нм (т.е. после завершения реакции), степень конверсии холестерина в исследуемых растворах была одинакова и составила 100%. На этом основании был сделан вывод, что спектрофотометрические свойства продукта реакции д4-холестен-3-она не постоянны и также меняются в зависимости от возраста растворов холестерина. Линеаризация полных кинетических кривых, представленных на рис.2,5А, с использованием рассчетных значений

эффективного коэффициента молярной экстинкции Д4-холестен-3-она в координатах Уолкера-Шмтидта (рис.2.6) позволила выявить влияние процессов «старения» растворов холестерина на кинетические параметры реакции его окисления под действием ХО.

Рис, 2.6. Полные кинетические кривые реакции окисления холестерина ХО (А), полученные при использовании свежеприготовленного раствора субстрата (I), раствора субстрата, приготовленного за 24 ч до эксперимента (II), и раствора субстрата, приготовленного за 24 ч до эксперимента и обработанного ультразвуком в течение 30 с (III) в координатах {Продукт; Время} и их линейные анаморфозы (Б). Растворы холестерина были приготовлены на основе 25 мМ ТЭА.буфера, рН 6,0, содержащего 10% пропанола.

Эти результаты представлены в таблице 2.3, из данных которой видно, что в исследованных условиях в результате «старения» раствора субстрата максимальная скорость реакции и константа Михаэлиса ХО для холестерина уменьшаются, а обработка «состарившихся» растворов холестерина ультразвуком [%[Р] ~ приводит к их увеличению.

Изучение рН-зависимости каталитических свойств ХО показало, что в исследованном диапазоне рН (6,0-8,0) максимальная скорость реакции и константа Михаэлиса ХО для холестерина существенно не менялись и фермент характеризовался широким рН-оптимумом действия с максимумом активности при рН 7,0.

2.4. Холестериноксидаза - индикатор структурной организации ассоциатов холестерина. Процесс старения растворов холестерина в водноорганических средах, используемых в качестве растворов субстрата, наглядно проявляется при сравнении полных кинетических кривых реакций окисления свежеприготовленных и «состарившихся» растворов стерина (рис. 2.6).

Таблица 2.3. Зависимость максимальной скорости реакции V, константы Михаэлиса Км ХО для холестерина и коэффициента молярной экстинции Д4-холестен-3-она от времени хранения растворов холестерина

Рассчетные параметры Свежеприготовленный раствор холестерина Раствор холестерина, приготовленный за 24ч до эксперимента Раствор холестерина, приготовленный за 24 ч до эксперимента и обработанный ультразвуком

Км, мкМ 16,5 4,0 9,1

V, Ю^Мс"1 8,9 2,2 5,1

£, М"1СМИ 16700 5300 10800

За процессом старения растворов холестерина следили в течение суток. Выбор этого срока определялся двумя причинами. Во-первых, интервал времени в 24 часа являлся достаточным для характеристики сравнительной устойчивости растворов стерина. Во-вторых, при более длительном хранении концентрация холестерина в растворе может заметно уменьшаться за счет его аутоокисления растворенным кислородом .

Наиболее правильное, на наш взгляд, объяснение наблюдаемого уменьшения конечных значений оптических плотностей при ферментативном окислении «состарившихся» растворов холестерина можно дать, если учесть способность молекул холестерина и д4-холестен-3-она образовывать в водных растворах агрегаты и изменения, происходящие с ними при старении.

Агрегаты холестерина в водных растворах, традиционно рассматриваемые как мицеллы, сформированы стыковкой плоскостей кольцевых систем молекул, имеют стержневидную (rod-like) форму, характеризуются длиной порядка 1000 А и фактически представляют собой микрокристаллы [Renshaw et al„ 1983]. Однако, процесс установления равновесия является медленным и в зависимости от концентрации холестерина может длиться от нескольких суток до нескольких недель.

Основываясь на этих данных, можно ожидать, что в свежеприготовленных водноспиртовых растворах холестерина, используемых в эксперименте в концентрации -10 мкМ, происходят аналогичные процессы. После смешивания спиртового раствора холестерина с водным буферным раствором первоначально, по-видимому, образуются квазиравновесные ассоциаты молекул стерина разной степени дисперсности. Со временем за счет растворения мелких происходит рост крупных по размеру ассоциатов, являющихся центрами кристаллизации.

Строение кристаллогидратов холестерина позволяет предположить равную доступность всех молекул для взаимодействия с ферментом. Действительно, во всех опытах регистрировалось одинаковое количество перекиси водорода - второго продукта реакции, соответствующее полному превращению холестерина в Д4-холестен-3-он. Это означает, что в условиях проведения экспериментов степень конверсии холестерина в продукт не зависило от степени его агрегации. Поскольку растворимость и критическая концентрация мицелообразования этих стероидов в воде характеризуются величинами одного порядка [Bruckdorfer & Sherry 1984], а скорость процесса формирования и перестройки их надмолекулярных структур несоизмеримо мала по сравнению со скоростью ферментативной реакции, можно ожидать, что структура ассоциатов холестерина и Д4-холестен-3-она до и сразу же после реакции будут идентичны. Другими словами, образование холестенона происходит в рамках уже сложившейся на момент реакции структуры ассоциатов холестерина.

Разная степень агрегации хромофоров, т. е. молекул Д4-холесген-3-она, в зависимости от возраста суспензий являлось, с одной стороны, основной причиной, обусловливающей разную оптическую плотность растворов, а, с другой стороны, позволяла судить о процессах, происходящих с водноорганическими растворами холестерина при старении. Действительно, характерной особенностью абсорбционной спектрофотометрии суспензий, содержащих агрегаты поглощающего вещества, является уменьшение кажущейся оптической плотности по сравнению со случаем его равномерного распределения [Белл 1965]. Другими словами, нарушение равномеркого распределения пигмента приводит к уменьшению его коэффициента молярной эксгинкции, причем чем крупнее агрегаты, тем «прозрачнее» суспензия. Таким образом, суспензия всегда меньше поглощает, чем раствор, и чем крупнее частицы, тем суспензия прозрачнее. В свою очередь, фермент ХО является своего рода «проявителем», благодаря которому удается обнаружить разную степень агрегации молекул холестерина в водноорганических растворах. В этом случае становится также очевидным, что причиной изменения интенсивности поглощения растворов д4-холестен-

3-она во времени, аналогично тому, как это показано на рис.2.6, является общность процессов, лежащих в основе старения суспензий холестерина и д4-холесген-3-она.

Таким образом, соотношение водной и органической компонент среды, природа органического растворителя и соли буфера, рН и «возраст» растворов холестерина оказывают влияние не только на кинетические параметры исследуемой реакции, но и на спектрофотометрические характеристики Д4-холестен-3-она - продукта згой реакции. Однако, многобразие значений коэффициента молярной зкстинкциии Д4-холестен-3-она, известное из литературы (от 5300 до 18000 М"1см"1), не может быть объяснено только с точки зрения различной степени агрегации молекул стерина или строения этих ассоциатов в растворах. Другой причиной, приводящей к снижению величины коэффициента молярной зкстинкции Д4-холестен-3-она, является рассеянный белый свет (stray light) в спектрофотометре [Bladon 1958]. Эта приборная ошибка существенно увеличивается при фотометрировании реакции (образца) на фоне раствора с изначально высокой оптической плотностью. Например, в растворах, содержащих также сильно поглощающие в ультрафиолетовой области спектра ПАВ как тритон Х-100, используемые для солюбилизации стерина, коэффициент молярной экстинкцпи д4-холестен-3-она характеризуется заниженной величиной и составляет 12 000 М^см'1. В присутствии же «прозрачных» ПАВ или в их отсутствие величина этого коэффициента возрастает как минимум на 25%(1).

Представленные данные указывают на необходимость корректировки значения коэффициента молярной зкстинкции Д4-холестен-3-она даже при незначительных, на первый взгляд, изменениях в методике проведения экспериментов (например, изменение порядка смешения реагентов при приготовлении растворов субстрата, рис.2.1). В противном случае не учитываемая возможность изменения этой величины может явиться источником ошибок в определений кинетических параметров данной реакции или, аналитических исследованиях. Так, например, с этих позиций можно объяснить, отмеченное в работе [Abe et al„ 1983], несовпадение величин удельной активности ХО при разных способах регистрации реакции.

С точки зрения использования ХО для аналитических целей представляется интересным сравнить кинетические параметры этой реакции при разных способах ее проведения: в присутствии ПАВ и описанным выше способом. Анализ этих данных показывает, что- при проведении реакций в оптимальных для обоих случаев условиях фермент характеризуется одинаковой способностью окислять холестерин (равенство максимальных скоростей реакций). В то же время наличие в реакционной среде ПАВ оказывает существенное влияние на сродство фермента к субстрату, ухудшая величину константы Михаэлиса ХО по холестерину на несколько порядков (при 6% концентрации тритона Х-100 Км = 2,4 мМ [Родионов и др. 1988]). Это обстоятельство в зависимости от свойств анализируемого объекта может сыграть определяющую роль в выборе того или иного способа проведения реакции. Тем не менее, для решения рутинных задач клинической диагностики широкое использование рассмотренного способа проведения реакции без каких-либо усовершенствований, на наш взгляд, является не целесообразным. Однако, в плане качественной, а может быть даже и количественной дигностики «статуса» клеточных мембран при той или иной патологии, рассмотренный подход проведения реакции окисления холестерина ХО, и главное -предлолженная методология интерпретации результатов, могут оказаться единственно приемлемыми. Так, результаты последних исследований показывают, что холестерин является не только инертным строительным компонентом клеточных мембран, но и формирует многие функции клеточных рецепторов [Gimpl et al.,1997; Pang et al„ 1999; Scanlon et al.,2001] и оказывает влияние на активность ряда мембран-связанных

ферментов [Lui & Chong 1999]. В литературе уже появились первые публикации, указывающие на возможность использования ХО как индикатора состояния клеточной мембраны [Ahn & Sampson 2004; Wang et al., 2004].

Глава 3. Алкогольоксидаза: поиск штамма-продуцента, наращивание, выделение и характеристика препаратов фермента

Для выбора микроорганизмов в качестве продуцента АО изучали 16 штаммов мезофильных дрожжей, использующих метанол в качестве источника энергии и углерода. На основании таких критериев как скорость роста, накопление биомассы, удельная активность и стабильность фермента был отобран штамм-продуцент АО Candida boidinii 4g. Разработана оригинальная методика очистки фермента, позволяющая получать препарат АО без примеси каталазы (см. табл. 3.1).

Таблица 3.1. Очистка АО сочетанием ионообменной хроматографии и хроматографии на микрокристаллической целлюлозе в присутствии сульфата аммония.

Общее Общая Степень Активность Общая

Стадия очистки количество активность очистки АО в % от активность

белка, мг фермента исходной каталазы

Гомогенат 2400 817 1 100 14500000

Хроматография на ДЕАЕ-целлюлозе 265 549 6,1 67 22000

Хроматография на микрокристаллической целлюлозе в присутствии (NHibSO* 72 478 19,4 58 0

Молекулярная масса АО, определённая гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-200, составила 630 кДа (рис.3.1). Эта величина близка по своему значению к молекулярной массе АО из других источников. Согласно результатам скоростного ультрацентрифугирования АО характеризовалась коэффициентом седиментации 19.7S.

По данным электрофореза в ПААГе в присутствии SDS и меркаптоэтанола наблюдалась одна полоса, соответствующая молекулярной массе 75 кДа (рис. 3.2).

На основании этих результатов было сделано заключение, что фермент АО из Candida boidinii 4g по всей видимости состоит из 8 идентичных субъединиц, соединенных S-S связями. Этот вывод был сделан на том основании, что при денатурации белка в присутстии SDS, но без обработки меркаптоэтанолом, по данным электрофореза образование субъединичных структур не наблюдалось.

АО из Candida boidinii 4g проявляла способность окислять различные первичные спирты. Однако, субстратная специфичность фермента резко уменьшалась с увеличением длины углеродного скелета субстрата. Так, значения константы Михаэлиса (Км) для метанола, этанола, бутанола и изопропанола составили 0,22,2,0 80,0 и 400 мМ, соотвественно. Значение Км изучаемого фермента для кислорода, определенное при насыщающих концентрациях этанола, составило 0,2 мМ.

Результаты изучения рН-зависимости скорости ферментативной реакции, катализируемой АО, снятые для метилового и этилового спиртов, представлены на рис. 3.3, из которого следует, что фермент харатеризуется широким рН-оптимумом в области рН 7,0 - 9,0. При окислении этанола с увеличением рН скорость реакции уменьшалась

существенно быстрее, чем при окислении метанола. Активность фермента практически не зависила от молярности реакционных буферных растворов в диапазоне 0,05 - 0,5 М.

Рис. 3.1. Определение молекулярной массы АО из Candida boidinii 4g с помощью гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-200.1 - АО; 2 - ферритан (440 кДа); 3 -катапаза (230 кДа); ГО (160 кДа); 5 - БСА (67 кДа).

Рис. 3.2. Определение молекулярной массы субъединиц АО из Candida boidinii 4g элеактрофорезом в ПААГе в присутствии SDS. 1,2 и 6 - субъединицы РНК-полимеразы с мол массой. 165,155 и 39 кДа, соответственно; 3 - ГО (80 кДа); 4 -АО; 5 - ВСА (67 кДа); 7 - ингибитор трипсина (21,5 кДа).

Наибольшя стабильность АО достигалась при pH 8,0 в бескислородной среде или при хранении препаратов фермента под аргоном, а также в присутствии ЭДТА или высоких концентраций сульфата аммония (примерно 80% от насыщения). Добавление в раствор SH-содержащих компонентов, таких как меркаптоэтанол или дитиотрейтол несколько защищали фермент от инактивации, что указывает на существенную роль серосодержащих групп в катализа, окисление которых приводит к инактивации фермента.

Рис. 3.3. pH-зависимость скорости реакции окисления метанола (1) и этанола (2), катализируемой АО.

Рис. 3.4. Зависимость скорости реакции окисления метанола (1) и этанола (2) АО от концентрации субстрата в двойных обратных координатах.

мп 1/га.тм-1

Глава 4. Разработка аналитических методов, устройств и приборов для определения субстратов оксидоредуктаз

Использование одинаковых схем регистрации реакций, катализируемых ферментами одного класса, позволяет использовать одинаковые конструкции ферментных электродов или других аналитических устройств для определения самых разнообразных биологически-активных соединений. Разработка методов иммобилизации ферментов с целью получения стабильного гетерогенного катализатора для подобного рода анализаторов является актуальной научно-технической задачей.

4.1. Критерии подбора носителей для иммобилизации ферментов. Матрицы-носители для иммобилизованных ферментов должны удовлетворять целому ряду требований, среди которых выделим основные: ёмкость, механическую прочность, резистентность к микробному заражению и возможность формирования определенных геометрических форм носителя, оптимальных для конкретного вида анализатора.

Среди большого разнообразия матриц-носителей, используемых для иммобилизации ферментов (латексы, гели, и т.д.), указанным критериям, на наш взгляд,

log мол. вес 6.0

20 40 60 ВО

Номер фракций

log Мол. вес

0 2 4 6 8CM

наиболее полно отвечают макропористые стекла (кремнеземы), имеющиеся в широком ассортименте и выпускаемые отечественной промышленностью под торговой маркой «Силохром». Этот носитель механически прочен, инертен и для обеспечения ковалентной сшивки белка с матрицей его поверхность может быть легко химически модифицирована. Кроме того, за счет пористости силохром обеспечивает большую поверхность носителя для связывания с ферментом и им можно легко наполнить полость реакционной ячейки любой геометрической формы. Основная задача, которую необходимо решить перед использованием той или иной марки силохрома заключается в выборе оптимальной удельной поверхности и пористости. Последняя в зависимости от целей использования катализатора может играть существенную роль, определяя не только уровень удельной активности получаемого гетерогенного катализатора, но и его стабильность. В диссертации дано теоретическое обоснование и приведены результаты экспериментальных исследований по данному вопросу, которые в кратком виде можно представить следующим образом:

Математическое описание химических процессов на пористом зерне катализатора учитывает такие параметры как размер частиц, размер пор, козфициент диффузии ■ реагентов и скорости реакции. Оказалось, что распределение концентрации реагента в порах оказывает решающее влияние на скорость процесса. Это распределение может быть охарактеризовано с помощью модуля Тиле (h), основной физический смысл которого заключается в выявлении соотношения скорости реакции к скорости диффузии. Другой важнейшей характеристикой является коэффициент эффективности или степень использования внутренней поверхности катализатора п- Этот параметр определяется из соотношения наблюдаемой скорости процесса к скорости реакции в отсутствии диффузионных затруднений. Для кинетической области (значениях h<0,5) степень использования близка к 1 (т.е. используется вся внутренняя поверхность), во внутридиффузионной области (h>2,5) соотношение между модулем Тиле и коэффциентом использования определяется выражением /)= 11 h.

В работе использовали каталазу из Candida boidinii 4g, выделенную как и АО по разработанной методике. Для иммобилизации фермента, проводимой с помощью глутарового диальдегида, использовали три вида кремнеземов, существенно отличавшихся по своим параметрам (см. табл.4.1).

При связывании менее 0,02 мг каталазы на 1г любого из носителей, используемых в работе, иммобилизация не приводила к изменению активности. При увеличении концентрации - наблюдалось значительное снижение эффективности действия иммобилизованного фермента.

[ а у S \ В

Рис. 4.1. Зависимость акгив-

ЬО ности иммобилизованной каталазы (1) и коэффициента

ц ц эффективности (2) ' от активности растворимого фермента при иммобилизации

0,6

О,В на разных кремнезёмах: а - С26; 6 - С80; в - CPG.

0,4

При концентрации

' ■ 1 ^ ' ' ' ' ■ гт~т-о-1 I I I ту 1 1Z 20 Ц 12 20 28 1 12 24 а¿/л/шь'С"1,

каталазы выше 1 мг на 1 г носителя коэффициент эффективности п не превышал 0,05 (рис. 4.1) и характер зависимости его

значений от концентрации фермента на матрице был одинаков для всех трех кремнеземов. Представленные результаты означали, что начиная с определенной концентрации иммобилизованного фермента, скорость реакции определялась исключительно скоростью диффузионных процессов.

В тоже время нельзя исключить из рассмотрения ситуацию, когда наблюдаемая активность фермента в порах сопоставима по величине с активностью фермента на внешней поверхности частиц. В этом случае наблюдаемую скорость реакции (Ун) можно представить как сумму скоростей реакций, катализируемых ферментом, связанных с внешней поверхностью (Ун(') и с поверхностью пор 0/нр>). Математическое описание этого процесса может быть представлено следующим выражением:

„ _ „ т , 3 л/А УППР Уог (4.1)

где: г - радиус пор носителя, О - коэффициент диффузии субстрата, Я - размер частиц, А - активность фермента в порах в отсутствии диффузионных затруднений и данной концентрации субстрата [Э], а - единица поверхности пор носителя.

На рис. 4.2 приведены графики зависимости наблюдаемой активности каталазы, иммобилизованной на различных кремнезёмах, от активности растворимого фермента в координатах \/н от 42. На представленных графиках можно выделить два участка. При малых количествах фермента на носителе наблюдался быстрый рост \/ц.

Скорее всего, величина измеряемой активности в данном случае в значительной мере была обусловлена ферментом, расположенном на внешней поверхности носителя. При значениях 4а> 0,5x102 наблюдаемый прирост Ун не столь велик и носил линейный характер. Величина тангенса угла наклона этой прямой зависила от скорости диффузионных процессов в порах кремнезёма, что позволила провести оценку эффективности параметров носителей в зависимости от их характеристик.

Рис. 4.2 Зависимость наблюдаемой активности каталазы, иммобилизованной на различных кремнезёмах, от активности растворимого фермента в координатах \/н от Рис. 4.3 Инактивация каталазы, иммобилизованной на силохроме С80, в реакторе вследствие проведения циклических процессов разложения перекиси водорода. Количество связанного фермента с носителем: кривая 1 -3,00 и кривая 2 - 0,01 мг белка/г носителя.

С этой целью был введен параметр

не зависящий от свойств субстрата и фермента. Величина этого параметра с учетом выражения (4.1) может быть рассчитана из следующего соотношения,

И0=

где (да - тангенс угла наклона линейной части фафика зависимости Ун от т/7.

Таблица 4.1 Характристики носителей и значения величины Ио рассчитанные теоретически и из

экспериментальных данных

Носитель Ьо эксперим. И» теореттич. Диаметр пор, А Удельная поверхность, м2/г носителя

Силохром С 26 0,17 0,005 500-700 26

Силохром С 80 0,31 0,006 2200-2700 80

СРв 0,43 0,009 1400 17,5

В таблице 4.1. приведены величины И0, рассчитанные как теоретически, исходя из параметров носителей, так и на основании экспериментальных исследований. Из данных таблицы следует, что во всех трех случаях экспериментально определяемые значения Гь были приблизательно в 30 - 40 раз выше рассчитанных теоретически. Это означает, что процесс диффузионного торможения реакции в действительности оказывает на величину наблюдаемой активности катализатора существенно большее влияние, чем можно было ожидать на основании характеристик, использованных в работе кремнеземов.

Результаты изучения изменения активности иммобилизованной каталазы в процессе проведения реакции разложения перекиси водорода представлены на рис. 4.3. При использовании в реакторе препаратов, содержащих 0,01 мг каталазы на 1 г носителя, после каждого 10-минутного цикла, начинавшегося добавлением 0,1М субстрата, наблюдалось снижение активности на 10 -15%. Препараты, содержащие 3 мг каталазы на 1 г носителя, сохраняли исходную активность даже после проведения по меньшей мере 50 циклов реакции.

Таким образом, можно заключить, что в плане предварительной оценки возможности использования для иммобилизации ферментов тех или иных силохромов с целью их дальнейшего применения в аналитических устройствах необходимо пытаться иммобилизовать на 1 г носителя такое количество фермента, чтобы эффективность его работы определялась исключительно диффузионными процессами. Как следует из представленных данных, в диапазоне исследованных параметров силохромов, величина их пористости и удельной поверхности принципиального значения не имели. Кроме того, для создания оптимальных условий функционирования анализатора на основе иммобилизованных ферментов предлагается конструктивно отделить измерительный электрод от фермента. Это позволит, с одной стороны, легко котролировать и ухаживать за регистрирующей частью анализатора и создать конструкцию реакционной ячейки, вмещающей оптимальное и необходимое для анализа, количество гетерогенного катализатора.

4.2 Анализаторы на основе иммобилизованных ферментов для определения субстратов окседоредуктаз. Нами были разработаны две конструкции анализаторов. Одна предназначалась для анализа дискретных проб, другая - для измерения в протоке. Устройство первого типа предполагалось использовать, в первую очередь, для нужд клинической диагностики. Устройства второго типа было ориентировано для проведения анализа преимущественно в замкнутых системах, например, ферментёрах, винодельческих ёмкостях и т.п. Широкое применение устройства второго типа могли найти и в медицине для решения специальных задач, например, при создании системы «Искусственная поджелудочная железа», основным элементом конструкции которой

является проточный анализатор глюкозы. Эта установка позволяет автоматически поддерживать необходимый уровень глюкозы, вводя в кровь пациенту при необходимости дозированное количество глюкозы или инсулина.

Рис. 4.4. Реакционная ячейка ферментного анализатора дискретах проб. 1 кислородный электрод; 2 - канал для ввода анализируемой пробы; 3 - верхний корпус ячейки; 4 - магнитная мешалка; 5 - пористая мембрана из инертного материала; 6 -соединительное кольцо; 7 иммобилизованный на силохроме препарат фермента; 8 - нижний корпус ячейки; 9 -реакционный объем.

Конструкция реакционной ячейки для анализатора первого типа представлена на рис 4.4. Как видно из схемы реакционной ячейки электрохимический датчик (в данном случае кислородный электрод) и препарат иммобилизованного фермента конструктивно отделены друг от друга. Размер ячейки выбран таким образом, чтобы разместить тонким слоем под нейлоновой сеткой максимально возможное количество иммобилизованного на силохроме фермента. Такая конструкция позволяет создать оптимальные условия для эксплуатации и профилактических работ как датчика (например, смена мембраны), так и катализатора (например, дополнительная промывка или хранение в специальных условиях). На базе этого устройства был сконструирован прототип промышленного анализатора (рис. 4.5).

Рис. 4 5. Фотография прототипа промышленного анализатора субстратов оксидоредуктаз на основе иммобилизованых ферментов.

Схема проточного анализатора и общий вид аналитической части системы «Искусственная

поджелудочная железа»

представлены на рис. 4.6 и рис. 4.7. Как следует из схемы работы анализатора (рис.4.6), устройство имеет два независимых контура циркуляции растворов А и Б, работа каждого из которых обечивается, соответственно, двумя перистальтическим насосами (поз.4). Важнейшим элементом конструкции является диализатор (поз. 3), в котором растворы двух контуров имеют возможность не смешиваясь «пообщаться» друг с другом через диализную мембрану. В результате этого «диалога» в контур В проникают низкомолекулярные соединения из контура А, в количестве прямо пропорциональном времени контакта растворов (зависит от скорости их протекания) и площади мембраны Таким образом, проба, введенная через устройство (поз.2) в русло раствора контура А, обогащает буферный раствор контура В анализируемым субстратом, который после прохождения через колонку с иммобилизованным ферментом (поз.5) обеспечивает

аналитический сигнал. Электрохимический датчик (поз.6) в разных вариантах был предназначен для регистрации концентрации кислорода или перекиси водорода.

Рис. 4.6. Схема разработанного проточного анализатора субстратов оксццоредукгаз (описание в

тексте).

Разработанная нами

установка была использована для непрерывного анализа концентраций глюкозы и этанола, при использовании иммобилизованной на силохроме ГО либо АО, соответственно.

Рис. 4.7. Фотография проточного анализатора. Устройство смонтировано на передвижной тележке, и расположено на трех уровнях. Внизу находятся две емкости для растворов: одна - для рабочего буферного раствора, другая - для слива жидкости; в средней части расположены два перистальтических насоса, регистрирующее устройство, диализатор и колонка с иммобилизованным ферментом и датчиком; вверху находятся блок управления (слева) и печатающее устройство.

4.3. Универсальный ферментный электрод для определения субстратов НАД-зависимых дегидрогеназ. Создание ферментных электродов на основе не только традиционно используемых оксидаз, но и НАД-зависмых дегидрогеназ позволит существенно расширить номенклатуру анализируемых соединений. Однако, в этом случае, необходимо найти решение двух непростых потенциальных проблем: удержание кофактора в приэлекгродной зоне и его регенерация.

Вышеуказанные проблемы наиболее эффективно, на наш взгляд, можно решить использованием I) полимерных форм субстратов и П) методом ферментативной регенерацией кофактора. В этом случае общая схема реакций, описывающая принцип действия универсального ферментного электрода для определения субстратов НАД-зависимых дегидрогеназ, может быть представлена следующим образом:

э [ моЧп ♦ Е1 * ♦

р делонь

е2

[А]„-Яес1 ♦ *

[А]„-Ох

Электрод

(4.2)

где: Е, - НАД-зависимая дегидрогеназа, специфичная по отношению к определяемому субстрату в; Е2 - НАДН-дегидрогеназа; Р - продукт реакции; [МАО*1„ - полимерная форма кофактора, [А]„-(?ес1/Ох - полимерная форма искусственного акцептора электронов в восстановленной или окисленной формах, соответственно.

Нами была исследована возможность использования поливиологенов как наиболее приемлемых высокомолекулярных субстратов НАДН-дегидрогеназы Синтез различных производных поливиологена проводили реакцией эквимолярных количеств 4,4'-дипиридилла с производными ксилилендихлорида (или бромида) в ацетонитриле. Полученные полимеры перед использованием в качестве субстратов НАДН-дегидрогеназы диализовали против буфера (0,1 М ТЭА-ЫаОН, рН 8,3) в течение 2 суток. Их свойства представлены в таблице 4.2.

При проведении вольт-амперометрических измерений в случае поливиологена I наблюдались две характерные для виологенов волны восстановления. Величины потенциалов, соответствующие полуволнам восстановления, составили -0,35 и -0,7 В (рис.4.8) относительно насыщенного каломельного электрода.

При проведении синтеза других полимеров предполагалось, что введение электронакцепгорных групп в бензольное кольцо должно привести к повышению окислительно-восстановительного потенциала полимера и, что весьма вероятно,

Таблица. 4.2. Субстратные и электрохимические свойства синтезированных поливиологенов

Структурная формула полимера

Активность

о ГО

"С NADH-

АГ

Электрохимическая активность

"ОО-

Вт- Вг

СН.")

m CI

(~сн, J

Вт- Br* j.

Г^о-о-

IV. CI

(-СН^ I а

Л W'OO"

а- а-

Активен ^=»—0,7 В

Но активен

Не активен

при прочих равных условиях, к улучшению кинетических параметров ферментативных реакций с их участием. Однако, введение в качестве акцепторных групп галогенов в бензольное кольцо привело к резкому уменьшению растворимости восстановленных форм полимеров. При исследовании их электрохимических свойств токи восстановления были незначительны и сравнимы с фоновыми. Возможно, что одной из причин низкой электрохимической активности поливиологенов II, III и IV явилась сравнительно низкая растворимость их восстановленных форм.

Восстановление любого из синтезированных поливиологенов легко регистрировалось спектрофотометрически или визуально по ярко-синей окраске

(появление дополнительной полосы поглощения в области от 500 до 600 нм). На рис. 4.9 приведены результаты исследования кинетических параметров окисления НАДН в присутствии НАДН-дегидрогеназы и поливиологена I, метилвиологена и бензилвиологена. Величины К« для бензилвиологена и метилвиологена в пределах ошибки совпадали 65±5 мкМ, а для поливиологена I эта величина составила 22+4 мкМ. Максимальные скорости реакций (в условных единицах) составляли: для метилвиологена -1; для бензилвиологена - 1,4 и для поливиологена -1,6. Таким образом, последний оказался несколько лучшим субстратом, чем мономерные виологены.

Водорастворимую полимерную форму НАД получали иммобилизацией НАД+-Ы6-(Ы-(б-аминогексил)-ацетамида) на декстране с мол. массой 15-20 кДа с помощью цианурхлорида. Полимер содержал 190 мкмолей НАД* на 1 г носителя. Сохранение коферментативной активности в реакциях с алкогольдегидрогеназой и НАДН-дегидрогеназой составило 55 и 35%, соответственно, от величины, измеренной при использовании немодифицированного кофактора.

Л "А Дм* г/в, л сл.ев.

Рис. 4.8. Стационарная поляризационная кривая (1) электровосстановления поливиологена I на вращающемся дисковом электроде из пирографита (600 об/мин; концентрация поливиолгена 100 мкМ, 0,1 М ТЭА-NaOH буферный раствор pH 8,5) и фоновые токи (кривая 2).

Рис. 4.9. Зависимости скорости окисления НАДН в присутствии НАДН-дегидрогеназы от концентрации метилвиологена (1), бензилвиологена (2) и поливиологена (3) в двойных обратных координатах.

НАДН-дегидрогеназу выделяли стандартными методами очистки из бактерий Bacillus brevis. Фермент характеризовался удельной активностью 7-10IU в реакции с 2,6-дихлорфенолиндофенолом. За 17 суток сохранялось до 90% исходной активности (К-фосфатный буферный раствор, 0.05М, pH 7,5,20-22°С).

Важно подчеркнуть, что восстановленные как моно-, так и поливиологены легко окисляются кислородом, что сделало возможным следить за процессами по схеме (4.2), измеряя содержание кислорода в замкнутой герметичной ячейке. Конструкции разработанных ферментных электродов для определения концентраций лактата и этанола (Е1 - лактагг- и алкогольдегидрогеназа, соответственно) не отличались от общепринятой. В качестве индикаторного использовали рОг-электрод.

4.4. Универсальное индикаторное устройство для определения концентраций субстратов ферментативных реакций - тест-капсулы. Ежегодная потребность в тест-полосках на глюкозу в Российской Федерации исчисляется десятками миллионов. Композиционный состав такого типа индикаторных полоск известен. Основная проблема z массового производства - высокая технология их изготовления. Дело в том, что реакционная область таких полосок состоит из слоев желатины с реагентами, микронной толщины, нанесенных друг на друга как коржи слоеного торта.

Рис. 4.10. Схематическое изображение частей капсулы А или Б (1), закрывающихся плотно крышкой (2) и наполненных застывшим желатиновым студнем.

Вот почему патенты (GB 2052057А; GB 20851596А; GB 2104215А и др.) на тест-полоски принадлежат таким фирмам как Kodac или Fuji - мировым лидерам производства фотографических пленок, технология изготовления которых основана на аналогичном принципе. Нами предложено принципиально новое по своей конструкции индикаторное устройство, которое выполняет все те же функции, что и тест-полоска, но отличается необыкновенной простотой своего технического воплощения.

Устройство выполнено в виде капсулы, состоящей из двух половинок (см. рис. 4.10), размеры которых не превышают 1,5 см в длину и 0,8 см в диаметре. Обе половинки снабжены резиновыми крышками. Одну половинку капсулы заполняют 10% раствором расплавленной желатины (45°С) с необходимыми реагентами (обозначим ее буквой А) , другую (В) - только раствором желатины, Капсулы закрывают плотно крышками и растворам дают застыть. Устройство готово к эксплуатации.

Рис. 4.11. Фотография опытных образцов капсул для определения этанола или глюкозы. Капсулы были изготовлены из стекляных трубок диаметром 8 мм и соединялись между собой резиновым кольцом.

Определение концентрации с помощью данного устройства проводят следующим образом: на гладкую поверхность застывшей желатины (часть капсулы В) наносят несколько капель анализируемого раствора. За фиксированное время (например, 1мин.) низкомолекулярные компоненты пробы продиффундируют в гель желатины в количестве прямо пропорциональном своей концентрации (и площади поверности, определённой размером капсулы). Через указанный интервал времени анализируемую пробу удаляют (например, ватным тампоном, смывают или встряхивают), часть В соединяют с другой половиной капсулы А и закрытую герметичную капсулу помещают на 10 минут в термостат (50°С). В результате желатиновые слои обеих частей капсул расплавляются, смешиваются и продиффундировавший субстрат инициирует каскад ферментативных реакций с

образованием окрашенного продукта. Интенсивность развившейся окраски будет прямо пропорциональна концентрации анализируемого соедиения.

Такие капсулы нами были разработаны для определения концентрации глюкозы и этанола. Единственным отличием состава указанных капсул была соответствующая замена фермента ГО на фермент АО.

УГЛЕВОДНЫЙ ОБМЕН: МЕХАНИЗМЫ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ

Глава 5. Молекулярные механизмы развития диабетических осложнений 5.1. Введение

Анализ данных литературы позволяет выделить три наиболее обсуждаемые гапотезы развития диабетических осложнений, основанных на i) повреждающем действии свободных радикалов, II) изменении функциональных свойств белковых структур вследствие их гликозилирования и Ш) т.н. полиоловом путе метаболизма глюкозы. В тоже время, ряд исследователей [Ефимов 1989] склонны рассматривать диабетические ангиопатии не как осложнения, а как формы проявления основного заболевания. Основная причина разносторонних представлений по данному вопросу обусловлена, с одной стороны, разнообразием форм проявлений осложнений СД, а с другой стороны - отсутствием на сегодняшний день единой теории, объясняющей природу и разнообразие рассматриваемых патологий.

Полиоловый путь метаболизма глюкозы рассматривается на сегодняшний день как одна из возможных и наиболее вероятных причин, приводящих к развитию диабетических осложнений. На первом этапе под действием гипергликемии активируется альдозоредукгаза - фермент, восстанавливающий альдегидную группу глюкозы. В результате происходит образование и накопление в клетках продукта этой реакции - сорбита (сорбитола). Цитоплазматическая мембрана почти непрониаема для этого осмотически-активного соединения и его концентрация может существенно возрастать (до 500%). Увеличение внутриклеточного содержания сорбита в клетках хрусталика проявляется в их осмотическом повреждении и развитию катаракты. Эти же процессы в эритроцитах приводят к изменению пластичности мембран. Осмотическое набухание эндотелиоцитоэ - клеток, выстилающих сплошным слоем полость сердца, кровеносных и лимфатических сосудов, приводит к сужению просвета капилляров.

Однако, прямая экстраполяция «осмотической гипотезы» на клетки нервной или почечной ткани выглядит несколько проблематичной, поскольку при СД увеличение концентрации сорбита в этих тканях происходит в гораздо меньшей степени, чем в эритроцитах или клетках хрусталика [Greene et al„ 1987]. В тоже время, ингибирование альдозоредуктазы приводит к обратному развитию не только диабетической катаракты [Kinoshita et а!., 1981], но и нейропатии [Handelsman et al., 1981], а также уменьшению толщины капилляров кожи и почечных клубочков. Следовательно, одновременно с накоплением сорбита протекают другие процессы, специфичные для гипергликемии...

Было установлено, что при длительной гипергликемии параллельно процессу образования в клетках одного сахароспирта - сорбита происходит уменьшение концентрации другого сахароспирта - изомерной формы инозита (инозитола), получившей название мио-инозит. Истощение запасов мио-инозита приводит, к примеру, к снижению активности №+,К*-АТРазы в клетках нервной ткани и, в свою очередь, к снижению скорость передачи нервного импульса. И наоборот - кормовая добавка мио-

инозита животным с экспериментальным диабетом способствует нормализации активности этого фермента. Однако, главное открытое было впереди и заключалось в том, что нарушение метаболизма инозита проявляется в активации внутриклеточной протеинкиназы С (РКС) [Lee et al.,1989].

В настоящее время в понимании одного из возможных путей развития диабетических осложнений сложились следующие представления: под действием длительной гипергликемии происходит активация РКС, т.е. перемещение фермента в цитозоле к внутренней поверхности мембраны и фосфорилирование по остаткам серина различных белковых субстратов, среди которых имеют место быть внутриклеточный участок бета-цепи инсулинового рецептора, 1RS, фосфолипаза С и многие другие. В результате такой «модификации» рецептор, к примеру, утрачивает способность активировать свою тирозинкиназную активность, 1RS изменяет свою специфичность, фосфолипаза С инактивируется. Все эти события (достаточно одного!) приводят к прерыванию инсулинового сигнала и возникновению состояния инсулииорезистенгности и, соответственно, развитию гипергликемии.

Попытки объяснить весь комплекс патологических процессов, определенных как диабетические осложнения, только с точки зрения реакций, протекающих в клетке, невозможно. Действительно, существенные нарушения в таких регуляторных экстрацеллюлярных системах как системы свертывания крови, фибринолиза или кининогенеза являются также характерными признаками осложнений при СД. Так, например, наличие тромбоэмболических осложнений при СД объясняют не только инактивацией антитромбина III, но и увеличением биосинтеза тромбоксана - активатора агрегации тромбоцитов [Halushka et.al„ 1981; Hui et al., 1989; Morinelli et al., 1993].

Предположение о том, что развитие диабетических осложнений может происходить в результате неферментативного гликозилирования различных белков и изменения их функциональной активности, не всегда находит экспериментальное подтверждение. Однако, полностью исключить влияние процессов гликозилирования из рассмотрения, по-видимому, не целесообразно. В то же время, известны работы, в которых важную роль в развитии диабетических осложнений отводятся метилглиоксалю [Thomalley et al., 1999] или ацетоацетату [Nath & Brahmankar 1962; Bhal & Nath 1970] - продуктам промежуточного метаболизма глюкозы и жирных кислот. Ряд авторов склонны рассматривать основной источник всех "бед" в действии инсулина [Gwlnup & Ellas 1991], фагоцитов [Wieaisz-Wysocka et al., 1987], эластазы нейтрофилов [Greer et al., 1989; Collier et al., 1989] или в высоком уровне свободных радикалов у диабетических больных [Oberley 1988; Glugliano et al., 1994; Da Ros et al., 2005]. Действительно, согласно клиническим и экспериментальным исследованиям, существенные положительные сдвиги в лечении диабетических осложнений наблюдаются при использовании витамина Е [Keegan et al., 1995; Kunisaki et al., 1996; Koya et al., 1997; Maltseva et al., 1998], липоевой кислоты [Ziegler et al., 1995] или ряда других антиоксидантов [Cameron et al., 1993], витаминов группы В [Ellis et al., 1991; Hobara et al., 1981; Ledermann und Wiedey 1989 ] или аминогуанидина, способного не только препятствовать "сшиванию" белков при их гликозилировании [Vasan et al.,1996, Sims et al., 1998], но и специфически улавливать мегилглиоксаль [Hammes et al., 1994; Li et al., 1996; Lo et al., 1994]. Эти лекарственные препараты, нейтрализующие действие некоторых из вышеперечисленных эффекторов, косвенно подтверждают значимость вклада каждого из них в процесс разрушения организма при СД.

Однако, какими же путями метаболизма связать воедино все эти представления? Существует ли взаимозависимости между высокими уровнями ацетоацетата и метилглиоксаля, глюкозы и тромбоксана, дисфункцией нейтрофилов и активностью антитромбина III? Как взаимодействуют между собой внутри- и экстраклеточные процессы, вызванные СД? Кроме того, отсутствуют представления о генерализованном механизме развития диабетических осложнений, способным охватоть весь комплекс патологических процессов. И, наконец, главное - а существует ли такой механизм в принципе? Действительно, «one voice or many?» [Stehouwer & Schaper 1996].

Целью настоящего исследования является обоснование оригинальной гипотезы существования генерализованного механизма развития диабетических осложнений. Совершнно очевидно, что учитывая черезвычайно широкий спектр патологических процессов, вовлеченных и формирующих данное заболевание, концепция существования единого механизма навряд ли может быть основана только на основании собственных результатов. Поэтому, для ее обоснования воспользуемся дополнительно уже накопленными даннными, многочисленными гипотезами и предположениями.

5.2. Результаты

На рис.5.1 продемонстрировано ингибирующее влияние различных концентраций МГ на активность AT-III. Как видно из представленного графика при концентрации МГ 0,25мМ кинетика процесса инактивации подчиняется механизму реакций, протекающих

.. <1,23 0.33 О.И I [Cl'UwitäuTop], етн-ед.

время, мин.

Рис.5.1. Инактивация АТ-Ш под Рис.5.2. Инактивация С1-ИНГ в присутствии 0,6

действием разных концентраций мМ раствора МГ График внутри рисунка:

МГ (0,25, 0,5 и 1мМ). определение

концентрации активного С1-ИНГ по степени гемолиза эритроцитов барана.

по псевдопервому порядку. С увеличением концентрации МГ в растворе пропорционально увеличивалась и начальная скорость инактивации белкового ингибитора. На основани полученных результатов была определена константа скорости реакции инактивации АТ-Ш под действием МГ, значение которой составило 25,2 М"1мин"1.

На рис. 5.2 приведены калибровочная кривая для количественного определения астивности С1-ИНГ в реакции связывания комплемента и кинетическая кривая

инактивации С1-ИНГ под действием МГ в концентрации 0,6 мМ. Реакции проводились при тех же условиях, что и для AT-III. В данном случае мы также наблюдали кинетику инактивации белкового ингибитора, подчиняющуюся механизму реакций, протекающих по псевдопервому порядку. Константа скорости процесса инактивации С1-ИНГ под действием МГ составила 7,8 М"1мин"1. Используя значения полученных констант инактивации AT-III и С1-ИНГ под действием МГ мы смогли вычислить время процесса инактивации данных белковых ингибиторов на 50% (т1Л ) при 5рМ концентрации МГ, измеренной у больных СД [Thomalley et al., 1989]. Соответствующие значения ъл для AT-III и С1-ИНГ составили ~ 90 и 290 час. Активность С1-ИНГ в присутствии 50 мМ раствора глюкозы без МГ в течение трех недель при температуре инкубации 20-22°С оставалась без изменений.

Функциональный статус нейтрофилов больных СД. Представлялось также необычайно интересным охарактеризовать общий статус нейтрофилов у больных СД с целью подтвердить или опровергнуть предположение о том, что длительная гипергликемия может способствовать переводу нейтрофилов в состояние идентичное или близкое к «возбужденному», наблюдаемое в аналогичных условиях у других клеток [Pirags et al., 1995; Ishii et al., 1996; Koya &King 1998].

Таблица 5.1. Некоторые показатели функционального статуса нейтрофилов больных СД и здоровых доноров до и после их активации суспезией Staphylococcus aureus.

Источник и статус нейтрофилов Хемилюминесценция, mV Дыхание клеток, 111 0г/Ю7 клеток/час

Собственные р-ты IMauseef et al., 1971

Здоровые доноры, не активированные нейтрофилы 19,5 ± 1,9 (п = 10) -7 (п=7) -6,1 (П=21)

Доноры с СД, не активированные нейтрофилы 1 24,4 ± 33,3 (п = 14) -15 (П=9) -10 (п=26)

Здоровые доноры, активированные нейтрофилы 309,9 ± 37,8 (п = 7) не проводились -11 (п=21)

Доноры с СД, активированные нейтрофилы 886,3 ± 56,6 (п = 14) не проводились -22 (п=26)

Базальный уровень свечения нестимулированных нейтрофилов, изолированных из крови больных СД, равно как и скорость потребления им кислорода, существенно превышают аналогичный показатель для клеток от здоровых доноров. При стимуляции стафилококовой суспензией свечение нейтрофилов от больных СД превышало аналогичный показатель почти в три раза (см. табл.5.1).

5.3. Обсуждение результатов в рамках новой концепции генерализованного механизма развития диабетических осложнений

Нами было впервые продемонстрировано, что МГ способен инакгивироватъ AT-III и С1-ИНГ. Наиболее вероятной причиной инактивации является модификация аргининовых остатков активных центров указанных молекул.

Полученные значения констант скоростей реакций инактивации АТ-Ш и С1-ИНГ под действием МГ позволили приблизительно оценить степень влияния этих процессов ín vivo. Оказалось что при концентрации МГ 5 рМ время, в течение которого произойдет ингибирование 50% всего пула АТ-Ш (т%~ 90 час) практически совпадает с временем его полувыведения из организма [Tengbom et al., 1981]. С учетом того, что реакция модификации С1-ИНГ под действием МГ протекает несколько медленнее чем с AT-III, а период полувыведения С1-ИНГ из организма составляет от 24 до 48 часов [Quastel et al., 1983], можно заключить, что чисто формально это соединение нё может оказывать in vivo какое-либо существенное влияние на активность С1-ИНГ и АТ-Ш. Следовательно, вклад МГ в процесс порчи С1-ИНГ и AT-III in vivo возможен, но при более высоких концентрациях МГ, • отражающих по всей видимости уровень компенсации СД. Либо процесс одновременной инактивации указанных серпинов должен происходить под действием гораздо более мощного, и не уступающего в специфичности, эффектора чем МГ.

Эластаза нейтрофилов способна инактивировать in vivo большинство серпинов, и в частности С1-ИНГ и AT-III, путем протеолиза их активных центров [Jordan et al., 1989; Pemberton et al.,1989]. Однако для этого необходимо существенное увеличение концентрации этого фермента, что возможно лишь в результате активации нейтрофилов - единственного депо этого фермента в организме. Активация последних включает в себя широкий круг внутриклеточных процессов, связанных с распадом инозитолфосфолипидов мембраны, стимуляцией РКС под действием диацилглицерола, высвобождением и окислением арахидоновой кислоты, мобилизацией ионов кальция и т.д. [Gaviofi at al., 1987, 1990; Pontremoli et al., 1990; O'FIaherty et al., 1990; Маянский и Пикуза 1993]. Можно заметить, что последовательность событий в нейтрофиле после его микробной стимуляции аналогична процессам, инициированных длительной гипергликемией в различных соматических клетках [Greene et al., 1987]. Такое состояние этих клеток по целому ряду параметров также рассматривается как «активированное» [Cester et al., 1996]. Таким образом как в нейтрофилах, так и соматических клетках разного вида благодаря протеканию идентичных внутриклеточных процессов, но инициированных разными причинами, наблюдается активация РКС. Так, в нейтрофилах под действием активированной РКС происходит фосфорилирование ферментного мембранного комплекса НАДФН-оксидазы, ответственного за кислородзависимую активацию метаболизма и цитотоксичность [Gavioli et al., 1987,1990]. Активация РКС вследствие длительной гипергликемии в других типах клеток (например, сосудистого эндотелия) оказывает громадное влияние на их функциональную активность и пролиферацию, вызывая, к примеру, состояние ИР [Lee et al.,1989].

Схожесть биохимических процессов в различных соматических клетках, инициированных высокими концентрациями глюкозы, с процессами, происходящими в нейтрофилах при их микробной стимуляции, а также наблюдающиеся многочисленные нарушения в функциональных свойствах и метаболизме нейтрофилов у больных СД позволили предположить, что гипергликемия вызывает у нейтрофилов «возбуждение», которое идентично или схоже с состоянием активации.

Какие же имеются данные, подтверждающие это предположение?

1. Через несколько часов инкубации нейтрофилов в условиях гипергликемии в клетках существенно возрастало содержание сорбита и снижалась концентрация мио-инозита [Suzuki et al„ 1999]. Так, количество сорбита в клетках, инкубировавшихся одно и то же время в 5 и 40 мМ растворах глюкозы, составило 0,21 и 0,45 нмолей, соответственно [Kawamura et al„ 1995];

2. среднее значение активности альдольредукгазы нейтрофилов (первого фермента, инициирующего полиоловый путь метаболизма глюкозы) у больных СД примерно в два раза превышало среднее значение активности этого же фермента в нейтрофилах здоровых доноров [Dent et al., 1991];

3. применение ингибиторов альдозоредукгазы устраняло выше указанные нарушения [Ramasamy et al., 1997; Keogh et al., 1997; Suzuki et al., 1999];

4. в прямой зависимости от уровня компенсации диабета, в нейтрофилах больных СД наблюдалось увеличение активности как растворимой, так и мембран-связанной РКС [Karima et al., 2005];

5. показано, что концентрация эластазы нейтрофилов в крови больных диабетом повышена более чем на 30% [Greer et al., 1989; Collier et al., 1989]. Наибольшие значения концентрации эластазы определялись у лиц с диабетическим осложнениями и некомпенсированным диабетом [Piwowar et al., 2000];

| дефицит инсулина или ИР|

гипергликемия

активация кейтрофилоа

усиление

адгезионных

свойств

лзстоацидоэ

Т-

утияюация жирных кислот

образование метилгпиохсаля 1 i - -"'■

гиперхолестерииомия

ИНАКТИВАЦИЯ

1—'бутарзт-

КИСЛОРОДНЫЕ РАДИКАЛЫ

ПОВРЕЖДЕНИЕ МЖРООХУДОЗ

TTOMSO-

ЭМКНШККИЕ

ооюжншия

11», 11 , , |Г /1 -£-

сниш<те

ФАГОЦИТАРНОЙ шиеноаи

СНИЖШИЕ ИММУНО-РВИСТЕННТНОС1И

Рис. 5.3. Сценарий разрушения организма диабетическим осложнениями

установлена четкая корреляция между повышением активности щелочной фосфатазы нейтрофилов и уровнем гликозированного гемоглобина у больных СД [Тзауапэ е1 а1.,1990]. Если последняя величина характеризует предысторию состояния больного за предшествовавшие измерению несколько недель, т.е. степень компенсации заболевания за этот период^ то повышение активности

и к, н \ай~>; ,

В И Г>. 1И О ! V ';

щелочной фосфатазы, как правило, связывают с активацией нейтрофилов [Шубин и Нагоев 1980];

7. примерно в 40% случаев у больных СД обнаруживаются аутоантитела против миелопероксидазы [Ассагс1ора!итЬо е1 а1., 1996]. Этот факт однозначно отражает статус хронической активации фагоцитов и как следствие - сенсибилизацию организма аутоакшгеном в результате его выброса во внеклеточную среду;

8. люминолзависимая хемилюминесценция является одним из основных методов, с помощью которого судят об активации нейтрофилов. Считается, что основными причинами свечения являются генерация кислородных и других радикалов в системах НАДФН-оксидазы и миелопероксидазы, а также процессы, связанные с окислением арахидоновой кислоты. Как следует из результатов собственных исследований (см. табл. 5.1) увеличение примерно в 6 раз люминолзависимой хемилюминесценции нестимулированных нейтрофилов больных СД указывает на повышенный базальный уровень означенных метаболических процессов в клетках, что также свидетельствует об их активации. Аналогичные результаты были приведены также в других работах, согласно которым, нестимулированные нейтрофилы больных СД генерировали в единицу времени большее количество супероксид-радикала (02"), о чем судили по восстанавлению тетразолия [Мегшг-М/увсска е1 а1.,1987] или ферри-цитохрома С [Кап'ша е1 а1„ 2005];

9. предполагаемая активация РКС нейтрофилов под действием длительной гипергликемии должна инициировать целый ряд метаболических процессов в клеточной мембране и, в частности, способствовать повышению активности НАДФН-оксидазы рЗамоН е! а1., 1987; Роп^етоН е1 а1„ 1990]. В свою очередь, активация этого ферментного комплекса должна проявиться в увеличении скорости потребления кислорода нестимулированными клетками. Действительно, как нами было показано (см. табл. 2С.1), у нестимулированнык нейтрофилов больных СД наблюдается существенное увеличение скорости потребления кислорода.

Таким образом, представленные данные однозначно указывают на то, что нейтрофилы больных СД находятся в возбужденном состоянии, которое, по-видимому, можно рассматривать как состояние субактивации и, что наиболее вероятной причиной функционального напряжения клеток является длительная гипергликемия.

Исходя из выше изложенного, в самом общем виде, сценарий разрушения организма при СД (см. рис.5.3) может выглядеть следующим образом: активированные длительной гипергликемией нейтрофилы реализуют весь свой эффекторный потенциал для повреждения и разрушения эндотелия, выбрасывая во внеклеточную среду различные агрессивные радикалы кислорода и окислов азота, многочисленные гидролазы, протеиназы и другие ферменты, среди которых особо отметим зластазу и миелопероксидазу. Выход во внеклеточное пространство миелопероксидазы на фоне повышенного содержания перекиси водорода создает благоприятные условия для образования из гмдроксиаминокислот различных высоко реакционоспособных альдегидов, сшивающих и модифицирующих белки и клетки, и окисления АсА с образованием МГ. Поскольку основная масса нейтрофилов локализована в маргинальном пуле, то перевод нейтрофилов в возбужденное состояние под действием длительной гипергликемии будет способствовать тому, что разрушению будут подвергаться в первую очередь микрососуды за счет создания «пристеночных» локальных высоких концентраций различных альдегидов и биологически-активных соединений, высвобождающихся из активированных нейтрофилов. Под действием эластазы и/или МГ могут подавляться активности двух основных регуляторов систем свертывания крови, кининогенеза и комплемента - АТ-

III и С1-ИНГ, что в свою очередь должно проявляться в нарушении микроциркуляции и синдроме диссеминированного внутрисосудисгого свертывания крови.

Представленная концепция общего механизма развития диабетических осложнений не безупречна, что, однако, вряд ли возможно в принципе. Однако, несмотря на свою «молодость» не осталась не незамеченной, обсуждается и находит свое подтверждение в работах других исследовалей [Christopher 1995; Ratliff et al. 1996; Piwowar et al., 2000; Smolle 2000; Oldenborg et a)„ 1998;1999,2000; Сафронова и др. 2001; Calvet & Yoshikawa 2001; Vander Jagt & Hunsaker 2003; Федосова и др. 2004; Kahn et al., 2005; Rajagopalan 2005].

Глава 6. Механизмы взаимовлияния СД и рака. Гипотеза. 6.1. Введение

Подавляющее число публикаций, описывающих разнообразие биохимических процессов с участием МГ, можно отнести, как правило, всего к двум тематическим направлениям - диабету или раку. Если роль и значение МГ при диабете была подробно рассмотрена в предыдущей главе, то благодаря своему свойству эффективно ингибироватъ процесс деления клеток, МГ серьезно рассматривался многими исследователями как потенциальный терапевтический препарат. Более того, это соединение было призвано играть одну из ключевых ролей в теории канцерогенеза Сент-Дьердьи.

Согласно этой теории, регуляторный механизм процесса деления клетки зависит от взаимодействия ее двух компонентов-антагонистов, названных как ретин и промин. Роль ретина, отвественного за состояние покоя клеток, приписывался МГ, а с промином отождествляли глиоксилазную ферментную систему или ее кофактор -глутатион [Балаж и Блажек 1982; Kalapos MP 1999]. Однако, до сих пор осталось невыясненным, является ли МГ эндогенным регулятором процесса клеточного деления. Основываясь на результатах многочисленных экспериментов, в которых инъекции МГ подавляли злокачественный рост, многие исследователи пытались заставить МГ сыграть эту роль. Для этого было предложено использовать специфические ингибиторы глиоксилазной ферментной системы, превращающей МГ в D-лактат. С помощью этих соединений предполагалось заблокировать основной путь катаболизма МГ и, следовательно, поднять таким образом его концентрацию в клетке. Действительно, управлять процессом биосинтеза МГ каким-либо другими доступным способом в соответствии со схемой процессов углеводного метаболизма Эмбдена - Мейергофа -Парнаса не представляется возможным.

С этой целью были синтезированы и испытаны многочисленные алкил-производные S-глутатиона [Vince & Daluge 1971; Sharkey et al., 2000] и ряд других соединений, способных выступать в роли конкурентных ингибиторов первого фермента глиоксилазного комплекса. К сожалению, большиство полученных препаратов характеризовались способностью подавлять рост раковых клеток только in vitro по причине их быстрого разложения in vivo.

Вследствие перманентной гипергликемии - одного из наиболее характерных метаболических нарушений при СД, только при данной патологии в крови больных наблюдается существенное увеличение концентрации МГ (см. главу 5) - соединения, как отмечено выше, с ярко выраженными свойствами цитостатика. Следовательно, можно предположить, что повышенная концентрация МГ у больных СД должна

инициировать состояние невосприимчивости этих людей к онкозаболеваниям. Другими словами, больные СД должны реже болеть раком. В литературе можно найти большое число публикаций, подтверждающих сделанный вывод. В тоже время, совсем не редкими являются альтернативные утверждения о том, что СД способствует развитию рака.

Настоящим исследованием предпринята попытка разобраться в большом количестве противоположных мнений о взаимовлиянии СД и рака и выявить молекулярный механизм, в рамках которого можно было бы дать разумное объяснение наблюдаемому феномену, обсуждаемому в научной и медицинской литературе более полутора веков! Обосновывается гипотеза, согласно которой процессы, ответственные за разрушение организма при СД, оказывают угнетающее воздействие не только на клетки здоровых тканей, но и клетки неоплазмы.

6.2. Сахарный диабет и рак.

Исследования, связанные с поиском взаимозависимости СД и рака осуществялись по нескольким направлениям, которые можно условно разделить на i) патологоанатомические, Н) клинические и Ш) исследования, выполненные на экспериментальных моделях.

(I) По результатам патологоанатомических наблюдений, охватывающих период с начала 20-х и по 60-е годы XX века, сниженная частота развития раковых заболеваний среди диабетиков была подтверждена практически всеми без исключения многочисленными исследованиями. Так, например, по данным института патологии при университете г. Лейпцига (Германия) среди 18605 аутопсий, проведенных за период с 1936 по 1940ГГ и с 1949 по 1953тг количество гистологически доказанных случаев злокачественных новообразований составило 3524 (19%). Этот же показатель среди диабетиков (637 случаев) составил лишь 9% (59 случаев) [Seifert und Eichler 1954]. А вот как выглядят аналогичные данные паталогоанатомических наблюдений центральной городской больницы этого же города, за период с1920 по 1953 гг. Общее число проведенных посмертных вскрытий составило 25147. Из них - злокачественные опухоли были выявлены в 4939 случаях (19,6%), а согласно историям болезни СД страдали 705 (2,8%) человек, из которых 50 (7,1%) также имели онкологические заболевания [Werner 1955]. Аналогичные данные (см. рис.6.1) приведены, например, и в работах других

Рис. 6.1. Частота (%) злокачественных опухолей среди общего числа аутопсий и аутопсий диабетиков в период с1938 -1959 гг. [Rockstroh und Schröter 1960].

(И) Суммируя выводы клинических наблюдений на протяжении трех столетий (sic!) приходится констатировать противоречивость представленных данных и мнений [Kessler 1971; Ragozzino et al„ 1982; O'Mara et al., 1985; Czyzyk & Szczepanik 2000; Rosenberg et al., 2002]. Основная причина противоположных представлений, скорее всего, заложена в природе самого явления. Кроме того, эпидемиологические исследования прошлых лет,

исследователей [Rockstroh und Schröter 1960].

Количество злоючссгеаших onjmncfl по Дании и яушкнП

• Количестао inoraiccmmiiK опухолей (%) по дышим аутопсий диа5стаюв

Ш J3 40 41 42 43 44 « 4S47 « 43 50 51 52 53 ¡4 55 S6 57

как правило, проводились без учета многообразия форм рака, различной злокачественности процессов ново-образования, степени ком-пенсации или способов лечения СД. Справедливости ради отметим, что медицина того времени и не располагала особо большими возможностями терапии СД. В то же время, статистические исследования, как правило, охватывали продолжительный по времени период их накопления (несколько десятилетий), и не учитывали разный подход в лечении как диабета так и рака, считавшихся "правильными" в свое время, т.е. на каждом этапе развития представлений о данных заболеваниях.

Современные эпидемиологические исследования во многом лишены вышеуказанных недостатков аналогичных работ прошлых лет и проводятся в соотвествии со строгими критериями отбора. Поиск взаимосвязей осуществляется исключительно между СД и только каким-то одним, определенным видом онкозаболевания. Стандартизуется не только математический аппарат, используемый при подсчетах, но и вводятся такие дополнительные критерии как уровень инсулина или глюкозы натощак, ожирение, гормональный статус и некоторые другие. Недавними исследованиями, к примеру, еще раз было подтверждено, что в сравнении с общей популяцией, среди больных СД наблюдается повышенное число случаев заболеваний рака груди и эндометрия, снижение риска заболеваемости раком простаты при наличии СД и отсутствие какой-либо зависимости между СД и овариальным раком [Weiderpass et al., 1997,2002].

В тоже время, важно подчеркнуть, что подобного рода исследования при всей их социальной и научной значимости, а так же тчательности в выборке критериев, все-таки остаются уязвимыми из-за большого числа неучтенных и/или неучитываемых факторов. Так, например, данные по сочетанности СД с раком молочной железы [Mink et al., 2002] или эндометрия [Anderson et al., 2001] после введения поправочных коэффициентов массы тела (BMI; body mass index) существенно преобразились: СД как фактор повышенного риска перечисленных онкологических заболеваний сохранился только для группы лиц с избыточной массой тела и ожирением!

(üi) Из результатов многочисленных экспериментов на животных, выполненных за последние полвека более чем в десятке лабораторий мира, выкристаллизовывается гораздо более четкая картина: экспериментальный СД способен не только препятствовать, но и подавлять (пусть и не до конца!) злокачественный рост многих видов опухолей. В качестве иллюстрации на рис. 6.2. приведены типичные результаты подобного рода исследований, общий вывод которых можно сформулировать так: СД, инициированный до или после перевивания раковой опухоли, существенно препятствовал ее развитию. На фоне длительной гипергликемии у таких животных наблюдалось уменьшение веса и размеров солидной опухоли, снижалось количество асцитных клеток, возрастал период выживаемости животных, а согласно данным анатомических исследований, солидные опухоли были изъедены множественными некрозами. [Шапот 1975; Pavelic 1979; Bell et al., 1989; Fung et al., 1985; Cocca et al., 1998].

Многие авторы отмечали, что чем в большей степени организм - носитель опухоли, страдал от СД, тем в большей степени проявлялось его детримальное влияние на процессы злокачественного роста. Так, например, тяжелое диабетическое состояние тормозило, инициированное канцерогеном, возникновение у самок крыс раковых опухолей печени и молочной железы. При легкой форме диабета, как и в предыдущем случае, ни у одной самки не возникало рака молочной железы, в то время как развитие

гепатом не подавлялось. Более этого, у этих самок вместо рака молочной железы обнаруживались в необычайно высоком проценте случаев опухолевые изменения в печени. Другими словами, лепсая форма диабета препятствовала возникновению рака молочной железы и способствовала развитию рака печени [Бильшовский и Бильшовская 1961]. Эти результаты лишний раз показывают, что в зависимости от уровня компенсации СД может не только препятствовать, но и способствовать развитию некоторых видов злокачественных опухолей.

Рис. 6.2. Влияние аллоксанового диабета на маммакарциному крыс. Каждая кривая отражает зависимость изменения размеров опухоли на крысе в зависимости от времени, прошедшем с момента инициирования диабета аплоксаном. [Heuson & Legras 1970].

Ответ на вопрос о причинах наблюдаемого явления, по нашему мнению, может быть дан, основываясь на том предположении, что процессы, ответственные за разрушение организма при СД, могут также оказывать угнетающее воздействие и на малигнизованные клетки. Более того, есть все основания полагать, что раковые клетки в гораздо большей степени чем здоровые чувствительны по отношению к патологическим процессам, иницированных СД.

б.З. Протеинкиназа С - регулятор процессов опухолевого роста и диабетических

осложнений.

Для того чтобы доказать или опровергнуть гипотезу о том, что процессы, ответственные за разрушение организма при СД, могут оказывать детримальное влияние и на малигнизованные клетки, еобходимо установить какие именно процессы в первую очередь отвественны за развитие диабетических осложнений, какие -за пролиферацию клеток. На втором этапе - постараться выявить общее между ними, поскольку причины взаимовлияния логичнее всего искать на поле, образованным перекрещиванием основных механизмов этих двух патологий.

Процесс опухолевого роста на разных этапах своего развития поддерживается множеством метаболических отклонений от нормы в системе передачи внешнего сигнала внутрь клетки. Эти нарушения, как правило, проявляются в виде неконтролируемой активации или усиленной генерации того или иного субкомпонента этой системы. В зависимости от вида опухоли обнаруживаются такие нарушения как усиленный биосинтез и активация рецепторов эпидермального фактора роста [Ritter &

6 14 22 28 36 42 продолжительность диабета, сутки

Arteaga 2003; Arteaga & Truica 2004], усиленный биосинтез инсулиподобного ростового фактора [Kazer 1995; Burtrum et al., 2003], неконтролируемая активация IRS-1 [Chang et al., 2002], гиперакгивация метаболического каскада, контролиремого PI3K [Workman 2004], дисбаланс в системе РКС и ряд других явлений. Важно подчеркнуть, что прерывание этой цепочки последовательных событий на том или ином этапе приводит к подавлению злокачественного роста и поиск соотвествующей «золотой пули» для точечной терапии является предметом мечтаний и кропотливого поиска.

Многочисленные метаболические нарушения, характерные для СД 2-го типа, во многом также обусловлены дисфункцией системы передачи внешнего сигнала внутрь клетки. Речь, в первую очередь, идет о таких двух клинически детерминированных состояниях как ИР и диабетические осложнения.

Состояние инсулинорезистентности теоретически может быть вызвано сбоем на любом из этапов передачи инсулинового сигнала - будь этот процесс обусловлен нарушениями метаболизма инсулинового рецептора, его субстрата (IRS) или активацией РКС. В последнем случае под действием длительной гипергликемии происходит активация РКС, транслокация фермента к внутренней поверхности мембраны и фосфорилирование по остаткам серина таких белковых субстратов как внутриклеточный участок бета-цепи инсулинового рецептора, IRS или фосфолипаза С. В результате такой «модификации» рецептор, к примеру, утрачивает способность активировать свою тирозинкиназную активность, IRS - изменяет свою специфичность, фосфолипаза С инакгивируется. Все эти события (достаточно одного!) приводят к прерыванию инсулинового сигнала и возникновению состояния ИР. Легко заметить, что сигнальные процессы злокачественного роста и передачи инсулинового сигнала протекают по одинаковому сценарию с одними и теми же участниками «в главных ролях»: Тирозинкиназная активность, Семейство IRS, Активация PI3K (фосфоинозитид-3-киназы), Активация РКС. Только вот «второстепенные роли» сыграли другие участники - и такой разный финал!

Диабетические осложения являются в конечном итоге также следствием гиперактивациии РКС под действием длительной гипергликемии. В соматических клетках (ретины, миокарда или эндотелия и некоторых других) это приводит, например, к существенным измениям физико-химических свойств мембраны и/или возникновению состояния ИР и различным другим метаболическим нарушениям. Однако, наиболее опасным для организма является глюкозозависимая активация РКС в таких эффекторных клетках как нейтрофилы. Переход в «возбужденное» состояние, которое идентично или схоже с состоянием активации, приводит к лавинообразному нарастанию патологических процессов, разрушающих весь организм. К таковым относятся: генерация различных радикалов, выброс во внешнюю среду миелопероксидазы, эластазы, катионных белков, нарушение гомеостаза системы свертывания крови, генерация МГ и прочие нарушения.

Один из важнейших выводов вышесказанного состоит в том, что внутриклеточная регуляция активности РКС является не только общим, но и по меньшей мере одним из основных процессов, отвественных за развитие диабетических осложнений, ИР и опухолевый рост. На этом основании перечисленные патологии можно рассматривать как "РКС-синдром" [McCarty 1996].

6.4. Протеинкмназа С и процессы злокачественной пролиферации

Исследование роли изотипов РКС в процессах пролиферации и малигнизации клеток, представляет большой интерес, поскольку показано, что регуляция активности этих ферментов может эффективно влиять на опухолевый рост [Barry & Kazanietz 2001]. Другими словами, среди прочих удалось найти такой механизм канцерогенеза, воздействуя на который, можно оказывать влияние на процесс злокачественной пролиферации.

Данные об активностях и роли РКС изотипов в малигнизованных клетках сильно разнятся в зависимости от вида опухоли. Так, например, в опухолевых клетках печени количество PKC-alpha изоформы существенно снижено, причем в степени обратно пропорциональной размерам опухоли. В тоже время уровни PKC-delta и PKC-zeta как в цитозоле, так и мембранной фракции раковых клеток были повышены [Tsai et al., 2000]. Усиленную экспрессию PKC-alpha в раковых клетках молочной железы человека связывают с повышенной склонностью к метастазированию опухоли [Carey & Noti 1999], а снижение активности сРКС как в цитозоле так и мембране может служить биологическим маркером колорекгального рака [Sakanoue et al., 1991]. Специфическая регуляция активности изоферментов РКС способна не только усиливать действие цитостатиков [Gravitt et al., 1994; Cartee et al., 1998; Svensson et al., 2000], но и непосредственно влиять на опухолевый рост.

Соединения, способные оказывать влияние на активность РКС, образовали новый класс противораковых препаратов, которые в настоящее время находятся на разных стадиях клинических испытаний [Carter & Капе 2004]. В зависимости от вида опухоли действие одного и того же эффектора способно как стимулировать, так и ингибировать опухолевую пролиферацию. Скорее всего, по коммерческим соображениям, большинство соединений с указанными свойствами известны лишь под кодом, например, LY379196, Ro31-8220, А23187, Н7, UCN-01, CGP 41251 или Go 7874. Ряд из них являются аналогами таких природных ингибиторов РКС как калфостин С (calphostln С) [Donson et al., 2000], стауроспорин (staurosporine) или бриостатин (bryostatin) [Gescher 1998; Zonder et al,, 2001].

Рассмотрим некоторые из процессов, управляемых семейством изоферментов РКС и являющихся характерными для канцерогенеза. Ряд исследователей указывают на взаимозависимость активностей РКС изоформ и таких белков-эффекторов как р53 или фактор некроза опухолей (TNF-alpha). Обе эти молекулы относятся к классу ингибиторов опухолевого роста. Было установлено, в частности, что фосфорилирование белка р53 находится в обратно пропорциональной зависимости от активности РКС, а применение ингибиторов РКС усиливало его антиметастазирующий эффект [Nakamura et al., 2000]. Так, например, ингибирование PKC-alpha, повышенную экспрессию которой связывают не только с прогрессирующим развитием рака молочной железы [Carey & Noti 1999], но и глиобластомы (glioblastoma multiforme), способствовало активации белка р53и усиливало апоптоз раковых клеток [Shen et al., 1999].

Аналогичный эффект ингибирования злокачественного роста наблюдался также в опытах с малигнизованными клетками кишечника LoVo. В этом случае активация РКС существенно усиливала айтипролиферативное действие TNF-alpha [Matsubara et al., 1990]. Диаметрально противоположный эффект наблюдался в экспериментах с клетками CMF-7 (рак молочной железы): замедление апоптоза опухолевых клеток авторы связывали с уменьшением цитотоксичности фактора некроза опухолей под действием

активированной PKC-eta-изоформы [Akkaraju & Basu 2000]. В целом, необходимо отметить, что число процессов, иницированных в раковых клетках взаимодействием РКС-изоферментов и TNF-alpha, необычайно велико. Причем, накопленные в этой области данные, показывают, что взаимовлияние между РКС и цитокином TNF-alpha редко обусловлено прямыми причинно-следственными связями, а, как правило, осуществляются через цепочку разнообразных молекул-посредников или процессов.

Процессы фосфорилирования IRS-1 под действием активированной РКС и TNF-alpha заслуживают особого внимания. Дело в том, что степень фосфорилирования IRS-1 определяет его субстратные свойства в реакции, катализируемой тирозинкиназой инсулинового рецептора. Чем в большей степени фосфорилирован этот белок-посредник, тем хуже его «способности» в передаче инсулинового сигнала. Указанные процессы, согласно современным представлениям, являются основными в формировании ИР в инсулинозависимых клетках перефереческих и жировых тканей. Это означает, что для некоторых видов опухолей способ их терапии равно как и процессы канцерогенеза perse могут явиться причинами инициирования состояния ИР [Hotamisligil et al., 1994; deVente et al., 1996; Kroder et al., 1996; Nakajima et al., 2000].

Таким образом, анализ молекулярных механизмов влияния опухолевого роста на активность РКС изотопов неожиданно вывел нас на известную проблему ИР при канцерогензе. Невосприимчивость клеток к инсулину является в тоже время одной из основных составляющих СД 2-типа и обуславливает высокий уровень гипергликемии при данном заболевании. Длительная гипергликемия, в свою очередь, активируя РКС, также способна вызывать состояние ИР.

Вышесказанное позволяет конкретизировать гипотезу о влиянии процессов, ответственных за развитие диабетических осложнений на рак: изменение статуса РКС под действием гипергликемии или в условиях ИР - наиболее характерных форм проявления СД, способно как "компенсировать" так и "усиливать" дисфункцию изоферментов РКС, обусловленную, в свою очередь, процессами канцерогенеза. Результирующий клинический эффект взаимовлияния диабета и рака, по-видимому, в этих случаях будет зависить от степени компенсации СД, вида и стадии онкологического заболевания. В рамках этих представлений, становится возможным объяснить, почему СД можелг подавлять, препятствовать или способствовать развитию рака. Более того, становится понятным, почему ингибиторы РКС могут быть использованы как для лечения СД, так и стимуляции развития некоторых онкологических заболеваний [Shen 2003].

6.5. Заключение

Дисрегуляция активности ферментов семейства РКС - важнейшего структурного компонента системы передачи внутриклеточного сигнала, является одним из решающих факторов, способных оказывать влияние на течение патологических процессов как при диабете, так и канцерогенезе. Не исключено, что по этой причине при онкологических заболеваниях нередко затрагиваются процессы, обеспечивающие регуляцию углеводного обмена - снижение гипергликемии у диабетиков, у которых наблюдается развитие онкологии, а так же возникновение в ряде случаев у онкобольных инсулинорезистентности или проявление признаков диабета. В свою очередь, влияние СД как комплексного заболевания на процессы опухолевого роста не столь однозначно

и будет зависить как тяжести диабета, его медикаментозного лечения, так и других сопутствующих факторов как, например, ожирение.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Изучен механизм действия ГО с искусственными акцепторами электронов; Впервые продемонстрировано, при окислении глюкозы ГО может проявлять несколько максимумов рН-акгивностм в зависимости от вида акцептора электронов. С кислородом максимум активности наблюдался в области значений рН 5,6; с одноэлектроннными акцепторами - в области рН 7,6; в случае ДХФИФ рН-оптимум реакции располагался в области значений < 5,0. Предложен механизм, объясняющий обнаруженное явление.

2. Впервые продемонстрирована возможность применения полимерных субстратов на основе окислительно-восстановительных индикаторов для ГО и НАДН-дегидрогеназы. Это позволило предложить новую конструкцию ферментных датчиков.

3. Впервые предложена и экспериментально обоснована оригинальная кинетическая схема действия ХО в водноорганических средах. Продемонстрировано, что каталитические свойства фермента ХО в сильной мере зависят от структурной организации субстрата, что м. б. использовано для диагностики состояния клеточных мембран.

4. Найден активный дрожжевой продуцент АО и каталазы Candida boidinii 4д. Разработана оригинальная методика очистки этих ферментов. Изучены основные физико-химические и каталитические свойства АО.

5. Обоснованы и экспериментально определены критерии подбора пористых носителей для иммобилизации ферментов.

6. Разработаны различные аналитические методы и устройства для определения некоторых субстратов GMC-оксидоредукгаз и НАД-зависимых дегидрогеназ.

7. Впервые продемонстрирована возможность инактивации AT-III и С1-ИНГ под действием МГ и проанализаировано его влияние при СД. На основании результатов собственных исследований и данных литературы предложена концепция генерализированного механизма развития диабетических осложнений. В соответствии с предлагаемой концепцией длительная гипергликемия переводит нейтрофилы в состояние возбуждения, которое идентично или схоже с состоянием их микробной активации. Вследствие этого происходит выброс во внешнее пространство свободных радикалов и различных эффекгорных белков, повреждающих сосуды и активирующих другие многочисленные и разнообразные патологические метаболические процессы (незаживляемые раны, дессиминированный синдром свертывания крови и т.д.), характерные для клинической картины, определяемой как диабетические осложнения.

8. Исследованы общие и значимые для СД и рака молекулярные процессы. На основании анализа данных литературы показано, что внутриклеточные процессы, контролируемые семейством ферментов РКС лежат не только в основе развития диабетических осложнений, но и контролируют злокачественный опухолевый рост. Высказана гипотеза, согласно которой изменение статуса РКС под действием гипергликемии или в условиях ИР - наиболее характерных форм проявления СД, способно как "компенсировать" так и "усиливать" дисфункцию изоферментов РКС, обусловленную, в свою очередь, процессами канцерогенеза. Результирующий клинический эффект взаимовлияния диабета и рака, по-

видимому, в этих случаях будет зависеть от степени компенсации СД, вида и стадии онкологического заболевания. В рамках этой гипотезы, стало возможным объяснить, почему СД может подавлять, препятствовать или способствовать развитию рака.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Александровский Я.А., Агасян П.К., Егоров A.M., Осипов А.П., Родионов Ю.В., Березин И. В. Ферментный электрод для определения глюкозы.//Журн. анал. химии -1978. - Том 33. -С. 1409-1412

2. Березин И.В., Егоров А.М, Осипов А.Н. Александровский Я.А., Кирш Ю.Э., Кабанов В.А., Лебедева Т.С. Способ получения водорастворимых комплексов ферментов класса окисдоредуктаз. //Авторская заявка 662557,1979

3. Александровский Я.А. Ферментный датчик для определения глюкозы.// Сборник научных трудов ИХФ АН СССР «Физико-химические процессы в газовой и конденсированной фазах», Черноголовка, 1979. - С.-121-122

4. Александровский Я.А., Сухно A.A., Родионов Ю.В. Полимерные субстраты окси-доредуктаз на основе 4,4,'- дипиридила. И Биохимия-1979. - Том.44. - С.2130-2133

5. Александровский Я.А., Сухно A.A., Родионов Ю.В., Диманис В.И., Пирузян Л.А. Способ количественного определения глюкозы. // Авторская заявка 857874,1981.

6. Сухно А.А, Александровский Я.А., Родионов Ю.В. Биоэлекгрохимическое окисление органических соединений с помощью НАД-зависимых дегидрогеназ.// Сборник научных трудов ИХФ АН СССР «Кинетика физико-химических реакций», Черноголовка 1980, - С.57

7. Александровский Я.А, Сухно А.А, Родионов Ю.В. О возможности применения в ферментных датчиках полимерных субстратов оксидоредуктаз.// Сборник «Получение и приминение иммобилизованных ферментов в научных исследованиях, промышленности и медицине», Ленинград 1980 - С.215

8. Родионов Ю.В, Александровский Я.А, Бежикина Л.В. Исследование реакций глюкозооксидазы с искуссвенными акцепторами электронов и разработка новых фотометрических методов определенич глюкозы на основе растворимой и иммобилизованной глюкозооксидазе».// Сборник «Получение и приминение иммобилизованных ферментов в научных исследованиях, промышленности и медицине», Ленинград, 1980-С.220

9. Александровский Я.А. Сухно A.A., Родионов Ю.В. Новый подход к созданию ферментных датчиков. Сборник научных трудов ИХФ АН СССР «Кинетика физико-химических реакций» Черноголовка 1980, - С. 41-42

10. Александровский Я.А., Сухно А.А, Родионов Ю.В., Пирузян Л.А. Ферментный электрод для определения глюкозы. II Авторская заявка 830229,1981

11. Александровский Я.А., Бежикина Л.В., Родионов Ю.В, Сравнительное изучение реакций, катализируемых глюкозооксидазой в присутствии различных акцепторов электронов. // Биохимия -1981.- Том. 46,- С.708-716

12. Александровский Я.А., Бежикина Л.В. Кинетические особенности взаимодействия глюкозооксидазы с искусственными акцепторами электронов.// Сборник «Кинетика и механизм физико-химических процессов», Черноголовка 1981,- С. 121-122,

13. Александровский Я.А., Родионов Ю.В., Пирузян Л.А. Способ определения глюкозы. II Авторская заявка 940020,1982

14. Сухомлин Т.К., Александровский Я.А. Выделение, основные свойства и иммобилизация алкогольоксидазы из Candida boidmi 4g. // Сборник «Получение и применение биокатализаторов в народном хозяйстве и медицине», Киев 1983.- С.68

15. Александровский Я.А., Сухно A.A. Ферментный электрод для определения субстратов NAD-зависимых дегидрогеназ. II Сборник «Ферменты в биохимических анализах», Вильнюс 1984.- С.54 - 55

16. Аникин А.И., Александровский Я.А., Родионов Ю.В. Свойства и применение в аналитических цепях внеклеточной хопестриоксидазы кориноформной бактерии. II Сборник «Ферменты в биохимических анализах», Вильнюс 1984 - С. 65-66

17. Александровский Я.А., Начапкина Н.В. Ферментный способ определения и регуляции концентрации кислорода в медико-биологических исследованиях. // Сборник Всесоюзного симпозиума мед. энзимологии, Москва 1986 - С.158-159

18. Александровский Я.А. Каталитические свойства холестериноксидазы в реакции окисления холестерина в водно-органических средах. // Биохимия -1987. -Том.52. -С. 1696-1703

19. Родионов Ю.В., Святодух Е.В., Рачинская Л.Г., Александровский Я.А. Влияние дифузионных затруднений на активность каталазы из метилотрофных дрожжей, иммобилизованной на различных кремнеземных носителях. // Биохимия -1987. - Том. 52.-С. 110-116

20. Сухомлин Т.К., Александровский Я.А., Родионов Ю.В. Свойства алкогольоксидазы из метилотрофных дрожжей Candida boidinii AKF 47 МГУ". II Биохимия -1987. - Том. 52.-С. 134-137

21. Александровский Я.А. Иммунологические аспекты развития и лечения инсулинозависимого сахарного диабета. //Клин.Мед.-1987. - Вып.7. - С.31-37

22. Александровский Я.А., Родионов Ю.В., Зарицкий Г.В. Устройство для определения концентраций ферментативных реакций. // Авторская заявка 1395663,1988.

23. Александровский Я.А. Роль ингибиторов активации системы комплемента в патогенезе и терапии инсулинозависимого сахарного диабета.// Вопр. мед. химии -1988. - Том. 34. - Вып. 3. -С. 7-15

24. Александровский Я.А. Роль иммунной системы в патогенезе и терапии инсулинозависимого сахарного диабета. II Препринт. Москва: ОИХФ АН СССР, 1988. -35с.

25. Aleksandrovskl Ya.A., TitovV.N. Influence of the structural organization of cholesterol aggregates in water-organic media on cholesterol oxidation catalyzed by Cholesterol Oxidase. //J.Chem. Blochem. Kinetics -1991.-Vol. 1. - P. 337 - 346

26. Александровский Я.А. Индикаторное тест-устройство для определения концентраций субстратов ферментативных реакций. // Авторское свидетельство 1768642,1992.

27. Александровский Я.А., Титов В.Н. Влияние структурной организации ассоциатов холестерина в водноорганических средах на реакцию его окисления, катализируемую холестериноксидазой. // Биохимия -1993.-Том.58.- С.1408-1419

28. Aleksandrovskii Ya.A.Antitrombin III, C1-lnhibitor, Methylglyoxal and Polymorphonuclear leukocytes in the development of vascular complications in diabetes mellitus. II Thromb.Res.-1992. - Vol. 67. - P. 179-189

29. Александровский Я.А. Молекулярные механизмы диабетических осложнений. II Биохимия -1998. -Том. 63. - С,1249 -1257

30. Александровский Я.А. Молекулярные механизмы взаимовлияния патологических процессов при совместном протекании сахарного диабета и рака. // Биохимия - 2002,-Том. 67. - С.1329-1346

31. Александровский Я.А. Диабет и рак. Механизмы взаимовлияния.// Биохимия -2003. - Том. 68. - С. 705-706

32. Александровский Я.А. Сахарный диабет. Эксперименты и гипотезы. Избранные главы.// Монография, М: СИП РИА, 2005, - 225 с.

1Р2 0 5 95

Подписано в печать 2, V /1V 2006 г.

формат 60x84/16. Заказ № .ТиражУ^ экэ.П.л. 2.45.

Отпечатано в РИИС ФИАН ооригинапа-макетазаказчика. 119991 Москва, Ленинский проспект, 53.Тел. 13251 28

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Александровский, Яков Александрович

Список сокращений Общая характеристика работы

Раздел 1. УГЛЕВОДНЫЙ ОБМЕН: АНАЛИЗ ВАЖНЕЙШИХ МЕТАБОЛИТОВ

Глава 1. ВЫДЕЛЕНИЕ, ИЗУЧЕНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ И КАТАЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ, ИММОБИЛИЗАЦИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ АНАЛИТИЧЕСКИХ ЦЕЛЕЙ ГЛЮКОЗООКСИДАЗЫ, АЛКОГОЛЬОКСИДАЗЫ И ХОЛЕСТЕРИНОКСИДАЗЫ.

1 А. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1А.1. Введение

1 А.2 Источники получения и основные свойства алкогольоксидазы, глюкозооксидазы и холестериноксидазы

1А.2.1. Алкогольоксидаза 1А.2.2. Глюкозооксидаза 1А.2.3. Холестериноксидаза 1А.2.4. Механизм действия глюкозооксидазы, алкогольоксидазы и холестериноксидазы

1А.З. Использование ферментов класса оксидаз в аналитических целях

1А.3.1. Химические и физико-химические методы определения глюкозы, спиртов, холестерина. /Краткая историческая справка/

1А.3.2. Методы анализа глюкозы, спиртов и холестерина с использованием растворимых GMC-оксидоредукгаз 1 А.3.3. Методы анализа глюкозы, спиртов и холестерина с использованием иммобилизованных GMC-оксидоредуктаз 1А.3.4. Ферментные электроды, реакторы и другие аналитические устройства на основе иммобилизованных GMC-оксидоредуктаз

1А.4. Изучение возможности создания ферментного электрода для определения субстратов НАД-зависимых дегидрогеназ

1А.4.1. Методы определения субстратов НАД-зависимых дегидрогеназ

1А.4.2. Получение полимерных форм НАД+

1 А.4.3. Полимерные субстраты оксидоредуктаз

Введение Диссертация по биологии, на тему "Углеводный обмен: механизмы патологических процессов, анализ важнейших метаболитов"

1 С.4.2. Критерии подбора носителей для иммобилизации ферментов. Теория и практика 131

1С.4.3. Анализаторы на основе иммобилизованных ферментов для определения субстратов оксидаз 138

1С.4.4. Способ повышения надежности и точности анализа в области нижнего предела определяемых концентраций 142

1С.4.5. Универсальный ферментный электрод для определения субстратов Н АД-зависимых дегидрогеназ 145

1С.4.6. Универсальное индикаторное устройство для определения концентраций субстратов ферментативных реакций -тест-капсулы 155

1С.4.7. Спектрофотометрические методы определения глюкозы на основе реакции глюкозооксидазы с искусственными акцепторами электронов 159

1С.5. Заключение 161

Раздел 2. УГЛЕВОДНЫЙ ОБМЕН: МЕХАНИЗМЫ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ

Глава 2. МЕХАНИЗМ РАЗВИТИЯ ДИАБЕТИЧЕСКИХ

ОСЛОЖНЕНИЙ

2А. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2А.1. Введение 168

2А.2. Гликозилирование белков 169

2А.З. Гликозилированные белки в оценке степени компенсации нарушения углеводного обмена 174

2А.4. Роль гликозилированных белков в патогенезе диабетических осложнений 176

2А.5. Роль промежуточных продутов процесса гликозилирования в патогенезе диабетических осложнений 184

2А.6. Диабетические осложнения как следствие интенсификации полиолового пути метаболизма глюкозы 190

2А.7. Анализ различных гипотез развития диабетических осложнений 193

2В. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

198

2С. РЕЗУЛЬТАТЫ 200

2D. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ В РАМКАХ

НОВОЙ КОНЦЕПЦИИ ГЕНЕРАЛИЗОВАННОГО МЕХАНИЗМА РАЗВИТИЯ ДИАБЕТИЧЕСКИХ ОСЛОЖНЕНИЙ

2D.1. Обоснование роли ингибиторов сериновых протеиназ в развитии диабетических осложнений 2D.2. Поиск «гуанидинового яда» и оценка потенциальной патологической роли металглиоксаля в развитии диабетических осложнений 2D.3. Статус нейтрофилов при сахарном диабете 2D.4. Сценарий разрушения организма при сахарном диабете 2D.5. Заключение

Глава 3. ДИАБЕТ И РАК. МЕХАНИЗМЫ ВЗАИМОВЛИЯНИЯ

Гипотеза)

ЗАЛ. Введение: Метилглиоксаль - «разрушитель» или «защитник»? 231

ЗА.2. Гипергликемия <-* Метилглиоксаль <-> Рак 234

ЗА.З. Сахарный диабет и рак 242 ЗАЛ. Протеинкиназа С - регулятор процессов опухолевого роста и диабетических осложнений 254 ЗА.5. Протеинкиназа С и процессы злокачественной пролиферации 256

ЗА.6. Заключение 262

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ 264

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 266

204

210 212 218 228

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AT-III - антитромбин III ИР - инсулинорезистентность С1-ИНГ - С1 ингибитор СД - сахарный диабет

ВВ - крысы (BioBreeding) - экспериментальная модель ИЗСД Glut - транспортные молекулы глюкозы через мембрану glucose transporter) IRS - семейство белков-субстратов инсулиного рецептора insulin receptor substrate) PI3K - фермент фосфоинозитид-3-киназа (phosphoinositide 3-kinase). РКС - семейство ферментов протеинкиназы С SOD - фермент Cu,Zn -супероксиддисмутаза

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Поддержание постоянства концентрации глюкозы in vivo является примером одного из самых совершенных механизмов гомеостаза, в функционировании которого участвуют печень, жировая и мускульная ткани, гормоны. Многочисленные нарушения процессов углеводного обмена чаще всего имеют место при сахарном диабете (СД) и характеризуются множественностью форм проявления таких как поражение глаз, почек, нарушение кровообращение, склонность к тромбозу, снижение иммунорезистентности к бактериальным инфекциям, появление незаживляемых ран. Многие специалисты склонны рассматривать перечисленные нарушения не как осложнения СД, а как естественную форму проявления основного заболевания. Такая точка зрения в основном обусловлена отсутствием механизма, позволяющего связать воедино и объяснить весь широкий спектр перечисленных патологий. Поиск такого механизма - одна из атуальнейших современных задач, особенно если принять во внимание неуклонный рост количества больных СД во всем мире.

Многообразие форм нарушений углеводного обмена могут проявляться в явном виде не только при СД, но и некоторых других заболеваниях. Так, например, более чем за 150 лет наблюдений (!) в научной и медицинской литературе накопилось много диаметрально противоположных утверждений, выражающих два полярных мнения о том, что диабет подавляет или, наоборот, способствует злокачественным пролиферативным процессам. С другой стороны, у онкологических больных нередко наблюдаются признаки, характеризующие сильное влияние основного заболевания на процессы углеводного обмена. Таким образом, представляется очень заманчивым попытаться «поставить точку» в этом затянувшимся споре и идентифицировать молекулярный механизм взаимовлияния названных патологий.

Одним из основных инструментов изучения механизмов патологии является селективный анализ различных метаболитов. В конечном итоге, как правило, цель достигается использованием ферментных или иммуноферментных аналитических методов. Разработка и внедрение в практику таких методов невозможно без наличия широкого ассортимента ферментных препаратов, а также фундаментальных знаний механизма их действия. Немаловажным обстоятельством, во многом обеспечивающим успех подобных исследований, является соответствующие конструктивные решения и аппаратурное оформление используемых аналитических методов.

Значения концентраций глюкозы и холестерина безусловно являются базовыми параметрами, адекватно отражающих в целом «согласованность» протекания процессов углеводного обмена in vivo. Мировая потребность в анализах указанных метаболитов обеспечивается аналитическими наборами, тест-полосками или анализаторами, принцип действия которых основан на использовании ферментов глюкозооксидазы и холестериноксидазы. Однако, до сих пор известный набор аналитических методов глюкозы и холестерина не покрывает всех нужд медико-биологических исследований. Разработка новых - является актуальнейшей научно-практической задачей. Причем, поскольку за биологической активностью указанных ферментов можно следить с помощью одних и тех же инструментальных методов анализа, разработка, к примеру, анализатора глюкозы, позволяет, в принципе, использовать созданный прибор и для анализа холестерина без каких-либо конструктивных изменений.

Оказалось, что не только с практической, но и научной точек зрения, изучение каталитических свойств глюкозооксидазы и холестериноксидазы представляет определенный интерес, поскольку оба фермента характеризуются высокой степенью гомологичности первичных струкур. По этому признаку, глюкозооксидазу и холестериноксидазу, равно как и некоторые другие ФАД-зависимые оксидоредуктазы (например, холин- или алкогольоксидаза) объединяют в т.н. семейство GMC-(glucose-methanol-сЬо1те)-оксидоредукгаз [Cavener 1992;Sampson 2001]. Среди членов этого семейства алкогольоксидаза, равно как и оксидазы глюкозы или холестерина, является основным реагентом большинства коммерческих наборов для анализа первичных спиртов в микробиологической и виннодельческой промышленностях. Таким образом, вышеуказанные причины позволяют рассматривать исследования глюкозооксидазы, холестериноксидазы и алкогольоксидазы как актуальную научную задачу с большой практической значимостью.

Цели и задачи исследований. Проведенные исследования были посвящены:

1. Изучению GMC-оксидоредуктаз:

• поиск штаммов-продуцентов алкогольоксидазы и разработка эффективной методики выделения этого фермента;

• изучение физико-химических и каталитических свойств глюкозооксидазы, алкогольоксидазы и холестриноксидазы;

• разработка ферментативных методов анализа глюкозы, спиртов и холестерина с использованием растворимых и иммобилизованных ферментов

• создание прототипов ферментных анализаторов субстратов GMC-оксидоредуктаз

Научная новизна.

Изучен механизм действия глюкозооксидазы с искусственными акцепторами электронов. Впервые продемонстрировано, при окислении глюкозы глюкозооксидаза может проявлять несколько максимумов рН-акгивности в зависимости от вида акцептора электронов, используемых в качестве второго субстратра. С кислородом максимум активности наблюдался в области значений рН 5,6; с одноэлектроннными акцепторами -в области рН 7,6; в случае 2,6-дихлорфенолиндофенола рН-оптимум реакции располагался в области значений < 5,0. Предложен механизм, объясняющий обнаруженное явление.

Впервые продемонстрирована возможность применения полимерных субстратов на основе окислительно-восстановительных индикаторов для глюкозооксидазы и НАДН-дегидрогеназы. Это позволило предложить новую конструкцию ферментных электродов.

Впервые предложена и экспериментально обоснована оригинальная кинетическая схема действия холестериноксидазы в водно-органических средах. Продемонстрировано, что каталитические свойства фермента холестериноксидаза в сильной мере зависят от структурной организации субстрата. Другими словами, холестериноксидаза является «проявителем» надмолекулярной структуры ассоциатов холестерина С этих позиций, разработанный подход проведения реакции окисления холестерина холестриноксидазой может оказаться приемлемым для дигностики состояния клеточных мембран.

Найден активный дрожжевой продуцент алкогольоксидазы и каталазы Candida boidinii 4g. Разработана оригинальная методика очистки этих ферментов. Изучены основные физико-химические и каталитические свойства алкогольоксидазы.

Предложены и обоснованы экспериментальные критерии подбора пористых носителей для иммобилизации ферментов.

Разработаны различные аналитические методы и устройства для определения некоторых субстратов GMC-оксидоредуктаз и НАД-зависимых дегидрогеназ.

Впервые продемонстрирована возможность инактивации антитромбина-III и С1-ингибитора под действием метилглиоксаля. Определены значения констант скоростей указанных реакций в условиях, максимально приближенных к условиям in vivo. Проведен критический анализ и оценка возможного влияния протекания этих процессов на развитие диабетичсеких осложнений. Впервые предложен и обоснован генерализованный механизм развития диабетических осложнений. В основе этого механизма лежит активация длительной гипергликемией внутриклеточных ферментов, входящих в семейство протеинкиназ С (РКС). В соматических клетках этот процесс ведет к состоянию инсулинорезистентности. В нейтрофилах - к их активации и выбросу во внеклеточное пространство миелопероксидазы, эластазы, катионных белков и других эффекторных молекул, разрушающих стенки кровеносных сосудов и иницирующих нарушения в системах свертывания крови и фибринолиза.

Исследованы общие и значимые для СД и рака молекулярные процессы. Показано, что внутриклеточные процессы, контролируемые семейством ферментов РКС лежат не только в основе развития диабетических осложнений, но и контролируют злокачественный опухолевый рост клеток. Это обстоятельство позволило классифицировать рассматриваемые патологии включая инсулинорезистентность как "РКС-синдром". Проведенный в диссертации анализ позволил высказать гипотезу, согласно которой изменение статуса РКС под действием гипергликемии или в условиях инсулинорезистентности - наиболее характерных форм проявления сахарного диабета, способно как "компенсировать" так и "усиливать" дисфункцию изоферментов РКС, обусловленную, в свою очередь, процессами канцерогенеза.

Результирующий клинический эффект взаимовлияния диабета и рака, по-видимому, в этих случаях будет зависить от степени компенсации сахарного диабета, вида и стадии онкологического заболевания. В рамках этой гипотезы, стало возможным объяснить, почему СД может подавлять, препятствовать или способствовать развитию рака.

Структура диссертационной работы. Диссертационная работа «Углеводный обмен: механизмы патологических процессов, анализ важнейших метаболитов» посвящена следующим конкретным научным аспектам по данной теме:

• выделению, изучение физико-химических и каталитических свойств ряда ряда ферментов класса оксидорекдуктаз с целью создания на их основе новых аналитических методик и устройств для анализа важнейших метаболитов углеводного обмена.

• обоснованию гипотезы существования генерализированного механизма развития осложнений при нарушениях углеводного обмен, обусловленных сахарным диабетом

• изучению взаимозависимости и взаимовлиянию патологических процессов при канцерогенезе и сахарном диабете.

УГЛЕВОДНЫЙ ОБМЕН: АНАЛИЗ ВАЖНЕЙШИХ МЕТАБОЛИТОВ

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Александровский, Яков Александрович

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Изучен механизм действия глюкозооксидазы с искусственными акцепторами электронов. Впервые продемонстрировано, при окислении глюкозы глюкозооксидаза может проявлять несколько максимумов рН-активности в зависимости от вида акцептора электронов, используемых в качестве второго субстратра. С кислородом максимум активности наблюдался в области значений рН 5,6; с одноэлектроннными акцепторами -в области рН 7,6; в случае 2,6-дихлорфенолиндофенола рН-оптимум реакции располагался в области значений < 5,0. Предложен механизм, объясняющий обнаруженное явление.

2. Впервые продемонстрирована возможность применения полимерных субстратов на основе окислительно-восстановительных индикаторов для глюкозооксидазы и НАДН-дегидрогеназы. Это позволило предложить новую концепцию создания ферментных электродов.

3. Впервые предложена и экспериментально обоснована оригинальная кинетическая схема действия холестериноксидазы в водно-органических средах. Продемонстрировано, что каталитические свойства фермента холестериноксидаза в сильной мере зависят от структурной организации субстрата. Другими словами, холестериноксидаза является «проявителем» надмолекулярной структуры ассоциатов холестерина С этих позиций, разработанный подход проведения реакции окисления холестерина холестриноксидазой может оказаться приемлемым для дигностики состояния клеточных мембран.

4. Найден активный дрожжевой продуцент алкогольоксидазы и катал азы Candida boidinii 4g. Разработана оригинальная методика очистки этих ферментов. Изучены основные физико-химические и каталитические свойства алкогольоксидазы.

5. Разработаны различные аналитические методы и устройства для определения некоторых субстратов GMC-оксидоредуктаз и НАД-зав исимых дегидрогеназ. Новизна всех разработое подтверждена патентной экспертизой.

6. Впервые продемонстрирована возможность инактивации AT-III и С1-ИНГ под действием МГ и проанализаировано его влияние при С Д. На основании результатов собственных исследований и данных литературы предложен общий механизм развития диабетических осложнений. Обосновывается предположение о том, что длительная гипергликемия, воздействуя, в частности, на семейство ферментов протеинкиназы С (РКС), вызывает у нейтрофилов «возбуждение» - состояние похожее или идентичное их активации. В результате этого происходит выброс во внеклеточное пространство миелопероксидазы, эластазы и других эффекторных молекул, разрушающих стенки кровеносных сосудов.

7. Исследованы общие и значимые для СД и рака молекулярные процессы. Показано, что внутриклеточные процессы, контролируемые семейством ферментов РКС лежат не только в основе развития диабетических осложнений, но и контролируют злокачественный опухолевый рост. Это обстоятельство позволило классифицировать рассматриваемые патологии включая инсулинорезистентность как "РКС-синдром". Высказана гипотеза, согласно которой изменение статуса РКС под действием гипергликемии или в условиях ИР - наиболее характерных форм проявления СД, способно как "компенсировать" так и "усиливать" дисфункцию изоферментов РКС, обусловленную, в свою очередь, процессами канцерогенеза. Результирующий клинический эффект взаимовлияния диабета и рака, по-видимому, в этих случаях будет зависть от степени компенсации СД, вида и стадии онкологического заболевания. В рамках этой гипотезы, стало возможным объяснить, почему СД может подавлять, препятствовать или способствовать развитию рака.

ЗА.6. Заключение

Дисрегуляция активности ферментов семейства рКС, являющегося важнейшим структурным компонентом системы передачи внутриклеточного сигнала, является одним из решающих факторов, способных оказывать взаимовлияние при совместном протекании СД и рака. Не исключено, что по этой причине при онкологических заболеваниях нередко проявляются состояния, затрагивающие процессы, обеспечивающие регуляцию углеводного обмена - снижение гипергликемии у диабетиков, у которых наблюдается развитие онкологии, возникновение у онкобольных инсулинорезистентности, или, наоборот, проявление признаков диабета. В свою очередь влияние СД как комплексного заболевания на процессы опухолевого роста не столь однозначно и будет зависить как тяжести диабета, его медикаментозного лечения, так и других сопутствующих факторов как, например, ожирение.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Александровский, Яков Александрович, Москва

1. Алексеев B.C. Метилглиоксаль: метаболизм и биологическая активность. // Укр. биохим. журнал. 1987. - 59(6).- С. 88-94

2. Афанасьева ГЛ., Щербухин В.Д. Модификация феррицианидного варианта глкжозооксидазного метода определения глюкозы. // Прикл. биохим. микробиол. 1975. - Вып. 11. - С. 460-462

3. АхремА.А., Титов Ю.А. Стероиды и микроорганизмы. -М,: Наука, 1970. -526с.

4. АшинВ.В., Троценко Ю.А. Формирование и распределение модифицированного ФАД меяеду изоферментами алкогольоксидазы из метилотрофных дрожжей Pichia methanolica. // Биохимия. 1998. - Т.63. -С. 1407-1413

5. БалажА., Блажек И. Эндогенные ингибиторы клеточной пролиферации. -М.: Мир, 1982.-302с.

6. Белл JI.H. Спектрофотометрия мутных сред. // Биофизика. 1965. - Т. 10. - С. 374-385

7. Березин И.В., Клесов А.А. Практический курс химической и ферментативной кинетики. М.: МГУ, 1976. 320 с.

8. Билъшовский Ф. и Бильшовская М. Канцерогенез у крыс с аллоксановым диабетом // Механизмы канцерогенеза. М.: Иностранная литература, 1961. -с. 128-141

9. Бишоп Э. Индикаторы. М.: Мир, 1976. Т. 2. - с. 114

10. Богданов В.П., Абалихина Т.А., Чухрова А.И., Дегтярь Р.Г. Об углеводном компоненте глюкозооксидазы из Penicillium vitalе// Республиканский межведомственный сборник. 1974. - Вып. 10. - С. 17 - 19

11. Богданов В.П., Морозкин АД, Абалихина Т.А. Субъединичная структура глюкозооксидазы из Penicillium vitale. // Республиканский межведомственный сборник. 1974. - Вып. 10. - С. 14 - 16

12. Ванштейн Б.К., Кисшее Н.А., Кафтанова А.С., Орлова Е.А., Лернер Ф.Я. Электроннная микроскопия глюкозооксидазы // Республиканский межведомственный сборник. 1974. - Вып. 10. - С. 19 - 20

13. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика. М.: Наука, 1999. 720с. Выдиборец С.В. Изменения эритроцитов при сахарном диабете // Врач. дело. - 1990. - Вып.2. - С. 56-61

14. Галенок В.А., Боднар Н.Н., Диккер В.Е., Ромашкан С.В. Гликозилированные протеины. Новосибирск: Наука, Сиб. Отделение, 1989. 256с.

15. Галенок В.А., Гостинская Е.В., Диккер В.Е. Гемореология при нарушениях углеводного обмена. Новосибирск: Наука, Сиб. Отделение, 1987. 259с.

16. Генес С.Г. Сахарный диабет. М.: Медгиз, 1963. -378с.

17. Гулый М.Ф., Дегтярь Р.Г. Очистка и кристаллизация глюкозооксидазы из гриба Penicillium vitale. II ДАН СССР 1962. - Т. 145. - Вып. 1. - С. 209 - 211

18. ГулыйМ.Ф., Таран Т.Т., Криворот Н.И., Клименко Л.П., Дзвонкевич Н.Д., Солодова Е.В. Реакция глицина с ацетоацетатом и некоторые свойства катализирующего ее фермента из печени крыс. // Укр. биохим. журнал -1989. Т. 61. -Вып.6. - С. 43-48

19. Дегтяр Р.Г., Гулий М.Ф., Гудкова JI.B., Массан Н.С. Природа лабиизаци глюкозооксидази. // Укр. BioxiM. Журн. 1971.- Т. 43. - С. 322 - 326

20. Дубохина Т.Б., Ершова Г.И. Рак поджелудочной железы и сахарный диабет. // Вопр. Онкологии. 1992. - Т. 38. - Вып.З. - С. 259 - 264

21. Жарков В.В., Демидчик И.Е., Ходина Т.В. Выживаемость больных раком легких при проведении комбинировнной терапии на основе гипергликемии. // Медицинская радиология. 1991. - Т.36. - Вып.4. - С. 36-38

22. Ена Я.М, Сушко Е.А., Волковская Т.Г., Иващеико Г.Ф., Шкапко В.Д. Внутрисосудистое свертывание крови при сахарном диабете // Пробл. эндокринол. 1991. - Т. 37. - Вып. 6. - С. 64 -70

23. Ефимов А.Е. Диабетические ангиопатии. М.:Медицина, 1989. 287с.

24. Ефимов А.Е., Обросова И.Г., Великий Н.Н. Сорбитоловый путь обмена глюкозы при стрепотозотоционовом диабете разной длительности и тяжести. // Проблемы эндокринологии. 1984. - Вып.2. - С. 71-75

25. Имшенецкий А.А., Никитин Л.Е., Назарова Т.С., Ефимочкина Е.Ф. Способность микроорганизмов утилизировать холестерин. // Микробиология. 1975,- Т. 44. - С. 210 -213

26. Иоффе Д.В. Стерины как комплексообразователи // Успехи химии. 1986. -Т. LV. - Вып. 2. - С. 333 -349

27. Камышева Е.П., Абелевич И.Г., Андрюхина Н.Н., Панова Е.И., Блохина Н.Ю. Сахарный диабет и рак// Российский медицинский журнал. 1992. - Вып.2. -С. 8-11

28. Кантор Ч, Шиммел П. Биофизическая химия. М.:Мир, 1984. Т.2. - 493с.

29. Кулемин В.В., Алъбицкий И.Б., Котомин С.В., Варигин И.А. Общая гипетермия и гипергликемия при комбинированном лечении рака прямой кишки. // Медицинская радиология. 1987. - Т.32. - Вып.1. - С. 50-52

30. Куницина М.А. Некоторые особенности течения рака молочной железы у больных сахарным диабетом// Вопросы онкологии. 1987. - Т.ЗЗ. - Вып.9. -С. 78-81

31. Коган-Ясный В.М. Сахарная болезнь. М.:Медгиз, 1957. 302с.

32. Козин С.В., Волошина Е.А., Винская Н.П., Золотое В.А., Черников В.И. Гипергликемия как средство повышения эффективности гипертермии прилучевой терапии опухолей.// Медицинская радиология. 1990. - Т.35. -Вып.3.-С. 3-6

33. Летягин В.П., Поддубный И.К., Соколова Г., Ермилова В.Д., Айтакова Т.И. Индуцированная кратковременная гипергликемия в комплексном лечении местно-распространенного рака молочной железы.// Вопросы онкологии. -1984. Т.ЗО. - Вып.7. - С. 63 - 65

34. Литвиненко Л.А. Влияние гипергликемии на антиоксидантный защитный статус эритроцитов у детей с сахарным диабетом и in vitro.// Пробл. эндокринол. 1991. - Т. 37. - С. 6-8

35. Логинов В.М. Искусственная гипергликемия как фактор, избирательно усиливающий противоопухолевый радиационный эффект.// Медицинская радиология. 1983. - Т.28. - Вып.7. -С. 66- 69

36. Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. Новосибирск: Наука, 1989. 341с.

37. Маянский А.Н., Пикуза О.И. Клинические аспекты фагоцитоза. Казань: Магариф, 1993. 192с.

38. Мейер Г. Анализ и определение органических соединений. Л.:ОНТИ, 1937. 457с.

39. Школъсъка О.О., Ясинчук Н.А. Природна м1нливють Penicillium vitale. Характеристика активных вариантов гриба, изо утворюють глюкозооксидазу.// М^кробюл. Журн. 1977. - Т. 39. - С. 601 - 610

40. Мороз JI.B., Кабиева А.О., Доненко Ф.В., Боровкова Н.В. Опыт совместного применения доксоубицина и искусственной гипергликемии.// Антибиотики и химиотерапия. 1990.- Т. 35. - Вып.4. - С. 34 - 36

41. Осинский С.П., Сидоренко М.В., Николаев В.Г. Микроциркуляция в опухоли во время искусственной гипергликемии.// Экспериментальная онкология. -1985.- Т.7.-Вып.3.-С. 51-53

42. Пасторова В.Е. Антитромбин III в регуляции функций коагуляционной и антикоагуляционной кровяных систем.// Успехи современной биологии. -1983. Т. 96. - Вып.1. - С. 69 - 84

43. Писарская И.В. Синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови при сахарном диабете.// Пробл. эндокринол. 1987. -Т.ЗЗ. -Вып.З. - С. 37-40

44. Петрова Л.Я., Глубоковская О.И., Подзухина Г.М., Селезнева А.А. Строение и свойства холестриноксидазы из Actinomyces lavendulae. II Биохимия. -1981.-Т.46. Вып.9. - С. 1570- 1575

45. ПодилъчакМ.Д., Терлецкая JI.M., Красивский Э.З. Активность катионных белков, пероксидазы и щелочной фосфатазы в нейтрофилах крови больных сахарным диабетом. // Врачебное дело. 1989. - Вып. 11. - С. 81 - 83

46. Полюдек-Фабини Р., Бейрих Т. Органический анализ. Руководство. Л.: Химия, 1981.-622с.

47. Попов В.О., Родионов Ю.В., Егоров .М., Березин КВ. Определение формиата с помощью бактериальной формиатдегидрогеназы. // Ж. анал. химии. 1978. -Т.ЗЗ.-С. 364-367

48. Рабинович Е. Фотосинтез. 1951-1959. - Т.2-3. - С. 770

49. Роберте Дою., КассериоМ. Органическая химия. М.: Мир, 1978. Т.2. -888с.

50. Родионов Ю.В., Аникин А.И., Шапошников Г.Л., Рачинская Л.Г. Выделение, очистка и изучение каталитических свойств холестериноксидазы из кориноформных бактерии. // Биохимия. 1988. - Т. 53. - С.742 - 747

51. Родионов Ю.В., Валеев И.И. Кисшева З.Л., Березин И.В. Изучение иммобилизованной формиатдегидрогеназы в нестациолнарном режиме проточного реактора идеального перемешивания .// Биоорг. Химия. 1977. -Т. З.-С. 1560- 1569

52. Сафронова В.Г., Габдулахова А.Г., Миллер А.В., Козарев И.В., Василенко Р.Н. Влияние инсулина на респираторный взрыв нейтрофилов. Роль тирозинкиназ и фосфатаз.// Биохимия. 2001. - Т. 66. - Вып.8. - С. 840 - 849

53. Cnecueifeea В.Г., Меньшиков В.В., Беляков Н.В., Мамаева Г.Г., Степанова Н.И. Система кининогенеза у больных сахарным диабетом до и после лечения продектином.//Пробл. эндокринол 1978 - Т.24- Вып.6 - С. 19-22

54. Сухно А.А., Петухова Р.И., Кисшева 3.JI., Дмитриева Е.Б., Родионов Ю.В., Половченко Б.И., Егоров А.М., Березин И.И. Биоэлектрохимическое окисление формиата.// Биохимия. 1978. - Т. 43. - С. 1900 - 1904

55. Ткачук Ю.В., Мельников И.М. Блокаторы альдозоредуктазы в лечении диабетических сосудистых поражений. // Актуальные проблемы эндокринологии. Фрунзе, 1983. - С. 99 - 101

56. Федосова Н.Ф., Алисиевич С.В., Лядов К.В., Романова ЕЛ., Рудько И.А., Кубатиев А.А. Механизмы диквертинопосредованной регуляции функции нейтрофилов у больных сахарным диабетом 2 типа. // Бюлл. Экспер. Биол. Мед. 2004.- Т. 137.- Вып.2. - С. 143 -146

57. Шаповалов Ю.А., Гладышев П.П. Учение адсорбционной иммобилизации кофактор-зависимых оксидоредуктаз и их свойства в элекгро-ферментативных процессах на электроде и биологических мембранах .// Мол. биол. 1985. - Т. 19. - С.662 - 670

58. Шапот B.C. Биохимические аспекты опухолевого роста. М.:Медицина, 1975.-302с.

59. Ширшова Г.А., Козлова В.Х. Влияние условий культивирования на холестеринразрушающую способность Achromobacter candicans.// Микробиология. 1973. - Т. 42. - С. 825 - 830

60. Шубич М.Г., Нагоев Б.С. Щелочная фосфатаза лейкоцитов в норме и патологии. М. :Медицина, 1980. - 223с.

61. Цукерштейн Е.И. Сахарный диабет. М.:Медгиз, 1931. - 264с.

62. ФизерЛ., ФизерМ. Стероиды. М.: Мир, 1964, с. 38-62,212-234. Ястребова Е.А. Автореферат дисе. на соискание ученой степени канд. хим. наук. - М. 1983.-44с.

63. Abe Т, Nikira Т., ТапакаА., FukuiS. Influence of long chain primary alcohols on cholesterol oxidase from Schizophyllum commune.// Biochim. Biophys. Acta. 1983,- Vol. 749.-P. 69-76

64. Abele J. and Khayam-Bashi H. Aqueous primary standard for use in measuring cholesterol by the cholesterol oxidase method.// Clin. Chem. 1979. - Vol.25. - P. 132-135

65. Accardopalumbo A., Triolo G., GiardinaE., CarboneM.C., FerranteA., Triolo G. Detection of anti-myeloperoxidase antibodies in the serum of patients with type 1 diabetes mellitus.// Acta Diabetologica. 1996.- Vol. 33. - P. 103 - 107

66. Adachi Т., Ohta H., Hirano K., Hayashi K., MarklundS.L. Non-enzymatic glycation of human extracellular superoxide dismutase.// Biochem. J. 1991. -Vol. 279 (Pt.l).-P. 262-267

67. Ahmed N. Advanced glycation end products -role in pathology of diabetic complications.// Diabetes Res. Clin. Pract. 2005. - Vol. 67. - P. 3-21

68. Ahn K.W. and Sampson N.S. Cholesterol oxidase senses subtle changes in lipid bilayer structure.// Biochemistry. 2004 - Vol. 43. - P. 827-836

69. Akkaraju G.R. and BasuA. Overexpression of protein kinase C-eta attenuates caspase activation and tumor necrosis factor-alpha-induced cell death.// Biochim. Biophys. Res. Commun. 2000,- Vol. 279. - P. 103 -107

70. Akyimaz E. and Dinckaya E. An amperometric microbial biosensor development on Candida tropicalis yeast cells for sensitive determination of ethanol.// Biosens. Bioelectron. 2005. - vol. 20. - pp. 1263 - 1269

71. Alexander N.M. and Boyer J.L. A rapid assay for the glyoxalase enzyme system.// Anal. Biochem. 1971. - Vol. 41. - P. 29 - 38

72. Andersen В., Goldsmith G.H., Spagnuolo P.J. Neutrophil adhesive dysfunction in diabetes mellitus: the role of cellular and plasma factors.// J. Lab. Clin. Med. -1988.-Vol. 111.-P. 275-285

73. Anderson K.E., Anderson E., Mink PJ., Hong C.P., Kishi L.H., Sellers T.A., Lazovich D., Folsom A.R. Diabetes and endometrial cancer in the Iowa women's health study. // Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 2001. - Vol.10. -P. 611-616

74. Argiles J.M. and Lopez-Soriano F.J. Insulin and Cancer.// Int. J. Oncol. 2001. -Vol. 18.-P. 683-687

75. Arteaga C.L. and Truica C.I. Challenges in the development of anti-epidermal growth factor receptor therapies in breast cancer. // Semin. Oncol. 2004. -Vol.31- Suppl. 3.-P.3-8

76. AtratP., HullerE., Horhold C. Steroid transformation with immobilized microorganisms. I. Transformation of cholesterol to cholestenone in organic solvents // Z. Allg. Mikrobiol. 1980. - Vol.20. - P.79 - 84

77. AzevedoM., Falcao J., Raposo J., Manso C. Superoxide radical generation by Amadori compounds //Free radic. Res. Commun. 1988. - Vol.4. - P. 331- 335

78. Bagdade J.D., Root R.K., Bulger R.J. Impaired leukocyte funktion in patients with poorly controlled diabetes // Diabetes 1974. - Vol.23. - P.9 - 15

79. Baranao R.I., Rumi L.S., Tesone P.A., Foglia KG. Some characteristics of neutrophils from diabetic patients and their relation to the levels of circulating immune complexes // Acta diabetol. lat. 1987. - Vol. 25. - P.13 - 23

80. Barry O.P. andKazanietzM.G. Protein kinase С isozymes, novel phorbol ester receptors and cancer chemotherapy.// Curr. Pharm. Des. 2001. - Vol. 7. - P. 1725 - 1744

81. Bassler K.H., Ackermann R.H., Wagner K., Schonerstedt B. Enzymatic changes associated with ketosis in long standing diabetes and prolonged starvation of rats.// Hoppe Seylers Z Physiol Chem. 1973. - Vol. 354. - P. 48 - 52

82. Basso D., Brigato L., VeronesiA., Panozzo M.P., Amadori A., PlebaniM. The pancreatic cancer cell line MIA PaCa2 produces one or more factors able to induce hyperglycemia in SCID mice.// Anticancer Res.- 1995. Vol.15. - P. 2585 - 2588

83. Bedetti C.D., Montero G.A., Stoppani A.O. Effect of diabetes, adrenalectomy and hypophysectomy on D-3-hydroxybutyrate dehydrogenase activity and substrate oxidation by rat mitochondria.// Biochem Int. 1987. - Vol.14. - P.45 - 54

84. Beisswenger P.J., Howell S.K., Nelson R.G., MauerM., SzwergoldB.S. a-Oxoaldehyde mrtabolism and diabetic complication. // Biochem. Soc. Transaction. -2003.-Vol.31.-P. 1358- 1363

85. BelceA., UsluE., KucurM., UmutM., IpbiikerA., Seymen H.O. Evaluation of salivary sialic acid level and Cu,Zn-superoxide dismutase activity in type I diabetes mellitus. // Tohoku J. Exp. Med. 2000. - Vol. 192. - P. 219 - 225

86. Bell R.H., McCullough P.J., Pour P.M. Influence of Diabetes on susceptibility to experimental p.ancreatic cancer.// Am. J. Surg. 1988. - Vol.155. - P. 159 - 164

87. Bell R.H., SayersHJ., Pour P.M., RayM.B., McCullough P. J. Importance of Diabetes in inhibition of pancreatic cancer by streptozotozin.// J. Surg. Res. 1989. -Vol. 46.-P. 515-519

88. Bell R.H. and StrayerD.S. Streptozotocin prevents development ofnitrosamine-induced pancreatic cancer in the Syrian hamster. // J. Surg. Oncol. 1983. - Vol. 24. -P.258-262

89. Benedict S.R. A modification of the Lewis-Benedict Method for the determination of sugar in the blood.// J. Biol. Chem. 1918. - Vol. 34. - P. 203 - 207

90. Bergstrom S. and Wintersteiner O. Auto oxidation of sterols in colloidal aqueous solution. The nature of the products formed from cholesterol. I I J. Biol. Chem.-1941.-Vol.141.-P. 597-610

91. Bhail. andNathM.C. Some Aspects of Protein Metabolism in Acetoacetate Injected Rats. // Indian J. Biochem. 1970. - Vol. 7. - P. 112 - 115

92. BiellmannJ.F., Hirth C.G., JungMJ., Rosenheimer N., WrixonA.D. Studies with analogues of nicotinamide adenine dinucleotide. // Eur J Biochem. 1974. - Vol. 41.- P. 517-524

93. Biswass S., Ray M., Misra S., Dulta D.P., Ray S. Selective inhibition of mitochondrial respiration and glycolysis in human leukaemic leucocytes by methylglyoxal. // Biochem. J. 1997. - Vol. 323. - P. 343 - 348

94. Bladon P. Cholesterol Chemistry, Biochemistry and Pathology / Ed. Cook P.P./ -N.-Y.: Acad.Press.1958, P. 98.

95. Blaedel W.J. and Engstrom R.C. Reagentloss enzyme electrodes for ethanol, lactate, and malate.// Anal. Chem. 1980. - Vol. 52 - P. 1691 - 1697

96. Boas J. Ueber Carcinom und Diabetes.// Berliner Klinische Wochenschrift. 1903. - No.ll. -S. 243 - 247

97. Bodily J.M., Hoopes D.J., RoederB.L., Gilbert S.G., Pettit G.R., Herald C.L., Rollins D.N., Robinson RA. The inhibitory effects ofbryostatin 1 administration on the growth of rabbit papillomas.// Cancer Lett. -1999. Vol.136. -P. 67-74

98. Bodman 0. and Walter M. Die Glukoseoxidasen aus Penicillium notatum (Notatin) und Aspergillus niger (Nigerin). // Biochim. Biophys. Acta 1965. - Bd. 110. - S. 496 - 506

99. Borders C.L., Sawnders I.E., Blech D., Fridovich I. Essentiality of the active site arginine residue for the normal catalytic activity of Cu-Zn-syperoxide dismutase.// Biochem. J. 1985. - Vol. 230. - P. 771 - 776

100. Bork K., Witzke G., Artmann K., Benes P., Bookers M., Kreus W. Interaction between CI-INA, coagulation, fibrinolysis and kinin system in hereditary angioneurotic edema (HANE) and urticaria. // Arch. Dermatol. Res. 1984. -Vol.276. - P. 375 - 380

101. BourajjajM., StehouwertC.D.A., van Hinsbergh V.W.M. & SchalkwijkC.G. Role of methylglyoxal adducts in the development of vascular complications in diabetes mellitus.// Biochem. Soc. Transaction 2003. - Vol.31. - P. 1400 -1402

102. Bovin J.C., Atallah M.T., Hultin H.O. Relative efficiencies of a soluble and immobilized two-enzyme system of glucose oxidase and catalase.// Biochim. Biophys. Acta 1976. - Vol.438. - P. 23 - 36

103. Bright H. J. and Porter D. J. T. Flavoprotein Oxidases.// The Enzymes. N.Y.- San Francisco London: Acad. Press. 1975,- Vol.12. - P. 421 - 505

104. Bright H. J. and Appleby M. The pH-dependence of the individual steps in the glucose oxidase reaction. // J. Biol. Chem. 1969. - Vol. 244. - P. 3625-3634

105. Bright H. J. and Gibson Q. H. The oxidation of 1-deuterated glucose by glucose oxidase. // J. Biol. Chem.- 1967. Vol.242. - P. 994-1003

106. BringerS, Sprey B, Sahm H. Purification and properties of alcohol oxidase from Poria contigua. // Eur. J. Biochem. 1979. - Vol. 101. - P. 563 - 570

107. Brown G.M., ZachwiejA., AtangerH.C. An improved technique for continuous in vivo analysis of glucose. // Clin. Chim. Acta 1966. - Vol. 14. - P. 386 - 390

108. Brown M.E. Ultra-micro sugar determination using 2,9,-dimethyl-1,10-phenan-throline hydrochloride (neocuproine).// Diabetes 1961. - Vol.10. - P. 60 - 62

109. Brown S.M., Smith D.M., Alt N., Thorpe S.R., Baynes J. W. Tissue-specific variation in glycation of proteins in diabetes: evidence for a functional role of amadoriase enzymes.// Ann. N. Y. Acad .Sci. 2005. - Vol.1043. - P. 817-823

110. Brownlee M., Cerami A., Vlassara H. Advanced glycosylation and products in tissue and the biochemical basis of diabetic complications.//N. Engl. J. Med. -1988.-Vol.318.-P.1315 -1321

111. Brownlee M, Vlassara H., Cerami A. Inhibition of heparin-catalyzed human antithrombin III activity by nonenzymatic glycosylation.// Diabetes 1984. -Vol.33.-P. 532-535

112. Bruckdorfer K.R. and Sherry M.K. The solubility of cholesterol and its exchange between membranes. // Biochim. Biophys.Acta 1984. - Vol.769. - P. 187-196

113. Buckland B.C., Dunnill P., Lilly M.D. The enzymatic transformation of water-insoluble reactants in nonaqueous solvents. Conversion of cholesterol to cholest-4-ene-3-one by aNocardia sp.// Biotechnol. Bioeng. 1975.- Vol. 17. - P. 815-826

114. Buckland B.C., Dunnill P., Lilly MD. The enzymatic transformation of water-insoluble reactants in nonaqueous solvents. Conversion of cholesterol to cholest-4-ene-3-one by a Nocardia sp. Biotechnol. Bioeng. 2000. - Vol.67. - P. 714 -719

115. Burke R. W., Diamondstone B.I., Velapoldi R.A., Menis 0. Mechanisms of the Liebermann-Burchard and Zak color reactions for cholesterol.// Clin Chem. -1974.-Vol. 20.-P. 794 -781

116. Burns R.A.Jr. and Roberts M.F. Cholesterol solubilization by short-chain lecithins: characterization of mixed micelles and cholesterol oxidase activity.// Biochemistry -1981.-Vol. 20.-P. 7102-7108

117. Calvet H.M. and Yoshikawa Т. T. Infections in diabetes.// Infect Dis Clin North Am. 2001.- Vol. 15.-P.407-421

118. Cameron N.E., CotterM.A., MaxfieldE.K. Anti-oxidant treatment prevents the development of peripheral nerve dysfunction in streptozotocin-diabetic rats.// Diabetologia 1993. - Vol. 36. - P. 299 - 304

119. Caraway W. T. and Kammeyer C. W. Chemical interference by drug and other substances with chemical laboratorium procedures. // Clin. Chim. Acta 1972. -Vol.41.-P. 395-434

120. Carey I. and Noti J.D. Isolation of protein kinase C-alpha regulated cDNAs associated with breast tumor aggressiveness by differential mRNA display. // Int. J. Oncol. 1999. - Vol. 14. - P. 951 - 956

121. Carrell R. W., Owen M.C. Plakalburain, alpha-antitrypsin, antithrombin and the mechanism of inflammatory thrombosis. // Nature 1985. - Vol. 317. - P. 730 -732

122. Cartee L., Kucera G.L. Protein kinase С modulation and anticancer drug response. // Cancer Invest. 2000. - Vol.18. - P. 731 - 739

123. Cartee L., Kucera G.L, Nixon J.B. The effect of gemcitabine and TPA on PKC signaling in BG-1 human ovarian cancer cells.// Oncol. Res. 1998. - Vol. 10. - P. 371 -377

124. Carter C.A. Protein kinase С as a drug target: implications for drug or diet prevention and treatment of cancer. // Curr Drug Targets 2000. - Vol. 1. - P. 163 -183

125. Carter C.A., Kane C.J. Therapeutic potential of natural compounds that regulate the activity of protein kinase C. // Curr. Med. Chem. 2004. - Vol. 11. - P. 2883 -2902

126. Cavener D.R. GMC oxidoreductases. A newly defined family of homologous proteins with diverse catalytic activities. // J. Mol. Biol. 1992. - Vol. 223. - P. 811 -814

127. Ceriello A, Giugliano D, Quatraro A, Consoli G, Stante A, Dello Russo P, D'Onofrio F. Induced hyperglycemia alters antithrombin III activity but not its plasma concentration in healthy normal subjects.// Diabetes 1987. - Vol. 36. - P. 320 - 323

128. CerielloA., Giugliano D., QuatraroA., StanteA., Dello Russo P., Torella R. Increased alpha-2-macroglobulin in diabetes: a hyperglycemia related phenomen assiciated with reduced antithrombin III activity .//Acta diabetol. lat. 1989. - Vol. 26.-P. 147-154

129. Chan Т. K. and Bruice Т. C. One and two electron transfer reactions of glucose oxidase. I I J. Amer. Chem. Soc. 1977. - Vol.99. - P. 2387 - 2389

130. Chang Q., Li Y., White M.F., Fletcher J.A., Xiao S. Constitutive activation of insulin receptor substrate 1 is a frequent event in human tumors: therapeutic implications.//Cancer Res. 2002. - Vol. 62. - P.6035 - 6038

131. Cheetham P.S., DunnilP., LilliM.D. The characterisation and interconversion of three forms of cholesterol oxidase extracted from Nocardia rhodochrous.il Biochem J. 1982. - Vol. 201. - P. 515 - 521

132. Cheillan F., Lafont H., Termine E., Hamann Y., Lesgards G. Comparative study of methods for measuring cholesterol in biological fluids. // Lipids 1989. - Vol. 24. -P. 224-228

133. Cheung S.T. and Lin W.N. Simultaneous determination of methanol, ethanol, acetone, isopropanol and ethylene glycol in plasma by gas chromatography. // J. Chromatogr. 1987. - Vol. 414. P. 248 - 250

134. Chong-Martinez В., Buchanan Т.A., Wenby R.B., Meiselman H.J. Decreased red blood cell aggregation subsequent to improved glycaemic control in Type 2 diabetes mellitus. // Diabet Med. 2003. - Vol. 20. - P. 301-316

135. Chosh R. and Quayle J. R. Phenazine Ethosulfate as a preferred electron acceptor to phenazine methosulfate in dye-linked enzyme assays. // Anal. Biochem. 1979. - Vol. 99. - P. 112-117

136. Christiansen N.O., Larsen C.S., Esmann V. A study on the role of protein kinase С and intracellular calcium in the activation of superoxide generation. // Biochim. Biophys. Acta 1988. - Vol. 971. - P. 317 - 324

137. Christopher M.M. Hematologic complications of diabetes mellitus. // Vet. Clin. North. Am. Small. Anim. Pract. 1995. - Vol. 25. - P. 625 - 637

138. Clark L.C. A family of polarographic enzyme electrodes and the measurement of alcohol. // Biotechnol. Bioeng. 1972. - Vol. 3. - P. 377 - 394

139. Cocca C., Martin G., Rivera E., Davio C., Cricco G., Lemos В., Fitzsimons C., Gutierrez A., Levin E., Levin R., CrociM., Bergoc R.M. An experimental model of Diabetes and cancer in rats. // Eur. J. Cancer 1998. - Vol. 34. - P. 889 - 894

140. Cohen R.A. Role of nitric oxide in diabetic complications. // Am. J. Ther. 2005. -Vol. 12. - P. 499 - 502

141. Constantinides P. and KiserM. Arterial effects of palmitic, linoleic and acetoacetic acid. // Atherosclerosis -1981. Vol. 38. - P. 309 - 319

142. Cordonnier M., Lawny F., ChapotD., Thomas D. Magnetic enzyme membranes as active elements of electrochemical sensors. Lactose, saccharose, maltose bienzyme electrodes. // FEBS Lett. 1975. - Vol. 59. - P. 263 - 267

143. Couderc, R. and Baratti, J. Oxidation of methanol by the yeast Pichia pastoris: purification and properties of alcohol oxidase. // Agric. Biol. Chem. 1980. -Vol. 44.-P. 2279-2289

144. Coulthafd C.E., Michaelis R., Short W.F. Notatin: an antibacterial glucose-aerodehydrogenase from Penicillium notatum and Penicillium resticulosum sp. Nov. II J. Biochem. 1945. - Vol.39. - P. 24 - 36

145. Craven B.M. Crystal structure of cholesterol monohydrate. // Nature 1976. -Vol. 260. - P. 727 - 729

146. Cremonesi P., Carrea G., FerraraL., AntoniniE. Enzymatic preparation of 20 beta-hydroxysteroids in a two-phase system. I I Biotechnol. Bioeng. 1975. - Vol. 17.-P. 1101-1108

147. Cremonesi P., Carrea G., Ferrara L., Antonini E. Enzymatic dehydrogenation of testosterone coupled to pyruvate reduction in a two-phase system. I I Eur. J. Biochem. 1974. - Vol. 44. - P. 401 - 405

148. CsukaiM. and Mochly-Rosen D. Pharmacologic modulation of protein kinase С isoforms: the role of RACKS and subcellular localisation.// Pharmacol. Res. -1999.- Vol. 39.-P. 253-259

149. CzyzykA. and SzczepanikZ. Diabetes mellitus and cancer. // Eur. J. Intern. Med. -2000.-Vol. 11.-P. 245-252

150. McCall J.L., TuckeylA., Parry B.R. Serum tumor necrosis factor alpha and insulin resistance in gastrointestinal cancer.// Br. J. Surg. 1992. - Vol. 79. - P. 1361-1363

151. McCarty M.F. Up-regulation of intracellular signaling pathways may play a central pathogenic role in hypertension, atherogenesis, insulin resistance, and cancer promotion the ,,PKC-syndrome". // Medical Hypotheses - 1996. - Vol. 46.-P. 191 -221

152. Da Ros R, Assaloni R, Ceriello A. Molecular targets of diabetic vascular complications and potential new drugs. // Curr. Drug Targets 2005. - Vol. 6. - P. 503 - 509

153. Daniel В. T. Glycemic crises in patients with hematologic malignancies. I I Crit. Care Nurs. Clin. North Am. 2000. - Vol. 12. - P. 297 - 305

154. Davis III, A.E. CI inhibitor and hereditary angioneurotic edema. // Ann. Rev. Immunol. 1988. - Vol. 6. - P. 595 - 628

155. Deckert Т., Feldt-Rasmussen В., Borch-Johnsen K, Jensen Т., Kofoed-Enevoldsen A., Mathiesen E.R. Natural history of diabetic complications: early detection and progression. //Diabet. Medicine 8 Symposium, -1991. S33-S37

156. Dennis J. U., Dean N.M., Bennett C.F., Griffith J. W, Lang C.M., Welch D.R. Human melanoma metastasis is inhibited following ex vivo treatment with an antisense oligonucleotide to protein kinase C-alfa. // Cancer Lett. 1998. -Vol. 128. - P. 65 - 70

157. DentM.T., Tebbs S.E., Gonzalez A.M., WardJ.D., Wilson R.M. Neutrophil aldose reductase activity and ist association with established diabetic microvascular complications. // Diabet. Med. 1991. - Vol.8. - P. 439 - 442

158. DetjenK.M., Brembeck F.H., Wetzel M., Kaiser A., HallerH., Wiedenmann В., Rosewicz S. Activation of protein kinase C(alpha) inhibits growth of pancreatic cancer cells via p21cip-mediated Gi arrest. // J. Cell Science 2000. - Vol. 113. - P. 3025 - 3035

159. Dickinson F.M. and Wandforth C. Purification and some properties of alcohol oxidase from alkane-growth Candida tropicalis. // Biochem. J. 1992. - Vol. 282. - Pt.2., P. 325-331

160. Dispenzieri A. andLoprinzi C.L. Chemotherapy-Induced Insulin-dependent diabetes mellitus. //J. Clin. Oncol. 1997. - Vol. 15. - P. 1287

161. DonsonAM., BanerjeeA., Gamboni-Robertson F., FleitzJM., Foreman N.K. Protein kinase С zeta Isoform is critical for proliferation in human glioblastoma cell lines. // J. Neurooncol. 2000. - Vol. 47. - P. 109 - 115

162. Dorfman L. Ultraviolet adsorbtion of steroids. // Chem. Revs. 1953. - Vol. 53. -P. 47 -144

163. Duarte J.M.C. Enzymes as Catalysts in Organic Synthesis. // NATO ASI Series.Series C. vol.178 Ed. Schneider M.P. Dordrecht: D.Reidel Publ.Co., 1986. P. 371 - 382

164. Duarte J.M.C. and Lilly M.D. The use of free and immobilized cells in the presenceof organic solvents: the oxidation of cholesterol by Nocardia rhodochrous. II Enzyme Engineering 1980. - Vol. 5. - P. 363 - 367

165. DuboisM, GillesK.A., Hamilton J.K., RebersP.A., Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. // Anal. Chem. 1956. - Vol. 28.-P. 350 -356

166. Duke F. R., Weibel M.K., Page D. S., Bulgrin V. G., Luthy J. The glucose oxidase mechanism. Enzyme activation by substrate. // J. Amer. Chem. Soc. 1969. - Vol. 91. - P. 3904 - 3909

167. Duysens L.N.M. The flattening of the absorption spectrum of suspensions, as compared to that of solutions. // Biochim. Biophys. Acta 1956. - Vol. 19,. - P. 1 -12

168. Editorials. The colon, the rumen and D-lactic acidosis. //Lancet 1990. - Vol. 336. -Nr. 8715.-P. 599 -600

169. Edwards S.W., SayJ.E., Taylor J., Hart C.A. Mieloperoxidase secretion during phagocytosis: a case of a patient with impaired bacterial activity. // J. Clin. Lab. Immunol. 1988. - Vol. 27. - P. 97 - 102

170. Ekelund S., Nygren P. and Larsson R. Guanidino-containing drugs in cancer chemotherapy: biochemical and clinical pharmacology (3). // Biochem. Pharmacol. 2001,-Vol.61. - P. 1183 -1193

171. Ellis J.M, Folkers K., Minadeo M., VanBuskirk R., Xia L.-J., Tamagawa H. A deficiency of vitamin B6 is a plausible molecular basis of the retinopathy of pathients with diabetes mellitus. // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1991.1- Vol. 79.-P. 615-619

172. Esmann V. The diabetic leukocyte. // Enzyme 1972. - Vol. 13. - P. 32 - 55

173. Esmann V. The glycogen content of leukocytes from diabetic and non-diabetic subjects. // J. Clin. Lab. Invest. 1961. - Vol. 13. - P. 134 - 139

174. Farrington J.A., EbertM. and Land E.J. Bipyridylium quaternaiy salts and related compounds. Part 6. Pulse radiolysis studies of the reaction of paraquat radical analogues with oxygen. J. Chem. Soc., Faraday Trans. 1 1978. - Vol. 74. -P. 665-675

175. Fazal F., Ahmed S., Rahman A., Hadi A.M. Generation of superoxide anion and hydroxyl radical by methylglyoxal. // Med.Sci.Res. 1994. - Vol. 22. - P. 21 - 22

176. Federspil G., VettorR., De Palo E., Radovan D., Sicolo N., Scandellari C. Plasma kallikrein activity in human diabetes mellitus. // Metabolism 1983. - Vol. 32. -P. 540 - 542

177. Fernandes E.N. and Reis B.F. Automatic flow procedure for the determination of ethanol in wine exploiting multicommutation and enzymatic reaction with detection by chemiluminescence. // J. AO AC Int. 2004. - Vol. 87. - P. 920 -926

178. OFlaherty J.T., Jacobson D.P., Redman J.F., Rossi A.G. Translocation of protein kinase С in human polymorphonuclear neutrophils. Regulation by cytosolic Ca2(+)-independent andCa2(+)-dependentmechanisms. //J. Biol. Chem. 1990. -Vol. 265.-P. 9146-9152

179. Fleer E. and Fleischer S. Modification of arginines in D-beta-hydroxybutyrate dehydrogenase. // Biochim. Biophys. Acta 1983. - Vol. 749. - P. 1-8

180. Fortes Z.B. Vascular reactivity in diabetes mellitus: role of the endothelial cell. // Br. J. Pharmacol. -1983. Vol. 79. - P. 771 - 781

181. Factor A. andHeinsohn G.E. US Patent 3 694 384 (Int. CI. C08g 33/6), 1972.

182. Folin O. and Wu H. A system of blood analysis. 1. A simplified and improved method for determination of sugar. // J. Biol. Chem. 1920. - Vol. 41. - P. 367374

183. Friedmann Т.Е. The action of alkali and hydrogen peroxide on glyoxals.// J. Biol. Chem. 1927. - Vol. 73. - P. 331-334

184. Fujii T. and Tonomura K. Oxidation of methanol, formaldehyde, and formiate by a Candida species. //Agric. biol. Chem. 1972. - Vol. 36. - P. 2297 - 2306

185. Fujino Y., Mizoue Т., Tokui N., Yoshimura T. Prospective study of Diabetes mellitus and liver cancer in Japan. // Diabetes Metab Res Rev. 2001. - Vol. 17. -P. 374-379

186. Fukuda #., Kawakami Y., Nakamura S. A method to screen anticholesterol substances produced by microbes and a new cholesterol oxidase produced by Streptomyces violascens. // Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 1973. - Vol. 21. - P. 2057 - 2060

187. FukuyamaM. andMiyake Y. Purification and some properties of cholesterol oxidase from Schizophyllum commune with covalently bound flavin. // J. Biochem. (Tokyo) 1979. - Vol. 85. - P. 1183-1193

188. Fung K.P., Chan T. W., Choy Y.M. Suppression of Ehrlich ascites tumor growth in mice by starvation and streptozotocin-induced Diabetes. // Cancer Lett. 1985. -Vol. 28. - P. 273 - 280

189. Ganguly P.K., Thliveris J.A., MehtaA. Evidence against the involvement of Nonenzymatic Glycosylation in diabetic cardiomyopathy. // Metabolism 1990. -Vol. 39. - P. 769 - 773

190. GeisslerJ., Ghisla S., Kroneck P.M.H. Flavin-dependet alcochol oxidase from yeast. Studies on the catalytic mechanism and inactivation during turnover.// Eur. J. Biochem. 1986. - Vol. 160. - P. 93 -100

191. George P. The chemical nature of the second hydrogen peroxide compound formed by cytochrome с peroxidase and horseradish peroxidase. I. Titration with reducing agents. // Biochem. J. 1953.- Vol. 54. - P.267 - 276

192. GerberM., Bodmann O., Schulz G.V. On the oligomerisation ofperiodate-oxidized glucose oxidase.// FEBSLett.- 1977. Vol. 80.-P. 294-298

193. Gescher A. Analogs of staurosporine: Potencial anticancer drugs? // General Pharmacology 1998.-Vol.31.-P. 721 -728

194. Gibson Q.H., Swoboda В. E. P., Massey V. Kinetics and mechanism of action of glucose oxidase. // J. Biol. Chem. 1964. - Vol.239. - P.3927 - 3934

195. Gilbert D.B., Tanford C., Reynolds J.A. Cholesterol in aqueous solution: hydrophobicity and self-association. // Biochemistry 1975. - Vol. 14. - P. 444 -448

196. GlazerR.1. The Protein Kinase ABC's of Signal Transduction as Targets for Drug Development. // Curr. Pharm. Des.- 1998.- Vol.4. P. 277 - 290

197. GlickB.R., Martin W.G., GirouxJJ., Williams R.E. The interaction of polymeric viologens with hydrogenases from Desulfovibrio desulfuricans and Clostridium pasteurianum. II Can. J. Biochem. 1979. - Vol. 57. - P. 1093 - 1098

198. Glicksman AS. andRawson R. W. Diabetes and altered carbohydrate metabolism in patients with ca.ncer.il Cancer 1956.- Vol.9. - P. 1127 - 1134

199. Goodall S.R. and Byers F.M. Automated micro method for enzymatic L(+) and D(-) lactic acid determinations in biological fluids containing cellular extracts. // Anal. Biochem. 1978. - Vol. 89. - P. 80 - 86

200. Goodwin Y.F. Spectrophotometry of Proline in Plasma und Urine.// Clin.Chem. -1972.-Vol. 18.-P. 449-454

201. Goranson E.S., Botham F., WillmsM. Inhibition of growth of transplanted hepatomas in alloxanized Wistar rats.// Cancer Res. 1954.- Vol.14. - P. 730 -733

202. Goranson E.S. and Tilser G.J. Studies on the relationship of alloxan-Diabetes and tumor growth. // Cancer Res. 1955. - Vol.15. - P. 626 - 631

203. Greene D.A., Lattimer S.A., SimaAA.F. Sorbitol, phosphoinositides and sodium-potassium-ATPase in the pathogenesis of diabetic complications.// New Engl. J. Med. 1987. - Vol.316. - P. 599 - 606

204. Greenfield P.F., Kittrell J.R., Laurence R.L. Inactivation of immobilized glucose oxidase by hydrogen peroxide.// Anal. Biochem. 1975. - Vol.65.- P. 109 - 124

205. Greer LA., HaddadN.G., Dawes J., Johnston T.A., Johnstone F.D., Steel J.M. Increased neutrophil activation in diabetic pregnancy and in nonpregnant diabetic women. // Obstet. Gynecol. 1989. - Vol.74. - P. 878 - 881

206. Gronberg L. and Slotte P. Cholesterol oxidase catalyzed oxidation of cholesterol in mixed lipid monolayers: effects of surface pressure and phospholipid composition on catalytic activity.// Biochemistry 1990. - Vol.29. - P.3173 - 3178

207. Grosse H. Das Problem der Syntropie von Diabetes und Carcinom. // Z. Krebsforsch. 1956. - Vol.61. - P. 587 - 588

208. Gugliucci A. and BendayanM. Histones from diabetic rats contain increased levels of advanced glycation end products.// Biochem.Biophys. Res. Comm. 1995. -Vol. 212.-P.56-62

209. Guilbault G.G. andMontalvo J. Urea-specific enzyme electrode.// J.Amer. Chem. Soc. 1969. -Vol. 91. - P. 2164 - 2165

210. Guilbault G.G. and Shu F.R. Enzyme electrodes based on the use of a carbon dioxide sensor and L-tyroside electrodes.// Anal. Chem. 1972. - Vol.44. -P.2161-2166

211. Guilbault G.G. Practical Fluorescence, Second Edition. New York: Marcel Dekker Inc., 1990. - P. 366 - 373

212. Gupta K., Krishnaswamy G., KarnadA., Peiris A.N. Insulin: a novel factor in carcinogenesis. // Am J Med Sci.- 2002. Vol.323. - P. 140 - 145

213. Gwinup G. andElias A.N. Hypothesis: insulin is responsible for the vascular complications of diabetes.// Medical Hypothesis 1991. - Vol.34. - P.l - 6

214. Haberland M.E. and Reynolds J.A. Self-association of cholesterol in aqueous solution.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1973. - Vol.70. - P.2313 - 2316

215. Hagedom H.C. and Jensen B.N. Zur Microbestimmung des Blutzuckers mittels Ferricyanid. // Biochem. Z. 1923. - Bd.135. - S.46 - 58

216. Haider J., Ray M. and Ray S. Inhibition of glycolysis and mitochondrial respiration of Ehrlich ascites carcinoma cells by methylglyoxal.// Int. J. Cancer 1993. - Vol. 54. - P.443 - 449

217. Hall S.S., Doweyko L.M., Doweyko A.M., Zilenovski J.S.R. Synthesis and Evaluation of a-Hydroxythiol Esters as Antitumor Agents and Glyoxalase I Inhibitors.// J. Med. Chem. 1977. - Vol.20. - P. 1239 - 1242

218. Halushka P. V., Rogers R.C., Loadholt C.B., Colwell J.A. Increased platelet thromboxane synthesis in diabetes mellitus.// J. Lab. Clin. Med. 1981. - Vol. 97. -P.87-96

219. Hamilton D.S. and Creighlon D.J. Inhibition of Glyoxalase I by the Enediol Mimic S-(N-Hydroxy-N-methylcarbamoyl)glutation. The possible basis of a tumor-selective anticancer strategy. // J.Biol.Chem. 1992. - Vol.267. - P. 24933-24936

220. Hammes H.-P., Brownlee M., Edelstein D., SaleckM., Martin S., Federlin K. Aminoguanidine inhibits the development of accelerated diabetic retinopathy in the spontaneous hypertensive rat.// Diabetologia 1994. - Vol.37. - P.32 - 35

221. Handelsman D.J. and Turtle J.R. Clinical trial of an aldose reductase inhibitor in diabetic neuropathy. // Diabetes 1981. - Vol.30. - P. 459 - 464

222. Harrison J.E. and Saeed F.A. Acetoacetate is an electron donor to myeloperoxidase and a promoter of myeloperoxidase-catalyzed fatty acid peroxidation.// Biochem. Med. 1981. - Vol.26. - P.339 - 355

223. Harrison J.E. and SaeedF.A. Radical acetoacetate oxidation by myeloperoxidase, Lactoperoxidase, Prostaglandin Synthetase and Prostacyclin Synthetase: Implications for Atherosclerosis.// Biochem. Med. 1983. - Vol.29. - P. 149 -163

224. Hashicya H.L., TakayamaS., WhiteM.F., King G.L. Regulation of insulin receptor internalization in vascular endothelial cells by insulin and phorbol ester.// J. Biol. Chem. 1987. - Vol.262. - P.6417 - 6424

225. Hayashi S. and Nakamura S. Comparison of fungal glucose oxidases. Chemical, physicochemical and immunological studies.//Biochim. Biophys. Acta 1976. -Vol.438.-P.37-48

226. Heard R.D.H. and Ziegler P. Steroids. IX. An improved method of preparation of cholestenone-4-С14.// J. Am.Chem. Soc. 1951. - Vol.73. - P.4036 - 4038

227. Hecht H.J., KaliszH.M., HendleJ., SchmidR.D., Schomburg D. Crystal structure of glucose oxidase from Aspergillus niger refined at 2.3 A resolution.// J. Mol. Biol. 1993. - Vol.229. - P. 153-172

228. Henon M. and DelaunayA. Modification of respiration and carbohydrate metabolism in the polymorphonuclesr leukocytes of diabetic rabbits.// C. R. Acad. Sci. Hebd. Seances. Ser. D 1970. - Vol.271. -P.1420 -1422

229. HeusonJ.C. and Legros N. Effect of insulin and of alloxan Diabetes on growth of the rat mammary carcinoma in vivo.// Eur. J. Cancer 1970. - Vol.6. - P. 349 -351

230. HobaraR., OzcrwaK., OkazakiM., Yasuhara H. Relationship between thiamine and glucose levels in diabetes mellitus.// Japan J. Pharmacol. 1981. - Vol. 31. -P. 1098-1100

231. Hoffman W.S. A rapid photoelectric method for the determination of glucose in blood and urine.//J. Biol. Chem. 1937. - Vol.120. - P.51-55

232. Hofmann J. Modulation of protein kinase С in antitumor treatment.// Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 2001. - Vol.142. - 1 - 96

233. HoltzA.H., van Dreumel H.J., van Campen E.Y. Revision of a method for the determination of high blood glucose values, based on Hagedorn and Jensen Technique.// Clin. Chim. Acta 1961. - Vol.6. - P.467 - 471

234. Hotamisligil G.S., Murray D.L., Choy L.N., Spiegelman B.M. Tumor necrosis factor alpha inhibits signaling from the insulin receptor.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994.- Vol.91. - P.4854 - 4858

235. HuangX., El-SayedI.H., YiX., El-SayedM.A. Gold nanoparticles : catalyst for the oxidation ofNADH to NAD+.// J. Photochem. Photobiol. В.- 2005. Vol.81. - P. 76-83

236. HuiS.-C.G., Ogle C.W., WangZ., An Y., Ни Y.-H. Changes in arachidonic acid metaboloc patterns in alloxan-induced diabetic rats.// Pharmacology 1989. - Vol. 39.-P. 291 -298

237. Huisman T.H.J, and Dozy A.M. Studies on the heterogeneity of hemoglobin-Binding of hemoglobin with oxidized glutathione.// J.Lab.Clin.Med. 1962. -Vol.60.-P. 302-319

238. Jain R.K., Shah S.A. and Finney P.L. Continuous noninvasive monitoring of pH and temperature in rat Walker 256 carcinoma during normoglycemia and hyperglycemia.//J. Natl. Cancer Inst.- 1984.-Vol.73.- P. 429-436

239. Jam D. Insulin-Cancer Relationships: Possible Dietary Implication. // Medical Hypotheses 1992. - Vol.38. - P. 111-117

240. Janssen F. W., Kerwin R.M. and Ruelius H. W. Alcohol oxidase, a novel enzyme from a Basidiomycete.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1965.-Vol.20.1. P.630-634.

241. Janssen F. W. and Ruelius H. W. Alcohol oxidase, a flavoprotein from several Basidiomycetes species. Crystallization by fractional precipitation with polyethylene glycol.// Biochim. Biophys. Acta. 1968. - Vol.151. - P. 330 -342

242. Jehl J., Mayer J. andMcKee R. W. Influence of the hereditary obese-hyperglycemic syndrome and of alloxan Diabetes on the survival of micenwith Ehrlich ascites carcinoma. // Cancer Res. 1955. - Vol.15. - P.341-343

243. Jerzykowski Т., Matuszewski W., Otrzonsek N., Winter R. Antineoplastic Action of Methylglyoxal. // Neoplasma 1970. Vol.17. - P.25-35

244. Johnson R.J., Couser W.G., Alpers C.E. VissersM., SchulzeM., KlebanoffSJ. The human neutrophil serine proteinases, elastase and cathepsin G, can mediate glomerular injury in vivo.// J. Exp. Med. 1988a. - Vol. 168. - P.l 169 - 1174

245. Johnson R.J., Couser W.G., ChilE.Y., AdlerA., KlebanoffSJ. New mechanism for glomerular injury. Mieloperoxidase hydrogen peroxide - halide system. // J. Clin. Invest. - 1987. - Vol.79. - P. 1379 - 1387

246. Jones J.K.N, and Pridham J.B. A colorimetric estimation of sugars using benzidine.// Biochem. J. 1954. - Vol.58. - P.288 - 290

247. Jordan R.E., Nelson R.M., KilpatpickJ., Newgren J.O., Esmon P.C., FournelM.A. Antithrombin inactivation by neutrophil elastase requires heparin. // Amer. J. Med.- 1989. Vol.87. - Suppl. 3B. - P. 18S-22S

248. Jorgensen A.M., Borders C.L., Fish W.W. Arginine residues are critical for the heparin-cofactor activity of antythrombin III. // Biochem. J. 1985. - Vol.231. -P.59-63

249. Joslin E.P. Diabetes in the Future. //Diabetes- 1961.- Vol.10. P. 148-151

250. Kamada Т., Baba Y., Otsuji S. Biochemical changes in membrane related to rheological properties of diabetic erythrocytes.// Monogr. Atheroscler. 1990. -Vol.15.-P. 198-208

251. Kalapos M.P. Methylglyoxal in living organisms. Chemistry, biochemistry, toxicology and biological implications.// Toxicology Letters 1999. - Vol. 110.-P. 145-175

252. Kalapos M.P. Mechanisms Leading to Complications in Diabetes Mellitus: Pathological Role of a-oxoaldehydes.// Biochem. Education. 1992. - Vol.20. - P. 27-29

253. Kalapos M.P. On the promine/retine theory of cell division: now and then.// BiochimBiophysActa 1999.-Vol. 1426,- P.l-16

254. Kalapos M.P. Methylglyoxal toxicity in mammals. // Toxicol Lett. 1994. - Vol. 73 . - P.3 - 24

255. KangJ.H. Modification and inactivation of human Cu,Zn-superoxide dismutase by methylglyoxal. // Mol.Cells 2003. - Vol. 15. - P. 194 - 199

256. Kang Y., Edwards L.G. and Thornalley P.J. Effect of methylglyoxal on human leukaemia 60 cell groth: modification of DNA, G1 growth arrest and induction of apoptosis. // Leukemia Res. 1996. - Vol.20. - P. 397 - 405

257. KanteA., Cherkaoui Malki M., CoquardC., LatruffeN. Metabolic control of the expression of mitochondrial D-beta-hydroxybutyrate dehydrogenase, a ketonebody converting enzyme.// Biochim. Biophys. Acta 1990. - Vol. 1033. - P. 291 -297

258. Kaplan A.P., SilverbergM. and Ghebrehiwet B. The intrinsic coagulation/kinin pathway, the classical complement pathway and their interactions. // Atemwegs und Lungkrankh. 1988. - Vol. 14 - Suppl.l. - P. 37 - 46

259. Kato N., Omori Y, Tani Y., Ogata K. Alcohol oxidases of Kloeckera sp. and Hansenula polymorpha. Catalytic properties and subunit structures. Eur. J. Biochem. 1976. - Vol.64. - P. 341 - 350

260. Kaubisch A. and Schwartz G.K. Cyclin-dependet kinase and protein kinase С inhibitors: a novel class of antineoplastic agents in clinical development. // Cancer J. 2000,-Vol.6.-P.192-212

261. Kawamura N, Ookawara T, Suzuki K, Konishi K, Mino M, Taniguchi N. Increased glycated Cu,Zn-superoxide dismutase levels in erythrocytes of patients with insulin-dependent diabetis mellitus.// J. Clin. Endocrinol. Metab. 1992. - Vol. 74.- P. 1352 - 1354

262. Kawamura Т., Suzuki K, Matsumae H., Sano Т., Sakomoto N., Hotta N. Effects of glucose and SNK-860, an aldose reductase inhibitor, on polyol pathway and chemiluminescence response of human neutrophils in vitro. // Diabet. Med. -1995.- Vol.12.-P. 392-396

263. Kazer R.R. Insulin resistance, insulin-like growth factor I and breast cancer: a hypothesis. // Int. J. Cancer 1995. - Vol.62. - P.403 - 406

264. KeeganA., WalbankH., CotterM.A., Cameron N.E. Chronic vitamin E treatment prevents defective endothelium-dependent relaxation in diabetic rat aorta. // Diabetologia 1995. - Vol. 38. - P. 1475 - 1478

265. Keilin D. and Hartree E.F. Specifity of glucose oxidase (Notatin). // Biochem. J. -1952.-Vol. 50.-P. 331 -341

266. Keilin D. and Hartree E.F. Properties of glucose oxidase (Notatin). // Biochem. J. 1948,- Vol. 42.-P. 221 -229

267. KellerH.U., HunzikerI.P., SordatB., Niggli V., SrokaJ. Protein Kinase С Isoforms Involved in Regulation of Cell Shape and Locomotion of Human Fibrosarcoma HT 1080 Cells. // Int. J. Cancer 2000. - Vol. 88. - P. 195-203

268. Kemp A. and Mendel В. How does the Ehrlich ascites tumour obtain its energy for«•, lit ■( .growth? // Nature 1957. - Nr. 4577. - P. 131 - 132

269. Keogh R.J., Dunlop M.E., Larkins R.G. Effect of inhibition of aldose reductase on glucose flux, diacylglycerol formation, protein kinase C, and phospholipase A2 activation.// Metabolism-1997.-Vol. 46. P. 41-47

270. KesslerLI. Cancer and Diabetes mellitus a review of the literature. // J. Chron. Dis. - 1971. - Vol.23. - P. 579 - 600

271. KiessM., Hecht H.J. andKalisz H.M. Glucose oxidase from Penicillium amagasakiense. Primary structure and comparison with other glucose-methanol-choline (GMC) oxidoreductases. // Eur J Biochem. 1998. - Vol.252. - P. 90 - 99

272. Kim J.A., Berliner J.A., Natarajan R.D., NadlerJ.L. Evidence that glucose increases monocyte binding to human aortic endothelial cells.// Diabetes 1994. -Vol. 43.-P. 1103-1107

273. Kinoshita J.H., Kador P. andCatilesM. Aldose reductase in diabetic cataracts. // JAMA-1981.-Vol.246.- P. 257-261

274. Khan Z.A., Barbin Y.P., Farhangkhoee H., BeierN., Scholz W., Chakrabarti S. Glucose-induced serum- and glucocorticoid-regulated kinase activation inoncofetal fibronectin expression.// Biochim. Biophys. Res. Comm. 2005. - Vol. 329.-P. 275-280

275. Kolb P. Das Problem der Syntropie von Diabetes und Carcinom. // Z. Krebsforsch. 1956. -Bd.61. - .S. 81 -91

276. Kondoh Y., KawaseM., Kawakami Y., OhmoriS. Concentrations of D lactate and its related metabolic intermediates in liver, blood and muscle of diabetic and starved rats. // Res. Exp. Med. - 1992. - Vol. 192. - P. 407 - 414

277. Koya D. and King G.L. Protein kinase С activation and the development of diabetic complications. // Diabetes 1998. - Vol.47. - P. 859 - 866

278. Koya D., Lee I.K., Ishii H., Kanoh #., King G.L. Prevention of glomerular dysfunction in diabetic rats by treatment with d-alpha-tocopherol. // J. Amer. Soc. Nephrology 1997. - Vol.8. - P. 426 - 435

279. Krag D.N., Storm F.K. and Morton D.L. Induction of transient hyperglycaemia in cancer patients. // Int. J. Hyperthermia 1990. - Vol.6. - P. 741-744

280. KunisakiM., Fumio U., Nawata H., King G.L. Vitamin E normalizes diacylglycerol-protein kinase С activation induced by hyperglycemia in rat vascular tissues. // Diabetes 1996. - Vol. 45. - Suppl. - P. 117S-119S

281. De 'Martinez S.G. and Green C. The action of cholesterol oxidase on cholesterol in vesicles and micelles proceedings. // Biochem. Soc. Trans. 1979. - Vol.7. - P. 978-979

282. Ma D. Recent advances in the discovery of protein kinase С modulators based on the structures of natural protein kinase С activators. // Curr. Med. Chem. 2001. -Vol.8.-P. 191-202

283. O'Malley J.J. and Weaver J.L. Subunit structure of glucose oxidase from Aspergillus niger. // Biochemistry. 1972. - Vol.11. - P. 3527 - 3532

284. Malinauskas A.A. and Kulys J.J. Preparation of high-molecular-weight NAD derivatives using cyanuric chloride. // Biotechnol. Bioeng. 1978. - Vol.20. - P. 769-772

285. Malinowski D.P. andFridovich I. Chemical modification of arginine at the active site of the bovine erythrocyte superoxide dismutase.// Biochemistry 1979. -Vol.18.-P. 5909-5917

286. MallickL., Banerjee S.K. and Shrivastava G.C. Effects of glucose feeding on tumour development in vivo. // Br.J Cancer 1968. - Vol. 22. - P. 110-115

287. O'Mara В., Byers Т., SchoenfeldE. Diabetes mellitus and cancer risk: a multisite case-control study. // J. Chron. Dis. 1985. - Vol.38. - P. 435 - 441

288. Matkovics В., Varga S.I., Szabo L., Witas H. The effect of diabetes on the activities of the peroxide metabolism enzymes.// Horm. Metabol. Res.- 1982. Vol.14. -P. 77-79

289. Matsubara N., Fuchimoto S. and Orita K. Differing roles of protein kinase С on the antiproliferative effects of tumor necrosis factor alpha and beta on LoVo cells.// Pathobiology 1990.-Vol.58. - P. 168-171

290. McGuinness E.T., Brown H.D., Chattopadhyay S.K., ChevF. Cholesterol oxidase: thermochemical studies and the influence of hydroorganic solvents on enzyme activity.// Biochim. Biophys. Acta 1978.- Vol. 530. - P. 247 - 257

291. McLellan A.C., Phillips S.A. and Thornalley P.J. The assay of methylglyoxal in biological systems by derivatization with l,2-diamino-4,5-dimethoxybenzene. // Anal.Biochem. 1992. - Vol.206. - P. 17- 23

292. McLellan A.C., Thornalley P.J., BennJ., Sonksen P.H. Glyoxalase system in clinical diabetes mellitus and correlation with diabetic complications. // Clin. Science 1994. - Vol. 87. - P. 21 -29

293. Medina R.A. and Owen G.I. Glucose transporters: expression, regulation and cancer.// Biol. Res. 2002. - Vol. 35. - P. 9 - 26

294. Medina R.A., Soulhworlh R., Fuller W., GarlickP.B. Lactate-induced translocation of GLUT 1 and GLUT4 is not mediated by the phosphatidyl-inositol-3-kinase pathway in the rat heart. // Basic Res Cardiol. 2002. - Vol. 97. - P. 168176

295. Mehler A.H. Formation of picolinic and quinolinic acids following enzymic oxidation of 3-hydroxyanthranilic acid.// Science 1954. - Vol.120. - P. 1043 -1044

296. Meiattini F. Process for the enzymatic determination of glucose with a glucose oxidase / peroxidase enzyme system.// USA Patent Re 29498 (CI. 195-103.5), 1977

297. Meinhardt G., Roth J. and Totok G. Protein kinase С activation modulates pro- and anti-apoptotic signaling pathways. // Eur. J. Cell Biol. 2000. - Vol. 79. - P. 824 -833

298. Milanesa D.M., Choudhury M.S., Mallouh C., TazakiH., KonnoS. Methylglyoxal-induced apoptosis in human prostata carcinoma: potencial modality for prostata cancer treatment.// Eur. Urol. 2000. - Vol.37. - P. 728 - 734

299. Milligan L.P., Baldwin R. L. The conversion of acetoacetate to pyruvaldehyde. // J. Biol. Chem. 1967.-Vol.242.-P. 1095- 1101

300. Miner-Williams W. Surfactant inhibition of cholesterol oxidase.// Clin. Chim. Acta., 1980., Vol.101.-P. 77-84

301. Mink P J., Shahar E., Rosamond W.D., AlbergAJ., FolsomA.R. Serum insulin and glucose levels and breast cancer incidence: the atherosclerosis risk in communities study.// Am. J. Epidemiol. 2002. - Vol. 156. - p. 349 - 352

302. Miyawaki O. and Yano T. Elecrochemical bioreactor with regeneration of NAD+ by rotating graphite disk electrode with PMS adsorbed. // Enzyme Microb. Technol. 1992. - Vol. 14. - P. 474 - 478

303. MoniaB.P., HolmlundJ. and Dorr F.A. Antisense approaches for the tratment of cancer. // Cancer Invest. 2000. - Vol. 18. - P. 635 - 650

304. Monier V.M. and Cerami A. Nonenzymatic browning in vivo& possible process for aging of long-lived proteins. // Science 1981. - Vol.211. - P. 491- 493

305. Moore N.F., PatzerE.J., Barenholz Y., Wagner R.R. Effect of phospholipase С and cholesterol oxidase on membrane integrity, microviscosity, and infectivity of vesicular stomatitis virus.// Biochemistry 1977. - Vol. 21. - P. 4708 - 4715

306. Morinelli Т., TempelG.E., Jaffa A.A., Silva R.H., NakaM., Folger W., Halushka P. V. Thromboxane A/prostaglandin H2 receptors in streptozotocin-induced diabetes: effects of insulin therapy in the rat.// Prostaglandins 1993.-Vol.45.-P.427 -438

307. Mota de Freitas D. and Valentine J.S. Phosphate is an inhibitor of copper-zinc superoxide dismutase.//Biochemistry 1984. - Vol.23. - P. 2079-2082

308. Motteran L, Pilone MS, Molla G, Ghisla S, Pollegioni L. Cholesterol oxidase from Brevibacterium sterolicum. The relationship between covalent flavinylation and redox properties.// J.Bio. Chem. -2001. Vol. 276. - P. 18024 - 18030

309. Moulinoux J.Ph., Quemener V. and Khan N.A. Biological significance of circulating polyamines in oncology. II Cell Mol. Biol. 1991, - Vol. 37. - P. 773 -783

310. Mowat A.G. and BaumJ. Chemotaxis of polymorphonuclear leukocytes from patients with diabetes mellitus. // N. Engl. J. Med. 1971. - Vol.284. - P.621 -627

311. Mukhopadhyay L., Ray J. Das S., Bhaitacharya P.K., Moulik S.P. Water-induced precipitation of cholesterol dissolved in organic solvents in the absence and presence of surfactants and salts. // Indian J. Biochem. Biophys.- 1989. Vol.26. -P. 178- 185

312. Murata-Kamiya N., Kamiya H., Kaji H., Kasai H, Methylglyoxal induces G:C to C:G and G:C to T:A transversions in the supF gene on a shuttle vector plasmid replicated in mammalian cells.// Mutat. Res.- 2000. Vol.468. - P. 173 - 182

313. Nakagawa Т., Mizumura Т., Mukaiyama H., Miyaji Т., Yurimoto H., Kato N., Sakai Y., Zomizuka N. Physiological role of the second alcohol oxidase gene MOD2 in the methylotrophic growth of Pichia methanolica. II Yeast 2002. - Vol. 19. - P. 1067-1073

314. Nakaminami Т., Ito S., Kuwabata S. and YoneyamaH. Electrochemical oxidation of cholesterol catalyzed by cholesterol oxidase with use of an artificial electron mediator.// Anal. Chem. 1997. - Vol.69. - P. 2367 - 2372

315. Nakamura K, Shinozuka K., KunitomoM. Suppressive effect of protein kinase С inhibitors on tumor cell function via phosphorylation of p53 protein in mice /Abstract/. // Yakugaku Zasshi 2000. - Vol. 120. - P. 1387-1394

316. Nakamura S., Hayashi S. and Koga К Effect of periodate oxidation on the structure and properties of glucose oxidase. // Biochim Biophys Acta. 1976. -Vol. 445. -P. 294 - 308

317. Nakamutsu Т., Acamatsu Т., Miyajima R., Shiio J. Microbiological production of glucose oxidase. // Agric. Biol. Chem. 1975. - Vol.39. - P. 1803 - 1811

318. NathM.C and Brahmankar D.M. Effect of acetoacetat on blood coagulation in rabbits and its prevention. // Am. J. Physiol. 1962. - Vol.202. - P. 545 - 546

319. Nath N., ChariS.N. and RathiA.B. Superoxide dismitase in diabetic polymorphonuclear leukocytes. // Diabetes 1984. - Vol.33. - P. 586 - 589

320. NauseefW.V., Volpp B.D., McCormick S., Leidal K.G., Clark R.A. Assembly of the neutrophil respiratortic and diabetic patients.// J. Lab. Clin. Med. 1971. - Vol. 78.-P. 158-166

321. Nelson N. A photometric adaptation of the Somogy method for the determination of glucose. // J. Biol. Chem. 1944. - Vol.153. - P. 375 - 380

322. Nelson R.D., McCormackR.T., Fiegel V.D., SimmonsR.L. Chemotactic deactivation of human neutrophils: Evidence for nonspecific and specific components.// Infect. Immun. 1978. - Vol.22. - P. 441 - 444

323. Nikolin B, Imamovic B, Medanhodzic-Vuk S, SoberM. High performance liquid chromatography in pharmaceutical analyses. // Bosn. J. Basic. Med. Sci. 2004. -Vol.4.-P. 5-9

324. Nilson H., Arerlund A.C. and Mosbach K. Determination of glucose, urea & penicillin using enzyme-pH-electrode.// Biochim. Biophys. Acta 1973. - Vol. 320.-P. 529-534

325. Nolan C.M., Beaty H.M. and Bagdade J.D. Further characterization of impaired bactericidal function of granulocytes in patients with poorly controlled diabetes.// Diabetes 1978. - Vol.27. - P. 889 - 894

326. Nutt J.E., Harris A.L. and Lunec J. Phorbol ester and biyostatin effects on growth and the expression of oestrogen responsive and TGF-B1 genes in breast tumor cells.// Br. J. Cancer 1991. - Vol.64. - P. 671 - 676

327. О 'Neill P., Davies S., Fielden E.M., Calabrese L., Capo C., Marmocchi F., Natoli G., Rotilio G. The effect of pH and various salts upon the activity of a series of superoxide dismutases.// Biochem. J. 1988. - Vol. 251. - P. 41 - 46

328. Oberley L. W. Free radicals and diabetes.// Free Rad. Biol. Med. 1988. - Vol.5. -P. 113 - 124

329. Oldenborg P.A and Sehlin J. Effects of D-glucose on chemokinesis and resting production of reactive oxygen species in neutrophil granulocytes of lean or obese-hyperglycemic mouse. // Biosci Rep. 1997.- Vol.17. - P. 487 - 498

330. Oldenborg P.A. Effects of insulin on N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (fMet-Leu-Phe)-stimulated production of reactive oxygen metabolites from normal human neutrophils.// Inflamm Res. 1999. - Vol.48. - P. 404 - 411

331. Oldenborg P.A., Sundqvist I.M. and Sehlin J. Different effects on extracellular and intacellular respiratory burst response in normal human neutrophils activated with the soluble agonist fMet-Leu-Phe.// Diabetic Med. 2000. - Vol.17. - P. 532 -537

332. Osinsky S.P., Evtishenko G. V., Annin E.A., Bubnovskaja L.N. Induced hyperglycemia and tumor chemotherapy: experimental and clinical studies.// Med. Oncol. Tumor Pharmacother. 1990. - Vol. 7. - P. 249 - 256

333. Osinsky S., Bubnovskaja L. and Sergienko T. Tumor pH under induced hyperglycemia and efficacy of chemotherapy. // Anticancer. Res. 1987. - Vol. 7. - P. 199 -201

334. Osinsky S., Protsyk V., GusevA., Bubnovskaja L., Cheremnych A. Hyperthermia and hyperglycemia in the tumors therapy. // Adv. Exp. Med. Biol. 1990a. - Vol. 267.-P. 457-462

335. PangL., GrazianoM. & WangS. Membrane cholesterol modulates galanin-GaIR2 interaction. // Biochemistry 1999. - Vol.38. - P. 12003 - 12011

336. PatzerE.J. and Wagner R.R. Cholesterol oxidase as a probe for studying membrane organisation. // Nature 1978. - Vol.274. - P. 394 - 395

337. Pavelic J., Benkovic B. andPavelic K. Growth and treatment of B-16 melanoma in hyperglycemic mice.// Res. Exp. Med. 1980. - Vol.177. - P. 71 - 78

338. Pavelic K. Aplastic carcinoma in diabetic mice: hyperglycemia-suppressed proliferation rate and insulin synthesis by tumor cells. // J. Natl. Cancer Inst. -1979.-Vol. 62.-P. 139-141 ^

339. Pavelic K., Slijepcevic M., Pavelic J., IvicJ., Audy-Jurkovic S., Pavelic Z.P., BoranicM. Growth and treatment of Ehrlich tumor in mice with alloxan-induced. //Diabetes. Cancer Res. 1979. - Vol. 39. - P. 1807 - 1813

340. PazurJ.H., Kleppe K. and Cepure A. A glycoprotein structure for glucose oxidase from Aspergillus niger. // Arch Biochem Biophys. 1965. - Vol. 111. - P. 351357

341. Pecsvarady Z., Fisher T.C., Darwin C.H., FabokA., Maqueda T.S., SaadM.F., Meiselman H.J. Decreased polymorphonuclear leukocyte deformability in NIDDM. // Diabetes Care 1994. - Vol. 17. - P. 57 - 63

342. Pemberton P.A., Harrison R.A., Lachmann P.J., CarrellR.W. The structural basis for neutrophil inactivation of CI-inhibitor.// Biochem. J. 1989. - Vol. 258. - P. 193 -198

343. PeynetJ., Canal J., DelattreJ., RousseletF., GirardM.L. Study of the specificity of action of cholesterol oxygen oxidoreductase on various sterols and related substances. // Ann. Biol. Clin. (Paris) 1976. - Vol.34. - P. 19-26

344. Philip P.A. and Zonder J.A. Pharmacology and clinical experience with bryostatin 1: a novel anticancer drug. // Expert. Opin. Investig. Drugs 1999. - Vol.8. - P. 2189-2199

345. Phillips S.A. and Thornalley P. J. The formation of methylglyoxal from triose phosphates. Investigation using a specific assay for methylglyoxal. // Eur. J. Biochem.- 1993.-Vol. 212.-P. 101 -105

346. Pirags V., Assert R., Haupt K., Schatz H., PfeijferA. Activation of human platelet protein kinase C-beta 2 in vivo in response to acute hyperglycemia.// Exper. Clin. Endocrinol. Diabetes 1996. - Vol.104. - P. 431-440

347. PiwowarA., Knapik-Kordecka M. and WarwasM. Concentration of leukocyte elastase in plasma and polymorphonuclear neutrophil extracts in type 2 diabetes.// Clin. Chem. Lab. Med. 2000. - Vol. 38. - P. 1257 - 1261

348. Pollegioni L., Wels G., PiloneM.S., Ghisla S. Kinetic mechanisms of cholesterol oxidase from Streptomyces hygroscopicus and Brevibacterium sterolicum. II Eur. J. Biochem. 1999. - Vol. 264. - P. 140-151

349. Pontremoli S., MichettiM., Melloni E., Sparatore В., Salamino F., Horecker B.L. Identification of the proteolytically activated form of protein kinase С in stimulated human neutrophil. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990. - Vol.87. - P. 3705 -3707

350. Procaccini R.L., DeFanti D.R. and Defeo J.J. Inhibition of in vitro histone acetylation in a cell free rat uterine system by methylglyoxal and phenylglyoxal.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1971. - Vol. 43. - P. 684 - 687

351. Prograis L.J., Hammer C.H., KatushaK., Frank M.M. Purification ofCl inhibitor. A new approach for the isolation of this biologically important plasma protease inhibitor. // J. Immunol. Meth. 1987. - Vol. 99. - P. 113 -122

352. Puckett C.L., Shingleton W.W. The effect of induced diabetes on experimental tumor growth in mice.// Cancer Res. 1972. - Vol. 32. - P. 789 - 790

353. QuastelM., Harrison R., CicardiM., Alper C.A., Rosen F.S. Behavior in vivo of normal and dysfunctional С1-Inhibitor in normal subjects and patients with hereditary angioneurotic edema.// J. Clin. Invest. 1983. - Vol. 71. - P. 1041 -1046

354. Ragozzino M., Melton L.J. III, Chu C.P., Palumbo P.J. Subsequent cancer risk in the incidence cohort of Rochester, Minnesota, residents with diabetes mellitus.// J. Chronic Dis. 1982. - Vol. 35. - P. 13 - 19

355. Rajagopalan S. Serious infections in elderly patients with diabetes mellitus.// Clin. Infect. Dis. 2005. - Vol.40. - P. 990 - 996

356. Ramasamy R., Oates P.J. and SchaeferS. Aldose reductase inhibition protects diabetic and nondiabetic rat hearts from ischemic injury. // Diabetes 1997. -Vol.46.-P. 292-300

357. Rao K.M., Hatchell D.L., Cohen H.J., DelapazM.A. Alterations in stimulus-induced integrin expression in peripheral blood neutrophils of patients with diabetic retinopathy.// Amer. J. Med. Sci. 1997. - Vol.313. - P. 131 - 137

358. ReboulA., PrandiniM.-N. andColomb M.G. Proteolysis and deglycosylation of human CI-inhibitor. Effect on functional properties.//Biochem. J. 1987. - Vol. 244.-P. 117-121

359. Reid V.W. and Salomon D.G. Analyst 1955. - Vol.80. - P. 704 - 710

360. Reiffen K.A. and Schneider F. A comparative Study on Proliferation, Macromolecular Synthesis and Energy Metabolism of in Vitro-Growth Ehrlich

361. Ascites Tumor Cells in the Presence of Glicosone, Galactosone and Methylglyoxal. // J. Cancer Res. Clin. Oncol. 1984. - Vol.107. - P. 206 - 210

362. Renshaw P.F., JanoffA.S. and Miller K. W. On the nature of dilute aqueous cholesterol suspensions.// J. Lipid Res. 1983. - Vol. 24. - P. 47 - 51

363. Repine J.E., Clawson C.C. and Goetz F.C. Leukocyte and host defense. Bactericidal function of neutrophils from patients with acute bacterial infections and from diabetics.// J. Infec. Dis. 1980. - Vol. 142. - P. 869 - 875

364. Rhomberg W. II Metastasierendes Mammakarzinom und Diabetes mellitus eine prognostisch guenstige Krankheitskombination.// Deutsch. Med. Wochenschrift -1975.-Bd.100.-S. 2422-2427

365. Richmound W. Use of cholesterol oxidase for assay of total and free cholesterol in serum by continuous-flow analysis.// Clin. Chem. 1976. - Vol. 22. - P. 1579 -1588

366. RiordanJ.F., McElvany K.D. and Borders C.L. Arginyl residues: anion recognition sites in enzymes. // Science 1977. - Vol.195. - N.4281. - P. 884 -886

367. Ritter C.A. and Arteaga C.L. The epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase: a promising therapeutic target in solid tumors.// Semin Oncol. 2003. -Vol. 30. - Suppl.l. - P. 3-11

368. Rockstroh H. und Schroter H. Die Haufigleit des Krebses beim Diabetes mellitus. // Munch. Med. Wochenschrift -1961. Heft 18. - S. 897 -901

369. Roggenkamp R., SahmH., Hinkelmann W., Wagner F. Alcohol oxidase and catalase in peroxisomes of methanol-grown Candida boidinii. II Eur J Biochem. -1975.- Vol.59.-P. 231-236

370. Roschau P., Bernt E.,Gruber W. Methods of Enzymatic Analysis, vol. 4 / Ed. Bergmeyer H.U. New York; San Francisco, London: Verlag Weinheim, Acad. Press Inc., 1974.-P: 1890-1893.

371. Rosenberg D.J., NeugutA.I., Ahsan H., Shea S. Diabetes mellitus and the risk of prostate cancer. // Cancer Invest. 2002. - Vol.20. - P. 157 - 165

372. Saltsman K.A., Ohashi H. and King G.L. Activation of protein kinase С by elevation of glucose concentration: proposal for a mechanism in the development of diabetic vascullar complications. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991. -Vol.88. - P. 9907

373. Sahm H. and Wagner F. Microbial assimilation of methanol. The ethanol- and methanol-oxidizing enzymes of the yeast Candida boidinii. И Eur J Biochem. -1973.-Vol. 36.-P. 250-256

374. Sakanoue Y., Hatada Т., KusunokiM., Yanagi H., Yamamura Т., Utsunomiya J. Protein Kinase С Activity as Marker for Colorectal Cancer. // Int. J. Cancer -1991.-Vol.48.-P. 803-806

375. Salvesen G.S., Catanese J.J., Kress L.F., Travis J. Primary structure of the reactive site of human Cl-inhibitor. // J. Biol. Chem., 1985. - Vol. 260. - P. 2432 -2436

376. Salzberg D. and Griffin A.C. Inhibition of azo dye carcinogenesis in the alloxan-diabetic rat. // Cancer Res. 1952. - Vol.12. - P. 294

377. Sampson N.S. Dissection of a flavoenzyme active site: the reaction catalyzed by cholesterol oxidase. // Antioxid Redox Signal. 2001. - Vol.3. - P. 839 - 846

378. Sane R.T., KamatS.S. and, Pandit A.D. Colorimetric method for determination of ethanol in presence of methanol. // J. Assoc. Anal. Chem., -1981. Vol.64. - P. 1145-1148

379. Sato A., Tamura R. and Shira T. Diabetes mellitus with intractable bacterial infections. // Abstracts. Nippon-Rinsho 1994. - Vol.52. - P. 389 - 394

380. Saunders N. A., Popa C., Serewko M.M., Jones S.J., Dicker A.J., DahlerA.L. Histone deacetylase inhibitors: novel anticancer agents. /7 Expert Opin. Investig, Drugs- 1999.-Vol.8. P.1611 - 1621

381. Schechter I. and BergerA. On the active site of proteases. Papain. // Biochem. Biophys. Res. Comm. -1967. Vol. 27. - P. 157 - 162

382. Scheim D.E. and LinJ.Y. Glucose effects in an ovarian cancer protocol of exceptional activity. // Med. Hypotheses 1993. - Vol.40. - P. 235 - 244

383. Schinder S.L., Kohn R.R. Glycosylation of human collagen in aging and diabetes mellitus. // J. Clin.Invest. 1980. - Vol. 66. - P. 1179 - 1181

384. Schmor G. Blutzuckerbestimmung mit Thymol-Schwefelsaure.// Klin. Wschr. -1955.-Bd. 33.-S. 449-450

385. Schumm D.E. and Matthews R.H. Diabetes and cancer: a postulated relationship. // Medical Hypotheses 1979. - Vol. 5. - P. 1353 - 1361

386. Schut N.H., van Arkel E.C., Hardeman M.R., Bilo H.J.G., Michels R.P.J., Vreeken J. Blood and Plasma viscosity in diabetes: possible contribution to late organ complications. // Diabet. Res. 1992. - Vol. 19. - P.31 - 35

387. Schutgens R.B., Awie C.T., Beemer F.A., Berntssen W.J. Rapid enzymic micromethod for the quantitative determination of L(+)alanine in blood and urine.// Clin Chim. Acta. 1977. - Vol. 80. - P. 1-5

388. Seifert G. and Eichler R. Statistischer Beitrag zur Syntropie von Diabetes mellitusund Carcinom. // Z. Krebsforsch. 1954. - Bd. 60. - S. 200 - 209

389. Shah S. V., Baricos W.H., BasciA. Degradation of human glomerular basementmembrane by stimulated neutrophils. // J. Clin. Invest. 1987. - Vol. 79. - P. 25 31

390. Shapiro R., Cohen B.I., Shiuey S.J., Maurer H. On the reaction of guanine with glyoxal, pyruvaldehyde, and kethoxal, and the structure of the acylguanines. A new synthesis of N2-alkylguanines. // Biochemistry 1969. - Vol.8. - P. 238-245

391. Shen G.X. Selective protein kinase С inhibitors and their applications. // Curr. Drug- Targets Cardiovasc. Haematol. Disord. 2003. - Vol.3. - P. 301 - 307

392. Simmons D.A. and WinegradA.I. Elevated extracellular glucose inhibits an adenosine-(Na+,K+)-ATPase regulatory system in rabbit aortic wall.// Diabetologia -1991.-Vol. 34.-P. 157-163

393. Sims T.J., Rasmussen L.M., OxlundH., BaileyA.J. The role of glycation crosslinks in diabetic vascular stiffening.// Diabetologia -1996. Vol.39. - P. 946 -951

394. Smith A.G. and Brooks CJ. Studies of the substrate specificity of cholesterol oxidase from Nocardia erythropolis in the oxidation of 3-hydroxy steroids. // Biochem. Soc. Trans. 1975. - Vol. 3. - P. 675 - 677

395. Smith A.G. and Brooks C.J.W. Cholesterol oxidase: properties and applications.// J. Steroid. Biochem. 1976. - Vol. 7. - P. 705 - 713

396. Smith A.G. and Brooks C.J.W. The substrate specificity and stereochemistry, reversibility and inhibition of the 3-oxo steroid delta 4-delta 5-isomerase component of cholesterol oxidase.// Biochem.J. 1977. - Vol. 167. - P. 121 -129

397. Smith M.D. and Olson C.L Differential amperometric determination of alcohol in blood or urine using alcohol dehydrogenase. // Anal. Chem. 1975. - Vol. 47. - P. 1074 - 1077

398. SneiderM.B., Matsuzaki H., HaorahJ., UlrichA., StandopJ., DingX.Z., Adrian Т.Е. Pour P.M. Prevention of pancreatic cancer induction in hamsters by metformin. // Gastroenterology 2001. - Vol. 120. - P. 1263 - 1270

399. Solomon B. and Levin Y. Flavin-protein interaction in bound glucose oxidase. // J. Solid-Phase Biochem. 1976. - Vol.1. - P. 159 - 171

400. Solomon В., Lotan N., Katchalski-Katzir E. Enzymatic activity and conformational properties of native and crosslinked glucose oxidase.// Biopolymers 1977. -Vol.16.-P. 1837- 1852

401. Soni N. MeropolNJ., PorterM, CaligiuriM.A. Diabetes mellitus induced by low-dose interleikin-2. // Cancer Immunol Immunother. -1996. Vol. 43. - P. 59 -62

402. Stankovich M. Т., Schopfer L.M., Massey V. Determination of glucose oxidase oxidation-reduction potentials and the oxygen reactivity of fully reduced and semiquinoid forms. // J. Biol. Chem. 1978. - Vol. 253. - P. 4971 - 4979

403. Stehouwer C.D and Schaper N.C. The pathogenesis of vascular complications of diabetes mellitus: one voice or many? // Eur. J. Clin. Invest. 1996. - Vol. 26. -P. 535 - 543

404. Stroes G.A. and, Zondag H.A. Some experience with a colorimetric method for the determination of glucose in biological Fluids.// Clin. Chim. Acta 1963. - Vol. 8. -P. 152-154

405. Sun Y., Oberley L. W.t Li Y.A. Simple method for clinical assay of superoxide dismutase.// Clin. Chem.,- 1988. Vol. 34. - P. 497 - 500

406. Suzuki K., Kawamura Т., Sakakibara F., Sasaki H., Sano Т., Sakomoto N., Hotta N. Effect of aldose reductase inhibitors on glucose-induced changes in sorbitol and myo-inositol metabolism in human neutrophils.// Diabetics. Med. 1999. -Vol.16. - P.67-73

407. Svensson K., Zeidman R., Troller U., SchultzA., Larsson C. Protein kinase С betal is implicated in the regulation of neuroblastoma cell growth and prolifiration.// Cell Growth Differ. 2000. - Vol. 11. - P. 641 - 648

408. Swoboda B.E. and Massey V. Purification and properties of the glucose oxidase from Aspergillus niger.// J. Biol. Chem. 1965. - Vol. 240. - P. 2209 - 2215

409. Szent-Gyorgy A., EgyudL.G., McLaughlin J.A. Keto-Aldehydes and Cell Division. Glyoxal derivatives may be regulators of cell division and open a new approach to cancer.// Science 1967. - Vol.155. - P. 539 - 541

410. Takahashi K. The reactions of phenylglyoxal and related reagents with amino acids.// J. Biochem (Tokyo) 1977. - Vol. 81. - P. 395 - 402

411. Takayama K., NakanoM., ZinnerK., Vidigal C.C., DuranN., Shimizu Y., Ciloento G. Generation of electronic energy in the myoglobin-catalyzed oxidation of acetoacetate to methylglyoxal. // Archives Biochem. Biophys. 1976. - Vol. 176. -P. 663-670

412. Tan J.S, Anderson J.L., Watanakunakorn С., Phair J.P. Neutrophil dysfunction in diabetes mellitus. //J. Lab. Clin. Med. 1975. - Vol. 85. - P. 26 - 33

413. Tengborn L., Frohm В., Nilsson L.E., Nilsson I.M. Antithrombin III concentrate: its catabolism in health and in antithrombin III deficiency. // Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1981. - Vol.41. - P. 469-477

414. Thevenot D.R., TothK., Durst R.A., Wilson G.S. Electrochemical biosensors: recommended definitions and classification. // Biosens Bioelectron. 2001. - Vol. 16.-P. 121-131

415. Thomas L.C. and Cristian G.D. Voltammetric measurement of reduced nicotinamide-adenine nucleotides and application to amperometric measurement of enzyme reactions.// Anal Chim Acta.- 1975. Vol. 78. - P. 271 - 276

416. Thornalley P.J. The Glyoxalase System in Health and Disease. // Molec. Aspects Med. 1993. - Vol. 14. - P. 287 - 371

417. Thornalley P. J. Methylglyoxal, Glyoxalases and the Development of Diabetic Complications.// Amino Acids 1994. - Vol.6. - p. 15-23

418. Thornalley P.J., Hooper N.I., Jennings P.E., Florkowski C.M., Jones A.F., Lunec J., Barnett A.H. The human red blood cell glyoxalase system in diabetes mellitus.// Diabetes Res. Clin. Pract. 1989. - Vol.7. - P. 115 - 120

419. Thornally P.J., LangborgA., Minhas H.S. Formation of glyoxal, methylglyoxal and 3-deoxyglucosone in the glycation of proteins by glucose. // Biochem. J. -1999.-Vol. 344.-P. 109-116

420. Thornton G.F. Infections and diabetes.// Med. Clin. North. Amer. 1971. - Vol. 55.-P. 931 -938

421. Thurnhofer H, Gains N, Mutsch B, Hauser H. Cholesterol oxidase as a structural probe of biological membranes: its application to brush-border membrane. // Biochim. Biophys. Acta 1986. - Vol.856. - P. 174 - 181

422. Torstensson A., Johansson G. Anal. Lett.,- 1980. Vol. 13. - P. 837 - 840

423. TosiM., Duponchel C., Bourgarel P., ColombM., Meo T. Molecular cloning of human CI-Inhibitor: sequence homologies with alpha- 1-antitripsin and other numbers of the serpins superfamily. // Gene 1986. - Vol. 42. - P. 265 - 272

424. TsaiJ.H., Hsieh Y.S., KuoSJ., ChenS.T., YuS.Y., HuangC.Y., ChangA.C., Wang Y.W., TsaiM.T., LiuJ.Y. Alteration in the expression of protein kinase С isoforms in human hepatocellular carcinima.// Cancer Lett. 2000. - Vol 161.-P. 171 -175

425. Tsavaris N.B., Pangalis G.A., Variami E., Karabelis A., Kosmidis P., Raptis S. Association of neutrophil alkaline phosphatase activity and glycosylated haemoglobin in diabetes mellitus.// Acta Haemat. 1990. - Vol. 83. - P. 22 - 25

426. Tsuge К, Natsuaki О., OhashiK. Purification, properties, and molecular features of glucose oxidase from Aspergillus niger. // J. Biochem., (Tokyo) 1975. - Vol. 78.-P. 835-843 1

427. UchidaK., KhorO.T., Oya Т., О saw а Т., Yasuda Y., Miyata T. Protein modification by a Maillard reaction intermediate methylglyoxal. Immunochemical detection of fluorescent 5-methylimidazolone derivatives in vivo.// FEBS Lett.-1997.-Vol. 410.-P. 313-318

428. Umpierrez G.E., KhajaviM., Kitabchi A.E. Diabetic ketoacidosis and hyperglycemic hyperosmolar nonketotic syndrome. // Amer. J. Med. Sci. 1996. -Vol. 311.-P. 225-233

429. Urano M., Kim M.S. Effect of hyperglycemia on thermochemotherapy of a spontaneous murine fibrosarcoma.// Cancer Res. 1983. - Vol.43. - P. 3041 -3044

430. Updike S.J. & Hicks G.P. Reagent loss substrate analysis with immobilized enzymes.// Science 1967. - Vol. 158. - P. 279 - 272

431. Vaca C.E., Fang J.L., ConradiM., Hou S.M. Development of a 32p-p0stlabelling method for the analysis of 2'-deoxyguanosine-3'-monophospate and DNA adducts of methylglyoxal.//Carcinogenesis 1994. - Vol. 15. - P. 1887 - 1894

432. VanderJagt D.L. Glyoxalase II molecular characteristics, kinetics and mechanism. /7 Biochem. Soc. Trans. - 1993. - Vol. 21. - P. 522 - 527

433. Vander Jagt D.L, HassebrookR.K., Hunsaker L.A., Brown W.M., RoyerR.E.

434. Metabolism of the 2-oxoaldehyde methylglyoxal by aldose reductase and by glyoxalase-I: roles for glutathione in both enzymes and implications for diabetic complications. // Chem Biol Interact. 2001. - Vol. 130. - P. 549 - 562

435. VanderJagt D.L and, Hunsaker L.A. Methylglyoxal metabolism and diabetic complications: roles of aldose reductase, glyoxalase-I, betaine aldehyde dehydrogenase and 2-oxoaldehyde dehydrogenase. // Chem Biol Interact. 2003. -Vol. 143.-P. 341 -351

436. Vasudevan P. Т., Zhou T. Kinetics of Cholesterol Oxidation by Cholesterol Oxidase. // Appl. Biochem. Biotechnol. 1996. - Vol.60. - P. 63 - 72

437. Varela E., Guillen F., Martinez A.T., Martinez M.J. Expression of Pleurotus eryngii aryl-alcohol oxidase in Aspergillus nidulans: purification and characterization of the recombinant enzyme. // Biochim. Biophys. Acta 2001. -Vol. 1546.-P. 107-113

438. Vince R. and Daluge S. Glyoxalase Inhibitors. A possible approach to anticancer agents. // J. Med. Chem. 1971. - Vol. 14. - P. 35 - 37

439. Vince R., Daluge S., Wadd W.B. Studies on the Inhibition of Glyoxalase I by S-Substituted Glutathiones. // J. Med. Chem. 1971. - Vol. 14. - P. 402 - 404

440. Villanueva G.B. and Allen N. Demonstration of altered antithrombin III activity due to nonenzymatic glycosylation at glucose concentration expected to be encountered in severely diabetic patients.// Diabetes 1988. - Vol.37. - P. 1103 -1107

441. Wakabayashi #., Hibasami H., IidaK., Sat oh N., Yamazaki Т., SonodaJ., Hi rata H., Nakashima K., IchidaA. Prevention of metastasis by a polyamine synthesis inhibitor in an animal bone metastasis model. // Oncology 2000. - Vol.59. - P. 75-80

442. WangMM., OlsherM., Sugar I.P., ChongP.L. Cholesterol superlattice modulates the activity of cholesterol oxidase in lipid membrane. // Biochemistry 2004. -Vol.43.-P. 2159-2166

443. Ward K.A. and Jain R.K. Responce of tumors to hyperglycemia: characterization, significance and role in hyperthermia.// Int. J. Hyperthermia 1988. - Vol.4. - P. 223 - 250

444. WareA.G. Method measuring the glucose content of blood serum. // USA Patent 3 404 069 (CI. 195-103.5), 1968.

445. Warnholtz A., WendtM., August M, Munzel T. Clinical aspects of reactive oxygen and nitrogen species. // Biochem. Soc. Symp. 2004. - Vol. 71 . - P. 121 - 133

446. WeibelM. К. and Bright H. Т. The glucose oxdase mechanism. Interpretation of the pH-dependence. // J. Biol. Chem. 1971. - Vol. 246. - P. 2734 - 2744

447. WeichherzJ. andMarschnik H. Die Loslichkeit des Cholesterin in Losungsmittelge-mische. // Biochem. Z. 1932. - Bd. 249. - S. 312-313

448. Weiderpass E., Gridley G., Persson I., Nyren O., EkbomA., Adami H.O. Risk of endometrial and breast cancer in patients with diabetes mellitus. I I Int. J. Cancer -1997.-Vol. 71.-P. 360-363

449. Weiderpass E., Ye W., Vainio H., Kaaks R., Adami H.O. Reduced risk of prostate cancer among patients with diabetes mellitus. // Int. J. Cancer 2002. - Vol.102. -P. 258-261

450. Weiderpass E., Ye W., Vainio H., Kaaks R., Adami H.O. Diabetes mellitus and ovarian cancer (Sweden).// Cancer Causes Control 2002a. - Vol.13. - P. 759 -764

451. Weidle U.H., GrossmannA. Inhibition ofHistone Deacetylases: a New Strategy to Target Epigenetic Modifications for Anticancer Treatment. // Anticancer Res. -2000,-Vol.20.-P. 1471 1486

452. Werner W. Diabetes mellitus und Carcinom. Statistische Untersuchungen an Hand von 25147 Sektionsfallen. I IZ. Krebsforsch. 1955. - Bd.60. - S. 399 - 407

453. Willner /., KatzE., WillnerB. Electrical-contact of redox enzyme layers associated with electodes: routes to amperometric biosensors. // Electroanalysis 1997. -Vol.13.-P. 965 -977

454. Wicki A., Niggli V. Role of protein Kinase С Isoforms in Locomotion of Walker 256 Carcinoma Cells. // Int. J. Cancer 1999. - Vol. 81. - P. 255 - 261

455. Wierusz-Wysocka В., WysockiH., SiekierkaA., WykretowiczA., SzczepanikA., Klimas R. Evidence of polymorphonuclear neutrophils (PMN) activation in patients with insulin-dependent diabetes mellitus. // J. Leukocyte Biol. 1987. -Vol. 42.-P. 519-523

456. Wierusz-Wysocka В., WysockiH., Wykretowicz A., Klimas R. The influence of increasing glucose concentrations on selected fimktions of polymorphonuclear neuetrophils. // Acta diabetol. lat. 1988. - Vol.25. - P. 283 - 288

457. Williams-Ashman H.G., SeidenfeldJ. Aspects of the biochemical pharmacology of methylglyoxal bis (guanylhydrazone).// Biochem. Pharmacol. 1986. - Vol.35. -P. 1217-1225

458. WinnJ.S., GuilleJ., Gebicki J.M., Day R.O. Hydrogen peroxide modulation of the respiratory burst of human neutrophils. // Biochem. Pharmacol. 1991. - Vol. 41. -P. 31 -36

459. Wybenga D.R., Pileggi V.J., Dirstine P.H., Di Giorgio J. Direct manual determination of serum total cholesterol with a single stable reagent. // Clin. Chem. 1970. - Vol.16. - P. 980 - 9841. H i! ,if> .»,

460. XiangJ., Sampson N.S. Library screening studies to investigate substrate specificity in the reaction catalyzed by cholesterol oxidase.// Protein Eng. Des. Sel. 2004,-Vol.17.-P. 341 -348

461. Yamafuji K., Yoshida T. Eine Micromethode zur Zuckerbestimmung mittels a-naphthol. // Biochem. Z. 1939. - Vol. 301. - P. 61-64

462. Yao Т., Musha S. Electrochemical enzymatic determinations of ethanol and l-lactic acid with a carbon paste electrode modified chemically with nicotinamide adenine dinucleotide. // Anal. Chim. Acta 1979. - Vol. 110. - P. 203-207

463. Yee H.Y., Goodwin Y.F. Evaluation of some factors influencing the o-toluidine reaction with glucose. // Anal. Biochem. 1973. - Vol. 45. - P. 2162 - 2165

464. Yoshimura Т., Isemura T. Subunit structure of glucose oxidase from Penicillium amagasakiense. // J. Biochem. 1971. - Vol.69. - P. 839 - 846

465. Zaborsky O.R., Ogletree J. The immobilization of glucose oxidase via actiation of it's carbohydrate residues. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1974. - Vol.61. -P. 210-216

466. Zhao B.-L., WangJ.-C., HouJ.-W., Xin W.-J. Studies on nitric oxide free radicals generated from polymorphonuclear leukocytes (PMN) stimulated by phorbol myristate acetate (PMA). // Cell Biol. Internat. 1996. - Vol.20. - P. 343 - 350

467. Ziegler D., HanefeldMRuhnau K.J., Meissner H.P., LobischM., Schutte K., Gries F.A. Treatment of symptomatic diabrtic peripheral neuropathy with the antioxidant a-lipoic acid. // Diabetologia 1995. - Vol.38. - P. 1425 - 1433

468. ZonderJ.A., Shields A.F., ZalupskiM., Chaplen R., Heilbrun L.K., Arlauskas P., Philip P.A. A phase II trial of bryostatin 1 in the treatment of metastatic colorectal cancer. // Clin. Cancer Res. 2001. - Vol.7. - P. 38 - 42

Информация о работе

Александровский, Яков Александрович
доктора биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.02

Диссертация

Углеводный обмен: механизмы патологических процессов, анализ важнейших метаболитов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы