Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СУКЦЕССИИ ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ И МЕСТО В НИХ КОНКРЕТНЫХ МИКРОБНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "СУКЦЕССИИ ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ И МЕСТО В НИХ КОНКРЕТНЫХ МИКРОБНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ"

На правах рукописи

КОЧКИНА Галина Александровна

СУКЦЕССИИ ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ И МЕСТО В НИХ КОНКРЕТНЫХ МИКРОБНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ

I

^ Специальность 03.00.07. - микробиология

Авторефера г диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ИЗДАТЕЛЬСТВО МОСКОВСКОЮ УНИВЕРСИТЕТА • 1981

Работа выполнена ка кафедре биологии почв Факультета Почвоведения Московского Государственного Университета вн. II.в.Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Д.Г.Звягинцев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

старший научный сотрудник

Г.А.Дубинина

кандидат биологических наук

старший научный сотрудник

Л. Л. Великанов

Ведущее учреждение - Московская сельскохозяйственная академия им, К.А.Тимирязева

на заседав*» специаляэированного Совета по почвоведению в МГУ им. И.В.Ломоносова в аудиторе« К-2,

С диссертацией мокко ознакомиться а библиотеке факультета Почвоведения МГУ.

Приглашаем Вас принять участие в обсуждения диссертации на заоеданик специализированного Совета по почвоведению в МГУ им. М.В.Ломоносова, а отзывы на автореферат в 2-х экземплярах просим направлять по адресу: 11725^, Москва, Ленинские горн, ИГУ, факультет Почвоведения, Учений Совет.

Защгеа состоится

Л ■ 198Y года в /.Г^

часов

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного Совета -у л ,

Доцент /ГЛЛЛ-^ Я.П.Бабьева

Актуальность проблемы. Для предотвращения неблагоприятное экологической ситуации необходимы исследования sas во оценке последовав антропогенного воздействия в экосистемах, ras л по деленалравленно-к; изменению их функционирования в желаемом направлении. В вдотоя-чае время все более осознается необходимоегь изучения эанономернос-теа, действующих в микробных системах, а, в частности , в комплексе почвенных микросргавизмов( Эаварзин, 1974, 1976). Решете этого вопроса невовможно без характеристики послеломмхьвосгя ообытиЯ в сукцессии микроорганизмов. Почву населяют мавв разнообразные микроорганизмы, я определение расписания развития каждой популяции весьма важно. Для изученных микроорганизмов иожно воспользоваться перечнем пржзваьов, испожьзэемнх в таксономических описаниях разного ранга. Однако, в атом случае невозможно будет составить хотя бы поверхностное» представление о микроорганизмах, не полученных в чистых культурах. По этой я другим причинам весьма актуальной была бы оценка возможности введения количественных показателей, отражающих в лаконичной Форме ключевую информацию о состояние всей ««кровной системы, а конечном счете такие показателя необходимы для индикации и прогноза событий в связи с конкретным воздействием. При положительном решения этой проблемы появляется возможность выяснения места конкретных популяция в мюеробннг системах путем выявления наиболее и наименее благоприятных дня их развития этапов в цели суме сс но иных превращений.

цель работы, цалыо работы являлось выяснение принципиальных особенностей сукцессии почвенных микроорганизмов sa счет введения ряда количественных критериев. При этом предполагалось выяви» этапы наиболее и наименее благоприятные для развития конкретных популяция на примере Rhizobium leguBinosarum 0 Arthrobacter cryotallo-poietee.

Основные задачи исследования. I. Изучение динамики различных групп микроорганизмов я некоторых показателей их активности в образцах типичного чернозема» после внесения в него целлюлозы, глюкозы я простого увлажнения. 2. Изучение динамики численности популяций Kh.legumliiosaTuir¡ и A .cr^s-tallopoietes при внесении в чернозем на разных стадиях сукдессий комплекса почвенных микроорганизмов, инициированных внесением глгкозы, целлюлозы и простым увлажнением. 5. Проведение количественного популяционаого анализа для клубеньковых бактерии на основании морфологических особенностей клеток для установления скоро»« ш ^азшожэдяя в почве. Исследование мета-/о'/Ч

биотически связен между вопухяцякми кдубеямових бактерий и арт-робактерв о почкенныма микроорганизмам* хах одного на возможных механизмов регухяцям численности исследуемых популяций в естественно почве.

Натчяая нов язва. Впервые предложены инеграхьяне количественные критерии ,харапери8у»цие стадии микробных сукДессий в почве. На основан» втхх критериев к аяахиза динамвкм отдельных группировок установлены освовныо тевденци развитая суквдссай в микробной системе к составлено их подробное распяеанне. Сопоставление кривых дхнамяях клубеньковых бактерий я артробактера с особенностям! сукцессия бохъмкх групп микроорганизмов позволяло установи» этапы гибели я развития этих популяций в почве ва фоке сукцессиоивых изменений ■ сделать вывод о принадлежности их х микроорганизмам с различной экологической стратегией. Впервые в количественном популяцвонвом анализе клубеньковых бактерий применены морфодогячес-кпе критерии дхя оценки наблюдаемой удельной скорости роста м процессов гябеди непосредственно в почве. Показано, что метабиоз с почвенными михрооргавивмани играет положительную роль в регуляция численности как клубеньковых бактерий, так н артробактера в ес-тествеххвг местообитаниях.

Пряктичеехам таииость. Разработанные критерии могут применяться прк реиеним вопросов, с вяза миг в прогнозированием сукцессия в естественных местообитаниях и жнмкацме* различных воздействий. Показана возможность це ленаправленного создавяя в почве условий, наябояее я нанмеяее благоприятных для конкретной популяция, что позволяет осуществил переход к организация контроля за примеве-вявм бактериальных удобрений идя удалением нежелательных микроорганизмов не почвы. Полученные результаты используется в курсе "Экология почвенных микроорганизмов" ва кафедре биологии почв факультета Почвоведения МГУ.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены ва XI симпозиуме "Биодинамика почв" (Таллии, 1979), на конференции "Научные основы прожвводетва м применения нитрагина" (Москва, 1981), а также ва заоедавии кафедры биология почв факультета Почвоведения МГУ С1981).

Публикации. По теме диссертация опубликование 5 работ, подучено положительное реяенме о выдаче авторского свидетельства.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, 8 глав, обсуждения

результатов, выводов. Материалы диссертация изложены на страницах машинописного текста, содержится 33/ рисунков, Я] таблиц, список литературы из<Й£ названий (аз них /Ф- зарубежные).

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе мсоле до вались образцы дернового горизонта (А4 -О-Юсм) типичного чернозема, мощного, среднесуглинистого, на

покровном суглинке (Воронехская обл., пос. Хреновое). Для опытов отбирали средние пробы почвы, удаляли коран и просеивали через сито с отверстиями в I мм.

Сукцессия инициировали раздельных внесением глшоаы или целлюлозы (1% от веса почвы) с одновременным увлажнением до 29 % от сухого веса почвы. Контролем служила почва без дополнительного внесения источников углерода. Почву инкубировали при температуре 17-20° . Через определенные промежутки времени проводили отбор образцов. в качестве приема предварительной обработки почв для микробиологически! анализов нсдользовали ультраввуковое диспергирование на низкочастотном диспергаторе типа УЗДН - X (в отдельных случаях применялась пропеллерная не пажа типа РГ-2).

Для учета различных трофических групп собственно почвенных бактерий использовались разные среда и условия культивирования. Бактерия, потребляющие легкодоступные вещества, определяли на среде МПА, разведенной в 10 раз. Спорообразующие бактерия учитывали после прогревания почвенной суспензии при 60° в течение 10 минут. Целлюлозоразяагаюкие аэробные бактерии определяли на среде Штаппа и БортельсаУс целлюлозой (Имленецкий, 1953). Анаэробные целлюлозо-лятические бактерии учитывали на той же среде при инкубации посевов в аназростате в течение двух недель. Динамику сульфатре дикторов изучали на среде Внноградского (Виноградский, 1952), где единственным источником углерода служила целлюлоза, целлюлозу для всех сред готовили из размельченной фильтровальной бумаги.

Динамику отдельных групп грибов изучали методом посева на среды Чапека с 3 % сахарозы и Штаппа я Бортельса (А) с целлюлозой. На тех же питательных средах определяли изменение средней радиальной скорости роста колоний почвенных грибов ). Для этого измеряли диаметры всех выросших на чашках колоний, затем измерения повторяли через определенный промежуток времени. Для вычисления Кг грибов МогЗДегеНа гаиаяп1апа и Мисог с1гс1пе11о1йвв использовали среду Трмнчх о глюкозой (иаау.тппс! , 1975).

Общее количество бактерии в почве определял« с помощь» метода люминесцентной микроскопия (Кожввян, 1976). Поезд подсчета бактерий, на rex же препаратах учитывали длину мицелия и количество обрывков грибных гиф (с помощью фазово-контрастноя микроскопии при общем увеличении 350х).

Динамика количества летучих жирных кяолп определялась методом отгонки в последними титрованием мл<яы> (♦ролов-Багреев с соавт., 1933).

В качестве объектов изучения были мвбравы популяции каубенько-вых бактерий выгоЫип legtuminoearum па мм zt (Латвийская сельскохозяйственная академия) и Artiirobacter crystallopoietes штамм BKlf-655. В отдельных случаях исследовали популяции Rhlzo -Мим leguminosarum мамм 115 И НМвоМшв tri foil 1 атаммы 0403 и Т-37.

ПОПУЛЯЦИИ Rb.leguniaoearuia (ZK) и A.crystallopoietefl ВНОСИЛИ раздельно в чернозем на различных начальных уровнях численности. В другой е*ри опытов по выяснению благоприятных и неблагоприятных для их развития этапов сукцессия, указанные популяции вносили в почву на едином высоком уровне (ДО9 клеток/ г почвы). Популяция вносили на 0, 2, 7, 16, 25 сутки всех трех вариантов сук-цессий (пожшир, шшшер, контроль) и учитывали посевом в использованием метода геистячосжо» маркировки при концентрации стрептомицина 1000 мкг/ш (Класен, 197<0. Учет проводили на среде ШИ для артробактера я яа бобовом агаре для клубеньковых бактерий.

Для микроскопического изучения динамики популяции клубеньковых бактерий в естественной среде обитания использовали метод нимунолюмкнесценция (Кохевин, Звягинцев« 1973). В ходе гяперямму-кизации кроликов были пожучены высокоспецифические аИтисыворотки, агглютинадяонный титр которых был не вяхе 1/1000, АнтикролячиЯ гамма-глобулин, меченный язотноцваватоя флуоресцеина, и бычий альбумин, меченный родамином« получвли в Идетигуте эпидемиологии и микробиология ям. Н.Ф.Гамалеи,

Метод иммунолюминесценции позволил определить динамику общего количества клубеньковых бактерий в черноземе, а также наблюдать различные морфологические формы клубеньковых бактерий и корреляцию между ними и скоростями роста для вьлвдоШлнмыив я Rh. txifolii в чистой культуре и в почве. Для опредемешкя ■нежизнеспособных" клеток в популяции клубеньковых бактерий применялась налидиксовая кислота (Kogure , 1979). Метод основан на

ее способности ингябировагь деление клеток, не влияя на их росг. Поэтому, клетки, способные к рост;, удлинялись в 2-3 pasa после б-часового инкубирования о наяндикоовой кислотой. Комбинация этого метода с иммуяолюмннеоцентной микроскопией позволила дифференцировать "нежизнеспособные 'клетки непосредственно в почве.

Изучение метабиотическкх вэавмоотвоаенай клубеньковых бактерия и артробактера с комплексом целлюлозоразлвгаюцих бактерий проводилось в жидкой среде Штаппа и Бортельса (&) с ивлгилозой. Комплекс целлюлозояитяческих бактерий выделяли из зон разложения целлюлозы, которые образуется на той же агаряэованной среде при посе-Se из почвенной суспензии, видовое определение бактерии яа проводилось* so количество их для-внесений в опытные колбы вычислялось с помощь» метода прямой микроскопии. Динамику популяций в этом случае изучали с помощью метода посева.

Результаты исследований обрабатывали статистически (Аякарин с соавт., 1975; Доспехов, 1979).

РЕЗУЛЬТАТУ ИССЛЕДОВАНИЙ

Динамика измевеикй комплекса почвенных микроорганизмов в черноземе при внесении дополнительных субстратов Обиая численность бактерий по данным люминесцентной микроскопии меняется незначительно даже в вариантах с внесением в почку органических веществ (рис. 1а). Между тем* численность бактерий по посеву на КПД, где учитываются организмы, потребляющие легкодоступные веиества, возрастает за первые 2-7 суток в 3-4 раза в случае простого увлажнения или внесения целлюлозы. Б гаркайте с внесением глюкозы происходит 20-кратное возрастание. Таким образом, метод посева более чувствителен для индикации конкретного воздействия на почву по сравнению с прямым микроскопически* методом. Количественное несовпадение данных, обоих методов связано с тем, что микроскопический метод и метод посева несут различную информацию. При прямой микроскопии мы наблюдаем все множество бактерий, а посев дает сведения лив* об определенной физиологической группировке. Было предложено использовать отнооение показателей численности по данным микроскопии и посева для характеристики сукцессионвых изменений в почве (Кожевин, Звягинцев, 1980). Мы экспериментально проверили ВТо предположение. Низкие значения показателя с свидетельствуют об относительном увеличении количества бактерий, погребля паях легкодоступные субстрат в высокой скорость». Это свойственно организмам со склонностью к г-стратегия, преобладающих па 2 - /¿/V

а) коичеогво бактераЯ по прямому катоду /

—----\

<5) количество бактвpiU на орвдв ШЦ —-----------

Ряс. I. Динамика численности вочзенянх бактерий при внесенна в чернозем целлмозя (I), глисозн (2), жроотом увлажнения (3)

Коэффициент И- частааяооть р0 «отросюют (._.д---^^

численность по посеву аа ИВА

Коэффициент & численность п<? прямой микродяопиу ,---

численность по посеву аа КОД мв- '

ayo чиоло спор

ранних стадиях сукцессии. Возрастание коэффициента К говорит об увеличении юли группировок, не растудах на MTU« но учитываемых при микроскопии: медленно растущих микроорганизмов, специализированных микроорганизмов, нежизнеспособных клеток. Следовательно, более высокие значения коэффициента К должны характеризовать более поздние этапы сукцессий, где преобладает ихкроорганиэиы с К-сграгегией. Данные по изменению коэффициента К в условиях эксперименте представлены на рис. 1в. Характер рассматриваемых кривых в полной мере подтверждает предположение о возможности применения коэффициента К для индикации стадий микробных сукцесснй. Действительно, уже на 7® сутки после внесения глюкозы коэффициент К резко ет, так что показатели численности по данным микроскопии и посева различаются не более, чем в 10-15 раз для варианта с внесением глюкозы, а для почвы о внесением целлюлозы и контроля -в 50-60 раз при первоначальном различия в 220 раз. В ходе опыта показатель К постепенно возрастает, что указывает на прохождение сукцессии, прячем возрастание более выражено для варианта с внесением целлюлозы и контроля. Более медленное возрастание К в варианте с глюкозой связано о высоким процентом споровых бактерий, особенно это проявилось после первого месяца культивирования почвы и само по себе являлось следствием первоначального активного развития микроорганизмов в этом варианте, т.е. в условиях нашего опыта исходное внесение веяеств и влаги привело к "омолаживанию" комплекса почвенных макроорганизмов, наиболее существенному в случае внесении глюкозы.

В варианте с внесениеи целлюлозы, характеризующийся более высокими К, сразу же отмечается вспышка целлюлоэораэлагающих бактерий, которые остаются на высоком уровне вплоть до 35- суток (табл. 3).

Среди анаэробной части комплекса почвенных бактерий изучали сульфэгредукторы и анаэробные целлюлозоразлагающие бактерии (табл.2), Внесение глюкозы не способствует активному росту сульфатредуцмру-пщих бактерий. Напротив, внесение полимера - целлюлозы - создает возможность для достижения наибольшей численности этих бактерий, что наблюдается на поздних этапах опыта. Максимум сульфагредукторов сопряжен о максимумом цедлилозоразлагаювдх анаэробов и приходится на 35$ сутки. Всем максимумам развития микроорганизмов в анаэробной зоне предшествует накопление в почве летучих жирных кислот (ЛЖ) (рис. 2),концентрация которых достигает наибольшей величины на 16s сутки для варианта с глюкозой и, особенно, для варианта о целлюлозой. ЛЕС .являясь в существенной степени продуктом анаэробной зоны,

Таблица I

Влияние внесеная различии субстратов ва дднатау целлюлоэоразлагаюмг кжкрооргавнзиов s почве

Вре-

foíi

Ш

Целдюловоразлагаедие бактерии Id6 меток да I г почвы

Целлюдозоравлагавдие грвбн НрАуямио на X г почвы

Кг цеюшлоаорвзлагасциг грибов (и/час)

цеддплоза

гияоза

контроль

целлодоаа

глшсова

контроль

цвлдшза

гхякова

контроль

0

1

г ?

16 35 50 80

3,2*0,4 14,3*2,1 22,9*5,7 19,9*4,8 10,2*2,1 14,3-2,2 7,7*1,3 5,6*0.7

3,2*0,4

9,0*1,9

8,7*1,7

10,3*1,6

13,1*3,9

10,5*2,0

10.8*3.3

3,2*0,4 3,7*1,2 10,2*1,9 6,7*1,0 8,1*2,7 10,9*1,9 7,9*1,3 4.0*0.9

50,5*11,5

62,9*12,8

94,7*12,6

102,4*33,7

168,7*31,9

184,3*37,2

Ш,3*22,8

79.7*16.2^

50,5*11,5

32,9*10,8 109,7*33,7 94,9*19,0 115,1*27,7 68,9*16,7 31.3*8.5

50,5*11,5

35,5*10,6

58,4*13,4

46,7*11,7

57,3*19,1

87,7*19,9

38,4*9,0

43.3*7.6

0,12*0,04 0,32*0,07 0,19*0,05 0,21*0,05 0,17*0,02 0,10*0,02 0,16*0,01 0.11*0.02

0,12*0,04 0,11*0,04 0,11*0,04 0,13*0,04 0,17*0,05 0,12*0,04 0,09*0,03 0.18*0.06

0,12*0,04 0,16*0,04 0,15*0,05 0,18*0,06 0,15*0,02 0,11*0,03 0,23*0,02 0-15*0.04

Табддод 2

Дияаиии авазробншг бадтерд! в чернозем после ввесендя различных субстратов

Вре-vu — Це дли до зо ра з лага с we бактерия 10я (Л почта) Судьфагрвдукгорн 10> < t¡4hb$ih)

(елки] недлилоза глюкоза контроль целлюлоза глюкоза контроль

0 8,0 * 0,6 8,0 * 0,6 8,0 * 0,6 10,4 10,4 10,4

2 115,7 * 9,7 65,1 * 14,0 46,6 * 8,0 3,9 3,9 1,95

7 39,4 * 3,5 72,0 * 0,9 24,5 * 6,3 13,0 7,1 3,3

16 46,3 * 13,8 83,9 * 29,4 И,6 * 2,9 39,0 1,2 2,0

25 99,7 * 36,6 88,6 * 15,9 34,7 * Т5,3 110,4 3,9 61,7

35 187,5 * 29,5 99,8 * 30,0 70,7 * 13,2 454,6 48,2 107,1

50 103,9 * 28,0 106,5 * 14,6 49,1 * 11,1 129,9 31,2 107,1

80 110,6 * 37,0 67,7 * 23,4 38,1 * 1,3 259,7 22,7 35,7

в свою очередь, являются субстратами для последующих групп в сук-

Рис. 2. Динамика образования летучих жирных кислот при внесении в почву целлюлозы (I), глюкозы (2) и при простом увлажнении (3)

Развитие и активность микроорганизмов анаэробной зоны подтверждает данные, отраженные в показателе К, о росте на поздних этапах опыта неучитываемой на НПА части комплекса почвенных мшс-рооорганизиов.

Таким обрезом, традиционное в почвенной микробиологии отноие-ние данных прямой микроскопии к данным посева, используемое ранее линь для дискредитации методов посева, оказалось применимым для индикации сужцессиовкых изменений комплекса почвенных мшсрооорга-низмов»

Перейдем к рассмотрении динамики комплекса почвенных грибов. Необходимо отметить существенное возрастание длины мвцехкя по данным прямого метода я течение первой недели после внесения в почву глюкозы и несколько меньшее - в остальных вариантах (ряс. За), К

суткам показатели численности убывает (длина мицелия и число обрывков), так что практически невозможно различать варианты между собой.

По посеву повышение количества грибов наступает сразу после внесения в почву веществ и остается на высоком уровне длительное время, причем ясно видна разница между всеми трем» вариантами опыта (рис. 36), При резком уменьшении длины мицелия по прямому методу, высокая численность гркбов по посеву пооле суток может 3 VJ-'/v

а) длила мицелия грибов по прямом; катоду

/

б) число колоний на среде Чапека

/

/

/

----------}

-------------

в) коэффициент %

суяш

Рис. 3. Дивапка ицюиодшеш грабов в чврвоэеш я разных вариантах опита: I - внесение цехжюлози; 2 - внесение глюкозы; 3 - простое увлажнение

Коэффициент XI чгюло обрав*ов "вдеямя по прямому метод коэффициент ъ Ч([0Л0 КОЛОЕЯЙ П0 посеву на среда Чапека

свидетельством«, о начале процесса кассового спорообразования. Таких образои, одному и сому же количеству колоний до посеву могут соответствовать оовераенно различные состояния комплекса почвенных грибов, а сам по себе метод посева еще недостаточно хорошо характеризует их сукцессию.

Более продуктивным, как и в случае в бактериями, оказывается сопоставление данных прямого метода н метода посева {коэффици-чиожо обрывков мицелия по прямом? методу » , , » ^ а число колония по дооеву на среде чапека * растание z в первые сутки характеризует "омолаживание" комплекса почвенных микроорганизмов, так как отражает прорастанне спор грибов . Менее высокое возрастание z в начальный период в варианте с глюкозой связано с тем, что основное число проросших спор принадлежит овхаролитическим грибам и довольно мало микроорганизмов с иными пищевыми потребностями и мертвого мицелия. Это является следствием наиболее активного "омолаживания" комплекса микроорганизмов в варианте с глюкозой. Вторая фаза развития комплекса грибов четко наблюдается, исходя из коэффициента ъ , начиная с 16* суток. Более резкое падение z в варианте о глюкозой является результатом массового спорообразования после обильного образования мицелия.

Следовательно, сопоставление данных двух методов способствует получению дополнительной информации и, кроме toro, может служить для индикации стадий сукцессии.

6 качестве еще одного показателя, характеризующего стадии сукцессии почвенных микроорганизмов, мы предлагаем использовать Kg. - средни» радиальную скорость роста колоний комплекса почвенных грибов. Считается, что показатели кинетики роста крайне важны для понимания экологии микроорганизмов. Однако, до оих сор нет ясности, в каких случаях целесообразно применение соответствующих показателей, к тому же очевиден дефицит достаточно надежных сведений. l&t исследовали некоторые количественные характеристики роста грибов ва твердой среде в зависимости ос концентрация глюкозы (табл. 3). Оказалось, что два гриба, выбранные нами, с заведомо различными экологическими свойствами, проявляют максимумы роста в разных участках достаточно широкого диапазона концентраций выбранного источника пита аия .Sort i erelia ramamiiana имеет ^.макс При 0,005?, a Mucor clrclnfftioid»B при 10% глюкозы в среде. Причем К^ у последнего микроорганизма на порядок выше,чем у Vort.ramanniana. wort, rajianaianfl обычно выделяется в конце разложения лесной подстилки и из почвенных образцов. H.circineiioidea преобладает в почвах

ovlnhooooqoo

88S8S88888

ооооооотгЗм

Т

а и

VS

i п

s

ооооооооооо

ооооооооооо Н-Н-М-Н-И-1+Н-Н-Н-К14

ооооооооооо оооооооооо

з

tt но

h>4

о

и

о. «

а

оооооооооо

SSföSSSSSSß

ii+н-н-м-н-н-м-н-и-н оооооооооо оооооооо

■SOiffiO-fr'P'HO

— <л

!8§

ty

!»

о вьюокик содержанием свежих раотительных остатков. Резкие различия экологических свойств этих микроорганизмов и появление их кв разных этапах сукцессии в природе хорошо согласуется о параметрами их роста на твердых средах. Это привело нас к мыоля, что интегральный показатель радиальной скорости роста комплекса почвенных грибов, выделяющихся на разных этапах, может служить индикатором стадий микробных сукцессий в почве (рис. 4). Внесение глюкозы в почву вызывает сильное (в 4-5 раз) увеличение Кр на среде с сахарозой, а внесение целлюлозы, напротив, несколько снижает скорости роста данной группы, по позволяет увеличить в раза скорость роста группе целлюлозолитических грибов (табл. 2), согласуясь с мнением об активном участии этой популяции в разложении целлюлоза сразу же о первых моментов ее поступления в почву. Следовательно, К является параметром весьма чувствительным и характеризует изменение комплекса почвенных грибов во времени, являясь еще одним принципиальным индикатором стадий микробных сукцессий.

Таким образом. К, Кг а г - ценные количественные показатели, которые позволили зарегистрировать сукцессиокные изменения в комплексе почвенных микроорганизмов в связи о внесением в почву органических веществ. Эти показатели в совокупности с анализом динамики отдельных группировок позволили установить, что после внесения органических веществ в одной и той же почве складываются сообщества разной степени зрелости. Внесение глюкозы не просто "омолаживает" комплекс почвенных микроорганизмов, но создает более "молодую", по сравнению с вариантом о внесением целлюлозы, стадию микробной сукцессии.

Динамика ПОПУЛЯЦИЙ ДМдпЬ^ 1еяут1поаагут И АггИгдЬас^г в нестерильной почве

Динамика популяций 1Ш.1ееш1111оввгит и А. огуага11оро1«*ев на разных уровнях внесения в черноземе в присутствии целлюлозы, глюкозы и в контрольном варианте представлена на рис. 5.

Наиболее важным моментом в динамике клубеньковых бактерий в черноземе является размножение в начальные периоды после внесения для всех трех уровней пояуляционной плотности. При рассмотрении вариантов о внесением дополнительных органических веществ видно, что численность здесь падает менее резко по сравнению с контрольным вариантом. Относительно разных первоначальных популяционных плотностей необходимо заметить, что самое резкое снижение численности клубеньковых бактерий происходит при более высоком

Рис. 5. Динамика численности (в - г fr ¿oflrtP вь. leguminosa.-ия (а,б,в) я A.cryetailopoietee (г,д,е) в черноземе sa различных первоначальных уровнях с внесением цел-лмозы (I), глгкозы (2), при простом увлажнения (3)

уровне внесения. В случае низкого первоначального уровня наблюдается даже повышение численности к концу опыта.

Совершенно яйэя картина динамики у аргробактера. Характер кривых имеет сходство в вариантах о внесвниеы всех субстратов, в отличие от клубеньковых бактерий, артробактер дает прирост численности лишь на низком уровне, причем на очень короткое время. Снижение популяцяояяой плотности о высокого и среднего уровней происходит гораздо более резко, чем для клубеньковых бактерий. Не отмечено выраженного влияния питательных веществ на динамику аргробактера.

Особенно важными являются данные го динамике Eh.legmalnoe«-rum и A,crystaHopol«tes при внесении их в чернозем в разные моменты сукцессия, инициированных предварительным внесением веществ и влаги. Предполагалось, что динамика численности исследуемых популяций после раздельного их внесения на резных этапах {0, 2, ?, 16, 25 сутки) всех трех вариантов сукцессии (полимер, мономер* контроль) будет зависеть от соответствия конкретной попудяциоаной стратегии суммарному изменению условий в основной массе почвенных иикрозои. В результате этих исследований оказалось, что диапазон уровней стабилизации для клубеньковых бактерий более яирок по сравнению с артробактером. Для аргробактера интервал равновесных уровней более сжат и нет столь выраженных осцилляция (рис. б), в качестве критерия приспособленности популяции к тому или иному этапу микробной сукцессии использовалась наблюдаемая удельная скорость роста - г (Уильамсон, 1967), прячем, вычисляемый критерий ыы относили ве к длительному, а к короткому (46 часов) промежутку времени после внесения популяций в исследуемые образцы, представляющие собой разные этапы и варианты сукцессия. Расчетные значения г для всех вариантов представлены на рис. 7. Наилучшим вариантом для популяции аргробактера был вариант с внесением полимера, причем на сутки после внесения отмечалось положительное значение г. Наиболее неблагоприятным являлся вариант с внесением глюкозы. Для популяции клубеньковых бактерий во всех вариантах самые высокие значения г были зарегистрированы в момент инициации сукцессии. Это подчеркивает преимущество для развития популяция клубеньковых бактерия в условиях "экологического вакуума", когда создаются благоприятные условия, но почвенные микроорганизмы еще не активны, что, в совокупности с отсутствием доминирования процессов гибели над процессами размножения у клубеньковых бактерий, характеризует принципиальные различии в поведении двух популяций.

16 г(чх) 0.02

ООО

-ори -006 г(чж*) 0,02 ООО

-002 -ДО«-

_ -006 ¿0 сутки

V

2 7 16 25 35

Рис. 6. Гравжпн изменения >о временя попугадионвих плотное«* (я) А.С ■ '

2 ?

16

"^"СуТЕЯ

плотносте* (я) А.сг7в*«а-1оро1*«м (а) я ньД»кп*1-

ио«*гаж (б)

Рис. 7. Изменение наблюдаемой удельноа скорости роста популяций (а) я №.

1*еия1поватш( (б), внесенных в почву на разных этапах микробных сукцвссий: I - целлюлоза; 2 - глюкоза; 3 - контроль

Сравнительные характеристики специфики развития обеих популяций в нестерильной почве приведены в табл. 4. По указанным признакам можно сделать вывод, что обе популяция обнаружили резкие различия в своих стратегиях. Артробактер по приведенной совокупности свойств можно отвести к организмам о К-етратегиея, а клубеньковые бактерии - к г-стратегам. Действительно, организмы с г-отратегжеа способны к повуляцяонным взрывам пря появлении "зкологического вакуума*, они характеризуются высоких темпом размножения, слабовираженнои зависимость» наблюдаемой удельной скорости роста от популяцяониой плотности, ияроким диапазоном уровней стабилизация, резким изменением во времени по нутационной плотности (КгеЪв, 19?2;Мау , 1976). Все эти признаки наблюдаются для кьлвгчпйпова-гил . Для л,«7^*11о|>о1**е« характерен признаки К-стратегии. Этот организм нацелен яе на быстрое размножение, а на сохранение равновесного уровня, первые этапы во всех вариантах в целом не соответствуют его злологической стратегия, более благоприятны для него условия поздних зтапов я* особенно, ситуация с признаками наиболее

"зрелой'системы в варианте в целлюлозой. Динамика артробвктера однотипна во всех вариантах опыта, наблюдаемая у да лиан опорос» роста завноит от полуляционной плотности,диапазон уровней стабилизации неширок, изменения попухяцмоияоЯ плотности во времени невелики.

Таблта 4

Характеристика особенностей популяция артробактера и клубеиьковых бактерий в почве

Признаки Артробактер Клубеньковые бактерии

I. Скорость размножения низкая высокая

II. Зависимость наблюдаемой удельной скорости роста от популяциовной плотности резко выражена слабо выражена

Ш. цопуляционвая плотность: а) стремление к определенному уровню стабилизации б) отношение начального уровня внесения к уровню стабилизации в) изменение во времени популяциовной плотности сильно выражено более высокое во выражено, популя-цяонная плотность стремится к уровню емкости среды имеется, но не резкое менее высокое весьма выражено, может возрастать в условиях "экохо ■ гического вакуума"

1У. Диапазон уровней стабилизации узкий широкий

*У. Усредненный (по всем веществам) максимальный показатель стресса на поздних этапах опыта 1,96 4,10

71. Возможность существо' вания за счет веществ, рассеиваемых при разложении целлюлозы имеется ярко выракена

УН. Эффект внесения полимера и мономера на развитие популяции положительный, во слабо выраженный яркий благоприятный эффект

7III, Стадия сукцессия, наиболее благоприятная для развития внесенной популяции поздние стадии начальные стадии

^Показатель стресса определяли по отношению количества микроорганизмов, вырастающих на разбавленных средах (I/IQ) к таковому на цельных средах

ИорФологические особенности клеток - поадздтели поолядиоц-

иой динамики кяубсньковыу бактерия

Описанную качественную сторону динамики изучаемых популяций следует дополнять строгим количественным подходом с учетом процессов гибели я размножения. Такую возможность мы смогли реализовать для клубеньковых бактерий. Б качестве возможных индикаторов темпа размножения при исследовании клубеньковых бактерия было рассмотрено: во-первых, соотношение палочковидных и кокковндных клеток в популяции (Израильский, 1933^во-вторях,процент двойных клеток, так как наличие еще не разоиедвихся после деления клеток непосредственно предполагает процесс размножения (Hags-tram et. al., 1979). Оказалось, что имеется корреляция между выбранными морфологическими показателями и наблюдаемой удельной скоростью роста (г) клубеньковых бактерий. Использование метода кммунолюмхвесценцин сделало возможным попытку оценки скорости размножения для двух видов клубеньковых бактерий непосредственно в почве, в этом случае бнда установлена существенная корреляция (с коэффициентом корреляция 0,7) для р и количества кокков. Уравнение регрессия представлено аа

Рис. б. Наблюдаемая удельная скорость роста (г) в процент кокков (и) в популяцяоняом анализе клубеньковых бактерий в нестерильной почве

Пользуясь этим критерием ,мы изучили поведение популяция кь, 1«еив1пов&гит при внесении ее в чернозем в разных вариантах опыта (целлюлоза, глюкоза, контроль). Выяснилось, что вариант с внесением целлюлозы является более благоприятным для клубеньковых бактерии на поздних этапах опыта. 8то следует не только из вычисления наблюдаемой удельной скорости роста, но в из анализа морфологических признаков популяции.

Яао интересовал не только процесс размножения, но я изменение доля "нежизнеспособных" клеток в популяции в процессе инкубирования ее в почве. Для дифференциация клеток мы применяла аалидюссо-вув кислоту, которая янгнбирует деление, во не влияет на удлинение

рис. 8.

* П% \ 80

Г=0,0К5-С>00032п

клеток, способных к росту. По мере культивирования популяций клубеньковых бактерия в почве процент нервстуцнх клеток увеличивается (табл. 5). После анализа взаимоотношения этого параметра о наблюдаемой удельной скоростью роста, оказалось, что между этими параметрами имеется сильная и существенная корреляция (рис. 9). Таким образом, для популяции клубеньковых бактерия впервые удалось

Таблица 5 т%

Изменение процента пнежиз- ч (9°

неспособных" клеток клубекь- *

новых бактерии в черноземе

Г=0,021~$(№т

Штаммы клубеньковое бактерий 3 сутки 13 оутки

НЬ.1«£ип>1пова-гша СйК) 20,5% 91,7%

ИЬ.1вйишХпоаа- гит (115) 27,6% 85,7%

ЕЬ.о11± (Т-57) 19,5% 90,0%

НЪ.*г1Го111 (0403) 50,8% 60,0%

-ОЛЮ 0/ОЮ

40(0 0,020 г^)

Рис. 9. Зависимость между наблюдаемой удельной скоростью роста клубеньковых бактерий (г) и процентом "нежизнеспособных" клеток (а) в почве

охарактеризовать не растущую в данных условиях среды часть популяции, При уменьшении скоростей роста клеток уменьшается количество палочковидных форм, уменьшается количество двойных клеток, увеличивается доля "нежизнеспособных11 клеток. По определению всех указавшее морфологических показателей можно судить о скорости, о которой популяция развивается или отмирает в естественном местообитании, а также оценивать степень благоприятности среда для роста клубеньковых бактерий.

Динамика популяций ДЧ1 тшМТД 1 <стд1 поваплп и аг^гоъас^г ^тггяеянорпт на среде с чеялюяозой в присутствии комплекса целлрлоэорязжя^ающат микроорганизмов

Твердо зстаяовтаннаЯ факт стабилизации численности клубеньковых бактерий в нестерильных почвах без растения (Звягинцев, Кожа-вин, 1974{ Имвенецкий о соавт., 1976; зсыаи* , 1974) не поясняет роли процессов размножения клубеньковых бактерий в длительном поддержании их численности. йадьны ли вообцэ такие процессы, а если реальны, то какими механизмами определяются?

Стабилизация численности клубеньковых бактерий и развитие их

го

при наличии контакта с почвенными микроорганизмами позволяет заключить, что бокыяаство микроорганизмов почвы не только не являются антагонистами и конкурентами клубеньковых бактерий, а, напротив, способствуют их сохранению. Ны в своих исследованиях воспроизвели один на вариантов возможных природных взаимодействий, смоделировали ситуацию совместного развития клубеньковых бактерий и артробак-тера с целлюлозоразвагамцвии микроорганизмами на среде с целлюлозой. Для клубеньковых бактерий оказалось, что они хорошо растут на среде с целлюлозой и комплексом цевлюлозолитиков, в их отсутствие роста на той же среде зарегистрировано не было (рис. 10). Для артробактера хотя и наблюдается некоторое развитие на среде с целлюлозой.при изолированном культивировании, но все же в присутствии целлюлозоравлагающих бактерий скорость размножения его выше (рис.II).

...-----4

>

А"

/

/ ______

2А 48 72. 16§час

Ж & п &-

Рис. 10. Развитие вь.1«ет1- Рно. II. Развитие А.огувга11о-

повагии на среде с целлю- ро!егвв на среде с цеххслозой

лозой з прясутс твии целлвло- в присутствии целлюлозоравда-

зоразлагающих бактеряй (I) гаюяих бактерий (I) я без

я без них (2) них (2)

Б этих же опытах не было установлено влияния исследуемых популяций на комплекс цеялюлоэоразлагаюяхх бактерий.

Полученные результаты можно расценивать, как прямой эксперимент, характеризующий возможные механизмы метабиоза клубеньковых бактерий и артробактера с почвенными микроорганизмами, т.е. вскрывается один из механизмов регуляции численности исследуемых популяций в естественных местообитаниях. Именно такой механизм может способствовать стабилизации численности этих популяций в почве. Соответствующий тип взаимодействия между клубеньковыми бактериями и артробактером, с одной стороны, и целлплозолитическин комплексом, с другой стороны, может быть охарактеризован как ситуация комменсализма (+, 0) или промкооперации (+, +■).

ОБСУЖДЕНИЕ

Рассматривая полученные результаты, следует прежде всего подчеркнуть, что нас интересовало изучение места конкретной популяции

в системе, а также прогноз и контроль событий в почве. Выбор в качестве объектов исследования популяций Rh.leEUminoeariua и A.crjs-tallopoletes не случаен. Артробактер традиционно рассматривается как наиболее типичный почвенный микроорганизм, но особенности его экологии до сих пор окончательно не ясны. Попытки выяснить его место в почвенной микробной системе по тем идя иным признакам, выявленным в лаборатория, необходимы, но явно недостаточны. Таких характеристик изучено много и постоянно прибавляется новая информация (Барышникова с соавт., i960; Chapman , Gray, 1981). Однако, какие характеристики в действительности определят сохранение данной популяции в естественном местообитании? Выявление и направленное изучение основных экологических особенностей, по нашему мнении, должно строиться на основе лопуляционной динамики in alto . Например, лабораторное опыты по изучению кинетики роста артробактера на питательной среде устанавливают его принципиальную возможность весьма быстро расти при высоких концентрациях питательных вещеогв (Никитин с соавт,, 1981). Однако, следует ли делать из этого факта вывод о значимости быстрого развития данной популяция для вшивания в почве или более существенным является не высокая скорость роста, а другие признаки, например, устойчивость к длительным стрессам? Вот вопросы, которые рассматривались, исходя из изучения популяции непосредственно в почве.

Относительно клубеньковых бактерий долгое вреыя наиболее распространенной была идея о возможное« существования данной популяции лиаь в тесной связи о растением м быстрой гибели в почве (Стейниер с соавт., 1979). В настоящее время экспериментально установлена стабилизация численности клубеньковых бактерий в нестерильной почве (Звягинцев, Кожевин, 1974; Кожевня, 1976; Schmidt, 1974). Наши исследования еще раз строго экспериментально показывают, что,как для популяции артробактера, так и для клубеньковых бактерий(в нестерильной почве выполняется критерий приспособленности, т.е. 11шД> 0. Следующий ваг состоял в выявлении возможных различий S'динамике двух популяций в почве и поиске соответствия экологической стратегии конкретной популяции состоянию комплекса почвенных микроорганизмов. Для решения этой задачи необходимо не только создавать разные этапы микробных сукцесскй в почве, но м иметь четкие количественные характеристики для контроля этапов,т.е. знать расписание событий в почве после определенных воздействий. Для этих цедей нами предложены, обоснованы я непосредственно использовались показатели К, К,. , Z.

Б результате доследований выяснилось, что при "омолаживании" комплекса почвенных микроорганизмов, вызываемом внесением веществ, A.cryataiiopoietee не реализует свою способность к размножению. Основной тенденцией его популяпионной динамики является стремление к поддержании определенного уровни численности. Единственный вариант, где наблюдается кратковременное повышение численности популяции при внесении ее на высоком уровне, это - I68 сутки после внесения целлюлозы, условия "зрелой" системы. Вся совокупность свойств этого организма свидетельствует о выраженной К-стратегии, Для этих микроорганизмов скорость роста сама по себе не имеет решающего значения. Напротив, клубеньковые бактерии, свойства которых близки к организмам с i-сгратегией, развиваются одновременно с комплексом микроорганизмов после внесения дополнительно! субстратов. Вместе с тем, наиболее благоприятным для стабилизации клубеньковых бактерий,спустя два месяца после внесения, оказывается вариант с внесением целлюлозы. Поокояьку клубеньковые бактерии не способны к самостоятельному росту на целлюлозе, полученные результаты подчеркивают значимость метабиоза между ними и почвенными гидролигиками. Кетабиоэ с почвенными микроорганизмами можно считать, как и предполагаюсь (Кохевии, 1976), одним из основных положительных факторов, регулирующих чиоленность клубеньковых бактерий и способствующих жх сохранению в естественных местообитаниях. Относительно механизмов, понижающих численность популяции (а ато-паразитизм, хищничество, аятибноа и т.д.), нужно заметить, что в изученной почва они не эффективны для артробактера при более низкой популяционной плотности, чем для клубеньковых бактерий.

Необходимо кратко остановиться на месте исследованных популяций в общей системе микроорганизмов в природе. В настоящее время очевидно, что при построении экологических схем необходимо учитывать стратегии микроорганизмов (Pugh, 1980). В самом общем виде можно сказать, что автохтонная и зямогенн&я микрофлоры Виноградо-кого (1952), это микроорганизмы с К- и r-сграгегией соответственно. 1Гожно проследить изменение доминирующих стратегий в комплексе микроорганизмов в ходе сукцессии. Если на начальных этапах доминируют микроорганизмы с r-стратегией, то основные микроорганизмы поздних этапов - типичные К-стратеги.

Из полученных нами данных вытекает, что артробактер и клубеньковые бактерии не являются "экологическими изотопами". В частности, условия "омолаживания" системы ведут к гибели артробактера и размножению клубеньковых бактерий.Для артробактеоа наиболее прием-

лемыми оказываются поздние этапы сукцессий. Следовательно, по от-нояению друг к другу клубеньковые бактерии и артробактер проявляют г-стратег*» и К-стратегяю соответственно.

Тахга образом, в результате нашей работы удалось 'ввести количественные характеристики микробных сукцессия в почве, выявить стратегии микроорганизмов, доминирующа на отдельных стадиях, установить наиболее благоприятные этапы для развития конкретных популяций, что позволяет прогнозировать сукцессии в определенных местообитаниях и управлять ими. Другими словами, мы приходим к предсказанию того, что должно произойти в микробной системе в связи с тем или иным воздействием, сколько времени это займет, уменьшится или увеличится за это время численность конкретной популяции. Налицо также возможность целенаправленного популяционного контроля в нестерильных местообитаниях. Например, для клубеньковых бактерий важно до момента заражения растения повысить численность популяции. Эту возможность можно реализовать, воссоздав в кратковременных опытах ситуацию первых этапов сукцессии внесением органических веществ. Соответствие условий этапа стратегии популяции можно контролировать, в частности, ло показателю К. Длительное сохранение клубеньковых бактерий на высоком уровне численности может происходить за счет активности почвенных микроорганизмов в условиях более"зрелой" системы,которая реализуется при внесении целлюлозы и прослеживается по тем же количественным критериям.

ВЫВОДЫ

1. Разработан ряд количественных критериев для характеристики изменений в комплексе почвенных микроорганизмов, с помощью которых можно определять стада» микробных сукцессий в почве.

2. С помощью сопоставления данных прямой микроскопии и посева удалось выявить количественные критерии сукцессия почвенных бактерий (коэффициент К) и микроскопических грибов (коэффициент Z ).

3. Сукцессию грибов после внесения в почву питательных субстратов и влаги удается охарактеризовать также с применением показателя

, отражающего изменение средней радиальной скорости роста колоний почвенных грибов во времени.

4. На основе предложенных количественных критериев и анализа свойств групп микроорганизмов, показано, что внесение глюкозы в почву сразу же создает более "молодую" стадию сукцессии по сравнению с целлюлозой, способствуя развитию г-стратегов.

5. Впервые после анализа расписаний микробных сукцессий и динами-

ки микробных популяций показана Возможность определения наиболее благоприятных и наименее благоприятных условий в одной и той же почве для развития различных микроорганизмов.

6. Выявлена принципиальные различия в динамике численности Hh.le-ggjttiaeear™ К А. ci-yatall оро i. et ев после внесения в нестерильную почву, на основании их анализа сделан вывод о том, что популяция Rh-leguBlnoearUm проявляет r-стратегшо, а A.ci-ystallopoietes имеет преимущественно признаки K-стратегов. Соответственно, наилучшими для развития клубеньковых бактерий являются ранние стадии

сукцессии, условия "экологического вакуума". Артробактер для своего развития предпочитает поздние стадии. Наилучшим для него является вариант с внесением в почву полимера.

7. Впервые для количественного популянионного анализа клубеньковых бактерий предложено использование морфологических критериев, по которым оказалось возможным оценить скорости размножения и гибели их непосредственно в почве.

8. Проанализированы мета биотические связи между популяциями клубеньковых бактерий , артробакгера и целлюлозоразлагающими микроорганизмами на среде с целлюлозой. Сделан вывод о существенной роли этого механизма регуляции в стабилизации численности изучаемых популяция в природных местообитаниях.

По материала« диссертации опубликованы следующие работы:

1. Радиальная екорооть роста колоний грибов в связи с их экологией (ссавт. Мирчинк Т.Г., Кожевия П.А., Звягинцев Д.Г.). Микробиология, 1978, т, 47, 964-965.

2. О критериях микробной сукцессии в почве (соавт. Кожэвик H.A., Ягодина Т.Г., Звягинцев Д.Г.). Микробиология, 1980, т. 49, 535-341.

3. Морфологические критерии в популяционном анализе клубеньковых бактерий (соавт. Коже вин П.А., Звягинцев Д.Г.). Доклады АН СССР, /9 tOj р. 255, 461-463.

4. Популяции клубеньковых бактерий в почве (соавт. Звягинцев Д.Г., Кочевка tl.fc., Кириллова Н.ПО. Тезисы конференции "Научные основы производства и применения нитрагина", 198!, U., стр. б.

5. Микробная сукцессия в почве и определение экологических стратегий конкретных популяций (соавт. Звягинцев Д.Г., Кожевин П.А., Полянская Л.М.). Микробиология, 1981, т. 50, 353-359.

6. Порчено положительное решение » 2913236/30-15/057457 от 29.X. 1980 о выдаче авторского свидетельства на способ "Способ определения скорости роста клубеньковых бактерия в почве" (соавт. Звягинцев Д.Г., Кожевин П.А.).

Подл. % печати ///¿¡Л/?6 Ф. йОПРО'М

Фи», п. л. Уч.-над. л С?

3>№ ¿Г/'/ Тираж /2с>

ИэДЮ Московского умммрсвтет*. Москва, К-Э. ул. Гердеи», 5/7. Типография Кзд-ва МГУ. Моек»», Леи поры

L