Структурно-функциональный анализ интактных клеток методами внутреннего отражения для целей экологического мониторинга

Королев, Юрий Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-функциональный анализ интактных клеток методами внутреннего отражения для целей экологического мониторинга
ВАК РФ 03.00.29, Охрана живой природы

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональный анализ интактных клеток методами внутреннего отражения для целей экологического мониторинга"

его ол

я 3 КОЙ «98

На правах рукописи УДК 504:576.3.08:535-7

КОРОЛЕВ ЮРИЙ НИКОЛАЕВИЧ

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ИНТАКТНЫХ КЛЕТОК МЕТОДАМИ ВНУТРЕННЕГО ОТРАЖЕНИЯ ' ДЛЯ ЦЕЛЕЙ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА

03.00.29 - охрана живой природы

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 1998

Работа выполнена в Московском Государственном Университете * М.В.Ломоносова и в Московской Государственной Текстильной Академии I А.Н.Косыгина.

Официальные оппоненты: В.В.Шиходыров, д.м.н., проф.

Д.Н.Маторин, д.б.н. В.А.Абакумов, д.б.н., проф.

Ведущая организация - Российский Университет Дружбы Народов

Защита состоится декабря 1998 г.

яа васедании диссертационного совета Д. 053.05.91 в Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, г. Москва, Воробьевы горы, МГУ им. М.В.Ломоносова, Биологический факультет, ауд. 389

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического кудьтета Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносо

Автореферат разослан ..... ноября 1998 г.

Ученый секретарь ' диссертационного совета к.б.н.

Л.И.Степанова

- з -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В XX веке наша Человеческая Цивилизация юлностью оформилась в техногенную Цивилизацию, смысл жизни и развития ■соторой является производство материальных ценностей, материальных 5лаг для потребления и использования их Человеком. Вся сумма результатов человеческой деятельности привела нашу цивилизацию к экологическим проблемам, катастрофическим изменениям среды обитания и климата Планеты. Возникла чрезвычайная экологическая ситуация. В таких условиях человечество за все время своего существования еще не находилось. Нужна смена логики социального поведения, нужна ликвидация монополии на знания. Прежде всего человек должен защищать биосферу, и это обернется его собственной, долговременной, а не сиюминутной выгодой. Это и есть искомая альтернатива антропоцентризму - биоцентризм.

Развитие науки в XX веке породило определенные противоречия в понимании основополагающих, концептуальных понятий в естествознании, которые создают значительные трудности в дальнейшем развитии науки.

Результаты новейших исследований позволяют вое чаще высказывать соображения о многомерности объективной реальности, искривлении пространства, проявлении эффекта дальнодействия и других явлениях, противоречащих концепции четырехмерного континуума. Все это свидетельствует об ограниченности наших миропредставлений и необходимости пересмотра многих основополагающих взглядов в современном естествознании. Перечень нерешенных проблем столь велик, что даже неприлично не только утверждать , но и думать о проникновении человека в тайны природы. Нет сомнений, имеются значительные успехи в установлении закономерностей к количественных соотношений в Природе, используемых в практических целях. Но без раскрытия сущности незримых реальностей, из которых состоит Мир, вести разговор о его устройстве бессмысленно. Из абстракция реальный Мир построить невозможно, как невозможно изучить его до концг методом индукции, т.е. умозаключениями от фактов к общему утверждению,

Об этом в свое время писал и академик Г.М. Франк: "На настояще! этапе развития биологиии задача заключается в том, чтобы попытатьс! совершить скачок в познании жизнедеятельности клетки - сложной системы, саморегулирующейся и устойчивой, несущей в себе не только программу стабилизации свойств и процессов, но и программу развития в нисходящих поколениях и программу реакции применительно к меняющимся уело

виям внешней среды. От набора отдельных химических компонент клетки расстановки этих компонент в пространстве следует перейти к анали. действия всего клеточного механизма "в сборе". Экспериментальные дш ные, полученные на разрушенных клетках, часто не отражают истинно] течения тех или иных процессов в условиях временной и пространствен» организации живой системы. Это связано и с тем, что свойства коопер, тивной системы, организованной из отдельных макромолекул, не являют! простой суммой свойств этих макромолекул. В такой системе проявляют качественно новые свойства, характерные для нового уровня организаод: Поэтому необходимо использовать методы получения информации без разр шения живой системы. Необходимо научиться объединяющему мышлению.

Однако, процесс синтеза - одежное дело, т.к. обязательно на заставить себя выйти за рамки стереотипов, за рамки обычного мышлени сделать шаг вперед, преодолеть самих себя. Об этом говорил и академ В.А.Энгедьгард: "... сведение - для целей познания - сложного к сум его частей требует и своего обращения - поисков правильного обратно пути к сложному". Синтез никогда не делается на том же уровне, на к тором делался анализ. Если надо объединить две противоположности, к торые не хотят сходиться, то синтез, точка их объединения, будет нал диться не в той плоскости, где они лежат, а выше. Синтез выводит к на совершенно новый уровень, "давая новое качество. Синтез - это ос единение не только частей, составляющих объект изучения, но это и ос единение внутри нас самих с окружающим миром, и тем самым, познав этого мира. Вопросы.синтеза выводят нас за пределы того мира, котог можно определить как "мир количества", и вводят нас в "мир качеств«: Т. о., необходимо найти в науке место для качественной оценки приро? С этой целью в работе рассмотрены некоторые новые разработки в нау| чтобы, опираясь на необходимость решения проблем мониторинга, с учес современной теоретической базы выстроить методическую и аппаратур] базы реализации решения ряда проблем охраны среды обитания имени учетом новых подходов и методов исследования мира.

Изменения в биосфере в результате различного антропогенного в< действия и социально-экономических преобразований хозяйственного ко: лекса страны влияют на состояние природной среды. Одной из основ задач экологического мониторинга является получение количественных : рактеристик и параметров, необходимых и достаточных для анализ оценке состояния среды обитания и степени ее влияния на качества б логической компоненты, в первую очередь на здоровье населения. Меди

дологическая проблема оценки характера взаимосвязи состояния здоровья о средой обитания имеет многопрофильный и многоплановый характер, экже разнообразны методы исследования и анализа для установления ука-анной взаимосвязи, а следовательно, и технические средства.

Каждое отдельное направление мониторинга ориентируется на наблю-ение и оценку состояния соответствующих компонентов среды обитания и риродных ресурсов. Получаемая информация, обосновывающая принятие уп-авленческих решений часто оказывается не полной и не достоверной, а ами решения - неадекватными степени экологической опасности, т.е. ногообразный фактический опыт оценки среды обитания и измерения ее морфологических" параметров уже не обеспечивают потребности темпов и асштабов внедрения человека в жизнь окружающей среды. Продуктивное правленческое решение может быть принято на основе анализа изменений арактера движений земного вещества, которые происходят или из-за уве-ичения, или из-за уменьшения его как накопления, так и расхода.

Известно, что для решения большого количества частных задач при онтроле среды обитания используют живые системы, в том числе различие микроорганизмы. Так, например, в Московском университете занимают-я методами биотестирования качества водной среды, вопросами утилизами загрязнений среды обитания с помощью микроорганизмов и т.д. Приме-ение их для целей контроля можно объяснить, в частности, тем, что ясные организмы способны воспринимать более низкие концентрации - веществ, ем любой аналитический датчик. Главное же, с нашей точки зрения, что зменения в движении земного вещества (среды обитания) находят обяза-ельное отражение в той или иной реакции живой системы.

Считают, что формализация вариантов взаимодействия среды обитания жизнедеятельности популяций в токсилогическом эксперименте и в нату-е может явиться основой в построении оперативных программ следящего онтроля за средой обитания методами определения непосредственного ре-гирования на различные воздействия и обратной связи с источниками агрязнений. Накопление избыточных количеств антропогенных факторов азличной природы приводит к снижению и истощению процессов саморегу-яции и адаптационного гомеостаза, увеличению общей гибели. Опережаю-ая токсикометрия к тому же является необходимым элементом обоснования естов реагирования живых систем на экзогенные воздействия, которые олжны быть встроены в структуру технологического мониторинга.

Загрязнение среды обитания даже сублетальными дозами токсикантов огут иметь серьезные последствия. Не вызывая видимых морфологических

нарушений и иаменений поведенческих реакций, при длительном воздей тбш они могут накапливаться в организме и приводить к отдаленным п талогическим изменениям в нем. В связи с этим необходим поиск так методов исследования, которые отражали бы изменения 'физиологически состояния организма в результате неблагоприятных внешних воздействий

Основная концепция рабода. Среди основных потоков в органическ природе (вещество, энергия, информация) наименее изученными остают закономерности патока информации. Современные данные позволяют сч тать, что в информационных взаимодействиях в живых системах болып роль принадлежит биологическим ритмам, т.е. временной организации би системы. Исследование временной организации механизмов функвдониров ния жизненно важных систем организма, а также их регуляции в различи условиях среды обитания является перспективным и многоплановым напра лением современной науки. Изучение цикличности физиологических проце сов позволяет подойти к решению ряда теоретических и практическ проблем хронобиологии, в частности, прогнозированию адаптационно-при пособительных возможностей организма, выработки научно обоснован« мероприятий, направленных на их оптимизацию в новых условиях сре обитания, ранней диагностики заболеваний, а также поиску эффективен методов, средств профилактики и лечения болезней.

Согласно современным представлениям о биологических системах, с ной из важных их черт является взаимосвязь между пространственными временными изменениями их показателей, т.е. единая пространстве но-временная организация. Временная организация, обладая широкими р= ками лабильности, участвует в процессах изменчивости биологичесь системы, подвергающейся воздействиям, и тем самым обеспечивает адат циогенез системы. Пространственная же организация биологической сист мы выполняет функцию ее структурно-функциональной стабилизации, сохранения даже в условиях действия экстремальных факторов.

Одним из проявлений пространственной организации биологичес* системы является их топографическая и топологическая гетерогенное! выражающаяся, в частности, в форме градиентов. Степень выраженное градиентов и их связь с временной динамикой процессов в системе из» няются при воздействиях на нее. Пространственно-временные законом! нооти экосистем пока изучены недостаточно, но есть основания полага' что это направление исследований как в теоретической, так и в прак' ческой экологии даст новую ценную информацию.

Т.о., для контроля за состоянием среды обитания перспективно ]

пользовать живые организмы (в частности, микроорганизмы), т.к. при определенном изменении среды система откликается' соответствующей "реакцией". Она ляется либо в количественном варианте ('изменение количества тех или иных биохимических компонентов в определенном объеме клетки, изменение степени пространственной ориентации этих биохимических образований) , либо в качественном варианте (изменение векторов изменений градиентов концентраций биохимических компонентов, изменение векторов изменений градиентов степени пространственной органивации).

Благодаря специфике объектов в биологии и своеобразию методов исследования теория биологии, с нашей точки зрения, существенно отличается от теории наук о неживой природе. Представление о единстве и разнообразии жизни .выдвигают проблему исследования сочетания разноуровневых процессов и их взаимосвязи в живых системах. Речь идет о необходимости получения комплексной структурно-динамической (пространственно-временной) информации для живых систем разной степени сложности.

Подчеркнем, что в системах, где проявляются качественно новые свойства, характерные для нового уровня структурной организации, изучать эти свойства необходимо, не разрушая этой структуры, т.к. свойства структуры, организованной из отдельных макромолекул не являются простой суммой свойств этих макромолекул. Получение разнообразной информации непосредственно из интактных клеток является важной задачей.

В последнее время исследователей все больше интересует подход, когда внимание переносится с элементов анализа отдельно взятой системы на отношения и связи не только между ними, но и окружающими системами вместе взятыми, т.е. основой такого подхода является исследование и изучение объекта с его взаимоотношениями и взаимосвязями с внешними по отношению к нему объектами и внутренними средами, полями и их следами. При переносе этого положения в исследования на клеточном уровне следует, вероятно, акцентировать вынимание на анализе и синтезе не свойств компонентов клеток, а отношений внутри них и их отношений с окружающим миром. Можно полагать, что одним из самых главных аспектов исследования является изучение скрытых (внутренних) отношений структурированных элементов, их свойств й признаков, а.также изучение внутренних отношений- (внутренней информации) с внешним миром (внешней информацией).

Следовательно, необходима методическая база, которая дала бы возможность сделать еще шаг к пониманию проблемы существа жизни, а при при работе над такой базой фундаментальные значения приобретают представления о единстве и многообразии жизни - двух неразрывно связанных

сторонах одного явления. Для отдельных направлений исследований ключевое значение имеет либо структурно-морфологическое многообразие, либо функционально-физиологическое единство жизненных явлений, что определяет и разные пути применения и разную роль в этих двух случаях количественных методов и количественного выражения итогов исследований.

Представления о единстве и многообразии жизни выдвигают проблему установления последовательности, направления, скорости перемещения вещества, энергии на разных уровнях организации, а также во взаимосвязи живых систем, и среды обитаний. Т.е. необходимо получение комплексной структурно-динамической и пространственно-временной информации через динамику изменений градиентов перемещения вещества, энергии, состояний, а также через "среду" живых систем различной степени сложности.

Структурно-морфологическое же многообразие и функционально-физиологическое единство жизненных явлений, которые имеют ключевое значение для отдельных направлений исследований, определяющие разные пути применения и разную роль в этих двух случаях количественных методов и количественного выражения итогов исследований, определяют подходы к разработке, которые адекватны поставленным задачам. Первое требует использование методов дискриптивного исследования с последующим анализом признаков единства, второе - методов, которые составляют экспериментальную основу классической биохимии и молекулярной биологии, с той только разницей, что объектами исследований являются макромолекулы и макромолекулярные системы, выполнявшие определенные функции в неразрушенной живой клетке на отдельных ее уровнях с учетом структурно-морфологического многообразия. Такое методическое направление можно считать естественным развитием исследований единства жизненных явлений, предназначенными для решения именно тех вопросов, которые невозможно либо трудно решать методами тех наук, которые предусматривают разрушение .живых систем, т.е. для решения вопросов, обеспечивающих связь дискриптивного и экспериментального методов исследования.

Задача заключается в их объединении и,применении с учетом разной роли в этих двух случаях количественных методов и количественного выражения итогов исследований. Приоритет "морфологическим" или "биохимическим" признакам можно и нужно отдавать только по отношению к отдельным частным задачам, но не к анализу системы в целом.

Коснемся одного из возможных вариантов реализации данной задачи.

Проблемы исследования структуры материи имеют огромное значение для биологии, ибо структура является основой функционирования любой

отемы. определяя ее разнообразные свойства. Поэтому необходимо раз-:тие методов исследования таким образом, чтобы они смогли обеспечить лучение информации о степени упорядоченности живых структур.

Сформулируем основные требования к методам исследования степени ;орядоченности. Для этого обратимся к гипотезе стохастической псев-«ристалличности, в соответствии с которой структуры рассматриваются « трехмерные случайные поля, обладающие упорядоченностью, степень 1Торой обусловливает свойства и Функциональные возможности исследуе-IX объектов. Структура является основой функционирования любой систе-I, определяя ее разнообразные свойства. Материальным носителем жизне-'ятельности организма является структурная организация живого объек-и Причем индикатором на изменения состояния живой системы, в том юле и при изменении среды обитания.' должны явиться динамические избиения (динамика изменения градиентов, потоков этих изменений, ско-ютей и направлений) пространственной и временной организации матерись ного носителя "состояния" организма, учитывающего глубокую общность взаимосвязь морфологии, физиологии и биохимии клетки.

Это означает, что, если разработаны методы и устройства получения [формации о неразрушенном объекте по трем координатам, то возможно ютъ количественную информацию о свойствах этого объекта. Лля живых ютем помимо пространственных координат существует и временная.

Т.о. исследования в таком направлении должны располагать методичкой базой, которая должна обеспечить выполнение следующих требова-м: 1) анализ многокомпонентных гетерогенных систем, каковыми являют-I клетки, должен проводиться без их разрушения: 2) необходимо обеспечь получение информации об изменении во времени химического состава уьектов на разном растоянии от его поверхности (определение динамики зменения градиента концентрации во времени); 3) необходимо обеспечить мучение информации об изменении степени организации биополимеров во земени и в пространстве (определение динамики изменения градиента гепени пространственной организации); 4) необходимо использовать статические методы анализа и синтеза, поскольку реальные объекты, как завило,'.носят случайный, а не детерминированный характер. Кроме того, гобходимо всегда помнить, что объект исследования находится в едином йормационном пространстве и является его частью. На основе спект-альных данных можно обеспечить получение информации об определенных вменениях в структурах клетки, т.к. спектральная характеристика свя-ана со строением атомов и молекул и отражает все изменения, проясхо-

цящие в них в процессе наложения на них внешних разнородных электс магнитных волн или в процессе отдачи ими информации.

Пели и задачи работ. С этой целью были рассмотрены некоторые > ■вые разработки в науке, чтобы, опираясь на необходимость решения эь логических проблем, с учетом современной теоретической базы выстро! методическую базу реализации решения ряда проблем охраны среды обит ния именно с учетом новых подходов и методов исследования мира.

Возможность определения этих параметров в живых системах откры} ет, с нашей точки зрения, перспективы в решении очень многих вопрос в проблемах экологии. Следует особо подчеркнуть, что речь идет о вс можности "послойного" анализа многокомпонентных- гетерогенных рассеш ших объектов, независимо от их происхождения.

Созданию именно такой методической базы и посвящена данная рабе

Для ее реализации необходимы:

1/ разработка простых технических средств для получения инфор» ции -при анализе неразрушенных нативных клеток:

2/ разработка методов получения информации при работе с нативт клетками "по слоям", т.е. необходимо получать информацию с раэлич1 "срезов" нативных клеток без их разрушения: часто нужен не интегра: ный"спектр, а внутрисистемная объемная информация;

3/ разработка методов получения информации о динамике измене! градиентов концентрации биохимических компонентов в различных сл( нативных клеток: т.к. скорость характеризует изменения и является, 1 видимому, свойством живого, если выразить динамические изменения в I дичественных характеристиках;

4/ разработка методов получения информации о динамике измене! градиентов, степени пространственной организации биополимеров в разл! ных слоях нативных клеток;

5/ выбор и разработка методологии анализа таких сложных сис как нативные клетки;

6/ необходимо на конкретных примерах показать возможность полу ния перечисленной информации из многокомпонентных гетерогенных сис и эффективность этой информации при анализе нативных клеток.

Все перечисленное требует исследования большого количества'воп] сов, объединенных одним - созданием методической базы анализа мно: компонентных гетерогенных систем (в том числе и нативных клеток") - : дикаторов изменения среды обитания.

Анализ современных методов исследования показывает, что получе

¡шформации о таких сложных объектах, как нативные клетки,, перспективно эсушествлять через регистрацию изменений параметров электромагнитных 18лучений при его взаимодействии с объектами исследований. Эти объекты сак правило многокомпонентны, гетерогенны, сильно рассеивают свет. 1ричем анализ их желательно вести по слоям. Наиболее полно в настоящее зремя отвечает перечисленным выше требованиям методы спектроскопии внутреннего отражения: если электромагнитная волна (например, свет) распространяется в более плотной среде (измерительный элемент - ИЭ), ^ем объект исследования, то при отражении от границы раздела этих сред три углах падения, больших критического (8кр), волна "заходит" в образец на некоторую глубину id) и если образец поглощающий, то, регистрируя изменение светового потока (из-за поглощения образцом) на выходе ЯЗ-та, получают спектральную характеристику. Она может быть получена шбо в режиме "массивного образца" (МО), когда d меньше толщины образ-jb, либо в режиме "тонкой пленки" (ТП), когда d превышает толщину образца. Преимущества заключаются в следующем: можно получать характеристики послойно (величиной d регулируема) даже непрозрачных объектов, эти характеристики могут быть получены в любом спектральном диапазоне «обыми методами, использующими электромагнитное излучение. Поэтому не-збходимо рассмотреть все особенности при работе этими метода»™ с сильно рассеивающими многокомпонентными гетерогенными системами.

Спектральные характеристики, полученные в поляризованном свете аают к тому же информацию и о преимущественной пространственной ориентации определенных химических связей в макромолекулярных компонентах •слетки. Это, в свою очередь, может характеризовать in vivo организованность биосистемы и, соответственно, ее функциональное состояние. Необходимо предложить и в этой области решения для ее практического использования при работе с нативными клетками.

Любой метод анализа требует знания количества прореагировавшего' с электромагнитным излучением образца. Следовательно, одним из самых важных вопросов подобного анализа является разработка методов количественного определения характеристик и параметров этого образца. Поскольку анализируются спектры нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО) образцов, представлюших из себя клетки, распределенные по поверхности измерительного элемента (ИЭ-та) (т.е. совокупную систему, ростоящую из клеток, воздуха, жидкой, среды и т.д.). то характерной эсобенностью при количественном анализе параметров исследуемых объектов является зависимость эффективных оптических свойств среды от объ-

ема незаполненного (заполненного) объектами пространства.

Из сказанного следует, что специфика количественного анализа методами НПВО требует в целом ряде случаев учета оптических постоянных объекта - показателя преломления (ПП) и коэффициента поглощения (К). При взаимодействии света с нативными клетками могут проявить себя эффекты, которые необходимо учитывать при количественных измерениях.

Научная новизна работ. Определяется тем, что впервые рассмотрены как качественно, так и количественно вопросы "послойного" анализа на-тивных клеток (без их разрушения) с целью получения информации о динамике разнообразных изменений градиентов биохимического состава и градиентов степени пространственной организации. Для этого впервые теоретически обоснована и создана методическая база по всем пунктам, перечисленным в "целях и задачах работы" и затронутым в "основных концепциях работы". Впервые, когда не только теоретически, но и экспериментально предпринята попытка объединения и применения с помощью разработанной методической базы методов исследования структурно-морфологического многообразия и функционально-физиологического единства жизненных явлений для количественного выражения итогов исследований, когда приоритет "морфологическим" или "биохимическим" признакам был отдан лит при решении частных задач (рассмотренных, также впервые, в следуюида главах), но не к анализу системы в целом.. Впервые разработана проста* аппаратурная база для экспериментальной реализации перечисленных выше задач не только при работе с любыми серийными спектральными приборами, но и для исследования нативных клеток методами циркулярного дихроизмг и дисперсии оптического вращения.

Научно-практическая значимость. Предлагаемые в данной работе методические и технические аспекты, составляющие значительную ее часть, и которые являются базой для анализа многокомпонентных гетерогенны) сильно рассеивающих систем, дают возможность получать разносторонним информацию не только при работе с интактными клетками, но и практически с любыми объектами самого различного^происхождения, находящихся : любых фазах (твердое вещество, жидкость, газ), что, в частности, необходимо при анализе среды обитания для ее охраны.

Апробация работ. Результаты работы докладывались на 1 Всесоюзно, конференции по биотехнике (Москва, 1972), на 3 Всесоюзном совещании п управляемому биосинтезу и биофизике популяций (Красноярск, 1973), на научной конференции молодых ученых Научно-исследовательской Лаборато рии экспериментальной иммунобиологии АМН СССР (Москва, 1973), на

Всесоюзной конференции по комплексной механизации и автоматизации технологических процессов в химико-фармацевтической промышленности (Ленинград, 1974),. на конференции "Вирусы микроорганизмов" (Пушино, 1981), на 3 совещании "Биофотометрия" (Пущино, 1985), на Всесоюзной конференции "Вирусы микроорганизмов и растений" (Ташкент, 1986), на Всесоюзной научной конференции "Физико-химическая биология и биотехнология фототрофных микроорганизмов" (МГУ, 1987), на Всесоюзной конференции "Биофизика микробных популяций" (Красноярск, 1987), на научных конференциях профессорско-преподавательского состава МГТА (Москва, 1987-1998), на 2 Всесоюзной конференции по проблемам реабилитации населения в зонах экологических нарушений (Москва, 1995), на Всероссийской конференции "Текстиль-96" (Москва, 1996), на Всероссийской конференции "Гекстиль-97" (Москва, 1997), на Международной конференции "Ин-тернас, 97" (Калуга, 1997), на Всероссийской конференции "Текстиль-98" (Москва, 1998), на Межвузовской научно-технической конференции "Современные проблемы текстильной и легкой промышленности" (Москва, 1998), на международной конференции "Прогресс-88" (Иваново, 1998).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, семи глав, заключения, списка цитированной литературы. Текст разбит на 28 параграфов, нумерация формул, рисунков и таблиц производится следующим образом: записывается номер главы, номер параграфа в этой главе и номер формулы (рисунка, таблицы) в этом параграфе.• Работа содержит 230 страниц, 74 рисунка, 15 таблиц, список литературы из 204 наименований.

Бее перечисленные выше проблемы были сформулированы и представлены во ВВЕДЕНИИ и в ПЕРВОЙ ГЛАВЕ в виде целого круга вопросов. Ответы на эти вопросы составляют содержание остальных 6-ти глав диссертации, каждая из которых излагает теоретические и экспериментальные основы разработанных методов, содержит экспериментальные результаты по конкретным объектам и специфическим задачам.

ВТОРАЯ ГЛАВА "Разработка аппаратуры для исследования нативных клеток" посвящена созданию специализированной аппаратуры для решения сформулированных в 1-ой главе вопросов.

Перечисленные в предыдущих оазделах задачи требуют специальной

техники, которая промышленностью не выпускается, но для работы с которой можно было бы приспособить серийно выпускаемые спектральные приборы. Поэтому в главе предлагаются разработанные нами устройства, которыми, пользовались при получении всех экспериментальных результатов.

Ранее было показано, что при работе с биообъектами методами НПВО получение контрастных неискаженных спектров определяется правильным выбором соотношений между в (угол падения светового потока), гн (показатель преломления материала измерительного элемента) и ng (показатель преломления исследуемого образца), которые связаны с К (коэффициентом поглощения образца).

Практическое выполнение этих требований часто сталкивается с тем, что выпускаемые промышленностью приставки для работы в режимах НПВО и МНПВО (многократного НПВО) имеют ограниченный набор измерительных элементов (ИЗ) и предназначаются для конкретной аппаратуры. При замене же стандартных ИЭ-тов на самостоятельно изготовленные с необходимыми для каждого конкретного эксперимента параметрами исследователь сталкивается с трудностями юстировки. Часто и' переюстировка не обеспечивает нормальный режим работы из-за несоответствия используемого ИЗ-та оптической схеме прибора. Сказанное приводит к необходимости разработки устройств, которые могли бы быть использованы для решения самых разнообразных задач, что требует иметь ИЗ-ты с любыми ni и 8 в спектрометрах с разными оптическими схемами и в разных спектральных диапазонах.

Разработанная универсальная приставка МНПВО выполнена на основе зеркальной оптики и позволяет регистрировать спектры МНПВО для углов падения от 5° до 85° при использовании ИЭ-тов, изготовленных из материалов для О.е^щле. Устройство позволяет использовать ИЭ-ты с различным числом отражений (N), дает возможность работать с жидкими и твердыми образцами, порошками, эмульсиями, суспензиями и другими объектами. Она смонтирована на легкой пластине и устанавливается в кюветное отделение прибора, легко снимается и устанавливается обратно, не требуя переюстировки. Предусмотрена возможность работы с ИЗ-ми различных геометрических размеров. Получены выражения для расчета ИЗ-тов для 45°<«<45°, если а - угол при большем основании элемента МНПВО.

При а<45° свет отражается от рабочих поверхностей ИЭ-та под углом 8=2«. Получена зависимость, связывающая полезную площадь светового отверстия с параметрами ИЭ-та: l=2t-sin8, где t-толщина элемента. Получено выражение для определения числа отражений в таком элементе: N= С(1g/t) + ctgjctgö, где ia-длина малого основания элемента. Это выражение справедливо для 6>45°. Для 8<45° получено выражение: N=C(lg/t) + sin2Ö]ctg0.

При а>4Б° свет отражается от рабочих поверхностей под углом

8=180°-2а. Число отражений находится из найденных выражений: iM=ctgeC(l2/t) +'ctg03-2 для 6>45° и N=ctg6[(l2/tJ + sin203-2 для 8<45°

Получено выражение, определявшее условие сохранения фокусировки мз-за конечной угловой апертуры прибора и из-за влияния дисперсии показателя преломления материала ИЭ-та: 2X=N-t•tge-fN-t/nicosQi-t/ni, где Х-расстояние от треугольной призмы до элемента МНПВ&. лаяа методика расчета параметров приставки, приведены примеры расчета.

Разработана беззеркальная приставка МНПВО. Свет от источника попадает в ИЭ с сечением в виде параллелограмма через его основание так, что отразившись от наклонных поверхностей элемента, попадает на рабочие поверхности. На вход монохроматора свет направляется при помоши аналогичного элемента, расположенного параллельно первому. Чтобы использовать ИЭ-ты с любыми 8, щ, и N, между основаниями элемента использован компенсирующий элемент, прозрачный в исследуемой области, с n-i. Для а<45° найдено, что N=(li/t)ctg9, а для <г-45° -N=(li/t)ctg0-2. Получено выражение условия сохранения фокусировки при использовании различных ИЭ-тов: K=(niVni)[(L-2nit)/ini'-l)], где К-длина компенсирующего элемента, щ"-показатель преломления компенсирующего элемента, L-действительная длина светового пути в ИЭ-те.

Лля работы в режиме ТО были реализованы простые ИЭ-ты НПВО й МНПВО, которые не нуждаются в сложных оптических схемах. Они позволяют производить плавную перестройку по. углам падения света и в режиме МНПВО. Здесь в качестве третьей, низкопреломляюшей среды, используется не воздух, а поверхность оптического материала, прозрачного в аналитической спектральной области, с показателем преломления меньшим, чем показатель преломления воздуха, тогда воздушная среда, в которой распространяется свет, будет являться ИЭ-том. В качестве третьей среды использовали пластинку фтористого лития (LiF), показатель преломления которого на длинах волн \> 10 мкм меньше единицы.

Известна зависимость d от X, в и n«i (ng/ni), а т.к. практически отсутствуют ИЭ-ты, у которых пц'.Х)-const, то было разработано устройство, которое учитывает это при записи спектров в различных диапазонах оптического излучения. Данная глава заканчивается этой разработкой. Приводится методика расчета необходимых ИЭ-тов, дается пример расчета для элемента из германия (Be) и расчетные значения параметров ИЭ-тов,

изготовленных из различных материалов.

Итак, создана техническая база для реализации поставленных задач. Необходима теоретическая и методическая базы для получения количественных характеристик и параметров исследуемых объектов.

В ТРЕТЬЕЙ ГЛАВЕ "Исследование, особенностей взаимодействия света < биообъектами при количественных измерениях" основное внимание был< уделено исследованию влияния формы и размеров интактных клеток при и; взаимодействии с электромагнитной волной.

Лля выполнения епектроаналитических определений были рассмотрен« вопросы подготовки биологических объектов. Известно, что для полученш контрастных спектров НПВО (МНПВО) требуется контакт между йЭ-ом и образцом. Для этого клетки наносили на рабочие поверхности ИЭ-тов в водной суспензии, затем подсушивали несколько минут. Проверка на выживаемость проводилась по принятой в микробиологии методике. Получек спектры микроорганизмов самых разнообразных форм и размеров в ИК диапазоне без их разрушения. Рассмотрены области поглощения различным! биохимическими компонентами, входящими в структуру микроорганизмов.

Количественный анализ параметров исследуемых объектов методам] внутреннего отражения зависит от эффективных оптических свойств сред; '.состоящую, например, из клеток, воздуха, жидкой среды и т.д.), о' объема прореагировавшего с электромагнитным излучением вещества. Поэтому интенсивность спектров будет зависеть от количества клеток н; ИЗ-те, плотности их упаковки, их формы, размеров. Было решено две задачи, которые обеспечивают этот анализ: т.к. объемная концентрация нг ИЗ-те для различных клеток может оказаться различной, то получены данные для микроорганизмов с самыми разнообразными размерами (табл.1) пр) условии, что они заполняют всю рабочую поверхность; разработаны метод! определения объема прореагировавшего со светом клеточного вещества независимо от количества клеток.

1. В основу первого метода был положен принцип "подходящего индикатора": если к нанесенным на рабочую поверхность ИЭ-та неразрушенно клеткам добавить известное количество другого вешества, то разноси показаний оптических плотностей в аналитической полосе индикатора пр] отсутствии интактных клеток и в их присутствии пропорциональна концентрации (объему) вещества клеток или же объему межклеточного пространства (параметры ИЭ-та известны). Б качестве индикатора, в частности, использовали водные растворы сахарозы, имеющей полосу поглощения :

области 1100 см"1. При записи спектров в режиме МО коэффициент отражения R будет зависеть не только от К, но также от 9. net и N. входящих ь выражение для а. Зная эти параметры, можно определить d в срезе, состоящую из клеток и индикатора. Это означает, что при совпадении их показателей преломления в анализируемой полосе поглощения стабилизация объема измеряемого вещества происходит автоматически. Поскольку R пропорционален а, то можно определить объем незаполненного пространства рабочей поверхности ИЭ-та клетками.

На основании анализа результатов измерений в. режиме МО можно сделать вывод, что объем межклеточного пространства для микроорганизмов с различной формой и размерами, заполнивших всю рабочую поверхность ИЭ-та, отличается максимально на 13% и что, исходя из средней величины этого разброса (6,5%), можно проводить измерения с достаточной, для практических целей точностью без учета их формы и размеров.

Таблица 1

измерительный объем межклеточного пространства, %

элемент

при 8 = 45° E.coli Cand.quii. Act.aureof. Chi.vulgar-. Spirui.plat.

германий 10 12 20 15 23

стекло ИКС-25 10 10 17 11 20

?:. Лля определения объема прореагировавшего с электромагнитным излучением штатных клеток методы, основанные на нарушении ПВО, в количественном анализе использованы не были. Поэтому был проведен теоретический анализ прохождения света из ИЭ-та в клетки и его возможного последующего изменения в зависимости от угла падения, от Формы и размеров объекта, его показателя преломления и формы контакта поверхности образца и рабочей поверхности ИЗ-та. Для этого рассмотрели возможность применения различных моделей, которые использовали для анализа отмеченных изменений интенсивности светового потока на выходе ИЭ-та.

а/' Если наблюдать с помощью микроскопа рассеянный клетками свет для 6, близких к 8Кр, при прохождении света из ИЭ-та в интактные клетки на длине волны, где нет поглощения, то происходит нарушение ПВО, но не за счет поглощения света клетками, а за счет рассеяния. Измеряемым

параметром здесь является рассеянный световой поток, который пропорционален заполнению рабочей поверхности ИЭ-та, т.е. объему прореагировавшего со светом образца.

Численные расчеты зависимости рассеянного светового потока от 8 [In$ísin9)] выполняли для моделей клеточных структур. В качестве модели слоя распластанных клеток полагали структуру, состоящую из плоских параллельных слоев, соответствующих зазору (2) между плазматической мембраной и ИЭ-том (1), плазматической мембране (3), цитоплазме (4). В последнем слое полагали наличие равномерно распределенных рассеивающих световую волну частиц. Интенсивность волны, прошедшей в этот слой, находили с ломошью теории характеристических матриц слоистых сред. При расчетах варьировали параметры модели h¿ и nj (ширина зазора и показателя преломления слоя i). В качестве модели сферических клеток на рабочей поверхности рассматривали монослой сфер в среде с ng. Была сделана опенка зависимости светового потока, рассеянного при HUBO на этой структуре, от угла падения плоской волны 8. На основании экспоненциального затухания волны в среде 2 при углах, превышающих предельный угол ПВО от границы ИЭ-культуральная среда, рассеянный световой поток полагали пропорциональным той части объема клетки, которая удалена от ИЭ-та на расстояние, не превышающее d поля волны в среду 2.

Получено, что для модели монослоя распластанных клеток резкое уменьшение по мере увеличения 8 начинается при 8g (sin0£ = П4/П5), который больше 83 (sinBi = n=/ni). Для модели монослоя сферических клеток уменьшение 1дФ по мере роста 8 начинается при 0i. Физический смысл этого состоит' в том, что при 8 > 61 основная часть поверхности сферических клеток удалена от ИЭ-та на расстояние, значительно превышающее d волны в среду 2. В эффективно сильное поле волны попадает малая часть клетки и резко уменьшается. Для модели монослоя распластанных клеток при 8 <. 82 и небольшом зазоре волна проходит практически без затухания и распространяется как бегущая электромагнитная волна. При 8 >82 поле становится экспоненциально затухающим, и рассеянный световой поток резко уменьшается по мере уменьшения d.

Величина уменьшения светового потока при увеличении 8 от 81 до 82 позволяет оценить площадь контакта поверхности клетки с ИЭ-том. Зная же d. a также площадь клеток на этой глубине, имеем значение объема прореагировавшего со светом клеточного вещества, что дает возможность проводить ¡количественные измерения, о которых было сказано выше.

б/ Известно, что ПВО наступает при 8 > 8кр. Тогда свет проникает

ъ образец на величину с!» которая пропорциональна той части образца, что прореагировала со светом и которую определяют как эффективную тол-шину. Она связана с оптической плотностью 0 = ос-И-с! , где « - показатель поглощения образца, бкр определяют из выражения з1п8кр = г>21 = Пй/П1. Для воздуха п = 1,0, а для стенок клеток примерно 1,5. Тогда в воздуха составляет 40°, а клеток - 52°. Следовательно, при изменении 8 рт 0 до 90° ПВО для воздуха наступает при меньших углах падения, чем для клеток. Поэтому интенсивность светового потока на выходе ИЭ-та при 3 < будет пропорциональна объему незаполненного пространства образцом на МЭ-те, т.к. при 6 < 8кР имеет место явление преломления, и гветовой поток в ИЗ не возвращается. Это означает, что при известных параметрах ИЭ-та получаем информацию о количестве объекта, прореагировавшего со светом потоком, и можем вести количественный анализ.

Для обоснования предложенного метода показано. Н зависит от п, г.к; форма объекта изменяет эту величину. Показано, что имеется механизм "просмотра" объектов по их толщине (глубине): при изменении в изменение й пропорционально величине относительного'зазора, т.е. форме збъекта. Иачастном примере предложена методика определения формы объекта. Показано также, что существует зависимость !? от площади контакта рбразца с ИВ-том. Получены зависимости I? от 8 для различных ги , показана возможная область углов падения при экспериментальной работе.

Для экспериментальной проверки теоретического анализа в качестве /словного монослоя выбран монослой целлюлозы. Сферические частицы смо-1елированы слоем сферического латекса диаметром 5 мкм. Получено, что зля монослоя сферических частиц резкое возрастание светового потока той возрастании 0 начинается с предельного угла ПВО от границы 'ИЭ-среда 2" (81). Для монослоя целлюлозы резкое возрастание й начинается при 02, превышающем 01. Согласно результатам теоретического ана-вдза угол 82 связан с показателем поеломления монослоя вблизи контактирующей с ИЭ-том поверхностью и позволяет его определить. Производная Ып[?/сЬз1п8 на линейном участке экспериментальных кривых при 8 > 82 газволяет оценить расстояние от поверхности ИЭ-та до монослоя. Резкое различие между указанными зависимостями позволяет исследовать кинетику гаполнения клетками поверхности ИЭ-та. Степень заполнения характеризовали разностью натуральных логарифмов измеренных значений световых потоков Д1пК = 1пК!(81) - 1пК(8о). Значение 1п!? позволяет оценить площадь юверхности, удаленной от ИЭ-та на расстояние не более а, т.е. опреде-шть объем прореагировавшего со светом объекта. Полученные характерно-

тики для моделей совпадают с характеристиками для нативных клеток.

Получена зависимость для случайного заполнения рабочей поверхности ИЭ-та "сжатыми" частицами, по излому которой можно определить показатель преломления (ПП) объекта. Данный метод позволяет также получит! усредненный по массе параметр объекта вблизи контакта с ИЭ-том. Увеличение светового потока начинается при угле Однако, изменение мене« 'резкое в сравнении с зависимостью для сферических частиц. Это означает, что форма объекта, обращенная к ИЭ-ту, отлична от сферической, I что увеличивается площадь контакта поверхности объекта с ИЭ-том.

в/ Рассмотренные выше два способа мы назвали амплитудными, предлагаем также фазовый спосо'б.

При линейно поляризованном световом потоке, распространяющемся з йЭ-те, при каждом отражении его от границы "ИЭ- образец" скачком изменяется фаза параллельной и перпендикулярной составляющих вектора нал-ряяженности электрического поля. Величина этого сдвига фаз различи; для каждой составляющей и зависит от разности ПП измеряемой системы ] ИЭ-та, а также от 8. При отсутствии образца ПП второй среды постоянен Поэтому разность Фаз также постоянна. При наличии образца на части ра бочей поверхности ИЭ-та .изменяется ПП, изменяются сдвиги фаз каждой и; составляющих электрического вектора и их разность, которая и являете: мерой объема прореагировавшего со светом вещества.

Для определение сдвига фаз был разработан следующий метод. На И' подается линейно поляризованный свет с такой ориентацией плоскости ПО' дяризации, при которой после многократного отражения от рабочих по верхностей ИЭ-та свет становится эллиптически поляризованным так, что пройдя компенсатор (преобразует сдвиг фаз между необыкновенным и обык новенным лучами в величину, равную 90°), имеет линейную поляризацию Тогда отраженное излучение может быть погашено путем поворота'анализа тора и с помощью фотоприемника определяют положения анализатора и по ляризатора, приводящие к минимуму интенсивности света на выходе, и п их углам поворота можно определить заполнение рабочей поверхност йЭ-та. В качестве компенсатора использовали ИЭ МНПВО с переменным уг лом падения, где входом служит призма однократного отражения. При иэ менении угла падения света на ИЗ число N будет различным, т.е. N зави сит от 0 и параметров ИЭ-та. Следовательно, для некоторого 8 разност <Ьаз на выходе может быть такой, что при неподвижном анализаторе све станет линейно поляризованным и погасится при определенной настройи анализатора. Тогда при изменении количества измеряемого вещества, т. 6

при различных заполнениях рабочей поверхности ИЗ-та. свет на выходе будет линейно поляризованным при другом значении 8. Это означает, что информация о заполнении веществом рабочей поверхности преобразуется из разности фаз в угловую зависимость, легко измеряемую. Информацию можно преобразовать во временной интервал, измеряемый с помощью электронных схем. Проведена проверка предлагаемого метода в лабораторных условиях. Разработана методика расчета компенсатора с переменным углом падения.

Т.о., в данной главе решалась одна из важнейших, с нашей точки зрения, задач - определение количества прореагировавшего со световым потоком объекта исследования, который представляет многокомпонентную гетерогенную непрозрачную среду (например, интактные клетки). Решение этой задачи дает^возможность перейти к решению следующего круга задач, связанных с количественным анализом параметров таких систем.

ЧЕТВЕРТАЯ ГЛАВА "Состояние поляризации источника излучения и особенности получения спектров НПВО интактных клеток" посвящена исследованию особенностей получения информации при работе с клетками для различных состоянияний поляризации источника излучения.

Дихроичное отношение в спектрах НПВО в общем виде описывается весьма сложным выражением, зависящим от многих переменных. Для случаев слабого поглощения (К<0,1) дихроичное отношение с высокой точностью аппроксимируется достаточно простым выражением. Показатель поглощения для пептидных полос достигает значений 0,2-0,3, поэтому провели дополнительное исследование. Теоретическим расчетом показали, а экспериментально проверили, что при достаточно больших 8 простое выражение дих-роичного отношения применимо и для случаев сильного пептидного поглощения, также определили границы применимости этого выражения.

Изучение ориентации молекул отдельных компонентов клеток на поверхности ИЭ-тов выполнено путем анализа интенсивности полос поглощения в спектре МНПВО, полученном при разной поляризации плоскополяризо-ванного света для 8=45°. Для изотропного образца дихроичное отношение в случае линейной поляризации равняется 2. Отклонение от этого значения характеризует степень анизотропии образца. Точность юстировки проверяли соотношением Ri2=Rh (Ri и Ru - R для перпендикулярной и параллельной составляющих шюскополяризованного света, соответственно), верным для изотропного образца при 0=45°-. Полученные данные (табл.2) указывают на отклонение от изотропного распределения макромолекул в

клетках: при исследовании интактных клеток необходимо учитывать дихроизм отдельных полос поглощения компонентов клеток.

Таблица 2

измерительный элемент бактерии Е.соП дрожжи СэдсЗ. ди111ег. мииелий Ас1. аигеох'ас.

германий ■1,8.1 2,17 1,92

кремний 1,85 2,10 1,79

ИКС-24 1,44

При записи спектров в режиме тонкой пленки (ТП) для ИЗ-тов из а и стекла ИКС-25 реализовали соотношение пз24/пз12>1, для элементов и; АеСГи из РЬГг - соотношение пзг4/пз12<1. Из эксперимента следует. чт< при выполнении второго условия выражения для слабопоглощающих объекто] лучше соответствуют полученным результатам, чем при выполнении первог? условия. Такое расхождение данных с теорией объясняем трудностью получения идеального'режима ТП при анализе интактных клеток.

Проведен анализ случаев, когда линейно поляризованный свет по; углом ' 45° взаимодействует с клетками. Тогда возникает разность фа; между двумя компонентами с взаимно перпендикулярной поляризацией, которая зависит от 6 и гн_. Путем преобразования ряда уравнений была получена зависимость изменения разности фаз от N и параметров И'З-та, , затем и зависимость сь® от N. Анализ этих зависимостей показывает, чт< при азимуте поляризации 45° необходимо знать N ИЭ-та и его характерно тики. При количественных измерениях следует работать не только с поляризованным светом, но и знать азимут поляризации.

Асимметрический анализ, оптическая активность и ее дисперсия яв ляются ценными методами исследования структуры, свойств биополимеров что может быть использовано для диагностики живого объекта, в'астроби ологии, в мониторинге, при анализе санитарного состояния среды... ид нако нет методической базы для исследования интактных клеток методам дисперсии оптического вращения (ЛОВ) и кругового дихроизма (КД). Ирак тическая реализация этих методов для исследования целых клеток требуе разработки специальных методик и аппаратурных возможностей.

Для регистрации КД клеток было использовано сочетание классических методов КП с методами спектроскопии НПВО. Получение циркулярной поляризации осно'вано на использовании ахроматического "четвертьволнового" компенсатора, в котором сдвиг фаз возникает при ПВО. Для этого свет, поляризованный линейно, направляется на компенсатор под углом г4Б° к его главному направлению. Расположение линейного поляризатора под углами, отличными от 45° , позволяет получить эллиптически поляризованным свет с любым эксцентриситетом эллипса и направлением вращения электрического вектора. Получены расчетные значения углов падения света на элементы ПВО, изготовленные из различных материалов, для определенных длин волн, обеспечивающих разность фаз 90°. Разработано устройство для получения КД интактных клеток, точность регистрации определяется как точностью получения циркулярной поляризации с использованием фазосдвигающего устройства, так и точностью регистрации спектров рассеивающих объектов методами спектроскопии BHyipeHHero отражения. Эксперименты показывают, что получаемые значения лежат в пределах расчетной величины. В качестве примера регистрации КД получены характеристики для Anabaena variabilis в области колебательных переходов.

Определены условия регистрации ДОВ интактных клеток, разработаны аппаратура и методики и на конкретных примерах показана практическая реализация этих условий. Для этого использовано устройство с ИЭ-том НПВО. В спектрополяриметрии фиксируется не поглощение света образцом, а поворот плоскости поляризации линейно поляризованного света з зависимости от его прохождения через оптически активное вещество. Мерой оптического вращения является угол поворота плоскости поляризации. При отсутствии образца в спекгрополяриметре на анализатор поступает линейно поляризованный свет. Установка ИЭ-та приводит к тому, что на выходе ИЗ-та появляется разность фаз между параллельной и перпендикулярной составляющими плоскополяризованного света, которая зависит как от 9, так и от П21 (возникает вращение плоскости поляризации света). Конечный результат измерения' будет также определяться значениями указанных параметров. Для устранения этого необходимо, чтобы разность фаз от изменения этих параметров была равна нулю. Это возможно при условии, что на выходе ИЭ-та будет присутствовать только параллельная или перпенди-.кулярная составляющая плоскополяризованного света. Для этого использовали линейно поляризованный свет с азимутом поляризации 0° или 90°.

В качестве примера регистрации ДОВ получена зависимость угла вра-

шения плоскости поляризации от длины волны для бактерий Е. coli.

В ПЯТОЙ ГЛАВЕ "Определение оптических постоянных дисперсных многокомпонентных гетерогенных рассеивающих свет объектов" рассмотрены вопросы определения оптических постоянных t'OII) нативных клеток при многократном отражении и приведены вычисленные по спектрам МНПЬО дисперсии показателя преломления и показателя поглощения клеток в различных областях спектрального диапазона.

Знание ОП позволяет оценить количественную сторону распространение излучения в среде и его взаимодействие с ней. ОП лают объективную характеристику самой среды, т.к, позволяют представить спектральные ланные в стандартной форме, не зависящей от условий измерения.

С практической стороны важно, что знание Oil обеспечивает основу »ля решения большинства прикладных задач, связанных с оптическими методами исследования: например, для. определения оптических свойств частиц смога, частиц минерального и биологического происхождения в атмосфере, фито- и зоопланктона в. океане, различных биологических объектов, лаже такая простая задача как получение спектра образца предполагает знание его ОП - только в этом случае можно обоснованно выбрать методику и условия регистрации и получить неискаженную информацию.

Олические константы необходимы для решения не только прямых задач. но и обратных. В частности, дистанционные методы немыслимы без знания ОП. Поэтому сравнительно хорошо известны ОП атмосферного аэрозоля, которые используют для оценки искажений при прохождении ИК излучения через атмосферу, для предсказаний изменений климата, для различных модельных расчетов. Однако этим данным не хватает значений оптических констант биологической составляющей атмосферного аэрозоля.

Известно, что от соотношения г>2/'ги и от K« при переходе света из ИЭ-та в образец зависит величина его расщепления, следовательно, и интенсивность поглощения света образцом и величина искажения спектров. Эти особенности методов НПВО для анализа дисперсии ОП биологических объектов представляют большой практический интерес и открывают новые принципиальные возможности для изучения интактных клеток. Поскольку в ИК диапазоне, в отличие от видимой области, данные по 0П биологических объектов практически отсутствуют, а сведений по дисперсии этих постоянных нет и для другого диапазона, в настоящем разделе предложена методика и рассмотрены особенности получения этих параметров.

Показано, что наибольшая точность при определении n« и может

быть достигнута при выполнении приближенного равенства [К?/(sirr-8-ngi2)ЬО,1. Конкретные условия эксперимента определили выбор "метода двух сред" с использованием ЙЭ-та МНПВО. Учитывая, что широкое распространение получили ИЭ-ты из ЯК стекол ИКС-24 и ИКС-25, а также из кремния (Si) и германия (Ge). представляет практический интерес получить значения R при определенном 8 для различных значений пг и Ко для определениям ОП с использованием указанных материалов.

Аналитический путь определения ОП трудоемок. Графическое определение проще и осуществляется с помощью рассчитанных. из формул Френеля кривых R=f(rvt ,П2,8)к2. где Кг - постоянная величина для каждой кривой. Измеренные значения Ri для двух ИЭ-тов при одной длине волны и одном угле падения яают две серии кривых ('возможных по-кг комбинаций). Решение этих комбинаций в системе пг-кг - координат дает единственную пару искомых значений ns и кг. Для этого необходимо построить отдельный график, для ИЗ-тов с разными показателями преломления. На основе проведенных расчетов для R} построены графики определения ОП при использовании ИЭ-тов из ИКС-24, ИКС-25, Si. бе. Значения Ri получены для угла падения светового потока 8 = 45°. Для вычисления Rh использовано свойство Формул Френеля для 8 = 45°, при котором Ri2 = Rii.

Опенка влияния дисперсии ПП ИЭ-тов на точность измерения по и kg показала, что проводить расчеты Ri для значенй ni, отличающихся менее чем на 0,01, не представляется целесообразным в выбранном диапазоне

значенй пг и Кг, т.к. ошибка при фотометрировании исследуемого объекта может превышать разность значений Ri, взятых из таблиц для известных пи, отличающихся менее чем на 0,01. Это позволяет за счет некоторого увеличения ошибки разделить интересующую спектральную область от 2-х до 4-х интервалов и построить, для каждого из них серию кривых Ri = fini, ng, 0)к2» приняв ni для каждого из интервалов постоянным. Используя полученные расчетные данные, были определены 0П бактерий Е.coil (С-85) в области полос поглощения амид 1 и амид 2 (рис.1). Было учтено влияние апертуры и учтен эффект многократного прохождения светового луча через ИЭ-ты с высоким показателем преломления.

Вносимая за счет этого ошибка при определении 0П: для ИЭ-тов из германия она составила 12Z, ив кремния - 8% и из стекла ИКС-25 - 17*.

Полученные в главе результаты позволили подойти к решению разнообразных практических задач для клеток, находящихся в сложных средах.

В ШЕСТОЙ ГЛАВЕ "Методические возможности исследования сложных сред при наличии биологических объектов" разработаны и предложены методики количественного исследования сложных сред в том числе, когда полосы поглощения анализируемых объектов перекрываются.

Исследования биообъектов в присутствии различных примесей представляет большой практический интерес, связанный и с проведением экспресс-анализа при контроле среды обитания, и с возможностью анализа клеток in vivo, и с решением большого числа аналитических задач... Большой интерес вызвает анализ объектов, когда их полосы поглощения перекрываются с полосами поглощения среды, где они находятся. Решение этой проблемы, вероятно, проходит черев решение большого количества частных вопросов. Перспективу именно такой позиции мы пытались продемонстрировать на конкретных примерах последующих двух глав.

На примере анализа клеток цианобактерий "по слоям" рассмотрены возможности экспериментального анализа ингактных клеток методами НПВО в ИК диапазоне. Показано, что разработанные методики можно применять в работах по изучению изменений в культурах клеток как при анализе причинности и механизмов перехода из одной фазы развития в другую, так и при различном воздействии на эти культуры.

Изучение возрастных изменений в живой системе так или иначе связано с анализом причинности и механизмов перехода из одной фазы развития в другую. Эти изменения представляются как переменная во времени

совокупность многих параметров живой системы, в которой важную роль играет перестройка регуляции путей метаболизма, что, в свою очерель, связано с модификациями пространственно-временной организации системы. Это свидетельствует о необходимости изучения изменений в структурной организации неразрушенной клетки, а также гетерогенности этой организации в процессе осуществления живой системой своих функций.

Показано, что разработанные методики дают информацию о наличии биохимических компонентов, идентифицируемых по их спектрам в заранее определенном, измеряемом слое клетки. Спектры, полученные в поляризованном свете, помимо упомянутой дают информацию о тех процессах, которые связаны с пространственной переориентацией определенных химических связей в макромолекулярных комплексах клеток, что может служить характеристикой прижизненной организованности системы в определенный момент времени. Именно это узкосмысловое определение вкладываем в понятие структурных изменений биополимеров в клетках.

Сформулированы условия, выполнение которых гарантирует получение спектральной информации с разных глубин ("слоев", "срезов") проникновения светового потока в клетку: 1) появление в спектрах, полученных с разных глубин, новых полос поглощения или исчезновение ранее обнаруженных полос; 2) если различаются концентрации биохимических компонентов в разных структурах клетки, то на разных глубинах должно изменяться соотношение полос поглощения, характеризующих эти компоненты; 3) определение дихроичных отношений на разных глубинах.

Важен также вопрос о влиянии времени записей спектров на результаты. Получены спектры ингактных клеток, записанные сразу и через 30 мин. В течение этого времени не обнаружено заметных изменений как в интенсивности полос поглощения, так и в дихроичных отношениях. Т.к. запись спектра производили за время, не превышавшее 1-3 мин, то считаем возможным не учитывать вероятную ошибку за время записи спектра.

В практике работы с микроорганизмами возникает необходимость анализа биомассы или ее компонентов в гомогенных или гетерогенных средах, когда их полосы поглощения перекрываются. Наиболее сложным является второй случай, когда наряду с микроорганизмами присутствует еще компонента среды - растительные клетки (например, мука злаковых, бобовых, пыльца растений и т.д.), полосы поглощения компонентов которых совпадают о полосами поглощения микроорганизмов. Особенности методов НПВО позволяют преодолеть эти сложности в конкретных случаях: с помощью вы-

бора соответствующих 0 и ГШ материала ИЭ-та, можно вастабилизировать количество исследуемого объекта. При записи спектров в режиме МО можем регулировать d, можем изменять размеры рабочих поверхностей ИЭ-та, т.е. возможно вести анализ наперед определенного количества вещества. Это приводит к очень важному следствию.

Допустим, что записан спектр одной из компонент сложной среды для заданного объема вещества, расположенного на ИЭ-те. Возможность записи спектров строго фиксированного объема вещества позволяет получить спектр известного количества второй компоненты сложной среды. Если D в выбранной для анализа полосе поглощения первой компоненты выше, чем D в этой же полосе поглощения второй компоненты, то в сложной среде, состоящей из этих компонент, интенсивность спектра не может быть больше, чем при записи характеристики первой компоненты, и не может быть меньше, чем при записи второй компоненты. Промежуточное значение (относительно двух крайних значений) D характеризует соотношение количества одной компонеты в среде относительно другой. Построив график зависимости концентрации одной компоненты- относительно количества другой от изменения D, можно определить количество искомой компоненты. .

В качестве примера практического анализа биологических систем, состоящих из микроорганизмов и гетерогенных сред, получены результаты количественного определения белка биомассы продуцента тетрациклина в присутствии кукурузной муки (в процессе биосинтеза этого антибиотика").

Приведенные примеры анализа компонентов клеток были выполнены в режиме МО. Возможности предложенных методик в режиме ТП показаны на примере изучения роста ядра и цитоплазмы при подготовке центральной клетки к делению и при созревании яйцеклетки в архегонии Pinus sibiri-са Du Tour, а также накопление белков и РНК в яйцеклетке. В этом исследовании одной из задач было определение содержания растворимого белка в режиме ТП, который имеет ряд преимуществ при подобном анализе.

Итак, на конкретных примерах ив практики показаны возможности анализа различных биохимических компонентов нативных клеток в режимах "массивного образца" и "тонкой пленки".

Для анализа многокомпонентных сильно рассеивающих сред, отдельные компоненты которых имеют перекрывающиеся полосы поглощения, что создает значительные трудности при анализе, исследовали особенности методов НПВО - использование ПП исследуемых образцов и фона, а также ПП и уг-

лов падения ИЭ-тов. Исследовали эти три варианта.

1/ Разделение с помощью выбора Ш: Допустим, что требуется провести анализ двухкомпонентной среды, состоящей из веществ А и В, имеющих соответственно показатели преломления пА и пв в выбранном для анализа спектральном диапазоне. Исследуемую среду вводим в непосредственный контакт с ИЭ-том. ПП которого удовлетворяет условию пгА <- П1< п«®. Тогда для вещества А можно обеспечить режим ПВО и при 0 > б^р получить режим НПВО или МНПВО. Для вещества В, у которого п«3 больше , чем Па ИЭ-та. условие в > 8кР выполнено быть не может . поэтому не удается обеспечить режим ПВО. Это означает, что в спектрах НПВО (МНПВО) двухкомпонентной среды будут проявляться полосы поглощения только того вещества, ПП которого в выбранном для анализа спектральном диапазоне меньше ПП ИЭ-та 1'в нашем примере только вещества А), даже если эти объекты сильно рассеивают свет и полосы поглощения вещества А и В совпадают в выбранной аналитической полосе спектрального диапазона. Так определяется оптическая плотность вещества А (Од), которая пропорциональна концентрации этого вещества в двухкомпонентной среде. Бд вещества В находим следующим образом. Если о помощью ИЭ-та, имеющего ПП, значение которого превышает значения ПП веществ А и В, определим суммарную оптическую плотность этих веществ, то оптическая плотность вещества В определяется из уравнения: Бв = Ое - Од. Таким же образом может быть проведен анализ многокомпонентной среды, состоящей из N компонентов с перекрывающимися полосами поглощения, когда 0 каждой компоненты. входящей в исследуемую среду, как разность двух последующих измерений могут быть вычислены на основании эксперимента: по результатам измерений определяем 0 каждой компоненты, входящей в исследуемую среду, как разность двух последующих измерений и по полученным оптическим плотностям определяем концентрацию каждой компоненты. Для иллюстрации возможностей предложенного метода приведены спектральные характеристики НПВО, позволяющие провести анализ сложной среды с перекрывающимися полосами поглощения, состоящей из воды и хинолина, на ИЭ-тах, выполненных из стекла ИКС-24 и флюорита (СаРг).

2/ Разделение с помощью выбора углов падения 9. Допустим, что требуется провести анализ двухкомпонентной среды, состоящей из веществ А и В, имеющих соответственно показатели преломления пгА и П2Е в выбранном для анализа спектральном диапазоне. Для каждого из этих веществ осуществляется режим НПВО при условии, что 8 > 01-р (вкрд = вкрВ). Если это условие не выполняется, то режим НПВО обеспечен быть не может. Ее-

ли ПП вешеотв А и В в выбранном диапазоне не одинаковы, то можно обеспечить неравенство 8крд < 8 < бкрв- 5то означает, что в спектре НПВО двухкомпоненгной среды проявляются полосы поглощения только того вещс-тва, для которого 8 > 8кР (в нашем примере только вещества А), даже если эти объекты сильно рассеивают свет и полосы поглощения вещества А и Б совпадают в выбранной аналитической полосе спектрального диапазона. Так определяется Од вещества А, которая пропорциональна концентрации этого вещества в двухкомпонентной среде. Оптическая плотность Dg вещества В определяется из уравнения: Db = De - Da. Анализ многокомпонентной среды, состоящей из N компонентов с перекрывающимися полосами поглощения, может быть проведен последовательным выбором 8, превышающим 9кр анализируемых компонентов смеси. По результатам измерений определяются D каждой компоненты, входящей в исследуемую среду, как разность двух последующих измерений.

В качестве примера практического использования предложенной методики получены спектры среды, состоящей из белка, липилов и нормальных углеводородов. Конечной целью измерения являлся анализ углеводородов в области 2930 см-1, где поглощают также и липиды. Следовательно, для определения углеводородов необходимо провести анализ липидов в другой области, характерной только для поглощения липилов, например, в области 1740 см-1. Но поглощение в этой области фонируется поглощением пептидных групп белка в области 1660 см-1. Использование ИЭ-тов с 8, превышающем 8кР для липидов, но меньшим 8кр для белка, позволило устранить мешаюшее влияние полосы поглощения белка и провести количественное измерение липидов в полосе 1740 см"*1. Затем было произведено измерение углеводородов в полосе 2930 см-1.

3/ Исследовано влияние соотношений оптических параметров биообъектов и фона на возможность обнаружения образца. Фон, даже непоглощаю-ший, в спектроскопии "на проход" значительно искажает результаты анализа. Это объясняется, в первую очередь, рассеивающими непрозрачными частицами фона, которые снижают интенсивность светового потока. Методы НПВО свободны от этого недостатка. Провели сравнение спектров МНПВО бактерий Е. coli С-85, полученных в области полос поглощения амид 1 и амид 2, и спектров такого же количества этих же бактерий в той же области ИК диапазона в присутствии фона (тальк). Анализ полученных результатов показал, что присутствие фона , не поглощающего в области исследуемых полос микроорганизмов, не влияет на интенсивность и контур этих полос при концентрациях фона, превышающих концентрацию микроорга-

низмов примерно в 100 раз. Но все же присутствие фона накладывает много особенностей при записи спектров НПВО.' Проанализируем их. Если ПП клеток в анализи- .

руемой полосе поглощения больше или равен ПП фона (П2м паФ), то для режимов ТП и МО. расположенных на элементе в виде монослоя, возможные варианты получения спектров уже были рассмотрены ранее. При взаимодействии света со вторым слоем микроорганизмов вычисление а9ф может оказаться не простой задачей, т.к. зависимость для бР будет определяться как режимом МО. если свет взаимодействует со вторым слоем микроорганизмов. так и режимом ТП, если за объектами находится фон. Поэтому количественные измерения можно вести только при условии, что свет не проникает за первый слой микроорганизмов. Рас- ' смотрены условия, при которых н<; происходит потеря чувствительности измерения, а также условия измерения, когда форма и размеры клеток неизвестны.

а о

£0

го

19 00

1 {

1 А

1 ■ ч 3 ! \ Г" 1

1 1 и-! \ ! ; • 1 1 1

; н

1 ■ <м I ' см''

1800 1700 1600 1500 1400

Рис.2.-

Определение 0П микроорганизмов по разработанной методике позволило для конкретных объектов рассмотреть и использовать эффект превышения ПП микроорганизмов над ПП ИЗ-та для повышения чувствительности измерения (рис.2). В этом случае вместо НПВО наблюдается преломление света и световой поток как бы проваливается в "оптическую яму". Таким образом удалось повысить чувствительность измерения до 1и~7 г. Условие выполнения такого режима можно выразить неравенством п>?мШ > гн.

Рассмотренные особенности можно использовать при разработке метода повышения чувствительности измерения, если стоит задача обнаружения (регистрации) в среде небольшого количества микроорганизмов или их

компонентов. Результаты еще pas показывают, какую важную роль • играет знание оптических постоянных нативных клеток и методов их определения.

Если П2м 1'2ф.. тс критический угол падения нужно рассчитывать относительно параметров фона. Но и в этом случае чувствительность измерения будет все равно меньше, чем для случаев, рассмотренных ранее, т.к. в^р выбирается относительно фона . а не объекта исследования, и ¿чувствительность уменьшится из-за уменьшения d. Рассмотрены также варианты, когда спектр НПБО клеток можно вообще не получить.

Нет необходимости подробно освещать вопросы, связанные со сложностью получения спектров в ИК диапазоне объектов, находящихся в водной среде. Специфика исследования биообъектов часто вынуждает прибегать либо к их взвесям в воде, либо к их водным растворам. Для получения спектров в ИК диапозоне используют различные приемы: в одном случае это очень тонкие слои водных растворов, .в других случаях подбираются растворители, имеющие высокую степень прозрачности именно в тех областях, где ожидается получение спектров исследуемого биологических объектов, в третьем случае используется замена НеО на HgO.

Методы НПВО создают хорошие предпосылки для исследования объектов е водных средах. В настоящем разделе предлагаем решение ряда конкретных задач. Показано, что при использовании дифференциального метода в спектроскопии МНПБО в области поглощения аммонийным азотом il360*1450 см""1) и углеводами i960*1170 см"1) вода не оказывает мешающего действия на регистрацию этих полос поглощения. Поэтому возможно измерение этих компонентов непосредственно в водных растворах. Было установлено, что мешающие компоненты сред в имеющихся концентрациях, которые используются в некоторых технологических процессах, не оказывают существенного влияния на регистрацию полос поглощения аммонийным азотом v углеводами. Следует указать, что при измерении аммонийного азота в качестве источника азота использовалась соль iNH4)gS04, а при измерение растворенных углеводов соль tNH4)a3Û4 заменялась на NH4NO3. Эа сче: выбора характеристик йЭ-та удается исключить мешающий эффект взвешенных частиц, в том числе и микроорганизмов, в процессе анализа. Такиь образом, и в решении этих задач методы спектроскопии внутреннего отражения открывают возможности для анализа водных ср&д без их специально* подготовки для измерения.

В СЕДЬМОЙ ГЛАВЕ "Исследование взаимосвязи в изменениях структур i

- зз -

шункиий интактных клеток" на примерах решения сложных задач показаны информативные возможности разработанной методической базы и аппацатуры.

Большое количество проблем, относящихся к экологии., проходит через проблему "структура - функция". Исследования структуры материи имеют огромное значение, ибо структура является основой Функционирования любой системы, определяя ее свойства. Это относится в равной мере и к среде обитания и к различным организмам, взаимодействующим с ней.

Организм можно рассматривать как систему лабильных информационных взаимодействий (внутреннее информационное поле), находящуюся в постоянно меняющемся внешнем информационном поле, что подразумевает обмен информацией и со средой обитания. Любые изменения в среде обитания вызывают изменения структур молекул, меняется их функция, а т.к. молекулы сами создают структуру клетки, то возникает новая функция, рожденная новой структурой. И в этом новом состоянии организма найдет отражение глубокая общность и взаимосвязь морфологии, физиологии и биохимии клетки. Одна из важных задач - научиться проявлять эту зависимость. Для этих целей и создавалась методическая база, когда появляется возможность учитывать не только корпускулярные свойства материи, но и появляются подходы для получения и интерпретации эксперимента с позиций учета ее волновых свойств. Данная глава построена так, чтобы на ,'юимерач решения некоторых сложных задач теоретической и практической биологии показать работу каждой из новых методических возможностей при поиске ответов на некоторые проблемы мониторинга.

Как уже было сказано, организм можно рассматривать как систему лабильных информационных взаимодействий, находящуюся в постоянно меняющемся внешнем информационном поле, что подразумевает обмен информацией и со средой обитания. ■ Это подход заставляет обратить внимание на пограничные структуры организма как на избирательный информационный "Фильтр", способный регулировать меру взаимодействия среды обитания и организма. Природа предоставила интереснейший объект - микроорганизмы, способные образовывать споры, переходя в состояние крайнего анабиоза, б процессе спорообразования практически полностью утрачивается одно из основных свойств живой материи - обмен веществ и энергии со средой обитания. Нет динамики процесса, вероятно, нет и динамики изменения внутриклеточных структур. Следовательно, можно "чисто" провести регистрацию характеристик этих структур и сопоставить "состояние" клетки и этих характеристик, т.е. связать информацию о структуре и функции.

Эндогенно? спорообразование у бактерий является своеобразным типом прокариотической клеточной дифференцировки, изучение которого представляет значительный интерес не только в связи с возможностью обнаружения на этой модели универсальных биологических закономерностей дифференциации клеток, но и выяснения причин и специфических .механизмов, обусловливающих возникновение у бактериальных спор уникального для живых объектов состояния криптобиоза - крайней степени анабиоза. Наиболее интересным аспектом этой проблемы, с нашей точки зрения, является изучение изменения гетерогенности структурной организации клетки в процессе перехода: вегетативное состояние - спора - вегетативное состояние. Объектом исследования были споры и вегетативные клетки анаэробной почвенной бактерии С1об1:г1с11ш1 рек1лпо1"егтегг1апз 15.

Фаза развития

Спектры, полученные в поляризованном свете, дают информацию о тех процессах, которые выражаются в пространственной переориентации отдельных (белковых, , липидных, и т. д. i макромолекул'. Можно предположить, что преимущественная ориента- -

ция определенных, химических связей Лаг-фаза в ансамблях макромолекулярных компонентов споры (что находит отражение в спектрах) может характеризовать in vivo организованность биосистемы (соответственно и ее функциональное состояние1) в определенный момент времени. Именно это узкосмысловое толкование'вкладывается в понятие'структурных изменений биополимеров споры. Использованные значения глубин проникновения света '"1.0; 0,6 и 0,25 мкм) обеспечили возможность получения информации с пелой споры, ее половины и клеточного слоя, включающего структуры от экаоспориума до внутренней мембраны споры.

Показано (табл.2"i, ' что живым

Таблица 3

Дихроичные отношения некоторых поло поглощения для вегетативных клеток С1. ресНпо/егтеМапэ 15

Толщина

СЛОЯ, МК1Л

Логариф мическая

Стационарная

1,0 0,5 0,25 1,0 0,5 0,25 1,0 0,5 0,25

Амид 1

Амид 2

2,25 1,45 1,90 1,74 1,90 2,09 1,74 1,88 1,98

1,62 1,26 1,90 1,56 1,64 2,07 1,62 1,79 2,00

1060 СМ-

1,80 1,87 1,87 1,51 1,80 i ,97 1,41 1,61 2,03

Таблица к

Дихроичные отношения Некоторых

полос поглощения для спор С1. pectlnofernuatans 15

Толщина слоя, МКМ Амид 1 Амид 2' 1060 см'

1,0 0,5 0,25 2,0 1,89 1,83 2,0 1,55 1,28 1,75 1,59 1,13

клеткам свойственна определенная

степень упорядоченности находящихся в них биополимерам. Данные этой главы для целых вегетативных клеток согласуются с этим (табл.-?). Однако исследования спор позволили получить совершенно иные результаты <табл.4). Особого внимания, на наш взгляд, заслуживает Факт изотропности при просмотре целой споры, а также увеличение анизотропии по мере исследования отдельных клеточных слоев в различных областях поглощения. Так, дихроичные отношения полос амид 1 и амид 2 при анализе целой споры предполагает изотропию образца. По мере светового деталиро-вания споры анизотропия возрастает и наибольшая упорядоченность наблюдается в слое 0-0.25 мкм, включающем клеточные структуры от экзоспори-ума до внутренней споровой мембраны. Сравнение полученных спектров спор с аналогичными характеристиками вегетативных клеток той же культуры в лаг-фазе, экспоненциальной и стационарной фазах роста выявило между ними существенные различия. Так спектры целых вегетативных клеток характеризуют определенную анизотропию объекта, которая меняется по мере деталирования его световым зондом и в слое 0.25 мкм. включающем клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану с .прилегающим слоем цитоплазмы, наблюдается изотропное состояние образца.

Полученные данные позволяют предположить, что обнаруженные изменения в структурной организации молекул белков в покоящейся споре, могут рассматриваться в качестве одного из объективных показателей крип-тобиотического состояния бактериальных спор..

Одной из важных сторон в исследовании покоящихся форм микроорганизмов является получение информации, в том числе спектральной, об изменении структурной организации клетки в процессе перехода вегетативная клетка - анабиотическая (гипометабодическая) Форма - вегетативная клетка. Для этих целей было использовано выделение физиологически активных специфических мембранноактивных метаболитов бактерий - Фактора сЬ (алкилоксибензолов). О его помощью экспериментально получают покоящиеся (цистоподобные) формы микроорганизмов, находящиеся в гипометабо-лическом или глубоком анабиотическом состоянии. Эти покояшиеся формы обладают рядом существенных характеристик, свойственных таким анабиотическим клеткам бактерий, как эндоспоры и цисты. Поэтому этот фактор, влияющий в зависимости от его концентрации на степень метаболической активности клетки в целом, использовали как инструмент при изучении -перехода от метаболически активного к гипометаболическому или анабиотическому состоянию и определении глубины покоя.

Стояла задача изучить пространственную организацию биополимеров

in vivo в анабиотических клетках, образующихся под влиянием фактора di, и сраЕненить полученные результаты с аналогичными исследованиями по спектрам эндоспор. Объектом исследования служила культура грамполо-жительных бактерий Bacillus cereus, штамм 504 (ВКМ). Для исследования использовали клетки экспоненциальной и линейной фазы роста.

Результаты, полученные при исследовании целых вегетативных клеток контрольной культуры согласуются с результатами спектральных исследований вегетативных клеток микроорганизмов, полученными ранее.

Таблица 5

Дихроичные отношения некоторых полос поглощения для клеток В. cereus, подвергнутых действию фактора dz

т« Экспоненциальная фаза роста культур

доза — 0,5 усл. ед. доза — 1,5 усл. ед.

вся клетка слой—0,2 мкм вся клетка слой—6,2 мкм

амид 1 амид 2 амид 1 амид 2 амид 1 амид 2 амид 1 амид 2

20 2,02 1,60 1,85 1,75 2,12 2,21 1,97 2,43

40 1,87 1,63 1,93 1,65 1,96 2,07 2,14 2,50

60 2,00 2,04 2,04 1,93 1,97 2,10 2,08 2,19

80 1,68 1,65 1,96 1,80 2,05 2,10 2,18 1,80

100 1,80 •1,75 2,0.3 2,06 2,07 2,01 1,96 1,96

20 40 60 80 100

Линейная фаза роста культур

1,92 1,63 2,04 2,11 2,07 1,74. 2,14 2,08

1,93 1,90 2,17 2,10 2,00 1,77 2,13 2,07

1,52 1,42 1,90 1,89 1,96 1,66 2,04" 2,00

1,88 2,05 1,79 1,67 2,07 ' 1,88 2,07 1,75

2,05 •1,98 1,81 1,56 2,06 1,93 .1,80 1,57

Время в мин после добавлена т к культурам фактора d,.

Следует отметить быструю реакцию культуры на действие фактора. Отбор проб проводили каждые 20 мин и уже в первой пробе наблюдаюсь отклонение для дихроичных отношений по сравнению с данными для вегетативных клеток. Экспериментально установлено принципиальное отличие параметров спектральных характеристик клеток, подвергнутых действию фак-

тора сЬ, от характеристик клеток контрольной культуры. Особо отметим данные для клеток линейной Фазы роста при воздействии 1,5 усл. ел. Фактора. На основании результатов для культуры, выдержанной с Фактором в течение 100 мин (при 20-минутном интервале отбора проб), можно сделать вывод о том; что действие фактора вызывает принципиальные изменения культуры таким образом, что спектры анабиотических клеток, полученных под воздействием Фактора <1\ в ряде случаев близки спектрам 1для дихроичных отношений) бактериальных спор (табл.б).

Если цистоподобным анабиотическим формам были свойственны характеристики, полученные для эндоспор, то для гипсметаболических клеток '"доза фактора 0,5 усл. ед., культура-экспоненциальной Фазы роста) к концу опыта наблюдался возврат параметров спектральных характеристик культуры к параметрам для вегетативных клеток контрольных культур. Получено, что этот возврат осуществляется через некоторый колебательный процесс, что он, его характер зависят как от дозы действующего на культуру фактора, так и от возраста культуры (полагаем, и состояния культуры), подвергнутой действию фактора (табл.5).

Полагаем, что экспериментально получаемые шстоподобные формы можно рассматривать как модель для изучения некоторых универсальных биологических закономерностей, в том числе для изучения переходных состояний биологических систем в цикле биоз - анабиоз.

Приведенные в данном разделе результаты позволяют предложить еще одну их интерпретацию. Несмотря на фундаментальность открытого в физике дуализма свойств, присущих всем видам материи, при исследовании биологических систем процессы и факты чаде всего рассматриваются с учетом только корпускулярных свойств и без учета волновых свойств материй. Однако, в последние годы все больше появляется свидетельств межклеточных и внутриклеточных взаимодействий волновой природы в живых организмах. Биологическую систему (.организм) можно представить как совокупность огромного числа резонансных систем, образованных молекулами и молекулярными комплексами, способными лабильно менять свои резонансные характеристики в зависимости от различных структурных изменений, что позволяет сохранять целостность системы (организма) во внешней среде.

Обращаясь к представленным результатам, полагаем, что изменение степени пространственной организации может быть связано и с изменением параметров связей макромолекулярных комплексов. Если биологические макромолекулы рассматривать как волновые резонансные системы, то изменение этих параметров должно привести к изменению волновых процессов в

системе. Упорядочивание (анизотропия! приводит к резкому сокрншениш ряйнообравия резонансных систем в пограничном слое ч-.е. к минимиааиии волновых взаимодействий со средой обитания 1. Это и характерно для спорового состояния. Сохраняющийся диапазон резонансных частот может служить для восприятия специфического сигнала, побуждающего к переходу в вегетативное состояние. Напротив, изотропия (неупорядоченность) поверхностного слоя вегетативной клетки предполагает наличие большого числа макромолекулярных систем с набором резонансных свойств, обеспечивающих возможность обмена информацией клетки со средой обитания.

В вегетативной клетке степень пространственной организации макромолекулярных комплексов постоянно меняется как послойно, так и во времени,. что связано с протеканием процессов, о постоянным обменом энергии. Криптобиотическому состоянию бактериальных спор соответствуег достаточная степень изотропии в организации клетки в целом и крайня) анизотропия поверхностного сдоя. Возможно, при спорообразовании кинетическая энергия, обеспечивающая Функционирования вегетативной клетки переходит в потенциальную энергию ориентированных связей макромолеку лярных комплексов оболочки споры, что позволяет длительное время иод яерживать и сохранять биологическую систему в состоянии анабиоза.

Рассмотренные экспериментальные данные демонстрируют возможное? получения информации о взаимодействии среды и нативных клеток при ре гистрации изменения градиента степени пространственной органиаади биохимических компонентов клеток.

Информационные возможности при регистрации изменений градиенч концентрации биохимических компонентов нативных клеток с помощью аш лиза изменений интенсивности полос поглощения, изменений отношений ш тенсивностей полос поглощения и дихроичных отношений покажем на прим* ре галофильных микроорганизмов при изучении отличий делящихся клетс гетерогенной и синхронной культур. Если выбрать глубину проникновеи светового потока в так называемую среднюю по размерам клетку пример: между серединой этой клетки и клеточной стенкой, то отклонение инте сивности полосы поглощения в области 1240 см"* от интенсивности эт полосы для "средней" клетки должно характеризовать изменение гетер генности, в частности, по размерам. Справедливость этого предположен проверяли при сравнении синхронной и несинхронной культур. Бо синхрс ной культуре подбирали параметры ИЗ-та такими, чтобы полоса 1240 ск не наблюдалась. В спектре несинхронной культуры того же возраста чет

видна полоса, интенсивность которой в процессе роста и развития может изменяться и с изменением размеров клеток. Появление этой полосы наблюдали и при рассинхронизапии культуры, т. е. при увеличении ее гетерогенности. Проводимый подсчет клеток подтвердил появление несинхронного деления клеток. Регулируя глубину проникновения светового потока можно, вероятно, изучать и гетерогенность культуры, связанную с нестабильностью пространственного положения биополимеров в клетке. Измеряя изменение соотношения полос поглощения ".например, амип 1 и амид 2). можно получить представление и о биохимической гетерогенности культуры з процессе развития.

Остановимся еше на одной возможности аначиеа. Было показано, что клеткам свойственна определенная степень упорядоченности находящихся в них биополимеров, которая исчезает для внешнего слоя. Результаты данного раздела для несинхронной культуры практически совпадают со ска-ганным выше, а для синхронной - значительно отличаются: для нее анизотропия наблюдается даже в тех областях поглощения, где она не выявлена для несинхронной. При рассинхронизапии культуры величины дихооич-ных отношений практически стали совпадать с величинами для несинхронной культуры (табл.6).

Таблица 5

Дихрончше отношения полосы амид 1 синхронной и несинхронной культур в различные часы роста

Несинхронная Синхронная

Время пос- анализируемый слой

ле посева

клеточная стен- клеточная стен- воя клетка

ка-(-мембрапа вся клетка ка-^мембрака

3 2,0 1,6 1,8 1,5

4 2,1 1,8 1,9 М

5 2,0 1,5 1,6 1,2

0 2,0 1,8 1,9 1,3

7 1,9 1,7 2,0 1,5

8 2,1 1,6 1,9 1,6

Полученные результаты дают основание, полагать, что изменения, происходящие в клетках в период деления, можно использовать для изуче-

ния уооеня "организованности" в процессе развития, а также испольгова-нить синхронную культуру б качестве одного из "инструментов" исследования интенсивности изменений в среде обитания.

Залее на примере микобактерий покажем возможности получения информации при регистрации динамики изменения градиента химических компонентов. Было проведено исследование поступления и дальнейшего превращения углеводорода в различных областях интактных клеток микобактерий в течение Есего периода их роста и развития.-

5 этом исследовании были использованы ИЗ-ты из германия и КО-2. рассчитанные и изготовленные так, чтобы обеспечить проникновение светового потока в клетки на глубину 0,25 и 1,0 мкм, соответственно. Т.к. клетки используемых микобактерий имели в поперечнике 0,8-1,0 мкм, тс ИЗ из КО-2 дает возможность получать информацию о всей клетке, а и; германия - об области клеточной стенки, иитоплазматической мембране I прилегающем слое цитоплазмы, и поступлении углеводорода в равлуганы! области клеток судили по интенсивности полос поглощения в области 290С и 1460 см-*, а также по перераспределению этих и других полос поглощения. Поскольку в области полосы амид 1 поглощают также углеводы, аминокислоты и нуклеиновые кислоты, считали., что эта область относится к< всей клетке. Поэтому полосу поглощения 1660 см 1 выбрали в качеств* опорной и относительно нее произвели расчет оптических плотностей интересующих полос поглощения. Параллельно проводили микроскопическо* исследование клеток.

Результаты показывают, что на среде с гексадеканом происходи1 быстрое насыщение углеводородом внешних слоев клетки толщиной не боле 0.25 мкм. Углеводород, "не вместившийся" в этот слой, адсорбируется н поверхности клетки. Накопления гексадекана в центральной части клетк не наблюдается. По мере окисления и утилизации исчезает адсорбирован ный на поверхности клетки субстрат, но уровень его во внешнем слое еш остается высоким, затем количество гексалекана начинает снижаться Окисление углеводорода клетками сопровождается накоплением триглииери лов в стационарной юаэе роста., большая часть которых концентрируется цитоплазме. Последующее -значительное снижение количества триглииершго свидетельствует об использовании этих соединений клеткой в качеств внутреннего резерва. Наступающая затем стабилизация всех параметре говорит о затухании метаболических процессов, связанных с окисление углеводорода, и наступлении состояния покоя.

Были проведены аналогичные исследования, выращивая ту же культуру на средах с углеводом ('глюкоза) и на мясолептонном бульоне. Исследование клеток, выращенных на разных средах, проведенное в течение всего периода их роста, показало, что как клетки, так и их внешние слои значительно различаются по биохимическому составу. Эти различия проявляются уже с 1-х суток роста и сохраняются в дальнейшем. Они особенно отчетливо обнаруживаются по содержанию липидов. Это согласуется с данными, полученными биохимическими методами.

Совокупность данных позволяет заключить, что в клетках сапрофитных микобактерий имеется эффективная система регуляции синтеза биополимеров клеточной стенки. Сигналом к перестройке стенки является природа ростового субстрата. При этом имеет значение не только степень гидрофобности субстрата, но и его принадлежность к определенному классу химических соединений. Процесс регуляции осуществляется, по-видимому. прежде всего путем синтеза липипных компонентов клеточной стенки -миколовых кислот.

Старение - это фундаментальное свойство, внутренне присущее всем живым организмам. Относительно эволюционной древности и обязательности этого свойства для Есех живых систем нет единого мнения, поскольку эти системы находятся на различных уровнях организации в Физиологическом -даже "социальном") смысле. Несомненным, однако, является существование старения клона, популяции и других более сложных уровней организации живых систем. Поэтому в исследованиях, затрагивающих вопросы возрастной физиологии живых систем, важно иметь возможность выражать степень " организованности" живой системы через какие-либо характеристики. Для решения поставленной задачи необходимо было выбрать Факторы воздействия на живую систему, которые могли бы еыявить ее специфику.

Б качестве фактора были использованы фаги. Объектами исследования служили цианобактерии Апасуэтлз Шскиапз и АпаЬаепа уаглаЫПэ. не образующие гетероиист и спор, и цианофаги А5-1 и А-ни. Задачей исследования было определить реакцию цианобактерии на присутствие Фага в~ среде, когда культура находится на разных этапах развития.

Б результате сравнения спектров опытных и контрольных культур в тех же концентрациях установлено, что на начальном этапе изменения спектров менее концентрированной культуры при введении иианофага в среду выражены сильнее, чем изменения спектров более концентрированной культуры (области 1550 и 1300-1500 ем! -) (Рис.3). Однако через нес-

колько часов изменения характеристик концентрированной культуры так? становятся значительными.

то то woo 15оо w шо i2oo two см 4 18оо то 1боо 1500 то то то то спч

I / Изменение спектральных характеристик зараженных фагом " концентрированной (А) н разбавленной (Б) культур Апа-baena variabilis. I — через 15 мин после заражения, /—контрольная культура,"2 — зараженная фагом культура

Были также изучены изменения в спектрах указанных культур пр: введении в систему культура+среда цианофагов в разных концентрациях Во всех без исключения случаях зарегистрирована реакция при действк пианотага. Расчет дихроичных отношений лля полос амид 1 и амил 2 hi дал пропорциональной или количественной зависимости между изменениям концентраций шага в среде и характером изменений дихроичных отношений Вероятно, это взаимодействие носит сложный биологический характер j рряд ли может быть описано математически.

Таким образом, разбавленная культура на введение в среду шанофа-га реагирует сильнее, чем концентрированная, хотя при сильном разбавлении количество контактов фагов и клеток должно уменьшаться и реакцге культуры должна была бы стать меньшей. Можно предположить, что боле« "старая" культура представляет собой такую степень организованности, при которой начальное взаимодействие цианофага с клетками не находит пока в достаточной степени своего отражения в реакции. При сильно* разбавлении культуры нарушается степень ее организованности, т. е. нарушается целостность системы клетка+среда, поэтому при введении в среду цианофага мы регистрируем в опыте ответ отдельных клеток (а ш культуры) на фаг, хотя количество контактов может быть меньше, чем i опыте с концентрированной культурой. Такое предположение подтверждает и проведенный опыт: в менее концентрированную культуру после ее выдер-

живания в стандартных условиях в течение нескольких часов был ввезен цианофаг. Реакция культуры на введение фага в среду была несколько задержана во времени. В точности такая же картина наблюдалась на спектрах концентрированной исходной культуры.

Существует динамическая связь между содержанием воды и физиологическими процессами, протекающими в клетке. Вариабельность такой сеязи осложняет условия и методы ее изучения, любые воздействия на клетку могут разрушить или изменить их. Предлагаемые в работе методы позволяют изучать состояние воды в клетках, находящихся в среде их обитания, не подвергавшихся никакому внешнему воздействию. Было сделано предположение, что изменение внутриклеточного водного баланса может быть выявлено по изменению оптических свойств клеток - 1Ш целых клеток или их "оптических срезов". При количественном анализе принимаются во внимание оптические постоянные - показатели преломления и поглощения. На примере галофильных микроорганизмов была рассмотрена возможность использования методов НПВО для выявления изменений внутриклеточного баланса воды в клетке по изменениям ПП клеток бактериальной культуры.

Установлено, что в экстремальные периоды роста клеток увеличивается оптическая плотность клеток. Основания полос поглощения смешены в сторону более высоких оптических . плотностей. Наибольшие изменения спектральных характеристик зафиксированы для целых клеток, меньшие -для их "спектральных срезов" (клеточных оболочек) Для целых клеток в области частот 1800-2000 ем~- не отмечено ярко выраженных полос поглощения. Сделано предположение, что именно в этой области частот можно регистрировать изменения во внутриклеточной организации по изменению спектральных характеристик. Цля нативных клеток отмечено смешение основания полос поглощения спектров по шкале "пропускания".

Физический смысл явления можно понять при рассмотрении уравнения й=\1./[2я(51пг8-п212)г/"] для глубины проникновения светового потока в образец. Глубина проникновения луча в клетку прямо пропорциональна оптической плотности, регистрируемой в опыте. Смещение основания полос поглощения спектров клеток может происходить только за счет изменения ПП клеток или их измеряемых слоев. Установлено, что увеличение интенсивности полос должно быть следствием увеличения а и возможно при увеличении ПП. • Увеличение ПП клеток возможно при уменьшении количества компонентов клеток с малыми ПП или при замене (или преобразовании этих компонентов) на компоненты с более высоким ПП. Самым ма-

лым Ш из компонентов клетки обладает вода. Учитывая большую подвижность воды (проникновение в клетку,, выход из нее. переход в различные состояния! и то, что вода составляет наибольшую часть содержимого клетки, есть все основания предположить, что наблюдаемый эффект смешения основания полос поглощения спектров в определенные периоды жизни клетки вызван изменением водного баланса в микроорганизмах.

Таким образом, разработанными методами можно регистрировать изменения водного баланса в клетках и в различных их слоях.

Наконец, продемонстрируем возможности комплексного использования регистрируемых характеристик нативных клеток на примере гагабактерий в процессе их культивирования.

Известно, что аэробные галофильные бактерии На1оЬа^ег1ит паюЬх-ит способны к фотосиктетяческому образованию АТФ. Возможность процесса Фотошосфорилирования в этих клетках обусловлена наличием особых мембранных комплексов - пурпурных мембран ¡ПМ). бактериородопсин (БР). Разработанные методы были применены для выяснения условия развитиг этих бактерий, которые способствуют интенсификации процесса накоплена ПМ в клетках галофила.

Были обнаружены четко выраженные периодические изменения спектро! этих бактерий в процесса культивирования. Выявлена периодичность в изменениях спектральных характеристик культуры с интервалом 22-24 час. Характерная периодичность свойственна" полосе поглощения (.1580-1600' см-1. Очевидно, что в эти фиксированные временные интервалы происходя' резкие биохимические изменения в клетках, которые проявляем по изменениям оптических характеристик. При глубине проникновения светового потока на 0,3 мкм такие изменения выражены слабо, тогда как при глубин проникновения света в образец на 1,0 мкм они весьма существенны. Нал рашивается вывод, что значительные перестройки в клетках происходя либо на границе с цитоплазмой, либо в самой цитоплазме. Спектр, запи санный для перпендикулярной составляющей плоскополяризованного света особенно четко отражает эти изменения (Рис.4).

Отметим еще одну особенность. Так спектры 21- и 23-часовой куль тур почти идентичны, в то время как спектр 22-часовой культуры сушест венно отличен. Т.е. в клетках происходит относительно кратковременнь: скачок резких биохимических изменений (менее чем за 2 час.).

Получены спектры МНПВ0 ИМ (Рис.5). Особое внимание заслуживав лихроизм полосы амид 2, изменяющийся по мере удаления света от повер>

•ности ИЭ-та. Зависимость дихроизма от глубины проникновения света в образец объясняем тем, что оседание на плоскую поверхность асимметричных молекул сопровождается ориентацией этих молекул в плоскости. Считаем, что обнаружена самопроизвольная плоскостная ориентация белковых макромолекул в сравнительно сложной системе, какой являются ПМ. Из полученных данных следует, что белок при выделении его из ПМ теряет необычную пространственную структуру. Таким образом, есть основание считать. что ярко выраженный дихроизм полосы амид 2 является характеристикой нагивной структуры БР-комплекса и может быть взят как объективный критерий для оценки содержания и состояния ПМ в клетках галофила. Это наглядно демонстрируется измерением дихроизма в области полосы амид 2 в процессе выделения ПМ из клеток, т. е. по мере увеличения удельной концентрации БР в образцах.

то то поо то woo см4 то ш то ш woo см

1-1 I I 1 1 Г- I I ----,-,-,-,-,--,--

'«с. 4. Спектры МНПВО культуры солевых бактерий: I — для перпендикулярной гавляющеа плоскополяризованного света; // — для параллельной составляющей п. кополяризованного света. Л—«а элементах из КО-2, Б — на элементах из герман /—19 нас ферментации, 2—22 час, 3 — 23 час

'ис. 5. Спектры МНПВО пурпурных мембран: а — для перпендикулярной составл; ;ей плоскополяризованного света; б — для параллельной составляющей плоскопо. рнзовашшго света. 1—-на элементах из германия! 2—на элементах из КО-2

Аналиа подученных - гначений позволил установить. что происходит периодическое -изменение дихроизма в области полосы амид 2. Полученные Результаты свидетельствуют о периодическом, а не о плавном образовании пурпурных мембран в клетках. Следует отметить, что степень рихроигма полосы амид в клетках и выделенных препаратах БР еависит от условий культивирования солевых бактерии.

Настоящая работа является обобщением применения методов спектроскопии внутреннего отражения для исследований интактных клеток в различных средах их нахождения, их реакций на изменения ь среде обитания, с номошыо регистрации динамики изменений разнообразных адаико-химических характеристик многокомпонентных гетерогенных сильно рассеивающих систем. В работе анализируются особенности методов спектроскопии £НУ.?ре«-него отражения, прояеляюие своя при исследовании биологических объектов, и даются рекомендации по использованию предложенной методической базы для решения самых разнообразных задач прикладного характера, относящихся и к проблемам «кологии, и к проблемам теоретической и практической биологии.

Предлагаемая в работе методическая бага не только не исчерпываем себя продемонстрированными.примерами, но она и создана для того, чтобь быть испольаованой как для работы с нативными клетками, так и с любым* объектами, находящимися в среде обитания. Проведенные исследования \ подученные результаты создают основу для принципиально новых подходе» в разработке общебиологических проблем и показывают большое практическое значение использования наработанных методик как в промышленности, так и в лабораторной практике.

ОБНОВИЖ ВЫВОЛЫ

! ■ Сосланы методические и технические основы для диагностики «>и экологического состояния живых клеток и аетуктиоовачия их наличия косной материи на базе'системного объединения методами внутреннего от ранения модифицированных методов оптического анализа интактных клеток когда для исследования образца возможно использование не только ег спектральной характеристики, но и его оптических характеристик свойств, параметров измерительного элемента, поляризованного сьегоног

ч'.л'ока, испольгоьание статистических характеристик совокупности мно--к^.'Ч'кР. ".¡»дом и размере» клеток < цитологич^скн»1 уарчку^истики.». «то не •■"ГЧ«» них особенностей соста^'/шшмх ^.ч^ментор 1 отд"льн.ну

клеток1. я нок?лнва«т • и«гм-уяет.» ^ероя-геость этой инди!,ил,-'йлмот?и. ■ьункция же распределения оптических плотностей.по нлошади объекта <фи-?нческая характеристика структуры) представляет собой количественное выражение оптических плотностей 'поля концентраций). Использование »сеч этих комбинаций позволяет получать гриниипиально новую ишюрмашво Ъ состоянии живых клеток.

2. Для целей количественного анализа рагработаны методы 'амплитудные и шаговый/ определения количества «.объема) проузаимод^йствовав-дего с поляризованным электромагнитным излучением клеточного.вещества независимо от Формы и размеров меток, что наряду о метопами, указанными ? пл. позволяет проводить количественные морФо-шункцмональнне .•¡■."следования неразрушенных клеток как в целом,, так и послойно 'при любой толщине анализируемого слоя), определять их оптические постоянные, получать информацию об изменении градиентов концентрации биохимических компонентов. об изменении градиентов степени пространственной ориентации <оргаяиеании» биополимеров натиьных клеток, нее что. в частности, позволило:

а- экспериментально доказать, что степень пространственной оога низании (ориентации) биологических молекул ц иятактных. клетках т целом и ари послойном их исследовании '■••с^'г информации для характеристики

• м'.аиологичесиого состояний кл'5т0к (у! уровня нк'»ивного до

•дцнбиозн:

б/ показать. что динамика изменения параметра степени цространс-"•рмняой организации белка в интактных клетках '.в области полос' амид 1 я амид 2) может служить биомаркером «для диагностики.1 жийых н мссте-г клеток:

в/ иметь возможность квучеяия нативных клеток в сложнач средах ■например, ускоренное определение биомассы или компонентов клеток, находящихся в гомогенной или гетерогенной среде: найденн условия, пои которых регко возрастает чувствительность обнаружении даже очень малого количества клеток при н&вичиии поглошаошего и непоглошаюгаего тона):

г/ найти критерий, характеризующий споровое состояние микроорганизмов;

ду цистоиодобные формы рассматривать как модель для изучения таких универсальных биологических закономерностей как переходных состоя-

.ний биологических систем в цикл* биоз - анабиоз:

<?/' получить различия делящихся клеток гетерогенной и синхронной культур и показать возможность использования оинхоонных культур в качестве чуветвительнох'о индикатора на изменения среды обитания:

х/ на примере микобактерий разработать метод для изучения динамики поступления в клетки и последующей утилизации компонентов енешней

•:р«гЗ!Ы:

с'/ на примере взаимодействия шанобактерий и цианофага показать, что для проявления степени организованности живой системы перспективно ¿■¡спольговать биологический фактор воздействия:

и/' разработать метол определения ?регистрации> водного баланса в нативных клетках и в различных их слоях;

ку обнаружить эффект периодичности пои развитии галоФило? с периодом примерно в 24 часа.

Рагработан ряд оптических методов, оригинальных устроист? ¡1 гк-ястаюк для определения параметров. интактных клеток и непрерывного контроля за их состоянием, концентрацией и т.д. (например, регистрация КЛ и ДОВ интактных клеток'!. для иовышени» чувствительности регистрации биообъектов ао''-10 ^ г), для регистрации аффектов самопроизвольной плоскостной ориентации ¡.например, оелкокчх компонентов), для использования всех разработанных юзможностей при исследовании самого широкого круга многокомпонентных систем как биологического, так и любого другого проке хождения.

Научные публикации по теме диссертации

:. Язаовский В.И.. Королев Ю.Н., Тарасова Г.11.. Флеров Ю.Л. • 'и<?ктры МНПВО некоторых неразрушенных микроорганизмов. Труды КЧИИВио-Т'ехника. вып. 1, 20?-208, М., 1978.

У.. Яйдоб'-'кш В.И., Королев 40. Н., Тарасова Т.П. , Флеров Ю. Л, Полутени« спектров рассеивающих биологических ооъектов в инфракрасном лиа-¡¡айОН" методом МНИби. Там ж<-.\ Р.Об-у. 197?.

с. Ягдовский ё'.И.. Королев Ю.Н. . Тарасова Т.П.. Кокауейа Т.А. йс-пользовани* метода ЫНПБО в ИК диапазоне идя получения спектральных характеристик водных растворов аминокислот. Гам же, 216-21 У. 197Я.

4. Королев Ю.Н.. Тарасова Т.П.. Бокарева Т.А.. Окурепо&а Н.А. Спектральные характеристики некоторых препаратов, выпускаемых мжроби-

••.•логической промышленностью. Гам же. 223-.?.?б. 1972.

Г'. Короле* К'.Н. Возможности спектроскопии НПВО для анализа неразрешенных микрооогачмгмо* и куль турэлъ ной средн. Гиологич-г-скяч сл.ектро-•ютометрия и Фитоактинометрии. 51. Красноярск,, 1вУ£.

<5. Королев >ХИ.. Телегин И.Л.. Бирюков В. Б. Исследование возможности иемеоения концентации аммонийного агота и углеводов, в культу-радьной жидкости пои производстве ?.нтибиотиков. Там же. 52, 1975.

}'. Королев Ю.К.. Телегин Н.Л. Особенности количественного определения основных компонентов микроорганизма при использовании спиК7рос-•сояим НПЕ'О. Там же. 53-54. 1973;

Королев Ю.Н., Байковз А.И. Количественное измерение бедка неразрушенных микроорганизмов в единиц? объема при использовании метол?. НПВО. Вопросы иммунобиологии. М.. изд. Медицина, 122-126, 197?.

9. Королев Ю.Н., Тарасова Т.П.. Телегин Н.Л. Использование нестандартных призм и приставке HIB0--1 для получения х'аряктеристик биоло-:ич^ских объектов. Микробиологическая промышленность. i&7i.

10. Коиолев Ю.Н. . Лебедев P.C.. Лнсов В.Л. , Склнднев A.A.. Г:-.рчсо-"а Т.п., Яндорский И.И. Способ определения нормальных параФинон г- про-•j'K'Ct» ¡¡олучения белкоро-ритнминного концентрата. Авторское «.-ридетель-■.";'чо N-4J1 •'.>•.<:. и зоб р. . МЫ . 7 У. 197-;.

iL. Богданов K.M., Королек ¡0. Н. , Яыссч; Б.Я.. Телегин Н.Л.. "ибняо-1-я И.В. Унирерсальнне приставки МЯПБО для получения ■!>.'•< ха-

рнктеристик микроооганиймон и культурачьной среды. Комплексная механи-■ -чш и автоматизация технологических прои^осоя у .чимико-Фасмаизд'ги-••еской промышленности. 7«hicu докладов 2-ой ¡icw-рной кою^р^ниш.

Ленинград. 1*7 i.

!S. Королев j>.'H.. Лебедев B.C.. Лысой В.Л.. Телегин Н.Л. Астшнти-•л-.'кйй ме-год анализа многокомпонентных сред с перекрывающимися полосами поглощения. Там же. 61-»-.2. 1974.

•3. Королев Ю.Н.. Тарасова-Т.П.. Телегин Н.Л. Применение элементов HiiBO с переменными углами паления для исключения влияния мешзюиих компонентен в сложных средах. Там же. 63-64. 1у74.

14. Королев Ю.Н., Слугина М.Л.. Вирюкоь В.В.. Макаревич В.Г. Измерение белка биомассы мицелия продуцента, тетрациклина в средах с кукурузной мукой. Там же,104-öö, }У?4,

15. Королев Ю.Н.. Жарова H.H.. Шрк<ков В.В.., Барташерич Ю.У. . Телегин Н.Л. Применение элементов МНПВО для автоматического контроля содержания эритромицина в нативных растворах. Там же. 67-66. 1974.

16. Королев Ю.Н.. Лысов В.а.. Ь'ибанова й.Б. Универсальные пристав ки для исследования методом многократного нарушенного полного ннутрен НУГО отражения. ПТ5>. N4. Z2B-ZK'. 1&74.

17. Чекулаева Л.Н.. Короле? Ю.Н.. Телегин Н.Л. Возможности изуче нт неразрушенных клеток культуры Haiobacterlimi hsioblum метопом ШЬО Биофизика, 19. 6. 1'iO:?-1104. 1974.

18. Королев ¡О.Н.. Телегин Н.Л. Приставка .метода Н№0 с частично компенсацией изменения глубины проникновения светового поток?.. ПТЗ Hb. J92-193, 1У75.

19. Русин В.Н.. Жуконскэй С. Л. . Короле? Ю.Н';. Телегин H.H. йссл»-яокани^ возможности использования спектральных методов ллн 'зннлиг* цсиросрачннх растьошв при получении пенициллина. Антиоиотмкк, N& 081-585/ 1975.

20. Лобржанский Г.1!1.. Короле« Ю.Н., Телегин H.H.. Исиачк?01?.чни< кристаллов штористого лития для получения режима нарушенного иоднег' внутреннего отражения. Крис тздиограа-ия. 20. 4. *8б-д37. 1975.

21. Чекулаева Л.Н.. Корилев Ю.Н.. Телегин H.H.. Рихирева Г.Г. изучение образования пурпурных мембоан ъ процессе кулы'иьмрокания сольны: бактерий. Биофизика, 20, Ъ. «39-843. 197Ь,

22. Королев К'. Н. Состояние поляризации источника излучения и особенности получения спектиа НПЬО неразрушенных микроорганизмов. Ниоши-гика, 20. 2. 20'"-/"<*0. 1975.

ЯЗ. Королеь К'. Н. Особенности определения оптических постоянных неразрушенных микроорганизмов методом спектроскопии НШО. Биофиаика, 20 2. 271-.27Б. 1976.

24. Королев Ю.Н.. Телегин H.H. Влияние примесей на спектры НПИ миологических объектов. ЖПС. 23. 1, 165-163, 1970.

25. Королев Ю.Н.. Муравьева С.А. Определение оптических постоянны; биосистем в ИК области методом НПВО. ЖПС. 23, 2. S44-546, 197b.

26. Чекулаева Л.Н.. Королев Ю.Н., Телегин Н.Л. Спектральные характеристики культуры солевых бактерий. ЛАН СССР-. 221. 2, 467., 167Ь.

27. Королев Ю.Н...Чекулаева Л.Н. , Корягин B.c.. Телегин H.H. Периодичность изменений культуры солевых бактерий. ДАН СССР, 222, Е-. 1227:229. 1975.

28. Королев Ю.Н.. Телегин H.H. Использование спектрополнриметр; ДЛЯ анализа рассеивающих объектов. ЖПС. 29. 3, 5S4-P38-, 1973.

29. Луда В.И., Королев Ю.Н.. Зль-Регистан Г.М.. Вужа М.В.. Телеги: H.H. Распределение и пространственна;! упорядоченность молекул биополи-

меров в покоящихся бактериальных спорах. Микробиология, 47, 4, 750755, 1978.

30. Гусев М.В., Коронелли Т.В., Королев Ю.Н. Исследование динамики поступления и утилизации углеводорода в клетках Mycobacterium paraffi-nicum с помощью спектроскопии в ИК-диапазоне. Микробиология, 47, 6, 1025-1029, 1978.

31. Королев Ю.Н., Гусев М.В., Телегин Н.Н. Использование серийных спектрофотометров для изучения циркулярного дихроизма рассеивающих образцов. ПТЭ, 2, 228-229, 1978.

32. Королев Ю.Н., Слугина М.Д., Макаревич В.Г., Телегин Н.Н. О возможности спектрального анализа гетерогенных биологических систем. Антибиотики, 3, 163-168, 1979.

33. Гусев М.В.., Коронелли Т.В., Королев Ю.Н., Комарова Т.Н. Индуцируемые субстратом изменения клеток и клеточных оболочек Mycobacterium paraffinicum. Микробиология, 49, 5, 761-765, 1980.

34. Ермаков И.П., Баранцева Л.М., Матвеева Н.П., Королев Ю.Н. Изучение роста клеток и метаболизма белков,и РНК в процессе развития ар-хегония Pinus sibirica Du Tour. Биологические науки, 2, 88-92, 1981.

35. Гусев М.В., Белогурова Н.Г.,. Королев Ю.Н., Никитина К.А., Телегин Н.Л. Особенности получения спектральных характеристик цианобак-терий методом нарушенного полного внутреннего отражения в инфракрасном диапазоне. Биологические науки, 5, 99-102, 1982.

36. Гусев М.В., Живописцева И.В., Королев Ю.Н., Никитина К.А., Телегин Н.Л. Об использовании фагов в исследовании цианобактерий. Биологические науки, 1, 85-89, 1984.

37. Чекулаева Л.Н., Королев Ю.Н. Получение спектральных характеристик делящихся клеток на примере галофильных микроорганизмов. Биофизика, 29, 6, 998-1000, 1984.

38. Королев Ю.Н., Чекулаева Л.Н. Анализ гетерогенности культуры клеток методом спектроскопии нарушенного полного внутреннего отражения. Биофизика, 30, 1, 173-176, 1985.

39. Королев Ю.Н., Чекулаева Л.Н. Определение количества воды в клетках методом спектроскопии полного внутреннего отражения. Биофизика, 2, 347-348, 1986.

40. Королев Ю.Н., Эль-Регистач Г.И., Козлова А.Н., Дуда В.И. Спектральные характеристики анабиотических цистоподобных форм Bacillus cereus. Микробиология, 55, 4, 652-656, 1986.

41. Никитина К.А., Королев Ю.Н., Телегин Н.Л. Изучение изменения

состава и локализация клеточных компонентов про- и эукариотных организмов в процессе инкубации на свету и в темноте с помощью спектроскопии внутреннего отражения. Биофизика микробных популяций. Всесоюзная конференция, тезисы докладов, 134, Красноярск, 1987.

42. Королев Ю.Н., Милехин Г.В., Станкевич Л.В., Гилярова Е.В. Устройство для определения спектральных коэффициентов пропускания и отражения. Межвузовский сборник научных трудов, посвященный 70-летию МТИ им. А.Н.Косыгина, 41-44, Москва-1989.

43. Королев Ю.Н., Милехин Г.В. Особенности использования измерительных элементов НПВО для анализа параметров текстильных материалов. Автоматизированные системы в текстильной промышленности. Межвузовский сборник научных трудов, 4-7, Москва 1993.

44. Петелин Д.П., Королев Ю.Н., Ермолаев Ю.А., Милехин Г.В. Использование современных методов получения информации в создании автоматизированных средств контроля параметров технологических процессов. Вестник МГТА, 168-163, 1994.

'45. Милехин Г.В., Петелин Д.П., Королев Ю.Н. Особенности контроля загрязнения внешней среды методами внутреннего отражения. Всероссийская научная конференция "Экология в текстильной промышленности". Тезисы докладов, 38, Москва-1994.

46. Королев Ю.Н., Милехин Г.В., Кочеткова С.А., Ермолаев А.Ю. Использование первичного преобразователя в качестве компенсатора для измерения .параметров технологических процессов. Изв. вузов, технол. текст, пром., 3, 93-96, 1994.

47. Королев Ю.Н., Голиченков В.А. К использованию в экомониторинге апробированных методов неразрушающего контроля исследуемых объектов. Сборник материалов 2-й Всесоюзной научно-практической конференции "Система единого экологического мониторинга - средство контроля и информации о состоянии окружающей среды", 36, Москва 1995.

48. Коллективная монография "Электроника и электромеханические системы в- промышленности", ч.1, (Учебное пособие под ред. проф. Д.П.Петелина, проф. Г.И.Кольиченко), Москва-1995.

49. Королев Ю.Н., Милехин Г.В. Способ определения содержания красителя в текстильном материале. Патент N2047858, Роспатент 1995.

50. Королев Ю.Н., Милехин Г.В. Способ определения степени пространственной упорядоченности полимерного материала. Патент N2047859, Роспатент 1995. j

51. Правдюк A.B., Лифанов О.В., Милехин Г.В., Королев Ю.Н. О воз-

можности использования одного первичного преобразователя для контроля уровня и концентрации рабочих сред. Системы автоматизированного проектирования технологических процессов и оборудования. Межвузовский сборник научных трудов, 79-82, Москва-1996.

52. Королев Ю.Н., Милехин F.B. Количественное определение влажное- • ти в технологических процессах при разной плотности текстильного материала. Всероссийская научно-техническая конференция "Современные технологии текстильной промышленности". Тезисы докладов, 147, Москва-1996.

53. Петелин Д.П., Милехин Г.В., Ермолаев Ю.А., Королев Ю.Н. Реализация первичной информации о параметрах технологических процессов при использовании одного первичного преобразователя. Изв. вузов, технол. текст, пром., 3, 106-107, 1996.

54. Королев Ю.Н., Милехин Г.В., Рыжкова Е.А. Количественный анализ параметров волокон без их разрушения. Всероссийская научно-техническая конференция "Современные технологии текстильной промышленности". Тезисы докладов, 63, Москва-1997.

55. Королев Ю.Н., Рыжкова Е.А., Шурпакова Е.А. Количественное определение изменения градиента концентрации химических реагентов в волокнистых материалах. Межвузовская научно-техническая конференция "Современные проблемы текстильной и легкой промышленности". Тезисы докладов, 50, Москва 1998.

56. Петелин Д.П., Милехин Г.В., Королев Ю.Н. О работе оптических датчиков в рабочих помещениях текстильной отрасли. Исследование и разработка средств автоматизации в текстильной промышленности. Межвузовский сборник научных- трудов, 4-6, С.-П., 1998.

57. Бурлакова О.В., Королев Ю.Н., Голиченков В.А. Подход к биообъектам с учетом корпускулярно-волнового дуализма материи. Международная конференция "Актуальные проблемы современного естествознания" (Интер-нас, 97). Тезисы докладов, 187-188, 1997.

58. Королев Ю.Н., Рыжкова Е.А., Никифорова И.H., Питкянен C.B. К решению проблемы унификации первичных преобразователей информации. ^ Международная научно-техническая конференция "Современные наукоемкие технологии" (ПРОГРЕСС-98). Тезисы докладов, 391-392, 1998.

59. Королев Ю.Н., Милехин Г.В., Шурпакова Е.А. О вопросах совместного построения первичных световодных преобразователей и блоков обработки информации. Там же, 393, 1998.

60. Королев Ю.Н., Милехин Г.В., Е.А.Шурпакова. Экологическое обеспечение технологических процессов биологическими индикаторами загряз-

нения. Всероссийская научно-тоническая конференция "Современные технс логии и оборудование текстильной промышленности". Тезисы докладо] Москва-1998.

61. Королев Ю.Н., Рыжкова Е.А., Бурлаков А.Б. Вопросы анализа синтеза информации биосистем. Синергетика. М., изд. МГУ, 1998, 228-2;

62. Бурлакова О.В., Бурлаков А.Б., Королев Ю.Н., Голиченков В.; Организм и внешняя среда. Корпускулярно-волновой дуализм в объяснен] пространственно-временной организации биосистем. Пространственно-вр< менная организация онтогенеза. Теоретические проблемы в биологии и м< дицине, коллективная монография, глава 2, 18-23. М., изд. МГУ, 1998.

63. Королев Ю.Н., Малахов Ю.И., Бурлакова О.В., Рыжкова Е.А., Г< личенков В.А. Методические возможности и особенности количественно; анализа живых объектов на уровне интактных клеток. Там же, глава i 65-72, изд. МГУ,1998.

64. Малахов Ю.И., Королев Ю.Н. К вопросу обработки спектральн» информации при исследовании пространственно-временной организации би< логических систем. Там же, глава 7, 73-80, изд. МГУ, 1998.

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Королев, Юрий Николаевич, Москва

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ТЕКСТИЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ им. А. Н. КОСЫГИНА

;; 'фисудилуче:/уюстепеньДОК7'

~—_..........^Шщилле^

\ начальник управ1^ГвАКР^

..............

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ИНТАКТНЫХ КЛЕТОК МЕТОДАМИ ВНУТРЕННЕГО ОТРАЖЕНИЯ ДЛЯ ЦЕЛЕЙ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА

03.00.29 - охрана живой природы

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 1998

С О Д Е Р Ж А Н И Е

ВВЕДЕНИЕ

стр. 4

ГЛАВА 1. ОБОСНОВАНИЕ И ОБЩАЯ .ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. О некоторых новых идеях б науке

1.2. О некоторых вопросах экологии

1.3. Цели и задачи работы

8 8

21 28

ГЛАВА 2. РАЗРАБОТКА АППАРАТУРЫ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ

МНОГОКОМПОНЕНТНЫХ ГЕТЕРОГЕННЫХ РАССЕИВАЮЩИХ СВЕТ ОБЪЕКТОВ

2.1. Универсальное устройство для получения характеристик

2.3. Использование нестандартных измерительных элементов

для получения характеристик биологических образцов 44

2.4. Измерительные элементы с переменными углами падения

для анализа объектов в режиме "тонкой пленки" 47

2.5. Приставка с частичной компенсацией изменения глубины проникновения светового потока 50

ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ СВЕТА

С БИООБЪЕКТАМИ ПРИ КОЛИЧЕСТВЕННЫХ ИЗМЕРЕНИЯХ 53

3.1. Вопросы получения и обработки информации при работе

с интактными клетками 56

3.2. Вопросы обработки спектральной информации 59

3.3. Влияние формы и размеров биологических образцов на характер получения информации (метод "подходящего" индикатора) 65

3.4. Основные модели клеток для теоретического анализа 71

3.5. Теоретический анализ амплитудного метода

о нарушением ПВО при регистрации изменения светорассеяния 74

3.6. Теоретический анализ амплитудного метода НПВО 81

3.7. Фаговый способ определения объема измеряемого

образцов без их разрушения 2.2. Беззеркальная приставка МНПВО

33 40

вещества 90

ГЛАВА 4. СОСТОЯНИЕ ПОЛЯРИЗАЦИЙ ИСТОЧНИКА ИЗЛУЧЕНИЯ И

ОСОБЕННОСТИ ПОЛУЧЕНИЯ СПЕКТРОВ НПВО ИНТАКТНЫХ КЛЕТОК 95

4.1. Определение дихроизма полос поглощения интактных

клеток 98

4.2. Методическая и аппаратурная возможности регистрации циркулярного дихроизма б исследованиях интактных

клеток 109

4.3. Методическая и аппаратурная возможности регистрации дисперсии оптического вращения в изучении интактных клеток 113

ГЛАВА 5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОПТИЧЕСКИХ ПОСТОЯННЫХ ДИСПЕРСНЫХ МНОГОКОМПОНЕНТНЫХ ГЕТЕРОГЕННЫХ РАССЕИВАЮЩИХ СВЕТ ОБЪЕКТОВ 118

ri TT А О А С »ЛТТГПТМТТП'ГИ/ТТГТГ ПОП* /rvifft ТГИТТМ1 Tjrtri ТПТТГГт А T ТТЛ"CT A JliVOH. U. iVlt, I ЦЦ■И'-ОЕЛ.'ПЛЕ, DUOMUffinUUUi ^'-''.-•^¿ЛиОЛГШЛ

БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ В СЛОЖНЫХ СРЕДАХ 127

u.a. mt?гид ичеитис? вивмитлиити и ииииунииити аилучеНИЯ

информации из неразрушенных клеток 128

5.2. Количественное определение биохимических компонентов интактных клеток 136

6.3. Использование оптических постоянных объектов и параметров измерительных элементов для разделения исследуемых объектов от фона 158

6.4. Об особенностях исследования водных сред в инфракрасном диапазоне 169

ГЛАВА 7. ИССЛЕДОВАНИЯ ВЗАИМОСВЯЗИ В ИЗМЕНЕНИЯХ СТРУКТУР

И ФУНКЦИЙ ИНТАКТНЫХ КЛЕТОК 173

7.1. Характеристика криптобиотического состояния спор при регистрации изменения градиента степени пространственной организации биохимических компонентов нативных клеток 174

7.2. Анализ гетерогенности культуры интактных клеток при регистрации изменения градиента биохимических компо-

нентоЕ клеток IbS

7.3. Исследование динамики поступления и утилизации углеводорода в клетках микобактерий при регистрации изменения градиента биохимических компонентов 192

7.4. Использование фагов в исследовании "состояния"

бактерий 201

7.5. Определение количества воды в интактных клетках при регистрации изменения градиента положения основания полос поглощения 207

7.8. Выявление особенностей культуры микроорганизмов в процессе ее развития при регистрации комплекса характеристик 209

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 215

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ 220

ЛИТЕРАТУРА

224

ВВЕДЕНИЕ

Общеизвестно, что основным предикат-ом, формирующим поведение человека, является его мировоззрение. От того, каким видит человек устройство Универсума и свое место в нем, выстраивается его миропонимание происходящих процессов. Человек постулирует свое поведение в этих процессах, будь то природных или социальных, и сам определяет свою философию жизни. При всем, казалось бы, многообразии точек зрения человечество, живя сообща на одной планете, бессознательно интегрировало это разнообразие в общую философию жизни, в единое житейское мировоззрение, которое на сегодняшний день называется и является в полной мере ПОТРЕБИТЕЛЬСКИМ.

При таком мировоззрении все ресурсы планеты, гипотетически, понимаются неограниченными и служат человеку исключительно для удовлетворения его разнообразных потребностей, запросов и даже прихотей...

Итак, в XX веке наша Человеческая Цивилизация полностью оформилась в техногенную Цивилизацию, смысл жизни и развития которой является производство материальных ценностей, материальных благ для потребления и использования их Человеком. Экономические механизмы всех стран, интегрированные в мировую экономическую систему, работают по принципам: -"Больше производства, больше потребление": -"Сегодня больше, чем вчера, завтра больше, чем сегодня". Вся сумма результатов человеческой деятельности привела нашу цивилизацию к экологическим проблемам, катастрофическим изменениям среды обитания и климата Планеты, неразрешимым при настоящем устройстве Общества (Аксенов, 1996).

Возникла чрезвычайка» экологическая ситуация. Она одинаково беспощадна как у "них", так и у "нас". Осталось очень мало времени до того, как может разразиться катастрофа: называют срок - от 10 до 30 лет /Гусев, 1992/. Представим себе невероятное: к сегодняшнему дню весь мир достиг американского уровня развития. Человечество производило бы в год 20 триллионов кет/ч электроэнергии, 15 млрд т угля, 140 млн автомашин, 1 млрд т бумаги и картона, 13 млрд т нефти. Перечень можно продолжать, и все цифры в 3-5-10 раз превысили бы нынешний уровень мирового производства и потребления. Но подобные показатели производства означали бы такое загрязнение земли, океанов, атмосферы, такое истощение ресурсов всех ендов, парниковый эффект такого масштаба, что экологическая система планеты, подвергшись глобальной индустриальной агрессии, вообще бы не выдержала и была бы разрушена. Это поставило бы под

вопрос сохранение человеческого рода, (Гусев, 1993).

На открытых парламентских слушаниях в Государственной Думе Российской Федерации 28 ноября 1995 года получила одобрение и рекомендацию к внедрению "Концепция Общественной Безопасности России". В ней, в частности, шла речь об изменении соотношения эталонных частот биологического и социального времени (т.н. законе времени), где было показано, что эталонная частота биологического времени с периодом в £5 лет (который не изменился за более чем 7000 лет глобального исторического процесса) и эталонная частота социального времени (период которого за 7000 лет изменялся от 300-150 лет вначале до 3-7 лет в наше время) совпали в период от 1914 до 1939 г.г. Поэтому скорость обновления информации генетической (которая за 7000 лет оставалась постоянной) в указанные годы пересеклась со скоростью обновления информации социальной (внегенетической) (которая из-за изменения периода все время возрастала). В таких условиях человечество за все время своего существования еще не находилось. Нужна смена логики социального поведения. нужна ликвидация монополии на знания.

Таким образом, речь должна идти не только о необходимости серьезных ограничений роста производства и потребления. И в этом свете гораздо более серьезные различия между социальными учениями, философскими системами проходят не по линии признания или отрицания борьбы социально-экономических систем, а по линии "стихийность или сознательность". Но если отказаться от позиции стихийности при обсуждении экологических вопросов при создании программ образования, то должен встать вопрос о роли биологического образования (Гусев, 1994; Гусев, 1997; Шеффер, 1997).

Надо ввести в законы всех стран положение, которое можно было бы назвать презумпцией виновности человека перед великим целым, именуемым природой /Гусев, 1992/. Из этого вытекает, что потребности как отдельного человека, так и всей популяции должны удовлетворяться лишь постольку, поскольку они не противоречат интересам других форм жизни на Земле, интересам биосферы. Такая установка создала бы новые критерии для решения споров, новые приоритеты для принятия решений. Принципы "не убий" в религии, "не навреди" в медицине, по существу, можно рассматривать как производные от более общего принципа презумпции виновности человека перед природой. Все сказанное ни в коей мере не означает, что нельзя любить и защипать самого человека. Но прежде всего человек должен защищать биосферу, и это обернется его собственной, дол-

г современной, а не сиюминутной выгодой. Это и есть искомая альтернатива антропоцентризму - биоцентризм (Гусев, 1992).

Всегда на протяжении всей истории человечества живет мечта о мире, где царит добро. В поразительной поэтической форме зта мечта Еыра-жена в загадочном древнем, уже тысячелетия занимающем умы людей удивительном пророчестве:"И отрет Бог всякую слезу с очей их, и смерти не будет уже; ни плача, ни вопля, ни болезни уже не будет, ибо прежнее прошло". Но такого Бога нет, а потому человек должен сам становиться богом своих детских снов - добрым, справедливым, милосердным и всемогущим, и стать таким человеку поможет наука, но не наука ракет, пестицидов, атомных бомб и электростанций, а наука человеческая, наука о человеке (Карпенко, 1992). Должна же существовать какая-то высшая этическая система, метазтика, моральные ценности в которой имели бы абсолютный и объективный характер, где добро было бы добром для всех, а зло, причиненное одному, вызывало бы общее страдание, а потому было бы невозможно. Должна существовать такая , не известная нам пока точка отсчета, такая мораль, где добро и зло были бы инвариантны, где их понимание не зависело бы от системы координат - от всех тех многочисленных преходящих и проходящих факторов, от которых они зависят сейчас. Это изменение статуса противоположностей, исчезновение их относительности не есть отступление от диалектики, содержащей в качестве одного из основных свои:": принципов систему противоположностей, которые всегда относительны, всегда переходят друг в друга. Поняв и приняв абсолют моральных ценностей, абсолют добра и зла, нравственный абсолют, установив критерии этой абсолютности, люди неминуемо встретятся с иными противоположностями, качества которых вообразить сегодня мы просто не в силах. Но дай нам Бог понять сейчас хотя бы, что есть зло - для всех,- потому что не понявшее этого и держащееся за собственное субъективное и такое непостоянное понимание добра и зла человечество обречено на гибель. Метазтика, как и любая другая новая система мышления, не может возникнуть на пустом месте. Однако есть уже признаки, позволяющие говорить о ее возрождении, поскольку на наших глазах набирает силу новая удивительная наука - экология-первая поистине космическая наука человечества.

Экология не только глобальна - этим может похвастаться и атомная физика,- но и глубоко человечна. Она олицетворяет совершенно новый, невиданный в истории подход к природе, когда человек, ощутив свою вину и свою оторванность от природы, рассматривает ее как единое целое, как

единый живой организм, неотъемлемой частью которого он сам начинает воспринимать себя, и тем самым все человечество начинает осознавать свое единство. Экология, родившаяся как утилитарное средство изучения антропогенных воздействий на природу, стремительно становится наукой этической, всепланетарной, наднациональной, определяющей добро и зло безотносительно. Экология - это пробуждающаяся совесть человечества, которое, словно бы очнувшись от тяжелого сна прагматизма, впервые, пожалуй, в таких масштабах поступается своими сугубо материальными интересами во имя непонятых ранее, таких эфемерных ценностей, как красота и чистота природы, любовь к природе становится научным понятием. Это первая ласточка грядущей научной революции, революции в человеческом сознании, и хоть ока, может быть, не делает весны, но это не значит, что весны не будет вовсе...

Экология - это вторжение эмоций, этических и эстетических категорий в строгий и стройный, сугубо материалистический мир науки, ее поворот к духовному миру человека вынуждает многих ученых высказывать мысли о неполноте знания, замыкающегося в сухих формализациях, об одностороннем хзрзктере достижении науки, вое больше напоминающих пирровы победы:"В этом победном шествии прогресса есть какие-то тревожащие моменты, и к этим тревожащим моментам не следует относиться легкомысленно. .. То, что дает нам искусство, никак не заменит никакая математизация. И очень страшно, если наиболее способные дети пойдут по линии такого суррогата" (Карпенко, 1992).

Подобная критика не ставит под сомнение научное мышление как таковое - она сомневается в человечности классической науки: "Критика направлена на неспособность классической науки справиться с некоторыми фундаментальными аспектами окружающего мира. Мы начинаем выходить за пределы того мира, который можно определить как "мир количества" и вступаем в "мир качества". Мы должны "найти в науке место для нашей качественной и этической оценки природы", что всегда являлось прерогативой искусства" (Карпенко, 1992).

■пттлгел •■( гупг\ги тпп л т тмтг т<г гугчтт я гт -■„- я г; л т/тттч-лд-пттугт- д ОЛТГ'ПТ!?

I ляЬн 1. иЬии-пионгшс, ух иощнл лнгагмигпи'Хлпк гАЬихо

1.1. О НЕКОТОРЫХ НОВЫХ ИДЕЯХ В НАУКЕ

До сих пор основой, на которой строились наши представления о Вселенной мало чем отличались от взглядов Ньютона и Коперника. Мы считали, что она представляет собой некий объем, в котором размещаются материальные тела, связанные между собой определенными силовыми дистантными взаимодействиями, природу которых мы понять не можем, а потому область таких взаимодействий условно называем "полями". Эти поля мы классифицируем по характеру предполагаемых взаимодействий и называем их соответственно - гравитационными, электромагнитными, сильными, слабыми, а в последнее время появились и торсионные поля и взаимодействия. Но природа полей и взаимодействий оставалась непознанной. Не было объяснений в классической науке тому, почему заряженные шарики,

чтг>«г»чг». лтлт»*»» »л *<г*гт*яп«г «»лжл« т»тттгь •пттаччтпт/'чм щ ♦

ниДвешсииыс па Нихлеал, армТигшзсаихин шш иттсшпшгснитии., йлешиикы арсз,-

щаю-тоя вокруг ядра, а планеты - вокруг Солнца и т.д. Постулируется че-

и V и

тырехмерныи континуум (трехмерное пространство и время), который является основой современных физических концепций.

Но результаты новейших исследований позволяют усомниться в справедливости таких утверждений. Все чаще и чаще высказываются соображения о многомерности объективной реальности, искривлении пространства, проявлении эффекта дальнодействия и других физических явлениях, противоречащих концепции четырехмерного континуума. Без раскрытия сущности незримых физических реальностей, из которых состоит Мир, вести разговор о его устройстве бессмысленно. Из абстракций реальный Мир построить невозможно, как невозможно изучить его до конца методом индукции, т.е. умозаключениями от фактов к общему утверждению.

Считая своей задачей установление причинно-следственных связей, т.е. отвечал на вопрос "почему ?", наука не всегда отвечает на вопрос "зачем ?". Об этом в свое время писал академик Г.М.Франк: "На настоящем этапе развития биологии задача заключается в том, чтобы попытаться совершить скачок в познании жизнедеятельности клетки - сложной системы, саморегулирующейся и устойчивой, несущей в себе не только прог-

рамму стабилизации свойств и процессов, но и программу развития в нисходящих поколениях и программу реакции применительно к меняющимся условиям внешней среды. От набора отдельных химических компонент клетки и расстановки этих компонент в пространстве следует перейти к анализу действия всего клеточного механизма "в сборе". Необходимо учиться процессу синтеза, должны научиться объединяющему мышлению.

Однако, процесс синтеза - сложное дело, т.к. нам обязательно надо заставить себя выйти за рамки стереотипов, за рамки обычного мышления, всегда надо сделать шаг вперед, преодолеть самих себя. Об этом говорил и академик В.А.Знгельгард: "... сведение - для целей познания - сложного к сумме его частей требует и сво�

Информация о работе

Королев, Юрий Николаевич
доктора биологических наук
Москва, 1998
ВАК 03.00.29

Диссертация

Структурно-функциональный анализ интактных клеток методами внутреннего отражения для целей экологического мониторинга - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Структурно-функциональный анализ интактных клеток методами внутреннего отражения для целей экологического мониторинга - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы