Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оценка влияния ионов тяжелых металлов и осмотического давления среды на уровень активности пищеварительных ферментов русского осетра

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Оценка влияния ионов тяжелых металлов и осмотического давления среды на уровень активности пищеварительных ферментов русского осетра"

На правах рукописи

Мартьянов Александр Сергеевич

ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ИОНОВ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ И ОСМОТИЧЕСКОГО ДАВЛЕНИЯ СРЕДЫ НА УРОВЕНЬ АКТИВНОСТИ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ РУССКОГО ОСЕТРА (Acipenscr gucldenstaedtii Brandt)

Специальность 03.03.01 «Физиология»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 6 ОсЗ

Астрахань-2012

005010072

005010072

Работа выполнена на кафедре гидробиологии и общей экологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Астраханский государственный технический университет»

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор

Александр Николаевич Неваленный

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор

Алтуфьев Юрий Владимирович

кандидат биологических наук Гераскин Петр Петрович

Ведущая организация Учреждение Российской академии наук

Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина

Защита состоится «29» февраля 2012 года в 15:00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.009.01 при Астраханском государственном университете по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Астраханского государственного университета по адресу: 414000, г. Астрахань,

пл. Шаумяна, 1.

Автореферат разослан <м> января 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Введение.

Актуальность проблемы. В последнее время одной из центральных проблем современной биологии является проблема адаптаций организмов к воздействию факторов окружающей среды. Основные особенности физиологии пищеварения рыб к настоящему времени изучены весьма подробно (Уголев, Кузьмина, 1993), однако факториальные исследования в этой области продолжаются по сей день (Кузьмина, 2007; Кузьмина, Ушакова, 2007). На протяжении ряда лет представители семейства АарспэспсЬс, многие из которых населяют воды Каспийского бассейна, привлекают к себе внимание исследователей. Однако до настоящего времени остается ряд вопросов, на которые не существует однозначного ответа. В области физиологии пищеварения рыб это касается особенностей воздействия на пищеварительные ферменты осетровых ряда ионов тяжелых металлов, так как относительно данного явления существует ограниченное количество работ (Кузьмина, Голованова, 1998; Неваленный, Бедняков, 2000; Бедняков, 2000; Неваленный и др., 2003). Кроме того, практически ничего не известно об особенностях адаптаций пищеварительных энзимов осетровых и вообще проходных рыб к периодически меняющимся (в силу их образа жизни) осмотическим условиям окружающей среды (Краюшкина, Семенова, 2006).

Цель работы - изучить воздействие ионов тяжелых металлов и осмоляр-ности среды на а-амилазу, мальтазу и щелочную фосфатазу слизистой оболочки кишечника и пилорической железы русского осетра, используя методы кластеризации, нейросетевого и нечеткого моделирования.

Задачи исследования:

1. Проанализировать с привлечением классификационных методов особенности реакций ферментов слизистой оболочки кишечника и пилорической железы на присутствие ионов металлов исследуемых концентраций;

2. Выявить изменения уровня активности исследуемых ферментов при различных значениях осмотического давления среды;

3. Сравнить и проанализировать изменения уровня активности исследуемых ферментов различного происхождения при исследуемых факториальных воздействиях;

4. Разработать модели воздействия осмолярности на уровень активности исследуемых ферментов, исследовать возможности и ограничения созданных моделей;

5. Сравнить созданные модели воздействия осмотического давления на уровень активности ферментов по критериям точности, применимости, возможности содержательной интерпретации.

Научная новизна работы. В диссертационной работе впервые исследовано воздействие осмолярности среды на активность пищеварительных ферментов русского осетра. При этом были сопоставлены реакции на данный фактор, а также на воздействие ионов тяжелых металлов ферментов слизистой оболочки кишечника и пилорической железы. Выявлены различия в реакциях ферментов разного происхождения, проведен всесторонний классификационный

анализ полученных закономерностей. Создан комплекс классификационных и прогностических моделей, результаты которого обладают существенно большей надежностью в сравнении с результатами изолированно используемых методик. Впервые в данной области исследований были применены с целью моделирования нейроинформационные технологии и системы нечеткого вывода.

Теоретическая и практическая значимость работы. Впервые проведено информационное моделирование факториальных воздействий на организм гидробионтов. Полученные результаты позволяют установить определенные различия в функциональности пищеварительных ферментов слизистой оболочки кишечника и пилорической железы русского осетра. Создан и рекомендован к дальнейшему применению комплекс моделей, генерирующей результаты с повышенной надежностью. Также предложены практические рекомендации по созданию базы данных, объединяющей массивы самих данных, результаты классификационного анализа и непосредственно взаимосвязанные прогностические модели.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы представлялись на Конференциях профессорско-преподавательского состава АГТУ в 2007 - 2010гг., конференции «Экология биосистем: проблемы изучения, индикации и прогнозирования» (Астрахань, 2007 г.), международной научной конференции «Биология: теория, практика, эксперимент» (Саранск, 2007 г.), Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2008 г.), конференции «Экологические проблемы природных и урбанизированных территорий» (Астрахань, 2008), международной конференции «Фундаментальные аспекты биологии в решении актуальных экологических проблем» (Астрахань, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 23 работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов исследования, заключения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 159 страницах, содержит 7 таблиц, 46 рисунков, список литературы включает 220 источников, из которых 41 иностранных.

Материал и методы исследований

Активность а-амилазы в данной работе определялась методом Smith Roe в модификации А.М. Уголева, определение уровня активности мальтазы производилось глюкозооксидазным методом, а активность щелочной фосфатазы определяли по степени гидролиза n-нитрофенилфосфата Na с образованием n-нитрофенола (Неваленный и др., 2005).

При иерархической кластеризации данных расстояния между анализируемыми объектами вычислялись как евклидовы, из возможных параметров объединения использовались метод наиболее удаленных соседей, невзвешенное попарное среднее, метод Варда. Для нейросетевого моделирования воздействий факторов на уровень активности ферментов использовалась модель класса «многослойный персептрон», нечетко-нейронное моделирование осуществлялось с помощью модели класса ANFIS.

Результаты и обсуждение

Приведенные в данной работе результаты по влиянию ионов металлов па пищеварительные ферменты рыб во многом подтверждают выводы А.Н. Нева-леппого с соавт. (2003) относительно воздействия высоких концентраций ионов тяжелых металлов па активность пищеварительных гидролаз осетровых. Помимо этого, следует отмстить обнаружение серьезных различий в уровнях активности ферментов для кишечника и пилорической железы. Различия реакций на воздействие ионов на эти ферменты дает основания для гипотезы о структурных и функциональных различиях этих белков, что подтверждается также результатами проведенного кластерного анализа (особенно важны его результаты при интерпретации данных относительно устойчивой к действию ионов щелочной фосфатазы). Устойчивость к воздействию данных факторов щелочной фосфатазы в принципе согласуется с литературными данными относительно поведения этого фермента в широком диапазоне концентраций ионов кадмия (Бедняков, 2000; Неваленный, Бедняков, 2000; Голованова, Фролова, 2005; Коростелев, Неваленный, 2007).

В результате проведения кластерного анализа экспериментальные данные как для а-амилазы, так и для мальтазы были четко подразделены на 3 группы. Результаты анализа показывают сильную обособленность группы, включающей данные о влиянии изучаемых ионов в концентрации 10 мг/л на а-амилазу слизистой оболочки кишечника. В случае же мальтазы данные о влиянии на фермент ионов в концентрациях 10 мг/л и 0,1 мг/л также достаточно четко разграничены, тогда как результаты относительно ферментов кишечника и пилорической железы полностью обособлены. В целом нам представляется, что успешная классификация данных, учитывающая цели проведенного исследования, может быть произведена при выбранном расстоянии 8 для а-амилазы и 10 для мальтазы. Также существенно и то обстоятельство, что результаты классификации этих 2-х ферментов можно сравнивать, несмотря на то, что уровни их активности измерен различным образом. Непосредственно результаты кластерного анализа свидетельствуют о серьезных различиях в уровне активности и в его изменении под воздействием ионов металлов между ферментами слизистой оболочки и кишечника и слизистой пилорической железы, что особенно ярко проявляется в случае мальтазы. При кластеризации аналогичных данных для щелочной фосфатазы очевидно подразделение исходных данных на 2 отдельных кластера, соответствующих различиям в происхождении ферментов. Таким образом, несмотря на внешнее сходство реакций на присутствие ионов тяжелых металлов, отличительной чертой которых была значительная устойчивость фермента, фосфатаза кишечника и пилорической железы оказались обособленными друг от друга, причем в значительно большей степени по сравнению с карбогидр азами.

Все данные, принадлежащие в отдельности результатам относительно кишечника и пилорической железы объединяются в кластеры при расстоянии 0,6, а окончательное объединение происходит лишь на расстоянии 2,4; соотношение между этими показателями 0,25, тогда как для а-амилазы 0,45, а для мальтазы 0,6. Подобные результаты позволяют предположить даже более существенные различия поведения и, возможно, структуры для фосфатаз разного происхождения.

Tree Diagram tor Variables' Complete Linkage Eucftdean distances

Control _

Control p <CuO,1p

Ш

Fe10p Ml Op MnlOp Cu10p Co 0,1 p

■ъш

FeO,1p Zn 0,1 p

0,0 0,5 1,0 :Vfi.

linkage Distance

Рис. 1. Результаты кластеризации, полученные для щелочной фосфатазы (Переменная Control содержит данные контроля; переменные, содержащие результаты относительно воздействия ионов тяжелых металлов на уровень активности а-амилазы, обозначены соответствующими химическими знаками; числа в именах переменных обозначают соответствующие концентрации исследуемых ионов, мг/л; переменные, содержащие результаты, полученные при исследовании слизистой оболочки кишечника, имеют в конце имени символ i, а полученные при исследовании слизистой пилорической железы - символ р. По вертикали расположены обозначения переменных, по горизонтали - расстояния)

С другой стороны, большинство авторов отмечает большое физиологическое значение постоянства осмотических параметров для внутренней среды организмов (Краюшкина, Семенова, 2006; Метельский, 2007; Металлов с соавт., 2010). Для большинства гидробионгов столь же важными являются достаточно узкие пределы изменения осмолярности внешней среды. Некоторые из рыб, к числу которых относятся и осетровые, периодически совершают миграции, в ходе которых сталкиваются с изменениями упомянутого параметра внешней среды и изучение адаптаций к этому фактору, безусловно, является необходимым для понимания особенностей пищеварения осетровых рыб.

В то же время исследования относительно влияния осмолярности внешней среды на процессы пищеварения и состав кишечной жидкости фрагментарны и не носят обобщающего характера (Аминева, Яржомбек, 1984).

Поэтому наряду с реакциями на изменение обсуждаемых факторов внешней среды ферментов слизистой оболочки кишечника мы сочли необходимым оценить также аналогичные реакции ферментов, содержащихся в пилорической железе русского осетра. Обработка данных при этом также выполнялась с привлечением методов кластерного анализа. Для ряда ферментов (преимущественно слизистой оболочки кишечника) был выявлен активирующий эффект низких значений исследуемого параметра. Это относится и к функционированию ферментов в среде, представляющей собой чистую дистиллированную воду.

6

В отдельных случаях подобное воздействие оказывали и довольно высокие его значения (мальтаза в 10% ИаС1 и щелочная фосфатаза слизистой оболочки и 01-амилаза пилорической железы в 2,5% №С1).

Однако все же в большинстве случаев при значениях осмотического давления, существенно превосходящих таковые используемого в экспериментах физиологического раствора наблюдается существенное понижение активности ферментов (в отношении 20%-го раствора хлорида натрия это правило соблюдается во всех случаях), поэтому имеет смысл говорить о достаточно высокой чувствительности пищеварительных гидролаз к данному фактору независимо от их структуры, функций и происхождения.

Сравнительный анализ реакций ферментов кишечника и пилорической железы на изменения осмолярности среды, проводимый при помощи кластеризации данных, позволил и здесь выявить существенные различия между данными группами ферментов. Хотя в отношении экстремальных значений солености эти реакции оказались во многом схожими и объединенными в общие кластеры, на большей части диапазона исследуемых концентраций отмечались тенденции группировки данных соответственно происхождению изучаемых ферментов. Это особенно ярко проявилось при анализе данных по активности щелочной фосфатазы, в принципе проявившей значительную устойчивость к воздействию внешних факторов. Таким образом, использование методов кластеризации данных позволило выявить различия между ферментами разного происхождения по отношению как к воздействию как ионов тяжелых металлов, так и осмотического давления среды. Для металлов, кроме того, выявлены кластеры, соответствующие различным концентрациям ионов, а также показано сходство в действии марганца и кобальта и железа с никелем.

Результаты кластеризации данных по воздействию осмолярности на пищеварительные ферменты весьма отчетливо свидетельствуют о глубоких различиях в поведении между ферментами кишечника и пилорической железы, наиболее выраженных у щелочной фосфатазы. Для а-амилазы при используемом расстоянии 10 выделяется 4 кластера, анализ структур которых показывает, что данные здесь сгруппированы относительно изучаемых концентраций растворов.

Однако это в большей степени характерно для высоких концентраций, тогда как при низкой осмолярности данные уже обособляются друг от друга согласно происхождению ферментов. Еще большая степень такого разграничения наблюдается в случае исследования кластеризации мальтазы: при расстоянии 50 наблюдается 2 обособленных кластера, один из которых включает большую часть данных относительно кишечного фермента, другой - пилорической железы.

Изучение адаптаций ферментных систем пищеварительного тракта рыб к воздействию меняющихся факторов окружающей среды является во многом нерешенной задачей. Приведенные результаты свидетельствуют, на наш взгляд,

о необходимости дополнительных биохимических исследований в этой области. В частности, это связано с изучением возможности существования отдель-

ных фракций ферментов, выполняющих сходные функции, но обладающих разной степенью устойчивости к воздействиям определенного фактора или группы факторов среды. Также необходимы дополнительные исследования функций ферментов пилорической железы и изучение особенностей их структуры. Понимание данных различий будет не только иметь важное фундаментальное значение, но также будет способствовать разработкам более эффективных кормовых рецептур в рыборазведении, а кроме того позволит прогнозировать физиологические изменения в организме рыб при загрязнении окружающей среды.

Применение методов многомерного статистического анализа при обработке данных эколого-физиологических исследований в настоящее время крайне ограничено. В качестве одного из немногочисленных примеров можно привести работу С.В. Шипулина (2006). Наибольшую распространенность имеют четкие методы кластеризации.

По ряду причин описание воздействия (даже количественное) в исследованиях по факториальной экологии относительно редко давало возможность прогноза количественного изменения изучаемого показателя при изменении интенсивности воздействия того или иного фактора на организм. Отчасти это связано с комплексностью воздействия факторов окружающей среды на организм в естественных условиях, следствием чего является трудность выявления и анализа причинно-следственных связей между влияющим агентом и происходящими изменениями. Другой же важной причиной является сложность самих данных связей, зачастую не позволяющих описать их (даже при изолированном действии какого-либо фактора) конкретной функциональной зависимостью. Одним из решений данной проблемы может стать построение непараметрических нелинейных моделей, способных аппроксимировать подобные зависимости при достаточном объеме обучающей выборки. К таким моделям можно отнести, в частности, нейронные сети и системы нечеткого вывода, обладающие способностью к обучению на выборке данных и к нелинейной аппроксимации функций (Дьяконов, Круглов, 2006; Рутковская с соавт., 2006; Хайкин, 2006).

Многослойным персептроном называют многослойную нейронную сеть с прямым распространением сигнала. Обычно сеть состоит из сенсорных элементов (входных узлов), которые образуют входной слой; одного или нескольких скрытых слоев вычислительных нейронов и одного выходного слоя.

Основным средством моделирования воздействия упомянутого фактора на активность ферментов служил многослойный персептрон. Цикл обучения составил 60 эпох, результаты продемонстрированы на рисунке 2. Для аппроксимации зависимости был сформирован многослойный персептрон с одним промежуточным слоем. Входной переменной служило осмотическое давление среды (кПа), выходной - относительный показатель изменения уровня активности исследуемого фермента (отношение наблюдаемого уровня активности к среднему его значению в физиологическом растворе Рингера для холоднокровных животных). Число нейронов в промежуточном слое было выбрано равным трем (Хайкин, 2006).

} аор Тга1пг1д ]

' Рис. 2. Изменение среднеквадратической ошибки в ходе обучения многослойного персептрона. Синим цветом отмечена ошибка для обучающей выборки, зеленым —

I для контрольной, красным - для тестовой. По горизонтальной оси отложены эпохи обучения, по вертикальной — значения ошибки I Уменьшение ошибки на контрольной, а главное тестовой выборках по-

зволяет говорить о достаточно хорошем качестве обучения сети, прежде всего — отсутствии эффекта переобучения. Результирующая среднеквадратическая I ошибка составила:

• для обучающей выборки - 1,99*10'2

• для контрольной выборки — 1,71*102

• для тестовой выборки - 2,91 * 10'2

Эти данные позволяют говорить о достаточно высокой точности аппроксимации исследуемой зависимости. Однако для подтверждения точности результатов был дополнительно проведен регрессионный анализ для каждой из выборок; анализировались линейная регрессия и корреляция между экспериментальными данными и вычисленными многослойным персептроном значениями. Результаты анализа (Т - данные эксперимента, А - данные, вычисленные персептроном, Л - коэффициент корреляции между Т и А):

• для обучающей выборки: А = 0,87*Т + 0,12, Б. = 0,95

• для контрольной выборки: А = Т - 0,033, Я = 0,96

• для тестовой выборки: А = Т + 0,021, И. = 0,93

I Аналогичным образом было проведено моделирование воздействия дан-

ного фактора на мальтазу слизистой оболочки кишечника и пилорической железы. Использовалась трехслойная модель с 5 нейронами в промежуточном слое. Циклы обучения заняли 50 и 100 эпох для мальтазы слизистой оболочки кишечника и пилорической железы соответственно. Значение усредненной

9

нормированной среднеквадратической ошибки в конце обучения составило:

0,0020, 0,0017 и 0,0034 для мальтазы кишечника и 0,0053, 0053 и 0,0062 для фермента пилорической железы для обучающей, контрольной и тестовой выборок соответственно.

При моделировании воздействия фактора на щелочную фосфатазу пилорической железы использовалась трехслойная модель с 5 нейронами в промежуточном слое (Дьяконов, Круглов, 2006). Цикл обучения занял 25 эпох. Значение усредненной нормированной среднеквадратической ошибки в конце обучения составило 0,11 при максимально допустимом значении 0,67. Результаты обучения показаны на рисунке 3.

Рис. 3. Изменение среднеквадратической ошибки в ходе обучения многослойного персептрона (по вертикали - значения ошибки, по горизонтали - циклы обучения сети).

Гибридная сеть представляет собой многослойную нейронную сеть специальной структуры без обратных связей, в которой используются обычные (не нечеткие) сигналы, веса и функции активации, а выполнение операции суммирования основано на использовании фиксированной Т-нормы, Т-конормы или некоторой другой непрерывной операции.

Реализация модели воздействия осмолярности на а-амилазу кишечника русского осетра осуществлялась в среде MATLAB с использованием пакета расширения Fuzzy Logic Toolbox (Дьяконов, Круглов, 2006). Из общего объема экспериментальных данных 15% было зарезервировано для тестовой и контрольной выборок. На оставшихся данных производилось обучение гибридным методом, сочетающим при минимизации среднеквадратической ошибки метод наименьших квадратов и алгоритм обратного распространения ошибки. Структура сети показана на рисунке 4.

Рис. 4.

Цикл обучения занял 500 эпох. Значение усредненной нормированной среднеквадратической ошибки в конце обучения составило 0,21 при максимально допустимом значении 0,67. При этом на обучающей выборке значение среднеквадратической ошибки составило 0,21, на контрольной и тестовой —

0,25. Результаты обучения показаны на рисунке 5.

Подобные вычислительные эксперименты были проведены с данными воздействия осмолярности и на остальные изучаемые ферменты. Результаты эксперимента однозначно свидетельствуют о значительных перспективах гибридного подхода, сочетающего нейросетевое моделирование и математику нечетких систем в исследованиях физиолого-биохимических аспектов адаптации пищеварительной системы гидробионтов (в частности, рыб), при создании прогностических моделей, а также при обобщении и систематизации больших массивов экспериментальных данных.

В работе была подтверждена возможность использования методов многомерного статистического анализа, а также приложений нечеткой логики и нейроинформационных технологий в исследованиях по экологической физиологии гидробионтов. Использованные в работе методы иерархической и нечеткой кластеризации показали высокую эффективность при построении классификационных моделей. Созданные нейросетевые и нечетко-нейронные модели обладают хорошими прогностическими свойствами. Все перечисленное свидетельствует о широких перспективах применения указанных методик в данной области исследований.

Структура нечетко-нейронной сети

Рис. 5. Результаты обучения нечетко-нейронной сети (синим цветом обозначены экспериментальные данные, красным - результаты моделирования).

При этом использование разработанных классификационных и прогно- | стических моделей при изучении факториальных воздействий на пищеварительные энзимы гидробионтов должно быть в обязательном порядке систематизировано. В качестве одной из возможных схем предложен приводимый в данной работе комплекс моделей. При независимом одновременном использовании представленных моделей и сравнении результатов моделирования последние будут обладать большей надежностью и обоснованностью, чем в случае избирательного применения используемых алгоритмов. Впоследствии, в случае более широкого применения использованных в работе методов станет возможным создание базы данных факториальных исследований по различным видам гидробионтов, содержащей организованный комплекс массивов эксперимен- ! тальных данных, результатов их статистической обработки (включая классификационные модели) и прогностических моделей - как обладающих содержательной интерпретацией закономерностей, так и лишенных таковой при условии высокой точности последних. Солидный объем данных и разнообразие подходов к моделированию изучаемых процессов при этом будут обеспечивать как высокую точность моделирования (залог ценности для практического применения), так и быстрое расширение границ их применимости, растущее по ме- | ре включения в базу новых факторов, либо расширения их диапазона.

В области прогнозирования воздействия осмолярности среды на уровень активности пищеварительных ферментов относительно редко используемые в настоящее время в данной области методы нейросетевого моделирования показали отличные результаты. Несомненно, что у применяемых в работе методов прогнозирования потенциально гораздо более широкая область применения,

так как они могут использоваться при изучении практически любых факторов срсды на организм, как по отдельности, так и совместно. Методы на основе многослойного перцептрона при этом имеют более высокую точность прогнозирования, однако моделирование на основе нечетко-нейронных сетей потенциально обладает более богатыми возможностями содержательной интерпретации структуры модели за счет возможности построения изоморфной данной сети системы логических предикатов первого порядка.

Выводы

1. При анализе структур сформированных кластеров для обеих исследуемых карбогидраз установлены различия реакций энзимов кишечника и пилорической железы русского осетра на присутствие различных ионов тяжелых металлов в концентрациях 0,1 и 10 мг/л. При этом концентрация 10 мг/л оказывает, как правило, угнетающее действие на активность ферментов, тогда как ионы в более низкой концентрации оказывают в ряде случаев активирующее воздействие на ферменты, наиболее сильные активационные эффекты наблюдались при воздействии ионов па мальтазу слизистой оболочки кишечника русского осетра. Наиболее устойчивой к воздействию ионов металлов как высокой, так и низкой концентрации оказалась щелочная фосфатаза.

2. Установлено, что в широком диапазоне осмотических воздействий, изучаемые ферменты сохраняют свою функциональность. Для высоких значений ос-молярности зарегистрировано преобладание ингибиторных эффектов. Обнаружено, что незначительное понижение осмолярносги вызывает резкое повышение уровня активности ферментов, тогда как повышение осмотического давления ведет к постепенному падению активности. Данные факты подтверждены результатами кластеризации данных и многомерного шкалирования.

3. Показаны серьезные различия в уровне активности и реакции на изменения среды энзимов слизистой оболочки кишечника и пилорической железы русского осетра, выделяемых при анализе в отдельные кластеры. Ферменты пилорической железы в целом более устойчивы к исследуемым воздействиям. В ряде случаев эффекты воздействия на фермент слизистой оболочки кишечника и пилорической железы были разнонаправленными. Данный результат позволяет подтвердить предположения о структурных различиях ферментов различного происхождения.

4. Результаты моделирования осмотического воздействия на активность пищеварительных ферментов свидетельствуют о высокой точности, широких границах применимости созданных моделей, их работоспособности и перспективности применения методов нейросетевого и нечеткого моделирования в экологофизиологических исследованиях. Созданные модели позволяют прогнозировать относительные изменения активности пищеварительных ферментов слизистой оболочки кишечника и пилорической железы русского осетра с малой погрешностью в широком диапазоне значений осмотического давления среды.

5. Наиболее высокая точность прогнозирования изменений уровня активности ферментов русского осетра при воздействии исследуемых факторов достигнута в случае, когда использовались нейросетевые модели. Для нечетко-нейронных моделей, в сравнении с нейросетевыми, характерна меньшая точность прогнозирования.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Мартьянов, А.С. Влияние некоторых модификаторов на активность пищеварительных ферментов у белуги и белорыбицы / A.C. Мартьянов // Сб. научн. Статей, Наука «Поиск», Т. 2, Вып.2, Астр. гос. техн. ун-т, Астрахань, 2004. С.160-162.

2. Мартьянов, A.C. Оценка влияния ионов тяжелых металлов на уровень активности некоторых пищеварительных гидролаз половозрелых особей русского осетра / A.C. Мартьянов // Актуальные проблемы современной биологии: Тезисы Российской студенческой конференции. 20 апреля 2005 г. Астрахань: Издательский дом «Астраханский университет», 2005. С. 63 - 64.

3. Мартьянов, A.C. Изменение уровня активности пищеварительных гидролаз русского осетра под влиянием ионов тяжелых металлов / A.C. Мартьянов // Сб. научн. Статей, Наука «Поиск», Т. 2, Вып.З, Астр. гос. техн. ун-т, Астрахань, 2005 - с. 140 -142.

4. Мартьянов, A.C. Влияние ионов тяжелых металлов на активность ряда пищеварительных гидролаз русского осетра / A.C. Мартьянов // Журн. Современные наукоемкие технологии 4/2005, материалы II конференции студентов и молодых ученых, Турция, 22 - 29 мая 2005 г. - С. 94 - 95

5. Неваленный, А.Н. Изменение уровня активности некоторых пищеварительных гидролаз вдоль кишечника русского осетра / А.Н. Неваленный, A.B. Туктаров, A.C. Мартьянов // Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря: Матер. VIII Международной научн. конф., 11-12 октября 2005 г.- Астрахань: Изд. дом «Астраханский университет», 2005,- с. 192-193.

6. Туктаров, A.B. Оценка уровня активности гидролитических ферментов слизистой оболочки пилорической железы русского осетра / A.B. Туктаров, А.Н. Неваленный, A.C. Мартьянов // Эколого-биологическиие проблемы бассейна Каспийского моря: материалы 8 Международной научной конференции. 11-12 октября 2005 г. / отв. ред. В.Н. Пилипенко - Астрахань: Издательский дом «Астраханский университет», 2005 - с. 193 - 194.

7. Неваленный, А.Н. Изменение уровня активности адсорбированной а-амилазы слизистой оболочки кишечника русского осетра при различных значениях осмо-лярности окружающей среды / А.Н. Неваленный, A.B. Туктаров, A.C. Мартьянов // Проблемы сохранения и рационального использования биоразнообразия Прикас-пия и сопредельных регионов: Материалы 4 международной заочной научной конференции / Ассоциация университетов Прикаспийских государств - Элиста: Изд-во КалмГУ, 2006 - С. 107 - 109

8. Туктаров, A.B. Использование кластерного анализа в исследовании характера воздействия ионов металлов на пищеварительные ферменты русского осетра / A.B. Туктаров, А.Н. Неваленный, A.C. Мартьянов // Вестник Астраханского государственного технического университета.- №3(32), 2006.- с. 112-118.

9. Туктаров, A.B. Использование методов иерархической кластеризации в исследовании активности пищеварительных ферментов русского осетра при различных значениях осмотического давления среды / А.В. Туктаров, А.Н. Неваленный, A.C. Мартьянов // Вестник Астраханского государственного технического университета - Приложение к № 6(35), 2006 - с. 93 - 99

10. Неваленный, А.Н. Использование деревьев решений для анализа характера влияния ионов тяжелых металлов на уровень активности пищеварительных гидролаз русского осетра (Acipenser gueldenstaedtii Brandt) / А.Н. Неваленный, A.B. Тук-

таров, А .С. Мартьянов // Современные проблемы адаптации и биоразнообразия. Труды международной научной конференции - Махачкала: Издательский дом «Наука плюс», 2006 - С. 51 - 53

11. Мартьянов, A.C. Оценка воздействия ионов тяжелых металлов на щелочную фосфатазу слизистой оболочки кишечника русского осетра с помощью методов кластерного анализа данных / A.C. Мартьянов // Наука: поиск-2006: сб. науч. ст.: в

2 т. Т. 2 / Астрахан. гос. техн. ун-т - Астрахань: Изд-во АГТУ, 2007 - с. 9 - 11

12. Неваленный, А.Н. Использование методов нечеткой кластеризации при анализе воздействия осмотического давления на пищеварительные гидролазы русского осетра / А.Н. Неваленный, A.B. Туктаров, A.C. Мартьянов // Экология биосистем: проблемы изучения, индикации и прогнозирования: материалы Международной научно-практической конференции, 20 - 25 августа 2007 г. / сост. В.Н. Пилипенко, С.Р. Кособокова, JI.B. Яковлева - Астрахань: Издательский дом «Астраханский университет», 2007 - ч.2-с.212-214

13. Неваленный, А.Н. Анализ применимости нейросетевых алгоритмов для прогнозирования физиологических показателей на примере исследования воздействия осмотического давления на уровень активности а-амилазы слизистой оболочки кишечника русского осетра / А.Н. Неваленный, A.B. Туктаров, A.C. Мартьянов // Экология биосистем: проблемы изучения, индикации и прогнозирования: материалы Международной научно-практической конференции, 20 - 25 августа 2007 г. / сост. В.Н. Пилипенко, С.Р. Кособокова, J1.B. Яковлева - Астрахань: Издательский дом «Астраханский университет», 2007 - ч. 2 - с. 229 - 230

14. Туктаров, A.B. Моделирование воздействия осмотического давления среды на уровень активности некоторых пищеварительных ферментов русского осетра (Acipenser gueldenstaedtii Brandt) с помощью нейроинформационных технологий / A.B. Туктаров, А.Н. Неваленный, A.C. Мартьянов // Вестник Астраханского государственного технического университета № 3(44)/2008 - Астрахань: Изд-во АГТУ, с. 49-52

15. Неваленный, А.Н. Нейросетевая модель прогнозирования измерений уровня активности щелочной фосфатазы пилорической железы русского осетра под влиянием осмотического давления среды / А.Н. Неваленный, A.B. Туктаров, A.C. Мартьянов // Биология: Теория, практика, эксперимент: материалы Междунар. Науч. Конф. - Саранск, 2008 - Кн. 2 - с. 134 - 137

16. Неваленный, А.Н. Опыт использования методов автоматической классификации в экологических исследованиях на примере анализа воздействия некоторых абиотических факторов среды на пищеварительные карбогидразы русского осетра / А.Н. Неваленный, A.B. Туктаров, A.C. Мартьянов // Экологические проблемы урбанизированных территорий: материалы Второй научно-практической конференции студентов, аспирантов, преподавателей и научных сотрудников, посвященной 10-летию кафедры экологии и безопасности жизнедеятельности Астраханского государственного университета. 26 - 27 мая 2008 г. - Астрахань: Издательский дом «Астраханский университет», 2008 - с. 72 - 73

17. Nevalennyy, A.N. Comparative Analysis of Changes in Activity Level of Digestive Enzymes of Russian Sturgeon (Acipenser gueldenstaedtii Brandt) Due to Environmental Factors / A.N. Nevalennyy, A.V. Tuktarov, A.S. Martianov // The Caspian Sea Natural Resources International Journal No. 2: Baku State University, Baku, 2008, pp. 30 - 43

' fi

I

18. Туктаров, A.B. Методы многомерного разведочного анализа и нейросетевого^ моделирования в исследованиях воздействия аботических факторов среды на процессы мембранного пищеварения русского осетра / A.B. Туктаров, А.Н. Невален-ный, A.C. Мартьянов // Механизмы функционирования висцеральных систем: VI Всероссийская конференция с международным участием, посвященная 50-летию открытия А.М. Уголевым мембранного пищеварения. - СПб: Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, 2008 — с. 205

19. Неваленный, А.Н. Нейросетевое моделирование воздействия осмолярности среды на уровень активности мальтазы кишечника и пилорической железы русского осетра / А.Н. Неваленный, A.B. Туктаров, A.C. Мартьянов Н Фундаментальные аспекты биологии в решении актуальных экологических проблем:Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения К.В. Горбунова, 10-12 декабря 2008 г.: Астрахань, ООО КПЦ «По-лиграфКом», 2008 - с. 185-188

20. Туктаров, А.В. Использование многослойного персептрона в исследовании воздействия осмолярности среды на уровень активности а-амилазы слизистой кишечника русского осетра (Acipenser gueldenstaedtii Brandt) / A.B. Туктаров, A.C. Мартьянов // Бюллетень Московского общества испытателей природы. Отдел биологический. - Том 114, выпуск 3,2009 г. Приложение 1, Часть 2 - с. 427-428

21. Туктаров, А.В. Моделирование изменений уровня активности некоторых кар-богидраз русского осетра под влиянием осмотического давления среды с помощью гибридных сетей / A.B. Туктаров, А.Н. Неваленный, A.C. Мартьянов // Юг России: экология, развитие, № 4,2010 - с. 73 - 75

22. Туктаров, A.B. Моделирование влияния осмотического давления среды на уро-

вень активности мальтазы слизистой оболочки кишечника русского осетра с помощью адаптивных нейронечетких сетей / A.B. Туктаров, A.C. Мартьянов // Международная отраслевая научная конференция профессорско-преподавательского состава Астраханского государственного технического университета - АГТУ (54 ППС): тез. Докл. В 2 т. / под общей редакцией проф. Н.Т. Берберовой, проф. A.B. Котельникова; Астрахан. Гос. Техн. Ун-т. - Астрахань: Изд-во АГТУ, 2010 - Т.1. -с. 42-43. „

23. Неваленный, А.Н. Моделирование изменений уровня активности щелочной фосфатазы русского осетра под воздействием осмолярности среды с помощью нечетко-нейронных сетей / А.Н. Неваленный, A.B. Туктаров, A.C. Мартьянов // Естественные науки, № 4 (33), 2010-с. 137- 141.

Подписано в печать 25.01.12 г. Тираж 100 экз. Заказ № 68 Типография ФГБОУ ВПО «АГТУ», тел. 61-45-23 г. Астрахань, Татищева 16ж.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мартьянов, Александр Сергеевич, Астрахань

61 12-3/674

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «АСТРАХАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

На правах рукописи

Мартьянов Александр Сергеевич ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ИОНОВ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ И ОСМОТИЧЕСКОГО ДАВЛЕНИЯ СРЕДЫ НА УРОВЕНЬ АКТИВНОСТИ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ РУССКОГО ОСЕТРА (Acipenser

gueldenstaedtii Brandt)

Специальность 03.03.01 - Физиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор А.Н. Неваленный

Астрахань - 2012

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

Введение.........................................................................................................................................................4

Глава 1. Литературный обзор................................................................................................................8

1.1. Виды и механизмы процессов пищеварения организмов............................8

1.2. Особенности процессов пищеварения рыб 14

1.3. Содержание тяжелых металлов в водах Волги и Каспия и их влияние на организм гидробионтов............................................................................................18

1.4. Действие тяжелых металлов на биологические системы рыб..................20

1.5. Осмолярность среды, ее значение в жизни гидробионтов......................25

1.6. Кластерный анализ............................................................................................................................30

1.7. Нейронные сети как средство анализа данных......................................................34

1.7.1. Свойства нейронных сетей....................................................................................................34

1.7.2. Знания в нейронных сетях......................................................................................................37

1.7.3. Применение нейросетевых технологий в биологичесих и медицинских исследованиях..............................................................................................................38

1.8. Многомерное шкалирование........................................................................................47

Глава 2. Материал и методы исследований..............................................................................50

2.1. Физиолого-биохимические методики исследований........................................50

2.2. Обзор техник применяемой иерархической кластеризации данных 53

2.3. Техники нечеткой кластеризации........................................................................................54

2.4. Методика исследования массивов экспериментальных данных с помощью многомерного шкалирования..................................................................................55

2.5. Список используемых для нейросетевого моделирования функций

Neural Network Toolbox..........................................................................................................................55

Глава 3. Результаты и обсуждение..................................................................................................60

3.1. Влияние ионов металлов на активность пищеварительных гидролаз слизистой оболочки кишечника русского осетра....................................60

3.2. Влияние ионов тяжелых металлов на уровень активности пищеварительных гидролаз слизистой оболочки пилорической железы

русского осетра....................................................................... 66

3.3. Влияние осмотического давления на уровень активности гидролаз слизистой оболочки кишечника русского осетра.............................. 73

3.4. Влияние осмолярности окружающей среды на уровень активности гидролаз слизистой оболочки пилорической железы русского осетра... 78

3.5. Кластерный анализ экспериментальных данных......................... 82

3.5.1. Кластеризация данных о воздействии тяжелых металлов на пищеварительные ферменты русского осетра................................. 82

3.5.2. Кластерный анализ данных о влиянии осмотического давления среды на уровень активности пищеварительных гидролаз русского

осетра................................................................................... 88

3.6. Анализ реакции комплекса ферментов на изменения осмолярности среды с помощью классификационных методик.............................. 95

3.7. Нейросетевое моделирование воздействия осмолярности среды на уровень активности пищеварительных гидролаз русского осетра......... 100

3.8. Нечетко-нейронное моделирование воздействия осмолярности

среды на пищеварительные ферменты русского осетра..................... 113

Заключение..................................................................!.......... 125

Выводы................................................................................... 132

Список литературы................................................................... 134

Введение

Актуальность проблемы. В последнее время одной из центральных проблем современной биологии является проблема адаптаций организмов к воздействию факторов окружающей среды. Относительно ферментов пищеварительной системы изучение воздействия подобных факторов приводит к вопросам относительно структурной однородности фермента, выполняющего определенную функцию. Основные особенности физиологии пищеварения рыб к настоящему времени изучены весьма подробно (Уголев, Кузьмина, 1993), однако факториальные исследования в этой области продолжаются по сей день (Кузьмина, 2007, Кузьмина, Ушакова, 2007; Кузьмина, 2009).

На протяжении ряда лет представители семейства Асгрешепёае, многие из которых населяют воды Каспийского бассейна, привлекают к себе внимание исследователей. Это обусловлено рядом уникальных свойств данной группы рыб. В частности, это специфичные морфофизиологические, филогенетические и экологические свойства осетровых. Однако до настоящего времени остается ряд вопросов, на которые не существует однозначного ответа. В области физиологии пищеварения рыб это касается особенностей воздействия на пищеварительные ферменты осетровых ряда ионов тяжелых металлов, так как относительно данного явления существует ограниченное количество работ (Кузьмина, Голованова, 1998; Неваленный, Бедняков, 2000; Бедняков, 2000; Неваленный и др., 2003). Кроме того, практически ничего не известно об особенностях адаптаций пищеварительных энзимов осетровых и вообще проходных рыб к периодически меняющимся (в силу их образа жизни) осмотическим условиям окружающей среды (Краюшкина, Семенова, 2006; Кузьмина, 2010; Металлов и др., 2010).

В случае рассмотрения изменений активности ферментов под влиянием вышеназванных факторов как адаптивных реакций подходящим средством для анализа экспериментальных данных, по нашему мнению, является кластерный анализ результатов экспериментов, позволяющий создать компактную

иерархическую классификацию исследуемых объектов, удобную для вычленения отдельных групп и сравнения их между собой (т.е. проведения сравнительного анализа). При этом алгоритмы кластеризации не требуют выдвижения каких-либо априорных гипотез относительно изучаемой выборки данных. Следует отметить, что в последние годы методы многомерного статистического анализа, и, в частности, иерархический кластерный анализ все шире используются в биологических науках, в том числе и в ихтиолоии при изучении популяций и межпопуляционных морфологических, биохимических, генетических отличий в пределах вида (Богданов, Книжин, 2007; Книжин и др., 2007; Богданов, 2007; Хрусталева, 2007; Книжин и др., 2006а,б,в,г,д, 2007, 2008; Алексеев, Осинов, 2006; Винников и др., 2006; Пичугин и др., 2006а,б; Мироновский, 2006; Волвенко, Кафанов, 2006; Волобуев и др., 2005), но применение таких методов при решении эколого-физиологических задач сравнительно мало распространено.

Цель работы. Изучить воздействие ионов тяжелых металлов и осмолярности среды на а-амилазу, мальтазу и щелочную фосфатазу слизистой оболочки кишечника и пилорической железы русского осетра, используя методы кластеризации, нейросетевого и нечеткого моделирования.

Задачи исследования:

1. Проанализировать с привлечением классификационных методов особенности реакций ферментов слизистой оболочки кишечника и пилорической железы на присутствие ионов металлов исследуемых концентраций;

2. Выявить изменения уровня активности исследуемых ферментов при различных значениях осмотического давления среды

3. Сравнить и проанализировать изменения уровня активности исследуемых ферментов различного происхождения при исследуемых факториальных воздействиях;

4. Разработать модели воздействия осмолярности на уровень активности исследуемых ферментов, исследовать возможности и ограничения созданных моделей;

5. Сравнить созданные модели воздействия осмотического давления на уровень активности ферментов по критериям точности, применимости, возможности содержательной интерпретации.

Научная новизна работы. В диссертационной работе впервые исследовано воздействие осмолярности среды на активность пищеварительных ферментов русского осетра. При этом были сопоставлены реакции на данный фактор, а также на воздействие ионов тяжелых металлов ферментов слизистой оболочки кишечника и пилорической железы. Выявлены различия в реакциях ферментов разного происхождения, проведен всесторонний классификационный анализ полученных закономерностей. Создан комплекс классификационных и прогностических моделей, результаты которого обладают существенно большей надежностью в сравнении с результатами изолированно используемых методик. Впервые в данной области исследований были применены с целью моделирования нейроинформационные технологии и системы нечеткого вывода.

Теоретическая и практическая значимость работы. Впервые проведено информационное моделирование факториальных воздействий на организм гидробионтов. Полученные результаты позволяют установить определенные различия в функциональности пищеварительных ферментов слизистой оболочки кишечника и пилорической железы русского осетра. Создан и рекомендован к дальнейшему применению комплекс моделей, генерирующей результаты с повышенной надежностью. Также предложены практические рекомендации по созданию базы данных, объединяющей массивы самих данных, результаты классификационного анализа и непосредственно взаимосвязанные прогностические модели.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы представлялись на Конференциях профессорско-преподавательского состава

АГТУ в 2007 - 2010гг., конференции «Экология биосистем: проблемы изучения, индикации и прогнозирования» (Астрахань, 2007 г.), международной научной конференции «Биология: теория, практика, эксперимент» (Саранск, 2007 г.), Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2008 г.), конференции «Экологические проблемы природных и урбанизированных территорий» (Астрахань, 2008), международной конференции «Фундаментальные аспекты биологии в решении актуальных экологических проблем» (Астрахань, 2008)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 23 работы.

Глава 1. Литературный обзор 1.1. Виды и механизмы процессов пищеварения организмов

Внеклеточное пищеварение характеризуется тем, что синтезированные в клетке ферменты выделяются за ее пределы во внеклеточную среду, где реализуется их гидролитический эффект. При внеклеточном пищеварении ферменты растворены в водной фазе и их распределение определяется законами теплового движения. В связи с этим возможна любая ориентация активных центров ферментов по отношению к субстратам, а структурная организация ферментных систем ограничена или невозможна (Еремина, Строкова, 2009). Растворенные в водной фазе ферменты атакуют поглощенные организмом субстраты, разрушая, в частности, крупные молекулы и надмолекулярные агрегаты, и обеспечивают главным образом начальные этапы пищеварения. Внеклеточное пищеварение обнаружено у всех организмов, включая бактерий. В тонкой кишке высших организмов полостное пищеварение сочетается с мембранным и иногда внутриклеточным (Уголев, 1991).

Под внутриклеточным пищеварением понимаются все случаи, когда нерасщепленный или частично расщепленный субстрат проникает внутрь клетки, где подвергается гидролизу не выделяемыми за ее пределы ферментами. Внутриклеточное пищеварение может быть разделено на 2 подтипа - молекулярный и везикулярный. Молекулярное внутриклеточное пищеварение характеризуется тем, что ферменты, находящиеся в цитоплазме, гидролизуют проникающие в клетку небольшие молекулы субстрата, главным образом димеры и олигомеры, причем проникают такие молекулы пассивно или активно. Например, с помощью специальных транспортных систем, активно, переносятся через клеточную мембрану дисахариды и дипептиды у бактерий. Если внутриклеточное пищеварение происходит в специальных вакуолях, или везикулах, которые образуются в результате эндоцитоза (пиноцитоза или фагоцитоза), то оно определяется как везикулярное, или

эндоцитозное. При везикулярном внутриклеточном пищеварении эндоцитозного типа происходит впячивание определенного участка мембраны вместе с поглощаемым веществом. Далее этот участок постепенно отделяется от мембраны, и образуется внутриклеточная везикулярная структура (Абдурахманов и др., 2003). Как правило, такая везикула сливается с лизосомой, содержащей широкий спектр гидролитических ферментов, действующих на все основные компоненты пищи. В образовавшейся новой структуре - фагосоме и происходят гидролиз поступивших субстратов и последующее всасывание образующихся продуктов. Непереваренные остатки фагосомы обычно выбрасываются за пределы клетки путем экзоцитоза. Таким образом, внутриклеточное пищеварение - это механизм, за счет которого реализуется не только переваривание, но и поглощение клеткой пищевых веществ, в том числе крупных молекул и надмолекулярных структур. Внутриклеточное пищеварение лимитировано проницаемостью мембраны и процессами эндоцитоза (Абдурахманов и др., 2003). Последние характеризуются низкой скоростью и, по-видимому, не могут играть существенной роли в обеспечении нутритивных потребностей высших организмов. С точки же зрения энзимологии внутриклеточное пищеварение везикулярного типа представляет собой сочетание микрополостного и мембранного пищеварения (Уголев, 1967). Везикулярное внутриклеточное пищеварение выявлено у всех типов животных, а молекулярное - у всех групп организмов.

Мембранное пищеварение происходит на границе внеклеточной и внутриклеточной сред и обладает некоторыми особенностями как внеклеточного, так и внутриклеточного пищеварения. Этот тип пищеварения также обнаружен у всех организмов. У человека и высших животных мембранное пищеварение реализуется преимущественно в тонкой кишке ферментами, связанными со структурами мембраны кишечных клеток. К этим ферментам относятся:

• ферменты, секретируемые клетками поджелудочной железы и адсорбированные на поверхности кишечных клеток, главным образом в гликокаликсе;

• собственно кишечные ферменты, которые синтезируются в самих кишечных клетках и затем встраиваются в их апикальную мембрану (Уголев, 1991).

Активные центры ферментов, осуществляющих мембранное пищеварение, обращены в полость тонкой кишки, т.е. ориентированы определенным образом по отношению к мембране и водной фазе. Этим мембранное пищеварение существенно отличается от полостного и внутриклеточного типов переваривания. Мембранное пищеварение малоэффективно по отношению к крупным молекулам и тем более надмолекулярным агрегатам. Панкреатические ферменты, адсорбированные на структурах кишечной слизистой оболочки, реализуют преимущественно промежуточные стадии гидролиза пищевых веществ (углеводов, белков, жиров, витаминов), мембранные - преимущественно заключительные стадии их расщепления. Мембранное пищеварение также интегрировано с процессами полостного переваривания и всасывания. Более того, собственно кишечные ферменты и транспортные системы мембраны могут образовывать ферментно-транспортные комплексы, благодаря которым продукты гидролиза получают преимущество при всасывании (Абдурахманов и др., 2003). Для высших организмов, в том числе рыб, наиболее характерна комбинация полостного и мембранного пищеварения, между которыми существует сложная функциональная зависимость, так как конечные продукты первого служат субстратом для второго. Крупные молекулы субстратов остаются в полости тонкой кишки и там гидролизуются главным образом ферментами, секретируемыми клетками поджелудочной железы. Относительная роль полостного пищеварения тем больше, чем крупнее молекулы пищевых веществ, а относительная роль мембранного гидролиза увеличивается по мере уменьшения размеров молекул. При определенных условиях мембранное

пищеварение становится доминирующим механизмом. Внутриклеточное молекулярное пищеварение у высших животных служит, по-видимому, дополнительным механизмом гидролиза ди- и трипептидов (Gardner, 1984, 1988).

Все три рассмотренных типа пищеварения существуют на всех уровнях эволюционной лестницы - от бактерий до млекопитающих и все многообразие пищеварительных механизмов обусловлено сочетанием трех основных типов пищеварения.

Однако в большинстве случаев усвоение пищевых веществ требует участия симбионтов - бактерий и простейших, поэтому особое место среди других механизмов переваривания пищи занимает симбионтное пищеварение, т.е. пищеварение за счет микроо�