Молекулярно-филогенетическое исследование камбалообразных рыб (Pisces, Pleuronectiformes) дальневосточных морей России по нуклеотидным последовательностям генов цитохрома B и цитохромоксидазы 1

Шарина, Светлана Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-филогенетическое исследование камбалообразных рыб (Pisces, Pleuronectiformes) дальневосточных морей России по нуклеотидным последовательностям генов цитохрома B и цитохромоксидазы 1
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-филогенетическое исследование камбалообразных рыб (Pisces, Pleuronectiformes) дальневосточных морей России по нуклеотидным последовательностям генов цитохрома B и цитохромоксидазы 1"

004613803

На правах рукописи

Шарнна Светлана Николаевна

МОЛЕКУЛЯРНО-ФИЛОГЕНЁТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КАМБАЛООБРАЗНЫХ РЫБ (PISCES, PLEURONECTIFORMES) ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫХ МОРЕЙ РОССИИ ПО НУКЛЕОТИДНЫМ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯМ ГЕНОВ ЦИТОХРОМА В И ЦИТОХРОМОКСИДАЗЫ 1

03.02.07 - генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 3 ПЕН О

004618803

На правах рукописи

Шарнна Светлана Николаевна

МОЛЕКУЛЯРНО-ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КАМБАЛООБРАЗНЫХ РЫБ (PISCES, PLEURONECTIFORMES) ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫХ МОРЕЙ РОССИИ ПО НУКЛЕОТИДНЫМ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯМ ГЕНОВ ЦИТОХРОМА В И ЦИТОХРОМОКСИДАЗЫ 1

03.02.07 - генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в Лаборатории генетики Учреждения Российской академии наук Институте биологии моря им. A.B. Жирмунского ДВО РАН (ИБМ ДВО РАН)

Научный руководитель:

доктор биологических наук

Картавцев Юрий Федорович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

Евгений Станиславович Балакирев

кандидат биологических наук, с.н.с.

Сергей Владимирович Шедько

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н И. Вавилова РАН.

Защита состоится 27 декабря 2010 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д.005.008.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии моря им. A.B. Жирмунского ДВО РАН по адресу: 690041, г. Владивосток, ул. Пальчевского, 17. Телефон: (4232) 310-905, факс (4232) 310-900, e-mail: inmarbio@mail.primoiye.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биологии моря им. A.B. Жирмунского ДВО РАН (690041, г. Владивосток, ул. Пальчевского, 17).

Отзывы просим присылать на e-mail: mvaschenko@mail.ru. Автореферат разослан —^ноября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

М.А. Ващенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Систематика камбал изучена слабо и классификация представителей в пределах отряда камбалообразные, в основном, базировалась на морфо-анатомических признаках. Имеется лишь несколько работ, выполненных с использованием молекулярных маркеров (Pardo et al., 2005).

В представляемой работе основной акцент сделан на исследовании семейства (сем.) камбаловые (Pleuronectidae) как наиболее распространенного в водах Дальнего Востока России и Тихого океана в целом. Таксономические отношения в сем. Pleuronectidae до сих пор остаются предметом многочисленных исследований. Вследствие использования различных методик, в настоящее время известно несколько вариантов классификации камбаловых рыб, предложенных разными авторами (Norman, 1934; Sakamoto, 1984; Линдберг, Федоров, 1993; Cooper, Chapleau, 1998). Родовая принадлежность разных видов семейства часто пересматривается, порой без достаточных для этого оснований, число родов в подсемействе Pleuronectinae меняется, что вызывает определенную критику (Расе, 1996). Одной из конкретных проблем является большая синонимия и, соответственно, необходимость прояснения таксономического статуса ряда представителей рассматриваемого семейства. Это касается, например, валидности нескольких представителей рода палтусовидных камбал Hippoglossoides, таких как H. dubius, H. robustus, H. ellassodon (Фадеев, 1978; Коваль, Богданов, 1982; Винников, 2003; Винников и др., 2006).

Филогенетические взаимоотношения родов и видов внутри сем. камбаловые изучены слабо. Палеонтологические находки весьма редки (Pardo et al., 2005) и не дают ясного представления о последовательности происхождения видов в группе.

В последние десятилетия для анализа системы таксономических отношений (систематики) и филогении рыб и других животных чаще всего используется сравнительный анализ митохондриального генома и входящих в него генов митохондриальной ДНК (мтДНК).

В данной работе для филогенетических исследований были выбраны два гена мтДНК - это ген субъединицы 1 цитохромоксидазы с (цитохромоксидаза 1, Со-1) и ген цитохрома b (Cyt-b). В последние десятилетия эти гены наиболее популярны в молекулярной филогенетике и обычно используются для анализа на уровне вид-семейство (Johns, Avise, 2004; Hebert et al., 2004; Картавцев, Ли, 2006; Kartavtsev, 2009а; b).

Цель и задачи исследования. Цель данной работы - исследование генетической изменчивости, филогенетических отношений и дивергенции камбалообразных рыб дальневосточных морей России на основе анализа нуклеотидных последовательностей генов Со-1 и Cyt-b.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) определить первичные нуклеотидные последовательности (далее -последовательности) и нуклеотидный состав генов Со-1 и Cyt-b исследуемых представителей камбалообразных рыб;

2) выяснить, как соотносятся уровни внутри- и межвидовой дивергенции у исследуемых представителей различных таксонов камбалообразных рыб;

3) провести реконструкцию филогенетических взаимоотношений исследуемых видов камбалообразных рыб с использованием в качестве молекулярных маркеров генов Со-1 и Cyt-b;

4) провести сравнительный анализ филогении сем. камбаловые и других семейств, полученных с использованием различных митохондриальных маркеров и морфологических данных;

5) подтвердить или опровергнуть монофилетичность сем. Pleuronectidae и его подсемейств;

6) уточнить таксономический статус видов рода Hippoglossoides - Н. robustus, Н. elassodon и Н. dubius.

Научная новизна работы. Впервые с помощью молекулярно-филогенетических методов установлены эволюционные взаимосвязи между видами внутри сем. Pleuronectidae. Уточнены уровни внутри- и межвидовой дивергенции исследуемых видов. Выдвинута гипотеза о преобладающем способе видообразования камбалообразных рыб.

Установлен монофилетичный статус сем. Pleuronectidae и представленных в исследовании подсемейств (Pleuronectinae, Hippoglossoidinae и Hippoglosinae). Сделано оригинальное предложение исключить трибу Microstomini из подсемейства Pleuronectinae.

Показана полифилетичность рода Limanda. Впервые сделано предложение рассматривать виды Limanda sakchalinensis и L. limanda как самостоятельные таксоны родового ранга в составе подсемейства Hippoglossoidinae.

Уточнена филогения рода Hippoglossoides. Рекомендована синонимизация выделенных ранее таксонов Hippoglossoides robitstus и Н. elassodon со сведением их, согласно приоритету, к виду Hippoglossoides elassodon Jordan, Gilbert, 1880.

Теоретическая и практическая значимость работы. Представленные генетические маркеры Со-1 и Cyt-b могут быть применены для идентификации видов камбалообразных рыб в таксономических, эволюционных и рыбохозяйственных целях, а также использованы в Международном проекте по штрихкодированию рыб на основе ДНК, Fish-BOL (http://www.fishbol.org/).

Работа послужит основой для дальнейших исследований в области систематики и филогении сем. Pleuronectidae и в целом отряда Pleuronectiformes.

За время работы были определены и депонированы в международную базу данных -Генный банк (GenBank, NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 132 нуклеотидные последовательности представителей сем. Pleuronectidae для двух генов мтДНК Со-1 и Cyt-b.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на российских и международных конференциях: «Modern Achievements in population, Evolutionary and

Ecological Genetics: International Symposium» (Владивосток - МБС «Восток», 2007), «Штрих-кодирование видов рыб России на основе ДНК. Интеграция в глобальную программу Fish-BOL». Рабочее совещание (Владивосток, 2007), «Second International Barcode of Life Conference» (Тайпей, Тайвань, 2007), «DNA Barcoding and Molecular Phylogenetics: The International Workshop» (Владивосток, 2007), «Школа-конференция молодых ученых «Секвенирование полных геномов»» (Иркутск, 2009), «Modern Achievements in Population, Evolutionary, and Ecological Genetics: International Symposium» (Владивосток - МБС «Восток», 2009), «The 2nd International workshop on DNA barcoding of Northeast Asian Fishes: Population, Species, and Phytogeny» (Сеул, Корея, 2010), на ежегодных конференциях Учреждения Российской академии наук Институте биологии моря им. A.B. Жирмунского ДВО РАН (Владивосток, 2008,2009).

Личный вклад автора. Автором были собраны образцы камбалообразных рыб из залива Восток (Японское море), выделена ДНК, проведены ПЦР реакции и реакции циклосеквенирования, разработаны специфические праймеры для гена Со-1 камбалообразных рыб, проведен анализ нуклеотидных последовательностей. Статистический анализ данных проводился с помощью научного руководителя.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 работ, из них 6 статей в рецензируемых международных и российских журналах; 4 входят в текущий список ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 161 странице, иллюстрирована 13 рисунками, содержит 5 таблиц и приложение с 5 таблицами. Список литературы содержит 149 наименований.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов ДВО РАН (07-ШБ-06-035, 07-Ш-Г-06-042, 08-Ш-Б-06-031, 09-П23-07, 09-1-23-07, 10-Ш-В-06-131) и РФФИ (07-04-00186, 08-04-91200).

Благодарности. Автор считает своим приятным долгом выразить глубокую признательность своему руководителю Картавцеву Юрию Федоровичу за внимательное и конструктивное руководство.

Автор выражает благодарность группе ученых за помощь в сборе и идентификации материала для настоящей работы: сотрудникам ИБМ ДВО РАН Ю.Ф. Картавцеву, A.C. Соколовскому, В.В. Земнухову, К.А. Винникову (ДВГУ) за сбор материала в б. Киевка (Японское море), И.И. Глебову (ТИНРО-центр) за сбор материала в Беринговом море; A.A. Баланову (ИБМ ДВО РАН) за помощь в определении рыб и подготовке их к хранению в коллекции музея ИБМ ДВО РАН в качестве ваучерных образцов.

Автор считает необходимым поблагодарить коллектив лаборатории генетики ИБМ ДВО РАН за создание рабочей атмосферы и моральную поддержку.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В главе приведен обзор по биологии, таксономии и филогении отряда камбалообразные (Pleuronectiformes) с акцентированием внимания на сем. камбаловые (Pleuronectidae). Рассмотрены методы исследования генетической изменчивости. Уделено внимание рассмотрению моделей нуклеотидных замен первичных последовательностей.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. Материалом для молекулярно-филогенетического анализа послужили 66 представителей 17 видов сем. Pleuronectidae. Отлов рыб проводили в трех морях Дальнего Востока РФ. Японское море: Liopsetta pinnifasciala (5 экз.) и Hippoglossoides dubius (1 экз.) - бухта Киевка; Pseudopleuronectes obscurus (4 экз.), Pseudopleuronectes herzensteini (5 экз.), Platichthys stellatus (5 экз.), Limanda punctatissima (5 экз.), Cleisthenes herzensteini (3 экз.) - зал. Восток; Pseudopleuronectes yokohamae (5 экз.) - прол. Старка. Берингово море: Lepidopsetta polyxystra (4 экз.), Gliptocephalus zachirus (4 экз.), Limanda sakchalinensis (5 экз.), Hippoglossoides elassodon (2 экз.), Hippoglossoides robustus (6 экз.), Reinhardlius hippoglossoides (5 экз.), Pleuronectes quadriluberculatus (4 экз.), Aiherestes stomias (1 экз.). Охотское море (о. Парамушир): Hippoglossus stenolepis (2 экз.).

Выделение и амплификация ДНК. Геномную ДНК выделяли из кусочков белой мышечной ткани, фиксированной в 96% этиловом спирте, по стандартной методике (Маниатис и др., 1984; Sambrook et al., 1989; Гафуров, 1999) с небольшими модификациями, состоящими в удалении фенола из протокола и добавлении рибонуклеазы. Амплификацию участков мтДНК проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) согласно протоколу с использованием праймеров, представленных в работах Ward et al., 2005; Takashima et al., 2006; Kartavtsev et al., 2007, разработанных доктором К. Saitoch (Япония) и собственно автором.

Определение нуклеотидной последовательности. Секвенирование генов Со-1 и Cyt-b мтДНК проводили с использованием ген-специфических праймеров и набора реактивов «Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit» V. 3.1 (Applied Biosystems, США) no методике производителя. Определение нуклеотидной последовательности ДНК осуществляли на автоматическом секвенаторе ABI-3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, ABI, США) методом флюоресцентно меченых терминаторов - 2'-, З'-дидезоксинуклеозидтрифосфатов Big Dye™ (ABI, США) на базе ИБМ ДВО РАН.

Первичный анализ нуклеотидных последовательностей. Консенсусные последовательности получали, используя редактор последовательностей ChromasPro (http://www.technelysium.com.au/chromas.html).

Для сравнительного филогенетического анализа были использованы нуклеотидные последовательности, извлеченные из генного банка.

Для филогенетического анализа, с учетом данных генного банка проанализировали: 83 последовательности полного гена Со-1 для 26 видов камбалообразных рыб и 2 видов трескообразных, которые были взяты в качестве внешней группы. Кроме того, были проанализированы 177 последовательностей полного гена Cyl-b для 57 видов камбалообразных рыб и 2 видов трескообразных. Для объединенных данных по генам Со-1 и Cyt-b использовали 75 последовательностей принадлежащих к 21 виду сем. Pleuronectidae и одну последовательность для сем. Soleidae, в качестве внешней группы.

Длина последовательностей после выравнивания и приведения к одной длине составила 1154 пар нуклеотидов (пн) и 887 пн для генов Со-1 и Cyt-b соответственно.

Филогенетический анализ. На основе выровненного набора последовательностей строили филогенетические деревья. Определенную модель нуклеотидных замен, использованную для расчета расстояний и построения деревьев, подбирали с помощью программы Modeltest 3.7 (Posada, 1998). Все деревья строили, используя четыре подхода: максимальной парсимонии (MP), ближайшего соседства (NJ), Байесовский (ВА) и максимального правдоподобия (ML).

Для описанного набора последовательностей (по гену Со-1, Cyt-b и объединенных последовательностей этих генов), как лучшая, была выбрана модель TrN+I+G (Tamura, Nei, 1993), с различными значениями параметра гамма-распределения (G): для гена Со-1 G = 0,4792, для гена Cyt-b G = 0,6326, для объединенного набора последовательностей G = 0,4272. Устойчивость полученных филогенетических деревьев оценивали методом бутстрепа (Zharkikh, Li, 1992а, b, 1995; Hasegawa, Kishino, 1994), используя для NJ- и ML-деревьев 1000 бутстреп-реплик; ВА-дерево создавали с 106 модельных генераций, для построения МР-дерева поиск стартовых деревьев проводили по принципу обмена ближайшими соседями, CNI (close-neighbor-interchange), и уровнем поиска 1, использовали опцию случайного добавления стартовых деревьев (10 реплик) при CNI-поиске.

Генные деревья Со-1 и Cyt-b строили, используя либо все нуклеотиды, либо только 1-ю и 2-ю позиции в кодонах для объединенных данных.

Деревья строили с помощью ПП MrBayes и PAUP, визуализировали и при необходимости редактировали, используя программу TreeView (Page, 1996,). Общий статистический анализ был выполнен с использованием программы STATISTICA 6.0 (StatSoft, 2001).

Глава 3. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ФИЛОГЕНЕТИКА КАМБАЛООБРАЗНЫХ РЫБ НА ОСНОВЕ ГЕНА СУБЪЕДИНИЦЫ 1 ЦИТОХРОМОКСНДАЗЫ С

При анализе нуклеотидного состава гена Со-1 соотношение пиримидинов (Т, С) к пуринам (A, G) отклонялось от пропорции 50%:50% (Kartavtsev et al., 2008) и составило: (1) 57,7%:42,3% для трех позиций в кодоне, (2) 60,2%:39,8% для первой позиции в кодоне, (3) 55,3%:44,7% для второй позиции, (4) 59,9%:40,1% для третьей нуклеотидной позиции в кодоне (данные учитывались для всех камбалообразных, использованных в анализе). Такое смещение от равновесной пропорции отмечается для многих живых систем (Лукашов, 2009).

Считается, что преобладание пиримидинов является отражением гидрофобных свойств белок-кодирующих генов (Nailor et al., 1996; Inoue et al., 2001).

Для сравнения дивергенции в иерархии таксономических (филетических) групп вычисляли попарные ^-расстояния, что позволило составить примерное представление о нуклеотидном разнообразии на четырех различных уровнях иерархии. Значения средних р-расстояний составили: (1) на внутривидовом 1,13±0,16%, (2) на внутриродовом 7,93±0,30%, (3) на внутрисемейственном 11,62±0,08% и (4) на внутриотрядном 19,03±0,13% (средняя арифметическая±стандартная ошибка, SE) (рис. 1). Оценивая различия между внутривидовым и межвидовым уровнями, данные о ^-расстояниях можно привлечь для выяснения реализованной модели видообразования. В частности, они позволяют сделать вывод, что среди представителей отряда камбалообразные преобладает географическая модель видообразования с накоплением случайных генетических изменений в течение длительного периода времени формирования подвидов, а затем видов и дальнейшей независимой эволюцией линий (Dobzhansky, 1955; Ayala et al., 1974; Bush, 1975; Templeton, 1981; Mayr, 1982; King, 1993; Harrison, 1998). Конечно, учитывая сложность концепции вида, вывод о преобладании той или иной модели, основанный только на генетических расстояниях, не может быть окончательным. Необходим учет и других характеристик изменчивости таксонов (Картавцев, 2005; Картавцев, Ли, 2006).

0,22 г 0.18}

S 0,14

н 0,10

га 0,06

О.

-0,02

12 3 4

группа сравнения

1С i1.85'SE О ilOO'SE о Средняя

Рис. I. График, иллюстрирующий результаты однофакторного дисперсионного анализа и изменчивость средних р-расстояний на четырех уровнях дифференциации (группах сравнения) камбалообразных (Р1еигопесйГогте$) для последовательностей гена Со-1. Группы сравнения (ось X): (1) внутривидовая, для особей одного вида, (2) внутриродовая, для особей одного рода, (3) внутрисемейственная, для особей, принадлежащих к одному семейству и (4) внутриотрядная, для особей, принадлежащих к одному отряду. Средние арифметические для /^-расстояний (ось У) даны в долях.

Рассмотрим подробнее результаты филогенетических реконструкций (рис. 2).

Наиболее рельефную ветвь представляет внешняя группа, что вполне естественно в связи с достаточной генетической удаленностью трескообразных от камбалообразных.

Наиболее крупную ветвь на представленном дереве (рис. 2) формирует сем. Pleuronectidae, которое в соответствии с целями исследования рассмотрено более подробно.

Монофилетичность этого семейства была предложена ранее (на основании результатов, полученных для 12S и 16S рРНК) для этого и ряда других семейств (Новиков, 2002; Pardo et al., 2005; Kartavtsev et al., 2007; Kartavtsev et al„ 2008). Данные о монофилетичности сем. Pleuronectidae хорошо поддерживаются также неполными последовательностями Со-1 (Kartavtsev et al., 2008), последовательностями гена Cyt-b (Kartavtsev et al., 2007) и морфологией (Cooper, Chapleau, 1998; Ratnasingham, Hebert, 2007).

Все роды на представленном дереве формируют обособленные кластеры, исключение составляют роды Pseudopleuronectes и Limanda, которые формируют полифилетичные кластеры.

Однако, учитывая тот факт, что полифилетические группы систематиками не признаются, в случае, если данные исследования надежно подтверждают полифилию группы, ее классификацию следует пересмотреть (Абрамсон, 2007). Таким образом, необходимо уточнить систематическое положение этих двух родов.

Род Pseudopleuronectes. Вид P. yokohamae формирует полифилетичный кластер с видами Р. obscuras и P. herzensteini. Таксономический статус этих видов и их принадлежность к роду Pseudopleuronectes активно обсуждается в литературе: одни авторы считают, что вид P. obscurus принадлежит роду Pleuronectes, как, например, Сакамото (Sakamoto, 1984) на основании сравнительно-анатомического исследования скелетных признаков. Другие авторы относят этот вид к роду Liopsetta, как, например, Норман (Norman, 1934), использовавший наружные морфологические признаки, которыми виды характеризуются в определителях и монографиях (Norman, 1934; Линдберг, Федоров, 1993; Расе, 1996). Однако последняя систематическая ревизия Купера и Чаплау (Cooper, Chapleau, 1998), основанная на остеологических данных, показала, что оба эти вида принадлежат роду Pseudopleuronectes, что согласуется с исследованиями, основанными на данных анализа сейсмосенсорной системы (Воронина, Евсеенко, 2001; Винников, 2007) и на сравнении электрофоретических спектров белков (Коваль, Богданов, 1982), которые показали, что все три представленных вида (P. yokohamae, P. obscurus, P. herzensteini) принадлежат к роду Pseudopleuronectes. Очевидно, требуется дальнейшее исследование этого рода с использованием других молекулярных маркеров.

Род Limanda. В сравнительном анатомическом исследовании Купера и Чаплау (Cooper, Chapleau, 1998) монофилия этого рода не была подтверждена.

Валидность всех остальных представленных родов сем. Pleuronectidae полностью поддерживается нашими данными.

г— рЯп/цсШ* 1

I I— Иоршь рШп1ГЛк»Ш 1147

I-

1К

—РтивармиппкамуаЬоЛмш» 1ЭЬ0?

—РтхК>р#*ппвсы» у&оЬлт*» 121-07

— РжиУхЛтптсЫ* уЫвГмтм 13&МТ

— ^миДОютмсм* /Ыа/шш 1&47 -К**тЫаАпк*НС003176

а 174 »273

РЬюпянам «<мми(*<еимя 271 РШ*огж**1д1т<ШМ№итя7ТЗ —иптирипеШЬилщЬЮ (¿чм* рипаввтт 9М7 ШъгхЬ рипсШЫйл* М07

ГщГ™"1

к::

рипсШм^па 17-07

I-И»

__) '— ирНорМ» ро^гугЯ* 220

»чоороощю I-1ц**р*а*

' ....... ЩНсрмНлра/рулЬв ИГ

— РмискфЬилумсИн ЬаоалвМЫ 02РЧ*и1

ЦДИЭГСМ —Ри^о(Мигоп«сМ| Ьагигмшш тк —Яиимйив'мсмьмтш^вк —РмиДОметмм лвдавЛп!06-07

г—* 1Ч»(*Я>р1»и»ог>«и* «Мвиг«п 42-07 г- | - Р»*1*)вр1кгоп»с1«* оЬиигя» «Ю7

I-Р»

•шлсшу* ччши* 11-ет

РкЛкШу» МЫм 15-07 ■РШМ>Шу*ЫЧ>Мя1347

•яллмлмлм-ог

■лжллк» «•**<• 1М7 Иггълдл «йсЫЬхпм и ЦтлпО* м*сМ»*л»| 78

итшнМ 72

О» $«кФШпвпЦ» 7$

г"

еря I_ц,

'---—■-"Ц

ОЛО*»« ЬвпаиШ* 7*47 С3*№«м« Авмпмем! Зв

Н^швкшви»* сЫЫм <К ^¿««св'виавм «лкл» т

- Мргх&мжжЬ* пым г»

—ОДшдЬавМм «АдовМ» «Мм 1»

- I «тоорь***»« пЬиОи* гм ^^Мюроркжюйм к&ммгм

Мшчмг»1вмл НС 00Ш1 ■НрродЬям чвпЫври ВфкЛрлЯ. 1 Ь»рсрым» и»по/щ* $*Щк.р»МЗ Н&хфолял шлоМ* НС 009710 Шрро&ши* ШмМ| ШГ4 9129 Мррорши* сук»*« МС 009709 Д^рорЬии ЛМГ40125

/ЫМягМя Щегх&яжАМв Ж ЯтЫш&и» А&еДОКиЬЬ* АШЛ»Ш

ЯнЫнеМи» 159

ЬдоеЬмоМм 266 fЫЫ>^пЯU^h^|з()ooЬx*>*)^tЗ¿>в

•ЛхЫмМв едрюсфМ* моими*

&Я>кхлрь*кя жЛпа 46 (ЯурЬхФрГяШл мсЛпя Оур*к«рМО* мсмгы* «3

р*ш#>**мбтялм2ж* Paгa^¡chthyidae

Р1еигопесЙс1ае

Рис. 2. Укорененное консенсусное (50%) МР-дерево, показывающее филогенетические взаимосвязи на основе последовательностей гена Со-1. В узлах показана бутстреп-поддержка для МР, Ш (п=1000 реплик), ВА (10б генераций) и МЬ (п=500 реплик) методов реконструкции деревьев (МР/Ш/ВА/МЬ). Деревья укореняли по двум внешним таксонам: трескообразные ((ЗасКГогтез).

-рт*т»**»ыетн* $сорди1а!ггис!ае -&шш»0*«*лвгго7во $о1ё1аае

- Оподкюи* ВиУМХ) I

Я тооКвпнм МС 0097231

'(СМдгоир

Представители рода Hippoglossoides формируют смешанный кластер. Р-расстояние между этими видами составило 1,06±0,11%, расстояние между видами Н. robushis и Я. elassodon равно 1,05±0,13%, расстояние между последовательностями в пределах Я robustus - 0,83±0,10%, а расстояние между последовательностями в пределах Я. elassodon - 1,5±0,3%. Эти данные могут свидетельствовать о том, что виды этого рода слабо различаются генетически.

Синонимия видов Я. elassodon и Н. robustus уже предлагалась ранее на основании морфологических и молекулярно-филогенетических данных (Ivankov et al., 2002; Kartavtsev et al., 2002; Vinnikov, 2003; Винников, 2006; Kartavtsev et al., 2007). При сравнении вида Я. dubius с Я. elassodon по результатам электрофоретических различий по белковым и ферментным системам сыворотки крови и мышц было сделано заключение, что, вероятно, они являются подвидами одного вида (Коваль, Богданов, 1982). Все эти результаты подтверждаются и нашими данными, в том числе и при сравнении средних р-расстояний для этих видов. Учитывая полученную информацию, а также литературные данные по морфологии и экологии рассматриваемых в работе таксонов камбал, правомочно группу Я. elassodon + Я. robustus принимать как один полиморфный вид Я. elassodon (Jordan, Gilbert, 1880). Второй таксон - Я. robustus, как более поздний, следует считать синонимом вида Я. elassodon (Jordan, Gilbert, 1880). Данные об отнесении в эту группу Я. dubius следует принять с осторожностью.

Остальные виды на представленном дереве формируют набор близких кластеров, обособляющий отдельных особей, которые классифицируются как образцы одного вида. Такое отнесение индивидуальных последовательностей к "своим" видам служит дополнительным подтверждением возможности идентификации видов камбал по гену Со-1 (barcoding) (Kartavtsev et al., 2008). Эти данные хорошо согласуются с описанной выше низкой внутривидовой и высокой межвидовой дивергенцией, обнаруженной по р-расстояниям.

Глава 4. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ФШЮГЕНЕТИКА КАМБАЛООБРАЗНЫХ РЫБ НА ОСНОВЕ ГЕНА ЦИТОХРОМА В

Ген Cyt-b широко используется в качестве филогенетического инструмента (Банникова, 2004) для оценки филогении рыб не только на внутри- и межродовом уровне, но и на уровне семейств и даже более крупных таксономических подразделений (Lydeard, Roe, 1997; Шедько, 2002).

Проведенный анализ нуклеотидного состава выявил отклонение как в соотношении пропорций отдельных нуклеотидов, так и в соотношении пуринов и пиримидинов (T+C):(A+G). Пропорции (T+C):(A+G) составили: (1) 57,6%:42,4% для трех позиций в кодоне, (2) 60,5%:39,5% для первой позиции в кодоне, (3) 55,3%:44,7% для второй позиции,

(4) 59,9%:40,1% для третьей нуклеотидной позиции в кодоне (средняя рассчитывалась для всех камбалообразных, использованных в анализе). Такое отклонение от равновесной пропорции уже было ранее описано в литературе для многих белок-кодирующих генов (Kim et al., 2004; Kartavtsev et al., 2007). Статистический анализ нуклеотидной последовательности гена Cyt-b показывает значимые отклонения состава и таксономические отличия. Считается, как уже было отмечено для Со-1, что такие смещенные пропорции нуклеотидных оснований отражают гидрофобные свойства полипептидов, кодируемых белковыми генами (Nailor et al., 1996). Однако обнаруженные таксономические отличия (выявленная гетерогенность пропорций нуклеотидов), очевидно, существенны и для эволюции таксонов и отражают их обособленную дивергенцию (Kartavtsev et al., 2007; 2008; 2009а; b).

Оценка ^-расстояний для различных этапов эволюционной истории показывает увеличение нуклеотидного разнообразия на (1) внутривидовом - 2,22±0,31%, (2) внутриродовом - 9,93±0,26%, (3) внутрисемейственном - 13,81±0,05%, и (4) внутриотрядном - 23,96±0,30% уровнях (рис. 3). Учитывая существенную разницу оценок генетических расстояний между внутривидовым и межвидовым уровнями, можно объяснить эти данные реализацией в эволюции определенной модели видообразования. В частности, данные по р-расстояниям позволяют сделать вывод, что среди представителей отряда камбалообразные преобладает географическая модель видообразования (Dobzhansky, 1955; Ayala et al., 1974; Bush, 1975; Templeton, 1981; Mayr, 1982; King, 1993; Harrison, 1998).

0,28 г

0,22

ZC i1.96'SE: □ it.OO'SÉ о Средняя.

0,16

8 и

Ç- 0.10

0,04 .................

-0,02

2 3 4

группа сравнения

Рис 3. График результатов однофакторного дисперсионного анализа (АИОУЛ), показывающий различие средних р-расстояний на четырех уровнях дифференциации камбалообразных (Р1еигопесМогте8) для последовательностей гена Су1-Ь. Группы сравнения (ось X): (1) внутривидовая, для особей одного вида, (2) внутриродовая, для особей одного рода, (3) внутрисемейственная, для особей, принадлежащих к одному семейству и (4) внутриотрядная, для особей, принадлежащих к одному отряду. Средние р-расстояния (ось У) даны в долях.

Основной пункт предпринимаемого в настоящей работе молекулярно-филогенетического исследования камбалообразных рыб - это монофилия семейств. В настоящее время основная информация о филогении семейств зоологическая (Cooper, Chaplau, 1998; Norman, 2006; Froese, Pauly, 2010). Однако есть исследования на этом уровне и по молекулярно-филогенетичским данным (Berendzen, Dimmick, 2002; Pardo et al., 2005).

Монофилия представленных в данном исследовании семейств (рис. 4) была поддержана, как уже отмечалось, результатами по различным молекулярным маркерам, в частности, по 12S и 16S рРНК (Berendzen, Dimmick, 2002; Azevedo et al., 2008) и по 16S рРНК (Pardo et al., 2005) среди которых Soleidae, Scophtalmidae и Pleuronecidae. Исключение составляет Paralichthydae, подразделенное на две группы, одна из которых с высокой вероятностью связана с Pleuronectidae (Pardo et al., 2005).

Согласно проведенной ревизии (Cooper, Chapleau, 1998), как отмечалось при обсуждении данных по Со-1, признается, что сем. Pleuronectidae - монофилетичная группа определенная десятью синапоморфиями. Данные секвенирования Cyt-b и реконструкция молекулярно-филогенетических деревьев четырьмя методами (MP, NJ, ВА, ML) (рис. 4), подтверждают монофилию семейства, а также согласуются с предшествующими молекулярными исследованиями о его филогенетическом единстве (Berendzen, Dimmick, 2002; Pardo et al., 2005; Kartavtsev et al., 2007, 2008; Шарина, Картавцев, 2010).

Как показано на рис. 5, последовательности Hippogbssoides robustas и Н. elassodon объединены в парафилетичный кластер, что в согласии данными по Со-1 позволяет считать синонимами эти два таксона и именовать вид по приоритету описания как Hippoglossoides elassodon (Jordan, Gilbert, 1880). Таким образом, синонимия этих таксонов согласуется как с морфологическими (Винников, 2003) к генетико-биохимическими (Коваль, Богданов, 1982), так и с молекулярно-филогенетическими данными как минимум по фрагментам двух генов (Kartavtsev et al., 2007, 2008) и по полным последовательностям Cyt-b. Последнее подтверждается филогенетическим анализом полных последовательностей Со-1, представленным ранее (глава 3). Средние внутривидовые /^-расстояния для таксонов Hippoglossus составили 0,84±0,105% и не изменялись между последовательностями этих видов. Кластеризация родов и видов на представленном генном дереве Cyt-b согласуется с морфо-анатомическим исследованием Купера и Чаплау (Cooper, Chapleau, 1998).

Виды рода Pseudopleuronectes (P. yokohamae, P. obscurus и P. herzensteini) формируют монофилетичную ветвь, показывая принадлежность этих видов к одному роду. Это согласуется, как отмечалось, с морфо-анатомическими реконструкциями (Cooper, Chapleau, 1998), исследованиями сейсмосенсорной системы (Воронина, Евсеенко, 2001; Винников, 2007), сравнением электрофоретических спектров белков (Коваль, Богданов, 1982), а также с результатами сравнительного изучения морфологии икринок, эмбрионального и

постэмбрионального развития личинок и предличинок дальневосточных камбал (Перцева-Остроумова, 1961).

Род Limando. Виды этого рода формируют полифилетичные кластеры. Вид L. pimctatissima формирует кластер с видами родов Platichthys и Pleuronectes. Виды L. sakchalmensis и L. limanda кластеризуются вместе и присоединяются к кластеру Hippoglossoides. То же обнаружено и в представленном ранее исследовании по Со-1 (рис. 2). Монофилия и взаимоотношения Limanda оказались не разрешенными и в анализе Купера и Чаплау (Cooper, Chapleau, 1998) по причине гомоплазии морфологических признаков, наблюдаемой в шести видах рода Limanda. Виды Limanda limanda и L. sakchalinensis в исследовании этих авторов образуют монофилетичную группу.

Одно из важных свойств деревьев, построенных по гену Cyt-b, - это четкие отличия между различными видами одного рода для всех пяти семейств. Эти данные очень надежны и поддерживаются топологией дерева, которая формирует ближайшие внутривидовые кластеры с очень маленькими средними внутривидовыми величинами /^-расстояний и незначительными величинами бутстреп поддержки. Эта особенность дерева показывает, что некоторые особи одного вида имеют почти идентичные последовательности.

Таким образом, представленные данные позволяют говорить о том, что диагностика видов по гену Cyt-b, как и по Со-1, является высокоэффективной в силу низкой внутривидовой и высокой межвидовой изменчивости этого маркера. Эта особенность используется в программе штрихкодирования видов на основе ДНК (http://www.boldsystems.org/vievvs/login.php; http://www.barcoding.si.edu/; http://ibol.org/; http://www.fishbol.org/; http://www.imb.dvo.ru/misc/barcoding/index.htm).

„J^™'Platichthys slellatus ^MwmPlatichthys flesus I—-Kareius bicoloratus .mLiopsetta pimifasciata

my vpiearonectes quadrituberculatus %wÈ£Pleuronectes platessa ssñmLimanda punctatissima mmsmLepidopsetta mochigarei mwAsAepidopsetta polyxystra

^"^^Pseudopleuronectes herzensteini

vxm

» . «ж®'pseudopleuronectes obscurus

pseudopleuronectes yokohamae vamm-mcieisthenes herzensteini

As 'ST ""Limanda sakchalinensis Limanda limanda mmflippoglossoides platessoides 'f™""! Hippoglossoides dubius "Hippoglossoides mbustus Hippoglossoides elassodon

jMmiчщ-Verasper variegatus Verasper mosert Sf ""Hippoglossus hippoglossus ^bnt,Mwpoglossus stenoiepis

Clidoaerma asperrimum

- '■"■•m'"-1'*Reinhardtius hippoglossoides

'Ivptocephalus cynoglossus ' ~>tocepuhis stellen itaeephalus zachirus

l~^ma^Micmstqmus kitt

fariffiffîKys^àivaiws5 Paralichthyidae

i^sP^—Glmtocepuliis stellen ^Gliptocephalus zachir ' " Atneresthes stomias

Pleuronectidae

tiJSSTm'Lepidorhombus boscii »»•i wmeXepidarhombus whijfiaganis -~^>hrynorhombus norvegtcia um tpw«Scaphthalmus rhombus 4fK¡KBPsetta maxima ЯгPselta maxima , „Шаупаищт Iwtitamctt ^Scpphifudmiis minimus Tldtichtmhys flesus ,лЩ?*т8о1еа senegalensis

M himSolea solea vim J—Pegusa cadenati tt*>sSolea lascaris

i mSiäßynapturichthys kleinii

>tmSmQ'folog!Pssa cuneata "»a™WgíamSíum luteum "*>жmMwrochirus boscanion

¡tíiavchirus variegatus hirushispidus, Qssa hexophlhalma

Scophthalmidae

urus azevia

Soleidae

¿nuptora Imílafiieu

jcne^te/uis írmglusswi svmilim'.-

Vi modißcams

Stynvvlussm svmiletrts ышышгЯ11!1'0^?* modißcant

p.VkL-i/ï /in^a/uJ./. Citharidae

[Cynoglossidae

Рис. 4. Схематизация филогенетических отношений по генному дереву, построенному на основе последовательностей гена СуиЬ. В узлах показана бутстреп-подвержка для МР, Ш (п=1000 реплик), ВА (106 генераций) и МЬ (п=500 реплик)методов реконструкции деревьев (МР/Ш/ВА/МЬ). Деревья укоренены по двум внешним таксонам; трескообразные (ваШйгтез).

-умфиа giirmanii Qutgroup

^utkhihvs stcllat atiyhthys slellat

•ILtuv \бО

Ш,пул jielhitux /5 ij tkvs stethtus 72 Q mvs sicllatus 14 0 Platichtnvs Actus A8i "Iptichthysjlextis

ч:Дйя ЩЬж-

-Лаг*/«.» bicoloratu* At Ш,

55/52/94/6S

9 ПШ8Т.

iareius bicotoratu .

. m-Liopselia pinnifasaaia I

1ШЦ .-lionsetta pinntfaxcuiia h у/

u — 'iopsettapinnffymata 21 07

[euroneoes quadntuberculattis 271 leuranecttis qucuiritubcitiilati« 27 j "1_r- Pleuroneclcs iiuaantubercumits 274 9Ш9Р1еигопесш fimaruubftvuhipts 275 n immnectes blatessa ЧУ ¡64472 kuronecmbiatma £1Ш2292 leuroni'ctesplcitessa cOWo ¡euronectes plamsa Eyj'Jn.15 .imandapunctatissima 5107 .imantia punctatisstnta 90 07 .'тамарипсштта ¿1

ЬУ-!%Ж x

ц\2тг

..vwa

lintandti punciatissima imama pyinciatissimei <?• .epiappsetta mochivam, spidopseita pvlwyxcra 4 epiappsetta potyxyxfra ¿J<t epidapsetM polyxyztra 2) 7 JpidtfosetMpotv/vstra 219 Yautopleuranctrfs herzensfeim 05 07 'seiuliinleuronectes henenslcim 06 07, ' ttuapplfunmectxis herzvnsteitu OjPlehe] euaopU'uronectes herzcnxteini 6k

ШЗ. 99/1 №

iPseudopTeumtiecies henenxteint /л Pseudopleuronecies obsatrns 56 . „ oyscvnts 4j I)J

97/100C' _ ............

- _ , л чм/11 н ^йГГм— )£fw3Jpleu>wMctej obscurtis 4]J)7 74/79/88/93 2П «СЬшШеигопесШ ohscur,tsDQ464116

n i-Pseudopleunntecies omcurus 4 ГО/

с qs;(vv~ Pseudopleuronecies yoknhamae 122 07 7 01ГТ-. Pseudoplcurvnectts yokohanute И5 07 л«. Txaaltipleumnectex yokohamae 136 07 ^ P ¡pleura пес lex yokohamae 1 j.j 07

I— P^cydefpleunmc'clos vvkoharnqe J38 07

_____Ueisf/ieneshurzmsfiim 78-07

-9/100/99/1 (KH-. rleisthenes herzensteinl 3S

i-Cfcisthencs hcrsenstciqi 19-07

Limanda sakchalinensis 7/ Limanda sakchaUntnsix 74 Limanda sakchalinensis 72 Limandp sakchalinensis 7J iLmaruifi sawkMin&xisJS , Limandp Umanda LV224011 Limanda timanaafJJ492U9 Lim<inda hm^nda LU4922&8 ^ _с- Jfippcmosso/ctes pkuexsotdes EV492W

Ф/99/1Й СвЙЖК^ «г/lfc [p- HipiK&Uvisoides robustus ' НМ/юШоллоШех rqbustus.

гпр/юу^омоide.i elqssodoi

9У9&ШОО

'ip'poglpssolMS robusms [ippoelpxsoidcs rob us ш mmlossoides elawodi,

hissoldt. r robustus [osxoides rqbitstus. JpoVloMOides elassodoi

«ММ

YyritSfk'

, ■ ippovlf)!

.jpoglosjus htppoiloi^---

'jj'povlpxsitj hippovlossux Aj Uppoglosstis hfppogloMusj-.

'tossows irdtiu.1 htppo&lpssaide,т 2 тШиз hippoppssoidcs 257 , j/viW hippoglossoidesNC ( vplncephcm cyrioemxu.? by4ч '■h'phKcpha¡ил crfioiilosxy.t hV49 'hptocepuJtci sieikff ЛЯПШО llypiotwhaliix zachtrtts ¡15 jhervsmes sfomiof246 ,., jlvpiocephalus zachirus U{ .rhptocephahis zachirux /V J

фйжхшШШ

Microstomas kill ¿11224065 Шспмотих kut ЕЬ492П?____

^araiichmys ohvaceus AB02H664

Pleuronectinae, Pleuronectini

Hippoglossoidinae

Hippogfossinae

Pleuronectinae, Microstomini

Рис. 5. Фрагмент MP-дерева, построенного на основе последовательности гена Cyt-b и показывающего филогенетические взаимосвязи отдельно для сем, Pleuronectidae. В узлах приведена бутстреп поддержка для MP, NJ (п=1000 реплик), ВА (10б генераций) и ML (п=500 реплик) методов реконструкции деревьев (MP/NJ/BA/ML).

Глава S. МОЛЕКУЛЯРНО-ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КАМБАЛООБРАЗНЫХ РЫБ, ВЫПОЛНЕННОЕ IIA ОСНОВЕ ОБЪЕДИНЕННЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНОВ СО-1II CYT-B

Для филогенетических целей последовательности генов Со-1 и Cyt-b были объединены. Анализ нуклеотидного состава для объединенных последовательностей не выполнялся, так как по результатам исследования отдельных генов уже было показано смещение соотношения пуринов и пиримидинов от пропорции 50%:50%.

Р-расстояния, оцененные в этом случае на трех различных уровнях иерархии, составили: (1) на внутривидовом - 0,87±0,08%, (2) внутриродовом - 8,89±0,36% и (3) внутрисемейственном - 11,58±0,06%. Значения р-расстояний показывают возрастание уровня дивергенции с увеличением ранга таксона.

Проведенный однофакторный дисперсионный анализ показал, что средние расстояния в трех проанализированных группах для объединенных последовательностей генов Со-1 и Cyt-b существенно различаются, как и по отдельным генам. Соответственно и объединение данных по двум генам дает статистически значимое увеличение р-расстояний в иерархии групп сравнения. Однако категоризированное представление средних значений по двум генам по отдельности и по группам сравнения более правомочно и оно показывает, что с увеличением ранга таксона (группы) имеется увеличение дивергенции для обоих генов - Со-1 и Cyt-b (Картавцев, Ли, 2006).

Таким образом, эти данные подтверждают высказанное ранее предположение о преобладании среди представителей отряда камбалообразных географической модели видообразования в соответствии с биологической концепцией вида (Dobzhansky, 1955; Ayala et al., 1974; Bush, 1975; Templeton, 1981; Mayr, 1982; King, 1993; Harrison, 1998).

Как отмечалось, сем. Pleuronectidae - одно из самых больших семейств камбал. Это семейство было формально разделено на подсемейства (Chapleau, 1993; Azevedo et al., 2008). Несмотря на формальность в разделении на подсемейства, в представленном анализе некоторые из них формируют весьма устойчивые ветви. Самую крупную ветвь на представленных деревьях по трем наборам данных формирует подсемейство Pleuronectinae (рис. 6). Это подсемейство подразделяется на четыре трибы, две из которых включены в анализ (Microstomini с родами Pleuronichthys, Microstomia и Glyptocephahts, в данный анализ включен только род Glyptocephahts). В трибу Pleuronectini входит пять родов (Cooper, Chapleau, 1998). В молекулярно-филогенетический анализ были включены четыре рода: Limanda (L. punctatissima), Platichthys (P. bicoloratus, P. Jlesus, P. stellatus), Phuronecies (P. pinnifasciatus, P. qitadritaberculatus), Pseudopleuronectes (P. herzensteini, P. obscurm, P. yokohamae). Род Lepidopsetta (Z. mochigarei по трем наборам данных и L. polyxistra no Cyt-b) также оказался включенным в трибу Pleuronectini, тогда как в исследовании Купера и Чаплау (Cooper, Chapleau, 1998) этот род рассматривался исключительно в составе трибы Microstomini.

Вид Limanda sakchalinensis по трем наборам данных и L. limanda (по гену Cyt-b) оказались включенными в ветвь подсемейства Hippoglossoidinae. Согласно представленным деревьям подсемейство Pleuronectinae может считаться монофилетичным, если исключить из

него трибу Microstomini.

В подсемейство Hippoglossoidinae включены два из трех родов Cleisthenes (С. herzensteini) и Hippoglossoides (Н. dubius, Я. elassodon, Н. robustus).

Подсемейство Hippoglossinae содержит все пять родов, которые описаны для этого подсемейства (Cooper, Chapleau, 1998): Reinhardtius (R. hippoglossoides), Hippoglossus (H. hipoglossus, H. stenolepis), Verasper (V. moseri, V. variegatus), Clidoderma (C. asperrimum). Несмотря на то, что ветви для этого подсемейства на Cyt-b дереве оказались не разрешенными, этот кластер поддерживается Со-J и объединенными последовательностями.

Полученные молекулярно-филогенетические данные поддерживают монофилию большинства родов сем. Pleuronectidae. Однако филогения или последовательность возникновения родов внутри семейства, и особенно внутри подсемейства Pleuronectini, несмотря на хорошие статистические поддержки ветвей, остаются не вполне ясными, так как топологии деревьев для этого подсемейства по ряду позиций отличаются в трех группах проанализированных данных: по Со-1, Cyt-b и по совокупным данным для этих двух генов. Причин данной несогласованности может быть три - это (1) различная информационная емкость маркеров, (2) случайная сортировка филетических линий, обусловленная неодинаковым составом представителей (последовательностей), входивших в построенные деревья и (3) топологические и статистические ошибки, связанные с конструированием деревьев и точностью подбора модели нуклеотидных замен. Все же, более предпочтительными являются совместные данные, так как являются наиболее репрезентативными и консесусными и, соответственно, дерево, построенное по двум генам, является более надежным.

Род Pseudopleuronectes в представленном анализе формирует монофилетичную ветвь, что согласуется с данными по гену Cyt-b, а также с другими исследованиями (Коваль, Богданов, 1982; Cooper, Chapleau, 1998; Воронина, Евсеенко, 2001; Винников, 2007). Однако кластеризация видов внутри ветви Pseudopleuronectes отличается по генам Со-1, Cyt-b и совместно по двум генам. Таким образом, требуется также дальнейшее исследование взаимоотношений видов внутри рода Pseudopleuronectes.

Род Limanda. В данном анализе представленный род также формирует полифилетичный кластер, как уже было показано для генов Со-1 и Cyt-b, что может служить свидетельством о необходимости ревизии этого таксона.

Как следует из данных, представленных на рис. 2, 4-6, виды камбал внутри отдельных родов чётко отличаются генетически. Недостаток четких диагностических морфологических признаков мог создать номинальные таксоны, которые не различимы генетически. На представленном дереве виды Hippoglossoides robustus, Я. elassodon и Я. dubius формируют смешанный кластер. Р-расстояния между этими видами составили 1,06±0,11 %, расстояние между видами Я. robustus и Я. elassodon составило 1,06±0,11%, расстояние между последовательностями вида Я. robustus - 1,0б±0,11%, расстояние между последовательностями Я. elassodon - 1,5±0,3%. Известно, что два первых вида достаточно сложно различать морфологически и, по-видимому, эти таксоны следует рассматривать как синонимы (Винников,

2006, Kartavtsev et al., 2007). Это предположение согласуется и с морфологическими данными (Ivankov et al., 2002; Kartavtsev et al., 2002; Vinnikov, 2003), и по первоописанию предпочтение следует отдать видовому названию Н. elassodon (Jordan, Gilbert, 1880), как было сформулировано ранее.

ОШ

r-L

—Ksreius bíco(o<"SfusNC003f 76 tnn 1—Lropsotta pinmfasasta 1K iyy-! i—Ikipstítta pinnifasoota 19 07 ' I r-Lhpsetta pinnifasciata 1 Ц-LfopseMa pinnríasc/aía 20 07 l-Uop$ctta pinnifasciata 21 07

,r.....Pleuronectes quadnluberculatua 274

' r-Pieuronectes (¡aedattiberculatus 273 %-P{Qumn<}ctcs quadritubercu/arus 2 71 •-Rlcuronectes quadriluberculatus 275 r-Piaiichthys siallalus 14 07 fi rPJatichthys steliatus 11 07 '-Ptatiehttiys sielíatus 16 07 ЮОЖХШ/КХ* ,-Piafichlhys slellatus 12 07 "lP!a(ichthys steliatus 15 07 Umanda ptinclalissima 37 Umanda punctatis&tma 87 07 4.imanda paneta fí&sima 88 07 ; ,-Umarttffl punctatissima 5107 ■"linwndti punctíitissima 90 07

--Psaudopkurcnectes obscuturs 4107

i-Psoudop huronea es obscuras 43 07

S9/ioo<'99í.to$.........Pseudoptauroneclos obscurus119 07

'-Pseudapleuronectes obscunjs120 07

^Pseudopleuronectes obscuros 36

.......'-PseudopteuroMcttis obscurus 42 07

r.......Pseudapleuronect&s herzertsleini 05 07

I—Pseudople (/голе cíes henensieini 06 07 loci'ioo'ti'ia^"—Pseudopleuronect&s herzenstoini 02Pioha 1

\_'Ps&uüapleufvnectes herzensteirtí 6K

-Pseudcpleurontictss hensensteini 7K i—Pseudopleuronectes yokohamae 12207

>•.......Pso itdcplc uronc etes yckohamsQ 128 07

oe'-rfíñ'«ürífiti'■-•■Psoudopleuroitectes yokohamae 135 07 8ftuxro»!«i—pseudopleurcnectesyokohamde 136 07 '—PsQuúoplourwectc-s yokolwnwe 138 07

......lepidopsetta polvxystra 217

4.ep¡dopsetta pof/xystra 218 _ ¡ Lupídopsetia poíyxystro 219

* Lepiaopsotta poíyxystia 220

>—Umanda sakchalinensis 72 1СШ£ШйНШ*—Lúrianda sakchalinensis 73 j i f-Limmida sakchalinensis 71

i í-f-Umanda sakhnhnensjs 74

¡-Umanda sakchalinensis 75 ....Йhorzonstomi 79 07

|iooiiposaaoc^c/e№f/ienes her2er]Sl0Ín¿ 78 Q7 ¡ -Cleislbenes herzensteinl 38

I 0,L,,,ar77i—Hippoglossoides robustos 288 ewvvSs Wb-Hippoglossoides robuslus 287 ! I j Hippoqlossoides dubius 5К I S$<70te&41ippoglQS$o¡d8$ robustos 289 ioo/ioo.'&9'iod —Hrppoyiossoides elassodon 33 \ \—Hippoglossoides elassodon 34 —Hippoglossoidesrobuslus 28$ 74/84/8* Ofi,—Hippoglossoides robustas 21)0 H/ppogla ssoides robuslus 31

«T^saíseef

'9HlppOQt'QSSUS SlODOlCpiS В poltl

&Ш/74Щ -Hippoglossus stenolepis В aalí2

i •-Reinhardtius hippoglossoides 2G0

I l j........Reifihúrdtius hippogtossoidos NC00971

iC0M(Xw9n£Kf ,—Reinhardtius hippoglossoides 257 --"S'í 4 r~Reinhardtíu$ hippoglossoides 259 i %'Remhardiius hippoglossoides 253 •Rvinhardtius hippoglossoides 258 l rV&rasper variegalus DQ403797

ШШМйЬ-Verasper mosari NC 008461

...JÜütlMÜilCfl}-

Pleuronectinae, Pieuronectini

Hippogiossoidinae

Hippoglossinae

ItoV Г ШвОрШ (TV UVUTU I ,

f^&sssssssr, áPIeuronectinae, H^teaKíSSaíJlMícrostomini

m-i-t-'-Pleuronichthys comulus ASIZP09V391

-Solea senegalen&s AB270760

|Outgroup

Рис. 6. Укорененное консенсусное (50%) ВА-дерево, показывающее филогенетические взаимосвязи на основе объединенных последовательностей генов Со-1 и Су1-Ь для сем. Р1еигопесМае. Цифрами показана вероятность повторяемости узлов в 10б генераций для ВА или их бутстреп поддержка в 1000 реплик, соответственно для МЬ, МР и N1 методов реконструкции деревьев (последовательность статистической поддержки: ВА/МЬ/МР/Ш).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В отличие от любых морфологических признаков, которые специфичны для каждой группы организмов, молекулярные признаки обладают универсальностью (есть у всех или у подавляющего большинства организмов и присутствуют на всех стадиях жизненного цикла). Основное преимущество молекулярных методов изучения изменчивости заключается в том, что они генерируют огромные наборы дискретных признаков, причем не только тех, которые находятся под давлением отбора, но и селективно нейтральных (Банникова, 2004).

На топологию получаемых филогенетических деревьев значительное влияние оказывает выбор молекулярного маркера (Абрамсон, 2007). Для данного исследования было выбрано два митохондриальных гена - это ген Со-1, который широко используется в программе ДНК-штрихкодирования рыб (Hebert et al., 2003, 2005; Ward, 2005; Kartavtsev et al., 2008), и ген Cyt-b, который активно используется для оценки филогении рыб на внутри- и межродовом уровне, а также на уровне различных семейств и более крупных таксонов (Шедько, 2002; Банникова, 2004; Абрамсон, 2007, 2009; Kartavtsev et al., 2008).

Последовательности этих двух генов были включены в анализ, как по отдельности, так и объединены для повышения достоверности полученных топологий (Банникова, 2004).

Анализ нуклеотидного состава, выполненный для генов Со-1 и Cyt-b, показал отклонение от пропорции 1:1:1:1 и отклонение в соотношении (Т+С):(А+Т), что хорошо описано в литературе для многих белок-кодирующих генов (Kim et al., 2004). В представленном исследовании это отклонение хорошо документировано статистически.

Оценка /^-расстояний для различных этапов эволюционной истории показала увеличение нуклеотидного разнообразия с возрастанием ранга таксона по данным для нуклеотидных последовательностей генов Со-1 и Cyt-b. Выявляются также различия между самими генами в степени дивергенции на четырех проанализированных уровнях, хотя суммарные средние расстояния по двум генам статистически значимо не отличаются. Таким образом, полученные данные согласуются с многочисленными литературными данными о разной скорости эволюции этих и других генов, их различных участков и неоднородности темпов эволюции (Li, 1990; Картавцев, Ли, 2006; Абрамсон, 2009).

Известно, что таксоны высшего ранга существуют дольше, чем таксоны более низкого ранга (Simpson, 1961; Nei, 1987). Таксономисты за редким исключением согласны с тем, что высшие таксоны (более или менее крупные группировки видов) представляют собой результат эволюционной дивергенции (изменений в ходе филогенеза) (Майр, 1971). Таким образом, учитывая оценки между внутривидовым и межвидовым уровнями, можно объяснить эти данные, как характеризующие определенную модель видообразования. В частности, данные по р-расстояниям позволяют сделать вывод, что среди представителей отряда камбалообразные преобладает географическая модель видообразования с накоплением случайных генетических изменений в течение длительного периода времени формирования подвидов, а затем видов и дальнейшей независимой эволюцией линий (Dobzhansky, 1955; Ayala et al., 1974; Bush, 1975; Templeton, 1981; Mayr, 1982; King, 1993; Harrison, 1998).

Один из центральных постулатов фитогеографии состоит в том, что внутривидовые монофилетичные группировки (ветви), разделенные значительными генетическими расстояниями, как правило, возникают в результате длительных внешних (биогеографических)

преград свободному потоку генов между популяциями (Avise et al., 1987). Ряд таких факторов, как подразделение популяций вида географическими преградами, расширение ареала и расселение, оказывают непосредственное влияние на характер внутривидовой генетической изменчивости (Абрамсон, 2007). Генетические различия приобретаются постепенно, в сформированных изолированных популяциях или их группах. В дальнейшем процесс дивергенции продолжается, диверсифицируются полувиды, близнецовые виды, роды и т.д. Таким образом, чем больше времени прошло с момента изоляции, тем большие генетические расстояния приобретаются между соответствующими таксонами (Картавцев, Ли, 2006). Представленные сравнительные данные по первичным последовательностям генов Со-1, Cyt-b и белковым маркерам позволяют твердо говорить о реализации этого процесса до уровня семейства (Картавцев, Ли, 2006) и даже отряда (Kartavtsev et al., 2009).

Одно из наиболее серьезных возражений против использования генетической дивергенции для определения видовых границ у разных таксонов состоит в том, что длительная изоляция близкородственных групп, индикатором которой служит величина дивергенции или р-расстояния, сама по себе не является обязательным условием (а только предпосылкой) образования новых видов (Ferguson, 2002).

Анализ филогенетических отношений выполнен на основании генных деревьев. Представленные деревья показали четыре принципиальных свойства; (1) обособленное положение таксонов внешней группы; (2) разделение на кластеры, включающие отдельные семейства Pleuronectiformes; (3) наличие кластеров, которые представляют различные роды и (4) существование кластеров, объединяющих особей одного вида в пределах одного рода.

В качестве внешней группы для исследуемых камбалообразных использовали представителей отряда трескообразные (Gadiformes). Это связано с тем, что сестринская группа для Pleuronectiformes остается не выясненной, а их происхождение от Perciformes подвергается сомнению. Трескообразные показывают хорошее разрешение на построенных деревьях, формируя обособленный кластер.

Все деревья, построенные по трем различным наборам данных (гены Co-I, Cyt-b и объединенные последовательности), показывают, что семейства, представленные в работе, формируют монофилетичные ветви. Однако достоверно можно говорить только о монофилетичности сем. Pleuronectidae, что хорошо поддерживается данньми по генам Со-1, Cvt-b, 12S и /(ИрРНК и морфологическим исследованием филогении (Cooper, Chapleau, 1998).

Все представители сем. Pleuronectidae формируют монофилетичные ветви. Полученные молекулярно-филогенетические данные поддерживают монофилию большинства родов сем. Pleuronectidae. Однако филогения представителей родов внутри семейства, особенно внутри подсемейства Pleuronectini остается неясной и требует дальнейшего исследования. Представленные в исследовании данные показывают, что последовательности генов Со-1 и Cyt-b подходят для дискриминации видов, что реализуется в программе штрихкодирования видов на основе ДНК.

В дальнейшем необходим анализ новых видов и больших геномных участков. Это даст лучшее понимание взаимоотношений среди различных таксонов камбал.

выводы

1. На основании представленных данных по первичным последовательностям нуклеотидов двух отдельных генов Со-1, СуьЬ, а также по объединенным данным для этих генов сем. Р1еигопесПс1ае следует считать монофилетичным. Монофилетичными являются и три других представленных в исследовании семейства: ЗсорНЫпийае, БоЫсЬе и Суш^1о$з1йае, за исключением семейств РагаНсЫЬуЫае и СШмп(1ае, которые были описаны ранее как полифилетичные.

2. Молекулярно-филогенетические данные, полученные по первичным последовательностям нуклеотидов генов Со-1 и Су1-Ь, показывают, что подсемейства HíppogIossoid¡nae и Нфро§1оззтае являются монофилетичными, подсемейство Р1еигопесипае также можно считать монофилетичным, если исключить из него трибу {уПсгозЦшнт и рассматривать род Ьер1с1ор5еПа в составе трибы Р1еигопес1тт Таксономический статус ЦтаЫа заксЬаИпепяз и Ь. ИтатЬ остается не вполне ясным. Можно предложить ревизию этого таксона с приданием ему родового ранга.

3. Таксоны Шрро$1о$5о1с1е5 гоЬшШ и Я. е1а*50с1оп являются синонимами с предпочтением видовому названию Я. е\а$зос!оп. Положение Я. ¡¡иЫга требует уточнения.

4. Идентификация видов по индивидуальным последовательностям генов Со-1 и Су1-Ь является высокоэффективной в силу низкой внутривидовой и высокой межвидовой изменчивости этих маркеров и может служить основой штрихкодирования видов (Ьагсос1ш§).

5. Значенияр-расстояний показывают возрастание уровня дивергенции с увеличением ранга таксона. Это позволяет сделать вывод, что среди представителей отряда камбалообразные преобладает географическая модель видообразования с накоплением случайных генетических изменений в течение длительного периода времени формирования подвидов, а затем видов и дальнейшей независимой эволюцией филетических линий.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи, опубликованные в журналах из списка, рекомендованного ВАК:

1. Kartavtsev Y.Ph., Park T.-J., Vinnikov K.A., Ivankov V.N., Sharina S.N., Lee J.-S. Cytochrome b (Cyt-b) gene sequence analysis in six flatfish species (Teleostei, Pleuronectidae), with phylogenetic and taxonomic insights II Marine Biology. 2007. Vol. 152. P. 757-773.

2. Kartavtsev Y.P., Park T.-J., Lee J.-S., Vinnikov K. A., Ivankov V.N., Sharina S.N., Ponomarev A.S. Phylogenetic inferences introduced on cytochrome b gene sequences data for six flatfish species (Teleostei, Pleuronectidae) and species synonymy between representatives of genera Pseudopleuronectes and Hippoglossoides from Far Eastern seas // Генетика. 2008. Т. 44, № 4. С. 524-531.

3. Kartavtsev Y.P., Sharina S.N., Goto Т., Balanov A.A. and Hanzawa N. Sequence diversity at cytochrome oxidase 1 (Co-1) gene among sculpins (Scorpaeniformes, Cottidae) and some other Scorpionfish of Russia Far East with phylogenetic and taxonomic insights // Genes and Genomics. 2009. Vol. 31, № 2. P. 183-197.

4. Шарина С. H., Картавцев Ю. Ф. Филогенетический анализ камбал (Teleostei, Pleuronectiformes) основанный на исследовании нуклеотидных последовательностей гена цитохромоксидазы 1 (Со-/)//Генетика. 2010. Т. 46, № 3. С. 401-407.

Статьи в других журналах:

1. Kartavtsev Y.P., Sharina S.N., Goto Т., Chichvarkhin A.Y., Balanov A.A., Vinnikov K.A., Ivankov V.N., Hanzawa N. Cytochrome oxidase 1 gene sequence analysis in six flatfish species (Teleostei, Pleuronectidae) of Russia Far East with inferences in phylogeny and taxonomy // Mitochondrial DNA. 2008. Vol. 19, № 6, P. 479-489.

2. Kartavtsev 1 Y.P., Sharina S.N., Goto T.„ Rutenko O.A., Zemnukhov V.V., Semenchenko A.A., Pitrukl D.L., Hanzawa N. Molecular phylogcnetics of pricklebacks and other percoid fishes from the Sea of Japan // Aquatic Biology. 2009. Vol. 8. P. 95-103.

Светлана Николаевна ШАРИНЛ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписан в печать 17.11.2010 Формат 60x84/16 Усл. печ. л. 1,39 Уч.-изд. л. 1,29 Тираж 100 Заказ 537 Типография ДВГТУ, 690990, г. Владивосток, ул. Пушкинская, 10

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шарина, Светлана Николаевна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика исследуемой группы рыб

1.1.1. Отряд камбалообразные (Р^игопесйГогтеБ)

1.1.2. Семейство камбаловые (Р1еигопесйс1ае)

1.2. Таксономический статус исследуемой группы рыб 14 1.2.1. Семейство камбаловые (Р1еигопес^ёае)

1.3. Систематика и филогения камбалообразных рыб по генетическим данным

1.4. Митохондриальные маркеры

1.5. Эволюционные модели 29 1.5.1. Модель Джукса-Кантора 3 О 1.5.1. Модель Кимуры

1.5.3. Модель Таджимы-Нея

1.5.4. Другие эволюционные модели

1.5.5. Гамма-расстояния

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы

2.2. Методы

2.2.1. Выделение ДНК

2.2.2. Амплификация

2.2.3. Определение нуклеотидной последовательности

2.2.4. Первичный анализ нуклеотидных последовательностей

2.2.5. Филогенетический анализ '

Глава 3. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ФИЛОГЕНЕТИКА КАМБАЛООБРАЗНЫХ РЫБ НА ОСНОВЕ ГЕНА СУБЪЕДИНИЦЫ 1 ЦИТОХРОМОКСИДАЗЫ С

3.1. Результаты

3.2. Обсуждение

Глава 4. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ФИЛОГЕНЕТИКА

КАМБАЛООБРАЗНЫХ РЫБ НА ОСНОВЕ ГЕНА ЦИТОХРОМА В

4.1. Результаты

4.2. Обсуждение

Глава 5. МОЛЕКУЛЯРНО-ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КАМБАЛООБРАЗНЫХ РЫБ, ВЫПОЛНЕННОЕ НА ОСНОВЕ ОБЪЕДИНЕННЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНОВ СО-1 И СТГ-В 80 5Л. Результаты 1 80 5.2. Обсуждение 84 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 89 ВЫВОДЫ 94 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 96 ПРИЛОЖЕНИЕ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-филогенетическое исследование камбалообразных рыб (Pisces, Pleuronectiformes) дальневосточных морей России по нуклеотидным последовательностям генов цитохрома B и цитохромоксидазы 1"

Актуальность. Систематика камбал изучена слабо и классификация представителей в пределах отряда камбалообразные, как и в других отрядах рыб, в основном базировалась на морфо-анатомических признаках. Имеется лишь несколько работ (Berendzen, Dimmick, 2002; Pardo et al., 2005; Azevedo et al., 2008),, выполненных с использованием молекулярных маркеров и, в частности, последовательностей нуклеотидов (далее для краткости -последовательностей), представляющих основной инструментарий* данной' работы. Чаплау (Chapleau, 1993) в своей ревизии, основанной на морфологических признаках, указал, что предшествующие классификации могли быть интуитивными, упрощенными и филогенетически не состоятельными. С другой стороны, филогения камбалообразных рыб отряда, Pleuronectiformes на основании молекулярных данных была ограничена малым количеством видов и/или семейств и в основном заключалась в рассмотрении^ взаимоотношений между семействами (Pardo et al., 2005; Azevedo et al., 2008). Берендзен и Диммик (Berendzen, Dimmick, 2002) представили наиболее полное исследование филогении по данным, основанным на последовательностях митохондриальной ДНК (мтДНК). Однако, хот;, большинство семейств отряда и были включены в работу, число видов и их взаимосвязи в пределах семейств представлены не полностью (Pardo et al., 2005).

В представляемой диссертационной работе основной акцент сделан на исследование семейства (сем.) камбаловые (Pleuronectidae) как наиболее распространенного в водах Дальнего Востока России и Тихого океана в целом.

Таксономические отношения камбал сем. Pleuronectidae до сих пор остаются предметом многочисленных исследований. Вследствие использования различных методик, в настоящее время известно несколько вариантов классификации камбаловых рыб, предложенных разными авторами (Norman, 1934; Sakamoto, 1984; Линдберг, Федоров, 1993; Cooper,

Chapleau, 1998). Родовая принадлежность разных видов семейства часто пересматривается, порой без достаточных для этого оснований, число родов в подсемействе Pleuronectinae меняется, что вызывает определенную критику (Расс, 1996). Подобная ситуация указывает на- то, что понимание таксономических отношений, как собственно в семействе камбаловых рыб, так и в отряде камбалообразные, требует более глубокого анализа. Одной из конкретных проблем является большая синонимия и, соответственно, необходимость прояснения таксономического статуса ряда представителей-рассматриваемого семейства. Это касается, например, валидности нескольких представителей рода палтусовидных камбал Hippoglossoldes, таких как H. dubius, H. robus tus, H. ellassodon (Фадеев, 1978; Коваль, Богданов, 1082; Винников, 2003; Винников и др., 2006) и камбал рода Pseudopleuroriectes, например, Р: schren/d, P. yokohamae и других (Cooper, Chapleau, 1998; Воронина, 2001; Винников и др., 2006).

В последние десятилетия для анализа системы таксономических" отношений (систематики) и филогении рыб и других животных чаще всего используется сравнительный анализ митохондриального генома и входящих в него генов митохондриальной ДНК (мтДНК).

МтДНК животных характеризуется рядом свойств, делающих ее подходящей для этих целей (Avise, 2000). К ним относится небольшой размер молекулы (Attardi, 1985), в 5-10 раз более высокая скорость эволюции последовательностей митохондриальных генов по сравнению с ядерными локусами (Brown et al., 1979), гаплоидное материнское наследование и отсутствие (Hayashi et al., 1985; Birky, 2001) или очень большая редкость (Eyre-Walker et al., 1999; Hagelberg et al., 1999) рекомбинаций. Это позволяет эффективно оценивать дифференциацию таксонов различного ранга по последовательностям генов мтДНК и даже анализировать внутривидовую дивергенцию. Спонтанные мутации в мтДНК, приводящие к заменам нуклеотидов в последовательностях генов, и дальнейшая дивергенция последовательностей у видов позволяют не только различать или дифференцировать таксоны, но и ретроспективно: реконструировать.историю возникновения таксонов и внутривидовых групп или выяснить их филогенез (Avise,.2000): . , ; \ , '

В данной работе для филогенетических исследований были выбраны два гена мтДНК - это ген субъединицы. 1 цитохромоксидазы с (цитохромоксидаза 1, Со-1) и ген цитохрома b- (Cyt-b). В последние десятилетия эти гены наиболее популярны в молекулярной фплогенетике и < обычно , используются для анализа- на уровне вид-семейство (Johns. Avise, 1998; Hébert et al., 2004; Картавцев, Ли, 2006; Kartavtsev. 2009а, h).- ; ; • ' Таким образом, существующие проблемы в филогении ш систематике-камбалообразных рыб определили; цель данной работы ; - исследование: генетической изменчивости; филогенетических отношений и дивергенции камбалообразных рыб дальневосточных^ морей России на основё анализа нуклеотидных последовательностей генов Со-1 и Cyt-b: •

В соответствии с заявленной целью были поставлены следующие задачи:

2) выяснить, как ' соотносятся уровни внутри- и межвидовой дивергенции- у исследуемых представителей различных таксонов камбалообразных рыб;

3) провести реконструкцию филогенетических взаимоотношений исследуемых видов камбалообразных рыб с использованием в качестве молекулярных .маркеров генов Со-1 и Cyt-b]

5) подтвердить или опровергнуть монофилетичность сем. Pleuronectidae; и его подсемейств;

6) уточнить таксономический статус видов рода Hippoglossoides- Н: robhstus, Н. elassodon wH: dubius.

Научная новизна. Впервые с помощью молекул ярно-филогенетических методов установлены эволюционные взаимосвязи между видами внутри сем. Pleuronectidae.

Уточнены уровни: внутри- и межвидовой! дивергенции исследуемых видов; Выдвинута гипотеза о преобладающем способе; видообразования; камбалообразных рыб. '

Установлен монофилетичный статус сем: Pleuronectidae и представленных в; исследовании'; подсемейств (Pleuronectinae, Hippoglossoidinae и- Hippoglossinae). Сделано оригинальное . предложение исключить трибу Microstomini из подсемейства Pleuronectinae.

Показана полифилетичность рода Limanda. Впервые: сделано предложение рассматривать виды, Limanda sakchalinensis и L. limanda как самостоятельные таксоны родового ранга в составе подсемейства Hippoglossoidinae.

Уточнена филогения рода Hippoglossoides. Рекомендована синонимизация выделенных ранее таксонов Hippoglossoides robusius и Н. elassodon со сведением их, согласно приоритету, к виду Hippoglossoides elassodon Jordan, Gilbert, 1880.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Представленные , генетические маркеры Со-1 и Cyt-b могут быть применены для идентификации видов камбалообразных рыб в таксономических, эволюционных и рыбохозяйственных целях, а также использованы в Международном проекте по штрихкодированию рыб на основе ДНК, FishBOL (http://www.fishbol.org/).

За время работы были определены и депонированы в международную базу данных (GenBank, NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 132 нуклеотидные последовательности представителей сем. Pleuronectidae для двух генов мтДНК Со-1 и Cyt-b.

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на российских и международных конференциях: «Modern Achievements in population, Evolutionary and Ecological Genetics: International Symposium» (Владивосток - МБС «Восток», 2007), «Штрих-кодирование видов рыбРоссии на основе ДНК. Интеграция в глобальную программу FishBOL». Рабочее совещание (Владивосток, 2007), «Second International Barcode i of Life Conference» (Тайпей, Тайвань, 2007), «DNA Barcoding and Molecular Phylogenetics: The International Workshop» (Владивосток, 2007), «Школа-конференция молодых ученых «Секвенирование полных геномов»» (Иркутск, 2009), «Modern Achievements in Population, Evolutionary, and Ecological Genetics: International Symposium» (Владивосток — МБС «Восток», 2009), «The 2nd International workshop on DNA barcoding of Northeast Asian Fishes: Population, Species, and Phylogeny» (Сеул, Корея, 2010), на ежегодных конференциях Учреждения Российской академии наук Институте биологии моря им. A.B. Жирмунского ДВО РАН (Владивосток, 2008, 2009).

По материалам диссертации опубликовано 17 работ, из них 6 статей в рецензируемых международных и российских журналах; 4 входят в текущий список ВАК.

Личный вклад автора. Автором были собраны образцы камбалообразных рыб из залива Восток (Японское море), выделена ДНК, проведены ПНР реакции и реакции циклосеквенирования, разработаны специфические праймеры для гена Со-1 камбалообразных рыб, проведен анализ нуклеотидных последовательностей. Статистический анализ данных проводился с помощью научного руководителя.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 162 страницах, иллюстрирована 13 рисунками, содержит 5 таблиц и приложение с 5 таблицами. Список литературы содержит 149 наименований.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Шарина, Светлана Николаевна

выводы

1. На основании представленных данных по первичным последовательностям нуклеотидов двух отдельных генов Со-Г, Су1-Ь, а также по объединенным- данным для этих генов сем. Р1еигопеси<1ае следует считать монофилетичным. Монофилетичными являются и три других представленных в исследовании семейства: 8сорЬга1т1ёае? БоЫёае. и Суш^1о5з1с1ае, за исключением семейств РагаНсМЬутёае и СШ1апс1ае, которые были описаны ранее как полифилетичные.

2. Молекулярно-филогенетические данные, полученные по первичным последовательностям нуклеотидов генов Со-1 и С\Ч-Ь, показывают, что подсемейства Hippoglossoidinae и Hippoglossinae являются монофилетичными, подсемейство Р1ешхтес1:тае также можно считать монофилетичным, если исключить из него трибу МюгоБйтит и рассматривать род Ьергёорзейа в составе трибы Р1еигопес1нп. Таксономический статус ЫтапсЬ яаксЬаНпет'^ и ¿. Итапс1а остается не вполне ясным. Можно предложить ревизию этого таксона с приданием ему родового ранга.

3. Таксоны Hippoglossoides гоЬиМт и Н. е1аххоЛоп являются синонимами, с предпочтением к видовому названию Н. е\аязойоп. Положение Н. йиЫж требует уточнения.

4. Идентификация видов по индивидуальным последовательностям генов Со-1 и СуиЪ является высокоэффективной в силу низкой внутривидовой и высокой межвидовой изменчивости этих маркеров и может служить основой штрихкодирования видов (Ьап^^).

5. Значения /»-расстояний показывают возрастание уровня дивергенции с увеличением ранга таксона. Это позволяет сделать вывод, что среди представителей отряда камбалообразные преобладает географическая модель видообразования с накоплением случайных генетических изменений в течение длительного периода времени формирования подвидов, а затем видов и дальнейшей независимой эволюцией филетических линий.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В отличие от любых морфологических признаков, которые специфичны для каждой группы организмов, молекулярные признаки обладают универсальностью (есть у всех или у подавляющего большинства организмов и присутствуют на всех стадиях жизненного цикла). И в этом их особая привлекательность как для единой идентификкционной системы: ДНК-штрихкода, так и для построения единого древа жизни (Абрамсон, 2009). Основное преимущество молекулярных методов изучения изменчивости заключается в том, что они генерируют огромные наборы дискретных признаков, причем не только тех, которые находятся под давлением отбора, но и селективно нейтральных (Банникова, 2004).

На топологию получаемых филогенетических деревьев значительное влияние оказывает выбор молекулярного маркера (Абрамсон, 2007). Для данного исследования было выбрано два митохондриальных гена - это . ген Со-1, который широко используется в программе ДНК-штрихкодирования рыб (Hebert et al, 2003, 2005; Ward, 2005; Kartavtsev et al., 2008), и ген Cyt-b, который активно используется для оценки филогении рыб на внутри- и межродовом уровне, а также на уровне различных семейств и более крупных таксонов (Шедько, 2002; Банникова, 2004; Абрамсон, 2007, 2009; Kartavtsev et al., 2008).

Анализ нуклеотидного состава, выполненный для генов Со-1, Cyt-b, показал отклонение от пропорции 1:1:1:1 и отклонение в соотношении (Т+С):(А+Т). что хорошо описано в литературе для многих белок-кодирующих генов (Kim et al., 2004). В представленном исследовании это отклонение хорошо документировано статистически.

Оценка ¿»-расстояний для различных этапов эволюционной истории показала увеличение нуклеотидного разнообразия с возрастанием ранга таксона по данным для нуклеотидных последовательностей генов Со-1 и Cyt-b. Выявляются также различия .между самими генами в степени дивергенции на четырех проанализированных уровнях, хотя суммарные средние расстояния по двум генам статистически значимо не отличаются. Таким образом, полученные результаты согласуются с многочисленными литературными данными о разной скорости эволюции этих и других генов, их различных участков и неоднородности темпов эволюции (Картавцев, Ли, 2006; Li, 1997; Абрамсон, 2009)

Известно, что таксоны высшего ранга существуют дольше, чем таксоны бол-зе низкого ранга (Simpson, 1961; Nei, 1987). Таксономисты, за редким исключением, согласны с тем, что высшие таксоны (более или менее крупные группировки видов) представляют собой результат эволюционной дивергенции (изменений в ходе филогенеза) (Майр, 1971). Таким образом, учитывая оценки между внутривидовым и межвидовым уровнями, можно объяснить эти данные, как характеризующие определенную модель видообразования. В частности, данные по ^-расстояниям позволяют сделать вывод, что среди представителей отряда камбалообразные преобладает географическая модель видообразования с накоплением случайных генетических изменений в течение длительного периода времени формирования подвидов, а затем видов и дальнейшей независимой эволюцией линий (Dobzhansky, 1955; Ayala et al., 1974; Bush, 1975; Templeton, 1981; Mayr, 1982; King, 1993, Harrison, 1998).

Один из центральных постулатов филогеографии состоит в том, что внутривидовые монофилетичные группировки (ветви), разделенные значительными генетическими расстояниями, как правило, возникают в результате длительных внешних (биогеографическнх) преград свободному потоку генов между популяциями (Avise et al., 1987). Ряд таких факторов, как подразделение популяций вида географическими преградами, расширение ареала и расселение, оказывают непосредственное влияние на характер внутривидовой генетической изменчивости (Абрамсон, 2007). Генетические различия приобретаются постепенно, в сформированных изолированных популяциях или их группах. В дальнейшем процесс дивергенции продолжается, диверсифицируются полувиды, близнецовые виды, роды и т.д. Таким образом, чем больше времени прошло с момента изоляции, тем большие генетические расстояния приобретаются между соответствующими таксонами (Картавцев, Ли, 2006). Представленные сравнительные данные по первичным последовательностям генов Со-1, Cyt-b и белковым маркерам позволяют твердо говорить о реализации этого процесса до уровня семейства (Картавцев, Ли, 2006) и даже отряда (Kartavtsev et ai., 2009а, b).

Одно из наиболее серьезных возражений против использования генетической дивергенции для определения видовых границ у разных 1 таксонов состоит в том, что длительная изоляция близкородственных групп, индикатором которой' служит величина дивергенции или /»-расстояния, сама по себе не является обязательным условием (а только предпосылкой) образования новых видов (Ferguson, 2002).

Анализ филогенетических отношений выполнен на основании генных деревьев. Представленные деревья показали' следующие принципиальные свойства: (1) обособленное положение таксонов внешней группы, (2) разделение на кластеры, включающие отдельные семейства Pleuronectiformes, и (3) разделение на отдельные подсемейства внутри Pleuronectidae, (4) наличие кластеров, которые представляют различные роды, (5) существование кластеров, объединяющих особей одного вида в пределах одного рода.

В качестве внешней группы для исследуемых камбалообразных использовали представителей отряда трескообразные (Gadiformes). Это связано с тем, что сестринская группа для Pleuronectiformes остается не выясненной, а их происхождение от Perci formes подвергается сомнению. Трескообразные показывают хорошее разрешение на построенных деревьях, формируя обособленный кластер.

Все деревья, построенные по трем различным наборам данных (гены Со-1, Cyt-b и объединенные последовательности), показывают, что семейства, представленные в работе, формируют монофилетичные ветви. Однако достоверно можно говорить только о монофилетичности сем. PIeuronectid£2, что'хорошо поддерживается данными по генам Со-1, Cyt-b, 12S- и 16S рРНК и морфологическим исследованием филогении (Cooper, Chapleau, 1998):

Все представители сем. Pleuronectidae формируют монофилетичные ветви. Основные представители подсемейств Hippoglossoidinae, Hippoglossinae собраны в обособленные кластеры. Подсемейство Pleuronectinae также можно считать монофилетичным, если исключить из него трибу Microstomini и рассматривать род Lepidopsetta в составе трибы Pleuronectini.

Полученные молекулярно-филогене'шческие данные поддерживают монофилию большинства родов сем. Pleuronectidae. Однако филогения представителей родов внутри семейства, особенно внутри подсемейства Pleuronectini остается неясной и требует дальнейшего исследования.

Род Pseudopleuronectes. На дереве, построенном по последовательностям гена Со-1 вид P. yokohamae формирует полифилетичный кластер с видами P. obscurus и P. herzensteini. На деревьях, построенных на основании гена Cyt-b и объединенных последовательностей эти виды объединены в монофилетичную группу (хотя кластеризация видов внутри груты отличается). Однако принадлежность этих видов к одному роду согласуется с последней таксономической ревизией, основанной на морфо-анатомических критериях Купера и Чаплау (Cooper, Chapleau, 1998), на особенностях строения сейсмосенсорной системы (Воронина, Евсеенко, 2001; Винников, 2007) и на сравнении электрофоретических спектров белков (Коваль, Богданов, 1982), а также с результатами сравнительного изучения морфологии икринок, эмбрионального и постэмбрионального развития личинок и предличинок дальневосточных камбал (Перцева-Остроумова, 1961)

Род Limanda. монофилия этого рода не была подтверждена, как и в сравнительном анатомическом исследовании Купера и Чаплау (Cooper, Chaplean, 1998) что может свидетельствовать о целесообразности дальнейшего подробного исследования этого таксона.

Валидность остальных представленных в исследовании родов сем. Pleuronectidae полностью поддерживается нашими данными.

Отдельные кластеры формируют практически все последовательности, принадлежащие к одному роду, и все особи, принадлежащие к одному виду также кластеризуются отдельно, за исключением видов Hippoglossoides robustus, Н. elassodon, Н. dubius, составляющих один объединенный кластер. На основании данных представленных в анализе виды Hippoglossoides elassodon и Н. robustus следует рассматривать как синонимы (Винников, 2006; Kartavtsev et al., 2007). Это предположение согласуется и с морфологическими данными (Ivankov et al., 2002; Картавцев и др., 2002; Vinnikov, 2003). По первоописанию предпочтение следует отдать видовому названию//, elassodon (Jordan, Gilbert, 1880).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шарина, Светлана Николаевна, Владивосток

1. Абрамсон Н.И. Филогеография: июги, проблемы, перспективы // Вестник ВОГиС. 2007. Т. 11, № 2. С. 307 331.

2. Абрамсон Н.И. Молекулярные маркеры, филогеография и поиск критерия разграничения видов // Труды Зоологического института РАН, Приложение № 1. 2009. С. 185 198.

3. Андрияшев А.П. Рыбы северных морей СССР. Определитель по фауне СССР. М.; Л.: Издательство АН СССР. 1954. 666 с.

4. Банникова A.A. Молекулярные маркеры и современная филогенетика млекопитающих // Журнал Общей биологии. 2004. Т. 65, №4. С.278 305.

5. Винников К.А., Иванков В.Н., Питрук Д.Л. Таксономический статус японской лиманды Pseudopleuronectes yokohamae и лиманды Шренка Р. schrenki (Pleuronectidae, по: Cooper, Chapleau, 1998) // Вопросы ихтиологии. 2006. Т. 46, № 3. С. 316 325.

6. Винников К.А., Иванков В.Н., Питрук Д.Л. Таксономические отношения трех видов камбал подсемейства Pleuronectinae Японского моря // Биология моря. 2007. Т. 33, № 2. С. 125 135.

7. Воронина Е.П. Особенности строения сейсмосенсорной системынекоторых представиелей семейства Pleuronectidae. Сообщение 1 // Вопросы ихтиологии. 2002. Т. 42, №5. С. 581 590.

8. Воронина Е.П., Евсеенко С.А. Морфология и систематика камбал рода »1.opsetta (sensu Norman, 1934) (Pleuronectidae, sensu Chapleau, Keast, 1988) // Вопросы ихтиологии. 2001. Т. 41, № 4. С. 442 454.

9. Гафуров Ю.М. Дезоксирибонуклеазы. Методы исследования и свойства. Владивосток. Дальнаука. 1999. 230 с.

10. Гречко В.В. Молекулярные маркеры ДНК в изучении филогении и систематики // Генетика. 2002. Т. 38, № 8. С. 1013 1033.

11. Картавцев Ю.Ф. Молекулярная эволюция и популяционная генетика: учебное пособие. Владивосток: Издательство Дальневосточного университета. 2005. 234 с.

12. Картавцев Ю.Ф. Молекулярная эволюция и популяционная генетика: учебное пособие / Ю.Ф. Картавцев. 2-е изд. Владивосток: Издательство Дальневосточного университета. 2009. 280 с.

13. Картавцев Ю.Ф., Ли Ж.-С. Анализ нуклеотидного разнообразия по генам цитохрома b и цитохромоксидазы 1 на популяционном, видовом и родовом уровнях // Генетика. 2006. Т. 42. № 4. С. 427-461.

14. Картавцев Ю.Ф., Свиридов В.В, Ханзава Н., Сазаки Т. Генетическая дивергенция видов дальневосточных красноперок рода Tribolodon (Pisces, Cyprinidae) ц близких таксонов // Генетика. 2002. Т. 38, № 9. С. 1 -14.

15. Коваль Е.З., Богданов Л.В. Строение электрофоретических спектров белков у разных видов дальневосточных камбал (Pleuronectiformes, Pleuronectidae)//Вопросы ихтиологии. 1982. Т. 22, вып. 4. С. 679-685.

16. Линдберг Г.У., Федоров В.В. Рыбы Японского моря и сопредельных частей Охотского и Желтого морей. Ч. 6. Teleostomi. Osteichthyes. Actinopterygii. XXXI. Pleuronectiformes. СПб.: Наука. 1993. 272 с.

17. Лукашов В.В. Молекулярная эволюция и филгенетический анализ. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний. 2009. 256 с.

18. Любецкий В.А., Горбунов К.Ю., Вьюгин В.В., Русин Л.Ю. Удалениешума в множественном выравнивании белковых последовательностей // Информационные процессы. 2005. Т. 5, № 5. С. 380 391.

19. Майр Э. Принципы зоологической систематики. М.: Мир. 1971. 454 с.

20. Майр Э., Линсли Э., Юзингер Р. Методы и принципы зоологической систематики. М.: Иностр. лит. 1956. 352 с.

21. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ./ Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. М.: Мир. 1984. 480 с.

22. Перцева-Остроумова Т.А. Размножение и развитие дальневосточных камбал. М.: Изд-во АН СССР, 1961. 484 с.

23. Расе Т.С. О таксономии малоротых камбал (Pleuronectidae, Pleuronectini) // Вопросы ихтиологии. 1996. Т. 36, № 4. С. 569 571.

24. Солдатов В.К., Линдберг Г.У. Обзор рыб дальневосточных морей // Известия ТИНРО. 1930. Т. 5, XLVIII. 576 с.

25. Таранец А .Я. Краткий определитель рыб советского Дальнего востока и прилежащих вод // Известия ТИНРО. 1937. Т. 11. 200 с.

26. Фадеев Н.С. Распространение и систематика тихоокеанских палтусовидных камбал рода Hippoglossoides // Известия ТИНРО. 1978. Т. 102. С. 3-18.

27. Шарина С.Н., Картавцев Ю.Ф. Филогенетический анализ камбал (Teleostei, Pleuronectiformes) основанный на исследовании нуклеотидных последовательностей гена цитохромоксидазы 1 (Со-1) // Генетика. 2010. Т. 46, № 3. С. 4Э1-407.

28. Шедько C.B. Филогения митохондриальной ДНК лососевых рыб подсемейства Salmoninae: анализ последовательностей гена цитохрома b II Генетика. 2002. Т. 38, № 3. С. 357 367.

29. Ahlstrom E.H., Amaoka К., Hensley D.A., Moser H.G., Sumida B.Y. Pleuronectiformes: development. In: Moser H.G., Cohen D.M., Fahay M.P., Kendall A.W. Jr, Richardson S.L. (eds). Ontogeny and systematics of fishes.

30. Special publication 1. American Society of Ichthyologists and Herpetologists, Lawrence, KS. 1984. P. 640-670.

31. Amaoka K. Studies on the sinistral flounders found in the waters around Japan. Taxonomy, anatomy and phylogeny // Journal of the Shimonoseki University of Fisheries. 1969. Vol. 18. P. 65 310.

32. Attardi G. Animal mitochondrial DNA: an extreme example of genetic economy // International Review of Cytology. 1985. Vol. 93. P. 93 145.

33. Avise J.C. Phylogeography. The history and formation of species. Harvard University Press, 2000. 447 p.

34. Avise, J.C., Walker D. Species realities and numbers in sexual vertebrates: Perspectives from an asexually transmitted genome // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1999. Vol. 96. P. 992 995.

35. Ayala F.J., Tracey M.L., Hedgecock D., Richmond R.C. Genetic differentiation during the spetiation process in Drosophila // Evolution. 1974. Vol. 28. P. 576-592.

36. Azevedo M.F.C., Olivera C., Pardo B.G., Martinez P., Foresti F. Phylogenetic analysis of the order Pleuronectiformes (Teleostei) based on sequences of 12S and 16S mitochondrial genes // Genetics and Molecular Biology. 2008. Vol. 31. P. 284-292.

37. Berendzen P.B., Dimmick W.W. Phylogenetic relationships of Pleuronectiformes based on molecular evidence // Copeia. 2002. Vol. 3. P. 642652.

38. Birky C.W. The inheritance of genes in mitochondria and chloroplasts: laws, mechanisms, and models // Annual Review of Genetics. 2001. Vol. 35. P. 125148.

39. Brown W.M., George M. Jr., Wilson A.C. Rapid evolution of animalmitochondrial DNA // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1979. Vol. 76. P. 1967 1971.

40. Bush G.L. Modes of animal speciation // Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 1975. Vol. 6. P. 339 364.

41. Chabanaud P. Le probleme de la phylogenese des Heterosomata // Bulletin of the Institute of Oceanography and Fisheries. (Monaco). 1949. Vol. 950. P. 1 -24.

42. Chapleau F. Pleuronectiform relationships: A cladistic reassessment // Bulletin of Marine Science. // 1993. Vol. 52. P. 516 540.

43. Chapleau F., Keast A. A phylogenetic reassessment of the monophyletic status of the family Soleidae, with notes on the suborder Soleoidei // Canadian Journal of Zoology. 1988. Vol. 66. P. 2797 2810.

44. Cooper J.A., Chapleau F. Monophyly and intrarelationships of the family Pleuronectidae (Pleuronectiformes), with a revised classification // Fishery Bulletin. 1998. Vol. 96. P. 686-726.

45. Dobzhansky Th. Evolution, genetics and man. Wiley and Chapman & Hall, New York, London. 1955. 398 p.

46. Eschmeyer W.H. Catalog of the genera of recent fishes. California Academy of Sciences. San Francisco. 1990. 700 p.

47. Eschmeyer W.N. Catalog of Fishes. California Academy of Sciences, San Francisco. 1998. 2905 pp.

48. Eschmeyer W.H., Herald E.S. A field guide to Pacific coast fishes of North America from the Gulf of Alaska to Baja California. The Peterson Field Guide Ser. N28, XII. 1983. 336 p.

49. Eyre-Walker A., Smith N. H., Maynard Smith, J. How clonal are human mitochondria? // Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 1999. Vol. 266. P. 477-483.

50. Felsenstein J. Cases in which parsimony or compatibility methods will be positively misleading // Systematic Zoology. 1978. Vol. 27. P. 401 410.

51. Felsenstein J. Inferring phylogenies. Sanderland, Massachusetts: Sinauer Associates Inc. 2004. 664 p.

52. Ferguson J.W.H. On the use of genetic divergence for identifying species // Biological Journal of the Linnean Society. 2002. Vol. 75. P. 509 516.

53. Froese R., Pauly D. Editors. FishBase. World Wide Web electronic publication. 2010. www.fishbase.org, version (05/2010).

54. Gill T. Synopsis of the pleuronectoids of the eastrn coast of North America //Proceedings of the Academy of Natural Sciences of Philadelphia. 1864. № l.P. 214-224.

55. Hall B. Phylogenetic trees made easy. A how-to manual for molecular biologists. Sinauer Associates, Inc., Sunderland. 2001. 179 p.

56. Harrison R.G. Linking evolutionary patter and process: the relevance of species concept for the study of speciation. In: Howard D.J., Berlocher S.H. (eds) Endless forms: species and speciation. Oxford University Press, Oxford. 1998. P. 19-31.

57. Hasegawa M., Kishino H., Yano T. Dating of the humanape splitting by a molecular clock of mitochondrial DNA // Journal of Molecular Evolution. 1985. Vol. 22. P. 160- 174.

58. Hasegawa M., Kishino H. Accuracies of the simple methods for estimating the bootstrap probability of a maximum-likelihood tree // Molecular Biology and Evolution. 1994. Vol. 11,№ 1. P. 142- 145.

59. Hayashi S., Kondoh H., Yasuda K., Soma G., Ikawa Y., Okada T.S. Tissue-specific regulation of a chicken 8-crystallin gene in mouse cells: nvolvement of the 5' end region'// European Molecular Biology Organization. 1985. Vol. 4. P. 2201 -2207.

60. Hebert P.D.N., Cywinska A., Ball S.L., de Waard J.R. Biological identifications through DNA barcodes // Proceedings of Royal Society, London, B: Biological Sciences. 2003. Vol. 270. P. 313 321.

61. Hebert P.D.N., Givinska A., Ball S.L., de Waard J.A. Biological dentification through DNA barcodes // Proceedings of Royal Society, London. 2002a. Vol. 270 (1512). P. 02PB0653.1 -02PB0653.9.

62. Hebert P.D.N., Ratnasingham S., deWaard J.A. Barcoding animal life:cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely rtelated spesies //i

63. Proceedings of Royal Society, London. 2002b. Vol. 270. (1512). P. 03BL0066.S1-03BL0066.S4.

64. Hebert P.D., Stoeckle M.Y., Zemlak T.S., Francis C.M. Identification of birds through DNA barcodes // PLoS Biology. 2004. Vol. 2. P. 312.

65. Hendy M.D., Penny D. A framework for the quantitative study of evolutionary trees // Systematic Zoology 1989. Vol. 38. P. 297 309.

66. Hillis D.M. Inferring complex phylogenies //Nature. 1996. Vol. 383. P. 130- 131.

67. Hilis D.M. Taxonimic sampling, phylogenetic accuracy, and investigator bias // Systems Biology. 1998. Vol. 47. P. 3 8.

68. Hoshino K., Amaoka K. Osteology of the flounder, Tephrinectes sinensis (Lacepede) (Teleostei, Pleuronectiformes), with comments on its relationships // Ichthyological Research. 1998. Vol. 45. P. 69 77.

69. Hubhs C.L. Flounders and soles from Japan collected by the United States i

70. Bureau of fisheries steamer "Albatross" in 1906 // Proceedings of the United States National Museum. 1915. Vol. 48. № 2082. P. 449 496.

71. Hubbs C.L. Phylogenetic position of the Citharidae, a family of flatfishes // Miscellaneous Publications Museum of Zoology University of Michigan. 1945. Vol. 63. P. 1-38.

72. Jin L., Nei M. Limitations of the evolutionary parsimony method of phylogenetic analysis // Molecular Biology and Evolution. 1990. Vol. 7. P. 82 -102.

73. Johns D.R. Mitochondrial DNA and disease // The New England journal of medicine. 1995. P. 638 644.

74. Johns G.C., Avise J.C. A comparative summary of genetic distances in the vertebrates from the mitochondrial cytochrome b gene // Molecular Biology and Evolution. 1998. Vol. 15. P. 1481-1490.

75. Jukes T.H. Cantor C.R. Evolution of protein molecules. In: Mammalian protein metabolism. 1969. P. 21 123. Edited by Munro, H.N. New York, USA: Academic Press.

76. Kartavtsev 1 Y.P., Sharina S.N., Goto T.,. Rutenko O.A., Zemnukhov V.V., Semenchenko A.A., Pitrukl D.L., Hanzawa N. Molecular phylogenetics of pricklebacks and other percoid fishes from the Sea of Japan // Aquatic Biology. 2009a. Vol. 8. P. 95-103.

77. Kim I-C., Kweon H-S., Kim Y.J., Kim C-B, Gye M.C., Lee W-O., Lee Y-S., Lee J-S. The complete mitochondrial genome of the javeline goby Acanthogobius hasta (Perciformes, Gobiidae) and phylogenetic considerations // Gene. 2004. Vol. 336.-P. 147- 153.

78. Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studues of nucleotide sequences // Journal of Molecular Evolution. 1980. Vol. 16. P. 111 120.

79. King M. Species evolution: the role of chromosome change. Cambridge University Press, Cambridge. 1993. 336 p.

80. Knowlton N. Molecular genetic analyses of species boundaries in the sea // Hydrobiologia. 2000. Vol. 420. P. 73 90.

81. Miya M., Saitoh K., Wood R., Nishida M., Mayden R.L. New primers for amplifying and sequencing the mitochondrial ND4/ND5 gene region of the Cypriniformes (Actinopterygii: Osteriophysi) // Ichthyological Research. 2006. P. 75-81.

82. Mayr E. Process of speciation in animals. In: Barigozzi C. (ed) Mechanisms of speciation. Alan R. Liss, New York. 1982. P. 1 20.

83. Naylor G., Brown W. Amphioxus mtDNA, chordate phylogeny, and the limits of inference based on comparisons of sequences // Systems Biology. 1998. Vol. 47. P. 61-76.

84. Naylor G.J., Collins T.M., Brown W.M. Hydrophobicity and phylogeny // Nature. 1996. Vol. 373. P. 565 566.

85. Nei M. Molecular evolutionary genetics. Columbia University Press, New York. 1987. 512 p.

86. Nei M., Kumar S. Molecular evolution and phylogenetics. Oxford University Press, New York. 2000. 333 p.

87. Nelson J.S. Fishes of the world. Second Edition. New York. Wiley and1. Sons. 1984. 523 p.

88. Nelson J.S. Fishes of the world. 4th ed. Wiley, New York. 2006. 601 p. Nielsen J.G. Pleuronectidae. Fishes of the north-eastern Atlantic and the Mediterranean. V. III. UNESCO. Paris. 1986. P. 1299 1317.

89. Norman J.R. A systematic monograph of the flatfishes (Heterosomata). V. 1. Psettodidae, Bothidae, Pleuronectidae, British museum (Natural History), London. 1934. 459 p.

90. Page R.D.M. TREEVIEW: an application to display phylogenetic trees on personal computers // Cabios Applications Note. 1996. Vol.12, № 4. P.357 358.

91. Pesole G., Sbisa E., Preparata G., Saccone C. The evolution of the mitochondrial D-loop region and the origin of modern man // Molecular Biology and Evolution. 1992. Vol. 9, № 4. P. 587-598.

92. Posada D., Grandal K.A. MODELTEST: testing the model DNAsubstitution//Bioinformatics. 1998. Vol. 14. P. 817-818.i

93. Ratnasingham S., Hebert P.D.N. BOLD: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org) // Molecular Ecology Notes. 2007. P. 1-10.

94. Regan C.T. The origin and evolution of the teleostean fishes of the order Heterostomata // Annals and Magazine of Natural History. 1910. Vol. 8, № 6. P. 484-496.

95. Regan C.T. Fishes. Article in Encyclopaedia Britannica, 14th ed. 1929. Vol. 19. P. 324-325.

96. Robins C.R., Ray G.C. A field guide to Atlantic coast fishes of North America. The Peterson Field Guide Ser. N 32, XII. 1986. 354 p.

97. Russo C.A.M., Takezaki N., Nei M. Efficiencies of different genes and different tree-building methods in recovering a known vertebrate phylogeny // Molecular Biology and Evolution. 1996. Vol. 13, № 3. P.525 536.

98. Sakamoto K. Interrelationships of the family Pleuronectidae (Pisces: Pleuronectiformes) // Memoirs of the Faculty of Fisheries, Hokkaido University. 1984. Vol. 31, № 1, 2. P. 95 215.

99. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press. 1989. 1626 p.

100. Showers C.P. Complete mitochondrial genomes and eutherian evolution // Journal of Mammalian Evolution. 2002. Vol. 9, № 4. P. 281 305.

101. Simpson G.G. Principles of animal taxonomy. The species and lower categories. Columbia University Press, NY. 1961.

102. StatSoft, Inc. STATISTICA (data analysis software system), version 6. www.statsoft.com. 2001.

103. Swofford D.L. PAUP*. Phylogenetic analysis using parsimony (*and other Methods). Version 4. Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts. 2002. 144 p.

104. Swofford D.L., Olsen G.J., Waddel P.J., Hillis D.M. Phylogenetic inference, molecular systematics. Hillis D.M., Moritz C., Mable B. (Eds.). Sunderland, Mass.: Sinauer Ass. 1996. P. 407-514.

105. Tajima F., Nei M. Estimation of evolutionary distance between nucleotide sequences // Molecular Biology and Evolution. 1984. Vol. 1. P. 269 — 285.

106. Tamura K. Estimation of the number of nucleotide substitutions when there are strong transition-transversion and G+C-content biases // Molecular Biology and Evolution. 1992. Vol. 9. P. 687 687.

107. Tamura K., Dudley J., Nei M, Kumar S. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0 // Molecular Biology and Evolution. 2007. Vol. 24, № 8. P. 1596-1599.

108. Tamura K., Nei M. Estimation of the number of nucleotide substitution in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees // Molecular Biology and Evolution. 1993. Vol. 10. P. 512 526.

109. Templeton A.R. Mechanisms of speciation population genetic approach // Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 1981. Vol. 12. P. 23 - 48.

110. Ursing B., Arnason U. Analyses of mitochondrial genomes strongly support hippopotamus whale clade // Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 1998. Vol. 265. P. 2251 2255.

111. Uzzel T., Corbin K.W. Fitting discrete probability distributions to evolutionary events // Science. 1971. Vol. 172. P. 1089 1096.

112. Vernau O., Moreau C., Catzeflis F.M., Renaud F. Phylogeny of flatfishes (Pleuronectiformes): comparisons and contradictions of molecular and morpho-anatomical data // Journal of Fish Biology. 1994. Vol. 45. P. 685 696.

113. Wakeley J. Substitution rate variation among sites in hypervariable region 1 of human mitochondrial DNA // Journal of Molecular Evolution. 1993. Vol. 37. P. 613-623.

114. Wallace D.C. Diseas of the mitochondrial-DNA // Annual Review of Biochemistry. 1992. Vol. 61. P. 1175 1212.

115. Ward R.D., Zemlak T.S., Innes B.H., Last P.A., Hebert P.D.N. DNA barcoding Australia fish species // Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. 2005. Vol. 360. P. 1847-1857.

116. Yusa T. Eggs and larvae of flatfish in the coastal waters of Hokkaido. 2. Early development of the flatfish Lepidopsetta mochigarei Snyder // Bulletin of the Hokkaido Regional Fisheries. Research Lab. 1957, № 15. P. 15 21.

117. Zharkikh A., Li W.H. Statistical properties of bootstrap estimation of phylogenetic variability from nucleotide sequences. I. Four taxa with molecular clock // Molecular Biology and Evolution. 1992a. Vol. 9. P. 1119-1147.

118. Zharkikh A., Li W.H. Statistical properties of bootstrap estimation of phylogenetic variability from nucleotide sequences. II. Four taxa without molecular clock //Molecular Biology and Evolution. 1992b. Vol. 35. P. 356 366.

Информация о работе

Шарина, Светлана Николаевна
кандидата биологических наук
Владивосток, 2010
ВАК 03.02.07

Диссертация

Молекулярно-филогенетическое исследование камбалообразных рыб (Pisces, Pleuronectiformes) дальневосточных морей России по нуклеотидным последовательностям генов цитохрома B и цитохромоксидазы 1 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы