Механизмы бимодального изменения всхожести семян в процессе ускоренного старения

Леонова, Екатерина Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы бимодального изменения всхожести семян в процессе ускоренного старения
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизмы бимодального изменения всхожести семян в процессе ускоренного старения"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УЩВЕЩПЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

-г 5 ден гт

На правах рукописи УДК 581.1

Леонова Екатерина Александровна

МЕХАНИЗМЫ БИМОДАЛЬНОГО ИЗМЕНЕНИЯ ВСХОЖЕСТИ СЕМЯН В ПРОЦЕССЕ УСКОРЕННОГО СТАРЕНИЯ

специальность 03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва - 2000

Работа выполнена на кафедре биофизики Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

В.А. Веселовский

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, академик РАЕН кандидат биологических наук

Ведущая организация:

Н.В. Обручева К.Г. Гуревич

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН (г. Пущино)

Защита диссертации состоится " 2000 г. в 15-*и часов

на заседании Диссертационного совета № к053.05.68 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, г. Москва, Воробьёвы горы, Биологический факультет МГУ, кафедра биофизики.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан "^Р" 2000 г.

Учёный секретарь Диссертационного совета:

доктор биологических наук, профессор/ Б.А. Гуляев

п а 7. о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальпость проблемы. При хранении семена стареют, теряют качество и жизнеспособность. Исследование механизма этого процесса является актуальной задачей физиологии и биофизики семян. Его лучшее понимание способствует разработке методов неповреждающего контроля состояния семян и прогнозирования сроков сохранения ими жизнеспособности.

Старение семян - это однонаправленный процесс [Priestly, 1986; Smith, Berjak, 1995]. Его динамика зависит от генетических особенностей семян, условий созревания на материнском растении, послеуборочного дозревания, механических повреждений, условий хранения и др. Поскольку по продолжительности жизни семена распределены нормально, то при хранении доля жизнеспособных семян в партии уменьшается по сигмоидной кривой [Ellis et al., 1982]. Однако всхожесть семян пониженного качества может изменяться более сложным образом: сначала возрасти, а позже, одновременно с жизнеспособностью, упасть. Улучшение всхожести семян наблюдали при тепловом воздействии [Priestley, 1986; Реймерс, 1987], при экспонировании в магнитном или электрическом полях [Аносова и др., 1992; Аксёнов и др., 1996], лазерном и ионизирующем облучении [Гудков, 1985; Кузин, 1995] и др.

Двухфазное изменение функциональной активности организмов при нарастании интенсивности воздействия, -.хорошо известное явление (фармакологическая инверсия, правило Арндта-Шульца, гормезис). Реже наблюдают более сложную бимодальную зависимость, которая получила название "парадоксальной", т.к. малые дозы оказывают больший эффект, чем средние. Однозначного объяснения этим явлениям до сих пор не существует [Александров, 1985; Кузин, 1995; Бурлакова, (ред.), 1999].

Нами обнаружено бимодальное изменение всхожести семян гороха при ускоренном старении (экспонирование семян при повышенной температуре и влажности) [Veselova et al., 1996].

Пелью работы было исследование явления бимодального (трёхфазного, парадоксального) изменения всхожести семян гороха и огурцов и биофизических механизмов, лежащих в его основе.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Выявить условия ускоренного старения, при которых имеет место би-

модальное изменение всхожести семян;

2. На основании ростовых характеристик, фосфоресценции при комнатной температуре, флуоресценции хлорофилла и утечки электролитов из семян определить качественный состав (наличие фракций) изучаемых партий семян и проследить за его изменением в процессе ускоренного старения;

3. Выделить фракции семян, отличающиеся по качеству, и сопоставить их физиолого-биохимические характеристики;

4. Для проверки предполагаемого механизма бимодального изменения всхожести семян построить математическую модель.

Научная новизна работы. Впервые выявлены условия ускоренного старения, при которых имеет место бимодальное изменение всхожести семян гороха и огурцов. Феномен более заметно выражен у партий семян низкого качества и наблюдается при условии постепенного (плавного) увеличения дозы действующего фактора, который не вызывает гибель семян. Показано наличие в популяции стареющих семян трёх дискретных фракций: жизнеспособные всхожие семена, из которых вырастают нормальны? проростки (I фракция), жизнеспособные невсхожие семена, дающие ненормальные проростки (II фракция) и мёртвые (III фракция). У семян II фракции синтез белка, накопление ß-тубулина и репликация ДНК (2С -> 4С) до проклё-вывания не нарушаются. После проклёвывания удвоение ДНК замедляется и рост корня останавливается. Показано возникновение гипоксии у зародышей быстро набухающих семян гороха II фракции. Предположено, что торможение удвоения ДНК вызвано постгипоксическим окислительным стрессом. Улучшение качества ослабленных семян в ходе ускоренного старения, по-видимому, происходит вследствие термоиндуцированных структурных перестроек в мембранной системе клеток семени, замедляющих процесс их гидратации. Медленное набухание уменьшает вероятность гипоксии и последующего стресса у семени. Исходя из предположения, что скорость поступления воды в клетки определяется степенью открытости мембранных пор, построена математическая модель, описывающая бимодальное изменение всхожести семян в процессе ускоренного старения.

Практическая значимость работы. Показано, что без проращивания, по уровню люминесценции воздушно-сухих семян, можно контролировать качественный состав партии. Отобрав ослабленные семена, можно улучшить качество исходной партии. Фракционирование воздушно-сухих семян поз-

воляет иметь однородный семенной материал для физиолого-биохими-ческого исследования. Гипоксическое состояние у зародышей семян гороха во время набухания можно обнаружить по фосфоресценции порфиринов.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на III съезде общества физиологов растений России "Физико-химические проблемы физиологии растений" (Пенза, 1996), конференции студентов и аспирантов России "Ломоносов-97" (Москва, 1997), II международном научно-практическом симпозиуме по селекции и семеноводству (Аранжеловач, Югославия, 1997), международной школе "Проблемы теоретической биофизики" (Москва, 1998), Н-м биофизическом съезде России (Москва, 1999), IV съезде общества физиологов растений и международной конференции "Физиология растений - наука III тысячелетия" (Москва, 1999) и школе-конференции молодых ученых России "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000).

Публикапии. По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Структура и объём и диссертации. Диссертация написана по традиционному плану и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы (Aie наименований, из них 4/Д/зарубежных источников). Работа изложена на /fj { страницах машинописного текста, иллюстрирована рисунками и Д таблицами.

1. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектами исследования служили стандартизированные семена гороха (Pisum sativum L.) и огурцов (Cucumis sativus L.). Используемые сорта гороха: "Немчиновский-91" (урожай 1995г.), "Норд" (1994г.), "Вега" (1996г.), "Карина" (1996г.), "Финал" (1996г.). Сорта "Немчиновский-91" и "Норд" были предоставлены НПО "Немчиновка", Московская обл., сорт "Вега" -НИИССОК, сорта "Карина" и "Финал", а также семена огурцов сорта "Тирия" (урожай 1995г.) были предоставлены CPRO-DLO (Голландия).

Ускоренное старение семян гороха проводили в течение 1-16 суток в камере с 85% относительной влажностью воздуха при 40°С. При старении влажность семян возрастала от 9,8 до 18,0 % в расчёте на сухой вес и далее оставалась постоянной.

При контролируемом повреждении семена гороха сначала помещали в

камеру с 85% относительной влажностью воздуха при 20°С. Когда влажность семян достигала 21% на сухой вес, их герметически запечатывали в пакеты из алюминиевой фольги и экспонировали 1-16 суток при 40°С [Dourado, Roberts, 1984].

После ускоренного старения и контролируемого повреждения для последующего использования семена подсушивали до постоянного веса в камере с 32% относительной влажностью воздуха при 20°С.

Всхожесть семян определяли по Международным правилам [ISTA, 1996]. Семена (4 пробы по 25 штук) проращивали в увлажнённых водопроводной водой рулонах фильтровальной бумаги при 20°С. Длину осевых органов проростков измеряли со 2 по 6 сутки от начала набухания. Жизнеспособными считали наклюнувшиеся семена, у которых длина осевых органов превышала половину ширины семени (> 4 мм). Семена, которые до 6 суток не проклевывались, считали мёртвыми (нежизнеспособными). Всхожие семена на 6 сутки проращивания давали нормально развитые проростки. Проростки гороха с повреждённым подсемядольным и надсе-мядольным коленами считали ненормальными, а семена невсхожими.

Содержание воды в семенах после старения определяли весовым методом в трех повторах по 5 г, в соответствии с рекомендациями Международных правил [ISTA, 1996], содержание воды рассчитывали на сырой вес.

Выход электролитов измеряли после 1,5 ч экспонирования каждого семени в 2 мл дистиллированной воды, то есть в период активной реорганизации мембранных структур клетки при регидратации сухого семени [Simontacchi, Puntarulo, 1994]. Электропроводность среды определяли бесконтактным методом при помощи Oscillotitrator ОК-302 (Венгрия).

Флуоресненпию хлорофилла v воздушно-сухих семян (ФХ) возбуждали светом лампы с галогеновым циклом через интерференционный светофильтр (656 нм). Флуоресценцию хлорофилла регистрировали при 730 нм. Конструкция установки описана в работе [Jalink, 1998].

Фосфоресиениию воздушно-сухих семян при комнатной температуре (ФКТ) регистрировали на установке с двухдисковым фосфороскопом Бек-кереля, при помощи которого объект освещали периодическими вспышками белого света: длительностью 6 мс (освещённость семени в этот момент составляла 60 клк). В промежутках между вспышками возбуждающего света в

течение 3-18 мс регистрировали фосфоресценцию. Детектором излучения служил фотоумножитель ФЭУ-79. Длительность измерения свечения одного семени составляла 2-3 с. На этой же установке регистрировали фосфоресценцию порфиринов набухающих семян [Веселовский, Веселова, 1990].

Потребление кислорода зародышевыми осями и семядолями семян гороха контролировали электрохимическим методом при помощи электрода Кларка (Е5047 pOj) с диаметром платинового электрода 20 мкм. Объем измерительной камеры, в которую помещали зародышевую ось или фрагмент семядоли (средний вес каждой 7-9 мг), равен 60 мкл. Для определения дыхания целых семян гороха использовали камеру объемом 1мл. Поглощение кислорода измеряли в течение 20-30 мин до нулевого уровня р02 в камере, затем камеру вновь заполняли насыщенной воздухом водой. Измерения повторяли до установления постоянной скорости поглощения кислорода.

Синтез белка в зародышевых осях семян гороха при прорастании определяли по включению [358]метионина (препарат отечественного производства, с удельной активностью 40 МБк/моль; инкубационная среда содержала 100 мкл препарата в мл). Перед инкубацией с меткой семена замачивали в воде в течение 3 ч (до проклёвывания) и 19 ч (момент проклёвывания). Радиоактивность измеряли сцинтилляционным счётчиком и выражали в имп/мин на мг белка. Общее поглощение метки тканью выражали как сумму ТХУ-растворимой и ТХУ-осаждаемой радиоактивностей, в имп/мин на мг белка [Скаженник, 1982; Арабова, 1996].

О прохождении клеточного цикла в клетках кончиков зародышевых корешков прорастающих семян гороха судили по репликации ДНК и синтезу белка Р-тубулина. Определение проводили до и после 3, 24, 48 и 72 ч набухания семян.

Репликацию ДНК оценивали методом проточной цитофотометрии. ДНК клеточных ядер окрашивали красителем Propodium Iodide, специфическим для нуклеиновых кислот. Максимум поглощения комплекса красителя с ДНК находится при 535 нм, а флуоресценции - при 617 нм. Интенсивность флуоресценции пропорциональна плоидности ДНК (2С, 4С, 8С ...). О накоплении ДНК судили по увеличению отношения 4С к 2С [Bino et al., 1992; 1993].

Метод определения накопления fi-тубулина. Белки выделяли в денатурирующих условиях с использованием SDS. Использовали модифицированный Лемли буфер (рН = 9). Концентрацию белков измеряли по пог-

лощению раствором белков света длиной волны 595 нм. Одномерный PAG электрофорез в готовых гелевых пластинах проводили согласно методу, описанному в инструкции (ExcelGel SDS). После PAG электрофореза белки переносили с геля на PVDF (Hybond- polyvinylidene difluoride) мембрану. После блоттинга мембрану инкубировали с анти-Р-тубулин антителами, по уровню хемилкшинесценции судили о накоплении Р тубулина [Castro, 1998].

Математический анализ результатов исследования. Результаты обрабатывали с помощью математических программ статистической обработки данных исследования: определение средней и ошибки средней. Применяли корреляционный анализ.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. ^Варьирование всхожести семян гороха при ускоренном старении. В таблице 1 показано, что в ходе 16 дневного ускоренного старения всхожесть семян гороха изменяется сложным образом.

До 12 суток число жизнеспособных (проклюнувшихся) семян практически не изменялось. В то же время всхожесть семян (число нормальных проростков) сохранялась постоянной до 5 суток, затем она падала от 82 до 72%, но к 8-10 суткам старения возрастала и даже превышала исходную. Разницу между жизнеспособностью и всхожестью семян определяет ко-

Таблица 1.

Изменение характеристик семян и проростков гороха при ускоренном старепии.

1 Время ускоренного старения, сутки Жизнеспособность, % Всхожесть на 6 сутки проращивания, % Длина осевых органов на б сутки проращивания, % Содержание воды в семенах, подсушенных до постоянного веса, % от сырого веса Фосфоресценция семян, подсушенных до постоянного веса, отн. ед. Выход электролитов, отн. ед.

0 96 82±1.8 8.0 ± 0.4 9.82 ± 0.08 18.9 ± 1.1 24.0± 1.8

3 96 82 ± 1.8 7.6 ±0.4 9.83 ± 0.09 19.3 ± 1.1 24.4± 1.9

5 96 72 ± 3.4 5.4 ± 0.4 9.59± 0.09 31.9 ±1.6 37.4± 2.2

7 96 72 ± 2.9 5.4 ± 0.5 9.57± 0.08 33.6 ±1.6 39.8± 2.2

8 96 92 ± 1.7 8.7 ±0.3 9.91 ± 0.09 17.7 ± 1.0 19.3± 1.8

9 96 92 ±1.7 8.2 ± 0.3 — 20.6 ±1.1 —

10 96 84 ±2.1 8.2 ± 0.4 9.67 ± 0.08 21.4 ±1.5 30.5± 1.8

12 96 64 ±2.5 4.9 ± 0.4 9.38 ± 0.09 34.2 ± 1.9 42.3± 3.6

13 90 42 ± 5.4 3.0 ± 0.4 0.со ± о.сз 57.7 ± 4.7 52.5* 4.ъ

14 70 24 ±4.1 2.9 ± 0.4 8.54 ±0.08 70.2 ± 4.5 61.1± 4.9

16 6 0 0 8.18 ± 0.09 86.2 ± 2.5 81.0± 3.4

личество ненормальных проростков. Следовательно, варьирование всхожести в первую декады старения есть изменение соотношения числа семян, из которых вырастали нормальные или ненормальные проростки. После 12 суток всхожесть и число жизнеспособных семян быстро снижались пропорционально времени тепловой обработки за счет появления мертвых семян.

Однако, характер изменения всхожести семян гороха при старении менялся от опыта к опыту. Причину этого мы попытались выяснить.

2.2. Факторы, определяющие бимодальное изменение всхожести семян во время старения.

Всхожесть семян гороха. На рисунке 1 (А, Б и В) представлены результаты ускоренного старения семян с 98, 82 и 58% исходной всхожестью. Под влиянием теплового воздействия жизнеспособность партии семян сначала не изменялась, а затем снижалась (кривые 1) с ростом мёртвых семян (кривые 3). Чем ниже исходная всхожесть, тем заметнее ее колебания (кривые 2). В партии семян с 98% всхожестью они не превышают ошибки опыта.

Влажность семян. Однонаправленное снижение всхожести гороха (Финал, Карина, Норд) с разным исходным содержанием воды (16,45, 11 и 9.8%), и набравших при предварительном увлажнении 22, 21 и 20% воды, при контролируемом повреждении происходило тем быстрее, чем выше была влажность семян (рис. 2). Колебаний всхожести не наблюдали.

Условия старения. При контролируемом повреждении тепловому воздействию подвергают более влажные семена (21%), чем при ускоренном старении (18%). В партиях гороха с одинаковой исходной всхожестью при контролируемом повреждении число мёртвых семян возрастало с 4 дня воздействия, а при ускоренном старении - с 12 дня. В первом случае происходило только снижение всхожести, тогда как во втором имело место ее колебание (рис. 3). По-видимому, при контролируемом повреждении в более влажных семенах активнее протекают деструктивные процессы, чем во время ускоренного старения при меньшей влажности.

Степень зрелости семян. Методом, основанным на ФХ воздушно-сухих семян [1аНпк, 1998], были отобраны семена огурцов разной степени зрелости и подвергнуты контролируемому повреждению. Зрелые семена содержали меньше воды по сравнению с незрелыми (5,7 и 6,5%, соответственно).

Время ускоренного старения, сутки

РИС.1. Изменение количества (в %) жизнеспособности (1), всхожести (2) и мёртвых семян (3) гороха сорта "Нем-чиновский" при ускоренном старении. Исходная всхожесть семян гороха 98 (А), 82 (Б) и 58% (В).

Время контролируемого повреждения, сутки

РИС.2. Изменение качественного состава партий сортов гороха: "Норд" (А), "Карина" (Б) и "Финал" (С) при контролируемом повреждении. Семена, из которых выросли нормальные проростки - белый, ненормальные проростки - серый столбик. Мёртвые семена - чёрный столбик.

Семена огурцов теряли всхожесть значительно медленнее, чем семена гороха (влажность последних 9,8%). Незрелые семена огурцов в ходе контролируемого повреждении начинали погибать через неделю, тогда как зрелые - только после 4 недель старения. Гибели зрелых семян могло предшествовать небольшое колебание всхожести (рис. 4).

Таким образом, бимодальное изменение всхожести семян, отражающее варьирование числа нормальных и ненормальных проростков, всегда лучше выражено в партии семян низкого качества. Причем, чем быстрее семена теряют жизнеспособность (вследствие более интенсивного влаготеплового воздействия), тем меньше вероятность наблюдения бимодального изменения их всхожести.

Пытаясь понять причину колебания всхожести семян гороха, проследили за изменением физико-химических характеристик воздушно-сухих семян

Время старения,

сутки

РИС.3. Изменение доли всхожих (1а, 16) мёртвых (2а, 26) семян гороха сорта "Немчиновский" при ускоренном старении (а) и контролируемом повреждении (6).

О 012 345678 Время контролируемого повреждения, недели

РИС.4. Изменение доли всхожих (1а, 16) мбртвых (2а, 26) семян огурцов сорта "Тирия" в процессе контролируемого повреждения; а - зрелые семена, б - незрелые семена.

при ускоренном старении. Известно, что качество семян можно тестировать без проращивания путем определения скорости утечки из них электролитов и других веществ в дистиллированную воду [Hill et al.,1988], а также с помощью регистрации уровня ФКТ [Веселова и др., 1995] и ФХ [Jalink et al., 1998].

2.3. Люминесцентные характеристики, выход электролитов в стареющих семенах.

Было сопоставлено изменение люминесцентных характеристик, выхода электролитов и содержания воды в семенах гороха, подвергнутых ускореннму старению, со всхожестью семян и ростом проростков (длина осевых органов).

Из таблицы 1, видно, что средняя длина осевых органов проростков варьирует подобно всхожести семян. Коэффициент корреляции между этими показателями равен 0,97. То есть, о качестве семян можно судить как по всхожести последних, так и по средней длине осевых органов.

Когда после 5-7 суток старения всхожесть семян в пробах снижается, выход электролитов возрастает. Напротив, восстановление исходной всхожести на 8-10 сутки сопровождается уменьшением выхода электролитов (коэффициент корреляции = 0,96).

ФКТ воздушно-сухих семян после ускоренного старения изменяется в противофазе со всхожестью (табл. 1). Коэффициент корреляции = - 0,99.

При контролируемом повреждении гороха (Финал, Карина, Норд), когда качество семян ухудшалось, также наблюдали рост ФКТ и ФХ (рис. 5). Исключение составлял сорт "Норд", у которого ФХ была слабой и не изменялась, т.к. семена не содержали хлорофилла (рис. 5, кривая 1а). Коэффициенты корреляции между жизнеспособностью, всхожестью, ФКТ и ФХ приведены в таблице 2. Люминесцентные характеристики лучше коррелируют со всхожестью, чем с жизнеспособностью семян.

а н о

н ©

/к

я^и^в—---- 2а

1а

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Время контролируемого повреждения, сутки

РИС.5. Изменение ФКТ (а) и ФХ (6) семян гороха сортов: "Норд" (1), "Карина" (2) и "Финал" (3) при контролируемом повреждении.

Таблица 2.

Коэффициенты корреляции между жизнеспособностью, всхожестью и люминес-пеипией (ФКТ и ФХ) семян трёх сортов гороха.

"Норд" "Карина" "Финал"

ФКТ ФХ ФКТ • ФХ ФКТ

Жизнеспособность -0,85 -0,60 -0,80 -0,82 -0,82

Всхожесть -0,89 -0,82 -0,92 -0,98 -0,99

Из таблицы 1 видно, что с уменьшением всхожести семян возрастают среднеквадратичные ошибки измерений. Это означает увеличение гетерогенности популяции либо за счет возрастания разнокачественности семян, либо вследствие появления новой фракции. Для проверки были построены распределения семян в пробах по уровню ФКТ и ФХ, а также выходу электролитов и длине осевых органов.

2.4. Распределение семян по ФКТ. ХФ. выходу электролитов и длине осевых органов.

На рисунке 6 видно, что распределение исходных семян (всхожесть 82%) по ФКТ имеет один максимум (I), 20 отн.ед., и небольшое плечо. После 5 суток старения (всхожесть 72%) в распределении появляется второй'мак-симум (II), который объединяет семена с уровнем ФКТ вдвое более

50 40 30 20 10 0 50 40 30 20 10 0

5 суток

а 50

а. 30 н

и 20 а

« 10

о О fr

о 50 а

er- 40 30 20 10 О

50 40 30 20 10 О

8 суток

14 суток

16 суток

высоким, чем у исходных. Однако 50 о суток

после 8 суток в распределении вновь виден один максимум (I). После снижения всхожести семян до 24% (14 суток старения) распределение опять становится бимодальным, но в нём уже нет максимума I, а появляется III фракция. Она включает семена, свечение которых превышает исходные в три и более раз. После 16 суток распределение мертвых семян гороха становится широким унимодальным.

Анализ распределения семян по выходу электролитов показал, что как и в случае ФКТ, в изначально однородной партии после 5-7 суток ускоренного старения появляется II фракция семян, которая исчезает на 8-10 сутки старения.

Распределения проростков по длине осевых органов (на 6 день проращивания) тоже изменялись. После 5 суток старения появлялась фракция "ненормальных" проростков с короткими осевыми органами (4 см и меньше). На 8 сутки старения, когда всхожесть семян

увеличивалась, средняя длина осевых органов проростков соответствовала "контрольным" значениям. Когда всхожесть семян упала до 24%, длина проростков не превышала 4 см.

При контролируемом повреждении, судя по распределениям семян по ФКТ и ФХ, фракционный состав тоже изменялся. Так, в партии гороха сорта "Финал" через 4-6 суток возникала II фракция. Из её семян вырастали ненормальные проростки. Семена с уровнем свечения, втрое превышающим исходный, не прорастали.

Таким образом, анализ фракционного состава стареющих партий воз-

40 60 80 100 133 ФКТ, отн.ед.

РИС.6. Распределение воздушно-сухих семян гороха сорта "Немчиновскин" по уровню ФКТ после разных сроков ускоренного старения. Цифрами I, II и III показаны фракции.

душно-сухих семян физико-химическими методами показал, что колебание всхожести связано с появлением и исчезновением II фракции. Причём, переход семян из одной фракции в другую происходит достаточно быстро и семян с промежуточными характеристиками в партии было мало. Например, II фракция возникала с 4 на 5 сутки и пропадала с 8 на 9 сутки старения. То есть появление ослабленных семян и возвращение их во фракцию нормальных есть не постепенный, а, скорее, "скачкообразный" процесс.

Семена II фракции быстрее выделяли электролиты в дистиллированную воду по сравнению с семенами I фракции, что является характерным признаком повреждения мембран у семян при старении [Smith, Berjak, 1995].

Высокий уровень ФКТ воздушно-сухих семян II фракции свидетельствует о более низком содержании в них воды, поскольку известно, что уровень ФКТ обратно пропорционален влажности семян [Веселова и др., 1981]. Проверка показала, что после 5-7 суток ускоренного старения влажность высушенных семян гороха немного уменьшилась (от 9,8 до 9,6%). На 8-10 сутки, когда из партии исчезли семена II фракции, влажность воздушно-сухих семян была близка к первоначальной. При увеличении срока старения, когда в популяции возрастала доля мертвых семян, влажность семян постепенно уменьшалась и к 16 суткам составляла 8,2%.

Вероятно, у семян II фракции выросла проницаемость клеточных мембран и покровов семени не только для выхода электролитов, но и для поступления воды. Поэтому они быстрее набухали. После 14 ч регид-ратации на фильтровальной бумаге семена II фракции содержали 57% воды, тогда как семена I фракции - только 38%. Через двое суток влажность семян обеих фракций составляла приблизительно 60%.

Набухая быстрее, семена II фракции проклевывались раньше, чем семена I. Однако их проростки плохо развивались, на 3-4 сутки прекращали рост и позже погибали. Быстрое поступление воды в семя может повредить клетки и даже вызвать гибель зародыша [Alison et al., 1978]. Замедление набухания осмотиками или другими способами увеличивает всхожесть ослабленных семян. Считают, что при медленной регидратации в семени возникает меньше нарушений, а также увеличивается время действия репарационных механизмов [Tilden, Y/esí, 1985; Vcrtucci, 1989; Woodstock, Tag, 1981].

Измерение ФКТ воздушно-сухих семян и определение утечки электролитов показали, что в процессе ускоренного старения на 8 сутки умень-

шается проницаемость клеточных мембран для воды (семена переходят из II фракции в I). По-видимому, связанное с этим замедление темпа регид-ратации клеток и приводит к улучшению качества семян.

Но каким образом увеличение проницаемости клеточных мембран семян II фракции влияет на рост осевых органов семени и вызывает появление ненормальных проростков? Пытаясь ответить на этот вопрос, исследовали изменение скорости синтеза белка и интенсивности дыхания зародышевых осей в процессе старения. Синтез белков начинается уже в первые часы набухания семян [Вгау, 1987], а дыхание обеспечивает энергией начало ростовых процессов при прорастании [Обручева, Ковадло, 1985].

2.5. Характеристика синтеза белков и дыхания семян.

В опытах использовали семена гороха высокой всхожести, и поэтому в первые 8 суток ускоренного старения ее изменения были незначительными. Интенсивность синтеза белков по включению [358]метионина в зародышевые оси определяли после предварительного 19 часового набухания в воде состаренных и контрольных семян без оболочки.

До 8 суток старения включение [358]метионина в зародышевые оси медленно снижалось, хотя всхожесть практически оставалась постоянной. Анализ радиоавтографов полипептидов показал сходство в составе белков и лишь небольшое уменьшение синтеза высокомолекулярного белка 86 кД. При появлении в пробах мертвых семян включение радиоактивной метки резко падало и к 16 суткам старения полностью прекращалось.

Далее был сопоставлен синтез белков у семян I и II фракций, выделенных методом. ФКТ после б суток старения, с контрольными. Оказалось, что скорость включения радиоактивной метки в белки зародышевых осей семян II фракции близка к контрольной и несколько превышала таковую у I фракции (рис. 7). Анализ радиоавтографов не

а 1

РИС.7. Включение [З^метионина в белок зародышевых осей семян гороха сорта "Норд" при 28°С (белый столбик) и при 40°С (чёрный столбик). К(1) - контрольные семена, I фракция; 6(1) и 6(П) -1 и П фракции семян после б суток старения.

выявил достоверных различий по составу полипептидов у зародышевых осей семян I и II фракций. Даже после кратковременного теплового шока (после 19 ч предварительного набухания зародышей и трёхчасового прогрев при 40°С) не было выявлено существенных различий в устойчивости процесса синтеза белка у семян I и II фракций.

Таким образом, ненормальное развитие проростков из семян II фракции вряд ли связано с нарушением синтеза белков.

Измерение интенсивности дыхания единичных зародышевых осей после 15-17 ч набухания семян на фильтровальной бумаге показало, что при одинаковом времени набухания оси семян II фракции поглощали в 1,5 - 2 раза больше кислорода, чем I (скорость поглощения кислорода составляла 4,0 -3,5 и 2,2 - 2,0 мкл 02 на зародыш в ч, соответственно).

Поскольку дыхание и белоксинтезирующая система клетки в течение первых двух суток гидратации у семян гороха II фракции серьезно не изменялись," то было проверено, не связано ли нарушение роста и образование ненормальных проростков с торможением клеточного цикла? Для этого на стадии набухания семян гороха исследовали репликацию ДНК (показатель перехода клетки от фазы Gj митотического цикла к фазе G2) и накопление специфического белка клеточного цикла ß-тубулина, ответственного за формирование микротрубочек и необходимого для перехода клетки от фазы G2 к митозу [Castro, 1998].

2.6. Характеристика прохождения клеточного пикла.

Накопление ß-тубулина. На рисунке 8 представлена динамика накопления ß-тубулина у семян I (контрольные, 6 и 9 суток старения), II (6 суток старения) и III (16 суток старения) фракций. Мёртвые семена, образующие III фракцию, содержали лишь следовые количества ß-тубулина. У жизнеспособных семян после 3 ч набухания ß-тубулин оставался на таком же уровне, как и у сухих семян. За 48 ч набухания семена II фракции (6 суток старения) синтезировали примерно такое же количество ß-тубулина, как и контрольные. У семян I фракции (6 и 9 суток старения) синтез ß-тубулина начинался с некоторой задержкой, но через 72 ч зародышевые оси семян всех вариантов синтезировали примерно одинаковое количество ß-тубу-лина. Таким образом синтез ß-тубулина у семян II фракции не нарушался..

Репликация ДНК. В работе методом проточной цитофотометрии

^—старение набухаииб— 1о 1« 11« 19 Шм

Зч — —

48 ч «г

72 ч О» тт ~гг

РИС.8. Элеетроблотг динамики накопления Р-тубулина в кончиках корешков зародышевых осей семян гороха сорта "Норд". Верхний индекс - фракции семян, нижний - срок ускоренного старения (в сутках).

подтверждено, что клетки зародышевых осей сухих семян гороха имеют в основном 2С набор ДНК и, следовательно, покоятся на фазе 61 (или С0) клеточного цикла. Лишь очень небольшое количество клеток имело 4С ДНК (клетки на фазе 02). При прорастании семян увеличивалась доля ядер с 4С и появлялись ядра с 8С набором (рис. 9).

Набухание жизнеспособных семян сопровождалось увеличением отношения 4С/2С (рис. 10). У семян II фракции (6 суток старения) после прок-левывания рост 4С/2С тормозился, тогда как у семян I фракции (9 суток старения), которые позже проклевывались, удвоение ДНК продолжалось. Это позволило предположить, что замедление удвоения ДНК у семян II фракции в момент проклевывания является причиной нарушения роста их зародышевых осей и появления ненормальных проростков.

Но почему во время проклевывания клеточный цикл тормозится у семян II фракции и не нарушается у семян I фракции?

2.7. ФКТ набухающих семян гороха.

Ранее наблюдали, что при набухании у некоторых семян сои и фасоли появлялась ФКТ, которая пропадала после проклевывания [Веселова и др., 1988]. Было показано, что свечение представляет собой фосфоресценцию не содержащих металла порфиринов семядолей в условиях низкого парциального давления кислорода (последний является сильным тушителем фосфоресценции), которое устанавливается в результате медленной диффузии кислорода через семенную оболочку и его быстрого потребления зародышем при дыхании [Веселова и др., 1986]. То есть, нарастание ФКТ у семян при набухании означает, что зародыш находится в гипоксических условиях. Возможна ли такая ситуация при набухании семян гороха, а если да, то не может ли недостаток кислорода быть причиной торможения клеточного

цикла у клеток семян II фракции? Для ответа на эти вопросы проследили за изменением ФКТ семян разных фракций в процессе набухания.

Гидратация воздушно-сухих семян и их частей тушила ФКТ. Если набухшие зародышевые оси или семядоли помещали в замкнутую камеру с водой, то свечение постепенно возрастало за счет уменьшения содержания растворенного в воде кислорода, потребляемого при дыхании. Удаление из среды, окружающий зародыш, кислорода путем растворения сульфита натрия давало тот же эффект. На воздухе свечение затухало.

В первые 3 ч набухания интенсивность фосфоресценции семян снижалась до фона (рис. И ). У семян I и III фракции в последующие дни свечение не наблюдали. Однако, у большинства семян II фракции после 14 ч набухания оно возникало, постепенно возрастало и после проклё-вывания семян (48 ч) затухало. То

Оч

2С

72 ч

я ЕГ

РИС.9. Распределения ядер с разным содержанием ДНК (2С, 4С, 8С) в клетках кончиков (5 мм) зародышевых осей у сухих (0 часов) и после прорастания (72 часа) семян гороха сорта "Норд".

1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 О

/?ч ' /

i и6

t /

t / я

¡..-..v-'V Ш|6

— т ■ ; ^

РИС.10. Динамика репликации ДНК (4С/2С) в процессе набухания семян гороха сорта "Норд". Римским цифрами обозначены номера фракций, а нижними индексами - время ускоренного старения (в сутках). Стрелка указывает на момент проклёвывания семян П фракции.

есть, зародыши семян гороха II фракции, в отличие от зародышей I фракции, до момента проклевывания пребывали в гипоксических условиях. Из этих семян вырастали ненормальные проростки.

Гипоксия, тем не менее, не мешала репликации ДНК и накоплению Р-ту-булина в осях. То есть гипоксические условия, в которых пребывали зародыши семян гороха II фракции, не препятствовали подготовке клеток к делению. Катастрофическим для семян гороха II фракции, по-видимому, явился переход от гипоксических условий к нормальной аэрации после проклевывания. Именно в этот момент тормозилась репликация ДНК (рост отношения 4С/2С прекращался), что возможно стало причиной нарушения роста

проростков.

Таким образом первопричиной торможение репликации ДНК, и как следствие, прекращение роста зародышевых осей и образование ненормальных проростков из семян II фракции является возрастание проницаемости клеточных мембран в процессе ускоренного старения. С целью подтвердить предположение о зависимости бимодального изменения всхожести семян от проницаемости клеточных мембран, была разработана математическая модель.

Время набухания, часы

РИС.11. ФКТ порфиринов у набухающих ссмян гороха первой (I) и второй (II) фракций. Стрелка указывает на момент проклёвывания семян.

2.8. Математическая модель, описывающая бимодальное изменение всхожести семян при старепии [Веселова., Веселовский, Колупаев, Леонова, Чернавский, 1999].

В основу модели положена теория конформационных переходов в биологических макромолекулярных конструкциях. Мы исходили из следующих положений.

Проницаемость мембран для воды определяют поры. Существование и функциональная роль пор в мембранах растительной клетки, образуемых специальными белками - аквапоринами, в последнее время широко обсуждают, в частности, в процессе прорастания семян [Chispeels, Maurel, 1994; Inoue et al.,1995; Daniels et al., 1996; Maurel, 1997; Carvajal et al., 1998].

Поры в мембранах жизнеспособных семян могут быть "открытыми" или "закрытыми", на что указывает бимодальное распределение воздушно-сухих семян по влажности. Если поры закрыты, то воды в семени сохраняется больше, а при открытых порах - меньше. Промежуточные состояния неустойчивы и не реализуются.

Семя ведет себя как единое целое: все поры открываются или закрываются одновременно. Теоретическим обоснованием кооперативного поведения пор является характер сил, участвующих в переходе. Эти силы даль-иодействугощие, то есть распространяются на все семя. Отсюда следует, что

областью кооперативности является все семя, и оно может находиться в двух дискретных состояниях.

Состояние поры ("открыто"-"закрыто") определяет баланс "осмотических", упругих и сил молекулярного сцепления, соотношение которых зависит от влажности семени. Условно названные нами "осмотические" силы (хотя, на самом деле, они не являются таковыми) возникают при увеличении объёма биополимеров во время гидратации. Упругие свойства, то есть модуль жесткости и предельные деформации, определяют структура и химический состав мембраны, в которой находятся поры. В процессе старения мембраны медленно меняются (характерное время - дни).

Было предположено, что в партии 80% семян имеет закрытые поры и только у 20% семян они открыты. После помещения семян в атмосферу с 85% относительной влажностью воздуха при температуре 40°С содержание воды в семенах постепенно увеличивается. В результате растут "осмотические" силы и поры раскрываются. Поэтому, когда такие семена набухают, то из-за высокой скорости поступления воды велика вероятность повреждения мембранных структур семени. С этим связано падение всхожести семян на 5-7 сутки после начала старения.

При раскрытии поры происходит деформация ее упругих элементов. Длительное тепловое воздействие (ускоренное старение) модифицирует свойства мембраны и пор; жесткость и энергия деформация компонентов последних увеличиваются. "Осмотические" силы компенсируются упругими; поры закрываются, что замедляет поступление воды в семя при набухании и уменьшает вероятность повреждения мембранных структур. Поры закрываются медленнее, чем открываются, и потому компенсация сил наступает только на 8-9 сутки. Поскольку закрываются поры даже у семян, у которых они изначально были открытыми, то на 8-10 сутки старения наблюдается более высокая по сравнению с исходной всхожесть семян.

При больших сроках ускоренного старения в результате продолжающегося роста жесткости упругих элементов относительные деформации достигают порогового уровня, и поры разрушаются. Это приводит к потере барьерных функций клеточных мембран и гибели семян.

На основании вышеизложенного была предложена формула для описания изменения всхожести семян во время ускоренного старении. Всхожесть равна:

где V - всхожесть, Ы^ - относительное число семян с порами в закрытом состоянии, р(ач,) учитывает, что распределение пор по параметру а^ нормальное, IV - вероятность застать пору в закрытом состоянии.

Результаты расчётов при определённых параметрах хорошо согласуются

с экспериментальными данными, то есть, модель качественно описывает зависимость всхожести от времени старения. Модель учитывает, что число стационарных состояний, реализующихся при старении семян, невелико (их три), эти состояния дискретны, а переходы между ними кооперативны.

Из модели следует, что состояние семян в точках 0 и 8 суток старения качественно различны. Семена после 8 суток старения при хранении должны быстрее потерять всхожесть, что было экспериментально подтверждено: через полгода всхожесть этих семян упала до 8%, в то время как у контрольных она практически не изменилась.

3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Биологические системы изменяют знак реакции при нарастании воздействия. Бимодальный (трехфазный, парадоксальный) ответ до сих пор вызывает у исследователей удивление и многие считают его экспериментальным артефактом. Поэтому обнаруженное трехфазное изменение всхожести семян гороха при ускоренном старении потребовало выяснения условий, при которых эта сложная зависимость воспроизводится.

В работе показано, что аномальные изменения всхожести гороха определяют условия ускоренного старения и исходное качество семян. Колебания всхожести практически отсутствовали у высококачественных семян и были более выражены в партиях семян с низкой всхожестью (рис. 1). Чем быстрее повреждались и гибли семена при старении, тем меньше вероятность обнаружить аномальные изменения всхожести (рис. 3). Поэтому противоречивые результаты о влиянии различных воздействий на всхожесть семян, имеющиеся в научной литературе, скорее всего, связаны с недостаточным учетом этих факторов.

Комплексный анализ свойств отдельных семян (ФКТ, ФХ, выход электролитов, рост проростков) выявил наличие в партиях семян трёх дискретных

фракций. Фракционирование воздушно-сухих семян люминесцентными методами и изучение физико-химических и биохимических свойств семян I и II фракции позволило предложить, что первопричиной колебаний всхожести семян является изменение проницаемости мембран при старении. При содержании 18 - 20% воды в стареющих семенах гороха основными процессами, влияющими на состояние мембран являются перекисное окисление ненасыщенных жирных кислот липидов и неферментативная реакция гликозилирования (реакция Мейларда) белков [Smith, Berjak, 1995].

В работе выяснено, что ненормальные проростки, с количеством которых связано аномальное изменение всхожести, вырастают только из семян II фракции. Мембраны семян этой фракции более проницаемы для ионов и воды. Этот факт подтверждает данные литературы о влиянии скорости набухания на всхожесть состаренных семян [Alison et al., 1978; Woodstock, Tao, 1981; Tilden, West, 1985; Hill et al., 1988; Vertucci, 1989].

До момента проклёвывания семян II фракции в зародышевых осях серьёзных нарушений в синтезе белка, накоплении ß-тубулина и удвоении ДНК, которые могли быть причиной развития ненормальных проростков, отмечено не было. Почему возросшая проницаемость мембран у семян гороха II фракции вызывала нарушение роста проростков стало очевидным после измерения фосфоресценции порфиринов у набухающих семян.

До момента проклёвывания уровень свечения порфиринов семян II фракции многократно превышал свечение семян из I. Это свидетельствовало о том, что почти двое суток их зародыши находились в гипоксических условиях, причиной которых, видимо, была медленная диффузия кислорода через семенную оболочку и его быстрое поглощение при дыхании.

Большинство семян при прорастании испытывают кратковременный анаэробиоз, который переживают за счёт усиления процесса брожения [Джеймс, 1956]. Но для растительных клеток (как и клеток животных) не столько опасна гипоксия, сколько последующий их контакт с кислородом. Постгипоксический окислительный стресс вызывает свободнорадикальное перекисное окисление липидов, повреждение белков и нуклеиновых кислот, образование цитотоксинов и др. [Crawford et al., 1994; Pfister-Sieber, Brandie, 1994; Puntarulo, 1994].

Поэтому мы полагаем, что именно постгипоксическая реоксигенация зародышевых клеток во время проклёвывания семян II фракции и является

причиной нарушения роста и появления ненормальных проростков.

С целью проверки реальности элементарных событий, лежащих в основе сложных дозовых зависимостей ответа биообъектов на внешние стимулы, используют математические модели. Полагают, что полимодальная реакция функционально активной живой системы на нарастающее воздействие возможна, если в клетке функционируют две одновременно существующие рецепторные системы, дающие ответы противоположного знака. В зависимости от величины стимула результирующая реакция может быть как положительная, так и отрицательная [Зайцев и др., 1990]. В другой трактовке сложных дозовых кривых более адекватным считают каскадное расположение усиливающих и проводящих сигнал элементов [Гуревич, Варфоломеев, 1999]. В обеих моделях предполагают временную потерю элементами рецепторных систем чувствительности ("мертвое" время). В модели "парадоксальной" реакции клеточной популяции [НокИиПег, С)иес1епаи, 1995] сложная дозовая зависимость представляет собой линейную суперпозицию множества состояний (не менее семи), через которые клетка последовательно проходит в ответ на действие фактора.

В стареющей партии воздушно-сухих семян гороха существуют только две жизнеспособные фракции. Семена могут скачкообразно переходить из одной фракцию в другую. Предполагая, что бимодальное распределение жизнеспособных семян отражает наличие в партиях семян с открытыми и закрытыми для воды клеточными порами, мы разработали математическую модель, основанную на теории конформационных переходов в биологических макромолекулярных конструкциях. Она удовлетворительно описывает немонотонный ход изменения всхожести семян при ускоренном старении. Экспериментальная проверка подтвердила одно из заданных следствий модели, согласно которому семена I фракции на 9-10 сутки старения по качеству отличаются от исходных семян I фракции.

4. ВЫВОДЫ

1. Обнаруженное бимодальное ("парадоксальное") изменение всхожести семян гороха при ускоренном старении более выражено в партиях семян пониженного качества и зависит от скорости старения: чем медленнее старение, тем выше вероятность наблюдения бимодального изменения всхожести.

2. Регистрация фосфоресценции при комнатной температуре (воздушно-сухих и набухающих семян) и флуоресценции хлорофилла, выхода электролитов и ростовых характеристик семян показала, что в стареющей партии семян гороха присутствуют три дискретные фракции: из семян фракции Г вырастают нормальные проростки, из фракции II - ненормальные проростки, III фракция содержит мертвые семена. Переходы семян из одной фракции в другую приводят к снижению всхожести после 5-7 суток и её восстановлению на 8-10 сутки ("парадоксальный" эффект) старения.

3. Семена II фракции при набухании поглощают воду и выделяют ионы быстрее по сравнению с семенами I фракции. Предположено, что мембранные структуры семян II фракции имеют более высокую проницаемость для воды и ионов.

4. Не обнаружено различий в синтезе белков и в их качественном составе на ранних стадиях набухания (19 ч) у I и II фракции семян гороха после 6 суток старения.

5. У семян гороха I и II фракций синтез Р-тубулина и удвоение ДНК в течение первых двух суток набухания практически не отличились. После проклевывания репликация ДНК у семян II фракции тормозилось, что, по-видимому, служило причиной замедления деления клеток и роста зародышевых осей.

6. Регистрация фосфоресценции порфиринов у набухающих семян II фракции показала, что до момента проклевывания зародышевые оси находились в гипоксических условиях. Об этом говорило активное поглощение кислорода при дыхании (зародышевые оси из семян II фракции вдвое быстрее поглощали кислород, чем из первой). Предположено, что нарушение репликации ДНК и роста проростков после проклевывания семян вызваны постгипоксическим окислительным стрессом. Восстановление способности семян прорастать после 8-10 суток старения, по-видимому, связано с уменьшением проницаемости мембранных структур для воды и, как следствие, уменьшением вероятности окислительного стресса.

7. Предложенная математическая модель подтвердила предложенный механизм бимодального изменения всхожести семян во время ускоренного старения.

РАБОТЫ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Veselova T.V., Veselovsky V.A., Leonova Е.А. Determination of viability and longevity of seeds by luminescent method. - Annual Symposium. Physical-chemical basis of plant physiology. Penza, 5-8 February, 1996, 112 p.

2. Веселова T.B., Леонова Е.А. Влияние гидратации на фосфоресценцию биополимеров и семян при комнатной температуре. - Тезисы докладов конференции "Ломоносов-97". Москва, МГУ, 8-10 апреля, 1997.

3. Колупаев А.Г., Леонова Е.А.. Чернавский Д.С., Веселова Т.В., Ве-селовский В.А. Моделирование процесса парадоксального изменения всхожести семян при ускоренном старении. - Тезисы, Проблемы теоретической биофизики. Международная школа. Москва, 15 - 20 июня, 1998, с. 138.

4. Veselova T.V., Veselovsky V.A., Leonova Е.А. Assessment of potential vigour and productivity of air-dried cucumber seeds by the application of luminescence method. - Selekcija I Semenarstvo, 1998, V. 5, pp. 85 - 90.

5. Веселова T.B., Веселовский B.A., Леонова Е.А. Что означает изменение гетерогенности популяции семян при ускоренном старении? -Физиология растений, 1999, Т. 46, № 3, с. 477 - 483.

6. Веселова Т.В., Веселовский В.А., Колупаев А.Г., Леонова Е.А.. Чернавс-кий Д.С. Математическая модель изменения всхожести семян при старении. - Тезисы на II биофизический съезд России, Москва, МГУ, 22 - 27 августа 1999, Т. И, с. 400.

7. Леонова Е.А.. Веселовский В.А., Веселова Т.В. Трёхфазное ("парадоксальное") изменение всхожести партии семян гороха при ускоренном старении. IV Съезд Физиологов Растений России, Международная конференция "Физиология растений - наука III тысячелетия". Тезисы докладов, Москва, 4-9 октября, 1999, Т. И, с. 620

8. Веселова Т.В., Веселовский В.А., Колупаев А.Г., Леонова Е.А.. Чернавский Д.С. Математическая модель процесса ускоренного старения семян. - Биофизика, 1999, Т. 44, № 3, с. 510 - 517.

9. Леонова Е.А.. Веселова Т.В. Окислительный стресс при проращивании как вероятная причина снижения всхожести семян гороха. - Тезисы Пущино, 2000, Горизонты физико-химической биологии, 2000, с. 38 - 39.

10. Leonova Е.А.. Veselova T.V., Groot S.P., Jalink H., Veselovsky V.A. Chlorophyll fluorescence and room temperature phosphorescence of pea seeds as non-invasive methods of seed quality assessment under controlled deterioration. - Seed Science Research (in press).

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Леонова, Екатерина Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Фазный ответ биологических систем на внешние воздействия.

1.1. Общие закономерности.

1.2.Математическое моделирование трёхфазных реакций.

1.3. Фазные изменения всхожести при различных обработках воздушносухих семян.

2. Старение семян.

2.1. Факторы старения семян.

2.1.1. Кислород.

2.1.2. Вода.

2.1.3. Температура.

2.2. Гипотезы о механизме старения семян.

2.2.1. Нарушение синтеза РНК и белков.

2.2.2. Повреждение ДНК, аберрации хромосом.

2.2.3. Изменения свойств семенной оболочки и клеточных мембран.

2.2.3.1. Повреждение липидов.

2.2.3.2. Повреждение белков.

2.2.3.3. Проницаемость мембран.

3. Набухание семян.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы бимодального изменения всхожести семян в процессе ускоренного старения"

Давно известно, что отклик клетки или организма в широкой области изменения внешнего фактора не пропорционален дозе воздействия. Кривые доза - биологический эффект полифазны. Они характерны как для жизнедеятельных организмов, так и для находящихся в состоянии покоя. Исследования механизмов, лежащих в основе многофазных реакций биообъектов, являются актуальными. Они, помимо научного интереса, предполагают использование их на практике для определения степени риска техногенных воздействий на биоту, а также оценки лечебного эффекта факторов разной природа в малых дозах [Александров, 1985; Кузин, 1995; Бурлакоеа, 1994].

Существуют разные точки зрения на природу многофазной реакции живой системы. Одни исследователи полагают, что в каждом конкретном случае существуют свои механизмы восприятия внешних стимулов и реагирования на них, а подобие сложных дозовых кривых - лишь внешнее сходство. Другие, не отрицая специфичности реакции на действия фактора, склоняются к мысли, что сходство дозовых кривых отражает общую закономерность реагирования живых систем на возрастающее воздействие [Бурлакоеа, ред., 1999].

Наиболее распространённое среди биологов объяснение сложной ("парадоксальной" по В.Я. Александрову, 1985) зависимости поведения функционально активных организмов основано на предположении, что при определённом критическом уровне давления внешней среды "включаются" клеточные репарационные системы. Причём, возможна их гиперфункция, и тогда вместо ингибирования жизнедеятельности наблюдается её стимуляция.

При исследовании механизмов снижения всхожести семян при ускоренном старении мы столкнулись с ситуацией трёхфазного изменения всхожести семян гороха [Veselova et al., 1998].

Поскольку однонаправленному воздействию (длительное прогревание при 40°С) подвергали воздушно-сухие семена, то связать фазные изменения всхожести семян с активацией репара-торных механизмов не представлялось возможным. Описанные в литературе факты колебания всхожести семян при хранении и различных воздействиях трактуют, к сожалению, преимущественно на вербальном уровне и экспериментально они мало обоснованы [Мэгайр, 1982; Зелинский, 1989; Атрощенко, 1997; Каримов, Донцова, 1999; Усманов, 1999; Woodstock & Тао, 1981; Likhatchev et al., 1984].

Поэтому целью настоящей работы стало исследование бимодального изменения всхожести семян в процессе ускоренного старения и биофизических механизмов, лежащих в его основе.

В результате исследования было установлено, что основной причиной трёхфазного изменения всхожести семян в процессе постоянного теплового воздействия является изменение проницаемости клеточных мембран для воды и ионов: увеличение проницаемости мембран снижало всхожесть, тогда как аномальный (парадоксальный) её подъем был связан с уменьшением проницаемости мембран. Быстрое поступление воды в клетки приводило к резкому росту дыхания и создавало гипоксию под семенной оболочкой (и около зародышевой оси). Хотя гипоксия серьезно не влияла на метаболизм семян (удвоение ДНК, синтез белков и (3-ту-булина) во время проклевывания, зародыши, по-видимому, подвергались окислительному стрессу, рост осевых органов нарушался и падала всхожесть семян (за счет образования ненормальных проростков).

Исходя из предположения, что скорость поступления воды в клетки семени определяется степенью открытости мембранных пор, построена математическая модель, описывающая фазные изменения всхожести семян в процессе ускоренного старения.

Показано, что путем регистрации фосфоресценции воздушно-сухих семян при комнатной температуре можно сортировать семена по качеству и выделять однородные фракции для последующих фи-зиолого-биохимических исследований. Отбор (без проращивания) из партии мёртвых и ослабленных семян позволяет увеличить всхожесть посевного материала.

Регистрация in vivo фосфоресценции порфиринов набухающих зародышей при комнатной температуре позволяет контролировать кислородный режим прорастающих семян.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Леонова, Екатерина Александровна

ВЫВОДЫ

2. Регистрация фосфоресценции при комнатной температуре (воздушно-сухих и набухающих семян) и флуоресценции хлорофилла, выхода электролитов и ростовых характеристик семян показала, что в стареющей партии семян гороха присутствуют три дискретные фракции: из семян I фракции вырастают нормальные проростки, из семян II - ненормальные проростки и III фракция содержит мёртвые семена. Переходы семян из одной фракции в другую приводят к снижению всхожести после 5-7 суток и её восстановлению на 8-10 сутки ("парадоксальный" эффект) старения.

4. Не обнаружено различий в синтезе белков на ранних стадиях набухания (19 ч) у I и II фракции семян гороха после 6 суток старения. То есть, появление ненормальных проростков не связано с нарушением синтеза белка.

5. У семян гороха I и II фракций синтез [3-тубулина и удвоение ДНК в течение первых двух суток набухания практически не отличились. После проклёвывания репликация ДНК у семян II фракции тормозилось, что, по-видимому, служило причиной замедления деления клеток и роста зардышевых осей.

6. Регистрация фосфоресценции порфиринов у набухающих семян II фракции показала, что до момента проклёвывания зародышевые оси находились в гипоксических условиях. Об этом говорило активное поглощение кислорода при дыхании (зародышевые оси из семян II фракции вдвое быстрее поглощали кислород, чем из первой). Предположено, что нарушение репликации ДНК и роста проростков после проклёвывания семян вызваны постгипоксическим окислительным стрессом. Восстановление способности семян прорастать после 8-10 суток старения, по-видимому, связано с уменьшением проницаемости мембранных структур для воды и, как следствие, уменьшением вероятности окислительного стресса.

7. Математическая модель подтвердила предложенный механизм бимодального ("парадоксального") изменение всхожести семян во время ускоренного старения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Леонова, Екатерина Александровна, Москва

1. Аксёнов С.И. Вода и её роль в регуляции биологических процессов. М.: Наука, 1990, 113 с.

2. Аксёнов С.И., Булычёв A.A., Грунина Т.Ю., Туровецкий В.Б. О механизмах воздействия низкочастотного магнитного поля на начальные стадии прорастания семян пшеницы. Биофизика, 1996, Т. 41, с. 919 - 925.

3. Александров В.Я. Реактивность клеток и белки. JL: Наука, 1985,318 с.

4. Атрощенко Е.Э. Действие ударно-волновой обработки семян на морфофизиологические особенности и продуктивность растений. Автореферат на соискание ученой степени к.б.н. М., 1997.

5. Богатыренко Т.Н., Редкозубова Т.П., Конрадов A.A., Антоновский В.Л., Бурлакова Е.Б. Влияние органических перок-сидов на рост культивируемых клеток высших растений. Биофизика, 1989, Т. 34, с. 327-329.

6. Бочваров П.З., Веселова Т.В., Алёхина Н.Д., Веселовский В.А. Использование метода замедленной люминесценции для оценки изменений, происходящих в семенах сои после ускоренного старения. С.-х. Биология, 1984, № 6, с. 66 - 68.

7. Батыгин Н.Ф., Савин В.Н. Использование ионизирующих излучений в растениеводстве. Изд-во Л.: Колос, 1966, 123 с.

8. Бурлакова Е.Б. Эффект сверхмалых доз. Вестник Российской Академии Наук, 1994, Т. 64, № 5, с. 425 - 431.

9. Бурлакова Е.Б., Кондратов A.A., Худяков И.В. Воздействие химических агентов в сверхмалых дозах на биологические объекты. Известия РАН. Сер. Биол., 1990, № 2, с. 183 - 194.

10. Бурлакова Е.Б. (ред.) Эффекты сверхмалых доз. Сборник трудов в российском химическом журнале, 1999, Т. XLIII, № 5.

11. Веселова Т.В., Веселовский В.А. Оценка изменения жизнеспособности семян сои при хранении методом замедленной люминесценции. С.- х. Биология, 1985, № 6, с. 76 - 79.

12. Веселова Т.В., Веселовский В.А., Карташова Е.Р., Терешкина С.Д. Количественное определение потери жизнеспособности семян сосны при разных способах хранения. Физиология растений, 1995, Т. 42, № 4, с. 616 - 621.

13. Веселова Т.В., Веселовский В.А., Колупаев А.Г., Леонова Е.А., Чернавский Д.С. Математическая модель процесса ускоренного старения семян. Биофизика, 1999, Т. 44, № 3, с. 510 - 517.

14. Веселова Т.В., Веселовский В.А., Чернавский Д.С. Стресс у растений. М.: Изд-во МГУ, 1993, 144 с.

15. Веселовский В.А., Веселова Т.В, Шеберлайн В., Маренков B.C., Рубин А.Б. Способ определения влажности семян растений и устройство для его осуществления. Авторское свидетельство № 1047431. Приоритет изобретения 13 июля 1981.

16. Веселовский В.А., Веселова Т.В. Старения семян и кис-лород. Надёжность и элементарные события процессов старения биологических объектов. Киев: Наукова думка, 1986, с. 182 - 183.

17. Веселовский В.А., Веселова Т.В. Люминесценция растений. Теоретические и практические аспекты. М.: Наука, 1990, 200 с.

18. Веселовский В.А., Веселова Т.В., Чернавский Д.С. Трёхфазная (парадоксальная) дозовая зависимость реакции растительной клетки на факторы внешней среды. Российский химический журнал, 1999, Т. XLIII, № 5.

19. Габуда С.П. Связанная вода. Факторы и гипотезы. -Новосибирск: Наука, Сибирское отделение, 1982, 157 с.

20. Голдовский A.M. Анабиоз и его практическое значение. Л.: Наука, 1986, 168 с.

21. Гринёва Г.М. Регуляция метаболизма у ратений при недостатке кислорода. М.: Наука, 1975, с. 278.

22. Гродзинский Д.М. Радиобиология растений. Киев: Наукова думка, 1989, 384 с.

23. Гудков И.Н. Клеточные механизмы пострадиационного восстановления растений. Киев: Наукова Думка, 1985, 221 с.

24. Гумилевская H.A. Синтез белков и рибонуклеиновых кислот в прорастающих семенах. Дис. докт. биол. наук, 1987.

25. Гумилевская H.A., Чумикина Л.В., Арабова Л.И., Зимин М.В., Шатилов В.Р. Действие повышенных температур на синтез белка в осях набухающих зародышей гороха. Физиология растений, 1996, Т. 43, № 2, с. 247 - 255.

26. Гупало П.П. Возрастные изменения растений и их значение в растениеводстве. М.: Наука, 1969, 249 с.

27. Гуревич К.Г. Вероятностное описание "лиганд-рецептор". -Биофизика, 1999, Т. 44, № 6, с. 1022 1026.

28. Гуревич К.Г., Варфоломеев С.Д. Вероятностное описание лиганд-рецепторного взаимодействия. Оценка достоверности событий с малыми и сверхмалыми дозами. Биохимия, 1999, Т. 64, № 9, с. 1233 - 1244.

29. Джеймс В.О. Дыхание растений. М.: Иностранная литература, 1956, 499 с.

30. Зайцев C.B., Ефанов A.M., Сазанов Л.А. Общие закономерности и возможные механизмы действия биологически активных веществ в сверхмалых дозах. Российский химический журнал, 1999, T. XLIII, № 5.

31. Зелинский Г.В. Периодические колебания всхожести, силы роста, скорости роста и активности протеиназ семян сои при различных режимах их длительного хранения. Физиология и биохимия культ, растений, 1989, Т. 21, № 5, с. 169 - 473.

32. Каримов К.К., Донцова C.B. Растворимые белки в семенах хлопчатника как связь с их жизнеспособностью. Физиология растений, 1999, Т. 46, № 3, 484 - 491.

33. Карташова Е.Р., Веселова Т.В., Веселовский В.А., Надыкта В.Д., Терешкина С.Д. Замедленная люминесценция семян подсолнечника при длительном хранении в условиях регулируемой газовой среды и на воздухе. Биол. Науки, 1988, № 5, с. 31 - 35.

34. Конев C.B., Катибников М.А. Длительное послесвечение белков и аминокислот при комнатной температуре. Биофизика, 1961, Т. 6, с. 638 - 642.

35. Кузин A.M. Идеи радиационного гормезиса в атомном веке. -М.: Наука, 1995, 158 с.

36. Ландау Л.Д., Лифшиц Е.М. Теория упругости. М.: Наука, 1965, 202 с.

37. Мажуль В.М., Конев C.B., Ермолаев Ю.С. Исследование равновесной динамики структуры белков клетки методом триптофановой фосфоресценции при комнатной температуре. -Биофизика, 1983, Т. 26, с. 980 983.

38. Международные правила анализа семян. Д.Б. Мак-Кей, Ф. Адер, Гордон А.Г., Хутин К. (ред.), М., 1984, 311 с.

39. Мэгайр Д.Д. Качество семян и их прорастание. В кн. Физиология и биохимия покоя и прорастания семян. Николаева М.Г., Обручевой Н.В. (ред.) 1982, с. 254 - 271.

40. Мюррей Э.У., Киршнер М.У. Чем регулируется клеточный цикл. В мире науки, 1991, № 1, с. 24 - 32.

41. Николаева М.Г., Лянгузова И.В., Поздова Л.М. Биология семян. Санкт-Петербург, 1999, 231 с.

42. Обручева Н.В., Ковадло Л.С., Прокофьев A.A. Уровень оводнённости как пусковой фактор мобилизации крахмала и белка при прорастании семян гороха. Физиология растенгий, 1988, Т.35, №2, с.322-328.

43. Обручева Н.В., Антипова О.В. Физиология начала прорастания семян. Физиология растений, 1997, Т. 44, № 2, с. 287 - 302.

44. Обручева Н.В., Антипова О.В. Общие физиологические механизмы подготовки семян с разными типами покоя к проклё-выванию. Физиология растений, 1999, Т. 46, № 3, с. 426 - 431.

45. Обручева Н.В., Антипова О.В., Котова JI.M. О запуске деления и растяжения клеток при прорастании семян кормовых бобов. Физиология и биохимия культурных растений, 1993, Т. 25, № 3, с. 243 - 248.

46. Прокофьев A.A., Обручева Н.В., Ковадло JI.C., Кулиева Л.К., Кожемякина И.С. Критический уровень оводнённости семян для начала их прорастания. Физиология растений, 1983, Т. 30, Вып. 1, с. 178 - 183.

47. Райнхарт Э. Гормезис и оценка свехмалых доз биоло-гически активных веществ. Биологическая Медицина, 1998, № 2, с.4 - 8.

48. Реймерс Ф.Э. Растение во младенчестве. Новосибирск: Наука, 1987, 181 с.

49. Сарапульцев Б.И., Гераськин С.АП. Генетические основы радиорезистентности и эволюция. М.: Энергоатомиздат, 1993, 209 с.

50. Скаженник М.А., Гумилевская Н.А.,КуваеваЕ.Б.,Кретович B.JI. Электрофоретический анализ компонентов состава суммарного белка семядолей семян гороха. Прикл. биохим. и микробиол., 1981, Т. 17, Вып. 6, с. 918 - 926.

51. Скаженник М.А. Синтез белков в семядолях семян гороха при прорастании. Дис. на соискание ученой степени к.б.н. М., 1982.

52. Солдатова О.П., Орлова H.H. Развитие мутационного процесса в семенах при хранении. Доклады BACXHHJI, 1984, № 11, с. 18 - 20.

53. Теренин Т.Н. Фотоника молекул красителей. Л.: Наука, 1967, 308 с.

54. Угольников О.В., Веселова Т.В., Сафьянникова Т.Ю. Влияние ускоренного старения на дыхание и всхожесть семян ржи. Онтогенез, 1992, Т. 23, № 3, с. 326 - 329.

55. Усманов П.Д. Старение семян Arabidopsis thaliana и его обращение. Физиология растений, 1999, Т. 46, № 3, с. 492 - 494.

56. Филенко О.Ф. Водная токсикология. М.: Изд-во МГУ, 1988, 154 с.

57. Фирсова М.К. Методы определения качества семян. М.: Сельхозлитература, 1959, 350 с.

58. Фирсова М.К., Попова Е.П. Оценка качества зерна и семян. -М.: Колос, 1981, 223 с.

59. Хайдекер У. Стресс и прорастание сеямн: агрономическая точка зрения. В кн. Физиология и биохимия покоя и прорастания семян. Николаева М.Г., Обручева Н.В. (ред.). 1982, с. 273 - 319.

60. Хегай Л.А., Ким Б.Б., Зайцев C.B., Гаврилова Е.М., Захарова Л.А., Михайлова А.А. Влияние энкефалина на бластотрансформацию спленоцитов. Иммунология, 1991, Т. 4, с. 24 - 25.

61. Циммер К.Г. Проблемы количественной радиобиологии. М.: Госатомиздат, 1962, 98 с.

62. Цундель Г. Гидратация и межмолекулярное взаимодействие. М.: Мир, 1972, 404 с.

63. Чикалин М.В., Пелецкая Ю.Г., Шушанашвили В.И. Некоторые физические и биохимические изменения семян пшеницы при потере посевных качеств. Физиология растений, 1995, Т. 42, № 6, с. 911 - 915.

64. Шульгина Э.С. Старение и стабилизация полимеров. Л., 1984, 68 с.

65. Aaron J.J., Andino M., Wineforder J.D. The effects of ion exchange filter papers and of heavy atoms on room temperature phosphorescence of several indoles. U.S.A., Analytica Chemica Acta, 1984, V. 160, pp. 713 - 717.

66. Abdul-Baki A.A. Biochemical aspects of seed vigor. -Hortscience, 1980, V. 15, pp. 765 771.

67. Abdul-Baki A.A., Anderson J.D. Phisiological and biochemical deterioration of seeds. In Seed biology. Kozlowski T.T. (ed.).

68. Academic Press., New York, 1972, V. 2, pp. 283 315.

69. Al-Ani A., Bruzau F., Raymond P., Saint-Ges V., Leblanc J.M., Pradet A. Germination, respiration, and adenylate energy charge of seeds at various oxygen partial pressures. Plant Physiol., 1985, V. 79, pp. 885 - 890.

70. Alsadon A., Yule L.J., Powell A.A. Influence of seed ageing on the germination, vigour and emergence in module trays of tomato and cucumber seeds. Seed Sci. & Technol., 1995, V. 23, № 3, pp. 665 - 672.

71. Anderson J.D., Gupta K. Nucleotide alterations during seed deterioration. In Physiology of seed deterioration. McDonald M.B., Nelson C.J. (eds.). Crop Science Soiety of America, madison, WI, 1986, pp. 47 - 63.

72. Baker E.H., Bradford K.J. The fluorescence assay for Maillard product accumulation does not correlate with seed viability. Seed Sci. Research, 1994, V. 4, pp. 103 - 106.

73. Baker J.E., Wang C.Y., Terlizzi D.E. Delay of senescence in carnations by pyrazon, phenidone analogs and triton. HortScience, 1985, V. 20, pp. 121 - 122.

74. Barber R.F. Senescence-related changes in the molecular organization of membrane lipid bilayers. Ph.D. Thesis, Univ. of Waterloo, Waterloo, Ontario, Canada, 1984.

75. Bewley J.D. Seed germination and dormancy. The Plant Cell, 1997, V. 9, pp. 1055 - 1066.

76. Bewley J.D., Black M. Physiology and biochemistry of seeds in relation to germination and growth. Berlin Heidelberg, New York: Springer-Verlag, 1978, 306 p.

77. Bewley J.D., Black M. Seeds, Physiology of Development and Germination. Plenum Press, New York, 1994.

78. Bino R.J., Lanteri S., Verhoeven H.A., Kraak H.L. Flow cytometric determination of nuclear replication stages in seed tissues. -Ann. Bot., 1993, V. 72, pp. 181 187.

79. Blok M.C., Vender Neut-kok E.C.M., van Deenen L.L.M., de Gier J. The effect of chain length and lipid phase transitions on the selective permeability properties of liposomes. Biochim. Biophys. Acta, 1975, V. 406, p. 187.

80. Bonnewell V., Koukkari W.L., Pratt D.C. Light, oxygen, and temperature reqirements for Typha latifolia seed germination. Can. J. Bot., 1982, V. 61, pp. 1330 - 1336.

81. Borochov A., Halevy A.H., Shinitzky M. Senescence and the fluidity of rose petal membranes. Relationship to phospholipid metabo-lizm. Plant Physiol., 1982, V. 69, pp. 296 - 299.

82. Bramhall S., Noack N., Wu M., loewenberg J.R. A simple col-orimetric method for determination of protein. Analyt. Biochem., 1969, V. 31, pp. 146 - 148.

83. Bray C.M., Dasgupta J. Ribonucleic acid synthesis and loss of viability in pea seeds. Planta, 1976, V. 132, № 1, pp. 103 - 108.

84. Bray C.M. Stress, protein biosynthesis and loss of vigour and viability in cereal seed. In Basic and applied aspects of seed biology. Ellis R.H., Black A.J., Murdoch A.J., Hong T.D. (eds.), 1997, pp. 437 449.

85. Brocklehurst P.A., Fraser R.S.S. Ribosomal RNA integrity and rate of seed germination. Planta, 1980, V. 148, № 5, pp. 417 - 421.

86. Brown S.L., Epps D.E. Immunol., 1985, V. 134., pp. 33843390.

87. Castro R.D. A functional analysis of cell cycle events in developing and germinating tomato seeds. Wageningen, The Netherlands, 1998, 110 p.

88. Chang D.Y., Miksche J.P., Dhillon S.S. DNA changes involving repeated sequences in senescing soyabean (Glycine max) cotyledon nuclei. Physiol. Plant, 1985, V. 64, pp. 409 - 417.

89. Chao C., Ma Y-S., Stadtman E.R. Modification of protein surface hidrophobicity and methionin oxidation by oxidative systems. -Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, V. 94, pp. 2969 2974.

90. Chrispeels M.J., Maruel C. Aquaporins: the molecular basis of facilitated water movement through living plant cells? Plant Physiology, 1994, V. 105, pp. 9 - 13.

91. Coolbear P., McGill C.R., Sakunnarak N. Susceptibility of pea seeds to acetone toxicity: interactions with moisture content and ageing treatments. Seed Sci. & Technol., 1991, V. 19, № 3, pp. 519 - 526.

92. Crocker W., Groves J.F. A method for prophesying the life duration of seed Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 1915, V. 1, pp. 487 - 489.

93. Daniels M.J., Chaumont F., Mirkov T.E., Chrispeels MJ. Characterization of a new vacuolar membrane aquaporin sensitive to mercury at a unique site. Pint cell, 1996, V. 8, pp. 587 - 599.

94. Dell'Aquila A., Taranto G. Cell division and DNA-synthesis during osmopriming treatment and following germination in aged wheat embryos. Seed Sci. & Technol., 1986, V. 14, pp. 333 - 341.

95. Delouche J.C., Baskin C.C. Accelerated aging techniques for predicting the relative storability of seed lots. Seed Sci. & Technol., 1973, V. 1, pp. 427 - 452.

96. Dourado A.M., Roberts E.H. Phenotypic mutations induced during storage in barley and pea seeds. Ann. of Bot., 1984, V. 54, № 6, pp. 781 - 790.

97. Duke S.H., Kakefuda G. Role of the testa in preventing cellular rupture during imbibition of legume seeds. Plant Physiol., 1981, V." 67, pp. 449 - 456.

98. Ellis R.H., Covell S., Roberts E.H., Summerfield R.J. The influence of temperature on seed germination rate in grain legumes. J. of Exp. Bot., 1986, V. 37, № 183, pp. 1503 - 1515.

99. Ellis R.H., Hong T.D., Roberts E.S., Tao K-L. Low moisture content limits to relations between seed longevity and moisture. Ann. of Bot., 1990, V. 65, pp. 493 - 504.

100. Ellis R.H., Osei-Bonsu K., Roberts E.H. The influence of genotype, temperature and moisture on seed longevity in chickpea, cowpea and soya bean. Ann. Bot., 1982, V. 50, pp. 69 - 82.

101. Ellis R.H., Roberts E.H. The quantification of ageing and survival in ortodox seeds. Seed Sci. & Technol., 1981, V. 9, pp. 373-409.

102. Ferguson I.B. Calcium in plant senescence and fruit ripering. -Plant Cell Environ, 1984, V. 7, pp. 477 489.

103. Goldstein I.M., Weissmann G. Effects of generation of superoxide anion on permeability of liposomes. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1977, V. 70, pp. 452 - 458.

104. Golovina E.A., Tikhonov A.N., Hoekstra F.A. An electron paramagnetic resonance spin-probe study of membrane-permeability changes with seed aging. Plant Physiol., 1997a, V. 114, pp. 383 - 389.

105. Golovina E.A., Wolkers W.F., Hoekstra F.A. Behaviour of membranes and proteins during natural seed ageing. In Basic and applied aspects of seed biology. Ellis R.H., Black A.J., Murdoch A.J., Hong T.D. (eds.). 1997b, pp. 787 - 796.

106. Grabe D.F. Prediction of the relative storability of corn seed lots. Proc. Assoc. Offic. Seed Anal, 1965, V. 55, pp. 92 - 96.

107. Harman G.E., Mattick L.R. Association of lipid oxidation with seed ageing and death. Nature, UK, 1976, V. 260, № 5549, pp. 323 - 324.

108. Harrington J.F. Practical Advice and Instructions on Seed Storage. Proc. Int. Seed Test. Assoc., 1963, V. 28, 989 - 994 pp.

109. Helm K., Peterson N., Abernethy R. The heat shock response of germinating embryos of wheat. Plant Physiol., 1989, V. 90, № 3, pp. 598 - 605.

110. Hendry G.A.F. Oxygen, free radical process and seed longevity. Seed Sci. Res., 1993, V. 3, pp. 141 - 153.

111. Hendry G.A.F. Free radicals in seeds moving the debate forward. - In Basic and applied aspects of seed biology. Ellis R.H., Black A. J., Murdoch A.J., Hong T.D. (eds.). 1997, pp. 657 - 663.

112. Hill H.J., Taylor A.G., Huang X.L. Seed viability determinations in cabbage utilizing sinapine leakage and electrical conductivity measurements. J. of Experimental Botany, 1988, V. 39, № 207, pp. 1439 - 1447.

113. Hiramoto K., Kato T., Kikugawa K. Generation of DNA breaking activity in the Maillard reaction of glucose - amino asid mixtures in a soil system. - Mutat. Res., 1993, V. 285, № 2, pp. 191 - 198.

114. Holzunter H.-G., Quedenau J. Mathematical modelling of cellular responses to external signals. J. of Biological Systems, 1995, V. 3, № 1, pp. 127 - 138.

115. TA (International Seed Testing Association). International Rules for Seed Testing. Seed Sci. & Technol., 1985, V. 13, pp. 299- 513.

116. TA (International Seed Testing Association). International Rules for Seed Testing. Seed Sci. & Technol., Supplement, 1996, V. 24.

117. Jalink H. Method for the Determination of Maturity and Qualityof Seeds by the Chlorophyll Content and an Apparatus for Sorting Seeds. Dutch patent № 10002984, 1996.

118. Jalink H., Van der Schoor R., Frandas A. Van Pijlen J.G. Chlorophyll Fluorescence of the Testa of Brassica oleracea Seeds as an Indicator of Seed Maturity and Seed Quality. Seed Sci. Res. , 1998, V.8, pp. 437 - 443.

119. Kalpana R., Madhava Rao K.V.M., On the ageing mechanism in pigeonpea (Cajanus cajan (L.) Millsp.) seeds. Seed Sci. & Technol., 1995. V. 23, pp. 1 - 9.

120. Kellogg E.W., Fridovich I. Superoxide, Hydrogen peroxide and singlet oxygen in lipid peroxidation by the xantine oxidase system. -J. Biol. Chem., 1975, V. 250, pp. 8812 8817.

121. Modeling of seed ageing. Seed Sci. & Technol., 1984, V. 12, pp. 385 - 393.1.nch D.V., Thompson J.E. Lipoxygenase-mediated production of superoxide anion in scenescing plant tissue. FEBS Lett., 1984, V. 173, pp. 251 - 254.

122. Maizel J.V. Polyacrylamide gel electrophoresis of viral proteins. Methods in Virology, 1971, V. 5, pp. 179 - 246.

123. Mans R.J., Novelli G.D. Measurment of the incorporation of radioactive amino acids into protein by filter-paper disk method. -Arch. Bioch. and Biophys., 1961, V. 94, № 1, pp. 48 51.

124. Marcus A. Seed germination and the capacity for protein synthesis. Symposium of the Society for Experimental Biology, 1969, V. 23, pp. 143 - 190.

125. Maurel C., Chrispeels M., Lurin C., Tacnet F., Greelen D., Ripoche P., Guern J. Function and regulation of seed aquaporins. -J. of Exp. Bot., 1997, V. 48, pp. 421 430.

126. Mayak S., Legge R.L., Thompson J.E. Superoxide radical production by microsomal membranes from senescing carnation flowers: an effect on membrane fluidity. Phytochemistry, 1983, V. 22, pp. 1375 - 1380.

127. McKersie B.D., Thompson J.E. Lipid crystallization in senescent membranes from cotyledons. Plant Physiol., 1977, V. 59, pp. 803 - 807.

128. Mercado A.T. Moisture equilibrium and quality evaluation of five kinds of seed stored at various relative humidities. M.S. Thesis, Mississippi State University, State College, 1967.

129. Mukhtar N.D., Laidman D.L. Mineral ion transport in the embryos of germinating wheat (Triticum aestivum). J. of Exp. Bot., 1982, V. 33, pp. 643 - 655.

130. Murdoch A.J., Roberts E.H., Goedert C.O. A model for germination responses to alternating temperature. Ann. of Bot., 1989, V. 63, pp. 97 - 111.

131. Niehaus W.G. A proposed role of superoxide anion as a biological nucleophile in the deesterification of phospholipids. Bioorg. Chem., 1978, V. 7, pp. 77 - 84.

132. Nooden L.D., Leopold A.C. Senescence and Aging in plants. Academic Press INC., 1988. 517 p.

133. Osborne D.J., Dobrzanska M., Sen S. Factors determining nucleic acid and protein synthesis in the early hours of germination. -Integration of activity in the higher plant. Soc. Exp. Biol. Symp. XXX.I, 1977, pp. 177 194.

134. Pandey D.K. A suitable liquid preservative for enhancing longevity of ortodox seeds. Scienta Horticulture, 1996, V. 66, pp. 1-8.

135. Papp S., Vanderkool J.M. Tryptophan phosphorescence at room temperature as a tool to study protein structure and dynamics. -Photochemistry and photobiology, 1989, V. 49, № 6, pp. 775 784.

136. Parrish D.L., Leopold A.C. On the mechanism of aging in soybean seeds. J. of Exp. Bot., 1977, V. 61, pp. 365 - 368.

137. Perl M., Luria I., Gelmond H. Biochemical changes in sorghum seeds affected by accelerated ageing. J. of Exp. Bot., 1978, V. 28, pp. 227 - 236.

138. Petruzzelli L., Taranto G. Phospholipid changes in wheatembryos aged under different storage conditions. J. of Exp. Bot., 1984, V. 35, pp. 517 - 534.

139. Pfister-Sieber M., Brandle R. Aspects of plant behaviour under anoxia and post-anoxia. In Oxygen environment stress in plants. Waiting R., Allen J.A. (eds.). Proceedings of the Royal Society of Edinburgh, 1994, 102B, pp. 313 -324.

140. Pillay D.T.N., Gowda S. Age-related changes in transfer RNA species and transfer RNA synthesis in germinating soyabean (Glycine max cultivar Harcor) cotyledons. Gerontology, 1981, V. 27, pp. 194 - 204.

141. Platt-Aloia K.A., Thompson W.W. Freez-fracture evidence of gel-phase lipid in membranes of senescing cowpea cotyledons. -Planta, 1985, V. 163, pp. 360 369.

142. Poovaiah B.W., Leopold A.C. Defferal of leaf senescence with calcium. Plant Physiol., 1973, V. 52, pp. 236 - 239.

143. Powell A.A., Matthews S. Deteriorative changes in pea seeds (Pisum sativum L.) stored in humid or dry conditions. J. of Exp. Bot., 1977, V. 112, pp. 787 - 794.

144. Powell A.A., Matthews S. The damaging effect on dry pea embryos during imbibition. J. of Exp. Bot., 1978, V. 29, № 112, pp. 1215 - 1229.

145. Powell A.A., Matthews S. The influence of test conditions on the umbibition and vigour of pea seeds. J. Exp. Bot., 1979, V. 30, pp. 193 - 197.

146. Powell A.A., Matthews S. Association of phospholipid changes with early stages of seed ageing. Ann. Bot., 1981, V. 47, pp. 709 - 712.

147. Priestley D.A. Seed Aging. Implications of seed storage and persistence in the soil. Ithaca: Cornell University Press, Ithaca & London, 1986, p. 304

148. Priestley D.A., McBride M.B., Leopold A.C. Tocopherol and organic free radical levels in soybean seeds during natural and accelerated aging. Plant Physiol., 1980, V. 66, pp. 715 - 719.

149. Pukacka S. Phospholipid changes and loss of viability in norwaymaple (Acer platanoides L.) seeds. Z. Pflanznphysiol. Bd. 1983, 112, pp. 199 - 205.

150. Puntarulo S. Effect of oxidative stress during imbibition of soybean embryonic axes. Proceedings of the Royal Society of Edinburgh, V. 102, 1994, pp. 279 - 286.

151. Quinn P.J., Williams W.P. Plant lipids and their role in membrane function. Prog. Biophys. Mol. Biol., 1978, V. 24, pp. 109 - 173.

152. Roberts E.H. Viability of seeds. London: Chapman & Hall,1972.

153. Roberts E.H. Quantifying seed deterioration. Spec. Publ., Crop Sci. Soc. Am., Madison, Wisconsin, 1986, № 11, pp. 101 - 122.

154. Roberts E.H. Seed aging: the genome and its expression. In Senescence and aging in plants. Nooden L.D., Leopold A.C. (eds.). Acad. Press INC., 1988, pp. 466 - 493.

155. Salama A.M., Pearce R.S. Ageing of cucumber and onion seeds: phospholipase D, lipoxygenase activity and changes in phospholipid content. J. Exp. Bot., 1995, V. 44, № 265, pp. 1253 - 1265.

156. Scott H. Wettlaufer, Leopold A.C. Relevance of Amadori and Maillard products to seed deterioration. Plant Physiol., 1991, V. 97, № 1, pp. 165 - 169.

157. Senaratna T., Gusse J.F., McKersie. Age-induced changes in cellular membranes of imbibed soyabean seed axes. Physiol. Plant., 1988, V. 73, pp. 85 - 91.

158. Shah N.K., Ludescher D. Influence of hidratation on the internal dynamics of hen egg white lysozyme in the dry state. Photochemistry and photobiology, 1993, V. 58, № 2, pp. 169 - 174.

159. Shinitzky M. Membrane fluidity and cellular function. In Physiology of membrane fluidity. Shinitzky M. (éd.). CRC Press, Boca Raton, Florida, 1984, V. 1, pp. 1 - 52.

160. Simon E.W., Harun R.M.R. Leakage during seed imbibition. J. of Exp. Bot., 1972, V. 23, № 77, pp. 1076 - 1085.

161. Simontaccihi M., Puntarulo S. Effects of ageing on oxygen radical generation by soyabean seeds. In Oxygen environment stress in plants. Waiting R., Allen J.A. (eds.). Proceedings of the Royal Society of Edinburgh, 1994, 102B, pp. 295 - 302.

162. Sivritepe H.O., Dourado A.M. The effects of humidification treatments on viability and the accumulation of chromosomal aberrations in pea seeds. Seed Sci. & Technol., 1994, V. 22, № 2, pp. 337 - 348.

163. Sivritepe H.O., Dourado A.M. The effect of storage environment on seed survival and the accumulation of chromosomal aberrations in pea landraces and cultivars (Pisum Sativum L.). Turkistan Journal of Botany, 1998, V. 22, № 4, pp. 223 - 232.

164. Smith C.A.D., Bray C.M. Intracellular levels of poly-adenylated RNA and loss of vigor in germinating wheat embryos. Planta, 1982, V. 156, № 5, pp. 413 - 418.

165. Stewart R.R., Bewley J.D. Lipid peroxidation associated with accelerated aging of soybean axes. Plant Physiol., 1980, V. 65, pp. 245 - 248.

166. Sun W.Q., Leopold A.C. The glassy state and accelerated aging of soybeans. Physiol.Plant., 1993, V. 89, pp. 767 - 774.

167. Sun W.Q., Leopold A.C. Glassy state and seed storage stability: a viability equation analysis. Ann. Bot., 1994, V.74, pp. 601 - 604.

168. Sun W.Q., Leopold A.C. The Millard reaction and oxidative stress during aging of soybean seeds. Physiol. Plant., 1995, V. 94, pp. 94 - 104.

169. Sung J.M. Lipid peroxidation and peroxide-scavenging in soyabean seeds during aging. Physiol. Plant., 1996, V. 97, pp. 85 - 89.

170. Stewart R.R., Bewley J.D. lipid peroxidation associated with accelerated aging of soybean axes. Plant Physiol., 1980, V. 65, pp. 245 - 248.

171. Tekrony D.M., Egli D.B. Relationship between standard germination, accelerated ageing and field emergance in soybean. In: Basic and applied aspects of seed biology. Printed in Great Britan. 1997, pp. 593 - 600.

172. Thompson J.E. The molecular basis for membrane deterioration during senescence. In Senescence and aging in plants. Nooden L.D., Leopold A.C. (eds.). Acad. Press INC., 1988, pp. 52 - 83.

173. Thompson J.E., Mayak S., Shinitzky M., Halevy A.H. Acceleration of membrane senescence in cut carnation flowers by treatment with ethylene. Plant Physiol., 1982, V. 69, pp. 859 - 863.

174. Thompson J.E., Legge R.L., Barber R.F. The role of free radicals in senescence and wounding. New Phytol., 1987, V. 105, pp. 317 - 344.

175. Thornley J.H.M. A germination model: responses to time and temperature. J. Theor. Biol., 1986, V. 123, pp. 481 - 492.

176. Tilden R.L., West S.H. Reversal of the effect of aging in soybean seeds. Plant Physiol., V. 77, 1985, pp. 584 - 586.

177. Vertucci C.W. The kinetics of seed imbibition: controlling factors and relevance to seedling vigor. In Seed Moisture. Crop Science Society of America. CSSA Special Publication, 1989, № 14, pp. 93 - 115.

178. Vertucci C.W., Roos E.E. Theoretical basis of protocols for seed storage. Plant Physiol., 1990, V. 94, pp. 1019 - 1023.

179. Veselova T.V., Veselovsky V.A., Leonova E.A. Assessment of potential vigour and productivity of air-dried cucumber seeds by the application of lumenescence method. Selekcija i Semenarstvo, 1998, V. 5, № 1 - 2, pp. 85 - 90.

180. Tekrony D.M., Egli D.B. Relationship between standard germination, accelerated ageing and field emergance in soybean. In: Basic and applied aspects of seed biology. Printed in Great Britan. 1997, pp. 593 - 600.

181. Thompson J.E. The molecular basis for membrane deterioration during senescence. In Senescence and aging in plants. Nooden L.D., Leopold A.C. (eds.). Acad. Press INC., 1988, pp. 52 - 83.

182. Thompson J.E., Mayak S., Shinitzky M., Halevy A.H. Acceleration of membrane senescence in cut carnation flowers by treatment with ethylene. Plant Physiol., 1982, V. 69, pp. 859 - 863.

183. Thompson J.E., Legge R.L., Barber R.F. The role of free radicals in senescence and wounding. New Phytol., 1987, V. 105, pp. 317 - 344.

184. Thornley J.H.M. A germination model: responses to time and temperature. J. Theor. Biol., 1986, V. 123, pp. 481 - 492.

185. Tilden R.L., West S.H. Reversal of the effect of aging in soybean seeds. Plant Physiol., V. 77, 1985, pp. 584 - 586.

186. Vertucci C.W. The kinetics of seed imbibition: controlling factors and relevance to seedling vigor. In Seed Moisture. Crop Science Society of America. CSSA Special Publication, 1989, № 14, pp. 93 -115.

187. Vertucci C.W., Roos E.E. Theoretical basis of protocols for seed storage. Plant Physiol., 1990, V. 94, pp. 1019 - 1023.

188. Vertucci C.W., Roos E.E. Theoretical basis of protocols for seed storage II. The influence of temperature on optimal moisture levels. -Seed Sci. Res., 1993, V. 3, pp. 201 213.

189. Vertucci C.W., Roos E.E., Crane J. Theoretical basis of protocols for seed storage III. Optimum moisture contents for pea seeds stored at different temperatures. Ann. of Bot., 1994, V. 74, pp. 531 - 540.

190. Veselova T.V., Veselovsky V.A., Leonova E.A. Assessment of potential vigour and productivity of air-dried cucumber seeds by the application of lumenescence method. Selekcija i Semenarstvo, 1998, V. 5, № i 2, pp. 85 - 90.

191. Walters C., Rao N.K., Hu X. Optimal seed water content to improve longevity in ex situ genebanks. Seed Sei. Res., 1998, V. 8, Supplement № 1, pp. 15 - 22.

192. Walton D.C., Soofi G.S. Germination of Phaseolus vulgaris III. The role of nucleic acid and protein synthesis in the initiation of axes elongation. Plant Cell Physiol., 1969, V. 10, pp. 307 - 315.

193. Wendell Q.S., Leopold A.C. The Maillard reaction and oxidative stress during aging of soybean seeds. Physiol. Plantarum, 1995, V. 94, pp. 94 - 104.

194. Wettlaufer S.H., Leopold A.C. Relevance of Amadori and Maillard products to seed deterioration. Plant Physiol., 1991, V. 97, pp. 165 - 169.

195. Willson D.O., McDonald M.B. The lipid peroxidation model of seed ageing. Seed Sei. & Technol., 1986, V. 14, pp. 269 - 300.

196. Wondrak G., Pier T., Tress R. Light from Maillard reactions: photon couting, emission spectrum, photography and visual perception. J. Biolumines Chemilumines., 1995, V. 10, № 5, pp. 277 - 284.

197. Woodstock L.W. Physiological and biochemical test for vigor. -Seed Sei. & Technol., 1973, V. 1, pp. 127 157.

198. Woodstock L.W., Tao K.J. Prevention of imbibitional injury in low vigor soybean embryonic axes by osmotic control of water uptake. Physiol. Plant., 1981, V. 51, pp. 133 - 139.

199. Работа выполнена при поддержке гранта Российского фонда фундаментальных исследований № 96-15-97782 и гранта № ООО^ЩЫ,

Информация о работе

Леонова, Екатерина Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2000
ВАК 03.00.02

Диссертация

Механизмы бимодального изменения всхожести семян в процессе ускоренного старения - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы