Механизмы адаптации кислородтранспортных и детоксицирующих систем к хроническому действию токсических веществ различных классов

Милякова, Марина Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы адаптации кислородтранспортных и детоксицирующих систем к хроническому действию токсических веществ различных классов
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы адаптации кислородтранспортных и детоксицирующих систем к хроническому действию токсических веществ различных классов"

На правах рукописи

. . О

ОД

милякова ? Я ¿2Г 7У&0

Марина Николаевна

в)

МЕХНИЗМЫ АДАПТАЦИИ КИСЛОРОДТРАНСПОРТНЫХ И ДЕТОКСНЦИРУЮЩИХ СИСТЕМ К ХРОНИЧЕСКОМУ ДЕЙСТВИЮ ТОКСИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ РАЗЛИЧНЫХ КЛАССОВ

03.00.13. — Физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Самара 2000

Работа выполнена в Самарском НИИ гигиены Самарского государственного медицинского университета

Научные руководители: доктор медицинских наук профессор Ю.С. Ротенберг доктор медицинских наук Н.П. Карханин, доктор биологических наук В.Г. Подковкин

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор В.Ф. Пятин; кандидат биологических наук, доцент Л.М. Кавеленова

Ведущая организация: Самарский военно-медицинский институт

Защита диссертации состоится 15 июня 2000 г. в // часов на заседании диссертационного совета К 063. 94. 10. при Самарском государственном университете (443 011, г. Самара, ул. Ак. Павлова, 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Самарского государственного университета (ул. Ак. Павлова, 1)

Автореферат разослан мая 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент -— O.A. Ведясова

РЛ4. /, о

Актуальность проблемы

В условиях углубляющегося экологического кризиса, когда проблема "Человек и среда" выдвигается в число самых первоочередных, одним из самых фундаментальных остается вопрос адаптации человека к экстремальным факторам среды обитания (Казначеев В.П.,1980).

До сих пор достаточно информативных критериев выявления состояния адаптации при длительном действии токсических веществ известно мало (Баевскнй P.M.,1979, Ильин B.C.,1981, Любченко Г.Н., 1997). Приспособление организма к длительному воздействию вредных веществ часто обозначают как "привыкание", имея в виду понижение чувствительности организма к химическим агентам. Однако привыкание может включать в себя широкий спектр адаптационных и компенсаторно-приспособительных реакций организма, различающихся по наличию и степени выраженности патогенетического компонента в приспособительных процессах, а также тяжести их отдаленных последствий. (Ковалев И.Е., 1990, Крылов С.С., 1984). Основным путем адаптации и причиной возникновения временной толерантности при хроническом действии токсических соединений считается их биотрансформация ферментами микросомалыюго и немикросомального окисления в печени (Meyer Urs.A.,1996, Pelkonen О., 1997). Однако известно, что бнотрансформация токсических соединений может приводит в их метаболической активации, а сопутствующие ей процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) являются причиной повреждения мембранных структур клетки (Coughtrie Michael W.H., 1996, Mannaioni P.E., 1995, Veidebaum Т., 1997). Поскольку пусковым механизм развертывания адаптационных процессов считается дефицит макроэргов в клетке, ряд авторов предлагает изучать биоэнергетические процессы при экзогенной интоксикации (Лукьянова Л.Д, 1997, Пузырев A.A., 1997). Однако при воздействии факторов малой интенсивности не всегда обнаруживаются фазовые изменения биоэнергетики, хотя нагрузочные тесты выявляют адаптацию.

В настоящее время многие авторы приходят к заключению, что в основе долгосрочной адаптации организма лежит пластичность и динамичность белков, допускающая множественность локальных обратимых превращений белковой молекулы (Дудченко А.И,1996, Меерсон Ф.З, 1988). Количественные и качественные перестройки в соотношении различных типов макромолекул при длительном воздействии химического фактора умеренной и слабой интенсивности могут проходить на фоне нормализации практически всех функциональных показателей (Acharya S., 1995). Однако экспериментальных работ, посвященных изучению механизмов адаптации на субклеточном уровне, с участием гетерогенных белковых систем, повреждаемых либо принимающих участие в промежуточном метаболизме чужеродных химических соединений в доступной нам литературе нет.

Цель исследования.

1. Изучение механизмов адаптации и деадаптации при хроническом воздействии токсических веществ различных классов на разных уровнях воздействия и выявление качественных и количественных изменений гетерогенных белков или ферментов, принимающих участие в метаболизме исследуемых веществ либо непосредственно повреждаемых ими, а также определение "энергетической цены" адаптации и деадаптации на различных уровнях воздействия токсических веществ.

Задачи исследования.

1. Дать сравнительную характеристику изоферментным спектрам алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы крыс, подвергавшихся хроническому 2-х месячному воздействию органического эфира, определяя момент наступления толерантности с помощью однократной нагрузки высокой дозой исследуемого вещества.

2. Выявить изменения фракционного состава гемоглобина при длительном воздействии анилина и гидропероксида трет-бутила в комплексе с изучением биохимических показателей с учетом специфики действия каждого вещества. Проверить, сохраняется ли зависимость доза - эффект на уровне обычных биохимических показателей и на уровне изменений состава гетерогенных белков при длительных сроках воздействия.

3. Проследить взаимосвязь между выраженностью деадаптивных перестроек на уровне фракционного состава гемоглобина и появлением патологических биохимических изменений в отдаленные сроки после прекращения воздействия вещества.

4. Определить "энергетическую цену" процессов адаптации и деадаптации на разных уровнях воздействия веществ по энергопроцессам в миокарде как наиболее чувствительном к энергодефициту органе.

5. На основании полученных результатов доказать целесообразность изучения гетерогенных белков и (или) ферментов, участвующих в метаболизме либо избирательно повреждаемых исследуемым веществом, для обнаружения состояния долгосрочной адаптации при длительном действии токсических веществ при отсутствии признаков токсического действия.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Хроническое воздействие диэтнлового эфира малеиновой кислоты в двух исследованных концентрациях вызывает адаптивные изменения изоферментных спектров участвующих в его метаболизме ферментных

систем - алкоголь- и альдегиддегидрогеназной, качественно различные на разных уровнях воздействия.

2. Длительное действие веществ метгемоглобинобразователей - анилина и гидропероксида трет-бутила - вызывает адаптивные изменения фракционного состава гемоглобина. При отмене воздействия развитие деадаптивных изменений идет с инверсией экспресии различных типов тетрамеров.

3. Зависимость "доза-эффект" при длительном действии токсических веществ в низких концентрациях носит качественно индивидуальный характер для каждого уровня воздействия.

4. Потомство животных, подвергавшихся хроническому воздействию гидропероксида трет-бутила во время беременности, рождается с предадаптивными изменениями красной крови.

5. Повышение интенсивности энергообмена сопровождает развитие как прямой адаптации к хроническому воздействию вещества, так и обратной адаптации при отмене его воздействия.

Научная новнзиа работы

1. Впервые исследованы изоферментные спектры алкогольдегидрогеназы (АДГ) и альдегиддегидрогеназы (АлДГ) в печени крыс, подвергавшихся хроническому 2-х месячному воздействию ДЭМК на двух уровнях воздействия.

2. Показано, что нормализация общей (тотальной) активности изучаемых ферментов в печени животных экспериментальных групп скрывает под собой изменения изоферментного состава, качественно различные на каждом из исследованных уровней воздействия.

3. Установлено, что наблюдающаяся при двухмесячном воздействии ДЭМК толерантность указанных ферментов к ингибирующему действию однократной высокодозовой нагрузки обусловлена появлением индуцируемых фракций АДГ и АлДГ с кинетическими параметрами, отличными от конститутивных.

4. В хроническом эксперименте с анилином впервые показано, что наблюдающееся при хроническом действии этого вещества отсутствие метгемоглобинемии в определенной мере обуславливается адаптивными изменениями гетерогенной системы гемоглобина.

5. Исследован фракционный состав гемоглобина у животных, подвергавшихся хроническому воздействию вещества-метгемоглобинобразователя в неонатальном периоде.

6. Впервые показано, что интесификация энергетического обмена миокарда при хроническом воздействии веществ сопровождает развитие не только адаптивных, но и деадаптивных изменений.

Научно - практическая значимость работы:

1. Обоснована целесообразность определения изменений фракционного состава гетерогенных белков и ферментов как показателя задействованнности механизмов долгосрочной адаптации, идущих с формированием "системного структурного следа".

2. Обоснована необходимость изучения содержания метаболитов и нзоферментных спектров участвующих в метаболизме конкретного химического вещества ферментных систем в отдаленные сроки после прекращения воздействия вещества.

3. Предложено определение показателей энергетического обмена для разграничения физиологической адаптации и деадаптации от таковых, протекающих с превышением физиологических резервов мощности энергообеспечивающих систем.

Внедрение результатов в практику:

Представленные материалы были использованы для обоснования ПДК ДЭМК в воздухе рабочей зоны (ГОСТ № 451) и ПДК ГПТБ в воде водоемов (02930001087, 1991г.).

Апробация работы:

Основные положения диссертации доложены на областной научно-технической конференции "Молодежь и научно-технический прогресс" (1984), на научно-практической конференции молодых ученых Куйбышевского НИИ гигиены (1991), на совместном заседании научно-методического совета Самарского НИИ гигиены, Самарского Государственного медицинского университета и кафедры биохимии Самарского Государственного университета (2000).

Диссертация изложена на 148-ми страницах машинописного текста, включает введение, обзор литературы, описание материала и методов исследования, 3 подглавы собственных наблюдений, заключение, выводы, практические рекомендации, список литературы, приложение. Работа иллюстрирована 18-ю таблицами и 24-мя рисунками. Список литературы содержит 201 источник, из которых 95 отечественных и 106 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ:

Материал и методы исследования.

Работа проводилась на 605 самках крыс, из них 360 линии Вистар и 245 беспородных, содержащихся в стандартных условиях виварного режима.

В качестве модельных веществ были использованы: диэтиловый эфир малеиновой кислоты (ДЭМК), этиловый эфир перметриновой кислоты (ЭЭПК), анилин и гидропероксид трет-бутила (ГПТБ). Всего было проведено 3 хронических эксперимента, один острый и 2 субхронических (4-х и 5-и -дневные). Длительность хронического эксперимента с ДЭМК составила 2 месяца, с анилином - 3 месяца, с ГПТБ - 6 месяцев, кроме того, в эксперименте с ГПТБ показатели снимались через 1 и 7 месяцев после прекращения затравок. Биохимические показатели у животных, подвергавшихся воздействию ГПТБ в неонатальном периоде, снимались по достижении потомством возраста 3-х месяцев.

Вещества животным вводили парентерально в следующих дозах: ДЭМК в хроническом эксперименте - 60 мг/кг и 24 мг/кг (действующая и пороговая дозы в пересчете с концентраций, выраженных в мг/м3 при ингаляционном воздействии); ДЭМК в субхроническом эксперименте, в остром опыте и при нагрузочном тесте - 120 мг/кг, ЭЭПК - 200 мг/кг и 40 мг/кг (действующая и пороговая дозы). Затравки ДЭМК и ЭЭПК осуществлялись ежедневно. Анилин животным в хроническом эксперименте вводили в дозах 55 и 27,5 мг/кг, при нагрузочном тесте - 110 мг/кг, ГПТБ - в дозах 0,7, 0,07 и 0,007 мг/кг 5 раз в неделю.

Забой животных осуществлялся методом дислокации шейных позвонков. Печень перфузировали средой выделения у пренаркотизированных этиловым эфиром животных. Субклеточные фракции получали общепринятыми методами дифференциального центрифугирования (Путилина Ф.Е., 1982).

Препаративное выделение АДГ осуществлялось методом жидкостной колоночной хроматографии, описанным Mezey Е., Potter J.( 1983), за исключением этапа аффинной хроматографии. Качество очистки контролировалось электрофоретическн. Выделение АлДГ различной субклеточной локализации проводилось по методу Lindal R., Evcer S. (1984) . Активность АДГ определяли по методу Кочеткова Г.А. (1980), активность АлДГ - по методу Nakanishi S. (1978).

Содержание гемоглобина и его дериватов в крови проводили по А.А. Покровскому (1969). Определение пероксидазной активности гемолнзата эритроцитов осуществлялось по Асатиани B.C. (1969). Определение активности метгемоглобинредуктазы крови проводили по методу Дервиз Г.В.

(1976). Для оценки интенсивности процессов перекнсного окисления липидов (ПОЛ) определяли содержание малонового днальдегнда (МДА) и гидроперекисей липидов (ГЛ) в плазме крови по методам Стальной М.Д.

(1977); для оценки состояния антиперекисной защиты определяли содержание восстановленного глутатиона по Miao-Lin Ни (1985) н активность каталазы крови по Keilin D. (1954), глутатионредуктазы крови и глутатионперокисдазы сыворотки крови по методам Панчепко Л.Ф.(1975) и Schramm II. (1985).

Фракционирование гемоглобина проводили в полиакриламидном геле по методу Стародуба Н.Ф. (1987) в градиенте рН. Гемолизат крови для электрофореза приготавливали по методу Minterbourn С. (1974). Гели

окрашивали Понсо-S, денсптометрпровали при 540 нм. Количественную оценку электрофореграмм осуществляли методом взвешивания пиков.

Активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) в митохондриях, активность гексокиназы, скорость гликолиза определяли по методам Путилиной Ф.Е. (1982). Фракционирование изоферментов ЛДГ осуществляли по методу Шаныгиной К.И. (1977). Статистическую обработку результатов проводили по методу Стыодента - Фишера (1980), в ряде случаев использовали непараметрический критерий Уилкоксона и парный Т-критерий (Ашмарин И.П., 1975). Рассчет кинетических констант проводили по способу Лайниувера - Берка (1980). Все расчеты осуществлялись на ПК с помощью программного приложения "Excel".

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ

ОБСУЖДЕНИЕ

I.Адаптация алкоголь - и альдегиддегндрогеназных мультиферментиых систем печенн к действию эфнров органических кислот (ДЭМК и ЭЭПК).

Этиловые эфиры органических кислот ДЭМК и ЭЭПК являются гидрофобными липидорастворимыми соединениями, которые могут быть гидролизованными до органических кислот и этанола (Рублева Л.М., 1964). Окисление этанола в печени катализируют апкогольдегидрогеназная система печени, микросомальный изофермент цитохрома Р-450 - 3450IEI (Martini R., 1997) и каталазно-пероксидазная системы (Коор D.E., 1985) . Окисление этанола при участии алкогольдегидрогеназы (АДГ) считается основным путем его метаболизма при низких уровнях воздействия, считают, что не более 40% этанола подвергается микросомальному окислению (Matsumoto Н., 1996) .

Известно, что АДГ и АлДГ печени крыс принимают непосредственное участие в окислении промежуточных продуктов метаболиза ДЭМК - этанола и ацетальдегида, - высокая токсичность которых и повреждающее воздействие на печень хорошо изучены.

В предварительном остром однократном эксперименте было установлено, что через 3 часа после однократного введения ДЭМК активность АДГ и АлДГ у интактных животных достоверно снижается и составляет соответственно 79% и 69% от контрольного уровня. Снижение активности после однократного воздействия сохраняется на том же уровне через 6 часов после нагрузки, и восстанавливается до нормы через 12 часов.

У животных, подвергавшихся хроническому воздействию ДЭМК на уровне 60 мг/кг, уровень ингибирования АДГ нагрузочной дозой снижается практически до нуля, на низком уровне воздействия величина остаточной активности меньше, но также достоверно превышает уровень контроля. Уровень ингибирования как цитоплазматической, так и митохондриальной АлДГ через 3 часа после нагрузки был наименьшим у животных 2-й группы.

На уровне хронического воздействия ДЭМК 60 мг/кг снижение уровня ингибирования АлДГ также достоверно, хотя и менее выражено, кроме того, повышена фоновая активность митохондриальной формы фермента (Табл.1).

Таблица 1

Изменение активности АДГ и АлДГ у контрольных и подвергавшихся хроническому воздействию ДЭМК крыс после однократной нагрузки ДЭМК в дозе 120 мг/кг (нМ/мг белка в мин).

Группа и уровень воздействия Активность ферментов

АДГ АлДГ мит. АлДГ цит.

Контроль, фон 4,286±0,200 7,714± 0,614 8,509±0,723

Контроль, нагрузка 3,43±0,23* 5,46±0,49* 5,84±0,39*

ДЭМК, 60 мг/кг,фон 4,09±0,22 8,28±0,76 7,26±0,67

ДЭМК, 60 мг/кг, нагрузка 4,17±0,21 7,33±0,60** 5,88±0,77

ДЭМК, 24 мг/кг, фон 5,67±0,31 ** 10,72±0,72** 6,37±0,39**

ДЭМК, 24 мг/кг, нагрузка 4,54±0,21 * 10,57±1,П 6,57±0,38

Примечание: * - р<0,05 для различий "Нагрузка" - "Фон"

** - р<0,05 для различий "Фон" контроля - "Фон" экспериментальной группы,

п = 9-10.

Изучение кинетических характеристик препаративно очищенной АДГ показало, что определенная в наших экспериментах Км для этанола АДГ из печени интактных крыс Вистар хорошо совпадала с данными Mezey Е., Potter J. (1983), по чьей методике проводилась очистка и выделение фермента.

Таблица 2

Кинетические константы АДГ контрольных и подвергавшихся хроническому воздействию ДЭМК крыс.

Группа и уровень п кга V макс.

воздействия повт. мМ этанола мМ/мг белка в мин

Контроль 3 1,600-10'3 80,26

ДЭМК, 60 мг/кг 3 **5,233-Ю"4 *55,29

ДЭМК, 24 мг/кг 2 *3,040-10"3 * 174,92

Примечание: *-р<0,05, **-р<0,01

Для АДГ из печени крыс, подвергавшихся воздействию ДЭМК на уровне 60 мг/кг, отмечается трехкратное повышение сродства к этанолу, скорость же

ферментативного катализа уменьшается в 1,5 раза. При низком уровне воздействия ДЭМК, наоборот, скорость катализа возрастает более чем двукратно при снижении сродства к ферменту в 1,9 раза (Табл.2). В силу большого количества требуемого для препаративного выделения ферментов биологического материала было сделано по 2-3 повторности определения кинетических констант для каждой экспериментальной группы, при этом в каждой серии объединялся биологический материал от 7-8 животных.

Хроматографическое разделение очищенной АДГ из печени животных контрольной и экспериментальных групп показало различие в их изоферментном составе (Рис.1)

20-1

15"

5 -

Активность, нм/мг белка в мин

5 10 15 20 25 30 35

Время, мин

Контроль

Активность,нм/мг белка в мин.

2 4 6 8 10 12 14

ДЭМК, 60 мг/кг

Время,мин

Активность, нм/мг белка в мин

10 12 14 16 18 20 22 24 Время, мин

ДЭМК, 24 мг/кг

Рис. 1. Профили элюирования АДГ при хроматографии на БР-сефадексе

АДГ из печени контрольных крыс элюируется 4-мя пиками, из которых 1 основной и 3 минорных, что согласуется с данными Mezey Е., Potter J. (1983). Выход фракций, содержащих специфическую активность, наблюдается с 9-ой по 22-ю и с 24-ой по 32-ю минуты элюции. АДГ из печени крыс, подвергавшихся воздействию ДЭМК на уровне 60 мг/кт, элюнровалась с колонки только 2-мя пиками: 1-ый - минорный, 2-ой - основной - и выходила отдельным от контроля по времени пиком, с 4-ю по 11-ю минуту элюции. АДГ из печени крыс, подвергавшихся воздействию ДЭМК на уровне 24 мг/кг, элюнровалась 3 пиками: 1-ый и 3-ий - минорные, 2-ой - основной, по времени выхода с колонки совпадала с основным изоферментом контроля.

Изменение хроматографических характеристик АДГ у животных экспериментальных групп подтверждает, что изменение кинетических параметров фермента из печени животных экспериментальных групп опосредуется изменениями их изоферментных спектров.

При характеристике АлДГ в основу был положен кинетический подход. Поскольку митохондриальный изофермент считается ответственным в основном за метаболизм эндогенного ацетальдегида (Lindal R., 1984), основное внимание в нашей работе было уделено фракциям АлДГ с микросомальной и цитоплазматическон локализацией. АДГ микросомальной фракции животных экспериментальных групп по сродству к ацетальдегиду и НАД не отличалась от контрольной.

Таблица 3

Активность АлДГс высокой и низкой Кт контрольных и подвергавшихся хроническому воздействию ДЭМК крыс в цитозоле, мкМ/мг белка в мин.

Группа и уровень воздействия Повт. 5 мМ ацетальдегид 0,005 мМ ацетальдегид

Контроль 3 1,586 1,454

ДЭМК, 60 мг/кг 3 1,942 1,942

ДЭМК, 24 мг/кг 3 3,814* 1,662

Примечание: * - р<0,05

В растворимой фракции печени крыс, подвергавшихся воздействию ДЭМК на низком уровне, возрастает активность изоформы АлДГ с низким сродством к ацетальдегиду (Табл. 3).

Активность окисления ароматического альдегида (бензальдегида) снижается относительно контрольного уровня как в микросомальной, так и в растворимой фракции печени крыс обеих экспериментальных групп. При этом снижение наиболее выражено на низком уровне воздействия (Табл.4).

Таблица 4

Активность АлДГс низкой Кт из печени контрольных и подвергавшихся хроническому воздействию ДЭМК крыс с различными субстратами, мкМ/мг

белка в мин.

Субклеточная Группа и уровень Ацетальде- Пропиональ- Бензаль-

локализация воздействия гид, 5 мМ дегид, дегид

5 мМ 5 мМ

Контроль 11,23 8,14 1,17

Микросомы ДЭМК, 60 мг/кг 11,62 7,30 0,23*

ДЭМК, 24 мг/кг 9,51 7,47 0*

Контроль 2,07 1,98 2,74

Цитозоль ДЭМК, 60 мг/кг 1,88 2,13 2,27

ДЭМК, 24 мг/кг 4,18* 4,53* 1,27*

Примечание: * - р<0,05

В растворимой фракции печени крыс, подвергавшихся хроническому воздействию ДЭМК, мы обнаружили изоформы АлДГ, по сродству к коферментам НАД и НАДФ не совпадающие с конститутивными, а схожие с идуцибельными, качественно различные для двух изученных уровней воздействия (Табл. 5).

Таблица 5

Соотношение активности с коферментами НАД и НАДФ АлДГ цитозольной фракции печени контрольных и подвергавшихся хроническому воздействию ДЭМК крыс (мкм/мг белка в мин)

Группа и Свободная на ДЭАЕ- Связанная с ДЭАЕ-

уровень ссфадексе фракция сефадексом фракция

воздействия НАД НАДФ НАД/ НАДФ НАД НАДФ НАД/ НАДФ

Контроль 17,78* 2,06 8,6 7,82 2,19 3,6

ДЭМК, 60 мг/кг 7,95* - 15,12 39,05* 0,4

ДЭМК, 24 мг/кг 4,08* 2,94 1,4 31,82* 14,54* 2,4

Примечание: * - р<0,05

Конститутивные изоформы АлДГс высокой Кт цитоплазматической фракции гомогената печени не строго НАД-специфичны (соотношение сродства НАД/НАДФ от 3-5/1 до 20/1 (Тоггопеп Я., 1985, что подтверждается и нашими данными, полученными на контрольных животных. Все же индуцируемые изоферменты могут быть разделены на две группы: индуцируемые канцерогенами (очень активны с ароматическими альдегидами и предпочитают НАДФ в качесте кофермента) и фенобарбитал-индуцируемые, строго НАД-зависнмые, не окисляющие ароматические альдегиды (ЫакатБЫ Б.,1978,1988; Тоггопеп К.,1977,1985) . В нашем эксперименте на уровне воздействия ДЭМК 60 мг/кг не связываемая на ДЭАЭ-сефадексе фракция проявляет строгую НАД-специфичность, что характерно только для

индуцируемых фракций. ДЭАЭ-связываемая фракция, наоборот, отличается высоким сродством к НАДФ, что также характерно только для индуцируемых фракций. На уровне воздействия ДЭМК 24 мг/кг не связанная на ДЭАЭ фракция проявляет сродство к коферментам НАД/НАДФ, близкое к 4/3, характерное для фенантрен-индуцнруемой фракции ;Тorronen R., 1985) .

Связанная на ДЭАЭ фракция также проявляет соотношение сродства НАД/НАДФ, близкое к таковому для ТСДД - индуцируемое фракции (Marsals M., 1977).

Таким образом, через 2 месяца от начала хронического воздействия ДЭМК в двух различных концентрациях ферменты цетоксицирующей системы печени АДГ и АлДГ подопытных животных обладают повышенной устойчивостью к однократной нагрузке ДЭМК в высокой дозе. Обнаруженная толерантность АДГ и АлДГ к ингибирующему действию ДЭМК обуславивается изменениями их изоферментных спектров, которые выражаются в изменениях кинетических характепистик АДГ и появлении индуцируемых фракций АлДГ в цитозоле.

Чтобы подтвердить адаптивный характер наблюдаемых нами изменений изоферментных спектров АДГ и АлДГ и отделить их от феномена генетической индукции, при которой само вещество в силу своих структурных особенностей является индуктором синтеза определенных изоформ того или иного фермента, мы провели субхронический эксперимент с 4-х дневным введением ДЭМК в дозе 110 мг/кг, используемом при нагрузочном тесте. В субхроническом эксперименте с ДЭМК через 24 часа после последней затравки мы не обнаружили индукции ни одной из изученных нами изоформ АлДГ, напротив, отмечалось снижение активности растьоримой формы фермента и отсутствие изменений в микросомальной. Сходные результаты при субхроническом (недельном) действии трихлорэплена наблюдал Wang RS., 1999. Что же касается АДГ, то уже после 4-х крап ой затравки высокой дозой ДЭМК в клетках печени обнаруживается изофермент с высокой Кт, близкой к той, что была определена при хроническом воздействии ДЭМК в группе с высоким уровнем воздействия (Кт=7,7б-10"4, р<0,01). Поскольку концентрация и токсическое действие метаболического ацетальдегида при использованной в субхроническом эксперименте концентрации ДЭМК возрастают, обнаруженные изменения можно трактовать как начало становления адаптивно-приспособительных реакций при высоком уровне образования токсичных продуктов метаболизма ДЭМК.

Возможно, что повышение сродства АДГ к субстрату и снижение скорости его превращения в ацетальдегнд с одной стороны и изменение кинетических параметров АлДГ с другой (повышение избирательности к алифатическим альдегидам по сравнению с ароматическими и появление индуцируемых изоформ в цитозолыюй фракции) позволяют эффективно снизить внутриклеточную концентрацию наиболее высокотоксичного метаболита - ацетальдегида - при высоком уровне хронического воздействия ДЭМК (60 мг/кг). Что же касается низкого уровня воздействия ДЭМК, то в

этом случае, напротив, увеличивается скорость окисления и этанола, и ацетальдегида, о чем свидетельствует снижение сродства к субстрату и повышение скорости катализа АДГ, а также повышение активности, избирательности к алифатическим альдегидам и появление индцируемых форм АлДГ в цитоплазматической фракции гомогената печени. Очевидно, на данном уровне воздействия оказывается более целесообразным увеличение скорости окисления субстратов, а не снижение пропускной способности данного метаболического звена.

Характер регуляции активности участвующего в промежуточном метаболизме органических эфиров фермента АлДГ на начальных этапах воздействия вещества в зависимости от уровня воздействия изучался при пятикратном воздействии ЭЭПК.

На высоком уровне воздействия (200 мг/кг) наблюдается достоверное снижение активности растворимой изоформы АлДГ с высокой Кт на обоих сроках снятия показателей (на 44 и 42 % соответственно, р<0,05), на низком уровне воздействия изменения не достигают значимого уровня. Активность микросомалыюго изофермента на высоком уровне воздействия повышена на обоих сроках снятия показателей (на 46 и 29,5 % соответственно, р<0,05). На низком уровне воздействия через 3 часа после затравки наблюдалось достоверное (р<0,05) снижение активности микросомальной АлДГ на 41 %, которое через 20 часов сменялось активацией (на 67 %, р<0,05). Активность растворимой АлДГ с низкой Кт на уровне воздействия ЭЭПК 200мг/кг снижается на обоих сроках воздействия (на 47 и 38,5 % соответственно, р<0,05). При низком уровне воздействия активность этой изоформы АлДГ повышается на 31 % (р<0,05) через часа и восстанавливается до уровня контроля через 20 часов после последнего введения ЭЭПК (Рис.2).

Складывается впечатление, что на высоком уровне воздействия быстрее устанавливается новый стабильный тип соотношения активности изоферментов с различной субклеточной локализацией и разным сродством к субстрату, тогда как на низком уровне воздействия наблюдаются значительные колебания активности различных изоформ АлДГ относительно уровня контроля в течение суток. Такая реакция на различные уровни воздействия ЭЭПК свидетельствует об отсутствии прямой количественной зависимости "доза - эффект" в отношении активности ферментов, принимающих участие в метаболизме ЭЭПК. Как и в хроническом эксперименте с ДЭМК, она носит качественный характер. При этом как при срочной, так и при хронической адаптации регуляторные сдвиги направлены прежде всего на нормализацию до физиологического уровня содержания в клетке наиболее токсичных метаболитов (в данном случае ацетальдегида) за счет изменения активности (в меньшей мере) и каталитических параметров (в большей мере) участвующих в метаболизме этого субстрата ферментов.

Рис.2. Изменения активности АлДГ различной субклеточной локализации при субхроническом воздействии ЭЭПК (в % к контролю).

-200 мг/кг;------40 мг/кг.

1 - 3 часа после воздействия; 2—19 часов после воздействия.

а) - микросомальная фракция, 5 мМ пропиональдегид;

б) - цитоплазматическая фракция, 0,05 мМ пропиональдегид,

в) - цитоплазматическая фракция, 5 мМ пропиональдегид.

II. Адаптация гетерогенной системы гемоглобина к хроническому действию веществ-метгемоглобннобразователен различных классов.

При хроническом трехмесячном воздействии анилина ни на одном из уровней воздействия ни разу в течение хронического эксперимента основной прогностический показатель интоксикации - процентное содержание метгемоглобина в крови животных экспериментальных групп - не превышал контрольный уровень, в то время как остальные исследуемые показатели претерпевали существенные изменения. Повышение активности метгемоглобинредуктазы и содержания восстановленного глутатиона в клетке свидетельствуют об интенсификации обезвреживания метгемоглобина в период срочной адаптации.

Через 3 месяца от начала затравок нормализуется содержание гемоглобина в крови и активность большинства ферментов антиперекисной защиты, а также активность метгемоглобинредуктазы, однако сохранение повышенного содержания глутатиона в крови может свидетельствовать об интенсивно протекающих процессах обезвреживания перекисных радикалов.

Таблица 6

Содержание дериватов гемоглобина в крови животных, подвергавшихся хроническому воздействию анилина до и через 3 часа после однократной нагрузки анилином в дозе 110 мг/кг

Сроки Статистичес- Группы и уровень воздействия

воздействия кие Анилин, Анилин, Контроль

55 мг/кг 27,5 мг/кг

показатели Фон На- Фон На- Фон На-

грузка грузка грузка

Метгемогло- М 0,40 0,61** 0,45 2,02* 0,43 2,26*

бин, г% т 0,03 0,10 0,04 0,12 0,03 0,08

Сульфгемо- М 0,38 0,35 0,36 0,42 0,11 0,23*

глобин, г% т 0,03 0,03 0,03 0,04 0,01 0,01

Примечание : п=10 во всех статистических группах

*-р<0,05 для различия "фон" - "нагрузка" внутри группы,

** р<0,05 для различия "нагрузка" экспериментальной группы - "нагрузка"

контроля.

Нагрузочный тест с анилином в дозе 110 мг/кг подтвердил доз -зависимое уменьшение образования дериватов гемоглобина у животных экспериментальных групп (Табл. 6) после однократной нагрузки.

Электрофоретическое фракционирование гемоглобина показало, что в крови животных обеих экспериментальных групп достоверно повышается содержание гемоглобина 3-ей, 4-ой и 6-ой фракций, наименее чувствительных

с аутоокисленшо (Стародуб Н.Ф., 1989) и резко падает содержание 1-ой и 2-ой более чувствительных), причем эти изменения являются доз - зависимыми Рис. 3).'

Перестройка в соотношении различных фракций гемоглобина )беспечивается изменениями в уровне экспрессии глобиновых цепей различного типа. У животных экспериментальных групп достоверно и юзазависимо повышена экспрессия аа цепей ( 59, 9 % в контроле, 63,2 % во 21 и 64,7 % в 1-й группе, р<0,01) и Ра цепей (61,6 % в контроле, 71,4 % во 2-ой \ 72,8 в 1-ой группе, р<0,01), и снижена а ь (40,8 % в контроле, 36,8 % во 2-ой I 35,3 % в 1-ой группе, р<0,01) и р ь цепей (15,2 в контроле, 6,34 % во 2-ой и 1,65 % в 1-ой группе, р<0,01). Уровень экспресии Р° - цепей остается фактически неизменным. Таким образом, при '.рехмесячном воздействии шилина нормализация показателей красной крови животных экспериментальных групп и повышение устойчивости гемоглобина крови этих «ивотных к дополнительному метгемоглобинобразованию при однократной «грузке анилином в высокой дозе в значительной мере обуславливается изменениями фракционного состава гемоглобина в сторону увеличения процентного содержания фракций с низким спонтанным четгемоглобннобразованием, и уменьшения - с высоким.

50 -40 30 20

о -

-ш

7=71

f-.ii1

•V

•у*

Я ■Ш

■< 6 номера фракций

□ -аннлшц 55 м г/кг; В-анилин, 27.5 мг/кг; □-контроль

Рис.3. Изменения фракционного состава гемоглобина при 3-месячном воздействии анилина

При хроническом воздействии ГПТБ повышение содержания метгемоглобина наблюдается только через 2 недели от начала воздействия в группах с высоким и средним уровнем воздействия ГПТБ. Активность

метгемоглобинредуктазы достоверно повышена во всех трех экспериментальных группах через месяц, а в 1-ой и 2-ой - через 2 месяца после начала затравок, в дальнейшем она нормализуется вплоть до восстановительного периода.

Показатели, характеризующие процессы ПОЛ и антиперекисной защиты, указывают на значительную напряженность процессов генерации и обезвреживания свободных радикалов. На ранних этапах воздействия (до 1 -го месяца) наблюдаются резкие колебания как содержания метаболитов ПОЛ, так и активности ферментов антиоксидантной защиты на всех уровнях воздействия. В период от одного до 3 месяцев хронического воздействия ГПТБ происходит нормализация содержания продуктов ПОЛ и активности ферментов в крови животных экспериментальных групп, повышается содержание глутатиона.

%60

3 4 5 6

номера фракций

В-ГГГГБ, 0,7мг/кг; Е - ГПТБ, 0,07мг/кг; ■ - ГПТБ, 0,007мг/кг; □-контроль

Рис.4. Изменения фракционного состава гемоглобина при 3,5-месячном воздействии ГПТБ .

Проведенное через 3,5 месяца от начала затравок электрофоретическое фракционирование гемоглобина показало, что в крови животных 2-ой и З-ей экспериментальных групп достоверно повышается содержание гемоглобина 3-ей фракции, снижается содержание 5-ой (только во 2-ой группе) и 6-ой фракций, а в 3-й группе, кроме того, 1-ой и 2-ой фракций, причем наибольшую выраженность изменения имеют в группе со средним уровнем воздействия (Рис.4).

Период от 3-х до 6-и месяцев хронического воздействия ГПТБ характеризуется исчезновением доз - зависимости в изменениях показателей.

Самый высокий по отношению к контролю уровен > глутатиона отмечается во 2-ой группе, в этой лее группе наблюдается наименьшее накопление терминального продукта ПОЛ МДА, что на наш взгляд согласуется с наиболее выраженными в этой группе адаптивными изменениями со стороны фракционного состава гемоглобина.

В период восстановления через 1 месяц после отмены воздействия ГПТБ в 1-ой группе наблюдается повышение процентного содержания метгемоглобина, снижение содержания глутатиона и падение активности метгемоглобинредуктазы и пероксидазы, которые можно трактовать как процесс обратного развития адаптивных приспособлений. Однако через 7 месяцев восстановления именно в этой экспериментальной группе показатели максимально приближены к уровню контрольной группы, наибольшее же число достоверно отличающихся от контроля показателей отмечается в группе го средним уровнем воздействия.

%45

номера фракций

□ - ГПТБ, 0,7мг/кг; Ш - ГПТБ, 0,07мг/кг; ■ - ГПТБ, 0,007ч.-/кг; □-контроль

эис.5. Изменение фракционного состава гемоглобина через 7 месяцев зосстановителыюго периода при хроническом воздействии ГПТБ.

Анализ фракционного состава гемоглоЗина через 7 месяцев восстановительного периода показывает, что в крови животных из групп со :редним и низким уровнями воздействия ГПГБ достоверно снижается 1роцентное содержание гемоглобина 3-ей, наименее чувствительной к аутоокислению фракции и повышается - 6-ой и ¿-ой (последней только на греднем уровне воздействия).

Таким образом, достоверно повышенный уровень метгемоглобина в фови животных 2-ой экспериментальной групп через 7 месяцев после отмены аействия ГПТБ обуславливается как низкой активностью

метгемоглобинредуктазы, та\' и перераспределением соотношения синетеза глобиновых цепей в сторону увеличения содержания высокочувствиельных к метгемоглобинобразованию форм и снижения - низкочувствительных (Рис. 5).

Потомство самок крыс, подвергавшихся воздействию ГПТБ во время беременности, в трехмесячном возрасте имеет нефизиологически низкий уровень метгемоглобина в крови (2,0 % на высоком и 1,8 % на низком уровне воздействия против 4,7 % Е контроле, р<0,01) на фоне высокого уровня перекисных метаболитов, а также деадаптационных изменений фракционного состава гемоглобина, выраженных только на низком уровне воздействия: повышенного содержания 5-ой (с 19,3 % до 21,9 %, р<0,05) и сниженного 3-ей фракции (с 31,9 % до 28,9 %, р<0,01), что очевидно, является результатом обратного развития врожденных предадаптивных изменений до уровня популяционной нормы.

Полученные результаты свидетельствуют, что зависимость изменений биохимических показателей от уровня воздействия вещества лишь на ранних этапах воздействия коррелирует с его уровнем, когда реализуются механизмы срочной адаптации, выражающиеся в количественном изменении содержания в клетке конститутивно экспр ессируемых белков и ферментов.

При более длительное воздействии вещества такой путь адаптации, являющийся пластически и э; ергетически более дорогостоящим для организма, постепенно заменяется более точным и менее энергоемким путем адаптации: заменой конститутивно фу. хционирующих в клетке белков, регулирующих содержание данного метаболита, на белки с иными кинетическими параметрами, наиболее эффективными в новых метаболических условиях. На уровне достижения тгюй долгосрочной адаптации поддерживаются нормальные концентрациошие соотношения метаболитов при измененной их продукции или поступлении ? организм.

Нагрузочные тесты покага.ш, что долгосрочная адаптация к хроническому действию химических соединений всегда осуществляется с определенным "запасом прочности" снстемь . Механизм формирования "прочностного запаса" неизвестен, однако сам фкт повышения устойчивости организма при прерывистом (интермиттирующем) режиме воздействия фактора давно и широко известен и получил название "предваряющей адаптации".

Очевидно, при формировании долгосрочной адаптации отмена воздействия вынуждает организм адаптироваться заново к изменившимся концентрациям метаболитов, но тоже с избыточным запасом, не сохраняя "памяти" о физиологической норме. Этим можно объяснить инверсию фракционного состава гемоглобина через 7 месяцев восстановления при действии средней дозы ГПТБ, которая в сочетании с падением содержания глутатиона и снижением активности метгемоглобинредуктазы приводит к метгемоглобинемии, обусловленной неэффективным обезвреживанием образующегося в физиологических концентрациях метгемоглобина.

Ш.Энергетнческие процессы в миокарде при хроническом воздействии ДЭМК н ГПТБ.

Для того , чтобы попытаться оценить "энергетическую цену" адаптации к фоническому воздействию ДЭМК и ГПТБ, мы проводили исследования шергетических процессов в миокарде как наиболее чувствительном к шергодефициту органе, не являющемся в тоже время специфическим органом ■ мишенью при действии данных веществ.

Хроническое 4-х месячное ингаляционное воздействие ДЭМК на /ровнях, эквивалентных дозам, использованным при внутрижелудочных затравках, приводило к дозазависимому подавлению аэробной фазы апологического окисления, оцениваемой по активности СДГ. Анаэробная фаза при этом компенсаторно интенсифицировалась, о чем свидетельствовало возрастание активности гексокиназы. В восстановительном периоде активность СДГ восстанавливается до нормы, в то время как активность гексокиназы остается повышенной. Достоверного уровня различия достигают только в группе с высоким уровнем воздействия, на низком уровне воздействия различия в показателях недостоверны (Табл. 7).

Таблица 7

Показатели энергетического состояния миокарда через 4 месяца хронического ингаляционного воздействия ДЭМК и через 1 месяц восстановительного периода

Показатель (нмоль/мг белка в мин) и срок воздействия Группа и уровень воздействия

1/20 ОЬ,0 1/50 БЬ0 Контроль

Активность гексокиназы, 4 мес. 34,89±1,61** ?0,18±1,68 25,20±1,78

Активность гексокиназы, восст. 53,54±2,76* 44,73±2,26 40,44±3,46

Активность СДГ, 4 мес. 8,72±1,80** 26,67±3,46 27,11±3,70

Активность СДГ, восст. 17,12±2,77 16,69±2,47 19,33±1,97

Примечание: * -р<0,05, ** -р<0,01, п = 9-10.

В хроническом эксперименте с ГПТБ забой животных и изучение энергопроцессов в миокарде проводилось через 7 месяцев восстановительного периода, то есть в период деадаптации к воздействию вещества (Табл. 8).

Таблица 8

Показатели энергетического состояния миокарда через 7 месяцев восстановительного периода после хронического воздействия ГПТБ

Показатель Группы и уровень воздействия

ГПТБ, 0,7 мг/кг ГПТБ, 0,07 мг/кг ГПТБ, 0,007 мг/кг Контроль

Скорость гликолиза, нмоль/мг белка в мин 15,69±0,64** 14,12±0,97** 12,25±1,13 11,31±0,64

Активность СДГ, нмоль/мг белка в мин 53,68±3/Л** 49,27±3,74* 37,75±2,34 39,28±1,86

Изоферменты лактатдегидрогеназы, % 1 30,05±1,40** 31,01±1,15** 32,20±1,76** 38,55±1,97

4 18,28±1,47** 18,99±1,83** 16,94±1,28* 7,89±1,10

Примечание: п во всех группах равно 10, * - р<0,05, **- р<0,05

В этом случае наблюдалась дозазависимая активация энергопроцессов в миокарде, причем как аэробной, так и анаэробной фаз биологического окисления, о чнм свидетельствует активация гликолиза и возрастание активности сукцинатдегидрогеназы, а также изменения изоферментного состава лактатдегидрогеназы. Полученные данные свидетельствуют, что деадаптационные процессы при хроническом воздействии токсических веществ также требуют повышенных энергозатрат, уровень которых прямо зависит от уровня воздействия вещества.

Выводы

1. Хроническое воздействие ДЭМК в дозах 60 и 24 мг/кг вызывает изменения изоферментных спектров АДГ и АлДГ, обуславливающие снижение либо отсутствие ингибирования данных ферментов при однократном нагрузочном воздействии высокой дозой ДЭМК

2. Адаптация к хроническому воздействию веществ метгемоглобинобразователей (анилина и ГПТБ) в значительной мере обуславливается изменением содержания различных типов тетрамера

гемоглобина, отличающихся по устойчивости к спонтанному метгемоглобинобразованию. При отмене воздействия ГШ Б развитие деадаптивных изменений вдет с инверсией экспресии различных типов тетрамеров.

3. После трех месяцев воздействия ГПТБ изме нения гетерогенной системы гемоглобина и ферментов антиоксидантнок защиты носят качественно различный характер на разных уровнях воздействия.

4. Животные, подвергавшиеся воздействию ГПТБ в неонатальном периоде, отличаются от интактных нефизиологически низким содержанием метгемоглобина и измененным фракционным составом гемоглобина.

5. Как адаптивные, так и деадаптивные изменения сопровождаются интенсификацией энергообмена миокарда, возрастающей при повышении уровня воздействия.

Практические рекомендации:

1. Поскольку отсутствие в ходе длительных экспериментов количественных изменений ферментативной активности может скрывать под собой адаптивные перестройки, включающие активацию генетического аппарата клетки и синтез новых, наиболее адекватных в новых метаболических условиях форм белков и ферментов, следует изучать изоферментные спектры важнейших регуляторных либо избирательно повреждаемых воздействующим фактором белков.

2. Так как адаптивные процессы направлены прежде всего на поддержание физиологических концентраций важнейших метаболитов, следует определять концентрацию тех метаболитов, содержание которых может быть нарушено в результате токсического действия либо в процессе метаболизма исследуемого вещества.

3. Необходимо проводить изучение содержания метаболитов и изоферментных спектров участвующих в метаболизме конкрет.чого химического вещества ферментов в отдаленные сроки после прекращения действия вещества с целью выявления нарушений метаболизма в ходе процесса деадаптации.

4. Поскольку процессы как прямой, так и обратной адаптации сопровождаются интенсификацией обменных процессов и повышением энергозатрат, целесообразно оценивать "энергетическую стоимость" процессов адаптации к хроническому воздействию исследуемого фактора и деадаптационных процессов после прекращения его воздействия.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1.Изменение энергетического обмена миокарда крыс при воздействии диэтилового эфира малеиновой кислоты // Молодежь и научно-технический прогресс: тез. обл. научн.-техн. конф. Ноябрь, 1584. - Куйбышев.-1984.- С65. (соавт. Музуров И.В.)

2.Оценка воздействия ДЭМК на состояние энергетического обмена миокард: И Гигиена труда и профпатология в машиностроительной и нефтехимическо! промышленности: Сб. научн. тр. Моск. НИИ гигиены им.Ф.Ф.Эрисмана,- М.-1984.-С.58-63.

3.Изменение изофермеьтного спектра алкогольдегидрогеназы I альдегиддегидрогеназы печени крыс при хроническом воздействие диэтилового эфира малеиновой кислоты // Сравнительная биохимии позвоночных.-Куйбышев: КГУ,- 1987. - С.3-9. (соавт. Губернаторова И.В.)

4.Роль изменений изоферментных спектров в адптации к длительному воздействию токсических веществ различных классов // Пояснит.записка № 86 /Куйбышевский филиал НПО "Гигиена и профпатология" МЗ РСФСР Инв № 02900011931.- Куйбышев. - 1990. - 86 с.

5.0 возможности выявления скрытых метгемоглобинемий при изучении фракционного состава гемоглобина. // Окруж. среда и здоровье. Сб. научн. тр.-М., 1991.- С.115-122.

Л.П.№020316 от 04.12.86 г. Подписано в печать /7?, О в'. 2.000 Формат 60X84/16. Бумага офсетная. Печать оперативная. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 9 Издательство "Самарский университет" УОПСамГ7 ПЛД № 67-43 от 19.02.98 г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Милякова, Марина Николаевна

Список сокращений и условных обозначений.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ АДАПТАЦИИ.

1.1 .Общие механизмы адаптации. Энергетические аспекты адаптации.

1.2. Механизмы адаптации к действию ксенобиотиков.

Глава 2.МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 3. СОБСТВЕННЫЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ДАННЫЕ.

3.1. АДАПТАЦИЯ АЛКОГОЛЬ- И АЛЬДЕГИДДЕГИДРОГЕНАЗНЫХ СИСТЕМ ПЕЧЕНИ К ДЕЙСТВИЮ ЭТИЛОВЫХ ЭФИРОВ ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ.

3.1.1. Изменение активности АДГ и АлДГ печени крыс при однократном воздействии ДЭМК в остром и хроническом экспериментах.

3.1.2. Сравнительная характеристика АДГ печени контрольных и подвергавшихся хроническому воздействию ДЭМК крыс.

3.1.3. Сравнительная характеристика АлДГ печени контрольных и подвергавшихся хроническому воздействию ДЭМК крыс.

3.1.4. Сравнительная характеристика АДГ и АлДГ печени контрольных и подвергавшихся субхроническому воздействию ДЭМК крыс.

3.1.5.Изменения активности АлДГ различной субклеточной локализации при субхроническом воздействии ЭЭПК.

3.2.АДАПТАЦИЯ ГЕТЕРОГЕННОЙ СИСТЕМЫ ГЕМОГЛОБИНА К ХРОНИЧЕСКОМУ ДЕЙСТВИЮ МЕТГЕМОГЛОБИН-ОБРАЗОВАТЕЛЕЙ РАЗЛИЧНЫХ КЛАССОВ.

3.2.1. Адаптация гетерогенной системы гемоглобина к хроническому воздействию анилина.

3.2.2. Адаптация гетерогенной системы гемоглобина к хроническому воздействию ГПТБ.

3.3 ИЗМЕНЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ КРАСНОЙ КРОВИ И ФРАКЦИОННОГО СОСТАВА ГЕМОГЛОБИНА У КРЫС, ПОДВЕРГАВШИХСЯ

ВОЗДЕЙСТВИЮ ГПТБ В НЕОНАТАЛЬНОМ ПЕРИОДЕ.

3.3 .ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В МИОКАРДЕ ПРИ

ХРОНИЧЕСКОМ ВОЗДЕЙСТВИИ ДЭМК И ГПТБ.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ЗАКЛЮЧНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы адаптации кислородтранспортных и детоксицирующих систем к хроническому действию токсических веществ различных классов"

Актуальность проблемы

До сих пор достаточно информативных критериев выявления состояния адаптации известно мало, а теории долгосрочного прогнозирования здоровья живых систем в условиях длительного существования в измененной среде практически нет [8, 11, 38]. Приспособление организма к длительному воздействию вредных веществ часто обозначают как "привыкание", имея в виду понижение чувствительности организма к химическим агентам. Однако привыкание может включать в себя широкий спектр адаптационных и компенсаторно-приспособительных реакций организма, различающихся по наличию и степени выраженности патогенетического компонента в приспособительных процессах, а также тяжести их отдаленных последствий [23, 34, 37, 41]. Основным путем адаптации и причиной возникновения временной толерантности при хроническом действии токсических соединений считается их биотрансформация ферментами микросомального и немикросомального окисления в печени [161, 165, 172, 174, 177]. Однако известно, что биотрансформация токсических соединений может приводить к их метаболической активации, а сопутствующие ей процессы перекисного окисления липидов являются причиной повреждения мембранных структур клетки [118, 160, 188, 193]. Поскольку пусковым механизмом развертывания адаптационных процессов считается дефицит макроэргов в клетке, ряд авторов предлагает изучать биоэнергетические процессы при экзогенной интоксикации [40, 60, 62, 64, 80, 83]. Однако при воздействии факторов малой интенсивности не всегда обнаруживаются фазовые изменения биологического окисления, хотя нагрузочные тесты выявляют адаптацию [92].

В настоящее время многие авторы приходят к заключению, что в основе длительной адаптации организма, обеспечивающей его нормальную жизнедеятельность в условиях постоянно меняющейся среды, лежит пластичность и динамичность белков, допускающая множественность локальных обратимых превращений белковой молекулы [28,47].

Необходимость углубленного изучения этого важнейшего стратегического пути долговременнной адаптации диктуется тем, что количественные и качественные перестройки в соотношении различных типов макромолекул при длительном воздействии фактора умеренной и слабой интенсивности могут проходить на фоне нормализации практически всех функциональных показателей [96]. Однако экспериментальных работ, посвященных изучению механизмов адаптации на субклеточном уровне, с участием гетерогенных белковых систем, повреждаемых либо принимающих участие в промежуточном метаболизме чужеродных химических соединений, а также сравнительной оценке энергозатрат организма в период срочной и долговременной адаптации к их действию в доступной нам литературе нет.

Цель исследования.

Задачи исследования.

1. Дать сравнительную характеристику изоферментным спектрам АДГ и АлДГ крыс, подвергавшихся хроническому 2-х месячному воздействию органического эфира, определяя момент наступления толерантности с помощью однократной нагрузки высокой дозой исследуемого вещества.

2. Выявить изменения фракционного состава гемоглобина при длительном воздействии анилина и ГПТБ в комплексе с изучением биохимических показателей с учетом специфики действия каждого вещества. Определить время перехода срочной (метаболической) адаптации в долгосрочную. Проверить, сохраняется ли зависимость доза - эффект на уровне обычных биохимических показателей и на уровне изменений состава гетерогенных белков при длительных сроках воздействия.

4. Определить "энергетическую цену" процессов адаптации и деадаптации на разных уровнях воздействия веществ по энергопроцессам в миокарде как наиболее чувствительным к энергодефициту органе.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Хроническое воздействие органического эфира (ДЭМК) в двух исследованных концентрациях вызывает адаптивные изменения изоферментных спектров участвующих в его метаболизме ферментных систем - АДГ и АлДГ, качественно различные на разных уровнях воздействия.

2. Длительное действие веществ метгемоглобинобразователей - анилина и ГПТБ - вызывает адаптивные изменения фракционного состава гемоглобина. При отмене воздействия развитие деадаптивных изменений идет с инверсией экспресии различных типов тетрамеров.

4. Потомство животных, подвергавшихся хроническому воздействию ГПТБ во время беременности, рождается с предадаптивными изменениями красной крови.

Научная новизна работы

1. Впервые исследованы изоферментные спектры АДГ и АлДГ в печени крыс, подвергавшихся хроническому 2-х месячному воздействию ДЭМК на двух уровнях воздействия.

3. Установлено, что наблюдающаяся при двухмесячном воздействии ДЭМК толерантность указанных ферментов к ингибирующему действию однократной высокодозовой нагрузки обусловлена появлением фракций АДГ и АлДГ с кинетическими параметрами, отличными от конститутивных фракций.

4. В хроническом эксперименте с анилином впервые показано, что наблюдающиеся при хроническом действии этого вещества отсутствие метгемоглобинемии при длительных сроках воздействия обуславливается адаптивными изменениями гетерогенной системы гемоглобина.

5. Исследован фракционный состав гемоглобина у потомства животных, подвергавшихся хроническому воздействию вещества метгемоглобинобразователя в период беременности.

6. Впервые показано, что интенсификация энергетического обмена миокарда при хроническом воздействии веществ сопровождает развитие не только адаптивных, но и деадаптивных изменений.

Научно - практическая значимость работы

2. Обоснована необходимость изучения содержания метаболитов и изоферментных спектров участвующих в метаболизме конкретного химического вещества ферментных систем в отдаленные сроки после прекращения воздействия вещества.

3. Предложено определение показателей энергетического обмена для разграничения физиологической адаптации и деадаптации от таковых,

10 протекающих с превышением физиологических резервов мощности энергообеспечивающих систем.

Внедрение результатов в практику:

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Милякова, Марина Николаевна

ВЫВОДЫ

2. Адаптация к хроническому воздействию веществ - метгемоглобинобра-зователей (анилина и ГПТБ) в значительной мере обуславливается изменением содержания различных типов тетрамера гемоглобина, отличающихся по устойчивости к спонтанному метгемоглобинобразованию. При отмене воздействия ГПТБ развитие деадаптивных изменений идет с инверсией экспресии различных типов тетрамеров.

3. После трех месяцев воздействия ГПТБ изменения гетерогенной системы гемоглобина и ферментов антиоксидантной защиты носят качественно различный характер на разных уровнях воздействия.

4. Животные, подвергавшиеся воздействию ГПТБ в неонатальном периоде, отличается от интактных нефизиологически низким содержанием метгемоглобина и измененным фракционным составом гемоглобина.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

106 форм белков и ферментов, следует изучать изоферментные спектры важнейших регуляторных либо избирательно повреждаемых воздействующим фактором белков.

3. Необходимо проводить изучение содержания метаболитов и изофермент-ных спектров участвующих в метаболизме конкретного химического вещества ферментов в отдаленные сроки после прекращения действия вещества с целью выявления нарушений метаболизма в ходе процесса деадаптации.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Милякова, Марина Николаевна, Самара

1. Алёнина Т.В. Некоторые вопросы патобиохимии и гистопатологии перегревания. /Труды Смоленского гос. мед. ин-та.,Т 30 - Смоленск, 1970.- с. 13 - 19.

2. Аполлонова Л.А. Гипоксемия, сдвиги кислотно-щелочного равновесия и реакции системы крови в механизмах адаптации//Бюл. экспер. биол.-1992.-Т.63.-№6.-С.574-577

3. Архипенко Ю.В., Шимкович М.В. Участие перекисного окисления липидов в регресии гипертрофированного сердца//Бюлл.эксперим.биол.-1989.-Т.58.-№11.-С.446-557

4. Архипова Л.В., Третьяк Т.М., Озолинь О.Н. Влияние катехоламинов на РНК-синтезирующую способность изолированных ядер и хроматина мозга и печени крыс // Биохимия. 1988. - Т.53, N 7. - С. 1078 - 1081.

5. Асатиани B.C. Ферментные методы анализа.-М: Наука.-1969.-740 с.

6. Астахова Л.Ф.,Мухамбетова Л.К.,Коганов З.И. и др. Экспериментальное исследование воздействия формальдегида в течение эмбриогенеза на активность ферментных систем печени крыс в онтогенезе//Вопр.мед.хим.-1996.-Т42.-ЖЗ.-С.217-222.

7. Ашмарин И.П., Васильев H.H., Амбросов В.А. Быстрые методы статистической обработки и планирования эксперимента. Л: ЛГУ.- 1975.-195 с.

8. Баевский P.M. Прогнозирование состояний на грани нормы и патоло-гии. -М.: Медицина. 1979.- 298 с.

9. Бардина Л.Р., Сатановская В.И., Пронько П.С. и др.Активность ферментов метаболизма этанола и ацетальдегида у крыс с различной изначальной чувствительностью к алкоголю//Укр. Биохим. Ж.-1997.-Т.69.-№1.-С.94-99

10. Бонашевская Т.И.,Меркурьева Р.В. Морфобиохимические критерии приспособительных реакций в некоторых барьерных системах организма// Гигиена и санитария.- 1982.-N 10.-С.21-24

11. З.Василенко Н.М., Звездай В.И. Сравнительная оценка изменений в крови при острой и подострой интоксикации ароматическими нитро- и аминосое-динениями // Фармокалогия и токсикология. 1972. - N 1.- С. 108- 110.

12. Василенко Н.М., Звездай В.И. Особенности гемотоксического действия нитро- и аминопроизводных бензольного ряда. М., ВНИИМИ, 1976.-112 с.

13. Гаркави JI.X., Квакина Е.Б., Уколова М.А. Адаптационные реакции и резистентность организма.-Ростов н/Д, 1979.-187 с.

14. Голиков П.П. Рецепторные механизмы глюкокортикоидного эффекта. М.: Медицина, 1988. - 298 с.

15. Голиков С.Н. Гомеостаз и химическая токсикология. В кн. "Всесоюзная учредительная конференция по токсикологии 25-27 ноября 1980 г., Тез. докл., Москва.-М, 1981.-214 с.

16. Гомеостаз на различных уровнях организации биосистем/ В.П.Нефедов, А. А.Ясайтис,В .Н.Новосельцев и др; Новосибирск: Наука, Сиб.отд-ние,1991. 232 с.

17. Гуревич B.C., Разумовская Н.И., Халифова Н.М. Нервная регуляция процессов транскрипции в ядрах скелетной мышцы // Доклады АМН СССР. -1973.-211.,В.2.-С. 501 -503.

18. Дервиз Г.В.Метод определения НАДНг.-зависимой метгемоглобинредукта-зы в крови//Лаб.дело.-1976.-Ы 4.-С.220-224.

19. Добрынина В.В. О механизмах привыкания к промышленным ядам, обладающим специфическим действием // Проблема адаптации в гигиене труда. -М., 1973.-С. 21.

20. Добрынина В.В. Проблема адаптации к промышленным ядам, обладающим специфическим действием // Гигиена труда и профзаболеваний. -1969. N 7. - С. 7 - 11.

21. Добрынина В.В. Адаптация к анилину в эксперименте // Материалы 2-й конференции молодых ученых Ленинградского НИИ ГТ. Л., 1968. - С. 43 -46.

22. Дударев В.П. Роль гемоглобина в механизмах адаптации к гипоксии и ги-пероксии Киев; Наукова Думка, 1979. - 145 с.

23. Дударев В.П., Стародуб Н.Ф. О влиянии гипо- и гипероксии на фракционный состав гемоглобина у крыс // Физиологический журнал. 1979. - N 4.-С. 413-418.

24. Дудченко А.И., Л.Д. Лукьянова. Влияние адаптации к периодической гипоксии на кинетические параметры ферментов дыхательной цепи мозга крыс. // Бюлл. эксперим. биол. и мед.- N 3.- 1996 г. стр. 252 255.

25. Ильин B.C. Центральное регулирование и адаптация обмена клетки высших организмов // Молекулярная биология: Проблемы и перспективы. -М.: Наука, 1964. С. 323 - 331.

26. Ильин B.C., Балябина М.Д., Емельянцева A.M. и др. Влияние иннервации и гормонов на активность и синтез ферментов // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 1978. - 14., В.1. - С. 13-18.

27. Казначеев В.П. Современные аспекты адаптации. Новосибирск: Наука, 1980.- 197 с.

28. Кирпиченок JI.H., Гидранович Л.Г., Хейдоров В.П. Сочетанное воздействие нитратов и у-излучения на протеиназноингибиторную и антиокислительную системы плазмы крови //Радиац.биол. Радио-экол.-1997.-Т.37.-№3.-С.287-302

29. Ковалев И.Е.ДЦипулина Н.В. Ковалентное связывание ксенобиотиков с белками организма как механизм адаптации//Хим. фармацевт, ж. - 1996. -N11-C.3 - 9.

30. Ковалев И.Е.,Шипулина Н.В.,Томилина Н.Ю. Регуляция тканевого гомео-стаза./Под.ред. Гачелидзе А.Г.-Тбилиси: Адаптоген,1990. С.61-68.

31. КозловН.Б., Алёнина Т.В., Стунжас Н.М.-в кн.: Биохимия животных и человека: Республиканский межведомственный сборник. Вып. 4. Биохимия белков нервной системы. Киев: Наукова думка, 1980, с. 22 - 28.

32. Кочетков Г.А. Практическое руководство по энзимологии. М.: Высшая школа, 1980. - 273 с.

33. Крылов С.С. Механизмы толерантности к ксенобиотикам // Успехи современной биологии . 1984.- т 98.- С. 80 -102.

34. Курлядский Б.А. Концепция пороговости и реактивность организма В кн."Проблема пороговости в токсикологии" - Под ред. Т.Н. Красовского - Москва, 1978 г., 104 с.

35. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1980.

36. Лукьянова Л.Д. Биоэнергетическая гипоксия: понятие, механизмы и способы коррекции//Бюл. экспер. биол.-1997.-Т124.-№9.-С.244-255.

37. Люблина Е.И., Минкина H.A. Основы общей промышленной токсикологии / Под ред. H.A. Толоконцева. Л.: Медицина, 1976.-145 с.

38. Люблина Е.И., Минкина H.A., Рылова М.П. Адаптация к промышленным ядам как фаза интоксикации. Л.: Медицина, 1971.-152 с.

39. Любченко Г.Н. Механизмы адаптации человека к химическому окружению/4 Рос.нац.конгр."Человек и лекарство",Москва, 8-12 апр., 997:Тез.докл. -М.,1997.-С.77

40. Любченко Г.Н. Экологическая агрессия и механизмы адаптации//Мед.труда и пром. экол. 1996. - N11. - С. 1 -5.

41. Макаров В.Г., Капица С.И. Моделирование токсического воздействия различной интенсивности в эксперименте с помощью дихлоргидрина полиэти-ленгликоляУ/Модельные системы в медико -биохимических исследовани-ях.-JI: ЛСГМИ, 1989.-С.85-90

42. Малышев И.Ю., Меерсон Ф.З. Адаптация организма к стрессорным воздействиям предупреждает кардиотоксический эффект рифампицина, но не по-лимиксина В//Бюлл.экспер.биол,-1991 .-Т.62.-№ 10.-С.З44-345

43. Меерсон Ф.З. Патогенез и предупреждение стрессорных и ишемических повреждений сердца. М.: Медицина, 1984 г. - 258 с.

44. Меерсон Ф.З., Вовк В.И. Влияние адаптации к стрессорным воздействиям и периодической гипоксии на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов изолированного сердца при ишемии и реперфузии//Бюлл. Эксперим. биол и мед.-1991.-Т.62.-№12.-С.573-577

45. Мертвецов Н.П. Гормональная регуляция экспрессии генов. М.: Наука, 1986.-324 с.

46. Мецлер Д. Химические реакции в живой клетке.-Т.2. Пер.с.англ.-М: Мир,1980 -607 с.

47. МинкинаН.А., Берлинер Е.Г., Горлинская Е.П., Кузьминская Г.Н. О возможности прогнозирования отдаленных последствий действия вредных химических веществ на организм В кн.: Актуальные проблемы гигиенической токсикологии - М, 1980.-С.87-95.

48. Мишин В.М., Ляхович В.В. Множественные формы цитохрома Р-450. -Новосибирск, 1986.-165 с.

49. Мишина Д.В., Мишин В.М., Ляхович В.В. Индукция цитохрома Р-450 в микросомах инбредных мышей инбредных линий после введения ксенобиотиков мх-типа // Биохимия. 1986. - Т.51, N 5. - С. 719 - 728.

50. Молодкина И.Н.,Попова Т.Б.,Радионова Г.К.Дарбакова А.Н. Проблема профессионального риска и некоторые подходы к его оценке //Мед.труда и пром. экол. 1997. - N 9. - С.6 - 9.

51. Павленко С.М.,Юдина Т.В.,Гусева В.А. Методические подходы к оценке скрытых реакций некоторых регуляторных систем организма при различных путях поступления токсичных веществ// Гигиена и санитария.-1975.-N 10.-С.55-60.

52. Панченко Л.Ф.,Герасимов А.М.Доен Я.М.Повышение активности глутати-онпероксидазы и глутатионредуктазы печени крыс при введении фенобар-битала//Фармакол. и токсикол.-1975.-М 3-С.334-337.

53. Пирузян Л.А.,Ковалев В.И.,Лаврицкая Э.Ф. Действие физиологически активных соединений на биологические мембраны.-М.: Наука, 1974.-387 с.

54. Продиус П.А., Манухина Е.Б., Буланов А.Е., Викман Г., Малышев И.Ю. Адаптоген АДАПТ модулирует стрессиндуцированный синтез HSP70 и повышает устойчивость организма к тепловому шоку.//Бюл.экспер.биол.-1997.-T.123.-№ 6.-С.629-631

55. Пузырев A.A., Иванова В.Ф., Маймулов В.Г. Адаптация организма к действию экологических факторов на клеточном и субклеточном уровнях/Морфология.-1997.-Т.1 12.-№4.-С.23-28

56. Путилина Ф.Е., Зоидзе С.Д. Методы биохимических исследований / Под ред. М.И. Прохоровой. Л.: ЛГУ, 1982. - 172 с.

57. Ротенберг Ю.С. Токсиколого-гигиенические аспекты биоэнергетики. Гигиена и санитария, 1975.- N 10.- С.35 60.

58. Рублева Л.М. Экспериментальное обоснование ПДК диэтилового эфира малеиновой кислоты в воде водоемов // Санитарная охрана водоемов от загрязнений промышленными сточными водами. М.: Медицина, 1964. - С. 207 - 208.

59. Румянцев А.П., Тиунова Л.В., Остроумова H.A. / Итоги науки и техники. -Вып. ВИНИТИ. Сер. Токсикология. -1981. - N 12. - С. 65-75.

60. Саноцкий И.В., Гродецкая Н.С. Ускоренное старение организма интегральный итог химического стресса/ЛГоксикол. Вестн.-1997.-№6.-С.8-12

61. Сердюк С.Е., Гмиро В.Е. Активация афферентных рецепторов желудка этанолом в малых дозах как способ изменения индувидуальной чувствительности к стрессу у крыс//Рос.физиол. ж.-1997.-Т.83.-№9.-С.112-116

62. Соколовский В.В. Окислительно-восстановительные процессы в биохимическом механизме неспецифической реакции организма на действие экстремальных факторов внешней среды. /Антиоксиданты и адаптация.- Л, 1984.-С.65-71

63. Справочник по клиническим лабораторным методам исследова-ния/Под.ред.проф.Е.А.Кост.-М. Медицина, 1975.-С.28.

64. Стальная Н.Д.Метод определения диеновой конъюгации ненасыщенных высших жирных кислот./Современные методы в биохимии.-М. Медицина, 1977.-С.66-68.

65. Стальная Н.Д.,Гаришвили Т.И. Метод определения малонового диальдеги-да с помощью тиобарбитуровой кислоты. /Современные методы в биохи-мии.-М.:Медицина,1977.-С.66-68.

66. Стародуб Н.Ф., Назаренко В.И. Гетерогенная система гемоглобина. Киев: Наукова Думка, 1987.-226 с.

67. Стародуб Н.Ф., Грицак А.Н. Биосинтез фракций гемоглобина крыс в условиях нормального и усиленного эритропоэза // Биохимия. 1979. - Т. 44.- N 8. -С. 1493 - 1501.

68. Стародуб Н.Ф., Артюх В.П., Грицак А.Н. и др. О природе гетерогенности гемоглобина у крыс // Украинский биохимический журнал. 1979. - Т. 51.-N2.-0. 117 -129.

69. Стародуб Н.Ф. Онтогенез красной кровяной клетки и гетерогенная система гемоглобина // Успехи современной биологии. 1976. Т. 16.- N5.-0. 770 - 773.

70. Стародуб Н.Ф. Изучение свойств фракций гемоглобина крыс // Биохимия. -1974.-Т. 39.-N4.-С. 757-761.

71. Тиунов Л.А. // Итоги науки и техники. Вып. ВИНИТИ. - Сер. Токсикология. - 1981. -И 12. - С. 5 - 52.

72. Тиунов Л.А., Иванова В.А. Роль глутатиона в процессах детоксикации // Вестник АМН СССР. 1988. - N 1. - С. 62 - 76.

73. Трахтенберг И.М., Сова Р.Е., Шефтель В.О. Проблемы нормы в токсикологии / современные представления и методические подходы, основные параметры и константы / Под ред. И.М. Трахтенберга. М.: Медицина, 1991 -208 с.

74. Узбеков М.Г., Карпачевская И.К. Активность Zn-,Cu- содержащей суперок-сиддисмутазы в ткани мозга антенатально алкоголизированного потомст-ва//Бюл.экспер. биол.-1991.-Т61.-№4.-С.354-355.

75. Ушакова H.H., Покровская Л.А., Родионов Л.П. и др. О профилактике действия лазерного излучения. - "Врачебное дело", N 6, 1989 Г.-С65-67.

76. Физиология адаптационных процессов./Руководство по физиологии/- М.: Наука, 1986.- 635 с.

77. Хайдарлиу С.Х. Функциональная биохимия адаптации. Кишинев, 1984 г.

78. Хасамов Э.Н., Еникеев Д.А. Система крови млекопитающих в среде химического загрязнения //Патол. физиол. и эксперим. терапия.-1997.-№4.-С.24-26

79. Хитров Н.К., Пауков B.C. Адаптация сердца к гипоксии. М., Меди-цина, 1991.-240 с.

80. Хлопушина Т.Г., Ковалев И.Е., Лысенкова Е.М. Влияние пер-фтордекалина и перфтортрибутиламина на систему цитохрома Р-450 печени // Биохимия. -1986.-Т. 51, N4.-С. 664-667.

81. Холинергическая регуляция биохимических систем клетки / С.Н. Голиков,

82. B.Б. Долго-Сабуров, Н.Р. Елаев и др. // М.: Медицина, 1985.-187 с.

83. Хочачка П., Сомеро Дж. Биохимическая адаптация: Пер. с англ.- М: Мир,1988.-586 с.

84. Худолей В.В.,Мизгирев И.В., Майорова И.Г. Феномен ферментативного импринтинга у взрослых животных// Бюл.экспер. биол.-1991.-Т61.-№4.1. C.546-548

85. Чекунова М.Л., Фролова А.Д., Луковникова Л.В. Биохимические механизмы адаптации при действии химического фактора. / В сб.: Актуальные проблемы гигиенической токсикологии - М., 1980 г.

86. Шаныгина К.И., Парфенова Н.С. Влияние перерезки чревных и блуждающего нервов на активность и изоферментный состав лактатде-гидрогеназыпечени крыс // Вопросы медицинской химии. 1977 - Т. 23.- В.5. - С. 650 -652.

87. Экологическая физиология животных. Часть I. Общая экологическая физиология и физиология адаптаций. В : Руководство по физиологии Л., Наука, 1979. 440 с.

88. Acharya S.,Mehta К.,Rodrigues S. et all. Administration of subtoxic doses of t-butil alcohol and trichloroacetic acid to male Wistar rats to stady the interactive toxicity//Toxicol Lett.-1995.-Vol.80.- №l-3.-P.97-104.

89. Ahmed-Choudhury J., Orsler D.J., Coleman R. Hepatobiliary effects of tertiary butylhydroperoxide (tBOOH) in isolated rat hepatocyte couplets//Toxicol. Appl. Pharmacol.-1998.-Vol. 152.-№ 1 .-P.270-275.

90. Albano E., Clot P., Bellomo G. et all. Ethanol-derived free-radical and alcohol toxicity:Abstr.6th. Congr.Eur.Coc. Biomed. Res. Alcohol, Stockholm, 28 June-1 July,1997: ESBRA 1997//Alcohol and alcohol.-1997.-Vol.32.-№3 .-P.323

91. A1ÜS J.W., Brown B.L., Simmons J.E. et all. Methanol hotentiation of cardón tetrachloride hepatotoxicity: the central role of cytochrome P450//Toxicology.-1996,-Vol. 112.- №2.-P. 131 -140

92. Anders M.W. Alteration of hepatic glutation s-transferases and release into serum after treatment with bromobenzene, carbon tetracloride, or N-nitrosodimetylamine // Biochem. Pharmacol. 1985, - Vol.34.- N 24. - P. 4239-4244.

93. Atchison M., Adesnic M. J. Interactions of methylenedio-xyphenil compounds with cytochrom P-450 and effects on microsomal oxidation // Biol. Chem.- 1983.-Vol.258.-N 18.-P. 11285- 11295.

94. Badawy A. Effect of chronic ethanol intake on activity and subcellular distribution protein synthesis in rat liver//Acta pharmacol et toxicol. 1982.-51,suppl. 1.

95. Baecer M. Reaction mechanism off rat-liver ADH with ethanol and NAD in the steady state // J. Mol. Catal. 1977. - Vol.2.- N 3. - P. 171 -177.

96. Basaglia F., Cucchi C.Phenylhydrazine induced changes in fructose -bisphosphate aldolase and glyceraldehyde - phospate dehydrogenase in Sctalurus melas (Suliriformes, Ictaluridae)//Cytobios. -1996. - Vol.85.- N342. - P. 137 -154.

97. Bass N.M. Glutathione S-transferases of rats and men // Hepatology. 1986. -Vol.6.-N4.-P. 753-754.

98. Behrens U.J., Hoerner M., Lasker J.N., Lieber S. Formation of acet-aldehyde adducts with etahanol-inducible P-450 II ol in vivo // Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1988. - Vol.154.- N 2. - P. 584-590.

99. Boxenbaum H.,Neatsey P.J.,Fournier DJ. Hormesis,Gompertz function,and risk assessment//Drug. Metab.Rev.-1982.- Vol.l9.-N.2.-P. 195-225

100. Breen P.H., Isserles S.A., Tabac E. et all. Protective effects of stroma-free methemoglobin during cyanide poisoning in dogs//Anesthesiology.-1996.-Vol.85.- №3.-P.558-564.

101. Brein A. The metabolism of xenobiotics. Biochem. Toxicol. Environm. Agents., 1978.-P. 1544.

102. Buc-Calderon P., Latour I., Roberfroid M. Biocemical changes in isolated hepatocytes exposed to tert-butyl hydroperoxide. Implication for its cytotoxicity .//Cell. Biol. Toxicol.-1991 .-Vol.7.- №2.-P.129-143.

103. Caprari P.,Bozzi A.,Malorni W., et all. Junctional sites of erythrocyte sceletal proteins are specific targets of tret buthylhydroperoxide oxidative damage//Chem. Biol. Interact. - 1995. - Vol.94.-N3 - P.243 - 258.

104. Chen J.J., Yu B.P. Detoxification of reactive aldehydes in mitochondria: effects of age and dietary restriction//Aging(Milano).-1996.-Vol.8.- № 5.-P.334-340

105. Chhabra S.K., Perella C., Anderson L.M. Induction of hepatic and renal P4502E1 of neonatal rats exposed translactationally to ethanol//Food. Chem. Toxicol.-1996.-Vol.34.- №5 .-P.469-476

106. Chu C.Y.,Tseng T.H., Hvang J.M. at all.Protective effects of capillarisin on tert-butylhydroperoxide-iduced oxidative damage in rat primary hepato-cytes//Arch. Toxicol.-1999.-Vol.73.-№ 4-5.-P.263-268.

107. Cobreros A., Sainz L., Lasheras B.et all. Hepatotoxicity of ethanol: protective effect of calcium channel blockers in isolated hepatocytes//Liver.-1997.-Vol.l7-№ 2.-P.76-82

108. Cook J.C., Hodson E. The induction of cytochrome P-450 by isosafrole and reletede methylendioxyphenyl compounds // Chem. Biol. Interact. V. 1985. -Vol.54.- N 3. P. 299- O., Kasanen M., Vahakangus K et al. Cytichrome P-450 315.

109. Cook J.C., Hodson E. Cytochrome P-450 induction by 3-metylc-holantrene and its antagonism by 2,2-dimetyl-5-t-butyl-l,3-benzodioxole // Biochem. Pharmacol. 1986. - Vol.35.- N 2. - P. 167-176.

110. Coughtrie Michael W.H. Sulphation catalysed by the human cytosolic sul-photransferases-chemical defence or molecular terrorism?//Hum.and Exp.Toxicol. -1996.-Vol.15.- №7.-P.547-555

111. Crabb D.W., Borson W. F., Li T., K. Ethanol metabolism // Pharmacol and Ther. - 1987, - Vol.34.-N 1. P. 59-73.

112. Cullen M.R.,Redlich C.A. Significance of individual sensitivity to chemicals : Elucidation of host susceptibility by use of biomarcers in environmental health researrch//Clin. Cem. 1995. - Vol.41.- N22, Pt 2. - P. 1809 - 1813.

113. Dalvi R.R. Purification of rat liver alchohol dehydrogenase and studies on kinetic characteristicd of tiamine, thiazole and NaD Synthese purified enzyme / Indian J.Biochem. and Biophys. 1987. - Vol.24.- N 4. - P. 248-251.

114. Deitrich R.A., Bludeau P., Roper M. Induction of aldehydedehydro-genases / Biochem. Pharmacol. 1978. - Vol.27. -P. 2343-2347.

115. Drago F., Marino K. Ethanol narcotic effect is inhibited by pretreatment with a small dose of the drug//Pharmacol. Res.-1997.-Vol.35.Suppt.-P.4

116. Duncan J., Havasteen B.H. On the catalytic activity of chemically modified enzymes involving two or more substates and products // Int. J.Peptide and Protein Res. 1976. - Vol.8.- N6. - P. 519-531.

117. Egashira T., Iakayama F.,Yamanaka Y. Effects of long term treatment with dicyclic, tricyclic, tetrocyclic and noncyclic antidepressant drugs on monoamine oxidase activity in mouse brain//Gen.P harmacol. - 1996. - Vol.27.-N5. - P.773 -778.

118. Finely B.L., Ashley P.J., Neptune A.G. et all. Substrate selective induction of rabbit hepatic UDP-glucuronyl transferases by ethanol and other xenobiotics // Biochem. Pharmacol. 1986. - Vol.35.- N 17. - P. 2875-2881.

119. Geer B.W., McKeednil S.W., Benthey W.M. et all. Induction of alchohol dehydrogenase by ethanol in Drosophila melanogaster / // J.Nutr. 1988. -Vol.118.-N7.-P. 398-407.

120. Giulivi C.,Cadenas E. Heme protein radicals: Formation, fate and biological concequences//Free Radic. Biol, and med.-1998.-Vol.24.-№2.- P.269-279

121. Goasduff T., Menes J.F., Dreano Y. CYP1A2 and 2E1 expression in rat liver treated with combined inducers (3-methylcholanthrene and ethanol//Biochem. Biophys. Res. Commun.-1995.-Vol.211.- №2.-P.-497-503

122. Goldstein J.A., Hardwick J. Regulation of a multigene family of P-450 isozymes by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin and related compounds. Biol. Mech. Dioxin. Act., 1984, P. 119-133.

123. Greim H.,Csanady G.,Filser J.G. at all. Biomarcers as tools in human health risk assessment//Clin.Chem. 1995. - Vol.41.-N12b, Pt 2. - P. 1804 - 1808.

124. Hammond A.H., Fry J.R. Effect of cyanamide on toxicity and glutathione depletion in rat hepatocyte cultures: differences betwttn two dichloropropanol iso-mers//Chem. Biol. Interact.-1999.-Vol. 122.- №2.-P. 107-115

125. Hammond A.H., Fry J.R. Involvement of cytochrome P4502E1 in the toxicity of dichloropropanol to rat hepatocyte cultures//Toxicology.-1997.-Vol.ll8.- № 2-3.-P.171-179

126. Harington M.C., Henehan C., Gans T.M., Tipton K.F.The interaction of alcohol dehydrogenase and aldechyddehydrogenases in the metabolism of ethanol in liver// Biochem. Sic. Trans. 1986. - Vol.16.- N 3. - P. 239-241.

127. HayshiA. The properties of Hb M. Reactivity of Met Hb M to cyanide, azide and fluoride. // Biochem. Biophys. Acta. 1967. - Vol. 27.- N 140. - P. 251 -257.

128. Hines R.N., Foldes R.L., Levy J.B. Regulation of expression of cytochrome P-450. Genet. Variabil. Respon. Chem. Exposure, 1984.- P. 37-49.

129. Hogson E., Rye D.Y., Adams N., Leni P.E. Biphasic responses in synergistic interaction //Toxicology. 1995. - Vol.105.- N 2-3. - P.211-216.

130. Hussey A.J., Stockman P.K., Beckett G.J., Hayes J. D. Variation in the glutation-S-transferase subunits expressed in human liver// Biochem. and Biophys. Acta: Rrotein stract. and Mol. Enzymol. 1986. - Vol.874.- N 1. - P. 1-12.

131. Hwang J.M., Tseng T.H., Hsitsh Y.S. et all.Inhibitory effect of atractylon on tert-butyl hydroperoxide iduced DNA damade and hepatic toxicity in rat hepato-cytes//Arch Toxicol.-1996.-VoL70.- №10.-P.640-644.

132. Infante P., Pettersson G. Kinetic equivalence of the subunits of liver alchohol dehydrogenase // Eur. J.Biochem. 1982. - 122, N3. - P. 559-568.

133. Iwahashi K., Ameno K., Rinishita H. et all. CYP2E1 and ADH2 genotypes and blood ethanol elimination kinetics//Clin. Chim. Acta.-1996.-Vol.255.- №1.-P.85-87

134. Keilin D., Hartree E.F. Reaction of methemoglobin and catalase with peroxides and hydrogene donors // Nature. 1954. Vol.197.- N 4407. P. 721 -723.

135. Khan S., O'Brien P.J. Role of the cellular redox state in modulating acute ethanol toxicity in isolated hepatocytes.//Clin.Biochem.-1999.-Vol.32.- №7.-P.-585-589

136. Koop D. E., Casazza J.P. Identication of etanol-inducible P-450 isozyme 3a as the acetpone and acetol monooxygenase of rabbit microsomes // J. Biol. Chem. 1985. - Vol.260.- N 25. - P. 13607-13612.

137. Kostrubsky V.E., Strom S.C., Wood S.G. et all. Ethanol and isopentanol increase CYP3A and CYP2E in primary cultures of human hepatocytes//Arch. Biochem. Biophys.-1995.-Vol.322.- №2.-P.516-520

138. Kraus P., Wigand J., Ostermaier R. Mitochochondrial glutatione transferases. The alkylation of mitochondrial membrane yy-lelds properties // Biol. Chem. Hoppe-Seyler. 1986. - Vol.367.- N 9. - P. 937-941.

139. Kukielka E., Cederbaum A.I. Ferritin stimulation of lipid peroxidation after chronic ethanol treatmetnt: role of cytochrome P4502E1//Arch. Biochem. Bio-phys.-1996.-Vol 332.-№l.-P. 121-127

140. Lad P.J., Leffert H.L. Rat liver alchohol dehydrogenase. 1. Purification and characterization // Anal. Biochem. 1983. - Vol. 133.- N 2. - P. 350-361.

141. Leal A.M., Regona Ruiz-Larrea M., Martinez R., et all. Cytoprotective actions of estrogens against tert-butyl hydroperoxide-induced toxicity in hepato-cytes//Biocem. Pharmacol.-1998.-Vol.56.-№ 11.-P. 1463-1469.

142. Lee J.Y., Chung S.M., Lee M.Y. et all. Ethanol co-exposure increases lethality of allyl alcohol in male Sprague-Dawley rats//J. Toxicol. Envir. Health.-1999.-Vol.56.- №2.-P. 121-130

143. Lieber Charles S. Biochemical and molecular basis of alchohol induced injury to liver and other tissues // N. Engl. J. Med. 1988. - Vol.319.- N 25. - P. 16391650.

144. Lieber Charles S. The microsomal ethanol oxidizing sistemrits role in ethanol and xenobiotic metabolism // Biochem. Soc. Trans. 1988. - Vol.16.- N 3.-P. 323-239.

145. Lindal R., Evcer S. Rat liver aldehyde dehydrogenase I. Isolation and characterization of four high Km normal liver isosymes. II. Isolation and characterization of four inducible isozymes // J. Biol. Chem. 1984. - Vol.259.-N19.-P. 1986-1996.

146. Lindros K.O., Jokelainen K.,Nanji A.A. Acttaldehyde prevents nuclear factor-kappa B activation and hepatic inflammation in ethanol-fed rats//Lab. Invest.-1999.-Vol.79.- №7.-P.799-806

147. Lintern M. C., Smith M. E., Ferry C. B.Effects of pyridostigmine on acetylcholinesterase in different muscles of the mouse//Hum. and Exp.Toxicol. -1977. Vol.16.-Nl. - P. 18 - 24.

148. Majewski J.L., Yang V.W. The class I alcohol dehydrogenase gene is gluco-corticoid-responsive in the rat hepatoma microcell hybrid cell line, 11-3//Alcohol.Clin. Exp. Res.-1995.-Vol. 19.- №6.-P. 1430-1434

149. Mannaioni P.E., Bello M.G.di, Mugnai L. et all. Activation of xenobiotics into free radicals by rats liver microsomes: Abstr.Symp.Struct.-Activ.Relationships Toxicol., Marseilles, 18-19 Apr.,1994//Hum.and Exp.Toxicol.-1995.-Vol. 14.-№6.-P.519

150. Mantovani A., Stazi A. V.,Riccardi C.,at all. Early indication of developmental toxicity: Pap. Int. Symp.Assess. and Manog Health Risk Drink Water Contamin.: Approachesand Appl., Rome 13-17 Sept.,1994//LPHS Publ. -1995.-N 233.-P.187- 193.

151. Marsals M., Torronen R. Increase of hepatic and serum aldechyde dehydrogenase activity often TCDD-treatment // Arch. Toxicol. 1978. - Vol.1. - P. 271-273.

152. Martini R., Ingelman-Sundberger M., Murray M. Pretranslational and post-translational regulation of rat hepatic CYPs 3A2 and 2E1 by disulfiram//Biocem. Pharmacol.-1997.-Vol.54.- №12.-P.1323-1329

153. Meyer Urs.A. Overview of enzymes of drug metabolism//J. Pharmaco Kinet. and Biopharm. - 1996. - Vol.24.-N5. - P.449 - 459.

154. Mezey E., Potter J. Separation and partial characterization of multiple forms of rat liver alchohol dehydrogenase // Arch. Biochem. Biophys. 1983. -Vol.225.-N2.-P. 787-794.

155. Mezey E., Potter J., Litt M. Influence of eqinefrine on alchohol dehydrogenase activity in rat hepatocyte culture // Biochem. Pharmacol. -1988. Vol.37.- N 15. - P. 2993-3000.

156. Miao-Lin Hu, Julian E.S. Dietary selenum and aniline-induced methemoglobinemia in rats // Toxicol. Leth. 1985. - Vol.25.- N 2. - P.205 -210.

157. Minterbourn C., Carrell R.W. Studies of hemoglobine and Heinz body formation in the unstable hemoglobins//J. Olin. Invest. 1974. - Vol.54.-N 3. -P. 678-689.

158. Nakanishi S., Shiohara E., Tsukada M. Rat liver aldehyde dehydrogenases: strain differenses in the response of the enzymes to phenobarbital treatment // Japan. J. Pharmacol. 1988. - Vol.28.- N 4. - P. 653-659.

159. Nakanishi S. et all. Genetic control of responsiveness of rat liver supernatant aldehyde dehydrogenase to phenobarbital and 3-metylcholantrene // Arch. Toxicol. 1978. - Vol. 43. - P. 135-140.

160. Nebert D. W., Kimyra S., Gonzales F. J. Molecular mechanismes of rat P-450 gene expression following exposure to foreign drug and carcinogens // Microsomes and drug Oxidations. 1985. - P. 145-156.

161. Oinonen T., Ronis M., Wigell T., Tohmo K., et all. Growth hormone-regulated periportal expression of CYP2C7 in rat liver//Biochem. Pharmacol.-200.-Vol.59.- №5.-P.583-589.

162. Okey A.B.,Roberts E.A.,Hasper P.A. et all. Induction of drug-metabolizing enzymes: mechanisms and consequenses//Clinical Biochem.-1986.- Vol.19.-N 4. P.527-535

163. Parker A.G., Rinot F., Grant D.F., et all. Regulation of mouse liver microsomal esterases by clofibrate and sexual hormones// Biocem.Pharmacol. -1996. Vol.51.- N5. - P.677 - 685.

164. Pelkonen O. Xenobiotic-metabolizing ensymes an overview//Hum. and Exp. Toxicol.-1997.-Vol. 16.- №10.-P.611

165. Peng R. Zhu X-Y., Yang G.S. Induction of rat liver microsomal cytochrome P-450 by muscon ( 3-metylcyclopentadecanone )//Biochem. Pharmacol. 1986. -Vol.35.-P. 1391-1394.

166. Puddeu I.B., Croft K. Alcoholic beverages and lipid peroxidation: Relevance to cardiovascular disease//Addict.Biol.-1997.-Vol.2, №3.-P.269-276

167. Ren L.,Meldahl A.,Lech J. Dimethyl formamid and ethylene glycol are estrogenic in rainbow tront//Chem. Biol. Interact. - 1996. - Vol.102.-Nl. - P.63 -67.

168. Runge M. M.,Rose K.,Kocarec Th.A. Regulation of rat hepatic sulfotransferase gene expression by glucocorticoid hormones//Drug.Metaband. Disposit.;Biol.Fate Chem. 1996. - Vol.24.- N10. - P. 1095 - 1101.

169. Schramm H. Robertson L. W., Oesch F. Differential regulation of hepatic glutatione transferase and glutatione peroxidase activities in the rat//Biochem. Pharmacol. 1985. - Vol.34.- N 20. - P. 3735-3739.

170. Seidel S.H., Shires T.K. Purification and characterisation of a previously unseparated form of cytochrome P-450 from the liver of 3-metylcholantrenepretreated rats//Biochem. J. 1986. - Vol.235.- N 3. - P. 859868.

171. Senior D.J., Tsai C.S. Purification and characterisation of aldehyde dehydrogenase from rat liver mitochondria//Arch. Biochem. and Biophys. -1988. Vol.262.- N 1. - P. 211-220.

172. Sinkler J.F., Zaitlin L.M., Smith E.L. Induction of 5-amino-laevulinate synthase by two five-carbon alcohol in cultured chickemriohepatocytes// Biochem. J. 1987. - Vol.234.- N 2. - P. 405-411.

173. Slawson M.H., Franklin M.R., Moody D.E. Correlation of the induction of microsomal epoxide hydrolase activity with phase II drug cojugating enzyme activities in rat liver//Toxicol. Lett.-1996.-Vol. 95.- №l.-P.29-34

174. Szymanska J. A., Piotrowski J.K., Fry dry ch B. Hepatotoxicity of tetrabromobisphenol -A: effect of repeated dosage in rats//Toxicilogy.-2000.-Vol.l42.-№2.-P.87-95

175. Torronen R. Inducible aldehyde dehydrogenases in the hepatic cytosol of the rat // Acta pharmacol. et toxicol. 1977. - Vol.41.- N 3. - P. 263-272.

176. Torronen R. Isolation and characterization of rat liver cytosolic aldehyde dehydrogenases induced by phenantrene or benzo(a)pyrene //Int. J. Biochem. -1985.-Vol.17.-N1.-P. 101-106.

177. Tseng T.H., Wang C.J.,Kao E.S. et all. Hibiscus protocatechuic acid protects against oxidative damage induced by tert-butylhydroperoxide in rat primary hepatocytes//Chem. Biol. Interact.-1996.-Vol. 101 .-№2.-P. 137-148.

178. Veidebaum T. Activation and inactivation of toxic agents by xenobiotic metabolising enzymes//Hum. and Exp.Toxicol.-1997.-Vol. 16.- №10.-P.611

179. Wartbug H. Comparative aspects of structural studies of alcohol dehydrogenases. Puridine Nucl. - Dependehydrogenases. Proc. 2nd Int. Symp. Konstant, 1977. febr. Symp. - 1977. - N 49. - P. 62668.

180. Waterman M.K., Sypson E.K. Mechanisms of indaction of endogenous substrate oxidation // Microsomes and Drag Oxidation. 1985, - P. 136-144.

181. Weber G. Study and evaluation or regulation of activity and syntesis in mammalian liver // Adv. Enzyme Regul. 1963. -№1.-P. 1-35.127

182. Weser E.,Yen K.Ch.,Win Lin,Masur A. Noniform biosynthesis of haemoglobins in the adult rat and gwinea pig//J. Biol. Chem. 1976. - Vol.251.-N 18. - P.5703 - 5710.

183. Yamamura K., Katon T., Kikuchi M., Arashidani K. Effect of benzene exposure on hematology and hepatic drug metabolic enzymes in ethanol administred rats//Sagyo Ika Daigaku Zasshi.-1999.-Vol.21.-№l.-P.29-35

184. Yonamine M., Aniya Y., Yokomakura T., Koyama T. et all. Acetaminophen-derived activation of liver microsomal glutathione-S-transferase of rats//Jpn. J. Pharmacol.-1996.-Vol.72.- №2.-P. 175-181

185. Zheng H., Liu J., Klaassen C.D. Hepatocytes from metallotionein-I and II knok-out mice are sensitive to cadmium- and tert-butylhydroperoxide-iduced cytotoxicity//Toxicol. Lett.-1996.-Vol.87,- №2-3.-P.139-145.

186. Zimatkin S.M., Pronko P.S., Grinevich V.P.Alcohol action on liver dose de-pendens and morpho-biochemical correlation//Cas. Lec. Cesk.-1997.-Vol. 13 6.-№19.- P.598-602

187. Изменения содержания гемоглобина в крови крыс при хроническомвоздействии анилина

188. Изменение содержания метгемоглобина в крови крыс при хроническомвоздействии анилина

189. Изменения активности метгемоглобинредуктазы при хроническомвоздействии анилина

190. Изменения активности пероксидазы в крови крыс при хроническомвоздействии анилина

191. Изменения содержания глутатиона в крови крыс при хроническомвоздействии анилина.

192. Изменение активности каталазы крови крыс при хроническом воздействиианилина

193. Изменения активности глутатионпероксидазы сыворотки крови крыс прихроническом воздействии анилина

Информация о работе

Милякова, Марина Николаевна
кандидата биологических наук
Самара, 2000
ВАК 03.00.13

Диссертация

Механизмы адаптации кислородтранспортных и детоксицирующих систем к хроническому действию токсических веществ различных классов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Механизмы адаптации кислородтранспортных и детоксицирующих систем к хроническому действию токсических веществ различных классов - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы