Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменения показателей продукции оксида азота в прилежащем ядре в ходе условнорефлекторного поведения

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Изменения показателей продукции оксида азота в прилежащем ядре в ходе условнорефлекторного поведения"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ им. И.П.ПАВЛОВА

На правах рукописи

САВЕЛЬЕВ СЕРГЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ИЗМЕНЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПРОДУКЦИИ ОКСИДА АЗОТА В ПРИЛЕЖАЩЕМ ЯДРЕ В ХОДЕ УСЛОВНОРЕФЛЕКТОРНОГО

ПОВЕДЕНИЯ

Специальность 03.00.13. - физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2006

Работа выполнена в лаборатории физиологии высшей нервной деятельности Института физиологии им. И.П.Павлова РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, доцент Н.Б.Саульская

Официальные оппоненты •

заслуженный деятель науки России, доктор медицинских наук, профессор В.Г.Шаляпина

доктор медицинских наук, профессор Б.Ф.Толкунов

Ведущая организация:

Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия

Защита диссертации состоится « 19 » заседании Диссертационного совета по присуждению

2006 года в 13:00 на ученой степени

кандидата наук (К 002.020.01) при Институте физиологии им. И.П. Павлова РАН (199034, Санкт-Петербург, наб Макарова, 6).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии им. И.П. Павлова РАН.

Автореферат разослан « 19 » мая 2006г.

Ученый секретарь Диссертационного совета жУ

кандидат биологических наук ' О.Г.Чивилева

fju>6o

з

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ Изучение механизмов межклеточной химической сигнализации в ЦНС

является одной из актуальных проблем современной нейрофизиологии. Новым быстро развивающимся

направлением этой фундаментальной проблемы является исследование функциональной роли и путей

регуляции продукции оксида азопга NO-ергическими нейронами мсвга. Оксид азота (N0) относится к группе

неклассических нейротронсмиттеров и обладай большим набором функций в организме, 'по послужило

причиной его детального изучения в последнее время. Установлена его важная роль в контроле мозгового

кровотока, в генезе нейродегенеразивных заболеваний, а также в процессах статической пластичности

[Раевский, 1997; Centonre et al, 1999; Baran ano et al., 20011. В стриатуме NO участвует в модуляции

синатического выброса нейротрансмштеров. в контроле возбудимости проекционных нейронов этого

подкоркового образования, а также в возникновении длительных изменений эффективности синаптической

передачи в глугаматергических синапсах, предположительно лежащих в основе обучения [C'cnton/e et а],

1999; West et al., 2002]. Вместе с тем, не установлено, меняется ли продукция N0 в стриатуме при реализации

поведения, контролируемою этой структурой. Литературные данные свидетельствуют о важной роли всех

отделов стриатума, включая прилежащее ядро, в условнорефлекторной деятельности [Шаповалова, 1978,

Толкунов, 1978; 2002; Огеллин, 1987; Огедлин, Арушанян, 1989; Саульская, 1990; 1993, Шаповалова и др.,

1992; Saulskaya, Marsden, 1995; Шаляпина и др, 1998; 2002; Самойлов, 1999; Шуваев, Суворов, 2000;

Саульская, Михайлова, 2001; 2003] В частности, показано участие прилежащего ядра в выработке и

реализации классических (Павловских) условных рефлексов с болевым подкреплением, моделирующих

процессы эмоциональной памяти [Саульская и да.. 1999; 2000; 2001]. Однако нет сведений об участии "NO-

ергических нейронов этой структуры в таких процессах. Более того, не существует пи одного исследования, в

котором бы в условиях прижизненной регистрации были показаны изменения каких-либо показателей

продукции оксида азота в ЦНС при реализации поведения. Одной из серьезных проблем, связанных с

исследованием функциональной роли и путей регуляции ншрергических систем мозга, является короткое

время жизни оксида азота (3-5сек), что «прудняет прямое определение N0, особенно в экспериментах in vivo

на ненаркшизированных животных Известно, что совместно с оксидом азота в ходе катализируемой NO-

сишазой реакции окислительного деаминирования аргинина в эквимолярном соотношении образуется со-

продукг реакции цитруллин. Тканевое и внутриклеточное образование штруллина широко используется в

биохимических и морфологических исследованиях в качестве показателя активности NO-синтачы и

продукции NO [Garthwaite a al., 1989; Blum-Degen et al., 1999; Martinelli et al., 2002]. В связи с этим очень

привлекательным, но пока еще малоиспользуемым подходом для оценки in vivo продукции NO в отдельных

областях мозга свободно движущихся животных может бьпъ микродаализкый мониторинг цктрудлина

Ограниченное использование этого метода для прижизненного исследования продукции NO связано с

недостаточной изученностью границ его применимости. Нет сведений, что результаты, полученные с

использованная микродиализного мониторинга щггруллина, совпадают с результатами, полученными-при

БАЛЬНАЯ1 илЬЛИОТСКА С.-Петербург

О 5» ОЛЛ

применении других методов определения продукции N0 Гак, с использованием разных показателей продукции оксида азота устаноапено, что дофаминергическая активация стимулируег продукцию N0 в стриатуме [Раевский, 1997; ВавКЫоуа а а1,1999; Л а1,2002]. Однако нет данных о том, меняется ли при этом уровень внеклеточного цитруллина в стриатуме, и зависят ли эти изменения сгг локальной активности МЭ-синтазы и от блокады рецепторов дофамина. Изучение механизмов дофамин-МО-ергаческого взаимодействия в стриатуме с применением внеклеточного цитруллина как показателя проекции N0 важно не только в плане доказательства правомерности использования цитруллина, определяемого в микродиализных экспериментах, в качестве непрямого маркера активности МО-синтазы. но и имеет самостоятельное научное значение, поскольку дофамин-ЫО-ергическое взаимодействие в стриатуме изучено не достаточно Ко времени выхода из печати результатов наших исследований [Савельев, 2005] в литературе не было данных, поденных в прижизненных экспериментах, о влиянии дофаминергической стимуляции и блокады стриатума на продукцию N0 в этой области мозга. Не был исследован селективный вклад различных подклассов рецепторов дофамина в стриатуме в этот процесс.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЩДОВАНИЯ В связи с вышеизложенным, основной целью работы стало обоснование использования внеклеточного цитруллина, определяемого в микродиализных экспериментах в дорсальном и шггральном стриатуме, в качестве прижизненного показа ге. га локальной активности МО-синтшы и продукции оксида азота в этих областях мозга, а также изучение с помощью этого подхода изменений активности МО-ергичсской системы вентрального стриатума (прилежащее ядро) в ходе выработки и реализации классического условного рефлекса с болевым подкреплением. Для решения этой цели были поставлены следующие задачи'

1. Изучить влияние введений в дорсальный стриатум агониста рецепторов дофамина - апоморфина на внеклеточный уровень цитруллина в этой области мозга, а также исследовать зависимость этих изменений ш активности МО-синтазы и от блокады Д] и Дг рецепторов дофамина, осуществляемой путем введений в эту струкгуру 8СН-23390 и раклопрайда - селективных блокагоров Д и Дг рецепторов дофамина

2 Исследовать влияние введении в прилежащее ядро субстрата МО-синтазы - аргинина и блокагора N0-синтазы - 1Ч-нитро-Ь-аргинина на уровень гопруллина в межклеточном пространстве этой структуры.

3 Исследовать динамику изменений уровня цитруллина и аргинина в межклеточном пространстве прилежащего ядра в ходе выработки, реализации и угашения классического условного рефлекса на звук с болевым подкреплением

4 Изучить, как изменяется уровень внеклеточного цитруллина в прилежащем ядре в ходе выработки и реализации классического условного рефлекса на звук с болевым подкреплением при введениях в эту структуру селективного блокагора нейронной изоформы МО-синтдаы - 7-нитроюшазола и неселективного блокагора МО-синтазы - К-нитро-Ь-аргш [ш а.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Уровень цитруллина в межклеточном пространстве дорсального стриатума и прилежащего ядра, определяемый in vivo в микродиализных экспериментах, отражает активность NO-синтазы и может служить непрямым показателем локальной продукции NO

2. Выработка и реализация классического условного рефлекса с болевым подкреплением сопровождается активацией NO-ергической системы прилежащих) ядра преимущественно за счет активации нейронной изоформы NO-синтазы.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА Основные результаты, полученные в работе, являются приоритетными. Впервые показано, что уровень внеклеточного цшруллина в прилежащем ядре, опрелеляемый в микродиализных экспериментах, может отражать продукцию N0 в этой области мозга В частности, установлено, что внеклеточный уровень цитруллина возрастает при локальных введениях в эту структуру аргинина субстрата NO-синтазы и снижается при локальной блокаде NO-синтазы N-нитро-! -аргинином, а эффекты аргинина полностью предотвращаются введениями N-нитро [ -аргинина. Получены ранее неизвестные данные о том, что локальные введения агонисга рецепторов дофамина - апоморфина в дорсальный сгриатум приводят к росту уровня внеклеточного шпруллина в этой области мозга и что зги изменения блокируются ишибигором NO-синтазы и антагонистом Дг рецетпоров дофамина. Впервые установлено, что в процессе выработки и реализации классического условного рефлекса с болевым подкреплением в прилежащем япре происходит увеличение внеклеточного уровня двух аминокислот, участвующих в метаболизме N0 -шпруллина и аргинина. Впервые показано, чго связанные с выработкой данного рефлекса изменения уровня шпруллина в прилежащем ядре предотвращаются локальными введениями неселекгивного блокатора NO-синтазы - N-нитро-! ,-аргинина и существенно снижаются при введениях селективного блокатора нейронной изоформы NO-синтазы - 7-шпроиндазола. Впервые установлено, что луслош горефлекторнью» изменения уровня шпруллина в прилежащем ядре в ходе реализации классического условного рефлекса с болевым подкреплением полностью блокируются введениями в эту структуру как селективного блокатора нейронной изоформы NO-сшпазы - 7-гапроищшолв, так и неселекгивного блокатора NO-синтазы - N-Hmpo-L-аргинина, причем такая блокада ухудшает реализацию изучаемого условного рефлекса Данная работа является первым исследованием, в каюром в условиях прижизненной регистрации обнаружены изменения показателей метаболизма NO в 11JÍC в ходе уеловнорефлекгорного поведения.

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ Полученные в работе новые данные об NO-синтаза-зависимом увеличении уровня внеклеточного цитруллина в прилежащем ядре в ходе вырабогки и реализации классического условного рефлекса с болевым подкреплением важны в теоретическом плане, поскольку впервые показывают потенциальную роль NO-ергаческих нейронов этого подкоркового образования в процессах, связанных с функционированием системы эмоциональной памяти о нашивных событиях. Полученные данные об ухудшении реализации классического условного рефлекса с болевым подкреплением при введении блокагоров NO-синтазы в прилежащее ядро вносят вклад в понимание механизмов контроля проявлений реакции страха, и могут иметь практическую ценность для

разработки подходов медикаментозного воздействия на этот процесс Данные о рсцепторных механизмах дофамин-КО-фтичсского взаимодействия в стриатуме могут иметь значение в силу широкого применения дофаминергических препаратов в медицинской практике и потенциальной нейротоксичносги избытка NO АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Основные результаты работы были доложены на Ш Всероссийской конференции "Механизмы функционирования висцеральных систем" (Санкт-Петербург, 2003); XIX Съезде физиологического общества им И П Павлова (Ькаггеринбург, 2004); Всероссийской конференции молодых исследователей •'Физиология и медицина" (Санкт-Петербург, 2005); Международном симпозиуме "Механизмы адаптивного поведения" (Санкт-Петербург, 2005).

ПУБЛИКАЦИИ По теме диссертации опубликовано 11 научных работ- 3 статьи и 8 тезисов Работа поддержана грантом РФФИ (Проект X» 04-04-48252), грантом для студен гов. аспирантов и молодых специалистов 2003г Правительства Санкт-Петербурга (шифр МОЗ-2 6К-115) и Научной программой Санкт-Пегербургскош научного центра2005г.

СТРУКТУРА ДИССТРТАЦИИ Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов и обсуждения собственных наблюдений, выводов и библиографии Диссертация изложена на 158 страницах печатного текста, иллюстрирована 26 рисунками и 2 таблицами Указатель литературы включает 59 отечественных и 293 иностранных источника.

МЕТОДИКА

Работа выполнена методом прижизненного внутримозгового микродиалюа на 82 крысах-самцах линии Спрег-Доули массой 240-425 г Каждое животное было использовано в нескольких экспериментальных сериях. Животным под наркозом (золотил (5 мг/100 г) + ромегар (1.4 мкг/100 г), ъ!ы) унилатералъно имплантировали концентрические диализные канюли в дорсальный или вентральный (медиальный отдел прилежащего ядра) стриатум Диализные эксперименты проводаш на второй и третий день после имтянтации канюль на свободно движущихся живстгных Через канюлю постоянно прокачиваш искусственную спинномозговую жидкость (ИСМЖ) со скоростью 2 mktWh

Для изучения нейрохимических механизмов, контролирующих уровень внеклеточного цитруллина в исследуемых областях мозга в дорсальный стриатум методом диализной инфузии вводили- тетродстжсин ( 1 мкМ. п=6), ИСМЖ с повышенным содержанием калия (ЗОмМ, n=l 1), апоморфин (100мкМ. п=8), раклопрайд (10мкМ, n=8), SCH-23390 (50мкМ, п^б), N-нитро] у-аргинин (1мМ. n=8), а также смесь апоморфина (100мкМ) и N-HHTpo-L-aprmnma (1мМ; п=7), смесь апоморфина (100мкМ) и раклопрайда (10мкМ; п=9) смесь апоморфина (10мкМ) и SCH-23390 (50мкМ; п=5) В прилежащее ядро вводили: аргинин (50 и 500 мкМ, п=6), N-mtTpo-L-аргинин (1мМ, n=12), а также смесь N-Hmpo-I -аргт шна (1мМ) и аргинина (50мкМ; п=6) и смесь N-ниггро-! .-аргинина (1 мМ) и аргинина (500мкМ; п=6). Диализат собирали каждые 10 мин

Для изучения изменений уровня внеклеточного цитруллина в прилежащем ядре в ходе условнорефлекторного поведения у крыс опытных групп (п=31) с предварительно вживленными в

прилежащее ядро диализными канкыями вырабатывали ювссический условнъа1 рефлекс с болевым подкреплением путем сочетания юна (10001 п. 10 сек, с интервалом 1 мин, 5 раз) с ударами тока (0 5 мА, 1 сек. с интервалом 1 мин. 5 рал) в условнорефлеклорной камере 11ронодили 2 сессии обучения (но 5 мин), с интервалом час, после чего приступали к опытам по реализации и угашению рефлекса В ходе зггих эксперич&пов животных пометали в камеру. предъявитт им условные сигналы без болевого раздражения 11роволи1ти 4 угасательиые сессии - две в первый и две во второй день экспериментов с интервалом межд) сессиями в 1 час I тс через час ос\ шести, ш восстановление рефлекса, во время которого крыс помещали а камер} и предъявляли им условные сигналы, сочетаемые с гоком. как во время обучения Эксперименты проводили либо без фармаколошчеекою вмешательства, либо на фоне введений в нрилелощее ядро ингибиторов 'ЫО-сингазы К-нитро-Ь-аргинина (0 5 мМ) или 7-нитроиндазола (0 5 мМ) во время выработки (обучение 1 и 2) и во время реализации (\1ашенис 1 и 2) рефлекса Во время пребывания животных в условнорефлекгорпой камере регистрировали время «мирания на условные (звук) и обстановочные (камера) стимулы, отражающее выработанное»» рефлекса С животными контрольной фупны (п-7) проделывали тс же проке туры. но без предъявления тока в ходе выработки рефлекса Диализат собирали каждые 5 мин в ходе жеперимеша

По «вершении жспфименшвосущесття-ш морфологический контрой токаииации канюль

Уровень питр\лтина и аргинина в диализате определяли методом высоко-эффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией [Савельев и др, 2005] Содержание цтруллина и аргинина рассчитывали в процентах по отношению к среднему фоновом) уровню перед тестированием В поведенческих экспериментах с введением блокаторов \'0-синтазы и при введении фармакологических препаратов на фоне введений блокаторов Ю-синтазы, фоновым считался уровень цшруАТИна. измененный предваряющим введением блокаторов Статистическую обработку проводили с помощью дисперсионного анализа и по 1-кригерию Стьюдента (ЗщтаБы 2.0)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Влияние стимуляции и блокады рецепторов дофамина дорсального сгриатума на вноаешчиьп! уровень цитру ллши в этой структуре

Фоновый уровень шпруллина в диализате дорсального стриатума составлял 48±5 нМ Лоюыыгые введения ингибиюра ЫО-синтазы - Х-ничро-Ь-аргинина вдвое снижали уровень цитрултпа в межклеючном пространстве дорсального стриатума (Р(х_-18г7.92. р<0.001). Напротив, локальные введения агониста рецепторов дофамина апоморфина увеличивали тггот показатель на протяжении всего пфиода воздействия препарата (Т^&з^ 5.82. р<0001; рис.1). Вызванный аиоморфином рост уровня внеклеточного щпру.шшш в дорсальном стриатуме предотвращался введениями ингиб!тгора >)0-синтазы - \Чштро-1 -аргинина (Ь(842>=1 Ч, ">)- а также блокагора /Ь рецепторов дофамина - раклонрайла (Г^-Ч) 78. р=0.62. рие.1).

I ^ \t 200

„V

¥ 1чо £

I 100

£ 50 5

- Аноморфин ■ Лпоморфин+Раклопрайд

♦ vz * т *

_ *** л ***

10 20 30

40 50 60 Время (мин.)

70 80 90

Рис 1. Уровень внеклеточного цитруллина в дорсальном стриатуче при введениях в эту структуру алочорфина (100 мкМ, п=8) и смеси апоморфина (100 мкМ) и раклопрайда (10 мкМ, п=9)

1авсь и далее: Ось абсцисс - время в минутах. Ось ордигаг-уровень цитруллина в процентах к собственному среднему фону перед введением фермахолоттеских препаратов. Разброс на графиках соответствует ошибке среднего. Обозначения: Горизонтальная линия - период введения фармакологического препарата. *** - р0001, гд е р -уровень значимости при сравнении с фоновыми значениями, +-р<005,+++-р0001, где р- уровень значимости при сравнении ¡рупп между собой.

Введения в дорсальный стриатум апоморфина на фоне введений блока гора Д1 рецепторов - ХСН-23390 приводили к росту уровня внеклеточного цитрушшна в этой структуре (Р,&зз,=12.8, р<0.001), аналогичному подьшу этого показателя, вызываемому введениями апоморфина.

Влияние введений в прилежащее ядро субстрата !ЧО-сшпазы - аргинина и (¡локатора !ЧО-сингазы -1Ч'-1штро-Ъ-аргинина на внеклеточный уровень цитруллина в этой структуре

Фоновый уровень цитруллина в диализате прилежащего ядра составлял 50ь8 нМ. Введения в прилежащее ядро аргинина в физиологической концентрации 50 мкМ, сопоставимой с содержанием аргинина в межклеточном пространстве, приводила к двукрашому росту уровня внеклеточного щпруллина в этой структуре (Р,845г4.7. р<0.001; п=6, рис.2Л). Напротив, введения ингибитора ЫО-синтазы - М-нитро-Ь-аргинина (1 мМ) значительно понижали уровень внеклеточного цитруллина (Р(8,45)=17, р<0 001; п-12, рис.2Б) Л 300 -

0 10 20 30 40 М> <0 70 80 90 1001 Время (мин )

L

Рис. 2. Изменения уровня i [итруллина в дгалгоате прилежащего ядра при введениях в эту структуру (А) - api инина (50 чкМ) (Б)-аргииию(50мкМ) на фоне введений Ы-нитро-1^-аргинина(1 мМ)

Обозначения: Гшкииная горизонтальная линия - период введения аргинина, пунктир шя - период введения N-Hmpo-L-аргинина. * -рО 001, гд е р - уровень значимости при сравнении с фоновыми значениями.

Кроме того, вызванные введением аргинина 50 мкМ изменения уровня цитруллина в межклеточном пространстве прилежащего ядра полностью предотвращались введениями N-нитро-Г.-артнина (1мМ; п=6; рис2Б) Введения аргинши в концентрации 500 мкМ, многократно превышающей физиологический

уровень, снижали уровень внеклеточного цшруллина прилежащего ядра (Р(&«г=15.9, рО.ОМ), но эти изменения также предотвращались введениями К-тпро-Ь-аргининаОмМ).

Изменения внеклеточного уровня цитруллина прилежащего ядра в ходе выработки, реализации и угашения классического условного рефлекса на болевом подкреплении

Выработка классического условного рефлекса с болевым подкреплением (сочетание тона с уд арами тока в камере, п~20) сопровождала^ увеличением внеклеточного уровня шпруллина в прилежащем ядре во время и сразу после обусловливания (Р(И228г15.3, р<0001 дня обучения 1 и Р(цдаг12.6, р<0.001 для обучения 2). Причем на первом ттапе выработки этого условного рефлекса максимальный рост продукции цшруллина (185±14%) происходил после, а не во время поведенческого тестирования Однако в ходе второго этапа обучения макшмум этих изменений перемещался на период обуслоативания (252±37%, рис.3).

Время (мин.)

Рис 3. №менения уровня внеклеточного цшруллина в прилежащем ядре в холе выработки, угашения и восстановления классического условного рефлекса с болевым подкреплением (выработка, утешение и восстановление рефлекса) и у контрольных животных (коктроль)

Обозначении: Стрелка соответствует времени помещения крысы в условнорефлекторную камеру *-рот005др0001, гдер уровень }( ¡ачимосш при сравшнии с собственным фоном -г-рог005до0.001, гжр-уровень значимости при сравнении групп моклу собой.

Реализация изучаемого условного рефлекса при предъявлении тона в камере, но без болевого раздражения (угашение 1, п=8; ^щипН 6; р<0001) сопровождалась «условнорефиекторным» подъемом уровня внеклеточного цитруллина в прилежащем ядре В ходе последующих неподкрепляемых током реализаций рефлекса (угашение 2-4, п=8) наблюдалось снижение выраженности подъема уровня внеклеточного цитруллина в этой структуре, коррелирующее со степенью угашения рефлекса (г=044, Р(|юг6.7, р=002) Восстаношюние рефлекса (п=7; Р(п7оу=54; р<0.001) приводило к росту уровня внеклеточного шпруллина в прилежащем вдре (303±60%).

Влияние локальной блокады активности МО-синтазы прилежащего ядра на изменения внеклеточного уровня иитруллина в ттой структуре в ходе выработки н реализации классического условного рефлекса с болевым подкреплением

Выработка классического условного рефлекса с болевым подкреплением на фоне введений М-нитро-1 ^ аргинина (05 мМ, п=4) в прилежащее ядро не сопровождалась изменениями уровня внеклеточного цитруллина в этой структуре в ходе обеих поведенческих сессий относительного собственного фонового уровня перед поведенческим тестированием (рис 4А; ^ щб)=0 78, р=0 7 для обучения 1 иР(щб,=1Др=0 5 для обучения 2) Реализация классического условного рефлекса с болевым подкреплением (угаптение 1 и 2. п=4). проводимая на фоне введения М-цихро-Ь-аргинина (0 5 мМ), также не сопровождалась изменениями уровня цитруллина в прилежащем ядре в ходе обеих угасательных сессий (рис4Б;Р(цэд=1 4, р=0 24 для угашения 1 и И,! цб)=1.6, р=013 дяя угашения 2) Межгрупповое сравнение выявило достоверные различия по уровню цитруллина как в ходе обучения, так и в ходе угашения между животными с введениями и бея введений Ы-нигро-Ь-аргинина. Таким образом, введения неселективного ингибитора МО-синтазы полностью предотвращали рост уровня цитруллина в прилежащем ялре, вызываемый выработкой и реализацией классического условного рефлекса с болевым подкреплениям

Рис. 4. И1че1 1ения уровня шк-к.кггочного ци|руллина в прилежащем ялре при вырабеггке реализации и угашении классического условного рефиккса с болевым подкреплением без фармакологического вмешательства (обучение, угашение) и на фоне введения неа^кжгииноги ишибшора КОсишал.! ^нитро! -арганина(0 5 мМ, обучение угашенис4 Ы-нтро-Ь-аргинин)

Обозначения: С грелю июлвелствуе! времени помещения крысы в условнорефлеклпрную гамеру Горизонтальная линия -период введения >йшро-1^аргинина. *** - р0001, * - гае р - уровень зримости при сравнении с собственным фоном +-р-"005 >+-р<)01,гяер-урове11ь-!начимос™присравненииг1^ппмеждуообой

Выработка классического условного рефлекса с бо 1евым ноткреплением на фоне введений селективного блокагора нейронной МО-сингазы 7-нитроиндазола (05 мМ, п=7) в прилежащее ядро сопровождалась небольшим, но достоверным ростом уровня внеклеточного цитрутлина в этой структуре в ходе обеих сессий обучения относительно собственного фонового уровня перед поведенческим тестированием (рис.5Д: К{1172)" 2.4, р=0.013 для обучения 1 и Р(ц д, -3 2, р=0.001 для обучения 2) Реализация рефлекса (угасательная

сессия 1 п=7) у животных, подвергшихся введениям 7-нитроиндазти в ходе его выработки, также сопровождалась небольшим, по достоверным ростом уровня внеклеточного цитруллши в прилежащем ядре относительно собственного фона перед тестированием (Р(п72г36, р<0001). Эти изменения были гакже достоверны относительно подъема уровня цитруллина в ходе угасательной сессии 1, наблюдавшегося у живоп 1ых без введений блокатора (1 от 2.2 до 4 1, р от 0 04 до 0 001). В ходе дальнейшего угашения рефлекса (угасательные сессии 2-4) у животных, которым 7-нитроиндазол вводили во время его выработки, мы не обнаружили достоверных изменений уровня щпруллина в прилежащем ядре Таким образом, введения в прилежащее ядро блокатора нейронной ЫО-синтазы во время обучения существенно снижати величину подъема уровня цитрудлина. наблюдаемого как во время выработки, так и во время реализации рефлекса.

Рис 5. Изменения уровня внеклеточного цнтруллиш в прилежащем ядре при выработке реализации и угашении классического условного рефлекса с болевым подкреплением бв фармакологического вмешагельегга (обучение, гашение) и на фоне введения ингибитора нейронной Т^Осиншзы 7-нтроинлазола(0 5 мМ. Обучение, Уг<циение+7нжроиндазол,) Обозначения: Стрелка соответсгауег времени помещения крысы в условнорефтекторнмо камеру. Горизонтальная линия -период введения 7-нигроинаазола. *** - у 0001, ** - р<001, * - р005, где р уровень значимости при сравнении с собственным фоном, -г - р<005, ++ - р<001, +++ - р<0 001, глер-уровень чначимости при сравшнии групп между собой.

В отличие от этого, введения 7-нитротиазола (05 мМ) во время реализации классического условного рефлекса с болевым подкреплением (угаиение 1 и 2, п=8) полностью предотвращаю условнорсфлееторный подъем уровня внеклеточного щггруллина в 1филежащем ядре А именно, реализация рефлекса у таких животных не приводила к изменениям уровня щпруллина в прилежащем ядре ни во время (угашение 1. 1"!11 мгО 9. р=0 56 и угашение 2, ^п м)=0.7,р=0.78). ни после (угаиение 3 и 4, рис 5Ь) введения препарата.

При введении 7-шпроиндаола и М-питро-Ь-аргиншта наблюдалось ухудшение реализации рефлекса, что отражалось в укорочении периодов замирания на условный стимул (1=4 4 и ^ 6 для угэгагельной сессии 1 и 2. р<0.001 при введениях 7-ншроицдазола; 5 и 2 6 дня угаса!Ыьной сессии 1 и 2. р=0 03 при введениям Ы-ншро-Ь-аргинина) При этом введения обоих ингибиторов ЫО-сингазы животным контрольных групп не оказывали влияния на подвижность животных

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Цитруллин является со-продукшм реакции при образовании оксида азота из аргинина [Knowels, Moneada, 1994] Тканевое и внутриклеточное содержание злой аминокислоты широко используется в качестве показателя активное™ NO-синтазы [Carlberg, 1994; Bhardwaj et al, 1998; MartíneM et al., 2002], так как иных ферментативных реакций, ответственных за образование шпруллина, в ЦНС не найдено [Wiesinger, 2001]. Ьсть единичные сведения о том. что внеклеточный цитруллин дорсального стриатума, определяемый в микродиализных экспериментах in vivo, также может отражать активность NO-синтазы и, возможно, локальную продукцию NO [Ohta et al, 1994; Goren et al, 2001] Результаты нашей работы подтверждают справедливость этого вывода для прилежащего ядра, так как они показывают, что стимуляция NO-ергической системы прилежащего дара аргинином (50 мкМ) приводит к увеличению уровня внеклеточного цитруллина. а блокада NO-ситазы злой структуры N-nmpo-L-аргинином (1 мМ) ведет к снижению этого показателя и полностью предотвращает эффекты локальных введений аргинина. И поскольку прямая прижизненная регистрация продукции N0 затруднена вследствие короткого времени жизни этой молекулы (3-5с), прижизненный микродиализный мониторинг цитруллина может являться альтернативным подходом для исследования функций N0 в организации поведения.

Следующий этап работы заключался в обосновании адеквашосги использованной нами модификации метода электрохимического определения цитруллина в диализате мозга [Савельев и др., 2005] для исследования функциональной роли NO-ергаческой системы стриатума. С этой целью мы экспериментально проверили ранее известные, но не исследованные при помощи in vivo микродиализа данные о дофамин-МОергическом взаимодействии в дорсальном стриатуме Поскольку помимо корковых птугаматергических афферентных входов NO-ергические нейроны стриатума получают проекции дофаминергических нейронов черного вещества [Kawaguchi et al. 1995]. а на мембране этих нейронов имеются популяции рецеггюров дофамина, то активность NO-ергических нейронов схриатума могла бьт также зависеть и от дофамштергического входа этой структуры Действительно, ранее в экспериментах m vitro было показано увеличение продукции N0 в стриатуме при системных введениях амфетамина (Bashkatova et al., 1999], а также снижение активности NO-сингазы в этой области мозга и уменьшение тканевого уровня метаболитов NO после разрушения дофаминергической системы стриатума 6-пцроксидофамином [De Vente et al., 2000; Sahach et al., 2000]. Результаты настоящего исследования находятся в соответствии с этими фактами и показывают, что не только системная, но и локальная активация дофаминергических рецепторов может приводить к усилению продукции NO в стриатуме, поскагьку введение аломорфина в дорсальный стриатум увеличивает внеклеточный уровень нитруя, юна в данной структуре и лот эффект полностью предотвращается №ш«ро-Ь-аргинином. Таким образом, наши данньк совпадают с результатами работ, выполненных с использованием иных методов оценки продукции NO в 1II 1С, что еще раз подтверждает правомерность использованного нами методического подхода для оценки

активности NO-ергической системы Кроме того мы впервые установили, что за апоморфин-зависимое увеличение уровня внеклеточного цигруллина в дорсальном стриатуме отвечают, по всей видимости, Д> рецепторы дофамина, так как введения раклопрайда (блокагора Д? pcuei ггоров дофамина) полностью предотвращают вызванный апоморфином рост уровня цигруллина в этой структуре, в то время как введения SCH-23390 (блокагора Дг рецепторов дофамина) были не эффективны. Одним из возможных механизмов опосредованного Д2 рецеттгорной активацией увеличения уровня цигруллина может являться активация пресипаптических Дг рецепторов, локализованных на тормозных ГАМК-ергических терминалах. которые образуют синапсы на NO-синтаза-содсржащих нейронах стриатума. Именно такой механюм акгавирующето действия дофамина был показан для других интернейронов стриатума [Momiyama, Koga, 2001 ; Bracci et al., 2002J.

Важным результатом данной работы явилось исследование ранее не изученных изменений активности NO-системы прилежащего ядра в процессе условнорефлекторного поведения Прилежащее ядро традиционно рассматривается в качестве связующего звена между лимбическими областями и исполнительными центрами мозга. Глугамагергические входы прилежащего ядра, играющие ведущую роль в формировании активности выходных нейронов этой структуры [O'Donnell, 1999], вовлекаются в образование ассоциации между условными (и/или обстановочными) стимулами и подкреплением в холе классическою обусловливания [Phillips, Le Doux, 1992] и могут участвовать в формировании корректирующих сигналов при переучивании [Strosziiajder et al, 1994, Сеульская и др., 2(Х)5]. «Память» о глутаматергической активации, сопровождающей эти процессы, может сохраняться в виде изменений эффективности синагттической передачи в глутаматергических синапсах прилежащего ядра. Одним из потенциальных механизмов, способствующих таким пластическим перестройкам, может являться глутамат-зависимое усиление продукции NO [Kraus, Prast, 2002], контролирующее синаптаческую пластичность в других областях мозга [Cerrtonze et al, 1999; Bon, Garlhwaite, 2003] Однако до сих пор не было данных, полученных в прижизненных экспериментах, показывающих, меняется ж продукция оксида азота в 1{НС в ходе условнорефлекторного поведения. В работе продемонстрировало, что во время выработки классического условного рефлекса с болевым подкреплением происходит значительное увеличение уровня цтруллина в межклеточном пространстве прилежащего ядра. Более того, гакое увеличение уровня цигруллина воспроизводится условнорефлекгорно при предъявлении стимулов (тон в камере), ранее сочетавшихся с болевым подкреплением, и этот эффект гаснет при угашении рефлекса и восстанавливается при его восстановлении, что предполагает вовлечение NO-ергической системы прилежащего ядра в контроль данной формы условнорефлекторного поведения.

Проведенный в работе нейрохимический анализ изменений уровня цигруллина, па&гюлаемых в ходе выработки и реализации изучаемого рефлекса, показал, что увеличение продукции внеклеточного цитруыина в лих жепериментах происходит преимущественно, но не исключительно за счет активации нейронной изоформы NO-синтазы. Об этом свидетельствует тот факт, что подъем уровня внеклеточного цигруллина в прилежащем ядре, наблюдаемый при выработке и реализации рефлекса, полностью

предотвращался Ы-нитро-! .-аргинином, блокирующим все изоформы ЫОсинтзды, и значительно снижался при введениях 7-нтроиндазола - селективного ингибитора нейронной ЬЮ-синтазы. Однако введения 7-нтроиндазола в ходе реализации изучаемого рефлекса полностью блокировали «условнорефлекгорный» рост уровня цигруллина Эти данные свидетельствуют, что все изменения уровня внеклеточного цигруллина прилежащего ядра, регистрируемые в ходе выработки и реализации рефлекса, являются результатом локальной активации ЫО-сингазы и, следовательно, отражают продукцию N0 в этой области мозга. Во-вторых. они предполагают вклад не только нейронной, но и других даоформ ЫОюинтазы (например, эндотелиальной) в изменения продукции N0 в ходе обучения, что перекликается с данными литературы об участии эндотелиальной МО-ситазы в процессах обучения [Шкшшп й а1., 1994; Яоп а1., 19%; Погеч1ее е! а1. 20031 В-трегьих. они свидетельствуют, что при реализации данного рефлекса условнорефлекторно воспроизводится только активация нейронной МО-синтазы. связанной с функционированием Ю-ергических ингернейронов прилежащего ядра.

Тот факт, что реализация рефлекса при первых отменах подкрепления сопровождается увеличением уровня внеклеточного цигруллина в ходе тестирования, позволяет предполагать, что уетовнорефлекгорная активация МО-ергической системы прилежащего адра может быгь важна дм реализации данной формы эмоциональной памяти. Результаты проведенных нами фармакологических тестов свидетельствуют в пользу этого предположения. А именно, мы установили, что введения в прилежащее ядро обоих использованных блокагоров 1ЧО-сшгсвы существенно укорачивают время замирания на условные стимулы, ранее сочетавшиеся с болевым раздражением (показатель выработанное™ исследуемого рефлекса), не влияя на подвижность животных кошрольных групп. Эти данные позволяют предполагать участие >ГО-ергической системы прилежащего ядра в процессах, связанных с контролем проявлений реакции страха, моделью которого является изучаемый в работе условный рефлекс

В целом, результаты настоящего исследования свидетельствуют, что уровень внеклеточного цигруллина в прилежащем ядре, определяемый в микродиашзных экспериментах, является отражением активности N0-синтазы и, весьма вероятно, продукции оксида азота в данной области мозга, поскольку подъем этого показателя, вызываемой фармакологаческой и поведенческой стимуляцией, полностью предотвращается локальными введениями блокагоров ЫО-сшггазы.

ВЫВОДЫ

1 Введения в дорсальный стриатум методом диализной инфузии агониста репетиров дофамина -апоморфина (100 мкМ) приводят к увеличению уровня внеклеточного ци'ФУ-ишла (со-цродуюа синтеза оксида азога) в этой области мозга, которое полностью предотвращается внутристриапплми введениями ингибитора ЫО-синтазы - N-1 штро-Ь-аргинина (1мМ) и блокагора Дг рецепторов дофамина -раклопрайда (10 мкМ), но не введениями блокагора Д] рецепторов дофамина - 8СН-23390 (50 мкМ) Эти

дашше свидетельствуют, что дофаминергическая стимуляция дорсального стриагума апоморфином приводит к активации NO-синтазы и. возможно, стимулирует продукцию оксида азота в этой области мозга с использованием Дг рецепторов дофамина.

2 Введения в прилежащее ядро субстрата NO-синтазы - аргинина (50 мкМ1 увеличивают, а введения блокагора зтого фермента-N-mnpo-L-apniHHHa (1 мМ) снижают внеклеточный уровень цитрулмна в данной области мозга, причем вызванный введениями аргинина рост уровня цтру.шина по.шостью предотвращается введениями Ы-нитро-Ь-аргинина.

3 Выработка классического условного рефлекса с болевым подкреплением coi 1ровожязегся ростом уровня внеклеточного цитруллина в прилежащем ядре, который воспроизводится сусловнорефлекторно» в ходе реализации рефлекса Условнорефлекторный подьем уровня цшрухшна в прилежащем ядре снижается в ходе утешения условного рефлекса и вновь возникает при его восстаноа юнии

4 Увеличение уровня внеклеточного цшруллина в прилежащем ядре в ходе выработки классического условного рефлекса с болевым подкреплением полностью предотвращается введениями в прилежащее ядро неселективного ингибитора NO-синтазьт - N-mnpo-I -аргинина (0 5 мМ) и существенно снижается при введениях селективного ингибитора нейронной изоформы NO-сшпазы - 7-нитроивдззола (0 5 мМ) Условнорефлекторные изменения уровня шпруллина в прилежащем ядре при реализации данного условного рефлекса полностью блокируются введениями в эту структуру обоих ингибиторов NO сиг тазы, причем такая блокада ухудшает реализацию условного рефлекса

5 Полученные данные позволяют предполагать, что в ходе выработки и реализации классического условного рефлекса с болевым подкреплением в прилежащем ядре происходит активация NO-синтазы и усиление продукции оксида азота преимущественно за счет активации нейронной изоформы этого фермента

6 Полученные в работе результаты свидетельствуют, что уровень цитруллина в межклеточном пространстве дорсального стриагума и прилежащего ядра, определяемый в микродиализных экспериментах, зависит от активности NO-синтазы и может быть использован в качестве непрямого маркера продукции оксида азота в этих областях мои а

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Савельев С.А. Репкина Н.С, Саудьская Н.Б. Прижизненный мониторинг содержания щпр^шина в межклеточном пространстве ЦНС как метод исследования продукции оксида азота / Материалы Ш Всероссийской конференции «Механизмы функционирования висцеральных систем» СПб. 2003. С289-290.

2. Савельев С А. Дофачин-NO-epi ическос взаимодействие в стриатуме крыс / Восьмая Санкг-I [erepñypicKan Ассамблея мешодых ученых и специашсгов Аннотации работ по грантам Саша-

Петербургского конкурса 2003 года для студентов, аспирантов и молодых специалистов. СПб, 2003. С.53-54.

3 Савельев С А, Репкина 11С Определение Ь-цитруллина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией / Материалы Седьмой Всероссийской медико-биологической научной конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье». СПб, 2004 С 252-253

4 Савельев СА Участие дофаминергического входа в регуляции продукции оксида азота в стриагуме крьюы / Тезисы докладов XI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2004». Москва МГУ им. МБ. Ломоносова. 2004. С. 137-138.

5 Савельев С А, Дофамин-ЫО-ергическое взаимодействие в стриагуме крысы // Тезисы докладов XIX Съезда физиологического общества им. И.П. Павлова Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. СПб.: «Паука», 2004. Т.90. №8 С.276-277.

6 Савельев СА. Репкина Н.С.. Сеульская Н.К. Чувствительный метод определения цитруллина для прижизненного мониторинга продукции оксида аэспа в ЦНС / Рос. физиол. журн. им. ИМ. Сеченова, 2005. Т.91 №5. С.587-591.

7 Савельев СА Изменение метаболизма оксида азота в вентральном стриагуме при выработке, воспроизведении и угасании следов эмоциональной памяти / Вестник молодых ученых Приложение к серии Науки о жизни Сборник материалов Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина» СПб, 2005. С.102.

8 Савельев С А Влияние локальных введений апоморфина на внеклеточный уровень щпруллина в стриатуме- участие Г)1- и Ш- рецепторов дофамина ' Рос физиол журн. им И М. Сеченова 2005. Т.91, №8 С'942-948

9 Савельев СА, Саульская Н.Б. Рецепторные механизмы дофамш-Ю-ергического взаимодействия в стриагуме // Гежсы докладов Мовдународного симпозиума «Механизмы адаптивного поведения», посвященного 80-.1ешю организации института физиологии им И.П.Пашюва РАН. СПб. 2005. С. 71-72.

10. Саульская Н.Б, Савельев С.А., Соловьева НА, Репкина Н.С., Фофонова Н.В. МО-ергические корреляты эмоциональной памяти // Тезисы докладов Международного симпозиума «Механизмы адаптивного поведения», посвященного 80-летию организации института физиологии им И П Павлова РАН. СПб. 2005. С. 73-74.

11. Савельев С А, Саульская Н.Б Уровень внеклеточного цитруллина в прилежащем ядре бгасситЬегк) в ходе выработки и утешения классического условного рефлекса на болевом подкреплении. / Журнал ВНД 2006 Т 56 №1 С 85-93.

Подписано в печать 25.04.2006 Формат 60x84 1/1 б.Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 315.

Отпечатано в ООО «Издательство "ЛЕМЛ"»

199004, Россия, Санкт-Петербург, В.О., Средний пр., д.24, тел./факс: 323-67-74 e-mail: izd_lema@mail.ru

Л&e>6A -ГА&бО

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Савельев, Сергей Александрович

1.ВВЕДЕНИЕ.

2.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ СТРИАТУМА.

2.1.1. Место стриатума в системе подкорковых структур переднего мозга.

2.1.2. Структура неостриатума и прилежащего ядра.

2.1.3. Деление стриатума на дорсальный и вентральный отделы.

2.1.4. Мозаичная организация стриатума.

2.1.5. Афферентные проекции дорсального и вентрального стриатума.

2.1.6. Эфферентные проекции дорсального и вентрального стриатума.

2.2. НЕЙРОХИМИЧЕСКАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ СТРИАТУМА.

2.2.1. Парвальбумин-содержащие ГАМК-ергические интернейроны.

2.2.2. Калретинин-содержащие ГАМК-ергические интернейроны.

2.2.3. Холинергические интернейроны.

2.2.4. NO-синтаза-содержащие интернейроны.

2.3. РОЛЬ ОКСИДА АЗОТА В ПОСТРОЕНИИ ФУНКЦИЙ ЦНС.

2.3.1. Общая характеристика оксида азота.

2.3.2. Функциональная роль оксида азота в построении функций ЦНС.

2.4. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ NO-ЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ СТРИАТУМА С ДРУГИМИ НЕЙРОМЕДИАТОРНЫМИ СИСТЕМАМИ.

2.4.1. Глутамат-ЫО-ергическое взаимодействие.

2.4.2. Ацетилхолин-ЫО-ергическое взаимодействие.

2.4.3. Дофамин-МО-ергическое взаимодействие.

2.5. УЧАСТИЕ NO-ЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ ВЕНТРАЛЬНОГО СТРИАТУМА В ОРГАНИЗАЦИИ ПОВЕДЕНИЯ.

2.5.1. Функциональная роль прилежащего ядра в организации поведения.

2.5.2. Вклад Shell и Core отделов прилежащего ядра в реализацию различных форм поведения.

2.5.3. Участие NO-ергической системы в организации поведения.

3.МАТЕРИ АЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ПРИЖИЗНЕННОГО ВНУТРИМОЗГОВОГО МИКРОДИАЛИЗА.

3.2. СХЕМА ПРОВЕДЕНИЯ ДИАЛИЗНЫХ ЭКСПЕРИМЕНТОВ.

3.2.1. Изготовление диализных канюль.

3.2.2. Операция по имплантации диализной канюли в вентральный или дорсальный отдел стриатума.

3.2.3. Диализный эксперимент.

3.2.4. Морфологический контроль.

3.3. КАЧЕСТВЕННЫЙ И КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ ДИАЛИЗАТА НА СОДЕРЖАНИЕ АМИНОКИСЛОТ.

3.3.1. Хроматографический анализ диализата.

3.3.2. Модификация метода ВЭЖХ с электрохимической детекцией для хроматографического разделения и электрохимического определения цитруллина и аргинина.

3.4. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.

3.5. ИССЛЕДОВАНИЯ ВЛИЯНИЯ ВВЕДЕНИЙ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ НА УРОВЕНЬ ВНЕКЛЕТОЧНОГО ЦИТРУЛЛИНА И АРГИНИНА.

3.6. ИССЛЕДОВАНИЯ ИЗМЕНЕНИЙ УРОВНЯ ВНЕКЛЕТОЧНОГО ЦИТРУЛЛИНА В ПРИЛЕЖАЩЕМ ЯДРЕ В ХОДЕ ПОВЕДЕНЧЕСКОГО ТЕСТИРОВАНИЯ.

3.6.1. Выработка и угашение классического условного рефлекса на звук с болевым подкреплением.

3.6.2. Выработка и угашение классического условного рефлекса на звук с болевым подкреплением на фоне блокады NO-ергической системы прилежащего ядра.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

4.1. Влияние калиевой деполяризации и введений тетродотоксина на внеклеточный уровень цитруллина и аргинина в дорсальном стриатуме.

4.2. Влияние локальных введений в дорсальный стриатум N-нитро-Ь-аргинина и апоморфина на внеклеточный уровень цитруллина этой структуры.

4.3. Влияние совместных введений в дорсальный стриатум апоморфина и селективных блокаторов Д] и Дг рецепторов дофамина - SCH-23390 и раклопрайда на внеклеточный уровень цитруллина в этой структуре.

4.4. Влияние локальных введений в прилежащее ядро аргинина и N-нитро-Ь-аргинина на внеклеточный уровень цитруллина этой структуры.

4.5. Выработка, угашение и восстановление классического условного рефлекса на звук с болевым подкреплением.

4.5.1. Поведение животных при выработке, реализации и угашении классического условного рефлекса с болевым подкреплением.

4.5.2. Изменения уровня цитруллина в межклеточном пространстве прилежащего ядра при выработке классического условного рефлекса с болевым подкреплением.

4.5.3. Изменения внеклеточного уровня цитруллина прилежащего ядра в ходе реализации и угашения выработанного классического условного рефлекса с болевым подкреплением.

4.5.4. Изменения уровня цитруллина в межклеточном пространстве прилежащего ядра в ходе восстановления угашенного классического условного рефлекса с болевым подкреплением.

4.5.5. Уровень цитруллина в прилежащем ядре в ходе контрольных тестов (предъявление камеры и тона, не сочетающееся с болевым раздражением).

4.5.6. Изменения уровня внеклеточного аргинина прилежащего ядра при выработке, угашении и восстановлении классического условного рефлекса с болевым подкреплением.

4.6. Выработка, реализация и угашение классического условного рефлекса на звук с болевым подкреплением на фоне блокады NO-ергической системы прилежащего ядра.

4.6.1. Поведение животных в ходе выработки и угашении классического условного рефлекса с болевым подкреплением на фоне блокады NO-ергической системы прилежащего ядра.

4.6.2. Влияние N-нитро-Ь-аргинина на изменения уровня внеклеточного цитруллина в прилежащем ядре при выработке и угашении классического условного рефлекса с болевым подкреплением.

4.6.3. Влияние 7-нитроиндазола на изменения уровня внеклеточного цитруллина в прилежащем ядре в ходе выработки классического условного рефлекса с болевым подкреплением.

4.6.4. Влияние 7-нитроиндазола на изменения уровня внеклеточного цитруллина в прилежащем ядре в ходе угашения классического условного рефлекса с болевым подкреплением.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изменения показателей продукции оксида азота в прилежащем ядре в ходе условнорефлекторного поведения"

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ Изучение механизмов межклеточной химической сигнализации в ЦНС является одной из актуальных проблем современной нейрофизиологии. Новым быстро развивающимся направлением этой фундаментальной проблемы является исследование функциональной роли и путей регуляции продукции оксида азота NO-ергическими нейронами мозга. Оксид азота (N0) относится к группе неклассических нейротрансмиттеров и обладает большим набором функций в организме, что послужило причиной его детального изучения в последнее время. Установлена его важная роль в контроле мозгового кровотока, в генезе нейродегенеративных заболеваний, а также в процессах синаптической пластичности [Раевский, 1997; Centonze et al., 1999; Baran ano et al., 2001]. В организме человека и животных NO образуется в результате реакции окислительного деаминирования аминокислоты аргинина и эту реакцию катализирует NO-синтаза. В ЦНС выявлено несколько изоформ этого фермента, в том числе нейронная изоформа. NO-синтаза-содержащие нейроны широко распространены в мозге. Наибольшее их количество приходится на кору больших полушарий, мозжечок и базальные ганглии. В стриатуме нейроны, содержащие NO-синтазу - это нешипиковые интернейроны средних размеров, в которых также обнаружены нейропептид Y, соматостатин, НАДФН-диафораза (ко-фактор, участвующий в продукции N0) и глутамат-декарбоксилаза (фермент синтеза ГАМК) [West et al., 2002]. В стриатуме NO участвует в модуляции синаптического выброса нейротрансмиттеров, в контроле возбудимости проекционных нейронов этого подкоркового образования, а также в возникновении длительных изменений эффективности синаптической передачи в глутаматергических синапсах, предположительно лежащих в основе обучения [Centonze et al., 1999; West et al., 2002]. Вместе с тем, не установлено, меняется ли продукция NO в стриатуме при реализации поведения, контролируемого этой структурой. Литературные данные свидетельствуют об участии всех отделов стриатума, включая прилежащее ядро, в организации адаптивного поведения, а именно, в обеспечении процессов целенаправленного внимания, эмоционально-мотивационного реагирования, в выработке и реализации условных классических и инструментальных рефлексов [Шаповалова, 1978; Толкунов, 1978; 2002; Отеллин, 1987; Отеллин, Арушанян, 1989; Саульская, 1990; 1993; Шаповалова и др., 1992; Saulskaya, Marsden, 1995; Шаляпина и др., 1998; 2002; Самойлов, 1999; Шуваев, Суворов, 2000; Саульская, Михайлова, 2001; 2003]. В частности, показано участие прилежащего ядра в выработке и реализации классических (Павловских) условных рефлексов с болевым подкреплением, моделирующих процессы эмоциональной памяти [Саульская и др., 1999; 2000; 2001]. Однако нет сведений об участии NO-ергических механизмов этой структуры в таких процессах. Более того, не существует ни одного исследования, в котором бы в условиях прижизненной регистрации были показаны изменения каких либо показателей продукции оксида азота в ЦНС при реализации поведения. Исследование роли NO-ергической системы прилежащего ядра в формировании и реализации следов памяти об эмоционально негативных событиях имеет не только теоретическое, но и практическое значение, поскольку может помочь в разработке методов направленной фармакотерапии патологических состояний, связанных с гипертрофированными реакциями страха (фобии, посттравматический синдром).

Одной из серьезных проблем, связанных с исследованием функциональной роли и путей регуляции нитрергических систем мозга, является короткое время жизни оксида азота (3-5сек), что затрудняет прямое определение NO, особенно в экспериментах in vivo на ненаркотизированных животных. Известно, что совместно с оксидом азота в ходе ферментативного окисления L-аргинина (аргинин) в эквимолярном соотношении образуется побочный продукт реакции L-цитруллин (цитруллин). Поскольку других реакций, ответственных за образование этой аминокислоты в ЦНС не найдено [Wiesinger, 2001], тканевое и внутриклеточное образование цитруллина используется в биохимических и морфологических исследованиях в качестве показателя активности NO-синтазы и продукции NO [Garthwaite et al., 1989; Blum-Degen et al., 1999; Martinelli et al.,

2002]. В связи с этим очень привлекательным, но пока еще малоиспользуемым подходом для in vivo определения NO в межклеточном пространстве отдельных областей мозга свободно движущихся животных может быть микродиализный мониторинг цитруллина. Ограниченное использование этого метода для прижизненного исследования продукции N0 связано с недостаточной изученностью границ его применимости. В частности, мало исследованы нейрохимические механизмы, регулирующие внеклеточный уровень аминокислот, участвующих в метаболизме N0 (цитруллина и аргинина), а также зависимость этих показателей от стимуляции и блокады NO-синтазной активности. Нет сведений, что результаты, полученные с использованием микродиализного мониторинга цитруллина, совпадают с результатами, полученными при применении других методов определения продукции N0. Так, с использованием разных показателей продукции оксида азота установлено, что дофаминергическая активация стимулирует продукцию N0 в стриатуме [Раевский, 1997; Bashkatova et al., 1999; West et al., 2002]. Однако нет данных о том, меняется ли при этом уровень внеклеточного цитруллина в стриатуме и зависят ли эти изменения от локальной активности NO-синтазы и от блокады рецепторов дофамина. Изучение механизмов дофамин-NO-ергического взаимодействия в стриатуме с применением внеклеточного цитруллина как показателя продукции N0 важно не только в плане доказательства правомерности использования цитруллина, определяемого в микродиализных экспериментах в качестве маркера активности NO-синтазы, но и имеет самостоятельное научное значение, поскольку механизмы дофамин-NO-ергического взаимодействия в стриатуме изучены не достаточно. Вместе с тем дофаминергический вход стриатума является вторым по величине (после глутаматергического) афферентным входом этой структуры и оказывает большое влияние на ее функционирование. Морфологической основой дофамин-МО-ергического взаимодействия являются синаптические контакты окончаний дофаминергических нейронов не только с шипиковыми проекционными нейронами стриатума [Горбачевская, Чивилева, 1994; 1998], но и с NO-продуцирующими интернейронами, а также наличие рецепторов дофамина на их мембранах [Aoki, Pickel, 1988; Vuillet et al., 1989; Kawaguchi et al., 1995]. Однако в литературе ко времени выхода из печати результатов наших исследований [Савельев, 2005] не было данных, полученных в прижизненных экспериментах, о влиянии дофаминергической стимуляции и блокады стриатума на продукцию оксида азота в этой области мозга. Не был исследован селективный вклад различных подклассов рецепторов дофамина в стриатуме в этот процесс.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ В связи с вышеизложенным, основной целью работы стало обоснование использования внеклеточного цитруллина дорсального и вентрального стриатума, определяемого в микродиализных экспериментах, в качестве прижизненного показателя локальной активности NO-синтазы и продукции оксида азота в этих областях мозга, а также изучение с помощью этого подхода изменений активности NO-ергической системы вентрального стриатума (прилежащего ядра) в ходе выработки и реализации классического условного рефлекса с болевым подкреплением.

Для решения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние введений в дорсальный стриатум агониста рецепторов дофамина - апоморфина на внеклеточный уровень цитруллина в этой области мозга, а также исследовать зависимость этих изменений от активности NO-синтазы и от блокады Д] и Да рецепторов дофамина, осуществляемой путем введений в эту структуру SCH-23390 и раклопрайда - селективных блокаторов Д] и Дг рецепторов дофамина.

2. Исследовать влияние введений в прилежащее ядро субстрата NO-синтазы -аргинина и блокатора NO-синтазы - N-нитро-Ь-аргинина на уровень цитруллина в межклеточном пространстве этой структуры.

3. Исследовать динамику изменений уровня цитруллина и аргинина в межклеточном пространстве прилежащего ядра в ходе выработки, реализации и угашения классического условного рефлекса на звук с болевым подкреплением. 4. Изучить, как изменяется уровень внеклеточного цитруллина в прилежащем ядре в ходе выработки и реализации классического условного рефлекса на звук с болевым подкреплением при введениях в эту структуру селективного блокатора нейронной изоформы NO-синтазы - 7-нитроиндазола и неселективного блокатора NO-синтазы - N-нитро-Ь-аргинина.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Уровень цитруллина в межклеточном пространстве дорсального стриатума и прилежащего ядра, определяемый in vivo в микродиализных экспериментах, отражает активность NO-синтазы и может служить непрямым показателем локальной продукции N0.

2. Выработка и реализация классического условного рефлекса с болевым подкреплением сопровождается активацией NO-ергической системы прилежащего ядра преимущественно за счет активации нейронной изоформы NO-синтазы.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА Основные результаты, полученные в работе, являются приоритетными. Впервые показано, что уровень внеклеточного цитруллина в прилежащем ядре, определяемый в микродиализных экспериментах, может отражать продукцию N0 в этой области мозга. В частности, установлено, что внеклеточный уровень цитруллина возрастает при локальных введениях в эту структуру аргинина - субстрата NO-синтазы и снижается при локальной блокаде NO-синтазы N-нитро-Ь-аргинином, а эффекты аргинина полностью предотвращаются введениями N-нитро-Ь-аргинина. Получены ранее неизвестные данные о том, что локальные введения агониста рецепторов дофамина - апоморфина в дорсальный стриатум приводят к росту уровня внеклеточного цитруллина в этой области мозга и что эти изменения блокируются ингибитором NO-синтазы и антагонистом Да рецепторов дофамина. Впервые установлено, что в процессе выработки и реализации классического условного рефлекса с болевым подкреплением в прилежащем ядре происходит увеличение внеклеточного уровня двух аминокислот, участвующих в метаболизме N0 - цитруллина и аргинина. Впервые показано, что связанные с выработкой данного рефлекса изменения уровня цитруллина в прилежащем ядре предотвращаются локальными введениями неселективного блокатора NO-синтазы - N-нитро-Ь-аргинина и существенно снижаются при введениях селективного блокатора нейронной изоформы NO-синтазы - 7-нитроиндазола. Впервые установлено, что «условнорефлекторные» изменения уровня цитруллина в прилежащем ядре в ходе реализации классического условного рефлекса с болевым подкреплением полностью блокируются введениями в эту структуру как селективного блокатора нейронной изоформы NO-синтазы - 7-нитроиндазола, так и неселективного блокатора NO-синтазы - N-нитро-Ь-аргинина, причем такая блокада ухудшает реализацию изучаемого условного рефлекса. Данная работа является первым исследованием, в котором в условиях прижизненной регистрации обнаружены изменения показателей метаболизма N0 в ЦНС в ходе условнорефлекторного поведения.

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ Полученные в работе новые данные об NO-синтаза-зависимом увеличении уровня внеклеточного цитруллина в прилежащем ядре в ходе выработки и реализации классического условного рефлекса с болевым подкреплением важны в теоретическом плане, поскольку впервые показывают потенциальную роль NO-ергических нейронов этого подкоркового образования в процессах, связанных с функционированием системы эмоциональной памяти о негативных событиях. Полученные данные об ухудшении реализации классического условного рефлекса с болевым подкреплением при введении блокаторов NO-синтазы в прилежащее ядро вносят вклад в понимание механизмов контроля проявлений реакции страха, и могут иметь практическую ценность для разработки подходов медикаментозного воздействия на этот процесс. Данные о рецепторных механизмах дофамин-ЫО-ергического взаимодействия в стриатуме могут иметь практическое значение в силу широкого применения дофаминергических препаратов в медицинской практике и потенциальной нейротоксичности избытка N0.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Основные результаты работы были доложены на III Всероссийской конференции "Механизмы функционирования висцеральных систем" (Санкт-Петербург, 2003); XIX Съезде физиологического общества им. И.П.Павлова (Екатеринбург, 2004); Всероссийской конференции молодых исследователей "Физиология и медицина" (Санкт-Петербург, 2005); Международном симпозиуме "Механизмы адаптивного поведения" (Санкт-Петербург, 2005).

ПУБЛИКАЦИИ По теме диссертации опубликовано 11 научных работ: 3 статьи и 8 тезисов. Работа поддержана грантом РФФИ (Проект № 04-04-48252), грантом для студентов, аспирантов и молодых специалистов 2003г. Правительства Санкт-Петербурга (МОЗ-2.6К-115) и Научной программой Санкт-Петербургского научного центра 2005г.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов и обсуждения собственных наблюдений, выводов и библиографии. Диссертация изложена на 158 страницах печатного текста, иллюстрирована 26 рисунками и 2 таблицами. Указатель литературы включает 59 отечественных и 293 иностранных источника.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Савельев, Сергей Александрович

6. выводы

1. Введения в дорсальный стриатум методом диализной инфузии агониста рецепторов дофамина — апоморфина (ЮОмкМ) приводят к увеличению уровня внеклеточного цитруллина (со-продукта синтеза оксида азота) в этой области мозга, которое полностью предотвращается внутристриатными введениями ингибитора NO-синтазы - N-нитро-Ь-аргинина (1мМ) и блокатора Д2 рецепторов дофамина - раклопрайда (ЮмкМ), но не введениями блокатора Д| рецепторов дофамина - SCH-23390 (50мкМ). Эти данные свидетельствуют, что дофаминергическая стимуляция дорсального стриатума апоморфином приводит к активации NO-синтазы и, возможно, стимулирует продукцию оксида азота в этой области мозга с использованием Дг рецепторов дофамина.

2. Введения в прилежащее ядро субстрата NO-синтазы - аргинина (50мкМ) увеличивают, а введения блокатора этого фермента - N-нитро-Ь-аргинина (1мМ) снижают внеклеточный уровень цитруллина в данной области мозга, причем вызванный введениями аргинина рост уровня цитруллина полностью предотвращается введениями N-нитро-Ь-аргинина.

3. Выработка классического условного рефлекса с болевым подкреплением сопровождается ростом уровня внеклеточного цитруллина в прилежащем ядре, который воспроизводится «условнорефлекторно» в ходе реализации рефлекса. Условнорефлекторный подъем уровня цитруллина в прилежащем ядре снижается в ходе угашения условного рефлекса и вновь возникает при его восстановлении.

4. Увеличение уровня внеклеточного цитруллина в прилежащем ядре в ходе выработки классического условного рефлекса с болевым подкреплением полностью предотвращается введениями в прилежащее ядро неселективного ингибитора NO-синтазы - N-нитро-Ь-аргинина (0.5мМ) и существенно снижается при введениях селективного ингибитора нейронной изоформы NO-синтазы - 7-нитроиндазола (0.5мМ). Условнорефлекторные изменения уровня цитруллина в прилежащем ядре при реализации данного условного рефлекса полностью блокируются введениями в эту структуру обоих ингибиторов NO-синтазы, причем такая блокада ухудшает реализацию условного рефлекса.

5. Полученные данные позволяют предполагать, что в ходе выработки и реализации классического условного рефлекса с болевым подкреплением в прилежащем ядре происходит активация NO-синтазы и усиление продукции оксида азота преимущественно за счет активации нейронной изоформы этого фермента.

6. Полученные в работе результаты свидетельствуют, что уровень цитруллина в межклеточном пространстве дорсального стриатума и прилежащего ядра, определяемый в микродиализных экспериментах, зависит от активности NO-синтазы и может быть использован в качестве непрямого маркера продукции оксида азота в этих областях мозга.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Савельев, Сергей Александрович, Санкт-Петербург

1. Арушанян Э.Б., Отеллин В.А. Хвостатое ядро. Очерки по морфологии, физиологии и фармакологии. JL: Наука. 1976. -222с.

2. Ванин А.Ф. Оксид азота регулятор клеточного метаболизма // Соросовский образовательный журнал. 2001. Т.7. №11. С. 7-12.

3. Горбачевская А.И. Структурная основа взаимодействия в стриопаллидуме лимбической и моторной систем // Физиол. журн. им. И.М.Сеченова. 1994. Т.80. №4. С. 17-22.

4. Горбачевская А.И., Чивилева О.Г. Организация афферентных связей стриатума структурная основа их функциональной организации // Физиол. журн. им. И.М.Сеченова. 1994. Т.80. №1. С.88-94.

5. Горбачевская А.К, Чивилева О.Г. Пространственная организация афферентных проекций прилежащего ядра мозга собаки // Морфология. 1998. Т.114. №4. С.22-23.

6. Горбачевская А.И., Чивилева О.Г. Морфологический анализ путей проведения информации в базальных ганглиях млекопитающих // Успехи физиологических наук. 2003. Т.34. №2. С.46-63.

7. Леонтович ТА., Михальченко Н.А. Структура и связи базальных ганглиев. Стриатум. // Успехи физиологических наук. 1997. Т.28. №1. С.3-26.

8. Саульская Н.Б., Якимовский А.Ф., Карпова И.В. Влияние микроинъекций фенамина в прилежащее ядро и бикукуллина в черную субстанцию на синаптический выброс дофамина в стриатуме крыс // Нейрохимия. 1989. Т.8. №3. С.390-394.

9. Сосунов А.А. Оксид азота как межклеточный посредник // Соровский образовательный журнал. 2000. Т.6. №12. С.27-34. (источник -www.issep.rssi.ru).

10. Суворов Н.Ф. Базальные ганглии: структура и функции // Российск. Физиол. Журн. им. И.М.Сеченова. 1997. Т.83. №1-2. С.4-10.37 . Суворов Н.Ф. Стриарная система и поведение. JL: Наука, 1980. - 280с.

11. Суворов Н.Ф. Роль стрио-таламо-кортикальной системы в условнорефлекторной деятельности // Стриопаллидарная система. J1.: Наука. 1973. С.3-13.

12. Суворов Н.Ф., Королев Е.Б., Дрягин Ю.М., Михайлов А.В. Анализ нейрональной активности корково-подкорковых структур условного рефлекса // Журн. высш. нервн. деят. 1978. Т.28. №3. С.557-565.

13. A3 .Толкунов Б.Ф. Стриатум и сенсорная специализация нейронной сети. JI., 1978.-175с.

14. Шаляпина В.Г., Рыбникова Е.А., Ракицкая В.В., Туркина Е.В. Дофаминергические механизмы неостриатума в регуляции кортиколиберином приспособительного поведения // Российск. физиол. журн. им. И.М.Сеченова. 1998. Т.84. №10. С. 1146-1151.

15. Шаповалова КБ. Холинергический механизм регуляции неостриатумом условнорефлекторной перестройки позы у собак // Физиол. журн. СССР им. И.М.Сеченова. 1988. Т.74. №4. С.478-489.

16. Carlberg M. Assay of neuronal nitric oxide synthase by HPLC determination of citrulline. J. Neurosci. Meth. 1994. 52: 165-167.

17. Carpenter M.B. Interconnections between the corpus striatum and brain stem nuclei. The basal ganglia: structure and functions, advances. Behav. Biol. N.Y.: Plenum Press. 1984. 27: 1-68.

18. Cauli В., TongX.-K., Rancillac A., Serluca N., Lambolez В., Rossier J., Hamel E. Cortical GABA interneurons in neurovascular coupling: relays for subcortical vasoactive pathways // The Journal ofNeuroscience. 2004. 24 (41): 8940-8949.

19. Centonze D., Gubellini P., Bernardi G., Calabresi P. Permissive role of interneurons in corticostriatal plasticity // Brain Res. Rev. 1999. 31: 1-5.

20. Cepeda C., Colwell C.S., Itri J.N., Chandler S.H., Levine M.S. Dopaminergic modulation of NMDA-induced whole cell currents in neostriatal neurons in slices: contribution of calcium conductances //J. Neurophysiol. 1998. 79: 82-94.

21. Christie M.J., Summers R.J., Stephenson J.A., Cook C.J., Beart P.M. Excitatory amino acid projections to the nucleus accumbens septi in the rat. A retrograde transport study utilizing D3H. aspartate and [3H] GABA // Neuroscince. 1987. 22(2): 425-439.

22. Chronister R.B., Sikes R.W., Trow T.W., De France J.F. The organization of nucleus accumbens// The neurobiology of the nucleus accumbens/ Eds. R.B. Chronister, J.F. de France. Brunswick: Haer Institute: 97-146, 1981.

23. Churchill L., Kalivas P.W. A topographically organized gamma-aminobutyric acid projection from the ventral pallidum to the nucleus accumbens in the rat // J. Сотр. Neurol. 1994. 345 (4): 579-595.

24. Cobb B.L., Ryan K.L., Frei M.R., Guelgomez V., Mickley G.A. Chronic administration of L-NAME in drinking water alters working memory in rats // Brain. Res. Bull. 1995. 38: 203-207.

25. Consolo S., Caltavuturo С., Colli E., Recchia M., Di Chiara G. Different sensitivity of in vivo acetylcholine transmission to Dl receptor stimulation in shell and core of nucleus accumbens //Neuroscience. 1999. 89: 1209-1217.

26. Contant C., Umbriaco D., Garcia S., Watkins K.C., Descarries L. Ultrastructural characterization of the acetylcholine innervation in adult rat neostriatum //Neuroscience. 1996. 71(4): 937-947.

27. Cossenza M., de Carvalho R.P. L-arginine uptake and release by cultured avain retinal cells I I J. Neurosci. 2000. 74(5): 1885-1894.

28. Cowan R.L., Wilson C.J., Emson P.C., Heizman C.W. Parvalbumin-containing GABA-ergic interneurones in the rat neostriatum // J. Compar. Neurol. 1990. 302(2): 197-205.

29. Creese /., Sibley D.R., Leff S., Hamblin M. Dopamine receptors: subtypes, localization and regulation // Fed. Proc. 1981.40 (2): 147-152.

30. Crosby E.L., Humphrey Т., Lauer E. Correlative anatomy of the nervous system. Ed. 2d. New York. 1962. 73 lp.

31. Dawson T.M., Snyder S.H. Gases as biological messengers: nitric oxide and carbon monoxide in the brain I IJ Neurosci. 1994. 14(9): 5147-5159.120 .Dawson T.M., Dawson V.L. Nitric oxide actions and pathological roles // Neuroscientist. 1994. 1:9-20.

32. Delle Donne K.T., Sesack S.R., Pickel V.M. Ultrastructural immunocytochemical localization of neurotensin and the D2 receptor in the rat nucleus accumbens//J. Сотр. Neurol. 1996. 371 (4): 552-566.

33. Dinerman J.L., Dawson T.M., Schell M.J., Snowman A., Snyder S.H. Endothelial nitric oxide synthase localized to hippocampal pyramidal cells: implications for synaptic plasticity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994. 91: 42144218.

34. Domesick V.B. Further observation on the anatomy of nucleus accumbens and caudatoputamen in the rat. The neurobiology of the nucleus accumbens// Eds. R.B. Chronister, J.F.De France. Haer Institute, Brunswick: 7-39,1981.

35. Dumartin В., Caille I., Gonon F., Block B. Internalization of D1 dopamine receptor in striatal neurons in vivo as evidence of activation by dopamine agonists//J. Neuroscience. 1998. 18(5): 1650-1661.

36. Eliasson M.J., Huang Z, Ferrante R.J., Sasamata M., Molliver M.E., Snyder S.H., Moskowitz M.A. Neuronal nitric oxide synthase activation and peroxynitrite formation in ischemic stroke linked to neural damage // J. Neurosci. 1999. 19(14): 5910-5918.

37. Fonnum F., Walaas I. Localizations neurotransmitters in nucleus accumbens. The neurobiology of the nucleus accumbens. Eds R.B.Chronister, J.F.De France. Haer Institute, Brunswick. 1981. P.259-272.

38. French S.J., Ritson G.P., Hidaka S., Totterdell S. Nucleus accumbens nitric oxide immunoreactive interneurons receive nitric oxide and ventral subicular afferents in rats //Neuroscience. 2005. 135(1): 121-131.

39. Gaffan I., Harrison M. Amygdalectomy and disconnection in visual learning for auditory secondary reinforcement by monkeys // J. Neuroscience. 1987. 7: 2285-2292.

40. Garthwaite J., Garthwaite G., Palmer R.M., Moncada S. NMDA receptor activation induces nitric oxide synthesis from arginine in rat brain slices // Eur. J Pharmacol. 1989. 172 (4-5): 413-416.

41. Garthwaite J., Boulton C.L. Nitric oxide signaling in the central nervous sustem // Annu. Revs. Physiol. 1995. 57: 683-706.

42. Gerfen C.R. The neostriatal mosaic. I. Compartmental organization of projections from the striatum to the SN in the rat // J. Сотр. Neurol. 1985. 236(4): 154-176.

43. Gerfen C.R. The neostriatal mosaic: organization of the basal ganglia // Ann. Rev. Neurosci. 1992. 15: 285.

44. Gomes M.Z., Del Bel E.A. Effects of electrolytic and 6-hydroxydopamine lesions of rat nigrostriatal pathway on nitric oxide synthase and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate diaphorase // Brain Res. 2003. 62(2): 107-115.

45. Goren M.Z., Aricioglu-Kartal F., Yurdun Т., Uzbay L.T. Investigation of extracellular L-citrulline concentration in the striatum during alcohol withdrawal in rats. Neurochem. Res. 2001.26(12): 1327-1333.

46. Gracy K.N., Pickel V.M. Ultrastructural immunocytochemical localization of the N-methyl-D-aspartate receptor and tyrosine hydroxylase in the shell of the rat nucleus accumbens//Brain Research. 1996. 739(1-2): 169-184.

47. Gracy K.N., Pickel V.M. Ultrastructural localization and comparative distribution of nitric oxide synthase and N-methyl-D-aspartate receptors in the shell of the rat nucleus accumbens // Brain Res. 1997. 747: 259-272.

48. Grima G., Cuenod M., Pfeiffer S., Mayer В., Do K.Q. Arginine avalability controls the N-methyl-D-aspartate-induced nitric oxide synthesis: involvement of a glial-neuronal transfer // J. Neurochem. 1998. 71(5): 2139-2144.

49. Groves P.M. A theory of the functional organization of the neostriatum and the neostriatal control of voluntary movement // Brain Res. Rev. 1983. 5(4): 109-132.

50. Guevara-Guzman R., Emson P.C., Kendrick K.M. Modulation of in vivo striatal transmitter release by nitric oxide and cyclic-GMP // J Neurochem. 1994. 62:807-810.

51. Heimer L., Switzer R.D., Van Hoesen G.W. Ventral striatum and ventral pallidum. Components of motor system? // Trends Neurosci. 1982. 5(1): 83-87.

52. Heimer L., Zahm D.S., Churchill L., Kalivas P.W., Wohltmann C. Specificity in the projection patterns of accumbal core and shell in the rat 11 Neurosci. 1991. 41(1): 89-125.

53. Непека М. Т., Schmidlin A., Wiesinger Н. Induction of argininosuccinate synthetase in rat brain glial cells after striatal microinjection of immunostimulants // J Cereb Blood Flow Metab. 1999. 19(8): 898-907.

54. Hong J.C., Yoshikawa K, Kanamatsu Т., Sabol S.L. Modulation of striatal enkephalinergic neurons by antipsychotic drugs // Feder. Proc. 1985. 44: 2535.

55. Hong J.Т., Kim H.C., Kim H.S., Lee Y.M., Oh KW. The role of nitric oxide on glutaminergic modulation of dopaminergic activation // Pharmacol. Res. 2005. 52 (4): 298-301.

56. Hull E.M., Lorrain D.S. The nitric oxide precursor, L-arginine, increases dopamine and serotonin release in medial preoptic area of male rats // Proc. Int. Symp. «Nitric oxide». Washington DC. 1993. P. 1.4.

57. McKenzie, J.S.Feger (Eds.), Basal ganglia IV (pp. 109-114). New York: Plenum.1994.

58. Kawaguchi Y., Wilson Ch.J., Augood S.J., Emson P.C. Striatal interneurones: chemical, physiological and morphological characterization. Trends Neurosci.1995. 18:527-535.

59. Kayalioglu G., Govsa F., Maisky V.A., Hariri N., Erdem В., Senyilmaz Y. Histochemical and fluorescent labeling of neurons projecting to nucleus accumbens: the relation to pain processing // Tr. J. of Medical Sciences. 1998. 28:219-229.

60. Kehr J., Ungerstedt U. Fast HPLS estimation of GAB A in microdialysis perfusates: effect nipecotic acid and 3-mercaptopropionic acids // J. Neurochem. 1988.51: 1308-1310.

61. Kehr J., Fuxe K, Ungerstedt U., Svensson T. (Eds) Monitoring molecules in neuroscience. Proceedings of the 10th international conference on in vivo methods. Stockholm: Karolinska Institutet. 2003. 507p.

62. Kelley A.E. Neural integrative activities of nucleus accumbens subregions in relation to learning and motivation // Psychobiology. 1999. 27 (2): 198-213.

63. Kelley A.E., Domesick V.B., Nauta W.J.H. The amygdalostriatal projection in the rat and anatomical study by anterograde and retrograde tracing methods // Neurosci. 1982. 7(3): 615-630.

64. Kitto K.F., Haley J.E., Wilcox G.L. Involvement of nitric oxide in spinally mediated hyperalgesia in the mouse//Neurosci Lett. 1992. 148(1-2): 1-5.

65. Knowles R.G., Moncada S. Nitric oxide synthases in mammals // J.Biochem. 1994.298:249-258.

66. Kopf S.R., Baratti C.M. Enhancement of the post-training cholinergic tone antagonizes the impairment of retention induced by a nitric oxide synthase inhibitor in mice //Neurobiol Learn Mem. 1996. 65(3): 207-212.

67. Koylu E.O., Kanit L., Taskiran D., Dagci Т., Balkan В., Pogun S. Effects of nitric oxide synthase inhibition on spatial discrimination learning and central DA2 and mACh receptors // Pharmacol Biochem Behav. 2005. 81(1): 32-40.

68. Krukoff T.L., Khalili P. Stress-induced activation of nitric oxide-producing neurons in the rat brain // J Comp Neurol. 1997. 377(4): 509-519.

69. La Gamma E.F., Stracker E., Lenn N.J., DeCristofaro J.D., Weisinger G.

70. Lee S.C., Yamamoto Т., Ueki S. Characteristics of aggressive behavior induced by nucleus accumbens lesions in rat // Neural. Biol. 1983. 37(2): 237-245.

71. Lee F.J., Xue S., Pei L., Vukusic В., Chery N. Wang Y., Wang Y.T., Niznik H.B., Yu X.M., Liu F. Dual regulation of NMDA receptor functions by direct protein-protein interactions with the dopamine D1 receptor // Cell: 2002. 111 (2): 219-230.

72. Lu X.-Y., Ghasemzadeh M.B., Kalivas P.W. Expression of D1 receptor, D2 receptor, substance P and enkephalin messenger RNAs in the neurons projecting from the nucleus accumbens // Neuroscience. 1998. 82(3): 767-780.

73. Martin P.D., Ono T. Effects of reward anticipation, reward presentation, and spatial parameters on the firing of single neurons recorded in the subiculum and nucleus accumbens of freely moving rats // Behav. Brain Res. 2000. 116(1): 2338.

74. Martin L.J., Blacfcstone C.D., Levey A.I., Huganir R.L., Price D.L. AMPA glutamate receptor subunit are differentially distributed in rat brain // Neuroscience. 1993. 53 (2): 327-358.

75. Martinelli G.P.T., Friedrich V.L., Holstein G.R. L-citrulline immunostaining identifies nitric oxide production sites within neurons // Neuroscience. 2002. 114(1): 111-122.

76. McFarland К., Davidge S.B., Lapish C.C., Kalivas P.W. Limbic and motor circuitry underlying footshock-induced reinstatement of cocaine-seeking behavior// J Neurosci. 2004. 24(7): 1551-1560.

77. McGeorge A.J., Faull R.L.M. The organization of the projection from the cerebral cortex to the striatum in the rat // Neuroscience. 1989. 29(3): 503-537.

78. Mena-Segovia J., Bolam J.P., Magill P.J. Pedunculopontine nucleus and basal ganglia: distant relatives or part of the same family? // TRENDS in Neurosciences. 2004. 27(10): 586-587.

79. Miki N., Kawabe Y, Kuriyama K. Activation of cerebral guanylate cyclase by nitric oxide // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1977. 75: 851-856.

80. Milad M., Quirk G.L. Neurons in medial prefrontal cortex signal memory for fear extinction //Nature. 2002. 420: 70-74.

81. Mogenson G.J., Jones D.L., Yim C.Y. From motivation to action: functional interface between the limbic system and the motor system // Prog. Psychobiol. 1980. 14: 60-97.

82. Moratallo R., Xu M., Tonegawa S., Graybiel A.M. Cellular responses to psychomotor stimulant and neuroleptic drugs are abnormal in mice lacking the D1 dopamine receptor// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. 93: 14928-14933.

83. Nauta W.J.H., Smith G.P., Faull R.L.M., Domesick V.B. Efferent connections of nigral afferents of the nucleus accumbens septi in the rat // Neuroscience. 1978. 3(4/5): 385-401.

84. Nedergaard Maiken, Ransom Bruce, Goldman Steven A. New roles for astrocytes: redefining the functional architecture of the brain // TRENDS in Neurosciences. 2003. 26(10): 523-530.

85. Ohta K., Shimazu K., Komatsumoto S., Araki TV., Shibata M., Fukuuchi Y. Modification of striatal arginine and citrulline methabolism by nitric synthase inhibitor //Neurochemistiy. 1994. 5: 766-768.

86. Prast H., Philippu A. Nitric oxide releases acetylcholine in the basal forebrain // Eur. J. Pharmacol. 1992. 216 (1): 139-140.

87. Русоск C.J., Phillipson O.T. A neuroanatomical and neuropharmacology analisis of basal ganglia output// Handbook of psychopharmacol. New York, London. 1984. 18: 191-278.

88. Ragsdale C., Graybiel A. Compartmental organization of the thalamostriatal connections in the cat//J. Сотр. Neurol. 1991.311: 134.

89. Redgrave P., Prescott T.J., Gurney K. The basal ganglia: a vertebrate solution to the selection problem? //Neurosci. 1999. 89(4): 1009-1023.

90. Reiter R.J. Melatonin: lowering the high price of free radicals // News Physiol Sci. 2000. 15:246-250282 . Rengasamy A., Johns R.A. Regulation of nitric oxide synthase by nitric oxide // Mol. Pharmacol. 1993. 44: 124-128.

91. Reynolds S.M., Berridge K.C. Glutamate motivational ensembles in nucleus accumbens: rostrocaudal shell gradients of fear and feeding // Eur. J. Neurosci. 2003. 17:2187-2200.

92. Robbins T.W., Everitt B.J. Functions of dopamine in the dorsal and ventral striatum // Seminars in the Neurosciences. 1992. 4: 119-127.

93. Roberts G.W., Woodhams P.L., Polak T.M., Crow T.T. Distribution of neuropeptides in the limbic system of the rat: the amygdaloid complex // Neuroscience. 1982. 7(1): 99-131.

94. Rueda J., Prieto J., Juis J., Angulo A. A Golgi study on the nucleus accumbens septi of the rat//J. Hirnforsch. 1986. 27(5): 515-520.

95. Russchen F.T., Price I.L. Amygdalostriatal projections in the rat topographical organization and fiber morphology showo using the lectin PHA-L as an anterograde tracer // Neuroscience Lett. 1984.47(1): 15-22.

96. Sahach V.F., Baziliuk O.V., Oleshko M.M., Kotsiuruba O.V., Bukhanevych O.M., Appenzeller O. The nitric oxide system in a chronic deficiency of mesostriatal dopamine: the action of nitroglycerin. Fiziolohichnyi Zhurnal. 2000. 46: 55-63.

97. Salamone J.D. Complex motor and sensorimotor functions of striatal and accumbens dopamine: involvement in instrumental behavior processes // Psychopharmacology (Berl.). 1992. 107(2-3): 160-174.

98. Saulskaya N.B., Mikhailova M.O. Feeding-induced decrease in extracellular glutamate level in the rat nucleus accumbens: dependence on glutamate uptake // Neurosci. 2002.112(4): 791-801.

99. Saulskaya N.B., Soloviova N.A. Tetrodotoxtin-dependent glutamate release in the rat nucleus accumbens during concurrent presentation of appetitive and conditioned aversive stimuli //J Neurosci. Meth. 2004. 140(1-2): 15-21.

100. Schafe G.E., Rodrigues S.M., Schoute A.M., LeDoux J.E. A role for neuronal nitric oxide synthase (nNOS) in auditory pavlovian fear conditioning // Program №85.7. Abstract Viewer/Itinerary Planner. Washington, DC: Society for Neuroscience. 2002.

101. Schultz W., Dayan P., Montague P.R. A neural substrate of prediction and reward//Science. 1997. 275: 1593-1599.

102. Schuman E.M., Madison D.V. A requirement for the intercellular messenger nitric oxide in long-term potentiation // Science. 1991. 254(5037): 1503-1506.

103. Steinhauser C., Galo V. News on glutamate receptors in glial cells // Trends Neurosci. 1996.19:339-345.314 . Strange A. Dopamine receptors: studies on their structure and function // Adv. Drug Res. 1996. 28:315.

104. IStrasser A., McCarron R.M., Ishii H., Stanimirovic D., Spatz M. L-arginine induces dopamine release from the striatum in vivo // NeuroReport 1994. 5: 2298-2300.

105. Sudha S., Pradhan N. Stress-induced changes in regional monoamine metabolism and behavior in rats//Physiol.&Behav. 1995. 57:1061-1066.

106. Surmeier D.J., Reiner A., Levine M.S., Ariano M.A. Are neostriatal dopamine receptors co-localized? // TINS/ 1993. 16 (8): 299-305.

107. Swanson L.W. Cerebral hemisphere regulation of motivated behavior // Brain Research. 2000. 886: 113-164.

108. Vega-Agapito Victoria, Almeida Angeles, Hatzoglou Maria, Bolanos Juan P. Peroxynitrite stimulates L-arginine transport system y+ in glial cells // J.Biol.Chem. 2002. 277(33): 29753-29759.

109. Vincent S.R. Nitric oxide: a radical neurotransmitter in the central nervous system//Prog. Neurobiol. 1994. 42: 129-160.

110. West A.R., Galloway M.P., Grace A.A. Regulation of striatal dopamine neurotransmission by nitric oxide: effector pathways and signaling mechanisms // Synapse. 2002.44: 227-245.

111. Wiesinger H. Arginine metabolism and synthesis of nitric oxide in the nervous system // Prog. Neurobiol. 2001. 64: 365-391.

112. Wilson W.G., Soltysik S.S. Pharmacological manipulations of the nucleus accumbens effects on classically conditioned responses and locomotor activity in the cat//Acta Neurobiol. Exper. 1985.45(3-4): 91-105.