Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменение интенсивности перекисного окисления липидов клеток растений при микрогравитации и ее моделировании

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Изменение интенсивности перекисного окисления липидов клеток растений при микрогравитации и ее моделировании"

ИНСТИТУТ цитологии АКАДЕМИИ НАУК СССР

На правах рукописи

ЖАДЬКО Сергей Иванович

ИЗМЕНЕНИЕ ИНТЕНСИВНОСТИ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ ЛЕТОК РАСТЕНИЙ ПРИ МИКРОГРАВИТАЦИИ И ЕЕ МОДЕЛИРОВАНИИ

03.00.25 — клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЛЕНИНГРАД 1991

Работа выполнена в отделе цитологии Института ботаники им. Н. Г. Холодного АН УССР

Научный руководитель — доктор медицинских наук,

профессор В. А. Барабой

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор А. Д. Браун, доктор биологических наук В. А. Веселовский

Ведущее учреждение — Второй московский ордена Ленина

государственный мед. ин-т им. Н. И. Пирогова

Защита диссертации состоится «¿¿/С» СгиЗ> 1991 г. в

¡7Р] 1

« \о » часов на заседании Специализированного совета Д.002.73.01 Института цитологии АН СССР по адресу: 194064, Ленинград, Тихорецкий проспект, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии АН СССР. ♦

Автореферат разослан "К^МЛ-У 1991 г.

Ученый секретарь _ ,

Специализированного совета (РГ /

кандидат биологических наук с Л. Н. Писарева

) — Институт цитологии АН СССР

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Дктуальность теш. С развитием космонавтики и освоением космического пространства.ведутся обширные исследования особенностей роста я развития растений в условиях космического полета, в частности, с целью использования растительных объектов в космических биотехнологиях и системах жизнеобеспечения /Дубинин, 1978; Газенко, Парфенов, 1982; Сытник и др., 1984; Halatead, Dutcher, 1987/.,,

Существенное влияние на растения, при космическом полете оказывает невесомость, или микрогравитадая, обусловливающая угнетение их роста и развития, а в некоторых случаях даже гибель, Чувствительность к микрогравитации возрастает с усложнением организации живых систем /¡Меркис и-др., 1984; Kriko-rian, 1984} Таирбеков, 1987; ; Кбрдюм и др.J'1989/. : -

По современным представлениям важное значение в механизме действия экстремальных агентов' пркнадлежит активации не- ' ферментативного перекисного окисления лшидов /П0Л/. Основным субстратом пероксидации являются.ненасыщенные жирные кислоты фосфолипидов мембран /Владимиров. Арчаков, 1972; Тарусов, Ве-селовский, 1978; Еурлакова и др.-," 1975; Clark, 1986; . : Бара-бой, 1989/.

В норме уровень ПОЛ является очень , низким. Это достигается за счет антиокислитэльной системы клеток и механизмов, снижающих парциальное давлений кислорода. При длительных экстремальных воздействиях, вызывающих индукцию ПОЛ,.наблюдается усиленный расход антиоксидантов /АО/ в реакциях обрыва цепей пероксидации, и резервная мощность АО-систем снижается. Возможна ситуация, когда уровень АО-защитной системы может оказаться недостаточным дам полной компенсации нарастающего ПОЛ. В результате процесс ПОЛ выходит из-под контроля АО-систем, что ведет к окислительной деструкции мембран и нарушению их функций /Владимиров, Арчаков, 1972; Dupont, 1984/. Мобилизация дополнительных АО-механизмов может вновь нормализовать равновесие и тогда ответ живой системы приобретает колебательный характер. Для его анализа, особенно на ранних стадиях, удобно использовать метод регистрации спонтанной хеми-

люминесценции /СХЛ/. - Высокая.чувствительность этого приема была показана ранее /Тарусов, Веселовский, 1978; Барабой, 1989/. •. • ':'./"..■

В литературе имеется ряд данных, указывающих на активацию ПСШ у растений при.изменении силы, тяжести Aeather et al., 1972/, однако систематические исследования отсутствуют.

Па.тгь и аятгачи исследования. Целью данной работы явилось" изучение кинетики ПОЛ клеток растений .различного уровня организации, отличающихся по устойчивости к изменению силн тяжести, под влиянием клиностатирования /моделирования в земных условиях действия микрогравитации/ и непосредственно микрогравитации в космическом полете. "

При этом были поставлены следующие задачи: ч

1. Изучить особенности ранних изменений интенсивности CXI, ПОЛ и антиокислительной активности /АОА/ у клеток хлореллы, культуры ткани гашюпаппуса и корней гороха при краткосрочном клиностатирования /до 3 суток/.

2. Исследовать характер ранних изменений пероксидащш в апекальных клетках, плазмалемме, микросомах и митоховдриях корней.проростков гороха, "... : i

3. Проанализировать изменения,интенсивности ПОЛ и АОА у исследуемых растений при длительном клиностатировании /3-24 суток/. - ■.■'•■"''Г.'

4. Исследовать изменения интенсивности ПО! у растений при микрогравитации в космическом налете. .'■";.

Научная новизна работы. Впервые изучены ранние /5 мин -72 час/ и последующие изменения интенсивности ПОЛ й АОА у . клеток растений различного уровня организации при клиностатировании я микрогравитации. Установлено, что у клеток хлореллы, культуры ткани гаплопаггпуса, корней гороха и пшеницы наблюдаются качественно аналогичные изменения интенсивности ПОЛ во времени: первоначально она снижается, затем более или менее длительно стабилизируется на пониженном уровне, после чего ПОЛ возрастает и становится выше исходного уровня. Аналогичная кинетика, с ранним снижением интенсивности перокси-дации, выявлена в апекальных клетках, плазмалемме, микрооо-

мах и митохондриях корней гороха.

Наиболее ранняя и высокоамшштудная ответная реакция характерна для клеток апексов и митохондрий корней гороха. Экспрессность а амплитуда изменений законшерно возрастают с■повышением уровня организации растений и формированием гравичувствительного аппарата у.проростков.

7 Выделены три фазы миярогравитационного стресса: фаза мобилизации АО-резервов со снижением пероксидации; фаза относительной стабилизации равновесия.ПОЛs^AOA и фаза вторичной индукции ПОЛ. . . . " '

- Воздействие комплекса факторов космического полета, ведущим из.которых является микрогравитация, индуцирует /с учетом особенностей космического эксперимента/ аналогичную кинетику изменений интенсивности ПОЛ. Однак'о амплитуда изменений больше, а смена фаз происходила быстрее.

. Практическое значение'работы. Полученные данные, характеризующие роль ПОЛ и АОА в реакции клеток растений на микро-" гравитацшо.могут использоваться при.разработке космических клеточных биотехнологий и приемов выращивания автотрофяого звена библогических систем жизнеобеспечения на космических летательных аппаратах. Данные с'видовой специфичности, экс-• прессности и амплитуде изменений интенсивности ПОЛ у растений при клиностатироваюш могут слулать тестовыми параметрами при определении реактивности растений к гравивоздействи- , ям, особенно в экспресс-методиках с регистрацией интенсивности хемилюминеецещщи. Разработааную методику с использованием оригинального детекторного блока-приставки к хемшго- . глннометру можно успешно применять для определения наиболее ранних изменений интенсивности СМ при разнообразных воздействиях в различных областях цитоэяологических исследо-- вапий. . ,

Основные положения диссертант. выносимые на запяту. I. Кинетика интенсивности ПОЛ у клеток растений различного уровня организация при клиностатироваяяи включает первоначальное /5-180 глин/ снижение с последующей стабилизацией на пониженном уровне, что является следствием повышения АОА

растений в ответ на изменение вектора силы тяжести. Наиболее раннее и внсокоамплитудное снижение пероксидации характерно для клеток апексов и митохондрий корней гороха.

2. .При продолжающемся клиностатировании после некоторого периода стабилизации развивается значительная индукция ПОЛ

с превышением контролей; АОА изменяется противоположно. Экс-прессность и амплитуда изменений закономерно возрастают с повышением уровня организации растений.

3. В динамике изменений ПОЛ и АОА у исследуемых растительных объектов в процессе клиностатирования выделяются 3 фазы: фаза мобилизации АО-резервов со снижением пероксидации; фа-,за относительной стабилизации равновесия nOJlstAOA и фаза вторичной индукции ПОЛ.

4. В условиях микрогравитации /космический полет/ у растений прослеживаются аналогичные закономерности изменений интенсивности ПОЛ. '

Апробация работы.Основные положения диссертационной работы были представлены и доложены на Всесоюзном симпозиуме "Биохемилшинесценция" /Ивано-Франковск, 1981/, на I Всесоюзном биофизическом съезде /Москва, 1982/, на Всесоюзном симпозиуме "Реакции клеток на внешние воздействия" /Киев, 1982/, на Всесоюзном совещании "Биология клетки в культуре" /Ленинград, 1983/, на Конференции СМУиС "Актуальные проблемы современной ботаники" /Киев, Ин-т ботаники, 1985/, на Всесоюзном сишозиуме "Биохемилюминесценция в медицине и ; сельском хозяйстве" /Ташкент, 1986/,. на У1 Всесоюзном симпозиуме "Ультраструктура растений" /Чернигов, 1988/, на 27; Сессии Комитета Косшческих Исследований /COSPAR //Финляндия, 1988/, на 40 Конгрессе Международной Астронавтической Федерации /1АР //Малага - Торемодинос, Испания, 1989/, на 28 Сессии cospar /Гаага, Нидерланды, 1990/, на III Всесоюзном сишозиуме "Клеточные мехашзш адаптации" /Чернигов, 1991/. Материалы работы в 1987 г. экспонировались на ВДНХ СССР /Свидетельство участника ВДНХ СССР й 22132/.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано М работ в отечественных и зарубежных изданиях.

Диссертация изложена на 119 страницах-машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения,- выводов-и,списка цитированной литературы из 197 наименований'/103 отечественных и 94 иностранных работ/. Текст сопровождается 25 рисунками и 2 таблицами. .'•

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ '

В качестве объектов исследования, использовали одноклеточную зеленую водоросль хлореллу / Chlorella vulgaris Beij er, автотрофный штамм ;ЛАРГ-1/, культуру ткани гаплопалпуса /На-plopappus gracilla (Butt) A.Grey /, проростки гороха /Pleura sativum L. ,■ -\ . . сорт Уладовский/ И пшеницы /Iriticum aestivum £./. У гороха и пшенида. исследовали корни, их . апексы '/длиной 3 ш/, плазмалёмму» . микрос<к1ы й штохондрии. - - " Хлореллу 'и культуру ткани'выращивали на твердых /2 п 1% arapá соответствешю/ питательных средах /Снтнзк и др., 1984/ в пробирках .¡диаметром 27'Ш'И ¡высотой 100' мм с 15 :лл -среды. Семена гороха проращивали в трубочках из влажной -фильтровальной бумаги в.пробирках, зеркевки пшеницы Ц на -влажной фильтровальной бушге в;'Чашках Петри. В эксперимент брали, хлореллу и культуру.¿ткани на б"или 9 сутки после, пересадки-на свежуй питательную среду, проростки гороха и пшеницы I-, 2- или 4-суточше/от момента замачивания/. Растения выращивали в темноте при температуре 20 или 24°С.

Плазмалемму, микросомы и митохондрии выделяли по методикам /Полулях, 1988; ВоЙников, 1980/.

Исследуемые объекты в лабораторных экспериментах подвергали воздействию медленного горизонтального клиностатирова-ния со скоростью 2 об/мин в течение 5, 10, 15 и 30 мин, I, 3, 6, 12 и 24 час, 3, 5, 7, 9, 12, 14, 21 и 24 суток. Эксперименты начинали в одно и то же время суток - в 10 час 00 мин. ■

Космические эксперименты проводили на биоспутниках "Космос. 1887", "Бион 9", орбитальных станциях "Мир" я "Салют" продолжительность» 2, 9, 13, 14, 28 суток. В этих экспериментах исследуемые. растения помещали в' специальные кентей-

нэрн и доставляли к месту старта космического корабля. После заданного режима полета, по приземлении, растения помещали в жидкий азот или на холод /2-3°С/ и доставляли в лабораторию.,

Интенсивность СХЛ измеряли на хемилюминометре ХМХЦ-01 в импульсах-за I с. В тех случаях, когда не удавалось зарегистрировать СХЛ, для усиления свечения применяли хемилюми-несцентный зонд люминал и измеряли люминалзавиащую хемилю-шнесценцшо /ЛЗХЛ/ /ТарусоЕ, Веселовский, 1978; Мамедов, 1982/. Ранние изменения СХЛ корней интактных проростков го- ' роха измеряли при помощи сконструированного наш детекторного блока-приставки к хемилюминометру /рис.1,А/, что значительно повысило надежность и точность измерений.' Блок-приставка состоит из светонепроницаемой камеры /I/ с ФЗУ /6/ и выносной кюветы /2/, имеющих соответственно шторки Ш-1 /4/ и Ш-2 /3/ на светооптяческих проемах окон. Проростки помещали в выносную кювету /2/ с фиксированным, расположением .. корней в проеме . окна /рис.1,Б,В/. СХЛ измеряли по следующей схеме: помещение проростков:в выносную кговету /2/, измерение свечения до воздействия, помещение Выносной, ответы /2/ в кли-ностат, после заданного режима BoáfleftcTBffii кювету переносили обратно в блок-приставку и измеряли СХЛ. Величину изменения интенсивности СХЛ выражали в % ио формуле I=It/I0, где 10 -СХЛ до клиностатированвд, -после.■/.'..

Содержание продуктов ПОЛ — ТЕК—активных продуктов /ТБКАД/ определяли посредством реакции, с 2-тиобарбитуровой кислотой: у интактных растений - фотометрически /Мерзляк я др.,1978/; в мембранах - флуориметрически /более чувствительная, мет о- " дика/ /Мерзляк и др., 1979/. Содержание АО определяли по Гле-винду. Количество белка - по Бредфорд / 'Bradford, 1976/. ,

Повторность экспериментов 3-7-кратная. Полученные данные обрабатывали статистически /Длохинский, 1970/.

íO_

1-V

к хлмщ-ог

Рис. I. Детекторный блок-приставка /А/ p¡ выноенач кювета /Б,В/, вид спереди /Б/ и сзади /В/, , для измерения СХЛ корней интактных проростков íopoxa при клиностати--ровании. ' ' ' ' • . ,

I - светонепроницаемая камера,' 2 - выносная кювета,-3 - шторка выносной кюветы /Е-2/, 4 - шторка светоне-'проницаемой камеры /Ш-1/, 5 - кожух, 6 - '¿ЗУ, 7 - салазки -для крепления, 8 - корни, 9 - светооптическое окно, 10 - проростки. ' V.- i

' ' ' РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Перекисное окисление липидов меток растений и их мембран в стационарных условиях выращивания.

В стационарных условиях выращивания у исследутачых растительных объектов интенсивность СХЛ, содержание ТБКАП и АО были.различны /табл.1/. СХЛ не зарегистрирована на протяжении всего, эксперимента /8-32 суток/ у клеток хлореллы и до 22-суточного возраста у клеток культуры ткани гаплолаштусз. СХЛ также не регистрировалась от 3-мм апексов корне"; гороха. Отсутствие свечения у хлореллы связано с присутствием в ее клетках хлорофилла /Тарусов, Весэловскип, 1978; Abeles, 1980; Мамедов, 1982/. В случае с культурой ткани гаплопаппу-са и апексами корней гороха отсутствие СХЛ можно объяснить

оа

Таблица I.

Абсолютные величины интенсивности СХЛ*, содержания ТБ1Ш1 и АО у интактных растительных объектов в стационарных условиях выращивания /контроля/.

Объекты

СХЛ.

! т _Т

|ид1»о »г ткани

{ТБКАП /по ВДА**/,!

! нмоль-г ткани 1 мкэкв-г ткани

,-1

АО,

Культура хлореллы В-15-суточная 25-32-суточная . не обнаружена 0,192 + 0,20 0,221 I 0,19 0,454 ± 0,039 0^23 ± 0,027 :

Культура ткани гаплопаппуса 8-18-суточная 22-28-суточная 12,33 ±Т0,93 10,430 ± 0,91 12,090 ±1,03 0,294 ± 0,032 ' 0 ,279 ± 0,021

Горох, апексы /Зт/ корней 2-7-суточных проростков не обнаружена 534,600 ± 45,70 2,781 ± 0,210

корни проростков 2-5-су?оч:шх" 7-13-суточных 503,10 ±48,30 552,70 ± 43,70 171,200 ± 14,20 179,980 ± 16,30 0,731 ± 0,059 0,707 ± 0,061 .

Пшеница, корни проростков. ■ 2-14-суточньк X X к 231,700 ± 70,40 .36.38 Я ... -

х - в пределах чувствительности /;

Примечание:

равно 80 имП'С « х - ЫДА - малоновый диальдегвд, зе ж х - не измеряли

применяемого ХЛМ1Ц-01 /фоновое свечение продукт ШЛ;

ограниченной чувствительностью применяемой.аппаратуры /хе-милкминЬметр "ХЖЩ-01/ й малым количеством исследуемого материала. .'/','./ ;

Содержание ТБХАП значительно возрастало в ряду - хлорелла, культура ткани гаплопаппуса, корни гороха А пшеницы. Количество АО увеличивалось^ но не столь значительно.

Прослеживается закономерное увеличение интенсивности СХЛ ; а. содержания- ТБКАП в онтогенезе, что согласуется с данными об интенсификации свободнорадикального окисления у организмов с возрастом при снижении АОА /Барабой, Орел, 1983; Маме дов, 1982; М1уааата а!., 1986/.

Для мембран клеток, корней проростков гороха было характерно довольно интенсивное свечение со значительным его увеличением от плазмалеммы к микросомам /табл.2/.

..•'-•У:•/•'■ Таблица 2.

• Интенсивность СХЛ мембран клеток корней 4-6-ти суточных проростков гороха в стационарных условиях выращивания

Митохондрии ■■ 68 ± 7.0

; Микросомы, у . -у:;.-578 + 59,4 -' '

7;-. Для удобства сравнения данных,' полученных в эксперидан- ■ тах с различными растительными' объектами при клиностатирова-нии'и микрогравитации, и большей.наглядности динамики изменений исследуемые показатели ПОЛ И; АОА на графиках и гистограммах выражали в процентах к■контролю. *

' 2. Перекисное окисление ли'пидов. Клеток растений при кля-" . нсстатировашш. .

Ранние изменения'в-клетках хлореллы. культуры ткани гаплопаппуса и корней гороха ггри краткосрочном воздействии /до 3 суток/- , -.. -;' '

При. краткосрочном клиностатировании одноклеточной зеленой

Мембраны.

.т

белка

Плазмалемма

38 + 4,1

3-13816

водоросли хлореллы в течение 0,5, 3, 6 и 24 час происходили незначительные изменения ЛЗХЛ, ТБКАП и АО, в среднем, в пределах ±10$. Только к 72 час отмечалось более существенное /на 19%/ снижение'ЛЗХЛ. У культуры ткани гаплопахшуса, представляющей собой каллусную ткань с полярным расположением, в ней клеток, достоверные,снижения ЛЗХЛ и ТБКАП на 12-15$ выявлялись уже к 6 и 24 час. ЛЗХЛ к 72 час воздействия снизи-' лась на 29$, что в 1,5 раза ниже, чем у хлореллы.

При переходе к проросткам гороха ответная реакция значительно возросла. У клеток корней 2-х суточных проростков в • первые 6-24 час клиностатирования происходило более выраженное /на 25-30$/ снижение СХЛ и ТБКАП на фоне увеличения АО на 11%. В дальнейшем, к 72 час, все исследуемые показатели приближались к уровням контродей. У клеток корней 4-х суточных проростков гороха с развитым гравичувствителвным аппаратом /Белявская, 1984/ кинетика изменений в основном была аналогична, однако снижение СХЛ на 20-23$ происходило уже к 30-60 мин клиностатирования /рис.2/.

<а <ц

I 120

х о к

X л о

100

80

60

■1.1

I I.

10 30 1 2 3

Рис.2. Ранние изменения интенсивности СХЛ /а/,со-5 держания ТБЙШ/б/ и АО /в/ в корнях, гороха при клино-в отатировании 2 об/шн. Эксперименты с 4-суточ- . ными проростками. К - контроль.

минуты

24 ^ 72

. Время, час

В экспериментах с 4-суточными проростками гороха СХЛ регистрировали при помощи специального блока-приставки к хе- . шлшинометру /рис.1/, что значительно повысило надежность и точность измерений. .

Таким образом, на начальных этапах клиностатирования у

исследуемых растений обмечается однонаправленное снижение интенсивности ПОЯ. Однако, у хлореллы это происходит к 3 суткам; у культуры ткани галлопадпуса к 24 час, а в корнях гороха в первые,минуты и часы клиностатирования в зависимости от возраста исследуемых проростков.. Наряду с возрастанием ответной реакции увеличивается амплитуда снижения, что можно объяснить увеличением чувствительности растений к гравитации-с повышением уровня их организации. Наиболее устойчивыми к микрограЕитация являются представители низших растений, к числу которых относится одноклеточная зеленая водоросль хлорелла; культура ткани высшего растения гаплопаппуса менее устойчива, а наиболее чувствительны -интактные высшие растения, особенно проростки /Ситник и др., 1984/. Наряду со степенью гравичувствительности растений, ответная реакция определяется также состоянием интенсивности ПОЛ и АОА. Известно, что с повышением организации . живых систем усложняются системы пероксидации и АО-защптЫ' /Барабой, Орел, 1983/. Высокий уровень СХЛ и содержания ТБКАП в корнях гороха по сравнению с хлореллой /табл.1/ отражает большую интенсивность пероксидации, а следовательно и более выраженные ранние изменения при клиностатиро-вании.

Апекальные клетки, плазмалемма. микросомы и митохондрии

корней гороха.

Известно, что в апексах 4-х суточных проростков гороха располагаются гравичувствительные клетки - статоциты, в которых при микрогравитации происходят наиболее ранние и многообразные ультраструктурные изменения /Сытник и др., 1984/.

Кинетика ПОЛ и АОА в апексах корней гороха при клиноста-тировании.аналогична вышеописанным изменениям в целом ксрнэ: наблюдалось раннее сшиение ЛЗХЛ и ТБКАП при увеличении АО, Однако амплитуда отклонений была в 1,5-2 раза больше, че:л в целом корне, что позволило выявить 25? снижение ЛЗХЛ уже к 15 мин воздействия.

Известно, что при различных воздействиях наибольшие изменения ПОЛ происходят в кдьточяых мембранах, л прэдде всего,

в митохондраалъных и микросомальных /Сидорик и др., 1989/. При клиностатироваяии 4-х суточных проростков гороха в мембранах корней также развивалось раннее угнетение пероксида-ции. При этом амплитуда снижения возрастала в ряду: плазма-лемма, микросомы, митохондрии /рис.3/. .

«

о и о

е-

X о к

s

H

о tft

60

100 -

. ---

80

I

Рис.3. Изменения' интенсивности СИГ ,плазмалеммы /а/, МШфОСОМ /б/ и митохондрий /в/-клеток корней проростков гороха: * при клиностатиро- -вании 2 об/глин. , К- контроль. ,

о

24

Время,час

48

В интактных митохондриях корней.гороха, выделенных в относительно мягких, условиях по методу /Войнияов, 1980/, к 0,5 час клшностагарования--интенсивностьСХЯ резко - снизилась'/на 5Сй/. В последующие. сроки происходило.йедаевдое ■ восстановив-. £ ние'СХЯ: через 18 час она всс еще била на 22$ шшз. контроля /ряс.4/.

К

«

<а «ч

о »

*

к

И

о

100

80

60

40

й-4

0,5 I

3

18

Рис.4. Ранние из-, менения интенсив--; ности СХЛ /а/ ми^,: тоховдрий корней ■, проростков гороха , при клиностатиро-^ вании 2 об/мин. К т. контроль.,

Таким образом, 'митохондрии клеток корней .гороха

Время,час

. проявляет наибольшую чувствительность к клиностатированяю. Это подтверждает их важную роль в развитии ответной реакции клеток на различные воздействия /казанский, Рабинович,. 1987; Войкаков, 1987/, в том числе и на изгленение , силы .тяжести.

Начальное скженке /пятенскБНости. СХЛ'отмечаетсякак у животных, так п у растений при очень многих воздействиях, д-rra таких, которые непосредственно генерируй свободные;.

-радикалы,. например, " облучение я оксйгенация /Митрофанов, 197Г; Гаопарян и др.,' 1970; Барабой, Орел, 1983/. Б.А.Еара-бой /1989/ - считает раннее снижение СХЛ,: ртражающее падение интенсивности пероксидации, 'начальной стадией' развития • стресс-реакции, во.время которой'возрастает■АОА, в ответ на начальную, вызванную экстремальным фактором,.индукцию ПОЛ.-Рост АОА тканей'организмов вазеа для рзалу.з'ац;-.и aflánTitBHUx возможностей.'- ;У '' .у:-" '• ■",<"''. '

Снижение хомиянеткосцвнции у-растений при краткосрочно:.: клиностатировании также можно' объясшйь .активацией АОА в ответ на первичную индукцию пероксидации../Однако, , при '-данном воздействии первичную "вспышку." пероксидации,•'предшествующую активации AOÁt■,'нaм;otíшpyfflTь^m;'Уfl^ócь;.'.■oз^eвиднp, в силу, ее. кратковременности и малой мплитуды rrpnj ¡довольно-: своеобразном "мягком", воздействии. - кяяностатяровзжш. Известно, .что для выявления первичней "вспн-пки": а стресс-реакоди требуется, кратковременное, и;довольно.'монщое'.. воздействие. В. . большинстве случаев при -умеренном, воздействии; агентов^'различной природы'первичная "вспышка"- незгачительна. и крат ковр оме к— на, ^выявить ее бывает сложно.' Зато ответная реакция .клеток в форме ранней активаций :А0-6истт и сякяежй . перокелдагщл выражена всегда. и при. .са*шх разных стресс-возг.ейстг.^ях /Ба-рабой, 1989, 1991/. ":"'.'-■'•■-' "

V . Раннее повышение; АОА у растений: на начальны:: этапах кли-ностатирования, более, выраженное в'корнях гороха, мояет быть следствием'активации: АО-ферментов - судёроксивдисмутазы, ка-талазы, пероксидаз,. индуцированных 0¿ и ILjO^,образуй'::!xc:i при клиностатировании, по механизму отрицательной обратной связи Д5ерзляж, 1989; Gillbara, Dodge,: 1986'}.Pridovich, 1975/. ;' .'У.растений"субстратом реакций пероксидации, наряду с .-и-пидами, могут-выступать фенолы, восстановленные $ормн котог рах .обладают.антиоксицанттдл потшщааяом/Барабой, 1976; Храпова,'.1962; ,Вес0ловский,- ..1982/. ' - . ,• '..'■ '

;. Наряду С; выявленным ранним сшвяением пероксидации и увеличением АОА у растений на начальных, этапах гаиностат:?рова-ния, в частности у исследуемого на-.с;: объекта - меток кор-

ней гороха, увеличивается индекс ненасыщенности жирных кислот и снижается ыикровдзкость билищцного слоя мембран к 24 час воздействия, что отражает адаптивный переход клеток в более устойчивое состояние /Полулях, 1988; Хочачка, Соме-ро, 1977/.

Следует отметить, что при клиностатировании растений наиболее раннее /к 15-30 мин/, и выраженное снижение перокси-дации удается выявить методом CXI, тогда как уменьшение содержания конечных продуктов ПОЛ - ТБКАП запаздывает на несколько часов /рис.2 а,б/. Изменения в содержании ТБКАП болев инерциальны и выявляются лишь при более экстремальных воздействиях/Веселовский, .1982/,

Изменения' ПОЛ -растений ш длительном клиностатировании

/от 3 до 24. суток/.

При длительном клиностатировании у исследуемых растений сниженный уровень ПОЛ и возросшая АОА стабилизируются. У . хлореллы и культуры ткани гаплопалпуса этот период относительно продолжителен, от 3 до 15 суток /рис.5,6/, у корней

Рис.5. Изменения интенсивности ЛЗХЛ /а/,

ШЩл^б/я АО . /в/ при длительном клино- , статировании "2 об/мин. -К - контроль.

Рис.6. Изменения интенсивности ,СМ /а/, ЛЗХЛ /б/, содержания ТБКАП /в/ и АО /г/ у культуры ткани . гаплопаппуса при длительном клиностатировании 2 об/мин. К - контроль.

120

о « в; ф О

100

t1 is а: US о pi к .. 80

м ° И >& 60

3 15

. Время, сутки

3 7 14

Вреыя, сутки

. гороха период стабилизации гораздо короче - от I до 24 час /рис.2/. :

Другое отличие касается амплитуды отклонений от уровня контроля. Если у хлореллы они в общем незначительны Д 810$/, то у культуры ткани-и корней гороха отмечается достоверное снижение интенсивности ПОЛ в среднем на 20-25$ и увеличение АОА на 12-16$.

• Известно, что отклонение многих параметров метаболизма от нормы и дальнейшее их сохранение на том же уровне означает адаптацию организма к данному воздействию /Удовенко, 1979; Генкель, 1982; Александров, 1985; Шматько и др.,1989/.

Вероятно, стабилизация повышенной АОА при продолжающемся клиностатировании сопряжена с ростом устойчивости клеток.

При достаточно длительных экстремальных воздействиях,

создающих постоянное "напряжение" метаболизма, резервы АО

могут постепенно расходоваться. Поэтому при. продолжающемся

клиностатировании растений-вслед за периодом стабилизации

равновесия ПОЛЛАОА резко возрастает интенсивность ПОЯ на

фоне снижения АОА, что особенно выражено в корнях проростков

гороха /рис.7/. Это согласуется с имеющимися в литературе

■ - ' - ■ а данными /Тарусов, Весе-

^ ловский, 1978;; Бурда-кова, Храпова, 1985; Мерзляк, 1989/.У растений при изменении -силы тяжести индукции ПОЛ после ее снияення может способствовать: а/ адаптивное накопление ненасыщенных

Рис.?. Изменения интенсивности СХЛ /а/, ЛЗХЛ/б/, содержания ТБЩУъ? и АО /г/в корниС проростков гороха при длительном клиностатировании . 2 об/мин. К -.контроль.

жирных кислот при данном , воздействии /Полулях, 1988; Таир-беков, 1988/.- легкоокисляемого субстрата пероксидации; б/ активизация цланнд-устойчивого дыхания с наработкой ак- . Тивных форм кислорода. / Rustin et al.,: 1984; Мерзляк,1989/. Когда соотношение' П0Л^А0Л::изменяется,в пользу- прооксндакт^ , ных факторов,;- вероятность развития патологического процесса увелич1шается. /Ёарабой, 1989'; Slater, 1987; Rabinovitch, i'ridovich, 1983/. Развитие процесса ПОЛ сопровождается накоплением чрезвычайно .токсичных продуктов -гидроперекисей^ альдегидов, кетонов, эпо^сидой^' что;в-конечном счете-ведет ' к деструкции мембран: и. гибели ¡клеток /Козлов, 1973; Дурав-Лев, 1982; Markluad, 1988; Pryor, 1984/. v '. . i -

Итак, в даашке. процесса ПОЛ и АОА у хлореллы, культуры ткани гаплопаппуса. и корней гороха'при краткосрочном недлительном клиностатировании можно выделить последователь-, ные фазы мшфогравитационного стресса: I фаза - мобилизации АО-резервов и снижения пероксидации /0-3 суток у хлореллы и культуры ткани, 0-1 час у гороха/; II фаза.« относительной стабилизации равновесия ПСЩзеАОА /3-15 суток у хлореллы, 3-14 суток у гаплопаппуса и 1-24 час у гороха/ и Ш фаза - актиЬацки ПОЛ /15-24 суток у хлореллы, 14-21 сутки у культур!! ткани гаплопаппуса и; 24-72 час у гороха/ /рис.2,5,6/. Продолжительность,фаз. уменьшается; а амплиту-; да изме нений. возрастает, с повышением, уровня ^организации; й исследуешх: растений. Это отражает различную .степень чувствительности растений к изменению силы тяжести.;v .

Ксди у клеток хлореллы и культуры .ткани, гаплопаппуса,изменения ПОЛ происходят в общем в пределах-физиологической;. норш реакции, то у гороха увеличение интенсивности ^пероксидации почти в 2 раза к 12 суткам клиностатирования указывает на суцостБоюшй сдвиг равновесия ПОЛйгАОА в сторону активащш ПОЛ с реальной угрозой развития' окислительной деструкции. Согласно литературным,данным у клеток корней гороха при данном воздействии также происходят более'су-: щественные ультраструктурные изменения. Предполагается, что в основе механизма нарушения проницаемости мембран, .'набухания, митохондрий ц аутолиза статоцитов /Сыт ни к и. др.,"

1984/ может лежать активация БОЯ.

3. Перекисное окисление липидов растений при ыикрограви-тации в условиях космического полета.

Колебательные изменения интенсивности ПОЛ, характерные для начальных и последующих фаз микрогравитационного стресса растений при клиностатировании, выявлены в корнях пшеницы в течение 2, 9 и 14 суток космического полета. Амплитуда отклонений была несколько больше, чем в корнях гороха, но общая тенденция.динамики изменений сохраняется - первоначальное снижение интенсивности ПОЛ на 50$ к 2-м суткам полета сменяется к 9 и 14 суткам значительной ее индукцией с превышением контролей на 30 я 40# соответственно /рис.8,а/.

«

а> «

а ■ &«

к .§

о

X

А «

©

О О

• ж

О

•в*

180

140

100

60

[■ц~-п Ч >ХП н „ I

2 ':;

? 9

Рис.8. Фазы микрогравитационного стресса клеток корней проростков пшеницы /а/ и культуры ткани гап-лопаппуса /б/ в условиях космического полета. I - фаза мобилизации АО-резервов. П - фаза относительной стабилизации равновесия ПОЛ^АОА.

И - фаза вторичной ■активащт ПОЛ.

-ТБКАД, .

- — продполагае-мая да намика и зме-,нений ТБКАП. •• К - контроль.

14 28 Время,; сутки .

Судя по степени накопления ТБКАП, у.культуры ткани1гап-лопаппуса к.9-м и 14-м суткам космического полета происходит довольно значительное, в. 1,5-2 раза, уве.вдчешге интенсивности ПОЛ с последующим его существенным снижением ¡г.«го контролей на 30$ к 28-м суткам. Индукцию ПОЛ на 9-е и 14-е сутки космического полета можно•отнести к.третьей фазе ек-

рогравктанионного стресса, а первые две фазы, следовательно, произошли до 9-х суток полета /рис.8,б/. Известно, что стресс-реакция имеет дсзозависимый характер и ее проявления могут.варьировать как по времени, так-и по амплитуде, однако общие закономерности сохраняются /Селье, 1982; Браун, Моженок, 1987/. Очередное снижение пероксидации у культуры ткани к 28-м суткам полета /рис.8,б/ является следствием повторной мобилизации резервных АО-механизмов.

В 14 суточном космическом эксперименте с культурой ткани гаплопаппуса. однонаправленное увеличение интенсивности ПОЛ происходило как в клетках культуры, так и в митохондриях, где отмечено 30$ увеличение СХ1 и 43$ увеличение ТБКАП /рис.9/. В, этом проявилась общность механизмов регуляции . равновесия ПОЛ и АОА при гравитационных воздействиях в земных и космических экспериментах.

150

100

50

2

гЬ

Б

1+

2

, Рис.9. Изменения интенсивности СХЛ /А/ и содержания ТБКАП /Б/ в митохондриях культуры ткани гаплопаппуса после 14 суток космическо-— го полета.

1 - контроль,

2 - полет.

Увеличение амплитуда изменений ПОЛ и экспрессности проявления фаз реакции растений при космическом полете, по сравнению с клиностатированием, видимо, прежде всего связано с особенностями влияния микрогравитации. В условиях космического полета у растений происходят более существенные и глубокие изменения метаболизма, чем при клиностати-рования /Меркис и др., 1976; Ситник, Кордам, 1986/. Нельзя не учитывать такке, что в космическом полете на растительные объекты воздействовал комплекс факторов, включающий, в частности, и действие ускорений на активных участках полета, что, возлегаю, увеличивало выраженность еум-ларного воздействия.

Выявленная нами кинетика микрограватацконного стресса

I

при клиностатировании и микрогравитации может быть уподоблена последовательности фаз,тревоги, резистентности и истощения общего адаптационного синдрома- по Г.Селье /1982/, установленных для животных. . ■

П.А.Генкзль /1982/ отмечает,-что прямое перенесение представлений о механизме развития стресса, животных на растения может быть сделано только с учетом своеобразия фазности ответной реакции растений на внешние воздействия, которую он предлагает назвать фитострессом. Однако он различает в фитострессе те же фазы, что и у животных. Для первой стадии фитостресса, считает он, характерен неспецифический комплекс изменений, а во второй проявляются также специфические изменения, связанные с работой генома.

Нам представляется, что специфической компонентой ответной реакции растений на стресс является индуцированный синтез фенолов, приводящий к увеличению устойчивости растений к различным воздействиям /Барабой, 1976; Мерзляк, 1989/, а том числе и к микрогравитации.

Таким образом, в условиях №!фогравитацтг при. космическом полете в клетках культуры ткани гяплопаппуса и корней пшеницы происходят колебательные изменения интенсивности ПОЛ, аналогичные выявленным ранее прл клиностатировании, но-их амплитуда, выше .и смена стресс-фаз проходит быстрее'.

В,целом.наше исследование выявило, что-изменения окис-,. лительного гомеостаза /активация АО-систем и снижение интенсивности ПОЛ, в особенности регистрируемое хекилжинос-центным методом/-'относятся К числу наиболее ранних, на- . чальных реакций клеток растений на шшрогравитацию и ее ■ модель - клиностатирование. Эта реакпря.возрастает в, своей амплитуде'и скорости развития-с.ростом организации рас-, тений и формированием гравичувстЕНтелыюго аппарата п связана преимущественно о мембранами митохондрий.. Состоянию -адаптации растительных организмов , к микрогравитацпонному стрессу соответствует стационарное зэяшонпз АОА клеток и снижений относительно контроля интзнсшзности ПШС. Наконец, развивающееся после продолжительной мпкрогравитацик ува-

личенгв СХЛ, ЛЗХЛ и ТБКАП при. сопряженном уменьшении АОА можно рассматривать как проявление связанного с расходом АО снижения устойчивости растительных организмов.

ВЫВ О Д Ы; .

I. Клиностатирование вызывает в клетках хлореллы, культуры ткани гашгопаплуса и корней гороха сложную колебательную динамику изменений интенсивности ПОЛ, включающую ее первоначальное снижение, затем стабилизацию на несколько пониженном уровне, после чего происходит значительная индукция, с превышением контролей. Экспрессность и амплитуда изменений закономерно-возрастает с повышением уровня организации, растений, а также формированием гравичувстви-тельного аппарата у проростков. ■ ' -

. 2. Раннее снижение; пероксидации. является следствием реактивного увеличения АОА растений в ответ на изменение " действия силы тяжести и наиболее выражено в клетках и ш-.' тохондриях высших растений/корней гороха/. . ; . 3. При продолжающемся' клиностатирования, _ после > сниже- • ' ния ПОЛ и. увеличения АОА, наблюдается некоторая стабилизация этих процессов, рассматриваемая как показатель состояния повышенной устойчивости растений к воздействию. Индукция ПОЛ после периода стабилизации развивается в ре- - / зультате снижения резервной мощности АО систем.

4. С учетом неспецифической динамики изменений интенсивности ПОЛ, ввделены три фазы микрогравитационного стресса: Фаза мобилизации. АО-резервов со снижением пероксидации; фаза относительной стабилизации ПОЛг?АОА и фаза вторичной активации ПОЛ.

5. В условиях микрогравитации при космическом полете динамика изменений интенсивности ПОЛ растений в основном ' аналогична наблюдавшейся при клиностатировании, однако смена фаз происходит быстрее, а аглиштуда отклонений больше. ■'. • •

6. Использование; хеадаюгжнесцентного метода позволяет получать наиболее ранкою с точную динамическую информацию об окислительном гомеостазеклеток 'растений;при изменении спды тяжести.

so

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

• I. Жадько C.I. Ранн1 реакцП проростк1в гороху на кл1но-статування: // Укр. ботан. журя. - 1986. - Т.34. - С.86-87.

2. Жадько С.И., Барабой В.А., Сидоренко П.Г., Карнаух И.М. Начальные реакции проростков гороха на.клиностатирова-ние // Докл. АН УССР., Сер.Б. - 1988. - И 8. - С.66-68.

3. Жадько С.И.,.Воробьева Т.В., Барабой В.А., Полулях •. КЗ.А., Сидоренко П.Г. Изучение структурно-функциональной модификации растительных мембран методом хемшшминесценции в условиях шкрогравитации // Тезисы докладов на У1 Всесоюзном симпозиума "Ультраструктура растений". - Киев, 1988. -С.36.

4. Жадько С.И. Перекисное окисление липицов растений при макрогравитационном стрессе /Тезисы докладов на Ш Всесоюзном симпозиуме "Клеточные механизмы адаптации" // Цитология. - 1991. - Т.33, № 5. — С.498.

5. Сидоренко П.Г., Ильин В.П., Еадько С.И. Свобоцнорада-кальные процессы в мембранах клеток растений in vitro подвергавшихся клиностатированиго // Тезисы I Всесоюзного биофизического съезда, Москва, 1982. - С.116.

6. Сидоренко П.Г. г Кллмчук Д.А., Мартин Г.М., Подлуцкий А.Г., Еадько С.И. Особенности роста культивируемых клеток 'высших растений в условиях измеленной силы, тяжести /Тезисы докладов и сообщений, .представленных на Всесоюзном совещании. "Биология клетки в культуре" // Цитология. - 1983. -Т.25, № 9. - С.1094.

7. Попова А.Ф., Сидоренко П.Г., Кллмчук Д.А., Глдько С.И. ..Мартын Г.М., Иваненко Г.<5. Исследование структурно-функциональных особенностей одноклеточных водорослей а культур клеток высших растений при моделирования отдельных факторов космического полета // Космическая биология и биотехнология. г- Киев: Наукова думка, 1986. - С.33-41.

.8. Барабой В.А., Еадько С.И...Кордам 2.Л., Сидоренко П.Г. Перекисное окисление липпдов растений различного уровня организации при микрогравптацпонном'стрессе // Известия АН СССР, Сер.Б. - 1991. - » 3. - С.368-375.

9. Zhadko S.I., Baraboy Y.A.,Polulyakh iu.A., Vasllenko A.I., Sidorenko F.G. Early Reactions of Plant Cells on Microgravity and Power-energy Charged Particles Effects // In: Abstracts of" tie 39th. International Astronautical Congress of the IAi, Bangalore, India, 8 - 15 October, - 1988. -P. 500. ■'.'.•.•"'■'.'

10. Zhadko S.I., Klimchuk D.A., Kordyum E.I,., Sidorenko P.G., Vorobyeva T.V., Baraboy V.A. Lipid Peroxidation and Ultras.tructural Organization of Haplopappus Tissue Culture . in Microgravity // In: Abstracts of the 28th Plenary Meeting of the Committee on Space Research, Hague, Netherlands,

25 June - 6 July. -1990. - P. 56.

11. Polulyakh Yu.A., Zhadko S.I., Klimchuk D.A., Sytnik K.M., Baraboy V.A., Alpatov A.M. Plant Cell Plasma Membrane .Structure and Proporties Under Microgravity //.In: Abstracts of the 27th Plenary Meeting of the Committee on Space Research, Helsinki, Finland, 18 - ,29 July. - 1988, - P. 368.

12. Kordyum E.L., Sidorenko P.G., Klimchuk D.A., Martin ' G.M., Zhadko S.I., Vasllenko A.I. Prospects of Studies in Space Phytobiologi // Preprint/40th Congress of the International Astronautical Federation,Malaga, Spain,-7 - 12 October, - 1989. - P. 1 - 7. .'/ •'.'•'.-/

13. Polulyakh Yu.A., Zhadko S.I., Klimchuk D.A., Baraboy V.A., Alpatov A.M., Sytnik K.M. Plant Cell Plasma Membrane . Structure and Proporties Under Clinoatattiag // Adv. Space Res. - 1989. - Vol. 9, Ho 11. - P. 71 - 74.j"

14. Kordyum E.L., Sytnik K.li., Zhadko,S.X., Popova A.P. Charges in the Rate of Biological Processes" on the Cellular Level in Microgravity // In: Abstracts of the 28th Plenary Meeting of the Committee on Space Research, Hague, Netherlands, 25 June - 6 July. - 1990. - IV 55* a

/fUQ