Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменение эпилептиформной активности мозга у крыс при электрической стимуляции подкорковых структур

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Изменение эпилептиформной активности мозга у крыс при электрической стимуляции подкорковых структур"

На правах рукописи У

БЛИК Виталия Александровна

ИЗМЕНЕНИЕ ЭПИЛЕПТИФОРМНОЙ АКТИВНОСТИ МОЗГА У КРЫС ПРИ ЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ СТИМУЛЯЦИИ ПОДКОРКОВЫХ СТРУКТУР

03.03.01 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ на соискание учёной степени кандидата биологических наук

28 НОЯ 2013

Москва-2013

005540015

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных биологического факультета Московского государственного университета им. Ломоносова (заведующий кафедрой - доктор биологических наук, профессор А.А. Каменский)

Научный руководитель:

Ннна Евгеньевна кандидат биологических наук, доцент, доцент

Чепурнова кафедры физиологии человека и животных

биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Официальные оппоненты:

Вивггор Ювеналиевич Щебланов

Юрий Валентинович Лихачёв

доктор биологических наук, заведующий лабораторией психофизиологического обеспечения Института биофизики ФГУП

кандидат биологических наук, доцент кафедры дифференциальной психологии и психофизиологии факультета медицинской психологии Института психологии им. Л.С. Выготского РГГУ.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт Высшей Нервной Деятельности и Нейрофизиологии РАН

Защита диссертации состоится «16» декабря 2013 г. в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д501.001.93 при биологическом факультете Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, г. Москва, Ленинские горы, д.1, строение 12, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат диссертации разослан «15» ноября 2013 г. ^ Учёный секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук Б.А. Умарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Около 30% больных эпилепсией относятся к случаям, в которых не удаётся добиться контроля над приступами с помощью антиэпилептических препаратов (АЭП) [Базилевич, 2009]. Такие формы эпилепсии называются фармакорезистснтными. Однако и в тех случаях, когда заболевание поддаётся фармакологическому контролю, побочные эффекты противоэпилептических препаратов зачастую ощутимо влияют на качество жизни пациента, особенно в условиях необходимости регулярного длительного приёма лекарства. Это объясняет необходимость поиска альтернативных методов лечения эпилепсии, позволяющих снизить тяжесть заболевания, улучшить состояние пациента, но при этом не вызывающих негативных последствий.

Глубокая электрическая стимуляция мозга (deep brain stimulation, DBS) является перспективным нефармакологическим методом лечения эпилепсии. В качестве мишеней для элсктростимуляции используется целый ряд структур мозга, однако клинические данные по их эффективности часто противоречивы. Ещё одной важной проблемой при использовании электростимуляции мозга является выбор режима стимуляции: постоянный или с обратной связью (в ответ на начало приступа). В некоторых работах показана большая эффективность в подавлении эпилептической активности при использовании метода с обратной связью по сравнению с постоянной стимуляцией [Fcddersen et al., 2007; Rahman et al., 2010].

Большая часть работ фокусируется на судорожных формах эпилепсии, но не меньшего внимания заслуживают бессудорожные (абсансные) эпилепсии. Абсансы характеризуются внезапной потерей сознания и генерализованной пик-волновой активностью а ЭЭГ. Они могут мешать процессу обучения и социальной адаптации и вызывать ухудшение процессов обработки информации в мозге.

Лечебная электростимуляция отдельных областей мозга меняет активность структур, участвующих в генерации патологической активности, и

подавляет развитие эпилептических приступов. Однако высока вероятность, что это влияние затронет и системы нормальной регуляции жизнедеятельности, например, цикл смены сна и бодрствования. Регуляция сна и бодрствования осуществляется сложным ансамблем структур [Ковальзон, 2011; КозепшавБег, 2009], некоторые из которых являются потенциальными мишенями для стимуляции.

Таким образом, вопрос о мишенях для стимуляции при абсансной эпилепсии и наиболее эффективных режимах остаётся нерешённым. Кроме того, практически не исследовано влияние лечебной электростимуляции на цикл сон-бодрствование при эпилепсии.

Цель работы: Исследовать изменения эпилептиформной активности абсансного типа у крыс при электрической стимуляции некоторых подкорковых структур мозга и их взаимосвязь с состояниями сна и бодрствования.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1) Исследовать влияние постоянной электрической стимуляции базального ядра Мейнерта на эпилептиформную активность, вызванную введением малых доз пентилентетразола, у крыс линии Wistar.

2) Изучить изменения спонтанной эпилептиформной активности и цикла сон-бодрствование при электической стимуляции базального ядра Мейнерта с обратной связью у крыс линии \УАОЛЩ.

3) Сравнить изменения эпилептиформной активности и цикла сон-бодрствование у крыс линии '\УАО/11у при электрической стимуляции базального ядра Мейнерта и туберомаммиллярного ядра в постоянном режиме и в режиме с обратной связью.

4) Исследовать влияние электрической стимуляции переднего ядра тапамуса и её совместного применения с этосуксимидом на эпилептиформную активность, вызванную введением малых доз пентилентетразола, у крыс линии \Vistar.

Научная новизна работы. Впервые было показано, что кратковременная высокочастотная стимуляция базального ядра Мейнерта (N8) и туберомаммиллярного ядра (ТМЫ) в момент начала абсансного приступа прерывает патологическую пик-волновую активность на ЭЭГ крыс линии \VAGZRij с врождённой предрасположенностью к абсансам. Было обнаружено увеличение количества приступов при стимуляции этих ядер с обратной связью в течение 3-х и 24-х часов. Был проведён анализ изменений цикла сон-бодрствование при стимуляции N1} и ТМЫ. Показано, что при стимуляции с обратной связью поведение животных становилось более дробным, и увеличивалось количество переходных состояний между различными фазами цикла. Впервые было показано противоэпилептическое действие стимуляции переднего ядра таламуса (АЫ) на модели абсансных приступов, вызванных введением малых доз пентилентетразола, а также аддитивное действие стимуляции АИ и противоабсансного препарата этосуксимида. Положения, выносимые на защиту:

1. Стимуляция N13 и ТМЫ с обратной связью у крыс линии АУАО/Яу прерывает пик-волновые разряды, однако приводит к увеличению их количества.

2. Стимуляция ЫП с обратной связью в течение 24 часов приводит к увеличению длительности пассивного бодрствования и снижению длительности сна только в первые 12 часов стимуляции. Изменение длительности пассивного бодрствования не коррелирует с повышением количества разрядов при длительной стимуляции.

3. Стимуляция ЫВ и ТМЫ в постоянном режиме не обладает противоэпилептическим эффектом у крыс линии АУАО/Яу.

4. Стимуляция АЫ в постоянном режиме снижает выраженность эпилептиформной активности абсансного типа, вызванной введением малых доз пентилентетразола, у крыс линии "\У1з1аг.

5. Совместное применение стимуляции AN и противоабсансного препарата этосуксимида вызывает более выраженное уменьшение эпилептиформной активности, чем каждый из способов отдельно.

Теоретическая и практическая значимость работы. В работе показана возможность остановки эпилептических приступов абсансного типа с помощью кратковременной электростимуляции NB и TMN с обратной связью. Это можегг иметь важное клиническое значение, так как позволяет остановить приступ в самом начале и избежать возможной травматизации, связанной с внезапной потерей сознания. Также обнаружен аддитивный эффект электростимуляции AN и этосуксимида. Полученные результаты свидетельствуют о том, что электростимуляция мозга может быть эффективной дополнительной терапией, позволяющей снизить дозу АЭП и, как следствие, выраженность отрицательных побочных эффектов препаратов.

Научный интерес представляют данные анализа изменений цикла сон-бодрствование при стимуляции NB и TMN, подтверждающие участие этих ядер в поддержании бодрствования. Было обнаружено отсутствие прямой зависимости между изменениями длительности сна и бодрствования и количеством пик-волновых разрядов.

Апробация работы. Результаты данной работы были представлены на конференциях: XIX Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 9-13 апреля, 2012), IX Международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Крым, Украина, 3-13 июня, 2013), Featured regional meeting of Federation of European Neuroscience Societies (Prague, Czech Republic, 11-14 September, 2013), XXII Съезд Физиологического общества им. И.П. Павлова (Волгоград, 16-20 сентября, 2013), The 25th Anniversary Meeting of British Sleep Society (Edinburgh, Scotland, UK, 17-19 October, 2013).

Структура и объём диссертации. Диссертация содержит 139 страниц и 20 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы исследования, результаты и их обсуждение),

заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы включает 337 наименований, в том числе 28 отечественных и 309 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. Работа проведена на самцах крыс линий Wistar и WAG/Rij. Крыс содержали в стандартных условиях вивария, с доступом к воде и комбикорму ad libitum.

Операции. Крысам имплантировали электроды из нихромовой проволоки для регистрации ЭЭГ (во фронтальную кору) и для стимуляции (билатерально в NB, TMN или AN). После проведения операций крыс содержали в индивидуальных пластиковых боксах.

Модели абсаисной эпилепсии. 1) Абсансоподобные приступы, вызванные введением малых доз пентилентетразола (ПТЗ). ПТЗ (25 мг/кг) вводили крысам линии Wistar виутрибрюшинно, регистрировали ЭЭГ в течение часа. 2) Крысы линии WAG/Rij имеют врождённую предрасположенность к абсансным приступам. В обеих моделях то время приступа на ЭЭГ регистрируются пик-волновые разряды (SWD).

Влияние постоянной стимуляции NB в течение 1 часа на эпилептиформную активность на модели малых доз ПТЗ.

В первый день крысам вводили ПТЗ и регистрировали ЭЭГ в течение 1 часа. Через 4 дня повторяли опыт, но за 10 минут до введения ПТЗ включали стимуляцию (частота 100 Гц, длительность импульса 300 мкс, амплитуда — 50% от поведенческого порога). Порог определяли накануне как амплитуду, вызывающую какую-либо новеденческую реакцию (подергивание, поворот головы, замирание).

Стимуляция NB с обратной связью у крыс линии WAG/Rij. В первый день регистрировали фоновую активность в течение 24 часов. Затем определяли пороговую амплитуду для прерывания SWD путём постепенного увеличения амплитуды импульсов, начиная с 20 мкА, с шагом 10 мкА. Пороговым считалось значение амплитуды, при котором стимуляция

прерывала каждый из трёх последовательных 8\\Т). Частота стимуляции внутри пачки составляла 130 Гц, длительность пачки - 1 с, длительность импульса - 400 мкс. На следующий день проводили стимуляцию с обратной связью в течение 3 часов. Чтобы исследовать влияние длительной стимуляции N13 на эпилептическую активность у крыс, была проведена также 24-часовая стимуляция с обратной связью, после чего ЭЭГ регистрировали ещё в течение 24 часов для обнаружения возможных пост-эффектов. Одновременно с записью ЭЭГ регистрировали двигательную активность животного с помощью инфракрасного датчика движения.

Электрическая стимуляция N8 и Т1УШ в течение 3-х часов при различных режимах у крыс линии \УАСЛ1ц.

В первый день записывали фоновую ЭЭГ в течение 3 часов. После этого определяли пороговую амплитуду для прерывания SWD. На следующий день проводили стимуляцию с обратной связью в течение 3-х часов. Через 1-2 дня снова записывали фоновую ЭЭГ, а на следующий день проводили постоянную стимуляцию с амплитудой 50% порога. Через 1-2 дня повторяли опыт, но амплитуду увеличивали до 70% от пороговой. Одновременно с регистрацией ЭЭГ проводили видеосъёмку животного для анализа поведенческой активности.

Сочетанное применение стимуляции AN таламуса и этосуксимида на модели малых доз ПТЗ.

Крысы были разделены на контрольную (п=5) и опытную (п=8) группы. В первый день крысам вводили ПТЗ, регистрировали ЭЭГ в течение 1 часа. Через 4 дня повторяли опыт, но за 10 минут до введения ПТЗ включали стимуляцию АЫ (частота 100 Гц, длительность импульса 100 мкс, амплитуда - 50% от поведенческого порога). В третий экспериментальный день животным опытной группы за 15 минут до введения ПТЗ вводили этосуксимид (препарат первого выбора при абсансной эпилепсии) в дозе 20 мг/кг ¡.р.. Доза была подобрана таким образом, чтобы эпилептическая активность снижалась, но не блокировалась полностью. Таким образом, при сочетанном применении стимуляции и этосуксимида можно было бы увидеть суммацию эффектов. На

четвёртый экспериментальный день крысам опытной группы вводили этосуксимид и проводили стимуляцию, как описано выше.

Крыс контрольной группы также подключали к стимулятору, но стимуляцию не проводили. Вместо этосуксимида им вводили соответствующий объём физиологического раствора.

Контроль положения электродов. После экспериментов проводили контроль положения электродов на срезах мозга, окрашенных крезивиолетом по стандартной методике.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета статистических программ Statistica 5.5 (StatSoft Inc.). Сравнение проводили с использованием дисперсионного анализа (с последующим применением критерия Ньюмена-Кейлса для post-hoc сравнений) и критерия Вилкоксона. Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05. Все величины указаны в формате (среднее±ошибка среднего).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Влияние постоянной стимуляции NB на эпилептиформную активность абсансного та, вызванную введением малых доз ПТЗ.

Количество SWD в контрольной записи составило 176±29 разрядов за 1 час регистрации, а средняя длительность - 2,3±0,2 с. Стимуляция NB не привела к статистически значимому изменению длительности и количества SWD. Известно, что электрическая стимуляция NB активирует нейроны этого ядра, вызывая усиление выброса ацетилхолина и десинхронизацию ЭЭГ [Metherate et al., 1992]. С другой стороны, ранее было показано, что холинергическая активация NB вызывает снижение количества и длительности SWD [Berdiev, van Luijtelaar, 2009]. В нашем эксперименте не нбалюдалось изменений в эпилептической активности. Возможно, при длительном действии стимуляции изменяется чувствительность нервной ткани или её реакция на стимуляцию.

Изменение эпилептиформной активности у крыс линии \УАС/ку при стимуляции N8 с обратной связью в течение 3 и 24 часов. Одним из возможных механизмов, обеспечивающих антиэпилептический эффект стимуляции некоторых структур, является их способность вызывать десинхронизацию ЭЭГ. Поэтому в качестве мишеней для стимуляции нами были выбраны ядра, активность которых ассоциирована с инициацией и поддержанием бодрствования и парадоксального сна - состояний, характеризующихся десинхронизацией мозговой активности. Это гистаминсргическое туберомаммиллярное ядро и холинергическое базальное ядро Мейнерта. В наших экспериментах кратковременная высокочастотная электрическая стимуляция N3, подаваемая в начале БМЭ, была способна прервать приступ (рис. 1А). Порог при унилатеральной стимуляции был достоверно выше, чем при билатеральной (рис. 1К). Это можно объяснить тем, что при билатеральной стимуляции мы воздействуем на эпилептический контур в большем количестве звеньев, и вероятность прекращения синхронной активности в нём возрастает. Часто стимуляция сопровождалась небольшой ориентировочной реакцией.

Рис. 1. А - пример вШ) у крыс линии "\УАО/Ю] и 8\УБ, прерванный при помощи стимуляции ЫВ с обратной связью; Б - сравнение порогов прерывания 8\УБ при унилатеральной (п=5) и билатеральной стимуляции (п=6). * - р<0,05.

При 3-хчасовой стимуляции NB с обратной связью было прервано более 90% SWD, но наблюдалась тенденция к увеличению их количества по сравнению с фоновой активностью.

Чтобы исследовать влияние длительной стимуляции NB на эпилептическую активность, мы провели также стимуляцию NB с обратной связью в течение 24 часов. При этом произошло значительное увеличение количества SWD по сравнению с контролем (1170±163 и 381±21 разрядов, соответственно). Повышенное количество SWD сохранялось на протяжении первых 12 часов после прекращения стимуляции (рис. 2). Полученные результаты согласуются с литературными данными. Так, было показано, что стимуляция чёрной субстанции у крыс с абсансными приступами также увеличивает количество SWD [Feddersen et al., 2007].

Известно, что наибольшее

количество SWD крыс линии

WAG/Rij наблюдается в

состоянии пассивного

бодрствования и лёгкого

медленноволнового сна, а также

во время переходных состояний

Рис. 2. Сравнение количества SWD в между сном и бодрствованием и контроле, при стимуляции NB ив

постстимуляционный день (п=6). * - р<0,05 междУ Различными фазами сна

по сравнению с контролем. [van Luijtelaar, Coenen, 1988].

Поэтому мы предположили, что возросшее количество SWD связано с

изменением соотношения фаз цикла сон-бодрствование. На основании данных

ЭЭГ и инфракрасного датчика движения мы выделили 4 типа активности:

активное и пассивное бодрствование, медленноволновой сон и REM-coh.

Действительно, мы обнаружили увеличение длительности пассивного

бодрствования и снижение длительности сна, но эти отличия были только в

первые 12 часов стимуляции (рис. 3), тогда как количество SWD было выше,

1-12 ч

12-24 ч

ш 20000 о

16000 ■] ' | 12000

8000 -

АБ

ПБ РЕМ МС

о 20000

о 16000

8000 4000 0

Л,

X

□ контроль ■ ОВЭ

АБ ПБ ИЕМ МС

А

Б

В

Рис. 3. . Сравнение суммарной длительности (А), средней длительности (Б) и количества эпизодов (В) различных типов активности в первой и второй половине суток в контроле и результате стимуляции ЫВ с обратной связью у крыс линии \УАС/Ш| (п=6). * - р<0,05.

чем в контроле, в течение всех 24 часов. Таким образом, мы пе обнаружили прямой корреляции между уровнем поведенческой активности и количеством 8ШО. Возможно, увеличение количества приступов связано не столько с увеличением длительности пассивного бодрствования, сколько с увеличением количества переходных состояний между различными типами активности.

Сравнительное исследование изменений эпилептиформной активности и цикла сон-бодрствование у крыс линии >УАС/Кц при трёхчасовой стимуляции ТМЫ и N8 в постоянном режиме и в режиме с обратной связью, Пороговая амплитуда при стимуляции ИВ с обратной связью составляла 59±11 мкА, а при стимуляции 'ГМК - 78±10 мкА. Отличия между порогами для разных структур были недостоверными.

Стимуляция и N6, и ТМЫ с обратной связью достоверно увеличивала количество SWD, в то время как их постоянная стимуляция с амплитудой 50% от пороговой не оказывала влияния ни на длительность, ни на количество 8\\Т>. При повышении амплитуды до 70% при стимуляции ИВ также не наблюдалось изменений, но при стимуляции ТМЫ с такой амплитудой происходило уменьшение количества 8ТО) (рис. 4, 5).

На основании зарегистрированной ЭЭГ и видеозаписей поведения крыс при стимуляции ТМЫ и N8 в различных режимах мы провели анализ изменений цикла сон-бодрствование. Стимуляция НВ с обратной связью вызывала увеличение длительности активного бодрствования и уменьшение длительности сна (рис. 6). Суммарная длительность пассивного бодрствования не изменилась, однако эпизоды пассивного бодрствования стали короче, а их количество возросло, что может свидетельствовать об увеличении количества переходных состояний, в которых вероятность возникновения Б ТО) высока, и таким образом объяснять увеличение количества разрядов.

Постоянная стимуляция N8 также сопровождалась изменением параметров сна и бодрствования, причём эффект был более выраженным при низкой амплитуде. Происходило увеличение суммарной длительности пассивного бодрствования и снижение средней длительности

§ 700

0

Р" 600

1

§ 500 | 400

о зоо

ОТ 200 о

£ 100

2 о

а ос

И ПС 50% ■ ПС 70%

Л Б

Рис. 4, Количество (А.) и средняя длительность (Б) вЖ) у крыс линии "№АО/11ц при трёхчасовой стимуляции НВ в различных режимах (п=5). * - р<0,05 по сравнению с контролем (100%). ОС - стимуляция с обратной связью, ПС -постоянная стимуляция.

А Б

Рис. 5. Количество (А) и средняя длительность (Б) у крыс линии АУАО/К.у при трёхчасовой стимуляции ТММ в различных режимах (п=6). * - р<0,05 по сравнению с контролем (100%). ОС - стимуляция с обратной связью, ПС -постоянная стимуляция.

медленноволнового сна (рис. 6). Однако это не вызывало изменений в эпилептической активности. Таким образом, между количеством 8\УГ) и длительностью пассивного бодрствования и сна не было обнаружено однозначной зависимости.

250 -

100

АБ ПБ КЕМ МС

Рис. 6. Суммарная, средняя длительность и количество эпизодов различных видов активности при стимуляции N1} у крыс линии \УАО/Яц в различных режимах (п=5). АБ - активное бодрствование, ПБ - пассивное бодрствование, КЕМ - парадоксальный сон, МС - медленноволновой сон, ОС - стимуляция с

обратной связью, ПС контролем (100%).

постоянная стимуляция. * - р<0.05 по сравнению с

При обоих режимах при стимуляции N13 мы наблюдали уменьшение количества эпизодов и длительности ЯЕМ-сна. что может свидетельствовать об уязвимости этой важной фазы сна при электростимуляции.

Стимуляция ТМИ с обратной связью приводила к укорочению эпизодов активного и пассивного бодрствования и увеличению их количества (рис. 7). Вероятно, большая дробность поведения может быть связана с наличием двигательной ориентировочной реакции на стимул.

Постоянная стимуляция ТМЫ с амплитудой 50% порога не оказывала влияния ни на параметры цикла сон-бодрствование, ни на эпилептическую активность. Однако при увеличении амплитуды до 70% мы наблюдали уменьшение количества вЖ), которое сопровождалось двигательной активацией и резким снижением длительности обеих фаз сна (рис. 7).

Нишида и соавт. показали, что электрическая стимуляция ТМК' с частотой 100 Гц приводит к увеличению уровня гистамина в мозге крыс [МэЫёа е1 а1., 2007]. Таким образом, полученные нами результаты согласуются с данными Самотаевой и соавт., которые показали, что увеличение содержания гистамина в мозге под действием метоприна, блокатора фермента деградации гистамина, приводит к подавлению вШЭ и усилению локомоторной активности у крыс линии \\/АСЯ1у [ЗатсЛаеуа е! а1., 2012]. В данном случае уменьшение количества 8\\Т), вероятно, носит вторичный характер по отношению к увеличению двигательной активности, так как, по литературным данным, всего 9% 8\¥Е> возникает в периоды АБ [Оп'пкепЬиг§ й а1., 1991].

шос

□ ПС 50% £S ПС 70%

Рис. 7. Суммарная, средняя длительность и количество эпизодов различных видов активности при стимуляции TMN у крыс линии WAG/Rij в различных режимах (п=6). АБ - активное бодрствование, ПБ - пассивное бодрствование, REM - парадоксальный сон, МС - медленноволновой сон, ОС - стимуляция с обратной связью, ПС - постоянная стимуляция. * - р<0,05 по сравнению с контролем (100%).

Сравнение влияния стимуляции переднего ядра таламуса и введения этосуксимида на эпилептиформнуто активность, вызванную введением малых доз ПТЗ. В настоящее время АЫ наиболее часто используется в качестве мишени для стимуляции как на моделях судорожных форм эпилепсии, так и у пациентов с судорожными приступами. Но влияние стимуляции этого ядра на эпилептическую активность абсансного типа практически не исследовано. В нашем эксперименте стимуляция АЫ вызывала снижение количества (на 30,6±7,8%) и их суммарной длительности (на 33,3±7,2%). Для сравнительного анализа крысам вводили этосуксимид (препарат первого выбора при абсансной эпилепсии), который снижал количество и суммарную длительность на 28,8±11,0% и 40,6+9,8%, соответственно (рис. 8). Более выраженный противоэпилептический эффект был получен при сочетании стимуляции АК и введения этосуксимида. Количество у крыс в этом

эксперименте уменьшилось на 55,5±9,7%, а их суммарная длительность - на 60,4±9,0%. В контрольной группе не было обнаружено различий в количестве и длительности Б'Ш), что говорит об отсутствии изменений чувствительности к ПТЗ при его повторных введениях с интервалом в 4 дня.

Этот эксперимент имитирует ситуацию, когда АЭП не оказывает удовлетворительного противоэпилегггического действия, однако его дозу нельзя повысить из-за дозозависимых побочных эффектов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в этом случае электростимуляция может оказаться эффективной дополнительной терапией, позволяющей снизить уровень эпилептической активности мозга без увеличения дозы АЭП.

100

120

100 -

□ контроль

□ ОВЭ 0ЕТХ

□ йВв+ЕТХ

□ контроль

а рве ВЕТХ 0 РВв+ЕТХ

г»

А Б

Рис. 8. Сравнение количества (А) и суммарной длительности (Б) вЖ) при стимуляции Л1\1, введении этосуксимида (ЕТХ) и их сочетанном применении на модели малых доз ПТЗ (п=8). * - р<0,05 по сравнению с контролем, # - р<0,05 в указанных парах.

выводы

1. Стимуляция базального и туберомаммиллярного ядер с обратной связью в течение 3 часов у крыс линии \УАО/Яу прерывает пик-волновые разряды, однако приводит к увеличению их количества и вызывает изменение соотношения фаз цикла сон-бодрствование, поэтому не может быть использована для эффективного купирования эпилептиформной активности у крыс. Повышенное количество разрядов сохраняется и при стимуляции базального ядра в течение 24 часов.

2. Стимуляция базального ядра с обратной связью в течение 24 часов приводит к увеличению длительности пассивного бодрствования и снижению длительности сна только в первые 12 часов стимуляции. Изменение длительности пассивного бодрствования не коррелирует с повышением количества разрядов при длительной стимуляции.

3. Постоянная стимуляция базального ядра с амплитудой 50% порога вызывает уменьшение длительности медленного и быстрого сна и увеличение длительности пассивного бодрствования. Стимуляция с более высокой амплитудой (70%) вызывает только уменьшение количества эпизодов быстрого сна. Эти изменения в цикле сон-бодрствование не сопровождаются изменением количества или длительности разрядов.

4. Постоянная стимуляция туберомаммиллярного ядра с амплитудой 50% порога не вызывает достоверных изменений в параметрах цикла сон-бодрствование, в количестве и длительности разрядов. Стимуляция с амплитудой 70% порога приводит к снижению количества разрядов, усилению двигательной активности, снижению длительности медленного и быстрого сна.

5. Постоянная стимуляция базального и туберомаммиллярного ядер с выбранными параметрами неэффективна в купировании эпилептиформной активности у крыс линии \УАО/11ц, однако может изменять соотношение фаз цикла сон-бодрствование.

6. Стимуляция переднего ядра таламуса в постоянном режиме приводит к снижению количества и длительности пик-волновых разрядов, вызванных введением малых доз пентилентетразола, у крыс линии Wistar. Совместное применение стимуляцияя переднего ядра таламуса и этосуксимида (20 мг/кг) вызывает более выраженное уменьшение эпилептиформной активности, чем каждый из способов отдельно.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Блик В.А., Аристов A.B., Чепурнова Н.Е. Применение системы автоматического анализа ЭЭГ и ответной стимуляции для остановки эпилептиформной активности у крыс линии WAG/Rij // Бюлл. эксп. биол. мед. (статья принята к печати)

2) Aristov А.V., Abbasova K.R., Berdiev R.K., Blik V.A., Galkina A.Yu., Chepurnova N.E. Research and development of a technique intended to predict or identify seizures of rats absence epilepsy // Формирование разряда спай-волна: генетические и эпигенетические факторы. Материалы конференции с международным участием. - М.: Издательский дом «Русский врач», 2010. - С. 9-12.

3) Блик В.А. Влияние высокочастотной электрической стимуляции базального ядра Мейнерта на эпилептическую активность у крыс линии WAG/Rij // Тезисы XIX Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных: Секция «Биология»; 9-13 апреля 2012г., Москва. - М.: МАКС Пресс, 2012. - С. 205.

4) Блик В. А., Гачкина А. Ю., Аристов А. В., Бердиев Р. К., Чепурнова Н. Е. Подавление пик-волновых разрядов у крыс линии WAG/Rij при автоматизированной стимуляции базального ядра Мейнерта // Сборник тезисов XXII Съезда Физиологического общества им. И.П. Павлова, 16-20 сентября 2013 г. Волгоград.

5) Блик В.А., Галкина А.Ю., Чепурнова Н.Е. Влияние электрической стимуляции переднего ядра таламуса на эпилептиформную активность,

вызванную введением малых доз пентилентетразола // IX международный междисциплинарный конгресс Нейронаука для медицины и психологии. Сборник тезисов. 3-13 июня 2013 г. Судак, Крым, Украина.- С. 81-82.

6) Blik V. A., Luttjohann А. К., Berdiev R. К., Chepurnova N. Е., van Luijtelaar G. Deep brain stimulation of two targets responsible for EEG desynchronization in WAG/Rij rats // FENS Featured Regional Meeting, Book of abstracts. 11-14 Sept 2013, Prague, Czech Republic. - P. 395.

7) Blik VA, Luttjohann A.K., Berdiev R.K., Chepurnova N.E., van Luijtelaar E.L.J.M. Deep brain stimulation of nucleus basalis of Meynert changes sleep-wake cycle in WAG/Rij rats // British Sleep Society 25th anniversary meeting. Book of abstracts. 17-19 October 2013, Edinburgh, Scotland. - Abstract 60.

Подписано в печать:

11.11.2013

Заказ № 9064 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 \vvvw.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Блик, Виталия Александровна, Москва

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Биологический факультет Кафедра физиологии человека и животных

На правах рукописи

04201450499

Блик Виталия Александровна

Изменение эпилептиформной активности мозга у крыс при электрической стимуляции подкорковых структур

03.03.01 - физиология

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

научный руководитель к. б. н., доцент Н.Е. Чепурнова

Москва-2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ........................................3

ВВЕДЕНИЕ.........................................................................................4

ЦЕЛЬ РАБОТЫ.................................................................................7

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ЗАДАЧИ.......................................................8

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................9

1.1 Эпилепсия.....................................................................................9

1.1.1 Классификация и механизмы эпилептических приступов

1.1.2 Фармакологическое лечение эпилепсии

1.1.3 Фармакорезистентность при эпилепсии

1.1.4 Абсансная эпилепсия

1.2. Нефармакологические методы лечения эпилепсии..............................25

1.2.1 Хирургическое лечение эпилепсии

1.2.2 Кетогенная диета при эпилепсии

1.2.3 Стимуляция блуждающего нерва (VNS)

1.2.4 Глубокая электрическая стимуляция мозга (DBS)

1.3. Регуляция сна и бодрствования.......................................................41

1.3.1 Структуры, участвующие в цикле сон-бодрствование

1.3.2 Механизмы регуляции цикла сон-бодрствование

1.3.3. Базальное ядро Мейнерта

1.3.4. Туберомаммиллярное ядро

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...................................................59

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ........................................68

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ............................................86

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.................................................................................98

ВЫВОДЫ.....................................................................................100

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................102

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АБ - активное бодрствование АЭП - антиэпилептический препарат МС - медленноволновой сон ПБ - пассивное бодрствование ПТЗ - пентилентетразол AN - переднее ядро таламуса

DBS - deep brain stimulation, глубокая стимуляция мозга NB - базальное ядро Мейнерта

REM - rapid eye movement, фаза быстрого движения глаз SNr - ретикулярная часть чёрной субстанции TMN - туберомаммиллярное ядро

ВВЕДЕНИЕ

Эпилепсия - одно из самых распространенных заболеваний нервной системы, которое представляет серьезную медицинскую и социальную проблему. Это хроническое заболевание головного мозга, характеризующееся повторными приступами с нарушением двигательных, чувствительных, вегетативных, мыслительных или психических функций, возникающими вследствие чрезмерных нейронных разрядов [Мухин и соавт., 2004]. Судорожные формы эпилепсии считаются наиболее тяжёлыми, так как связаны с высоким риском травматизации во время приступа и серьёзными нарушениями работы не только мозга, но и всех жизненно важных систем организма. Однако не меньшего внимания заслуживают бессудорожные (абсансные) эпилепсии. Во время абсансных приступов пациент внезапно замирает, взгляд кажется отсутствующим, иногда наблюдаются слабо выраженные действия автоматического характера. Хотя сама по себе болезнь не всегда сопровождается интеллектуальными нарушениями, абсансы могут мешать процессу обучения и социальной адаптации, вызывать ухудшение процессов обработки информации в мозге и могут привести к длительной потере сознания [Абрамович, 1965; Hughes, 2009].

Формы эпилепсии, при которых не удаётся снизить частоту и тяжесть приступов, нормализовать психическое состояние пациента с помощью традиционных лекарственных средств и их комбинаций, называются фармакорезистентными. Доля таких больных среди пациентов с эпилепсией составляет от 20% до 40%. Для больных фармакорезистентными формами эпилепсии в первую очередь имеет огромное значение разработка альтернативных способов лечения. Однако и в тех случаях, когда заболевание поддаётся фармакологическому контролю, побочные эффекты противоэпилептических препаратов зачастую ощутимо влияют на качество жизни пациента, особенно в условиях необходимости регулярного длительного приёма лекарства. Это объясняет повышенный интерес исследователей и

врачей к альтернативным методам лечения эпилепсии, позволяющим снизить тяжесть заболевания, улучшить состояние пациента, но при этом не вызывающим негативных последствий.

Модификация метода электрокоагуляции, применявшегося для точечного разрушения определённых мозговых структур при хирургическом лечении эпилепсии, привела к развитию нового направления - лечебной электрической стимуляции мозга. Механизмы её эффекта до конца не известны, но положительные результаты её применения в клинике указывают на перспективность этого способа лечения. В настоящее время активно исследуются проблемы, связанные с выбором структуры для стимуляции, параметров и схемы стимуляции. В связи с развитием компьютерной техники и микроэлектроники стало возможным использование имплантируемых стимуляторов, что открывает новые возможности для применения данного метода при лечении эпилепсии.

В качестве мишеней для электрической стимуляции используется целый ряд структур, однако клинические данные по эффективности стимуляции часто противоречивы. Наиболее обоснованно на данный момент можно говорить о положительном действии стимуляции переднего ядра таламуса, благодаря наличию результатов большого контролируемого исследования [Fisher et al., 2010]. Тем не менее, поиск новых эффективных мишеней продолжается.

Одним из возможных механизмов, обеспечивающих антиэпилептический эффект стимуляции некоторых структур, является их способность вызывать десинхронизацию ЭЭГ [Kerrigan et al., 2004; Nishida et al., 2007]. Поэтому в качестве мишеней для стимуляции нами были выбраны ядра, активность которых ассоциирована с инициацией и поддержанием состояний бодрствования и парадоксального сна, характеризующихся десинхронизацией мозговой активности, а именно, туберомаммиллярное ядро и базальное ядро Мейнерта. Ранее было показано, что стимуляция туберомаммиллярного ядра оказывает противоэпилептическое действие на модели судорожной эпилепсии у крыс, а базальное ядро Мейнерта вовлечено в патогенез абсансной эпилепсии, и

его активация может снижать количество и длительность приступов [Berdiev, van Luijtelaar, 2009; Nishida et al., 2007].

Ещё одной важной проблемой при использовании лечебной электростимуляции мозга является выбор режима стимуляции. Существует два основных алгоритма: при постоянной стимуляции стимулы подаются с определённой частотой, независимо от наличия приступа, а при стимуляции с обратной связью короткая пачка импульсов подаётся в ответ на появление на ЭЭГ пациента патологической активности, свидетельствующей о приближении или начале эпилептического приступа. В некоторых работах показана большая эффективность в подавлении эпилептической активности при использовании метода с обратной связью по сравнению с постоянной стимуляцией [Psatta, 1983; Rahman et al., 2010; Feddersen et al., 2007]. Этот метод также позволяет снизить время воздействия электрического тока на мозг и вероятность связанных со стимуляцией осложнений, а также экономит заряд батареи стимулятора, что очень важно при использовании имплантируемых устройств.

Хотя точные нейрональные механизмы действия лечебной электростимуляции ещё не определены, в целом можно сказать, что электрическая стимуляция отдельных областей мозга меняет активность структур, участвующих в генерации патологической активности, и подавляет развитие эпилептических приступов. Однако высока вероятность, что это влияние затронет и системы нормальной регуляции жизнедеятельности, например, цикл смены сна и бодрствования.

Таким образом, данная работа посвящена исследованию противоэпилептического действия электрической стимуляции нескольких подкорковых структур на моделях абсансной эпилепсии у животных, а также влиянию стимуляции мозга на такой важный для организма процесс, как регуляция цикла сон-бодрствование.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Исследовать изменения эпилептиформной активности абсансного типа у крыс при электрической стимуляции некоторых подкорковых структур мозга и их взаимосвязь с состояниями сна и бодрствования.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ЗАДАЧИ

1) Исследовать влияние постоянной электрической стимуляции базального ядра Мейнерта на эпилептиформную активность, вызванную введением малых доз ПТЗ, у крыс линии \\^Б1аг.

2) Изучить изменения спонтанной эпилептиформной активности и цикла сон-бодрствование при электической стимуляции базального ядра Мейнерта с обратной связью у крыс линии \¥АО/Ш].

3) Сравнить изменения эпилептиформной активности и цикла сон-бодрствование у крыс линии \УАО/Ш) при электрической стимуляции базального ядра Мейнерта и туберомаммиллярного ядра в постоянном режиме и в режиме с обратной связью.

4) Исследовать влияние электрической стимуляции переднего ядра таламуса и её совместного применения с этосуксимидом на эпилептиформную активность, вызванную введением малых доз ПТЗ, у крыс линии Wistar.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Эпилепсия

1.1.1 Классификация и механизмы эпилептических приступов

Эпилепсия - это хроническое заболевание головного мозга, характеризующееся повторными приступами с нарушением двигательных, чувствительных, вегетативных, мыслительных или психических функций, возникающими вследствие чрезмерных нейронных разрядов [Мухин и соавт., 2004].

Эпилепсии свойственна лёгкость формирования очагов патологической активности, образование вторичных и зеркальных фокусов. Поэтому характерным для этого заболевания является полиморфизм пароксизмов, обусловленный как разной интенсивностью возбуждения, исходящего из одного и того же эпилептического очага, так и одновременным сосуществованием нескольких очагов [Болдырев, 1976].

При классификации эпилептических припадков их разделяют, прежде всего, на фокальные и генерализованные. Генерация фокальных приступов происходит в результате изначальной активации нейронов ограниченной области одного полушария. При генерализованных приступах эпилептическая активность может возникать в какой-либо точке, но затем быстро распространяется на оба полушария, захватывая кору и подкорковые структуры. Фокальные припадки, согласно классификации ILAE (International League Against Epilepsy), принятой в 1981 году, разделяются на простые (с сохранением сознания) и сложные (с потерей сознания), однако в настоящее время ILAE предлагает отказаться от подобного деления, не основанного на известных механизмах возникновения этих приступов. Вместо этого рекомендуется индивидуально описывать фокальные приступы пациента с использованием признаков различной степени нарушений сознания [Lee, 2013].

Генерализованные приступы могут быть судорожными (миоклонические, клонические, тонические и тонико-клонические - grand mal) и бессудорожными (абсансы, petit mal). Если большому судорожному припадку предшествует аура, тогда он относится к вторично-генерализованным. Аура - это начальная фаза эпилептического припадка, возникающая до утраты сознания, о которой у больного остаётся воспоминание. Картины аур очень многообразны и зависят от локализации первичного очага. Аура может выражаться в форме неопределённого страха или других эмоциональных состояний, ощущений определённого запаха или вкуса, чувства жара, холода, озноба, а также в форме сложных галлюцинаций, переживаний «уже виденного» или «никогда не виденного» и т. д. [Абрамович, 1965].

Эпилептогенез связан с нарушением двух основных механизмов мозга: баланса возбуждающих и тормозных процессов на уровне нейронов и системной организации межнейронной активности, определяющей уровень локальной и общей временной и пространственной синхронизации работы нейронов. На уровне отдельных нейронов в основе эпилептогенеза лежит нестабильность потенциала покоя мембраны с тенденцией к избыточным деполяризационным сдвигам под влиянием афферентной импульсации или, возможно, спонтанным [Зенков и соавт., 2003]. Деятельность нейрона определяется как внешними, так и внутренними факторами. К «внешнему контролю» относятся ионная среда вокруг клетки, совокупность аксонных терминалей от других клеток, действие возбуждающего либо тормозного медиатора или нейропептидов, выполняющих медиаторную/комедиаторную функции. «Внутренний контроль» осуществляется благодаря свойствам мембраны сомы клетки и ее отростков, величине мембранного потенциала, системам вторичных мессенджеров, а также экспрессии генов субъединиц белков мембранных рецепторов, их синтезу и правильной сборке в структуры. При нарушениях механизмов внутреннего контроля нейроны могут образовать генератор эпилептической активности [Чепурнов, Чепурнова, 1997].

Определённый уровень синхронизации активности структур мозга является необходимым условием надёжности его функционирования. Но при дефектности тормозных механизмов на тот же объём афферентного притока мозговые системы реагируют синхронным ответом гораздо больших популяций нейронов. В свою очередь, генерируемые этими нейронами более массивные залпы обусловливают более массивные ответы нейронов последующих каскадов [Зенков и соавт., 2003].

Для эпилептогенеза существенны не только изменения, происходящие в нейронах, но и адаптивные изменения глиальных клеток. Глия регулирует ионные концентрации вокруг нейронов, а также участвует в транспорте нейромедиаторов. В астроцитах регистрируются осцилляции кальция. Кроме того, они могут выделять в межклеточное пространство глутамат [Чепурнов, Чепурнова, 1997].

Эпилептический очаг, образованный патологически активной группой «эпилептических» нейронов, индуцирует формирование эпилептической системы, т.е. вовлечение в эпилептический разряд определённых путей и образований мозга. Этот процесс похож на развитие экспериментальной киндлинг-эпилепсии, когда подпороговая химическая или электрическая стимуляция при многократном применении вызывает развитие полноценного приступа. При этом происходит изменение чувствительности нейронов медиаторных систем, снижается порог возбуждения, прежде всего путём повышения синаптической проводимости, и развивается вся гамма нарушений, результатом которых явлется эпилептизация нейронов [Шандра и соавт., 1999].

Важное значение для подавления активности эпилептической системы имеют механизмы, антагонистические по отношению к ней, которые образуют систему антиэпилептической защиты [Крыжановский и соавт., 1992]. К ней относятся мозжечок, каудальное ретикулярное ядро моста, хвостатое ядро, верхние бугорки четверохолмия, дорзальное ядро шва, голубое пятно. Функция антиэпилептической системы - предотвращение распространения и генерализации эпилептической активности. Фармакологическая или

электрическая активация этих структур приводит к подавлению эпилептической активности в различных экспериментальных моделях, в то время как их разрушение приводит к усилению пароксизмов.

1.1.2 Фармакологическое лечение эпилепсии

Традиционным способом лечения эпилепсии в настоящее время является лекарственная терапия. Существует множество различных антиэпилептических препаратов (АЭП), отличающихся по способу действия. При правильном подборе дозы используемого лекарства и рациональной политерапии возможно достичь большой эффективности в лечении заболевания или же полного выздоровления пациента.

Купировать эпилептические приступы химическими веществами впервые начали в конце XIX века. Для этого использовали бромид калия, и в течение долгого времени этот препарат оставался единственным эффективным средством. Бромид калия оказывал как противосудорожное, так и успокоительное действие. Если малые дозы оказывались неэффективными, то прибегали к большим дозам бромидов, при этом часто больные получали отравление бромом. Кроме того, при длительном применении и в больших дозах соли брома притупляют умственные способности и ухудшают память [Сепп и соавт., 1954]. Поэтому была очевидна необходимость в поиске новых препаратов для лечения эпилепсии.

Действие большинства используемых в настоящее время АЭП направлено либо на усиление тормозной активности (различные агонисты ГАМК и вещества, усиливающие обмен ГАМК), либо на снижение возбуждающей активности (антагонисты различных и Са-каналов)

головного мозга.

К препаратам, усиливающим тормозные процессы за счёт влияния на ГАМК-систему, относятся барбитураты, бензодиазепины, вальпроевая кислота и её соли. Противоэпилептические свойства барбитуратов были открыты в 1912

году. Их достоинством являлась высокая эффективность в малых дозах, по сравнению с бромидами, и барбитураты довольно быстро стали широко применяться для лечения эпилепсии. Механизм действия барбитурато