Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Инсерционный полиморфизм ALU ретроэлементов и его влияние на транскрипционную активность генов человека

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Инсерционный полиморфизм ALU ретроэлементов и его влияние на транскрипционную активность генов человека"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

UD3U59748

Институт биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова

На правах рукописи

АМОСОВА АННА ЛЕОНИДОВНА

ИНСЕРЦИОННЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ ALU РЕТРОЭЛЕМЕНТОВ И ЕГО ВЛИЯНИЕ НА ТРАНСКРИПЦИОННУЮ АКТИВНОСТЬ ГЕНОВ

ЧЕЛОВЕКА

03 00 03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 Ш 2007

Москва - 2007

003059748

Работа выполнена в лаборатории Сравнительной и функциональной геномики Института биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Научный руководитель

доктор биологических наук Ю Б Лебедев

Официальные оппоненты

Рубцов Петр Михайлович - доктор биологических наук, профессор, заведующий Лабораторией молекулярной эндокринологии Института молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН

Куприянова Наталья Сергеевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Отдела организации генома Института биологии геца РАН

Ведущая организация

Институт общей генетики им Н И Вавилова РАН (ИОГен)

Защита состоится 30 мая 2007 года в 10 часов на заседании специализированного совета Д 002 019 01 при Институте биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН по адресу 117997, ГСП-7, Москва, В-437, ул Миклухо-Маклая, 16-10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Автореферат разослан 30 апреля 2007 г

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность проблемы.

В последнее время достигнут значительный прогресс в определении нуклеотидных последовательностей геномов различных видов высших эукариотических организмов Анализ первичной структуры секвенированных геномов подтвердил предположение о том, что число генов у высших организмов различается не значительно и не зависит от морфологической сложности организмов Так, общее число генов для Н sapiens оценено как 32000 генов, 26000 - для М musculus, 18266 - для С elegans, 13338 - для D melanogaster Согласно другой общепринятой гипотезе, фенотипические различия между родственными видами и группами организмов определяются не столько разницей в количестве и составе кодирующих последовательностей, сколько различиями в системах регуляции экспрессии генов Поэтому изучение факторов, определяющих транскрипционную активность различных генов, является одной из фундаментальных задач современной молекулярной биологии Один из таких факторов - активность ретроэлементов - мобильных генетических элементов, способных к перемещениям внутри генома в процессе наследуемых ретротранспозиций К наиболее многочисленным и транспозиционно активным ретроэлементам геномов приматов относятся Alu повторы, составляющие около 13% генома человека Из них свыше 5000 специфичны для генома человека, а около 20% эволюционно недавних интеграции представителей молодых подсемейств AluY полиморфны в популяциях человека

Потенциальная возможность представителей AluY к размножению и к интеграции в генные области делает эти элементы наиболее перспективной моделью для изучения взаимодействия ретроэлементов с системами регуляции транскрипционной активности генов

В последние несколько лет активно обсуждаются возможные функциональные последствия интеграции Alu элементов За счет большой распространенности в геноме и высокой гомологии между собой, Alu элементы могут служить мишенями гомологичной рекомбинации - возможной причины нарушения структуры генов Интеграции Alu в интроны привносят дополнительные сайты сплайсинга, что способно приводить к образованию альтернативных продуктов Поскольку ретроэлементы подвергаются интенсивному метилированию, то внедрения новых Alu элементов могут менять профиль метилирования гена и участвовать в эпигенетической регуляции Кроме того, последовательность Alu содержит набор регуляторных

з

элементов, таких как промотор РНК-полимеразы III, сайт полиаденилирования, участки связывание рецепторов гормонов и других транскрипционных факторов Однако большинство существующих гипотез о функциональной роли Alu элементов носят достаточно общий характер Таким образом, подтверждение и уточнение механизмов влияния интеграций Alu элементов на активность различных генов человека in vivo остается одной из актуальных задач функциональной геномики, решение которых необходимо для понимания как функционирования генома человека в целом, так и отдельных генов, в частности

Цели и задачи работы.

Целью данной работы является исследование влияния ретроэлементов на транскрипционную активность генов человека, на примере диморфных интеграций Alu в интронах генов

Были поставлены следующие экспериментальные задачи

Провести полногеномный поиск полиморфных Alu-маркеров, расположенных в интронах генов человека

Определить аллельное состояние различных клеточных линий человека для обнаружения гетерозигот по инсерции Alu

Провести сравнительный анализ относительного количества несплайсированных транскриптов аллелей генов, отличающихся содержанием интронной инсерции Alu

Научная новизна и практическая ценность.

С использованием биоинформатических подходов и экспериментальных методов проведен исчерпывающий анализ геномного окружения известных и вновь идентифицированных диморфных инсерций AluY элементов Результаты анализа систематизированы в базе данных инсерционных полиморфизмов ретроэлементов, на основе которой создан интернет ресурс с возможностью поиска с заданными параметрами Данный ресурс предоставляет расширенные возможности конструирования молекулярно-генетических маркеров для фундаментальных и клинических исследований

Создан представительный набор молекулярно-генетических маркеров, на основе полиморфных интеграций Alu, расположенных в интронах генов человека, относящихся к различным функциональным группам Разработан метод мониторинга генотипов клеточных линий человека, использующий предложенный набор Alu маркеров, и показана его высокая информативность

Предложен новый метод сравнительного анализа уровня несплайсированных транскриптов аллельных вариантов генов, отличающихся инсерцией Alu в клеточных линиях человека Впервые показано, что инсерции Alu способны существенно снижать уровень или полностью подавлять транскрипцию Alu-содержащего (А1и+) аллеля в гетерозиготных клеточных линиях Эффект интеграции Alu на количество гетерогенной ядерной РНК (гяРНК) А1и+ аллеля в клетке выявлен для всех проанализированных генов, однако он проявляется не во всех клеточных линиях, что предполагает тканеспецифический характер обнаруженного эффекта Влияние инсерции Alu на уровень транскрипта не зависит от ориентации ретроэлемента относительно направления транскрипции гена, положения интеграции в гене и от принадлежности Alu элемента подсемейству AluYa5, AluYb8, AluYb9 или AluYcl Определено, что различия в степени влияния одной интеграции Alu на уровень транскрипции А1и+ аллеля в разных клеточных линиях не обусловлены структурными изменениями последовательности Alu элемента

Методом торможения в геле было показано образование ДНК-белковых комплексов как для Alu-содержащего, так и для Alu-несодержащего ДНК-фрагмента, причем профили связывания Alu-содержащего и Alu-несодержащего фрагментов в ряде случаев различаются

Предложенные подходы к оценке функциональной роли ретроэлементов применимы для широкого круга молекулярно-генетических исследований Полученные результаты расширяют существующие представления о Alu-ретроэлементах как о важных функциональных единицах генома, модулирующих активность многих генов человека

Структура диссертации.

Диссертация изложена на 97 листах машинописного текста и состоит из обзора литературы, результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 180 ссылок

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Создание представительного набора полиморфных Alu-маркеров, расположенных в нитронах генов.

Для создания представительного набора полиморфных маркеров был проведен биоинформатический поиск Alu повторов, для которых был ранее показан полиморфизм в популяциях человека, и экспериментальный полногеномный поиск полиморфных инсерций

Характеристика экспериментально идентифицированных Alu полиморфизмов Экспериментальный поиск проводился разработанным в нашей лаборатории, при непосредственном участии автора данной работы, методом, включающим в себя селективную амплификацию последовательностей, фланкирующих ретроэлемент, и последующую вычитающую гибридизацию полногеномных фракций ДНК индивидов В результате впервые был показан интеграционный полиморфизм для 41 инсерции Alu Ya5/8 в геноме человека, 18 из которых невозможно было выявить путем анализа опубликованных геномных баз данных Полиморфизм обнаруженных интеграций Alu был подтвержден результатами локус-специфических ПЦР на репрезентативных выборках этнически разнородных популяций Из 41 вновь обнаруженной полиморфной инсерции 12 Alu элементов локализованы непосредственно в интронах генов человека

Создание интернет базы данных полиморфныхретроэлементов По результатам исследования была создана электронная база данных, содержащая сведения об известных полиморфных интеграциях ретроэлементов, обнаруженных как в нашей лаборатории, так и другими авторами

В современном информационном пространстве существует большое количество баз данных, систематизирующих существующую информацию о полиморфизмах в геноме человека Подавляющее большинство таких ресурсов посвящено мононуклеотидному полиморфизму, однако встречаются и ресурсы, описывающие короткие прямые повторы или различные другие молекулярно-генетические маркеры Основным недостатком подавляющего большинства баз данных является отсутствие возможности поиска по большому числу заданных параметров Такие базы данных, как правило, не дают возможности конструировать молекулярно-генетические маркеры (МГМ), так как содержащейся в них информации недостаточно и требуется обращение к нескольким информационным ресурсам Созданный при выполнении

б

настоящей работы интернет ресурс представляет собой первый пример базы данных, позволяющей легко и быстро конструировать МГМ с заданными параметрами на основе инсерционного полиморфизма ретроэлементов. Такая возможность обеспечивается не только наличием необходимого набора данных в базе, но и возможностью поиска по большому количеству параметров, а также наличием перекрестных ссылок на другие базы данных, позволяющих дополнить результаты поиска. Интерфейс поиска по созданной базе данных представлен на рисунке 1.

База данных спроектирована с учетом возможных запросов широкого круга исследователей в области популяционной и медицинской генетики, а также сравнительной геномики человека. Разработан макет страницы интернет портала, позволяющий производить поиск в базе данных с заданными параметрами. Первая версия интернет ресурса с базой данных доступна по адресу http .-//www, tbch. ru/labcfs.

i^PRED Polymorphie Rtftroelcmcnts Ddtabaae Главная Поиск Ссылки

Параме1ры поиска Оэо&рздить а результатах

ю 1-1 | ш в частот* □

КЛАСС ><й| КЛАСС □ гдоймеры □

семейство ГЙГ Sil семейство а

хромогена Ii л! ЯВОХОСОННЫЙ .1:: - Y с В врвуэер UCSC в

accession 1 1 ecMSsitin Q Пбследовпельносгь □

близлежащие г«ны f "1 прямой повтор □

расгюло**ние бл№<Чи|И4 ГВИЬ I а

ориентация (жпол^хснне □ ссылка п

чветотя 1 «1 CPWrTlUMfl о

л Найти! [Очистить Выбрать все

Дгн куше* теле*« поиска нвойчодто имт*. успмг.ч п еттчтить пздпзттзд еьгдммкыв в (мйуътатв ПСЫКЙ. Рнг1ЬТ*Ш ГСВЛСТМЛЙЮТШ Б виде Г4ййЦЬ в КПИ^ЮК ПЯрНЯ нвйденнь* И базе ЙЕ, УАОЙГЙ ТВДЛСЧШЛ ПХКа, болве ПйДСйбиЛП О ДОЦЦН СЖТрЦЭЛВМЬТВ

ави^ктсв^г^тся в ртдетнон окне

Рисунок 1.

Страница поиска по базе данных полиморфных ретроэлементов.

Согласно разработанной структуре, каждая включенная в базу интеграция ретроэлементов (РЭ) имеет следующие характеристики: таксономическая информация (класс, семейство, подсемейство); информация о положении в геноме (хромосомная локализация, точные координаты на хромосоме, номер последовательности в базе данных МСВ1); информация о нуклеотидной последовательности (самого РЭ и коротких прямых повторов, образовавшихся в результате интеграции); описание молекуяярно-генетического маркера

(частота РЭТ аллеля в исследованных популяциях; структура ло кус-специфической пары олигонуклеотидных праймеров, условия проведения и ожидаемые результаты ПЦР-анализ а, ссылка на публикацию). Полная информация по каждому индивидуальному локусу выводится в отдельном окне (рисунок 2).

ftMH^i^jmwqcaag :D храмосекндй Блмздеш-ащНс уааюяайвж.чиья ййия ««рэр^^бовукр

1р22,1 TACSTD2 „ даыелоыя Stanford ucsc

cAiut'923?7fc9*i 1036.21 KIAAJCßfr

сМи\-25722767 1рЭ6.11 GftRPl * ^ антисньспмм* Stoftfocd UC5C 'после гвка

Уа5АГА5В9 1031. L иитрон ЗД&З

Нсшый поиск

го класс семейство 5Г№ AiuY»S

5tpQM0CO4»*i*i 1рэг.|

локус

веседоп AL035411

близлежащие тдгзтог

рвеполажетме 16 №

ориякгаций СП)С№№

частота IF

прдйгеры for: АТСАТT1GAATТАТСТТТ rev: TÜGGCTAQATGGACTCATCC

60

Рисунок 2.

11редставление результатов поиска с заданными параметрами по базе данных.

Кроме того, в базу данных включены интерактивные ссылки на браузер международной программы «Геном человека» Калифорнийского университета Санта-Круз (http¡//genome.ucsc.edu"). позволяющие получить более подробную информацию о геномном положении каждой полиморфной интеграции. Каждый предполагаемый иди известный ген, вблизи которого находится интеграция, также связан ссылкой с общедоступной базой данных SOURCE Стен форде ко]-о университета (http://source.stanford.edu"). содержащей подробную информацию о генах,

В ходе полногеномного поиска, проводимого с использованием экспериментальных к бноинформатических методов, было подробно охарактеризовано более тысячи полиморфных представителей эволюционно молодых подсемейств AluYaS, AluYa5a2, AIuYb8, AluYb9, AluYcl и A!uYc2. По результатам проведенного анализа сконструирован представительный набор моле кул яр но-генетических маркеров для дальнейших исследований.

Определение аллельного состояния клеточных линий по полиморфным интеграция« Alu.

По результатам анализа были отобраны 32 локуса, содержащие полиморфные интеграции Alu в нитронах различных генов человека. Для каждого локуса были подобраны и синтезированы пары уникальных геномных праймеров, фланкирующие сайт интеграции Alu. Для панели линий клеток человека было

определено аллельное состояние по присутствию/отсутствию Alu по всем выбранным л оку сам. Наличие Alu повтора в ДНК клеточной линии определялось методом локус-специфической ПЦР с фланкирующими инсерцию геномными прайм ерам и. Присутствие Alu" и Alu0 аляеля устанавливалось по длине получаемого ПЦР продукта. Схема эксперимента представлена на рисунке 3 (1). Пример электрофореза в агарозном геле ПЦР продуктов с праймерами для локуса MLS63 показан на рисунке 3 (2),

G-for

-й Alu I аааО

I

G-rev

ПЦР

G-for

AlU [ААА>-—" G-rev

G-for

G-tcv

Рисунок 3.

1) Схема локус-специфической ПЦР. Alu ретроэлемент обозначен белым прямоугольником. Расположение и ориентация уникальных геномных праймеров (G-for, G-rev) показана стрелками. Черные треугольники обозначают прямые повторы, образующиеся в результате регропозицни.

2) Электрофореграмма ПЦР анализа локуса ТМС5. Стрелками с Иран а показано положение Alu' и Alu' ПЦР-продуктов. Названия клеточных линий, ДНК которых использовалась в качестве матрицы ПЦР, показаны над злсктрофореграммой.

Результаты типирования для всех 11 клеточных линий представлены в таблице 1. Часть проанализированных л о кусов не показала полиморфизма в исследованных линиях клеток.

Каждая исследованная клеточная линия характеризуется уникальным распределением AI и-содержащих и AI и-не содержащих аллелей (таблица I).

Созданный нами набор полиморфных Alu маркеров может использоваться для генотипирования клеточных линий с различными фенотипами и различного тканевого происхождения.

Таблица I.

Результаты генотипирования клеточных линий.

Генотипы: «+1 - оба аллеля содержат Alu; «-» - оба аллеля не содержат Alu, «+ / -» - один аллель содержит интеграцию Alu, а другой нет.

Из использованных в анализе Alu инсерции, для 21 был обнаружен полиморфизм в используемой панели клеточных линий человека. Принимая, что диплоидная клетка может иметь 3 генотипа (+/+, +/- или -/-) и что все эти

to

генотипы равновероятны, мы получим, что для 21 диморфного локуса существует Ю10 (1/3"2') уникальных комбинаций генотипов Таким образом, вероятность того, что две различные клеточных линии будут иметь одинаковое распределение генотипов по всех локусам, крайне мала, и предложенный набор маркеров достаточно информативен, чтобы эффективно различать индивидуальные клеточные линии Большинство клеточных линий человека, особенно линий опухолевого происхождения, в течение культивации подвержены разного рода генетическим перестройкам, что влияет на биохимию, регуляцию и другие характерные черты Таким образом, необходимо периодически подтверждать генетическую идентичность образцов клеточной линии каким-либо стандартным тестом, и предложенный метод на основе использования полиморфных инте1раций Alu в качестве маркеров может успешно применяться для мониторинга генотипа клеточных линий

Сравнение относительного количества иесплайсированных транскриптов алелей генов, различающихся интроннон пнсерцией Alu.

Гетерозиготные по интеграции Alu клеточные линии являются перспективной моделью для изучения влияния недавних инсерций AluY на экспрессию генов, поскольку как Alu содержащий аллель (А1и+), так и Alu не содержащий аллель (Alu0) будут находиться в одинаковых условиях и одинаковом генном окружении, что позволяет с большой достоверностью утверждать, что предполагаемые различия обусловлены именно интеграцией Alu ретроэлемента Для анализа использовались клеточные линии человека различного тканевого происхождения (эпителиальные (Tera-1, Tera-2, НЕК293, HeLa, НТ1080, HepG2), лимфобластоидные (HL60, Jurkat), фибробластные (RMS-13, OsA-CL), нейробластная (NGP-127)) и гены с различными функциями и тканеспецифичностью экспрессии, что дает возможность экстраполировать получаемые результаты

Для определения относительного количества транскриптов обоих аллелей нами проводилась полуколичественная ОТ-ПЦР на матрице гетерогенной ядерной кДНК (гякДНК) клеточных линий, имеющих интронную интеграцию Alu в одном из аллелей гена Схема эксперимента изображена на рисунке 4 С целью наблюдения за динамикой накопления ОТ-ПЦР продукта через каждые три цикла амплификации, начиная с 24, из реакционной смеси отбирали аликвоты для последующего анализа методом электрофореза в агарозном геле

По количеству циклов, необходимых для появления видимого ОТ-ПЦР продукта, оценивали содержание соответствующей гяРНК Отношение числа

и

циклов, необходимых для появления видимого Aluü ОТ-ПЦР продукта, к числу циклов для А1и+ ОТ-ПЦР продукта, отражает относительное количество Alu0 и Alu+ гяРНК в клетке. В качестве примера на рисунке 4 приведена электрофоре грамм а ОТ-ПЦР продуктов, полученных при анализе гякДНК линии Jurkat с праймерами, фланкирующими инсерцию Alu в интронс гена ТМС5.

Рисунок 4.

1) Стратегия локус специфической ОТ-ПЦР.

На рисунке схематически изображена интеграция ретроэлемента в интроне гена. Расположение и ориентация уникальных геномных цраймеров (G-for, G-rev) обозначены стрелками, Белым прямоугольником показан Alu ретроэлемент. Пунктирными линиями и черными прямоугольниками даны нитроны и экзоны гетероядерной РНК (гяРНК).

2) Электрофореграмма ПЦР продуктов, синтезированных с праймерами к локусу ТМС5 на матрице гякДНК линии Jurkat. Цифрами показано количество циклов реакции. Отрицательный контроль (ОТ-). В качестве положительного контроля проводилась ПЦР на матрице геномной ДНК той же линии клеток (дорожка ДНК).

Результаты ОТ-ПЦР анализа гякДНК аллельных пар всех изученных генов суммированы в таблице 2,

-а t 3 1 щ л о. g к х 3 ез X S Я С- С X с & X X Клеточные линии

35 ел о* ^ EU Я а CS 1 X J V X Jurkal 1 £ "NGP-127 RMS-13 о л = OsA-CL о W о Ё X

M1.S48 ais 3/22 ACTG2 >39/>39 >39i>39 >39/>35

Ь8-120 a/s 1/12 SLC25AJ8 *39/>39 >39/>39 >39M9 >39:>19

Ь8-157 s 18/30 NRPI >39/>39

№-30 s 11/16 SYT17 >39/> 39

MLSI4 a/s 4/60 HUS1 >39/>39 >39/>39

MLS18 a/s S/5 LUZP2 >39/>3$

а5-216 ais 7/30 AMPH ?39/>39 >39/>Э9

а5-210 s 4/16 SEMA3A >39Л>39 =■39^39

b 8-2 30 a/s 3/55 TSC2 >19/>39

MLS36 ais 11/35 PHF2/A

ье-106 a/s 11/34 DSCÄM >39/=-39 >39M9

MLSlt a/s 25/42 MY05C

MUS 19 a/s 40/70 LAMA 2 >39/>39 Ж Ж

MLS41 a/s 7/10 ZFPM2 ^39/>39 >39fr35 >39/>39 :-39j>39

Ь8-148 s 10/12 TSHR Ш 36/36 Ш >39A-39

MLS26 a/s 12/19 ШЮР ш

MLS34 27/30 RPC2 >№>39 >39£>39 »39/>39

MLS63 a/s 7/33 TMCS 1

с 1-63 $ 17/25 ШРЗК? »39/>3S - 36/3 ь

MLS70 a/s 4/53 COL4A2 >39M9 >39,->39 >39i>3S EB >39/>39 я

а5-148 s 8/53 R.PN2 EU ШШ

Таблица 2.

Относительный уровень транскрипции Alu0 и Alu+ аллеля в гетерозиготных линиях клеток. Цифрами обозначено число циклов, необходимых для появления видимого количества соответствующего ГТЦР продукта, «>39» означает, что А1и+ транскрипт не детектируется. Случаи, когда наблюдалось различие в экспрессии аллелей, отмечены цветом.

В большинстве случаев (таблица 2), когда детектировалась транскрипция, ОТ-ПЦР продукт с Alu+ аллеля в гетерозиготной клетке появлялся на 3-9 циклов позже, чем с Aluu аллеля. Число циклов ПЦР, необходимое для накопления видимого количества ПЦР продукта, различается для разных клеточных линий, что отражает тканеспеиифичность экспрессии рассматриваемых генов.

Для исключения возможных артефактов, связанных с перестройками в геноме клеточных линий и различной эффективностью амплификации разных аллелей^ нами проводилась также полуколичественная ПЦР на матрице

геномной ДНК исследуемых клеточных линий Различие в транскрипции можно оценить через отношение NAiu°/Naiu+ для геномной ДНК и гякДНК, где NAiu+ и Naiuo соответствует количеству циклов ПЦР необходимых для появления видимого продукта AliT и Alu0 аллелей, соответственно Например, NA1U=/NA|U+ отношение циклов появления ПЦР продуктов для геномной ДНК линии Jurkat по локусу MLS63 - 27/27, а на матрице соответствующей гякДНК - 33/36 Это позволяет утверждать, что уровень первичного транскрипта А1и+ аллеля гена ТМС5 в линии клеток Jurkat ниже, чем Alu0 аллеля Результаты подобного сравнения для аллелей ряда генов суммированы в таблице 3 В ряде клеточных линий содержание А1и+ аллеля транскрипта значительно (до трех порядков) снижено, тогда как обратной ситуации не наблюдалось ни в одном случае

Ген (локус) Клеточная линия Отношение числа циклов (Na)u°/Na]u+) 3 Alu°/Alu+b

НТ1080 ДНК 24/24 1

RPN2 гякДНК 27/>39 8192s

(а5-148) OsA-CL ДНК 24/24 1

гякДНК 30/>39 1024 £

RMS-13 ДНК 21/21 1

COL4A2 гякДНК 30/>39 1024 £

(MLS70) НТ1080 ДНК 24/24 1

гякДНК 30/>39 1024 ~

Jurkat ДНК 21/21 1

гякДНК 36/36 1

МАРЗК7 RMS13 ДНК 24/24 1

(cl-63) гякДНК 30/33 8

OsA-CL ДНК 24/24 1

гякДНК 33/>39 128 £

RPC2 HL60 ДНК 24/24 1

(MLS34) гякДНК 30/>39 1024£

Таблица 3

- Отношение числа циклов, необходимых для появления видимого количества ПЦР продукта Nai„+ - число циклов для образования видимого количества А1и+ ПРЦ продукта, NAiu° - число циклов для образования видимого количества Alu0 ПЦР продукта

ь Отношения количества транскриптов гена Alu°/Alu+ = 2"/2m, где п - число циклов необходимое для образования видимого количества Alu0 ПЦР продукта (Naiu°). m - число циклов необходимое для образования видимого количества А1и+ ПЦР продукта (Naiu+) s Alu ПЦР продукт не обнаруживается В этом случае предполагается, что количество соответствующего транскрипта настолько мало, что не обнаруживается методом ОТ-ПЦР, и составляет менее 1 мочекулы на клетку

Влияние интеграции Alu на уровень первичного транскрипта А1и+ и А1и° аллелей каждого отдельного гена не во всех клеточных линиях проявляется одинаково Большинство изученных генов можно разделить на 3 группы в зависимости от содержания транскриптов А1и+ и Alu0 аллелей в проанализированных клеточных линиях В первую группу входят ACTG2, SLC25A18, NRPJ, SYT17, HUS1, LUZP2, AMPH, SEM A3 А, TSC2, PHF21A и DSCAM гены, которые не транскрибируются или транскрибируются на крайне низком уровне в проанализированных линиях клеток Эти гены, таким образом, исключены из дальнейшего рассмотрения Другая группа генов, таких как MY05C, LAMA2, ТМС5, TSHR или MYRIP, показывает почти одинаковое изменение транскрипции во все гетерозиготных линиях клеток Присутствие последовательности AluY в интронах этих генов приводит к небольшому уменьшению уровня первичного транскрипта А1и+ аллеля Единственное исключение составляет ген TSHR, у которого А1и+ и Alu0 аллели транскрибируются на одном уровне в линии клеток HeLa Ген МАРЗК7 также может быть отнесен к этой группе, поскольку для него наблюдается небольшой эффект интеграции на транскрипцию А1и+ аллеля, однако этот эффект меняется в зависимости от клеточной линии от отсутствия вчияния в линии клеток Jurkat, до полного отсутствия транскрипта А1и+ аллеля в линии OsA К последней, третьей группе можно отнести гены, которые демонстрируют выраженную тканеспецифичность экспрессии (ZFPM2, RPC2, COL4A2 и RPN2) Эти гены экспрессируются только в одной или двух из проанализированных клеточных линий Влияние интеграции Alu для таких генов особенно выражено, поскольку в гетерозиготных линиях клеток Alu0 аллель транскрибируется на относительно высоком уровне (сравнимом с уровнем экспрессии некоторых генов клеточного хозяйства), а экспрессия А1и+ аллеля не детектируется вовсе

Разнообразие характеристик исследованных локусов (таблица 2) дает основание считать, что влияние инсерции Alu на уровень транскрипта не зависит от принадлежности индивидуальной последовательности Alu элемента к подсемейству AluYa5, AluYb8, AluYb9 или AluYcl, ориентации ретроэлемента относительно направления транскрипции гена и положения интеграции в гене

Таким образом, в настоящей работе впервые показано, что содержание гяРНК Alu-содержащего аллеля гена ниже, чем Alu-несодержащего аллеля того же гена в одной и той же клеточной линии, и этот эффект носит тканеспецифический характер По-видимому, снижение уровня

несплайсированного Alu+ транскрипта обусловлено именно присутствием Alu в интроне аллеля гена

Анализ возможных причин сниження уровня транскрнпта Alu-содержащего аллеля генов человека.

Для выяснения причин уменьшения количества Alu-содержащих транскриптов генов в гетерозиготных линиях клеток, было предложено несколько гипотез Одной из возможных причин обнаруженного эффекта может являться изменения в нуклеотидной последовательности индивидуальных интеграции Alu в различных клеточных линиях Другой вероятной причиной наблюдаемых различий в уровне транскрипции может являться привнесение или, наоборот, разрушение интеграцией Alu существующих сайтов связывания специфических белковых факторов Также снижения количества Alu-содержащего транскрипта может происходить из-за преждевременной терминации гяРНК на стадии транскрипции

Сравнительно-структурный анализ нуклеотидных последовательностей Alu элементов, проявляющих различную степень влияния на уровень экспрессии в разных клеточных линиях

Из результатов, представленных в таблице 2, следует, что локусы с 1-63 и Ь8-148 обнаруживают различную степень влияния интеграции Alu на экспрессию Alu-содержащего аллеля в разных клеточных линиях от отсутствия влияния в линиях клеток Jurkat и HeLa, до полного подавления транскрипции AIu+ аллеля в OsA-CL и NGP-127, для локусов с 1-63 и Ь8-148 соответственно Одной из возможных причин обнаруженного эффекта может являться изменения в первичной последовательности индивидуальных интеграции Alu в различных клеточных линиях Для проверки этой гипотезы была определена нуклеотидная последовательность индивидуальных инсерций Alu в линиях клеток Jurkat и OsA-CL для локуса с 1-63 и HeLa и NGP-127 для локуса Ь8-148 Нуклеотидные последовательности Alu-элементов, оказывающих и не оказывающих влияние на транскрипцию исследуемых локусов, оказались идентичны

Анализ связывания исследуемых локусов с ядерными белками Другой вероятной причиной наблюдаемых различий в уровне транскрипции аллелей может являться привнесение или, наоборот, разрушение интеграцией Alu существующих сайтов связывания ядерных белков Для исследования взаимодействия белковых факторов с Alu-содержащими и с Alu-

несодержащими ДНК фрагментами были отобраны те J! о кусы и клеточные линии, где различия в транскрипции аллелей были наиболее значимыми или проявлялась тканеспецифичность влияния инсерции Alu.

Исследование взаимодействия ДНК последовательностей с ядерными белками проводилось методом торможения в геле (Mobility Shift Assay). Принцип метода основан на разнице а элехтрофоретических подвижностях фрагмента ДИК и комплекса ДНК с белком. Пример полученных радиоавтографов приведен на рисунке 5.

Введение радиоактивной метки в исследуемые ДНК фрагменты проводилось таким образом, что удельная радиоактивность Alu0 и AIu+ П1ДР продуктов была одинаковой, что позволяло сравнивать интенсивность связывания с белковыми факторами для обоих фрагментов.

4» & Р & я? 0

d у// .</ ууу

^ sHPft

ш ш

tr

■ в

Рисунок 5.

Связывание ПЦР продуктов локуса МЬЭ26 (МУШР) с ядерным экстрактом линии клеток НТЮ80. Вверху показана концентрация по белку ядерного экстракта, используемого в связывании.

Методом торможения в геле было показано образование ДНК-белковых комплексов как АКьсодержащими, так и А1 и-несо держ ащим и ДНК-фрагментами, причем профили связывания белковых факторов для А1и-содержащего и А1и-несодержащего фрагментов различаются в ряде случаев. По результатам анализа полученных радиоавтографов была определена относительная подвижность (Я/) выявленных ДНК-белковых комплексов. Значения Л/'приведены в таблице 4.

MLS63 Ь8-148 MLS26 MLS26 с 1-63 MLS41 MLS41

HeLa HeLa Jurkat HT1080 OsA-CL Jurkat HT1080

Alu Alu+ Alu Alu+ Alu Alu Alu Alu+ Alu Alu+ Alu Alu" Alu Alu+

0 08 0 07 0 04 0 1

0 13 0 13

0 14 0 14

0 18 0 18 0 16 0 18

0 22 0 21 0 21 0 25 0 21 0 21 0 25 0 25 02 0 23

0 28 0 26 0 28 0 28 0 28 0 29

0 39 0 39 041 0 41

0 57

0 72 0 76

08 08

0 82 0 88 0 88 0 86

Таблица 4

Относительная подвижность ДНК-белковых комплексов

В верхней строке таблицы приведены названия локусов и источник ядерного экстракта

Можно отметить, что на радиоавтографах наблюдаются ДНК-белковые комплексы, характерные только для А1и+ фрагментов ДНК, например, с Rf = 0,41 для линии клеток НТ1080, и с Rf= 0,39 для HeLa Высокомолекулярный комплекс с Rf порядка 0,07 образуется для нескольких линий клеток Образование подобных комплексов, возможно, обусловлено взаимодействием специфических Alu-связывающих белков или их комплексов с последовательностью Alu Связывание белковых факторов с Alu элементом может являться одной из причин снижения количества гяРНК А1и+ аллеля гена Например, связывание регуляторов транскрипции способно напрямую изменять активность транскрипционного комплекса РНК-полимеразы II, а связывание белков, взаимодействующих с последовательностью Alu, может создавать механическое препятствие для продвижения транскрипционного комплекса, что, возможно, приводит к его замедлению вплоть до полного прекращения транскрипции и образования укороченного транскрипта С другой стороны, внедрение Alu способно нарушать существующие сайты связывания специфических белков, что также может негативно сказаться на уровне Alu-содержащего транскрипта Можно видеть, что в ряде случаев белок образует комплекс с Alu-несодержащим фрагментом, тогда как с Alu-содержащим фрагментом комплекс с тем же значением Rf не образуется Например, Rf= 0,16 и Rf= 0,57 для фрагмента ДНК MLS26 в линии клеток НТ1080

Также наблюдались комплексы, характерные только для одного локуса, независимо от присутствия Alu, такие как Rf= 0,8 для фрагмента ДНК cl-63 и Rf = 0,14 в случае MLS63 Вероятно, в этом случае связывание белка происходит со специфической последовательность, находящейся во фланкирующей Alu ДНК и присутствующей в обеих аллелях гена

Оценка размеров интронного Alu элемента в составе гякДНК Возможной причиной снижения количества Alu-содержащего транскрипта может быть преждевременный обрыв гяРНК на стадии транскрипции Прерывание транскрипции РНК полимеразой II может происходить по нескольким причинам прекращение транскрипции на АТ-богатых участках Alu элемента, остановка транскрипционного комплекса на участках последовательности Alu, образующих комплекс с белковыми факторами или входящими в состав вторичных структур Для проверки этой гипотезы были выбраны локусы и клетки, для которых транскрипция Alu-несодержащего аллеля детектировалась на достаточно высоком уровне, а Alu-содержащий транскрипт не обнаруживался

Предполагаемую точку обрыва транскрипции определяли по результатам серии ОТ-ПЦР, проводимой с уникальным геномным и каждым из набора Alu Y-специфических праймеров Схема эксперимента приведена на рисунке 6 В данном случае, дискриминацию транскриптов (гякДНК) двух алчелей проводили не по длине, а по наличию ПЦР-продукта, образуемого с Alu-специфических праймеров AY1, AY2, AY3 и AY4 Причем, образование полной серии G-for/AY ПЦР продуктов соответствует наличию полноразмерного ретроэлемента в составе транскрипта А1и+ аллеля, а отсутствие одного или нескольких ПЦР продуктов серии позволяет локализовать район предполагаемого обрыва транскрипции по известному положению соответствующих AY праймеров

Результаты предложенного ПЦР-анализа локуса MLS70 клеточной линии НТ1080 придставлены на рисунке 7 Как это видно из приведенной электрофореграммы, образование специфических ПЦР продуктов Alu-содержащего аллеля наблюдается при использовании всех 4-х AY праймеров (дорожки 2, 4, 6 и 8), но не праймера G-rev (дорожка 10) В тоже время, количества G-for/AY ПЦР продуктов А1и+ аллеля сравнимы с количеством G-for/G-rev продукта Alu0 аллеля (дорожка 10) Полученные результаты позволяют предположить, что транскрипция А1и+-аллеля прекращается между участками COL4A2 гена, комплиментарными ближайшему к началу Alu

элемента А1иУ-специфическому праймеру АУ1 и геномному праймеру О-геу Подобный анализ локусов МЬ826, МЬ841 (линия НТ1080) и с1-63 (линия ОэА-СЬ) не выявил образования укороченного транскрипта А1и+ аллеля

Рг

п

т^п. гёхЛ-—i t*- ( □ х днк

Транскрипция

•------1 Kxl I 1 Ex« I-........ЧТТТ| AluYa/s V '

И

—--I Exl I i Ex, 1-........-4......-1 Ех„*. ( Q-------ААА

гяРНК

Синтез первых цепей

. G-for

Ж2 \ ЕЖ1 F=-<ТТТ| AhlY a/s_ V __

AY4 AY3 AY2 AY1 G-reV

И гякДНК

£Го,

17П 1 ex, ^—«-;г{1Ж117 О-ААА

G-rev

/

ПЦР

G-for / G-rev

\ПЦР

G-for /AY

G-for

(¿•fo

G-rev

G-for

S:for

(¿-fo

-<TTT|—|

AY4 HTTTj

чттт|

-<П I '

Рисунок 6

Схема поиска возможной точки преждевременной остановки транскрипции Alu-содержащего аллеля 1ена Alu ретроэлемент (в антисмысловой ориентации относительно направления транскрипции гена) обозначен белым прямоугольником Расположение и ориентация уникальных геномных праймеров (G-for, G-rev) и AluY-специфических праймеров (AY) показаны стрелками Черные треугольники обозначают прямые повторы, образующиеся в результате ретропозиции

G-for

——-<ттт] "ÄjuY MLS7Ü .......Ц—1 F.xS |-} Ex 6 |—

AY4 AV3 AY2 AY1

/ / / / / / / / / r / У ж Ж ж

% 4 ❖ 4 Ф 4 ❖ 4 4 ф 4? ^ ^

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Рисунок 7,

1. Схема локуса MLS70. Расположение н ориентация уникальных геномных и Alu-специфических праимеров показано стрелками.

2. Электрофоре грамма разделения продуктов ПЦР реакции для локуса MLS70 на матрице гякДНК (ОТ+) клеточной линии НТ1080. В качестве положительного контроля проводилась ПЦР на матрице геномной ДНК. Сверху обозначены используемые прайм еры и матрицы. Расположение ПЦР-продуктов ожидаемой длины, образующихся с Alu -аллеля, отмечено черными треугольниками, а образующихся с Alu -аллеля - белыми треугольниками. Внизу обозначены номера дорожек.

Различия в результатах проведенного анализа служат указанием на существование различных механизмов, приводящих к снижению транскрипции А1и-содержащего аллеля того или иного локуса.

выводы

1) По результатам полногеномного экспериментального сравнительного анализа и биоинформатического поиска создана интернет база данных, содержащая сведения об известных на настоящий момент полиморфных интеграциях ретроэлементов Сконструирован представительный набор молекулярно-генетических маркеров, представленный 32 полиморфными интеграциями Alu в интронах различных генов человека

2) Разработан метод полуколичественной ОТ-ПЦР для сравнения уровня транскрипции аллельных вариантов генов человека Проведен анализ количества транскриптов Alu-содержащего и Alu-несодержащего аллелей в 11 клеточных линиях Из 19 локусов для 12-ти было показано различие в уровне транскрипции аллелей Выявлен ингибирующий эффект интеграции Alu на содержание транскрипта А1и+ аллеля гена и показана тканеспецифичность проявления обнаруженного эффекта

3) Показано, что в исследованной выборке ингибирующий эффект интронных инсерций Alu не зависит от принадлежности Alu элемента к филогенетической группе AluY повторов, ориентации ретроэлемента относительно направления транскрипции гена, положения интеграции в гене и нуклеотидной последовательности индивидуального Alu элемента

4) Методом торможения в геле показано различие в профилях связывания Alu-содержащих фрагментов в сравнении с Alu-несодержащими фрагментами ДНК с ядерных белков клеточных линий

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

Статьи:

Mamedov I Z, Arzumanyan Е S , Amosova A L , Lebedev Y. В , Sverdlov Е D (2005) Whole-genome experimental identification of insertion/deletion polymorphisms of interspersed repeats by a new general approach. Nucleic Acids Res, 33(2), el6

Ustyugova S V , Amosova A L , Lebedev Y В , Sverdlov E D (2005) Cell line fingerprinting using retroelement insertion polymorphism. BioTechmques, 38 (4), 561-565

Устюгова С В, Амосова A JI, Лебедев Ю Б, Свердлов Е Д (2006) Тканеспецифическое снижение уровня пре-мРНК L1- и Alu-содержащих аллелей генов человека. Биоорганическая химия, 32 (1), 103-106

Lebedev Y В, Amosova A L, Mamedov I Z, Fisunov G Y, Sverdlov E D (2007) Most recent AluY insertions in human gene introns reduce the content of the primary transcripts in a cell type specific manner. Gene, 390 (2007), 122-129

Опубликованные тезисы конференций:

Mamedov 1 Z , Arzumanyan E S , Amosova A L , Lebedev Y В , Sverdlov E D "Alu insertion polymorphism to study russian populations". "Retrotransposons and genome evolution", 2nd International workshop, Sochi, Russia, 20-22 April 2003, стр 23

Ustyugova S V , Buzdm A A , Gogvadze E V , Amosova A L, Lebedev Y В , Sverdlov E D "Differences in LI integration and their application to cell line genotyping". International workshop on encoding information in DNA sequences, Okinawa, Japan, 21-27 February 2005, стр 196

Ustyugova S V, Amosova A L , Lebedev Y В , Sverdlov E D "Retroelement insertion polymorphism in cell line identification." 1st FEBS Advanced Lecture Course "System biology from molecules & modelmg to cells", Austria, Gosau, 1218 March 2005, стр 171

Устюгова С В , Амосова A JI, Лебедев Ю Б , Свердлов Е Д «Использование инсерционного полиморфизма ретроэлементов для генотипирования клеточных линий». XVII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» Москва, Россия, 7-10 февраля 2005, стр 24

Амосова A JI, Устюгова С В , Лебедев Ю Б , Свердлов Е Д «Использование инсерционного полиморфизма ретроэлементов для генотипирования клеточных линий». VI Международная конференция «Молекулярная генетика соматических клеток» Звенигород, Россия, 12-16 декабря 2005, стр 85

Mamedov I Z, Amosova A L , Arzumanyan Е S , Lebedev Y В , Sverdlov Е D "New approach for whole-genome identification of interspersed repeats insertional polymorphisms". European Human Genetics Conference, Amsterdam, Netherlands, 6-9 May 2006, стр 368

Устюгова С В, Амосова А Л, Лебедев Ю Б, Свердлов Е Д «LINE1 -длинные диспергированные повторы: распространение в геноме и возможное влияние на экспрессию генов человека». VIII чтения, посвященные памяти академика Ю А Овчинникова Москва-Пущино, Россия, 25-27 октября 2006, стр 39

Подписано в печать 25 04 2007 г Исполнено 26 04 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 481 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМА Г» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Амосова, Анна Леонидовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ALU РЕТРОЭЛМЕНТОВ И ГЕНОМА

ЧЕЛОВЕКА. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Введение

1.1 Структура и амплификация Alu-ретроэлементов

1.2 Классификация Alu-ретроэлементов

1.3 Взаимодействие Alu-ретроэлементов и генома человека

1.3.1 Транскрипция Alu-ретроэлементов с собственного промотора способна влиять на транскрипцию близлежащих генов

1.3.2 Образование А1и-элементами вторичных структур меняет уровень транскрипции генов человека

1.3.3 Последовательность Alu способна определять структуру хроматина

1.3.4 Транспозиционная активность Alu-повторов - источник инсерционного мутагенеза в геноме человека

1.3.5 Последовательность Alu содержит сайты связывания целого ряда регуляторов транскрипции

1.3.6 Интеграции Alu в интроны способны приводить к нарушению нормального сплайсинга гена

1.3.7 Длинные поли(Т) последовательности интронных интеграций Alu вызывают образование укороченного транскрипта

1.3.8 Метилирование CpG динуклеотидов в составе А1и-последователъности влияет на экспрессию как отдельных генов, так и обуславливает полногеномный импринтинг

1.3.9 Редактирование РНК Alu-повторов

1.3.10 Транскрипты Alu-элементов способны оказывать влияние на трансляцию белков

1.3.11 Рекомбинация между А1и-ретротранспозонами может являться причиной локальных и обширных перестроек в геноме человека

ГЛАВА II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1 Материалы

2.2 Методы

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

3.1 Создание представительного набора полиморфных Alu-маркеров, расположенных в интронах генов

3.1.1 Характеристика экспериментально идентифицированных Alu полиморфизмов

3.1.2 Создание интернет базы данных полиморфныхретроэлементов

3.2 Определение аллельного состояния клеточных линий по полиморфным интеграциям Alu

3.3 Сравнение относительного количества несплайсированных транскриптов аллелей генов, различающихся интронной инсерцией Alu

3.4 Анализ возможных причин снижения уровня транскрипта Alu-содержащего аллеля генов человека

3.4.1 Сравнительно-структурный анализ нуклеотидных последовательностей Alu элементов, проявляющих различную степень влияния на уровень экспрессии в разных клеточных линиях

3.4.2 Анализ связывания исследуемых локусов с ядерными белками

3.4.3 Оценка размеров интронного Alu элемента в составе гякДНК

Введение Диссертация по биологии, на тему "Инсерционный полиморфизм ALU ретроэлементов и его влияние на транскрипционную активность генов человека"

В последнее время достигнут значительный прогресс в определении нуклеотидных последовательностей геномов различных видов высших эукариотических организмов. Анализ первичной структуры сиквенированных геномов подтвердил предположение о том, что число генов у высших организмов различается не значительно и не зависит от морфологической сложности организмов. Так, общее число генов для Н. sapiens оценено как 32000 генов, 26000 - для М. musculus, 18266 -для С. elegans, 13338 - для D. melanogaster. Согласно другой общепринятой гипотезе, фенотипические различия между родственными видами и группами организмов определяются не столько разницей в количестве и составе кодирующих последовательностей, сколько различиями в системах регуляции экспрессии генов. Поэтому изучение факторов, определяющих транскрипционную активность различных генов, является одной из фундаментальных задач современной молекулярной биологии. Один из таких факторов - активность ретроэлементов -мобильных генетических элементов, способных к перемещениям внутри генома в процессе наследуемых ретротранспозиций. К наиболее многочисленным и транспозиционно активным ретроэлементам геномов приматов относятся Alu повторы, составляющие около 13% генома человека. Из них свыше 5000 специфичны для генома человека, а около 20% эволюционно недавних интеграций представителей молодых подсемейств AluY полиморфны в популяциях человека.

Потенциальная возможность представителей AluY к размножению и к интеграции в генные области делает эти элементы наиболее перспективной моделью для изучения взаимодействия ретроэлементов с системами регуляции транскрипционной активности генов.

В последние несколько лет активно обсуждаются возможные функциональные последствия интеграций Alu элементов. За счет большой распространенности в геноме и высокой гомологии между собой, Alu элементы могут служить мишенями гомологичной рекомбинации - возможной причины нарушения структуры генов. Интеграции Alu в интроны привносят дополнительные сайты сплайсинга, что способно приводить к образованию альтернативных продуктов. Поскольку ретроэлементы подвергаются интенсивному метилированию, то внедрения новых Alu элементов могут менять профиль метилирования гена и участвовать в эпигенетической регуляции. Кроме того, последовательность Alu содержит набор регуляторных элементов, таких как промотор РНК-полимеразы III, сайт полиаденилирования, участки связывание рецепторов гормонов и других транскрипционных факторов. Однако большинство существующих гипотез о функциональной роли Alu элементов носят достаточно общий характер. Таким образом, подтверждение и уточнение механизмов влияния интеграций Alu элементов на активность различных генов человека in vivo остается одной из актуальных задач функциональной геномики, решение которых необходимо для понимания как функционирования генома человека в целом, так и отдельных генов, в частности.

Цели и задачи работы:

Целью данной работы является исследование влияния ретроэлементов на транскрипционную активность генов человека, на примере диморфных интеграций Alu в интронах генов.

Были поставлены следующие экспериментальные задачи:

Провести полногеномный поиск полиморфных Alu-маркеров, расположенных в интронах генов человека.

Определить аллельное состояние различных клеточных линий человека для обнаружения гетерозигот по инсерции Alu.

Провести сравнительный анализ относительного количества несплайсированных транскриптов аллелей генов, отличающихся содержанием интронной инсерции Alu.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Амосова, Анна Леонидовна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящая работа является одной из первых попыток проведения систематического анализа функциональных взаимодействий полиморфных инсерций Alu ретроэлементов с системами регуляции экспрессии генов человека.

Создание базы данных, включающей все известные на данный момент полиморфные интеграции ретроэлементов, позволило создать наиболее полную выборку расположенных в интронах генов человека Alu элементов. Благодаря предложеному полногеномному подходу и использованию в качестве модели для исследования гетерозиготных линий клеток человека, был открыт функциональный эффект полиморфных интеграций Alu ретротранспозонов на уровень транскрипции генов, независимо от их систематической принадлежности и расположения. Во всех случаях, когда наблюдалось различие в экспрессии аллелей, происходило снижение уровня несплайсированного транскрипта содержащего внедрение Alu, что указывает на то, что негативный эффект интеграции связан именно с присутствием ретроэлемента. Экспрессия гена - сложный, многостадийный процесс, и зависимость проявления обнаруженного эффекта от типа клеток предполагает существование тканеспецифических факторов, модулирующих влияние последовательности Alu.

Полученные в настоящей работе данные свидетельствуют о том, что целый ряд недавно интегрировавших в геном ретроэлементов способен in vivo изменять систему регуляции экспрессии окружающих генов. Таким образом, новые данные и методические разработки могут служить основой для дальнейшего изучения роли различных классов ретроэлементов в функционировании генома человека.

По результатам полногеномного экспериментального сравнительного анализа и биоинформатического поиска создана интернет база данных, содержащая сведения об известных на настоящий момент полиморфных интеграциях ретроэлементов. Сконструирован представительный набор молекулярно-генетических маркеров, представленный 32 полиморфными интеграциями Alu в интронах различных генов человека.

Разработан метод полуколичественной ОТ-ПЦР для сравнения уровня транскрипции аллельных вариантов генов человека. Проведен анализ количества транскриптов Alu-содержащего и Alu-несодержащего аллелей в И клеточных линиях. Из 19 локусов для 12-ти было показано различие в уровне транскрипции аллелей. Выявлен ингибирующий эффект интеграции Alu на содержание транскрипта А1и+ аллеля гена и показана тканеспецифичность проявления обнаруженного эффекта. Показано, что в исследованной выборке ингибирующий эффект интронных инсерций Alu не зависит от принадлежности Alu элемента к филогенетической группе AluY повторов, ориентации ретроэлемента относительно направления транскрипции гена, положения интеграции в гене и нуклеотидной последовательности индивидуального Alu элемента. Методом торможения в геле показано различие в профилях связывания Alu-содержащих фрагментов в сравнении с Alu-несодержащими фрагментами ДНК с ядерных белков клеточных линий.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Амосова, Анна Леонидовна, Москва

1. Batzer, М.А. and P.L. Deininger, Alu repeats and human genomic diversity. Nat Rev Genet, 2002. 3(5): p. 370-9.

2. Sen, S.K., et al, Human genomic deletions mediated by recombination between Alu elements. Am J Hum Genet, 2006. 79(1): p. 41-53.

3. Lander, E.S., et al, Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature, 2001. 409(6822): p. 860-921.

4. Zietkiewicz, E., et al., Monophyletic origin of Alu elements in primates. JMol Evol, 1998. 47(2): p. 172-82.

5. Jurka, J. and P. Klonowski, Integration of retroposable elements in mammals: selection of target sites. J Mol Evol, 1996. 43(6): p. 685-9.

6. Goodier, J.L. and R.J. Maraia, Terminator-specific recycling of a Bl-Alu transcription complex by RNA polymerase III is mediated by the RNA terminus-binding protein La. J Biol Chem, 1998. 273(40): p. 26110-6.

7. Daniels, G.R. and P.L. Deininger, Characterization of a third major SINE family of repetitive sequences in the galago genome. Nucleic Acids Res, 1991. 19(7): p. 1649-56.

8. Liu, W.M., E. P. Leeflang, and C. W. Schmid, Unusual sequences of two old, inactive human Alu repeats. Biochim Biophys Acta, 1992.1132(3): p. 306-8.

9. Britten, R.J., Evidence that most human Alu sequences were inserted in a process that ceased about 30 million years ago. Proc Natl Acad Sci U SA, 1994. 91(13): p. 6148-50.

10. Deininger, P.L., et al, Master genes in mammalian repetitive DNA amplification. Trends Genet, 1992. 8(9): p. 307-11.

11. Boeke, J.D., LINEs andAlus--thepolyA connection. Nat Genet, 1997.16(1): p. 6-7.

12. Roy-Engel, A.M., et al, Active Alu element "A-tails": size does matter. Genome Res, 2002.12(9): p. 1333-44.

13. Deininger, P.L. and M.A. Batzer, Alu repeats and human disease. Mol Genet Metab, 1999. 67(3): p. 183-93.

14. Carroll, M.L., et al„ Large-scale analysis of the Alu Ya5 and Yb8 subfamilies and their contribution to human genomic diversity. J Mol Biol, 2001. 311(1): p. 17-40.

15. Labuda, D. and G. Striker, Sequence conservation in Alu evolution. Nucleic Acids Res, 1989.17(7): p. 2477-91.

16. Kapitonov, V. and J. Jurka, The age of Alu subfamilies. J Mol Evol, 1996. 42(1): p. 59-65.

17. Jurka, J. and A. Milosavljevic, Reconstruction and analysis of human Alu genes. J Mol Evol, 1991. 32(2): p. 105-21.

18. Batzer, M.A., et al., African origin of human-specific polymorphic Alu insertions. Proc Natl Acad Sei USA, 1994. 91(25): p. 12288-92.

19. Maraia, R.J., et al, Multiple dispersed loci produce small cytoplasmic Alu RNA. Mol Cell Biol, 1993.13(7): p. 4233-41.

20. Kochanek, S., D. Renz, and W. Doerfler, Transcriptional silencing of human Alu sequences and inhibition of protein binding in the box В regulatory elements by 5'-CG-3' methylation. FEBS Lett, 1995. 360(2): p. 115-20.

21. Englander, E. W., A.P. Wolffe, and B.H. Howard, Nucleosome interactions with a human Alu element. Transcriptional repression and effects of template methylation. J Biol С hem, 1993. 268(26): p. 19565-73.

22. Englander, E.W. and B.H. Howard, Nucleosome positioning by human Alu elements in chromatin. J Biol Chem, 1995. 270(17): p. 10091-6.

23. Chesnokov, I. and C. W. Schmid, Flanking sequences of an Alu source stimulate transcription in vitro by interacting with sequence-specific transcription factors. J Mol Evol, 1996. 42(1): p. 30-6.

24. Ullu, E. and A.M. Weiner, «перед геном» sequences modulate the internal promoter of the human 7SL RNA gene. Nature, 1985. 318(6044): p. 371-4.

25. Bredow, S., et al., Activating-transcription-factor (ATF) regulates human 7SL RNA transcription by RNA polymerase III in vivo and in vitro. Nucleic Acids Res, 1990. 18(23): p. 6779-84.

26. Liu, W.M., et al., Cell stress and translational inhibitors transiently increase the abundance of mammalian SINE transcripts. Nucleic Acids Res, 1995. 23(10): p. 1758-65.

27. Wu, J., et al., Negative regulation of the human epsilon-globin gene by transcriptional interference: role of an Alu repetitive element. Mol Cell Biol, 1990. 10(3): p. 1209-16.

28. Bateman, E. and M.R. Paule, Promoter occlusion during ribosomal RNA transcription. Cell, 1988. 54(7): p. 985-92.

29. Hanke, J.H., J.E. Hambor, and P. Kavathas, Repetitive Alu elements form a cruciform structure that regulates the function of the human CD8 alpha T cell-specific enhancer. J Mol Biol, 1995. 246(1): p. 63-73.

30. Kazazian, H.H., Jr., Mobile elements: drivers of genome evolution. Science, 2004. 303(5664): p. 1626-32.

31. Vansant, G. and W.F. Reynolds, The consensus sequence of a major Alu subfamily contains a functional retinoic acid response element. Proc Natl Acad Sci USA, 1995. 92(18): p. 8229-33.

32. Norris, J., et al., Identification of a new subclass of Alu DNA repeats which can function as estrogen receptor-dependent transcriptional enhancers. J Biol Chem, 1995. 270(39): p. 22777-82.

33. Britten, R.J., DNA sequence insertion and evolutionary variation in gene regulation. Proc Natl Acad Sci USA, 1996. 93(18): p. 9374-7.

34. Makalowski, W., G.A. Mitchell, and D. Labuda, Alu sequences in the coding regions of mRNA: a source of protein variability. Trends Genet, 1994. 10(6): p. 188-93.

35. Britten, R.J., Mobile elements inserted in the distant past have taken on important functions. Gene, 1997. 205(1-2): p. 177-82.

36. Bogerd, H.P., et al., Cellular inhibitors of long interspersed element 1 and Alu retrotransposition. Proc Natl Acad Sci USA, 2006.103(23): p. 8780-5.

37. Ricci, V., et al., An Alu-mediated rearrangement as cause of exon skipping in Hunter disease. Hum Genet, 2003.112(4): p. 419-25.

38. Tiret, L., et al., Evidence, from combined segregation and linkage analysis, that a variant of the angiotensin I-converting enzyme (ACE) gene controls plasma ACE levels. Am J Hum Genet, 1992. 51(1): p. 197-205.

39. Kazazian, H.H., Jr. and J.V. Moran, The impact of LI retrotransposons on the human genome. Nat Genet, 1998.19(1): p. 19-24.

40. Wallace, M.R., et al., A de novo Alu insertion results in neurofibromatosis type 1. Nature, 1991. 353(6347): p. 864-6.

41. Tighe, P. J., et al., Inactivation of the Fas gene by Alu insertion: retrotransposition in an intron causing splicing variation and autoimmune lymphoproliferative syndrome. Genes lmmun, 2002. 3 Suppl 1: p. S66-70.

42. Teugels, E., et al., De novo Alu element insertions targeted to a sequence common to the BRCA1 and BRCA2 genes. Hum Mutat, 2005. 26(3): p. 284.

43. Miki, Y., et al., Mutation analysis in the BRCA2 gene in primary breast cancers. Nat Genet, 1996.13(2): p. 245-7.

44. Abdelhak, S., et al., Clustering of mutations responsible for branchio-oto-renal (BOR) syndrome in the eyes absent homologous region (eyaHR) of EYA1. Hum Mol Genet, 1997. 6(13): p. 2247-55.

45. Schollen, E., et al., Characterization of two unusual truncating PMM2 mutations in two CDG-Iapatients. Mol Genet Metab, 2007. 90(4): p. 408-13.

46. Gu, Y., et al., The first reported case of Menkes disease caused by an Alu insertion mutation. Brain Dev, 2007. 29(2): p. 105-8.

47. Manco, L., et al., Molecular characterization of five Portuguese patients with pyrimidine 5'-nucleotidase deficient hemolytic anemia showing three new P5'N-I mutations. Haematologica, 2006. 91(2): p. 266-7.

48. Sobrier, M.L., et al., Alu-element insertion in the homeodomain of HESX1 and aplasia of the anterior pituitary. Hum Mutat, 2005. 25(5): p. 503.

49. Ganguly, A., et al., Exon skipping caused by an intronic insertion of a young Alu Yb9 element leads to severe hemophilia A. Hum Genet, 2003. 113(4): p. 348-52.

50. Sukarova, E., et al, An Alu insert as the cause of a severe form of hemophilia A. Acta Haematol, 2001.106(3): p. 126-9.

51. Wulff K„ et al., Identification of a novel large F9 gene mutation-an insertion of an Alu repeated DNA element in exon e of the factor 9 gene. Hum Mutat, 2000. 15(3): p. 299.

52. Li, X., et al., Frequency of recent retrotransposition events in the human factor IX gene. Hum Mutat, 2001.17(6): p. 511-9.

53. Vidaud, D., et al., Haemophilia B due to a de novo insertion of a human-specific Alu subfamily member within the coding region of the factor IX gene. Eur J Hum Genet, 1993.1(1): p. 30-6.

54. Wulff, K„ et al, Molecular analysis of hemophilia B in Poland: 12 novel mutations of the factor IX gene. Acta Biochim Pol, 1999. 46(3): p. 721-6.

55. Janicic, N., et al, Insertion of an Alu sequence in the Ca(2+)-sensing receptor gene in familial hypocalciuric hypercalcemia and neonatal severe hyperparathyroidism. Am J Hum Genet, 1995. 56(4): p. 880-6.

56. Bai, M., et al, Markedly reduced activity of mutant calcium-sensing receptor with an inserted Alu element from a kindred with familial hypocalciuric hypercalcemia and neonatal severe hyperparathyroidism. J Clin Invest, 1997. 99(8): p. 1917-25.

57. Su, L.K., et al, Genomic rearrangements of the APC tumor-suppressor gene in familial adenomatous polyposis. Hum Genet, 2000.106(1): p. 101-7.

58. Hailing, K.C., et al, Hereditary desmoid disease in a family with a germline Alu I repeat mutation of the APC gene. HumHered, 1999. 49(2): p. 97-102.

59. Muratani, K., et al, Inactivation of the cholinesterase gene by Alu insertion: possible mechanism for human gene transposition. Proc Natl Acad Sci USA, 1991. 88(24): p. 11315-9.

60. Mustajoki, S., et al, Insertion of Alu element responsible for acute intermittent porphyria. Hum Mutat, 1999.13(6): p. 431-8.

61. Apoil, P.A., et al, HIGM syndrome caused by insertion of an AluYb8 element in exon 1 of the CD40LG gene, Immunogenetics, 2007. 59(1): p. 17-23.

62. Mitchell G.A., et al, Splice-mediated insertion of an Alu sequence inactivates ornithine delta-aminotransferase: a role for Alu elements in human mutation. Proc Natl Acad Sci USA, 1991. 88(3): p. 815-9.

63. Knebelmann, B., et al., Splice-mediated insertion of an Alu sequence in the COL4A3 mRNA causing autosomal recessive Alport syndrome. Hum Mol Genet, 1995. 4(4): p. 675-9.

64. Zhang, Y., et al., AluY insertion (IVS4-52ins316alu) in the glycerol kinase gene from an individual with benign glycerol kinase deficiency. Hum Mutat, 2000.15(4): p. 316-23.

65. Zhang Y-H, H.B.-L., Finlayson G, Deininger PL, McCabe ERB, Alu Sx insertion in a patient with benign glycerolkinase deficiency. Am J Hum Genet Suppl, 1998. 63(A395).

66. Uddin, R.K., et al., Breakpoint Associated with a novel 2.3 Mb deletion in the VCFS region of 22qll and the role of Alu (SINE) in recurring microdeletions. BMC Med Genet, 2006. 7: p. 18.

67. Vervoort, R., et al., A mutation (IVS8+0.6kbdelTC) creating a new donor splice site activates a cryptic exon in an Alu-element in intron 8 of the human beta-glucuronidase gene. Hum Genet, 1998.103(6): p. 686-93.

68. Oldridge, M., et al., De novo alu-element insertions in FGFR2 identify a distinct pathological basis for Apert syndrome. Am J Hum Genet, 1999. 64(2): p. 446-61.

69. Lester , T., McMahon, C., VanRegemorter, N., Jones, A., Genet, S., X-linked immunodeficiency caused by insertion of Alu repeat sequences. J Med Gen Suppl, 1997. 34(Suppl 1): p. S81.

70. Ostertag, E.M. and H.H. Kazazian, Jr., Biology of mammalian LI retrotransposons. Annu Rev Genet, 2001. 35: p. 501-38.

71. Conley, M.E., et al., Two independent retrotransposon insertions at the same site within the coding region ofBTK. Hum Mutat, 2005. 25(3): p. 324-5.

72. Beauchamp, N.J., et al., Major structural defects in the antithrombin gene in four families with type I antithrombin deficiency-partial/complete deletions and rearrangement of the antithrombin gene. Thromb Haemost, 2000. 83(5): p. 715-21.

73. Ishihara, N., et al., Clinical and molecular analysis of Mowat-Wilson syndrome associated with ZFHX1B mutations and deletions at 2q22-q24.1. J Med Genet, 2004. 41(5): p. 387-93.

74. Rowe, S.M., et al., Ovarian carcinoma-associated TaqI restriction fragment length polymorphism in intron G of the progesterone receptor gene is due to an Alu sequence insertion. Cancer Res, 1995. 55(13): p. 2743-5.

75. Economou-Pachnis, A. and P.N. Tsichlis, Insertion of an Alu SINE in the human homologue of the Mlvi-2 locus. Nucleic Acids Res, 1985.13(23): p. 8379-87.

76. Saffer, J.D. and S.J. Thurston, A negative regulatory element with properties similar to those of enhancers is contained within an Alu sequence. Mol Cell Biol, 1989. 9(2): p. 355-64.

77. Tomilin, N.V., S.M. Iguchi-Ariga, and H. Ariga, Transcription and replication silencer element is present within conserved region of human Alu repeats interacting with nuclear protein. FEBSLett, 1990. 263(1): p. 69-72.

78. Babich, V., et al., Association of some potential hormone response elements in human genes with the Alu family repeats. Gene, 1999. 239(2): p. 341-9.

79. Nilsson, S. and J.A. Gustafsson, Estrogen receptor transcription and transactivation: Basic aspects of estrogen action. Breast Cancer Res, 2000. 2(5): p. 360-6.

80. Hudson, L.G., A.P. Ertl, and G.N. Gill, Structure and inducible regulation of the human c-erb B2/neu promoter. J Biol Chem, 1990. 265(8): p. 4389-93.

81. Piedrafita, F.J., et al., An Alu element in the myeloperoxidase promoter contains a composite SPl-thyroid hormone-retinoic acid response element. J Biol Chem, 1996. 271(24): p. 14412-20.

82. Chesnokov, I., et al, Binding specificity of human nuclear protein interacting with the Alu-family DNA repeats. Biochem Biophys Res Commun, 1991.178(2): p. 6139.

83. Polak, P. and E. Domany, Alu elements contain many binding sites for transcription factors and may play a role in regulation of developmental processes. BMC Genomics, 2006. 7: p. 133.

84. Laperriere, D., et al., Widespread Alu repeat-driven expansion of consensus DR2 retinoic acid response elements during primate evolution. BMC Genomics, 2007. 8: p. 23.

85. Neznanov, N.S. and R.G. Oshima, cis regulation of the keratin 18 gene in transgenic mice. Mol Cell Biol, 1993.13(3): p. 1815-23.

86. Maouche, L., J. P. Cartron, and S. Chretien, Different domains regulate the human erythropoietin receptor gene transcription. Nucleic Acids Res, 1994. 22(3): p. 33846.

87. Kim, J.H., et al., Unique sequence organization and erythroid cell-specific nuclear factor-binding of mammalian theta 1 globin promoters. Nucleic Acids Res, 1989. 17(14): p 5687-700.

88. Brini, A.T., G.M. Lee, and J.P. Kinet, Involvement of Alu sequences in the cell-specific regulation of transcription of the gamma chain of Fc and T cell receptors. J Biol Chem, 1993. 268(2): p. 1355-61.

89. Kidwell, M.G. and D.R. Lisch, Perspective: transposable elements, parasitic DNA, and genome evolution. Evolution Int J Org Evolution, 2001. 55(1): p. 1-24.

90. Shankar, R., et al., Evolution and distribution of RNA polymerase II regulatory sites from RNA polymerase III dependant mobile Alu elements. BMC Evol Biol, 2004. 4(1):p. 37.

91. Sorek, R., G. Ast, and D. Graur, Alu-containing exons are alternatively spliced. Genome Res, 2002.12(7): p. 1060-7.

92. Lev-Maor, G., et al., The birth of an alternatively spliced exon: 3' splice-site selection in Alu exons. Science, 2003. 300(5623): p. 1288-91.

93. Lai, F., et al, Editing of glutamate receptor B submit ion channel RNAs by four alternatively spliced DRADA2 double-stranded RNA adenosine deaminases. Mol Cell Biol, 1997.17(5): p. 2413-24.

94. Kreahling, J. and B.R. Graveley, The origins and implications of Aluternative splicing. Trends Genet, 2004. 20(1): p. 1-4.

95. Cubero, E., F.J. Luque, and M. Orozco, Theoretical studies of d(A:T)-based parallel-stranded DNA duplexes. J Am ChemSoc, 2001.123(48): p. 12018-25.

96. Hizver, J., et al., DNA bending by an adenine—thymine tract and its role in gene regulation. Proc Natl Acad Sei USA, 2001. 98(15): p. 8490-5.

97. McConnell, K.J. and D.L. Beveridge, Molecular dynamics simulations of B '-DNA: sequence effects on A-tract-induced bending and flexibility. J Mol Biol, 2001. 314(1): p. 23-40.

98. Economou, E.P., et al, The polydeoxyadenylate tract of Alu repetitive elements is polymorphic in the human genome. Proc Natl Acad Sci USA, 1990. 87(8): p. 2951-4.

99. Arcot, S.S., et al., Alu repeats: a source for the genesis of primate microsatellites. Genomics, 1995. 29(1): p. 136-44.

100. Jurka, J. and C. Pethiyagoda, Simple repetitive DNA sequences from primates: compilation and analysis. J MolEvol, 1995. 40(2): p. 120-6.

101. Montermini, L., et al., Phenotypic variability in Friedreich ataxia: role of the associated GAA triplet repeat expansion. Ann Neurol, 1997. 41(5): p. 675-82.

102. Liu, W.M., et al., Alu transcripts: cytoplasmic localisation and regulation by DNA methylation. Nucleic Acids Res, 1994. 22(6): p. 1087-95.

103. Schmid, C.W., Human Alu subfamilies and their methylation revealed by blot hybridization. Nucleic Acids Res, 1991.19(20): p. 5613-7.

104. Bird, A.P., DNA methylation and the frequency of CpG in animal DNA. Nucleic Acids Res, 1980. 8(7): p. 1499-504.

105. Liu, W.M. and C.W. Schmid, Proposed roles for DNA methylation in Alu transcriptional repression and mutational inactivation. Nucleic Acids Res, 1993. 21(6): p. 1351-9.

106. Hartner, J.C., et al., Liver disintegration in the mouse embryo caused by deficiency in the RNA-editing enzyme ADAR1. J Biol Chem, 2004. 279(6): p. 4894-902.

107. Higuchi, M., et al., Point mutation in an AMPA receptor gene rescues lethality in mice deficient in the RNA-editing enzyme ADAR2. Nature, 2000. 406(6791): p. 7881.

108. Esnault, C., et al., AP0BEC3G cytidine deaminase inhibits retrotransposition of endogenous retroviruses. Nature, 2005. 433(7024): p. 430-3.

109. Athanasiadis, A., A. Rich, and S. Maas, Widespread A-to-I RNA editing of Alu-containing mRNAs in the human transcriptome. PLoS Biol, 2004. 2(12): p. e391.

110. Blow, M., et al., A survey of RNA editing in human brain. Genome Res, 2004. 14(12):p. 2379-87.

111. Kim, D.D., et al., Widespread RNA editing of embedded alu elements in the human transcriptome. Genome Res, 2004.14(9): p. 1719-25.

112. Levanon, E.Y., et al., Systematic identification of abundant A-to-I editing sites in the human transcriptome. Nat Biotechnol, 2004. 22(8): p. 1001-5.

113. Levanon, K., et al., Letter from the editor: Adenosine-to-inosine RNA editing in Alu repeats in the human genome. EMBO Rep, 2005. 6(9): p. 831-5.

114. Chu, W.M., et al., Potential Alu function: regulation of the activity of double-stranded RNA-activated kinase PKR. Mol Cell Biol, 1998.18(1): p. 58-68.

115. Rubin, C.M., R.H. Kimura, andC.W. Schmid, Selective stimulation of translational expression by Alu RNA. Nucleic Acids Res, 2002. 30(14): p. 3253-61.

116. Bovia, F„ et al., The SRP9/14 submit of the human signal recognition particle binds to a variety of Alu-like RNAs and with higher affinity than its mouse homolog. Nucleic Acids Res, 1997. 25(2): p. 318-26.

117. Chang, D. Y., K. Hsu, and R.J. Maraia, Monomeric scAlu and nascent dimeric Alu RNAs induced by adenovirus are assembled into SRP9/14-containing RNPs in HeLa cells. Nucleic Acids Res, 1996. 24(21): p. 4165-70.

118. Goodyer, C.G., H. Zheng, and G.N. Hendy, Alu elements in human growth hormone receptor gene 5' untranslated region exons. J Mol Endocrinol, 2001. 27(3): p. 357-66.

119. Stuart, J. J., et al., The 3' UTR of human MnSOD mRNA hybridizes to a small cytoplasmic RNA and inhibits gene expression. Biochem Biophys Res Commun, 2000. 274(3): p. 641-8.

120. Sobczak, K. and W.J. Krzyzosiak, Structural determinants of BRCA1 translational regulation. JBiolChem, 2002. 277(19): p. 17349-58.

121. Hasler, J. and K. Strub, Alu elements as regulators of gene expression. Nucleic Acids Res, 2006. 34(19): p. 5491-7.

122. Deininger, P.L., et al., Mobile elements and mammalian genome evolution. Curr Opin Genet Dev, 2003.13(6): p. 651-8.

123. Stenger, J.E., et al, Biased distribution of inverted and direct Alus in the human genome: implications for insertion, exclusion, and genome stability. Genome Res, 2001.11(1): p. 12-27.

124. Bailey, J.A.a.E., EE., Genome-wide detection and analysis of recent segmental duplications within mammalian organisms. Cold Spring Harb Symp Quant Biol., 2003. 68: p. 115-24.

125. Symer, D.E., et al., Human 11 retrotransposition is associated with genetic instability in vivo. Cell, 2002.110(3): p. 327-38.

126. Gilbert, N., S. Lutz-Prigge, andJ.V. Moran, Genomic deletions created upon LINE-1 retrotransposition. Cell, 2002.110(3): p. 315-25.

127. Dewannieux, M., C. Esnault, and T. Heidmann, LINE-mediated retrotransposition of marked Alu sequences. Nat Genet, 2003. 35(1): p. 41-8.

128. Salem, A.H., et al., Recently integrated Alu elements and human genomic diversity. Mol Biol Evol, 2003. 20(8): p. 1349-61.

129. Rudiger, N.S., N. Gregersen, and M.C. Kielland-Brandt, One short well conserved region of Alu-sequences is involved in human gene rearrangements and has homology with prokaryotic chi. Nucleic Acids Res, 1995. 23(2): p. 256-60.

130. Lehrman, M.A., et al, Alu-Alu recombination deletes splice acceptor sites and produces secreted low density lipoprotein receptor in a subject with familial hypercholesterolemia. JBiolChem, 1987. 262(7): p. 3354-61.

131. Chae, J.J., et al., Two partial deletion mutations involving the same Alu sequence within intron 8 of the LDL receptor gene in Korean patients with familial hypercholesterolemia. Hum Genet, 1997. 99(2): p. 155-63.

132. Lehrman, M.A., et al, Mutation in LDL receptor: Alu-Alu recombination deletes exons encoding transmembrane and cytoplasmic domains. Science, 1985. 227(4683): p. 140-6.

133. Rudiger, N.S., et al, Repetitive sequences involved in the recombination leading to deletion of exon 5 of the low-density-lipoprotein receptor gene in a patient with familial hypercholesterolemia. Eur JBiochem, 1991.198(1): p. 107-11.

134. Yamakawa, K, et al., Three novel partial deletions of the low-density lipoprotein (LDL) receptor gene in familial hypercholesterolemia. Hum Genet, 1989. 82(4): p. 317-21.

135. Nissen, P.H., et al., Genomic characterization of five deletions in the LDL receptor gene in Danish Familial Hypercholesterolemic subjects. BMC Med Genet, 2006. 7: p. 55.

136. Harteveld, K.L., et al., The involvement of Alu repeats in recombination events at the alpha-globin gene cluster: characterization of two alphazero-thalassaemia deletion breakpoints. Hum Genet, 1997. 99(4): p. 528-34.

137. Flint, J., et al., Chromosomal stabilisation by a subtelomeric rearrangement involving two closely related Alu elements. Hum Mol Genet, 1996. 5(8): p. 1163-9.

138. Ko, T.M. and X. Xu, Molecular study and prenatal diagnosis of alpha- and beta-thalassemias in Chinese. J Formos Med Assoc, 1998. 97(1): p. 5-15.

139. Nicholls, R.D., N. Fischel-Ghodsian, and D.R. Higgs, Recombination at the human alpha-globin gene cluster: sequence features and topological constraints. Cell, 1987. 49(3):p. 369-78.

140. Stoppa-Lyonnet, D., et al., Clusters of intragenic Alu repeats predispose the human CI inhibitor locus to deleterious rearrangements. Proc Natl Acad Sci USA, 1990. 87(4): p. 1551-5.

141. Ariga, T., P.E. Carter, and A.E. Davis, 3rd, Recombinations between Alu repeat sequences that result in partial deletions within the CI inhibitor gene. Genomics, 1990. 8(4): p. 607-13.

142. Pousi, B., et al., Alu-Alu recombination results in a duplication of seven exons in the lysyl hydroxylase gene in a patient with the type VI variant of Ehlers-Danlos syndrome. Am J Hum Genet, 1994. 55(5): p. 899-906.

143. Olds, R.J., et al., Complete nucleotide sequence of the antithrombin gene: evidence for homologous recombination causing thrombophilia. Biochemistry, 1993. 32(16): p. 4216-24.

144. Botto, M., et al., Homozygous hereditary C3 deficiency due to a partial gene deletion. Proc Natl Acad Sci USA, 1992. 89(11): p. 4957-61.

145. Kozak, L., et al., Identification and characterization of large deletions in the phenylalanine hydroxylase (PAH) gene by MLPA: evidence for both homologous and non-homologous mechanisms of rearrangement. Mol Genet Metab, 2006. 89(4): p. 300-9.

146. Kutsche, K., et al., Characterization of breakpoint sequences of five rearrangements in L1CAM and ABCD1 (ALD) genes. Hum Mutat, 2002. 19(5): p. 526-35.

147. Matejas, V., et al., Identification of Alu elements mediating a partial PMP22 deletion. Neurogenetics, 2006. 7(2): p. 119-26.

148. Costa, E., et al., Identification of a novel AluSx-mediated deletion of exon 3 in the SBDS gene in a patient with Shwachman-Diamond syndrome. Blood Cells Mol Dis, 2007.

149. Markert, M.L., et al., Adenosine deaminase (ADA) deficiency due to deletion of the ADA gene promoter and first exon by homologous recombination between two Alu elements. J Clin Invest, 1988. 81(5): p. 1323-7.

150. Huang, L.S., et al., Hypobetalipoproteinemia due to an apolipoprotein B gene exon 21 deletion derived by Alu-Alu recombination. J Biol Chem, 1989. 264(19): p. 11394-400.

151. Shimada, F., et al, Insulin-resistant diabetes associated with partial deletion of insulin-receptor gene. Lancet, 1990. 335(8699): p. 1179-81.

152. Zhang, G., et al., Identification of Alu-mediated, large deletion-spanning exons 2-4 in a patient with mitochondrial acetoacetyl-CoA thiolase deficiency. Mol Genet Metab, 2006. 89(3): p. 222-6.

153. Kornreich, R., D.F. Bishop, and R.J. Desnick, Alpha-galactosidase A gene rearrangements causing Fabry disease. Identification of short direct repeats at breakpoints in an Alu-rich gene. J Biol Chem, 1990. 265(16): p. 9319-26.

154. Marcus, S., et al., Duplication in the hypoxanthine phosphoribosyl-transferase gene caused by Alu-Alu recombination in a patient with Lesch Nyhan syndrome. Hum Genet, 1993. 90(5): p. 477-82.

155. Burwinkel, B. and M.W. Kilimann, Unequal homologous recombination between LINE-1 elements as a mutational mechanism in human genetic disease. J Mol Biol, 1998. 277(3): p. 513-7.

156. Hori, T., et al., Mucopolysaccharidosis type IVA: common double deletion in the N-acetylgalactosamine-6-sulfatase gene (GALNS). Genomics, 1995. 26(3): p. 535-42.

157. Gervasini, C„ et al., Uncommon Alu-mediated NF1 microdeletion with a breakpoint inside the NF1 gene. Genomics, 2005. 85(2): p. 273-9.

158. Rouyer, F., et al, A sex chromosome rearrangement in a human XX male caused by Alu-Alu recombination. Cell, 1987. 51(3): p. 417-25.

159. Myerowitz, R. and N.D. Hogikyan, A deletion involving Alu sequences in the beta-hexosaminidase alpha-chain gene of French Canadians with Tay-Sachs disease. J BiolChem, 1987. 262(32): p. 15396-9.

160. Neote, K., et al, Structure and distribution of an Alu-type deletion mutation in Sandhoff disease. J Clin Invest, 1990. 86(5): p. 1524-31.

161. Rohrer, J., et al., Unusual mutations in Btk: an insertion, a duplication, an inversion, and four large deletions. Clin Immunol, 1999. 90(1): p. 28-37.

162. Kristufek, D., et al., Characterization of novel Bruton's tyrosine kinase gene mutations in Central European patients with agammaglobulinemia. Mol Immunol, 2007. 44(7): p. 1639-43.

163. Strout, M.P., et al., The partial tandem duplication of ALL1 (MLL) is consistently generated by Alu-mediated homologous recombination in acute myeloid leukemia. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95(5): p. 2390-5.

164. Swensen, J., et al., Identification of a 14 kb deletion involving the promoter region ofBRCAl in a breast cancer family. Hum Mol Genet, 1997. 6(9): p. 1513-7.

165. Schichman, S.A., et al., ALL-1 tandem duplication in acute myeloid leukemia with a normal karyotype involves homologous recombination between Alu elements. Cancer Res, 1994. 54(16): p. 4277-80.

166. Puget, N., et al„ An Alu-mediated 6-kb duplication in the BRCA1 gene: a new founder mutation? Am J Hum Genet, 1999. 64(1): p. 300-2.

167. Fukuuchi, A., et al., A whole MEN1 gene deletion flanked by Alu repeats in a family with multiple endocrine neoplasia type 1. Jpn J Clin Oncol, 2006. 36(11): p. 73944.

168. Mauillon, J.L., et al., Identification of novel germline hMLHl mutations including a 22 kb Alu-mediated deletion in patients with familial colorectal cancer. Cancer Res, 1996. 56(24): p. 5728-33.

169. Onno, M., et al., Rearrangement of the human tre oncogene by homologous recombination between Alu repeats of nucleotide sequences from two different chromosomes. Oncogene, 1992. 7(12): p. 2519-23.

170. Hsieh, S.Y., et al., High-frequency Alu-mediated genomic recombination/deletion within the caspase-activated DNase gene in human hepatoma. Oncogene, 2005. 24(43): p. 6584-9.

171. Rothberg, P.G., et al., A deletion polymorphism due to Alu-Alu recombination in intron 2 of the retinoblastoma gene: association with human gliomas. Mol Carcinog, 1997. 19(2): p. 69-73.

172. Zucman-Rossi, J., et al., Interethnic polymorphism of EWS intron 6: genome plasticity mediated by Alu retroposition and recombination. Hum Genet, 1997. 99(3): p. 357-63.

173. Roy-Engel, A.M., et al., Alu insertion polymorphisms for the study of human genomic diversity. Genetics, 2001.159(1): p. 279-90.

174. Свердлов E. Д., Ретровирусные регуляторы экспрессии генов в геноме человека как возможные факторы его эволюции. Биоорганическая химия, 1999. 25(11): 821-827.

175. Хуснутдинова Э. К, и др., Оценка генетических расстояний и таксономический анализ популяций народов Волго-Уралъского региона на основе данных о полиморфизме ДНК. Генетика, 1999. 35(7): 982-9871. БЛАГОДАРНОСТИ

176. Я благодарена Борису Олеговичу Глотову за помощь в написании статей.

177. За помощь и внимание к моей работе я глубоко признательна Елене Анатольевне Стукачевой.

178. Автор выражает благодарность сотрудникам кафедры Молекулярной биологии биологического факультета Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова за полученные знания, а также за высокую требовательность и постоянное внимание.

179. Отдельную благодарность хотелось бы выразить моим оппонентам, Петру Михайловичу Рубцову и Наталье Сергеевне Куприяновой, за любезное согласие оппонировать мою рабботу и справедливые замечания.

180. А также огромное спасибо моей семье и друзьям, поддерживавшим меня своим вниманием и теплотой.