Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Индуцированная соматическая химерность и частота мутаций у Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (Исследование действия на воздушно-сухие семена гамма-излучения, N-нитpoзo-N-мeтилмочевины, этиленимина, рогора и фозалона)

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Индуцированная соматическая химерность и частота мутаций у Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (Исследование действия на воздушно-сухие семена гамма-излучения, N-нитpoзo-N-мeтилмочевины, этиленимина, рогора и фозалона)"

РГ6 од

О П На правах рукописи

J " '' УДК 575.24:632.95

Л\АХМАДБЕКОВ Тимур Султонназаровнч

индуцированная соматическая химерность

и ЧАСТОТА Д\УТАЦИЙ У А1МВтОР815 ТНАЫАЫА (ь) неу1чн

(Исследование действия на воздушно-сухие семена гамма-излучения, Г^-нитрозо-Ы-метнлмочевины, этиленимнна, рогора и фозалона)

(03.00.15 — генетика)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ДУШАНБЕ — 1007

Работа выполнена в лаборатории физиологической генетики Института физиологии растений и генетики Академии наук Республики Таджикистан.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

академик АН РТ, профессор, доктор биологических наук Усманов П. Д.

кандидат биологических наук, старший научный сотруд-' ник Медник И. Г.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор Абдуллаев X. А.'

. кандидат биологических наук, доцент Хурматов X. X.

Ведущая организация: Таджикский аграрный университет.

Зашита диссертации состоится « СЯ^^^^ьЗ&^Ч г. в^^Мас. на-заседании Диссертационного совета Д 065.01.00 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Таджикском государственном национальном университете (734025, г. Душанбе, пр. Ргда-кн, 17).

.С .диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета. • .

Автореферат разослан 1997 г.

И. о. Ученого секретаря

Диссертационного совета,

доктор химических наук,

профессор • Б. X. КИЛ1САНОВ

ОПдАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

• Актуальность темы. Научно-техническая резолюция выдзи-ула перед человечеством проблему долговременных, и на обратных измелены окружающей среди. Наряду с экологичен .нши пос-. эдогвиями и отрицательным воздействием на здоровье нынеапого околения людей, загрязнение биосферы.имеет.еще и далеко иду-не генетические последствия.(Дубинин, 1976; Герпензон, 1983; эхаров, 1984-; Инге-Вэчтомов, 1989).

Результатом осознания этого явилось'зарождение на рубеже -. Э-70-ых годов новой области биологического знания - генетичес^-/ эй токсикологии, которая занимается изучением мутагенной эф-зктивности факторов антропогенной природы, разрабатывает мето-j и cntJo6bi оценки.их генетической активности (Дубинин, 1976; згэ-Вечтомов, 1989). . .. .....

Успехи в этой области напрямую зависят, по-ыиыо всего про- • зго, и от дальнейшего совершенствования систем мониторинга, также разработки, генетических тест-систем для испытаний на этзнциальную мутагенность химических веществ, широко исполняемых Человеком в своей производственной деятельности. В г.юе-эле исследователей, занимающихся генетической токсикологией, ке сейчас имеется специально разработанные для этих целей на астениях, нивотных и микроорганизмах оригинальные тест-систе-J, достоинства и недостатки которых широко обсуждаются в лито- ■ зтуре (Ауэрбах, 1978; Гернюизон,-I983).

Высшие растения в этой связи, согласно мнению ряда ученых liiltdn, 'Owens,1982j Sandliu et al. »1991), обладают особыми 10СТ0Ш1СТВЭМИ, заключающимися в следующем:

- растения - эукариотичесгсие организмы и их.реакция на мутагены близка к реакции животных и человека;

- эксперименты с растениями относительно просты и дешевы, а в ряде случаев могут проводиться Mn situ";

■ ряд растительных видов обладает достаточной, чувствительностью к мутагенам и коротким жизненным ци;слом; • изучение мутагенов ня растениях даёт наиболее адекватные данные о последствиях мутационного давления на фитоценозы.

Сказанное делает вполне актуальной задачу создания новых

ы^икочувствительных тест-систом на высших растениях, необходи мых для оперативной оценки мутагенной активности различных антропогенных загрязнителей.

Цель и задачи исследований. Целью настоящих исследований явилось,создание на арабидопсисе новой, основанной на индуцированной соматической химерности, тест-системы и ее использование для количественной оценки частоты мутаций, вызываемых гамма-излучением (ГИ),- к-нитрозо- D -метилмочевиной (НММ), этилениыином (ЭИ), рогором и фозалоном.

Для реализации этой цели было необходимо решение следующих -задач: •

- получить полудоминантный хлорофилльный мутант (ПХМ) для конструирования новой генетической тест-системы;

- изучить на этом мутанте закономерность индуцируемой 1И к НЛ1 соматической хиыерности и на этой основе разработать метод количественного учета мутаций;

- провести апробацию метода на примере обработки семян Ш и ШМ;

- изучить генетичес -ую активность широко используемых в растениеводство пестицидов - рогора и фозалона.

Научная новизна и практическая значимость. Впервые вь". ,е-лен и феногенетически изучен ШШ арабидопсиса типа " Chlorina". На этом мутанте разработана высокочувствительная тест-система для обнаружения и оценки мутагенно: активности различных агентов методом индукции соматических химер, с помоцп которой в кратчайшие сроки (15-20 дней), с минимальными затратами труда можно количественно, в общепринятых единицах (количество мутаций на инициальную клетку- ИК) оценг'-ь мутагенную активность различных физических агентов, химических веществ и антропогенных загрязнителей.

Предложен новый метод .сравнения относительной мутагенной эффективности ионизирующих излутний и химических веществ (ЭИ, рогор) на примере арабидопсиса.

Практическое значение работы связано с возможность» использования новой тест-систем.! на арабидопсисе для определения генетической активности антропогенных загрязнителей и проведен демострационных опытов по курсу "Сс;щая генетика" в раз; ,'ле

Дотационный процесс" на практических занятиях в учебных заве-ниях.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложе-(или представлены) на: ежегодных научных семинарах лабора-рии физиологической генетики Отдела генетики АН РТ (Душанбе, 90-1996), научной конференции "Изучение и рациональное ис-льзование природных ресурсов" (Уфа, 1991), совместном сени-ре Отделения биологических и медицинских наук АН РТ, Таджик-ого общества генетиков и селекционеров и Таджикского общест-физиологов растений на тему: "Генетические тесты по оценке грязнения окружающей среды", посвященном 50-летию ООН и ЕСКО ("Наука.в интересах прогресса и окружающей среды") уианбе, 1995), в законченном виде работа была доложена на ъединенном сеыинаре лабораторий: физиологической генетики физиолого-генетической селекции растений Института физиологии стений и генетики АН Республики Тадзи. ;истан .(Душанбе, 1997).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано Ч пе-атных работа в I - в лочатк.

Структура у; объем диссертации. Диссертация изложена на 98 стрзгицах мэиияописного текста и состоит из введения, >бзора литературы, объекта I" ,методов исследований, эк-париетальной части. Завершается работа заключенней и выводами, 'абота иллюстрирована 9 таблицами и б рисунками. Список цити-юванной литературы включает'в себя 160 источников, из них Э иностранных авторов.

основное содее;:аш;е работы

Объект и методы исследований. Объектом для исследований :лужили воздушно-сухие семена 1Ш.арабидспсиса, подробное шисание которого будет дано ниже. Семена облучали различными ;озами ге, обрабатывали растворами различных концентраций су-¡ермутагенов Н!.ш и эи, а также пестицидов - рогора. и фозалона.

Облучение, семян 1И проводили в лаборатории радиац..онной )бработки материалов физического факультета Таджикского государственного национального университета на установке РХМ'У 20 ч юточиик -Со60, при:20-25% дозами: 2.0, 40, 60, 80 и 100 ;илорентген (:сР)•■. '['*'' .

Химические вещества разводили в дисхилированной воде (ШМ предварительно растворяли в дашетилсульфоксиде) до получения необходимой концентрации, затеи семена замачивс.ш в растворе мутагена в точение 18 часов при 20-25°С. Контролем служили семена, замоченные в дкстилированной воде (в опьнй с НММ - в соответствующем растворе диметилсульфоксида). Пь^ле завершения обработки семена по вариантам, опыта, включая контроль, промигали проточной водой в течение одного часа. Далее семена высаживали в чашки Петри на питательную агаризованную минеральную, сре^ ду Велеминского-Гихнера ( Veleminsky , Gichner , 1964). Проращивание семян проводили в световой установке при освещенности 10-20 тыс. люкс и фотопериоде, равном 16 часам в сутки, температура 22-25°С в дневное время и 1б-18°С ночью. Семена, обработанные рогором и фозалоном, высаживали в ящики, заполненные смесью песка и цветочной почвы в соотношении 1:2. Растения выращивали в естественных условиях под двойным слоем.марли на биостанции Сиё-Кух на высоте 2,5 тыс. м. над ур.моря.

Учет индуцированной соматической химерности проводили на вполне сформировавшихся 4-х розеточных листьях гомозиготных ' растений1 дикого типа и гетерозиготах. Под-микроскопом МБС-2 учитывали число мутантных секторов, их тип, размеры, а также количество растений с одним, двумя и более мутантными сектора^ ии по методике Б.К.Вига ( »ig , 1975). Статистическую обработку экспериментальных данных проводили по общепринятым мето-. дикам_(Рокицкий, 1964; Урбах, 1964; Лакин, 1980).

I. Феногенетика полудоминантного хлорофилльного мутанте Ch*/ch~ . Среди большого многообразия наследственно-изменчивых форм, индуцируемых мутагенами у кивых организмов, особую научную ценность представляет, так называемые, нерецессивные доминантные и полудоминантные мутации, представляющие значительный интерес для изучения генетического строения и наследственной изменчивое?'.! высших растений. Этот тип мутаций - событие весьма редкое. Частота их возникновения составляет не более нескольких процентов от общего числа, вызываемых различными мутагенами, рец^сивных мутаций (Гостимский, 1981; Med-nik, lTar.:arov, 13Ь2).

В ISo3 году в Ст;,г;лз республиканской Академии

^^Кз хлорофийдьных химер перврго поколения после мутаген-Ищшботки .воздуш&о-сухих семян арабидопсиса ( HednUc et al,., \55). При использовании этого метода в опыте по учету мутаций ¡рабидопсиса, индуцированных раствором 0,0225 объемных процен-(otf.SS) ЭИ, у расы Enkhsin (En ), был получен ПХМ араби-гсиса типа - " ciilorlna " ( Ch. ). При размновании гетерози-гного растения ( ch. /oh ) его потомство распадалось на три ютипических класса: на проростки нормального зеленого цвета знозиготы дикого типа -Ch+/Ch+ ) ; на проростки келто-зелено-цзета (гетерозиготы - Ch.Vob"*); и на проростки белесо-зелено цвета (гомозиготы - oh."/o3i~).

. Учет частоты встречаемости проростков по классам дал слезшие результаты:

Генотипич_еские классы JX? Р

Ch+/Ch+ Ch+/ch" ch~Jch~ (1:2:1)

асщепление

зктическое 1287 2343 825 _10

зсщепление 107,8 10

шдаемое 1113,75 ■ 2227,50 1113,75

Эти данные, без учета 322 невзошадших семян, отвергают 1евую гипотезу о соответствии фактических данных теоретически ' 1даем,ому расцеплению 1:2:1, характерному для .явления неполного (инирования. Однако статистически достоверное отклонение от змулы 1:2:1 все же можно было бы объяснить зарегистрирован-I в опыте большим дефицитом рецессивов - oh"/oh." . У нас есть » основания считать, что мутантный ген ch~ в гомозиготном зтояник oh"/oh~ блокирует развитие зародыша на стадии зак-irai семядольных листьев. Такие мутации выявляются лишь в зучках незадолго до, созревания в них семян. Семена -.носитэ-этих мутаций.(обусловливающие."зародыыевую летальность"), эк правило не'дают всходов,-'однако малая часть из них все же эрастазт, формируя'семядоли'и дане 1-2 пары настоящих лиоточ-з,- На поверхности агаровой среды кроме проростков гомозигот-с по'.'гену дикого типа ( Gh+/Gh.+ -, ) и мутантных гетсрозигот-с проростков нелто-зеленого' цвета ( CbÎ/oh"" ) поддается шту и небольшая доля взошед^лх" семян, содериащих эмбрио-

V

эсле^^^Н

сеыяь^^Н

ля Д0фиц!4

6 •

нально-летальныа мутации в гомозиготном состоянии ( сьГ/ Они гибнут, как нами было установлено, на 8-12 день после^ прорастания. Все эти особенности прорастания мут~нтых как нам представляется, и служат причиной возни "¡овения дафной* та регрессии.

При.пересадке из агаровой,питательной средч в почву проростки дикого типа ( сь+/(Ж+ ) и яелто-зелзного цвета (с5+/сЬ~; завершали цикл" своего развития обильным плодообразованием. При дальнейшем изучении.полученнохо материала было обнаружено, однако, что в стручках растений дикого типа семена незадолго до их созревания были нормально-зеленого цвета. А в стручках иу-тантных гетерозиготных растений регулярно наблюдали следующую картину расщепления по окраске эмбрионов:

Соотношение эмбрионов,окрашенных Генотипические в цвета : ' ' 2

классы нормально-зеленые белесо-келтые % Р

(3:1)

СЬ+/СЬ+ 17821

фактическое

сч+/си** II "78 3765

ожидаемое 1,1 0,30

11132,25 3710,75

Приведенные здесь.результаты генетических-анализов совершенно ясно показывают, что лри помощи ЭИ получена моногенно наследуемая ЮМ. Эта мутация в гомозиготном состоянии ( сЬ."/оЬ*' ) вызывает гибель семян на заключительном этапе эмбрионального их развития. На стадии прорастания семян, полученных от гетерозиготных растений в чашках Петри на агаровой среде, набл.одается совпадение в' рэрщеплениях по генотипу и фенотипу в соотношении 1:2:1, однако с резки».! дефицитом рецессивов ( сь"*/оЬ™ ). Интересной особенность» гетерозиготных растений является возможность их идентификации не только по внешней желто-зеленой их окраске, но и по окраске зародыше;! се:.!ян. Правда, на эмбриональной фазе - регистрируется расцепление в соотноиен'.ш 3:1, а не 1:2-1, характерное для неполного доминирования. ато происходит из-за твозмокпоети различить в стручках пс окраске.светло-золеные г гелто-зопеныв зарольш семян с генотипами Сл+/С^+ п С1+/с}Г".

^ - А'учони следующая характеристика тейпов развития

<У

тяос^о^.лх нормальных и мутантных растений:

Фазы развитая (в днях)

шотипы Сеиядольные Розеточныз листья листья

1+/сн+

Цветение Плодоно- Созро-

шаниз ваниэ

2.-6 7-3? 32 - 55 .44 -59 55 - 66

2-6 7-52 43 - 63 54 - 67 62 - 69

Эта данные указывают на неодинаковые темпы развития рас-эниИ двух генотипических классов на разных этапах их онтоге-?зп. лвнс; отставание в развитии гзтерозигот по сравненье с зрмоП па фазах розеточныз листья й цветения сыепяется ускоро-.:он их развития при вступлении растений в фазу плодонозепиэ созревание.

Результаты фенологических наблюдений показывают такго, то к концу регетации различия в окраске листьев и стебля у отерозигот и растениЧ дикого типа исчезают, по своему развито гатерозиготы начинают приблинаться к гомозиготам.

Относительно полная характеристика признаков различия окду растениями различных генотипических классов по сравно-ип с исходной формой Ка представлена з табл. I.

Таблица I

Дейстзие гена з гоио- и гетерозиготной.состоянии

на-изменчивость некоторых количественных признаков у арабидопсиса

Изученные показатели

Сиивол гена ■

"высота .число .длина :главно-*струч- *струч-.го цве-:ков на :ка, •тоцоса,.главной, си : си -И^ЙФ?*

.число .вес •сеыяп '1000 ■ :в стру*сеиян, .чке, . иг

• пт. •

число .длина . кориаИ;глаппо-

шт. :го-кор-.нп, • си

)

9 2,5

II 4,2

13 2,9 -

Еп 22,7

СЬ+/С1г+ 23,4 СЬ+/сК~ 12,5

16 18 II

1,3 1,3

47 31 24

16,8 23,9 15,4

*>

Она дает нам наглядное представление об общей габитусе растений по вариантам опыта и показывает, что нормальные растения Оb?/Ch+ превосходят по многим изученным показателям исходную расу En и гетерозиготы Ck+/ch~ , из которых они выделены.

Особо следует отметить, что на основании результатов предварительных генетических анализов, нами установлена принад- , деяность мутантиого гона ch~ арабидопсиса к четвертой хромосомной группе сцепления.

2. Предпосилки создания и математическое обоснование молода опенки генетической активности мутагенных факторов.'В нас тоявде время твердо установлено, что'растения обладают рядом преимуществ как объекты для исследования мутационного процесса Они - высшие эукари мы, и полученные на них экспериментальные данные ио:шо аппроксимировать как на млекопитающих, так и на Человека. Исследования на растениях не требуют больших материальных затрат; семема растений допускают достаточно жесткую об' работку, и, наконец, на растениях «окно изучать все типы наследственных изменений, характерные для эукариот (Квитко, Ыюллв] 1961; Relichove , 1977; Сидорова, 1981; Giolmor et al., J993), Поэтому задача создания новых недорогих и высокочувствительных тест-систем является весьма актуальной для решения соьре-мешшх проб чем генетической токсикологии п экспериментального мутагенеза (Ауэрбах, 1978; йнге-Вечтоаов, 1989; Sandliu et al,, I991; Great, Saluaoaa 1994).

Еще в 1968 г. Б.К.Виг i; Е.Ф.Паддок разрабо'^ли оригинальный ые~од для предварительной оценки мутагенности различных агентов при помовд ПХЫ сои ( Vxg, Paddock , 1968). 3 дальнейшем Б.К.Виг с соавторами опубликовали ряд рзбот ( Vig et al., 1970; Vic » 1973,1902) о возможностях этол тест-системы. В основа данного метода лезли неустойчивое состояние соотноиания аллелей гена yellow -Уиу, которое отвечает за окраску листьев сои и под действием различных ...шическп:: и фяз:г .-ских агентов изменяют светло-зеленую окраску листьев гетерозиготных растений (Уу) на зеленую (УУ и УУу) и гсслтую (уу и уО), что выпасается в возиикновош:;] пктзи различию: цгз?ов ¡¡а:!" ¡рэь ла листьях мутантиых растени:1.. 5 иетоцл:в Ь.':'..^ига сд.:::;::;:." учета является количество ппген тайного ;лпа- на i лист. А гик .?а:с инт-

i очень-мелкие, тг это указывает, что листья сои образуются j десятков , а гоз11 окно, и сотен ИК. Точное определение числа С у сои ь ли.атратурэ отсутствует. Поэтому количественная оцен-з частоты ..¡утаций у этого объекта до сих пор про£ ¡ематичпа, го уменьшает реальную чувствительность метода как скрининг-зста..Этот существенный недостаток метода Б.К.Вига мояно уст-энить, если использовать для количественной оценки частоты му-зций описанную нами в предыдущем разделе 1Ш арябидопсиса. У рабидопсиса, согласно опубликованным данным, в образовании со-этических тканей принимаем участие небольшое по сравнению о эей чнсл^ ИК, от.2-4 и до 16-20 (Иванов,- 1974; Шевченко,Три-

о

лх, 1981; Rodel , 1982).

С' jThmii данными вполне согласуются и результаты наших пре-варительных опытов по индуцированию супепутагеном сомати-зскоц химернооти у 1Ш арабидопсиса (Медник и др., 1997). Воз- 5 озсность точного определения числа ИК на арабидопсисе открыва-т перспективу не тсько качественпой, но и количественной оцен-¡1 мутагенной активности исследуемых агентов.

У арабидопсиса в методическом плане удобно учитывать ..пт-а на 1-ой и 2-ой парп сформировавшихся розеточньг' листьев, о-есть на 4-х настоящих листьях. В таком случае достаточно чезидной становится следующая формула для оценки частоты инду-ированных мутаций: уа !.1р ^

ы ик '

це II- среднее число нутаций на одну ИК, Ир- среднее число му- • эций-на одно растение и Пик- среднее число ИК, образующих' зрвые 4-е листа. Экспериментально наблюдаемыми величинами нв-пются: соотношение числа пятен различных видов, их относи-злъные размеры, распределение числа пятен на растениях и на ' -ой и 2-ой паре розеточных листьев. Чтобы перейти от этих ве-ичин к оценке Up, Ник и LI в целом, необходимо изучить сладу-циз вопросы:

- подпадают.ли под действие диплонтного отбора клетки, фор-ируюцие мутантш^ ткани листа, что естественно Moser исказить скомуц частоту мутаций;

- какоьо соотношение числа Г.К для 1-оЛ и 2-ой пэры настся-листьев, то-есть следует ли нзть он: генетический воз-

раст листьев для оценки частоты мутаций;

- каков характер взаимосвязи ыекду числом пятен на растении и числом независ, лдс мутационных событий.

1. главе 4 диссертации приводятся исчерпывающие ответы на поставленные здесь вопросы, дается теоретическое обоснование тест-системы для оценки генетической активности мутагенов по индукции соматической химерности на розеточных листьях араби-допсиса. В автореферате полученные результаты излагаются в краткой' форме.

О £оли_^плонтного_отбз)1а. В экспериментальном мутагенезе правильное решение вопроса о наличии, или отсутствии диплонтно-го отбора и о его величине имеет принципиальное значение, так как от этого зависит.оценка частоты и фенотиппческого спектра индуцируемых мутаций. . .

Если предположить, что клетки, формирующие нормальную и мутантную ткани листа, развиваются с.одинаковыми скоростями, то естественно считать, что:

(2),

и п ^ 8П

где?1-ик- число ПК, образующих один лист, нп- число листьев с пятнами, ¿ли ап- площади листа ;; питай соответственна.

Однако, одинаково справедливым ыохено считать и другое предположение о том, что скорость роста нормальной и мутантной ткани листа неодинаковая. В этом "лучае при определении 11 пк но пятнам желтого и светло-зеленого цвета мы получим завышенную величину, а при определении по зеленым пятнам - заниженную. Определяя 71ик для пятен различных типов необходимо учитывать, что величина этого показателя мо^е1'' заиисить как от возраста листа, так и г вида и дозы мутагена. Поэтому сравнение Пик лишь тогда корректно, когда имеют дело с листьями одного возраста, о одинаковыми.дозами мутагена и с одинаковыми условиями выращивания растопи;-.. Учитывая сказанное, нами при помощи формулы (2) определены слодуицие ие.чичнни Г.К па один лист р.^дзль-но по желтым и золены}.! пятнам, индуцированным воздействием но сухие с «.«ми пи Пл..: чрайпдоь'оией IV. и химмутегеном ;1'1.'.1:

Мутаген Доза, Пятна на первых 4-хлистьях:

концентрация нелтые золеные

1Й 50 кР 3,10 2,95

-"- 100 кР 2,30 2,35

НШ 300 мкМ 3,10 3,30

-"-• 400 мкМ 3,85 * 3,70

Полученные результаты указывают на отсутствие статисти-ески достоверных различий между Мик, вычисленными по нелтым зеленым пятнам. Это свидетельствует о том, что в данном слу-ае у 1Ш1 отсутствует диплонтный отбор. Отсутствие диплонтного тбора говорит в пользу того, что мутации пигментной.недоста-очности не затрагивают механизма клеточного деления. И, что лорофиллоносныз клетки, формирующие иормально-зелоную ткань иста, в процессе фотосинтеза образуют общий пул метаболитов дииаково доступный всем растущим клеткам. К аналогичному заклю-ению ранее припал П.Д.Уимлнов с соавторами (1975) при обсузде-ип результатов фаноген-отич^икого изучения пестролистных мутсн-ов арабидолсисо v хлопчатника. Подобный эффект также обнаружен а культуре кл.г'чж млекопитающих ( BUrli Dt al* 1968).

О £Олн_одщг^н^тич1еско-го_ возраста, листа. M окно предположить, то, если онт^онетичесч более .молодые листы, образуются боль-

количеством ИК, то учет мутантных пятен на онтогенетически злее старых листьях приведет зя.-пгаенннч оценкам среднего чис-з ИК, образующих один лист, по розсточным листьям различного :1тогенетического возраста дал» следующие результаты:

Мутаген Доза, Роза-точные листья:

концентрация 1-я пара 2-я пара

Ш 80 кР 2,70 2,60

100 иР 2,60 2,10

НММ 3U мкЧ 3,30 3,40

оти да>.лне указывают такхе на отсутствие статистически юстоверпых различий по 1Ь ик, вычисленных для 1-ой и 2-пЧ пазы настоящих розеточных листьев. Из этого следует, что онтого-штичсскиЛ возраст листа также не влияет на оценку среднего шс..а ПК, оо'разупщпх один лист.

О дзии/оочпяи «iuyigi_ 'гт^м^шелом ивз;ш101Щ1к_!'2-

raijro'iuiix стбчгиП. лотя число lui, оортулдих ':-о листа, по на-

.12 • риантам опыта не менялось, из этого совсем на следовало, что ник » 4Я.ИК. Если одна и та ке ИК участвует в образовании тка-нэй более, чей одного листа, то в этом случае: шш в (I - £ )4 Ник < 4.1ик. Здесь •/• - это до^.- ИК, участвующих в образовании тканей более, чей одного лиг га, или ке, что то ке самое, доля случаев, когда одно первично^ мутационное событие приводит« появлению более, чем одного пятна. Оценка вел; чины.^, следовательно, приобретает принципиальное значение, т; как от этого зависит относительная точность определения'числа ИК в целой и частоты мутаций (М) на одну ИК в частности. Процз' дура определения величины -р подробно описана в 'главе 4 диссерп ции. Она'основывается на естественной допущении, что частота возникновения растений с 1-й, 2-мя и 0олее мутациями (мутантны-ии пятнами) соответствует распределению Пуаосона. Ряд процентных значений £ , отобранных нами из 15 вариантов и вычисленных как .отклонения от Пуассоновского распределения, представлены в табл. 2.

Полученные результата показывают, что индуцируемая нутаге' ном в ИК мутация приводит в большинстве случаев к образованию только одного пятна. Однако первичное мутационное событие'ноже1 приводить и к образованию двух и более пятен. В пользу этого у верядения говорят вычисленные значения £ , которые колебались • от опыта к опыту в пределах от 0 и до, 20%. Следовательно форму ла к ик ез (I )4 Я.ик, предложения для определения числа И1 является наиболее точной. Исходя из вышеизложенного, формула для количественной оценки частоты мутаций приобретает следующи; окончательный вид; . .

М н -М£- (3).

4(1 - ) дик

3. Апробация метода. Тест-система, основанная на учете соматической химерности, позволяет в принципе рассчитывать час' тоту индуцированных мутаций по экспериментальным данным двоякого рода. Во-первых, по данным регистрации мутантных пятой на нормально-зеленых розеточных листьях гомозиготных растений, доминантных по генам дикого типа ( ). Вс-вторыу, по учету мутантных пятен на хселтс-зеленг : листьях гетерозиготных рас тений арабидопсиса ( ик+/с11~ ).

Распределение пятен на гетерозиготных растениях арабидопсиса ( сь+/°ь~ )

мутаген

Доза, кР; концентрация, мкМ

Наблюдаемое число растений

без пятен .

с .однмн пятном

с двумя и

более пятнами

Теоретические значения

с одним пятном

с двумя

и более пятнами

%

П1 40 732 18 0 17,8 0,2 0

60 369 16 0 15,7 0,3 0

30 952 56 6 60,1 1,9 6,8

— Ч — юи ■ 891 64 3 64,6 2,4 • 0,9

1Ш 2П0 234 26 0 24,9 1,1 0

300 536 56 18 69,3 4,7 19,2

400 2243 165 170,4 6,6 3,2

Следует оообо подчеркнуть, что на растениях дикого типа можно оценить .такта частоту мутаций и при помощи другого метода - метода эмбрионального теста. Использование двух названных методов учата частоты мутаций на одном и том ка материала позв лязг получить дополнительные сведения о роли генсгппа в экопер ментальном мутагенезе, а такао ответить на вопрос, какова абсс лютная и относительная чувствительность предлагjeu ого нами мет да. В апробационных опытах ппиненяли ГО и НММ, широко иопользу омыв в исследованиях по экспериментальному мутагенезу (Домченк 1975; Pujii. , 1984; ModnJi.Uomonov , 1985; Vig., 1985).

Из данных, представленных в табл. 3, видно, что по частот мутаций геторозиготы, примерно б 5-7 pas, оказались чувсивител нее к мутагенным воздействиям, чем гомозиготы дикого типа. Эти результаты вполне согласуется о экспериментальными данными, пс лученными.Б.К.Вигом ( Vig, 1975) ранее на растениях сои. В ука занной работа.автор установленные различия в чувствительности объясняет там, что целый ряд генетических изменений, приводят« к возникновению химерно^ти у сои (роцессивные точковые мутации долоции, соматический кроссинговер), у гомозиготных растений к возникновению химерных тканей не приводит, Вполне возможно, чт данное объяснение приенлимо и для получоыных нами результатов.

В опытах по апробации метода мы также питались получить ответы и на поставленные выше вопросы.об абсолютной и относительной чувствительности тест-сиотемы. Для оценки абсолютной чувствительности метода сравнивали частоты мутаций, расчитан-лыо как по дапным учета индуцированной соматической химерности хая и по данным эмбрионального теста. Результаты такого сравне ния для ряда изученных нами мутагенов показали, что величина Ii

' вычисленная по мутантиыг пятнам, изменялась в проделах от

' —3 —3

0,9*10 и до 9*10 , что примерно в 15-20 раз меньше соответс вуюп^йх величин, .полученных при помощи эмбрион-теста.

Большая абсолютная чувствительность эмбрион-теста объясня отоя том, что в нем регистрируются мутации по нескольким сотня локусов ( L'uller ; 1963; Иванов, 1974; Rodel , 1982), а при ин аудировании мутантних пя-ин у полудогшнантного мутанта араби-допсксл лишь по одному локусу - cji . Однако, согласно предвари тольяой оценке, частотя гут«ни:К, региотрирузмая наши;.; методом

и iu.ii аа ъоиточ м.углции 1и ), расчитайную по кутаатнкм ллгнаь', на гомо- к гетерозиготных растениях арзендопсиса

: п-1 иО. Л- ^ о о , Л* , Гомозиготы ( «г/Яг' ) ■ Гетерозиготы ^ ЙоТсЬ" )

Мутаген ! ¡««центра* • ЦП Я, " число : 11 Е1П — 13 пах ! х число • 15 и1л - И сах X

Г/, 50 421 0,007-0,22 0,060 661 0,26 - 0,66 0,43

75 206 0,009-0,40 0,030 287 0,28 - 1,05 0,57

¡¡^М 200 150 0,009-0,2? 0,078 310 0,20 - 0,58 * 0,35

-"- 0 162 0,003-0,31 0,068 322 0,24 - 0,75 0,44

¿,00 1295 0,034-0,15 0,076 2420 0,43 - 0,63 . 0,53

3 контроле М -1*10-°. Цутаген::оиу воздействию подвергал!! воздуино-сухие семена ЮШ ; о}-., допейся. Посев обработанных сзыяы, их проращивание на агаре з чапках Петри и пересадку про-Гогтков в почву озуЕоствдяли о стандартной методика (Иванов, 1974). У .ет ¡^тантных пятен прово-•,г..т,: на 4-х сформировавшихся розеточных листьях.

в локусо Oh, примерно на порядок величин больше, чем средняя (на I локус) частотг возникновения летальных.хлорофилльных мутаций, выг .шемая методом эмбрионального теста.

При оценке относительной чувствительности^тест-системы, основаннбй на учете соматической хикерности, необходимо иметь ввиду, что за I час можно изучить 1500-2000 растений или же 20 000-30 ООО'ИК. При помощи• эмбрионального теста за то'.жа самое время можно проанализировать, примерно 200 стручков, что эквивалентно лишь 80-100 Ж при 5-и стручковом анализе на од- . ном растении, или ко 200 ИК при одностручковом анализе (llednik, 1988). Следовательно, для ГИ при помощи эмбрион-теста регистра* руют 8а единицу времени, примерно в 10 раз меньше.мутаций, чем с пойоцью .теста на соматическую химёрность; для НИИ - в 3 раза меньше, а для ЭИ - в 2-4 раза меньше. Если предположить, чт-за один рабочий день можно проанализировать 10^ растений (I05 - I.S'IO^K), то удается выявить мутагенную активность, соответствующую 100 Р и достаточно точно оценить величину ti для I кР4 Сказанное свидетельствует о достаточно высокой чувствительности разработанного нами метода и дает нам все основания рекомендовать его для количественной оценки мутагенной активности не только физических агентов и химических веществ, но к любых факторов антропогенного происхождения. .,

.4. Действие IV!, гШ. ЭИ, рогора и фозалона на число инициальных клеток и частоту мутаций у арабидопс'иса. Мутационные исследования, в которых мутагенному воздействию повергают организмы любого вида, начинают с построения кривых доза-эффект (Ли, 1963; Тимофеев-Ресовский и др.,.1968; Иванов, 1974). Кривые доза-эффек , построенные по мнох^м экспериментальны!,! точкам (охватывающие верхние границы толерантности объекта), дозволяют плодотворно исследовать закономерности действия мутаген них факторов не только на генетическое строение, но и на на еле ственную изменчивость кивых организмов.

В опытах по учету частоты мутаций, основанных ка применен апробированного нами метода индуцирозанной соматической химерн стг, изучали действие И'., супер;:утагонои н:.!М и Ж, ч так:хе двух пестицидов - рогора i: фозалона, варохо используемых в хлопководстве для борьбк с иогскагиуи-зрздктелнан хлог>, а тайка.

ПхЮ'

50 100

400 икы

10 *

0,0025 0,005 0,01

0,02 0б.%

ИхЮ"

0,0x25 0,025 0,05

4-Ц-

0,10

-о I

0,20

Риз. I. Действие различных доз ГИ и концентраций ЭИ, Ш&, рогора фозалона на число , шщналышх меток ( нес) ц частоту хиутиций (11) у арабвдоподса.

Результаты проделанной работы представлены на рис. I. На этом рисунке для ионизирующих излучений и супермутагенов приводятся также д-.шые по влиянию различных доз и концентраций химмутаге нов на изменчивость числа ИК, образующих вегетативную ткань ра тений арабидопсиса. Они полностью подтверждают обнаруженную ра нее закономерность,.что с возрастанием дозы мутагена уменьшает ся число ИК (ЫейпИс, иашапоу . , 1982; 1985), причем, как и в процитированных здесь работах, этот эффект не проявляется для 1Ш. Для объяснения такого результата можно привлечь известные сведения о том, что значения чисел ИК, полученных в опытах с ионизирующими излучениями, обычно меньше, чем в опытах с большинством химмутагеиов {Шевченко, Гриних, 1981). Обычно это объ ясняют, так называемый, продленным мутагенезом. Однако возможно и другое объяснение полученного результата, основанное к . практической невозможности 1007» отмывки обработанных семян от прош,.шего в них мутагена. Тогда с увеличением концентрации ШШ возрастает, с одной стороны цитотоксический эффект и гибед ИК, а с другой - повышается абсолютное количество мутагена, ос тающееся после отмыыси в сеиени, так называе.мий "эффект хранения" (Ауэрбах, 1978). Взаимодействие этих двух причин вполне может привести к нерегулярным, хотя и статистически значимые, различиям в числе ИК при различных концентрациях НИМ. Из рис.1 также видно, что средняя частота мутаций при расчете на одну ИК закономерно возрастает для всех изученных мутагенов.

Результаты опытов показывают, что изученные «озы.Ш и кон цантращ"" Н1Ш индуцируют на порядок величин больше мутаций, чем ЭИ и на два порядка больше мутаций, чем пестициды. Аналогичные результг-'ы для ЭИ и НМЛ были получены на сое, традесканции и некоторых других растительных объектах (Сальникова и др„, 1994).

Изложенные в этой главй экспериментальные данные позволяют предложить необычный для высши.. растений, новый способ оцен ки относительной мутагенной эффективности физических агентов и химических соединений.

Известно, что тского рода сравнения косят проб зматичный характер и решаются различными авторами по-разному (Хропова ' и др., 1964; Сидорова, 1966; Захаров, •лпнбпскнй, 1572; ^езчен-

Рис. 2. Оценка относительной мутагенной эффективности I - рогор, 2 - ЭИ, 3 - 1И.

: 20 ко, 1979). Располагая экспериментальными данными по изменчивости числа ЙК и частоты мутаций при различных дозах мутагенных воздействий, мы провели калибровку генетических эффектов по числу ИК. Результаты проделанной таким образом рабс:ы представлены на рио. 2. Они в целом подтверждают сделанный нами ранее вывод о том, что по генетической эффективности исследованные мутагены ыоено размоотигь .в следуйщей последовательности: Ш>8И>рогор.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Апробация разработанной нами новой тест-системы, основанной на индукции соматической .хиыерности (ТСХг-тест на соматическую химериос.ть) у полученного и. подробно описанного нами нового полудоминантного хлорофилльного мутанта арабидопсиса, дока-вала возможность количественной оценки.с ее помощью генетической активности потенциальных мутагенов..Анализ структуры химерных растений позволил предложить достаточно точные методы оценки 'Л-ик, и иик, и на атой основе модифицировать известную формулу для.оценки чес оты мутаций, которая окончательно приобретает следующий вид: __ . Следует подчеркни ) пак

путь, что возыоашость' надежного определения "И-ик связана с благоприятным обстоятельством - арабидопсис обладает самым малень-; киа вегетативным апексом из всех изученных растений (Певченко, Гриних, 1981), поэтому лист образует- лишь несколько (3-8)ИК, а но сотни, как, например, у сои.

Методическая простота анализа делает ТСХ высокочувствитель-. нам в практическом отношении - за единицу времени с помощью этого метода можно обнаружить в несколько раз больше мутаций, чем-о помощью эмбрион-теста. Еще одним преимуществом разработанного нами ТСХ перед эмбрион-тестом на арабидопсисе и' тестом на соматическую химерность у сои, является более высокая скорость получения результатов (15-20 дней, вместо 30-35 дней). Арабидопсис, по-мимо всего почего, характеризуется относительно низкой частотой спонтянных мутапй. В контрольных вариантах опыта ни в одном случае нами химорных растений не было обнару-кено. Вместе с тем, всего два химер:.-дх растения все ке было обнаружено при размножении очень большой по объему генетической

текции лаборатории физиологической генетики, что дало нам лоаноств определить частоту спонтанных мутаций по локусу а.„г1па ", равную 1х1С~^. Следовательно, на таком фоне споп-1ого мутирования становится возможным улавливание мутагонной активности далее очень слабих мутагенов, что позволило нам троить кривые доза-эффект для широко используемых в сельс-хозяйстве пестицидов- рогора и фозалона.

Что касается гензтических механизмов возникновения сомати-:ой химерности у арабидопсиса, то они, как нам представляет-идентичны механизмам, приводящим к возникновению химерности гастьях. сои, предложенных Б.К.Вигом ( У^а , 1975). По его шю, к возникновению химерности на листьях сои приводит наряд генетических событий - соматический кроссинговер, раз-ше виды анеуплоидии, делеции, точковые мутации и др. При I соматический кроссинговер, рецессивные точковые мутации, щии у гомозиготных растений дикого типа (в виду их гомози-юсти) к возникнезогл:» химерности не приводят. А цитоплазма-¡ские мутации (например, нутации в ДНК хлоропластоз), согла-Б.К.Вигу, ,;р;;зодлт к возникновению химерности растений осо-) вида с ууталтнымп пятнаки, не имеющими четких границ, в ;чие от случаев ядерных мутаций, детерминирующих мутантные т с совершенно четкими очертаниями.

Сравнительное изучение индуцированной соматической химерен на сое (в нашем распоряжении имелись семена ПХМ сои лиТ 219, использованные в работах Б.К.Вига) и арабидопсиса ывает на более высокую чувствительность к мутагенноиу воз-'твию гетерозиготных растений по сравнению с гомозиготами. !ших опытах с арабидопсисом, так ке как и в опытах Б.К.Вига юс, были зарегистрированы случаи возникновения на растеии-:лорсфилльных птен, ке имеющих четких границ. На таких рас-ях не представлялось возмонныа точное определение соотнеые-нутантной части листа к нормальной, в связи с чзм они исклю-сь.из дальнейших расчетов частоты мутаций. Следует юдчерк-, что генетика пятнистости, индуцируемая мутагенами у полу-нантных мутантов, не достаточно изучена. В связи с этим ый интерес представляют результаты-опытов П.С.Карлсона.' ■1аоп, 1974), который . правы генетический анализ различных

типов химерности у полудоминалтного мутанта табака и пришел к исключению, что во всех случаях (100%) имело место ядерное наследование признака пятнистости, а также.опытов С.Г..Демченко с соавторами (Dencherüco ot al., I972;I973) и Г.Рёбб-элена (Hübbe-len, 1972), которые определили генно-хромосомный :^рактер возникновения хлорофилльной химерности путем.исследования каллус-ной культуры мутантной ткани арабидопсиса.

. Соглаоно описанию соматической химерности табака по П.С.Ка] лсону, она, как. нам предотавляется, идентична пятнистости, наблюдаемой нами на арабидопсисе и Б.К.Вигом на сое. Сказанное говорит в пользу того, что генетические механизмы, лежащие в основе соматической химерности у полудоминантных мутантов сои, табака и арабидопсиса, вполне входные.

В заключение краткого описания основных итогов проделанной работы следует еще раз подчеркнуть, что нами создана новая тзст-систеыа,. позволяющая в кратчайшие сроки и с минимальными затратами труда регистрировать генетические изменения, возникающие в инициальных клетках арабидопсиса. Разработанную нами тост-систему на арабидопсисе можно рекомендовать для определения генетической активнооти исследуемых мутагенов и антропогенных загрязнителей. А также в учебном процессе при чтении лекций по курсу "Общая генетика" и при' проведении практических занятий по разделу индуцированная мутационная изменчивость у высших растений.

ВЫВОДЫ

Настоящая работа посвящена феногенетическому изучению индуцированной соматической химерности у полудоминантного хлоро-фклльного мутанта A.thallana и- созданию на этой основе новой высокочувствительной тост-системы для количественного учета частоты мутаций. Основные полученные результаты можно кратко сформулировать следующим образом.

I. В результате обработки воздушно-сухих семян расы ЕпЗг-hoira супориутагеноы ЭК в концентрации 0,0225 об# получен новый полудоминантный мутант типа Cblorii-j, стручковое потомство которого распадается на ри геиотип.леских класса в соотношении: I OhVcH4" : 2 Ch+/ch~ : х ch~/ch~ . То-есть, на 1-у часть раотзикй дикого типа приходится 2-е части гетерозигот и..1-а •-■

сть рецессивна гомозигот, гибнущих на фаза формирования са-дольных лиыь.в.

Анализ стручкового потомства ПХМ Ch.+/ehT показал, что во ах ег.о плдах обнаруживается расщепление и по огласке, однако есь на 3-й части семян, окрашонных в нормально-зеленый цвет, иходилась 1-а часть семян ярко-желтого цвета. То-есть, имело сто расщеп;..шЙ9 в соотношений 3 Cb.+/Ch.+ : I сЪ~/сЪ~.

Феногзнетическое изучение ПХЦ показало, что желто-заленал раска листьев Меняется к концу вегетации на нормально-зэле-ю окраску; по другим изученный параметрам - по росту, разви-п, плод' зитости и т.д. такой нормализации но происходи-.

2. При изучении на розвточных листьях растений, относящих-к дг.м геиотипическиы классам (Ch+/Cli+ и сь+/сь"* ),

коиомерностей возникновения и развития 1..;дуцированной rauua-лучьнием (ГИ) и Н -нитрозо- Н -метилмочевиной (НШ) ссмати-ской химерчости получен ряд новых сведений (о роли диплонт-го отбора, о роли онтогенетического возраста листа, о харак-ре взаимосвязи между частотой возникновения пятниотости ^ ной стороны, и числом независимых мутационных событий -угой, позволяющих достаточно точно определить ч^сло ИК, фор-рующих генеративную ткань арабидопсиса (число ИК колебалось' пределах о? 8 и до 30) и модифицировать известную формулу .tillar, 1963; Иванов, 1974) для оценки частоты индуцируемых таганами мутаций, которая приобретает следующий окончатель-а вид: ц В tip_ .

4(1 -f ) TLик

3. Детальная апробация метода, проведенная на примере ли-цирования соматической химерности различным дозами ГО и нцентрацилми ¡ш у растений, принадлежащих к двуы генотипп-ским'классам (Ch+/cn+ и óh+/ch" ), зыявила относительно льшую чувствительность гетерозигот по признаку - частота ыу-ций по сравнению с гомозиготными растениями дикого типа. Сло-ватэльно, для изучения мутагенной, активности но только "силъ-к" (ионизирую^, j излучения, химические супермутагены), но я лабых" (химические загрязнители пригодной срег.ы) мутагенов лесообзазно использование полудсктнзитаэго мутантз арабпдоп-са (Ch+/c¿i~ ) з качестве зысокочузстзнтел- эй тосг-систе^ы.

4. Высокочувствительная тест-система, разработанная нами на полудоминантном -лорофилльнои мутанте арабидопсиса, исполь зована ¿,"я изучения мутагенного действия Ш, НИМ,- ЭИ и двух п тицидов - рогора и фозалона. Анализ характера хода кривых доз эффект (ДЭ) в широких диапазонах доз Ш и концентраций химиче ких веществ привел к обнаружению сильной мутагенной активиост Ш, НММ и ЭИ и очень слабой - рогора и фозалона.

Возможность регулярного определения числа ИК и, следовательно, частоты мутаций от опыта к опыту, позволила нам предл ï..iT3 новый способ оценки относительной мутагенной активности зических и химических веществ, сводящихся к калибровке мутаге ной эффективности, (частоты индуцированных мутаций) по числу Ж. Это позволило расположить исследованные факторы по мутагенной эффективности в следующем порядке: И> НИМ >ЭИ>РОГОР >ФОЗ/ "Ю - 5. Наиболее общим выводом, из всех проделанных экспериме тов, является следующий. Впервые на примере, полученного под действием ЭИ, полудоминантного хлорофилльного мутанта арабидо сиса создана новая высокочувствительная тест-система, которая позволяет с небольшими затратами труда и времени, а такие с н значительными материальными затратами, на количественной осно оценивать генетическую активность любых факторов, включая и х, иических загрязнителей природной среды.

Список опубликованных рабо^ по теме диссертации:

1. Махаадбеков Т.С. Новая тест-система на высших растени для обнаружения мутагенов природной срзды // Тез. докл.научн. конф. "изучение и рациональное использование природных ресурсов".-.Уфа, I99I.-C. 63.

2. Медник .¡.Г., Махладбеков Т.О. Использование ипдуциров, ной соматической химерности у арэбпдопск.са для оценки.частоты возникающих мутаций //ЭКОГЕН.-Новосибирск, 1992,- 1:ï I.- С.1.5

3. Медник И.Г., Махмадбеков Т.С., Успанов П.Д. О новом тодо оценки генетических эффектов, вызываемых мутагенными воз' действиями на семена Arabidopeis thalianc. (L) .НзупЬ/Д1зв.АП : Отд. биол. и мод. наук.- 1997.- !й 1-2(137).- С. 62-73.

4. Усманов П.Д., Махмадбеко:! Т.С., Назарова X. Г. Полудом; нантлан хлорофилльная мутация с рецессивным летальная дейстяи у Arabidopala thaJlana (L) líeynh //" Г.зв.АН PT. Отд. о::ол. и мед. наук.- 1997.- № 1-2(137).- С. 74-80.

5..5-52303 ¿.С., Уагл:;.-: 'Л.Г., Усмснов П.Д. ¿зЛетзге ага:;?сз на частот/ аутациЛ б яхлциальных клзтхах за-ггзтт:-: оЛ .••■чсзсгзми роосзочныг. .~:стъез АгаЪ1с.овз1з 4ЬаХ1аае

Ноуг^. -и зозд^гас-сузсх сзмензх, подззргзу-

а. лдк.-наа различных к^гзгзаог.) //.'зз. Ай ?Т. Стд. Сло~. и зд. наук.- (з лачэгл).

Подписано ь печать 5.33.57г. Формат 50x54'У^о. ...зга" Т"П 2. Офсетная печать. Узл.~«ч.л»15. Усл. г'ц.отт.1,7 . Уч.т*зд.л.1,Ь. 6С. Заказ С41.

1'*псгряфир Акядеу."» наук Республик*« Т*д.-г-к*стгн