Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гетеротрофные скользящие бактерии мидии прибрежной зоны Одесского залива

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Гетеротрофные скользящие бактерии мидии прибрежной зоны Одесского залива"

ОДЕССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им.И.И.МЕЧНИКОВА Биологический факультет Кафедра микробиологии и вирусологии

На правах рукописи

Д2АХУДК АБДЕЖГИНЯ

УДК'579.82:574.3

ГЕТЕРОТРОФНЫЕ СКОЛЬЗЯЩИЕ БАКТЕРИИ МИДИЙ ПРЙБРЕЯНОИ ЗОНЫ ОДЕССКОГО ЗАЛИВА

03.00.07 - Микробиология Диссертация на соискание 749ной степени кандидата биологических наук

Одесса 1992

Работа выполнена на кафедре микробиологии и вирусологии

Научный руководитель - кандидат биологических наук доцент В.А.Иваиица

Официальные оппонента - член корреспондент АН Украины

Ведущее учреждение - кафедра микробиологии

Московского госуниЕерсктета

Защита диссертации состоится 26 аш 1992 года в 13 часов на заседании Специализированного совета

|< 006. 09 Ой < Игстигут микробиологии АН Белоруски Минск,уп.Жодииская(2.

С диссертацией шшно ознакошться в .библиотеке инситута шкробиояогки АН Беларуси •

Автореферат разослан 26 мая 1592 года Ученый секпетаоь ■

Одесского госуниверситета ш. И.И.Мечникова

профессор В.П.Тульчииская, кандидат биологических наук Г. А.Соломина

Н.В.Образцова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

_Акт£алькость_теш В связк с бурки развитием мзрикудьтуры морских моллюсков изучение микрофлоры мидий представляется ' акту а лыки.

'Микроорганизмы используются моллюска™-био<|ил>тратораыл как источник питания и могут применяться при искусственном раззедеяии, • особенно для подкормки -личинок. Накапливаясь во внутренних органах, патогенные микроорганизмы могут представлять опасность для человека при использовании в пищу недостаточно обработанных моллюсков. 3 то не время некоторые микроорганизмы являются патогенншга для моллюсков, особенно на ранних стадиях их развития.

Изучение численности и состава микрофлору моллетскоз и вод, предназначенных для искусственного развития, используется при мониторинге и дает возможность повысить экономическую эффективность хозяйств марикульт-уры.

Хемосрганогетеротрофнне скользящие бактерии, являясь одной из относительно иало изученных групп бактерий, представляй.1 интерес благодаря своим специфическим биологическим особенностям и. активному метаболическому потенциалу (Relchenbach, BvvorfcLn, 19Ö1; Ивзяица I9S0). Они играют ванную роль в круговороте веществ в природе, выступают как биологический регулятор численнсзти бактерий в ыжфобных ценозах, лизируя клетки про- н эукарпотных микроорганизмов. Есть достаточно сообщений о том, что.Оактерьга этой группы вызывают заболевания рыб, креветок, и других гидробиоктов. Однако, практически мало что известно о численности и свойствах скользя1цих бактерий микрофлоры моллюсков.

Ш:5ь_р8богн: Изучение количественного и качественного состава хемооргзногетеротрсфнпз скользящих бактерий, входных б состав микрофлора мидий прибрежной зоны г. Одессы, их биологических особенностей и характера взаимоотношений с. иоллвскгли.

1, Изучение численности бактериологических ц протоолитич&скмх скользящих бактешй'-в мягких тканях я па поверхности стборок раковин мидий.

2.' Получение' частых культур скользявзк бактерий.

3. Изучение фвнотипических признаков и идентификация вташов, изолированных из мидий.

4. Определение уровня резистентности к антибиотикам и тяаелшм металлам изолированных таймов екользящдх бактерий.

5. Разработка кетодаки получения и поддержания в' физиологически активно:..1 состоянии культей клеток гинтак нндиЯ.

6. Изучение цитслатического действия изолированных штаиыов скользящих бактерий на ионослойную культуру клеток мантии ыздий.

Вперзые определены простралствешю-времешще закономерности количественного содеряашк сксльзяцде бактерий в мидиях прибрежной зоны г.Одесса.

Показано, что в мягких тканях мидий скользяхцие бактерии представляют транзитную микрофлору, а на поверхности створок раковик входят з состав постоянных обитателей.

Впервые определен таксономический состав скользяща бактерий -членов микробного населения индий, и продемонстрировано наличие ■ шжсоСчКтерий в обьектах морской среды.

Изучение характера взаимоотношений изолированных птаиаов цитофаг и шксобактерий с нидиями ка модели культуры клеток ыаитии позволило отнести их к сапрофитный ыикроорганизыаи нормальной микрофлоры этих моллюсков.

Установлены высокие уровня и спектры резистентности скользящих ' бактерий микрофлоры шдай к антибиотика« и тяганш металлам.

Скользящее бактерии составляют значительную часть гетеротрофной микрофлора шдай в районе Одесского поберззья. В иягккх тканях издай ош представляет транзитную иифсфагору» на поверхности раковин входят в состав постоялках сапрофитных обитаплей моллхюхоз. Таксономический состав скользящей шщрофлоры, шдай Еклачает широкий спектр видов родов СуйорЬа^а и Ро1уап^1ш. Скользяща бактерии микрофлоры задай обладают высокой и множественной устойчивостью к антйбиотнкаы и тякалш неталлаа.

Практической анотениа. Подучекгше розуяымга ютут быть ксиояьзована при проведении ноииторянта прибрагишх аод, пргдиззкачекых для искусственного варздазашя колдхскэз.

Л

Метод получения нонослойшх культур клеток кантата мидий когет Сыть использован для определения патогенных свойств бактериЗ по отношению к коллоскам.

Полученные данные использованы в учебно;,! процессе при чтении лекций, выполнении курсовых и дипломных работ на кафедре микробиологии Одесского гооуниверситетэ.

Глазные результаты по теме диссертации представлены ка конференциях молодых преподавателей и ученых (г.Одесса, 1950, 1991, 1992 гг.), на Всесоюзной научной конференции (г.Махачкала, 1990 г.), на семинарах кафедры микробиологии и вирусологии Одесского госуниверситета.

П^блик^ции. По теше диссертации опубликована I печатная работа и 2 сданы в печать.

Диссертационная работа изложена на 166 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, вюшчзщего 189 наименования. Текст иллюстрирован 50 рисунками и 14 таб.лщаш.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и метода исследований Объектом исследования являлись скользящие бактерии, входящие в состав. шикрофлоры мидий, собранных в различных местах Одесского поберегья Черного иоря.

Мидии (НуШиз qalloprovincialis) и пробы воды отбирали в района волнолома на восьми станциях Одесского побережья: Чузановка, Гавань, Лангерсн, Дельфин, Биостанция, Аркадия, 10-ая и 16-ая станции • Большого Фонтана . Волнолом представляет собой искусственное железобетонное сооружение, которое- предназначено для защиты береговой полосы от разрушения. Он тянется сплошной полссо" с небольшая разрываю на расстоянии 50-100 метров от берега.

Отбор кадия осуществляли с поверхности воднолона со сторона меря и со стороны берега. Подготовку их к анализу проводила сбжепргшят® ггетодрга с учетом правил асептики. Сяжяе ч&тоион

клетки оэктерий суспендировали в стерильной морской воде на Магниткой ыеиалке.

Учет микроорганизмов во внутренних органах моллюсков пров&дили путем посева гомогената, приготовленного из мягких тканей.

Общую численность гетеротрофных микроорганизмов определяли на нясо-лептоннон бульоне методом предельных разведений. Численность бактерий группы маечкой палочки (БГКП) - на среде Зндо.

Скользящие бактерии с прогеолитической активностью выявляли на среде CFCK (Ивашща, Еликская, 1988), содержащей (%): пептон - 0,1, дрожжевой экстракт - 0,2, обезжиренное молоко - 1,5, агар - 1,5. Среду готовили на морской воде с добавлением 38 мкг/мл полншксина к 25 шсг/мл циклогекскиида, рН - 7,2.

Скользящие бактерии с бактериологической активностью учитывали на среде с E.coli (E.coli Médium), которая включает (55): промытые клетки Escherihia coli - 0,1 г/100 мл, MgS0¿ 7Hg0 •• 0,05, NaCl -0,6, агзр - 1,5 (Reichendach, Dworkin, 1987).

Посевы инкубировали в течение 72 часов при 25 °С.

В ходе исследований было выделено 34 шташа скользящих бактерий, которые затем служили обьектои изучения и идентификации.

Морфологические свойства клеток определяли с поыоцыо фазово-контрастной и электронной микроскопии (ЭВМ 100 АЮ.

Для определения ряда физиолого-биохимических признаков была использована комплексная система тестирования API 20NE (Biomsreux, France), предназначенная для идентификации грамотрицательных не кишечных бактерий (21 гест). Выделение ашиака, сероводорода, гидролиз крахмала выявляли по Н.С.Егорову (1976). Липолитическую активность, разжижение коллагена, гидролиз и рост 'Ь присутствии додецалсульфатв натрия (SDS) выявляли по методу P.Christensen О 977).

Наличие пигментов типа флексирубин определяли методом £. Pauta (1578). '

Для идентификации видов использовали схемы,' описанные в э4оы издании определителя Берги (1984) и Procaryotes (1984).

Минимальные ингибирувдке концентрации (МИК) определяли методом стандартных серийных разведений в плотной агаровой среде СРОК. В работе использовали 12 антибиотиков основных групп: бензйдпегащиллин (Реп), ампициллин (Аир), метащшин (líet), амоксиллин (Amo), генташвдш (Gen), кангз^щик (Кап.), моношцнп

ó

(Ь'оп), стрептомицин (Str), хлораифеяпкол (Clm>, тетрациклин (let), налщгассоввя кислота (Nal).

При определении устойчивости я тяяелым тталлеи использовали соли Hg(l'03)2 2Н20, Pb(ira3)2, CuS04 (безводный), CdCl,, CoCl,, ÜÍS04.

Для выявления патогенных свойств бзктеркй в качестве ыодела использовали первичную культуру клеток мантии 1.с1дий. С зтсй. целью в настоящей работе была отработана методика диспергирования ткани на отдельные клетки методом гомогенизации (Spier, Griffiths, 1935). В H2ZZIX исследованиях гомогенизацию тканей проводили на магнитной мешалке в раствора Хенкса с антибиотиками (пенициллин 2 мкг/нл и стрептомицин I гжг/шо.

Для получения монослойных культур приготовленную суспензию клеток вносили в ростовую среду до конечной концентрации I06 кл/ыя. Клетки выращивали на покровных стеклах площадью I сьГ.

В качестве ■ ростовых использовали питательные среда различного состава,-приготовленные на основе среда Игла и среда 199 с добавлением сыворотки крупного рогатого скота (CXFC) и зыбряокалыюй сыворотки плодов коров (ЭСПК) в различных кощентрациях.

Флаконы с ;сформированным конослоен культуры клеток мантии зящиЗ ззркгалй суспензией 48-часовой культура бактерий з концентрации 1,0 х I0J кл/кя. Патогенные свойства ' бактерий оценивали по степени деструкции шнослоя (цятоталгааркпй эффект) я соотношению мертвых и яивых клеток наитии шдяй, применяя дифференциальное окрашивание .трипановыа синим. Степень дегенерации монослоя , клеток в нативных препаратах оценивали по 4-х бальной системе; дегенерацию 75-103 % оценивали как реакцию "Й", от 50 до 75 £ "+++", от 25 до 50 % - "++", менее 25 % - "+", нормальный монослой оценивал! как (Тульчинская и др., 1984). -

Микроорганизмы; вызыващиге увеличение числа «нежизнеспособши. клеток до ,25.,% и " деструкцию консслоя, не превышаяцую 25 %, считаются непатогенныыи, в диапазоне от 25 до 50 2 - потенциально патогенткш и свыше 50 % - патогенными.

С целью изучения морфологических и цитологических изменений клеток наптпп производили фиксацию препаратов в фиксаторе Бузка с последующей окраской геиатсксилкн зозин'еи (Тульчинская я др. ,■ 1Э84). ■'''■•'

Количественные результаты опытов подвергались статистической обработке по Н.А.Плохинскому (1975).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

I. Численность скользящих бактерий в мягких тканях и на , поверхности мидий

Проведенные исследования позволили установить основные пространственно-временные закономерности обсеыененности индий скользящими бактериями, обладающими протеолитической и бактериолитической активностями.

Численность протеолитических скользящих бактерий в воде зависит от сезона года и колеблется в чределах Ю3 - Ю4 КОЕ/ыл с выраженным максимумом в летний период (Рис.).

В мягких тканях мидий протеолитические скользящие бактерии обнаруживаются в широком диапазоне значений от 80 до 1,8 Ю5 КОЕ/г (табл. I).

Бакч-ериолитмческие скользящие бактерии присутствуют во внутренних органах в значительно меньшем количестве. Численность их колеблется в основном в пределах 10-Ю4 КОП/г (табл. 2). '

Сравнительный анализ данных показывает, что на всех обследованных станциях в мидиях, отобранных с волнолома со стороны берега, содержание представителей этой группы бактерий значительно выше, чаще всего на порядок, чем в моллюсках,снятых со стороны коря.

Установлены значительные сезонные колебания численности обеих групп скользящие бактерий в мягких тканях моллюсков. Наибольшая обсемеценность отмечена в летний период. В вто время года она возрастает по отношение к весне и осени на один-три порядка, что объясняется их физиологической активностью и уровнем численности этих бактерий в водной среде. Наличие сезонных колебаний и зависимость между уровнем численности скользящи:- бактерий во ш-утренних о. ханах и в морской воде свидетельствует о транзитном" характере пребывания этих микроорганизмов в моллюсках.

На поверхности створок раковин мидий, как и внутри моллюсков, численность бакгериолитических бактерий обычно несколько чиже, чем протеолитических. Диапг-зон колебаний ¡представителей обеих групп довольно широк .и »составляет 1С-104 КОЕ/сы2 (табл. 1,2), Наибольшая

- станки/. отОора проб

обремененность как и в мягких тканях нуждается в летний период.

Установлено отсутствие существенных различий в оОсеыененности створок раковин мидий, собранно; с волнолома со стороны берега и со стороне! моря.

Отсутствие заметных колебаний численности скользяща: бактерий на поверхности раковин мидий, связанных с сезонностью и местом локализации моллюсков, дает основание утверждать, что зта группа бактерий представляет постоянных обитателей ракоаин гидрбионтов. Это утверждение обосновывается так^в теп, что скользящие бактер™, обладая особым способом -передвижения по поверхности субстрата, шеют .тенденцию к активной «адгезии.

Изучение скользящих бактерий в настоящей работе проводилось в сравнении с общей численностью гетеротрофных бактерий и БГКП.

Общее содержание гетеротрофных бактерий в воде прибреаной зош Одесского залива зависит от сезона и колеблется от Ю3 до Ю6 КОЕЛ-л.

Значительное число гетеротрофных микроорганизмов обнаружено в мягких т".анях шдий. В летние месяцы количество их составляло, как правило, Ю6 - Ю7 КОЕ/г.

Общая численность гетеротрофов в шэдиях, отобранных с волнолома со стороны берега на одак-дза порядка превышает содержание их в «оллюсках, снятых'со стороны открытой части моря. В среднем ч"сленность их составляет 103 - 104 КОЕ/си2.

Высокое содержание бактерий группы кишечной палочки было обнаружено в прибрежных участках моря, отгороженных волноломом. В летние ыгсяцы численность БГКП в этих участках в основном составляла сотни клеток в киллилитрэ, а на отдельных станциях (10-я 'станция, Аркадия) равнялась, соответственно, 2700 и 5600 КОЗ/пл. ОСсеменекность раковин ывдий достигла. 620-780 КОЕ/си2.'Наибольшее содержание санатерко-показательных бактерий внутри мидий составляло 9,0 Ю4 КОЕ/Г.

Таким образом, проведенные исследования позволили установить, что скользящие бактерии составляют значительную часть общей, гетеротрофной микрофлоры шдай (в средней 16-18 %), собранных в районе Одесского поберакья. Численность их, ' несомненно, связана о общей численностью гетеротрофов и БГКП и, следовательно, иолко предположить наличие прямой зависимости кевду обсе&ененостьв акутрёшкх "органов моллюсков бактериями этой группа и уровней

•о

Таолжа 1

Численность скользящих бактерий ео внутренних органах мадий, отобранных с волнолома прибрс-жиой зоны г. Одессы

/ М ±А. га с Р ч< 0,05 /

Станция Сг зон протеолктические (КОЕ/г) х 10 бактериолитичоские (КОЕ/г; к 10

со стороны барега со стороны моря со сторон« берега со оторо мы моря I

Лузано-вка весна лето осень 70 ± 6 3500 ±54-1 46 ± 12 110 650 57 £39, о +97,6 £ 16 40 •900 32 х 10 £ 118 £ 1 у £60 49 ± 1 ± 12 £ 13

Гавань весна лето осень 230 ± 58 2 7000+1350 32 ±10,9 - 1800 1500 42 £ 143 £ 150 £ 12

Ланже-рон . весна лето осень 40 ± 5 16000±1936 1400 £ 105 9 +2,8 12000+5200 52 ± 12 6 4400 750 £ 1,2 ±1094 £ 76 4 700 8 +1,2 £ 94 £ 2

Дельфин весна лето осень 160 + 12 4700 + 335 2300 £ 191 ■ 40 5й5 33 £ 4,9 +13,8 +Г.4.4 8 460 4 ± 1 £ (2 2,8 38 о ±0,7 ±8,7 ±0,1

Биостанция веска лето осень 60+5,4 120С0+ 465 НО £ 6,3 7,6 2400 36 + 2,8 + 212 £ 2,3 39 650 7 £ 3 80 ± 1 3,5 9 £ 1 ±1,1

Аркадия весна лето осень 3700 + 900 3000 £ 814 500 £89,2 24 2200 Во +12,7 ± 541 £10, 2 3100 1800 35 + 771 £ 94 £ 6 29 420 25 +1.9 ± 93 ±1,1

10-ая станция весна лето осень 310 +91,7 18000+ 751 3800 ±810 64 ±11,8 12000+ 652 2600 ± 133 270 1400 2500 ± 96 ± 127 £ 123 46 +5,4 1200+272 500 £107

16-ая станция весна лето осень 220 + 9,5 3000 + 725 1400 ± 242 390 300 760 £ 105 1 42 £ 155 81 3000 4500 + 8 £ 9-1 + 900 600 90 640 + 86 £ 12 £ 33

Примечание: * - исследование ке проводилось

Г.-'бЛ',!:,' Л» '

Численность сксдьгяшх бактерий ж>, ясверхягс«ги -ита. отоОрачггых с волнолома прибрежной' зоны г. Одессы

/ - М ±Л, где р'< 0,05 /

!

! п::стеоди?ические : ! I I КОЕ/смт х 10 '

Юта:!щ:я I Сезон [-------1---

! ! отоос-|зо оторо-

|вн с^рс-га! ки.моря

,---г------.----и

1 (соска! £0 ± 5 ¡4.5 1 0,9

¡ДУЗПКО- ичето I 180 ± 3911-10 ± 3.5

¡осеьы 300 1 '731120 ± £9 : : ! !• *

I ¡весна! 1-0 ± £91 - *

!Гавань ¡лето I 76 ± 7 |

Iосень! 80 ± 2?\ - !

! > I ■ ! I

1 ¡весна! 600 + 911260 + 65 |

Цапхе- !лето ! ЬЗ ± 141250 ± 71 |

¡рок осеньI 200 ± 451 00 ±1г'.о

бактериолитическке! (КСЕ/омт х 10 I

со стороны!со сторо береги • ¡г;к моря

у ±1,1 5 ±1,2 20 ¿1,3

1 Делырик

I

г гона

лето

осень

I (весна

¡Еио- ¡лето ¡станция¡осень

I ;

I ¡весна

I Аркадия|лото I |осень

!10-ая !станция

¡16-ая ¡станция

весна

лете

осень

весна

лето

осень

Г.Э ±3.71 2;±0,3 7.9 ±1,914.5 ± 1,2 <20 ±5,3(1,5 ± 0,2

12 ±1,31 \ 8 ± 2,1 300 ± 60¡110 ±31.5 4,3 ±0.4 3 ± 0,5

!

34 ±5.9 400 + 39 5,8 ±0,8

650 + 99 3000 ±492 360 ±154

14 ± 3,4 68 ± 6,9 1800± 602

42 ± 7,2 99 ±24,6 59 ±15,4-1

0,7 ~ 0,1 3 ± 0,5 7 ±1.1

¿0 1 11 23 ± 1 25 ± 0,6

240 ±12,2 14 ±1,4 590 ±84 1120 ±9,4 30 ± 9,31 19 ±1,2

4 ± 1 82 ±13,9 2 +0,15

13 ± 1,2| 0,7 ± 0,2|

150 + 14,0.5 ±0.15 260 ± 78 ±0,31

45 ± 6

2,7 ±0,42

26 ±1,25 17

320 ± 90 22

3 ± 1,1 200

180 ±11.1 6

1400 ±143 51

90 +9,8 45

60 ±10,1

вО ±11,1 9

IV ± 1,-* 18

5 ±1,1 21 ±1,3

7 ±1,2

±1.6 ±0,8 ± Ю

±1,4 ±7,3 ± 14

Примечете: * - исследование не проводилось

антропогенного загрязнения морской среды. Во внутренних органах скользящие бактерии представляют часть транзитной микрофлоры. Постоянный высокий уровень обсемененности поверхности раковик мйдгЯ свидете. ьствует, что гидрбионты не являются лишь объектом транзитного пребывания в вих скользящих бактерий, а служат длл последних экологической гошей. Это позволяет отнести исследуемые • хеыооргзнотрофше скользящие бактерии к постояюшы представителям нормальной микрофлоры раковин мидий.

2. Обзг.л характеристика штаммов скользящих бактерий, выделенных из мидий В ходе изучения закономерностей обсеыенешости мидий, собранных у берегов г.Одессы, было выделено и получение в чистой культуре 34 _гатамма скользящих. бактерий. Культуры скользящих бактерий были изолированы из мидий, собранных со всех обследованных станций, расположения вдоль поберелья. Штаммы выделяли осенью, весной и летом из мягки" тканей и поверхности створок раковин мидий, снятых с волнолома со стороны берега я со стороны моря обеих использованных средах (СРСН и ЕСМ). Это позволило охвати-«, весь возможный для выделения на в тих средах круг скользящ; х бактерий, входящих в микрофлору мидий.

Все изолированные штаммы образуй на плотной питательной сред« колонии в осноеноы желтого, кремового, оранжевого и розового цвета. Клетки большинства штаммов обладают ярко выраженным и характерные для этой группы скользящим движением, что , определялось быстрым распространением колоний по поверхности плотной питательной среды.

Лишь у 9 штаммов 'обнаружен пигмент типа фдексирубин. Все они окрашиваются по Грэму отрицательно, имеют форму прямых или слегка изогнутых палочек с закругленными или заостренными концами. Размеси варьируют от I до 10 мкм, в ширину 0,2-1,0 шеи, отдельно расположены, не соединены в нити.

Колонии шести штаммов через 1-у недели образовывали плэдс<ше тела, которые имели, как правило, форму шаровидных или овальных образований размером 20-60 х 40-400 мкм. На основании формы и структуры плодовых тел эти штаммы были отнесены к различным видам рода Ро1уапй1ш. .

Бее выделенные нггаммы являются мезофилла!, хорошо растут в диапазоне температуры 20-30 °С. Часть из них обнаруживали хорояий

рост и при 37 °С. Большая часть (около оО %) атамнов отнесены к аэробам, остальные - к факультативным анаэробам. Они спсзобны расти при 2-5 % NaC t что ;пзляется характерным для иорских бактерий.

Изучение биохимических свойств позволило показать дыхательный характер метаболизма у исследуемых шташов.

Яа отношение большинства из них к аэробаы указывает полсжителышй тест на оксидазу и каталазу. Б отсутствие кислорода изучаемые бактерии могут переключаться на анаэробное дыхание, при этом ош в основном восстанавливают нитраты до нитритов, но не до молекулярного азота.

Изучаемое представители «икрофлоры индий, как и большинство известных скользящих бактерий не образуют индол, .;е утилизируют серусодержащие аминмсислоты и, как следствие, ке выделяют !L,S. Большая часть штатов ведет процесс аыыояификашз! агяшскислот с выделением аммиака, но не имеет уреазу.

Наличие D-галактозидазы и отсутствие яденилдегидрогеназы ыодао считать характерным признаком изучаемых шташов. Гидролиз тирозина и SDS для них не является типичный.

Представители исследуемой группы обладают выраженной гидролитической активностью. Так, 62 % штампов гидролизуют коллаген, 59 % - желатин, 35 % - крахмал, 56 % - агар, В I -целлюлозу, 56 % лизируют клетка Е. coli. У 56 % штеышв обнаружена .лвполитическая активность.

Изученные штамму по-рззноыу относятся к предложенным источника« углерода. Мальтозу ассимилируют 63 % штаммов, ыаннит-63 %, лактозу - 57 %, сахарозу - 47 %, глюконат - 82 %, ызлат -79 %, цитрат - 63%. Обращает на себя внимание высокий процент итэымов, утилизирующих Ы-ацетилглюкозаыин, что следует.увязать со . способностью гидролизовать клеточные стешси бактерий».

На основании изученных признаков по схеме H.Reichenbach (1981) и девятого издания определителя Берги (Bergey's manual determinative bacteriology 9th ed) представители дайрой группы били отнесены к родам Polyangiua (6 штампов): Р. luteum от Л, ? Vitelline шт.13, 28, Р.aureura шт.30, P^celluloeum irr.16, P.minor шт.43; и Cytophaga (26 шташов): C.aquatilis ит.2, C.arvensicola шт.З, 10, C.lytica ит.4, C.heparina нт.5, C.fievensis и.8, 24, C.hutchinsonii шт.9, . C.latercuis. шт.14, C.feraentans шт.7, . C.succinicans шт.15, С.гозеа штЛ7* С.rubra e?.I8s

C.albogilva шт.20, С.uliginosa шт.22, C.xantha шт.23,

C.aurantiaca пт.25, C.saccaharophlla шт.27, C.salraonicolor шт.29, G.ílavicula шт.31. C.marinoílava шт.32, С.marIna шт.35, C.haloílava шт.36, C.johiiBonae шт.37, C.aprica шт.39.

3. Устойчивость штаммов скользящих бактерий к антибиотикам и тяжелым металлам

Результаты исследования свидетельствуют о том, что скользядае бактерии, выделенные из мидий Одесского залива, в подавляющей большинстве характеризовались высокой устойчивостью к антибиотикам группы пенициллинов. Так, для ыетициллина, ашшициллина, амоксиллйна я бензилпеницяллина доля устойчивых штаимов составляла 100 55, 91,2 %, 73,5 % и 61,8 %, соответственно. Регистрировалась также высокст устойчивость этих штампов по отношению к антибиотикам группы аминогликозидоз (Str - 70,6 %; Kan - 6Д,7 % )и тетрациклину - антибиотику широкого спектра действия (67,6 %). Чувствительными исследуемые штаммы оказались к гентаыицину (5,9 % устойчивых) и налидиксовой кислоте (8,8 % устойч1шых).

Диапазоны, в пределах которых варьировали МИК антибиотиков очень разнообразны. Значения МИК Pen, Amp, Met,. Won, Str и Kan распределены в широком диапазоне концентраций от I до 1024 «кг/ил. Узкий интервал значений МИК отмечен для Amp и Hal (8-32 мкг/ыл), С1ш (I-I28 икг/мл), let (4-128 ыкг/мл) и Gen (0,2-2,5 мкг/ил).

Модальные значения МИК варьировали в зависимости от вида антибиотика. Так мода МИК Amp, Met, Str, Kan одинаково высоки и составляют 1024' мкг/мл.

В то ise время, наиболее»характерный уровень устойчивости к Gen и Olm равнялся 1,25 мкг/ыл и 4 шсг/iui, соответственно. Низкими оказались также модальные значения .Mon, Nal (16 ыкг/мл), Amo и Tet (32 икг/мл).

Модальные значения МйК антибиотиков отдельно от цитофаг и ииксобактерий существенно ке отличалась.

Для 94,1 % изученных штаммов, выделенных из,мидий, свойственна множественная устойчивость к антибиотикам (4 и более детершшант резистентности). Наиболее распространены штамны, несущие б маркеров устойчивости (25,9 %).

Комбинации детершжант резистентности к антибиотикам представлены 26 R-спектраки. Доминируодяы, характерней для 11,8 %

i 5

штаммов, был R-спектр из 7 детершшвнт: Pen, .'jap, Ket, Amo, Те' Str, Kail.

Исследования устойчивости к тяжелым металлам показали, ч' практически все изученные штагам проявляют устойчивость к нот меди, свинца, кобальта, кадмия, ртути, никеля.

НИКи ионов металлов лежат в широком диапазоне значений: медь 3,1-100 ist/л, свинед - 2,5-160 мг/л, кобальт - 3,6-464 иг/я, кадо - 10-640 мг/л, ртуть - 0,2-350 иг/л, никель - 6,2-400 мг/л.

Модальные значения МИК ионов тяжелых металлов для общей грута всех изолированных пггаммоь скользящих бактерий состава соответственно для медо 50 иг/л (32,4 % штаммов), свинца 40 ыг. (55,9 %), кобальта 116 мг/л (47 %), кадмия 80 иг/л (55,9 %}, рту 5,5 мг/л (23,5 %), никеля 100 мг/л (41,2 55).

Мода (Ж тяжелых металлов длт цитофзг я миксобактерьЛ основном не совпадают и отличаются в большую или меньшую сторон Таким образом, цитофаги оказались более устойчивы к меда, кадмию ртути, тогда как ииксобактерии - к кобальту.

4. Изучение патогенных свойств шт;.мкоа скользящих бактерий

Как извест»'о, некоторые представители скользящих бактер вызывают заболевания раб, креветок и крабов. £ качест экспериментальной модели для определения патогенных свойств штамм скользящих бактерий, изолированных из мидий была выбрана первичл культура клеток мантии мидий. Нами разработан модифицирована метод дезагрегации и культивирования клеток тканей лида позволяющий получать полноценный, функционально активный hohocj: культуры клеток.

В качестве показателей патогенных свойств бактер использовали: I) деструкцию ыонослоя и морфологические изменен клеток; 2) выживаемость клеток ыонослоя (число негнзнеспособи клеток).

В результате исследования установлено, что в течение цервах часов после заражения ни один из изученных штаммов скользет бактерий не вызывал деструктивных изменений моиоелоя мантий мида количество нежизнеспрособнах клеток на 2-ь % превышало контроль! уровень.

Через 24-48 часов штаты 'Cytophaga heparina мт.5, Cytopíu marínoílava пгг 32, С. aprica s? 39, Cytophaga sp. et, б оказивзл:

iaOo вываленное действие на сформированный монослой культуры теток. При отс-ч отмечались морфологические изценения клеток, жкокапельная вакуолизации цитоплазмы, деформация ядер.

При микроскопическом изучеюш постоянных препаратов наблюдали дгезию шпсрооргаиизнов на поьэрхности клеточных мембран и рошгхяовеготе их в цитоплазму, при этом число неюгонеснособшх леток уве.щчилось незначительно (в пределах 5-10 2).

Однако увеличение срока экспозиции до 72 часов не приводило к силеншо цитопатического действия указанных штаммов на моноелей леток мантии шдий.

Бактериальные клетки остальных исследованных штаммов на гротякении всего периода наблюдения (72 часа) не фиксировались на юверхности клеток ииднЯ, не вызывал« их дегенеративных изменений и шрушэкш целостности монослоя и статистически достоверного гвеличеняя числа нежизнеспособных ¡теток.

Такии образом, на основания исследований, проведенных на -¡одели культуры клеток ыантии мидий, мошго заключить, что ;юследуеше пташа скользящих бактерий не проявляли патогенные свойства и, слздо&атэлыю, являются лрэдотвавктеляш сапрофитных шкроорганизаов, составляющих нормальную микрофлору мидий.

ВЫВОДИ

1, Установлено, что скользящие бактерии составляют значительную часть гетеротрофной шкрефлоры шздий, снятых в районе

Одесского побережья. В мягких тканях задай численность

р

протеолитических скользящи бактерия колебалась от 10 до Ю5 КОВ/г, бартеряолитичэскях - от 10 до Ю4 KOS/г, на поверхности раковин диапазон» колебаний составили дат обеих груш I0-I04 КСЕ/см?

2, В мягких тканях шдий сг.ояьзяздхз бактерия представляют часть транзитной юкрефлора, заашыэдэй от численности их в вода и сезона года. На поверхности створок раковин представителя втоЯ группы вхедст в состав постоянной шкрофяорн,

3, Результаты таксовоотчзского анализа показали, что болотшетво изолированна* из ь*ддяа оташоз отнесет] г. -чздаи рода Cytophaga , (С. aquatills, С. lytlca, 0. heparins, С. arrsnaicola, 0. Xlevensis, С. hutchinsonii, С. latercma, С. rosea, С. rubra, с. aifcogiiva, G. xentha, C. uliginosa, C. aurantiaca,

С. Baooharophilla, 0. saliranicolor, С. marina, С. ílavícula, С. marinoílava, С. ha.loflava, С. jolinsonae is G. aprica).

4. Среди представителей микрофлоры мадий обнаружены миксобактерии, которые по фенотипическим признакам идентифицированы как Folyangiura luteum, P. vitellinum, P. cellulosum, P. aurem,' P, minor.

5. Установлена высокая и множественная устойчивость' изолированных шташов к антибиотикам: к Реп - 61 55, Met - 100 Amp - 91 %, Amo - 73 %, Str - 70 %, Kan - 65 Tet - 67 % штаммов. Модальные значения МИК варьировали в зависимости от антибиотиков и существенно не отличались у цитофаг и миксобактерий. Наиболее' распространенный R-спектр, вклмчащай Pen, Amp, Met, Алю, Tet, Str, Кап отмечен у 11,8 % штаммов.

6. Установленные модальные значения МИК тяжелых металлов, исследуемых штаммов составляли: для кобальта - 116 ыг/л (у 47 % штаммов), меди - 50 иг/л (32,4 %), кадмия - 80 да/л (55,9 %), свинца - 40 мг/л (55,5 %), ртути - 5,5 иг/л (23,5 %), никеля -100 мг/л (41,2 %). Мода МИК ионов металлов для цитофаг и миксобактерий не совпадают и свидетельствуют о большей устойчивости цитофаг к меди, кадмию и ртути.

7. Оценка цитопатического действия на культуру клеток мантии мидий позволила отнести исследуемае штаммы цитофаг и «икс об а кт е рпй к сапрофитным микроорганизмам, входязред в состав нормальной микрофлоры мидий.

Список работ по теме диссертации

Ивзница В.А., Елииская H.A.,Кутштоенко Е.К., Канара Иа Секу, Дкахуди Абдедьгхани. Микробиологические исследования балластных вод и морских акваторий Одесского побережья с различной антропогенной нагрузкой //Материалы Всесоюзной научной конференции "Человек - океан" (Махачкала, окт.1930).- М., 1990.- С. 29 - 30.

Пошыс печати 19.03.92г. Формат 00x54 IЛ0. Об "ем 0,7уч, пая. л 1,0п.л. Занаэ 1389; Тираж 120экз. Гортипографня Одесского облдаляграфизп»*а,цак№3» Ленина 49.

»