Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетический контроль мутационных процессов ... кукурузы

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетический контроль мутационных процессов ... кукурузы"

^ ©> На правах рукописи

«О ^

я> ^ -о

с*

КРИВОВ Николай Васильевич

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ МУТАЦИОННЫХ ПР0П1" КУКУРУЗЫ

Генетика - 03.00

АВТОРЕФЕРАТ Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный кон^. Доктор с-х нау. профессор В.Н. Лысигсоь

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1697

Диссертационная работа выполнена в Институте Генетики Академии наук Республики Молдова (г. Кишинев) 1979-1995 гг.

Научный консультант:

доктор с-х наук, профессор Лысиков В.Н.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Смирнов В.Г.

чл-кор АН РМ, профессор Балашова H.H.

доктор биологических наук, профессор Ригин Б.В.

Ведущая организация - Институт общей генетики имени Н.И. Вавилова РАН.

Защита состоится "oHß' ¿¿AJHb1997 г. в "ty ч

часов на заседании Специализированного совета Д.020.18.02 при Всероссийском научно-исследовательском институте растениеводства имени Н.И. Вавилова по адресу: 190000, Санкт-Петербург, Большая морская, 44. Fax. 219-47-70

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского Института растениеводства имени Н.И. Вавилова

Автореферат разослан ря

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор Э.А Гончарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. У кукурузы локализованы четыре доминантные гетерохронные мутации Cgl 3S-35, Tpl 7L-46, Тр2 10L-48 и ТрЗ 3S /Poethlg 1988с; Weatherwax, 1929; Peterson, 1959/, которые прежде назывались макромутациями /Goldschmldt 1951/. В то время предполагали, что основное структурное изменение происходит во время короткой макроэволюционной фазы за которой следует длительный период сравнительно незначительного изменения, и гетерохронные мутации интерпретировались как мгновенная морфологическая революция /Goldschmidt 1951/. Теперь гетерохронные фенотипы рассматриваются как резерв первоначальных неожиданных морфологических возможностей, интегрирувдк вид за счет вариации необходимой для обеспечения макроэволюции без утверждения (как это сделал Гольдшмидт) каких-либо специальных мак-ромутационных механизмов /Freeling at al., 1992/. Трудности в изучении гетерохронии связаны с отсутствием точных критериев сдвигов мор-фогенетических процессов во времени, слабой разработанности причинного механизма гетерохронии и отсутствии знаний о действительной распространенности гетерохронии в эволюции /Gould, 1988/.

Все гетерохронные мутации чувствительны к генетическому фону, а Гр1 и к доэе гена. Тр2 в отличии от Tpl не реагирует на варьирование зозы гена /Poethlg 1988а/. Хроническая обработка гиббереллином (GA3) триводит к частичной нормализации мутантного фена у Cg 3S-35 /Тгасу i Ritchlngs 1986; Ritchlngs & Тгасу 1989/. Однако до сих пор не описано ни одного случая реверсии от гетерохронного фенотипа к феноти-шчески нормальной кукурузе, которая обычно обозначается wild type, ии мутирования от wild type к гетерохронному фенотипу у кукурузы, 'ем более ничего не известно о генетическом контроле таких ссбытий у

гетерохронных мутаций т.е. о причинных механизмах гетерохронии. Отсутствует также информация о том, что в потомства;; гетерохронных мутаций Cgl, Tpl, Тр2 и ТрЗ спонтанно возникают какие-либо мутации.

Таким образом, изучение мутационных процессов, затрагивающих Cg2 локус, а также другие мутантные локусы, возникающие спонтанно с высокой частотой в линиях носителях аллелей Cg2 и в потомстве фено-типически нормальной кукурузы (wild type), несущей аллели Cg2+, является актуальной проблемой, так как позволит точнее определить причины и факторы естественного мутационного процесса, их роль в эволюции и происхождении Zea mays L. Особенно актуальной является проблема генетического контроля нестабильного состояния Cg2 гена. Отмеченное взаимодействие аллелей Cg2 и Cg2+ с геномом цитоплазмы представляет чисто научный интерес в плане проверки эндосимбиотической гипотезы происхождения клеток эукариот, которая подразумевает обмен генетической информацией между ядрами, митохондриями и хлоропластами /Kemble et al., 1983/ и как вектор для переноса генетической информации, если, конечно, такое взаимодействие связано с перемещением эписомоподобного генетического элемента.

Цель и задачи исследований. Настоящая работа преследовала три основных цели. Во-первых, элементарный генетический анализ, который позволит определить количество, генов контролирующих мутантный признак, а также влияние на экспрессию и пенетрантность гетерохронной мутации Cg2 дозы гена и чужеродных генетических фонов. Во-вторых, выявление закономерностей в мутационных процессах, наблюдаемых в потомстве гетерохронной мутации Cg2 и вскрытие причинного механизма т.е. генетических факторов, контролирующих эти процессы. В-третьих, предложить новые оригинальные пути использования гетерохронной мутации Cg2 и генетической системы контроля поведения нестабильных аллелей Cg2 и Cg2+ в селекционно-генетической работе.

В соответствии с намеченными целями решались следующие задачи:

- Оценить характер проявления Сг2 гена у гомо- и гетерозигот, а также влияние дозы гена на экспрессию гетерохронной мутации Сё2.

- Изучить влияние чужеродных генетических фонов на проявление и выражение гетерохронного фенотипа

- Охарактеризовать поведение нестабильных аллелей и С%2+ в потомстве самоопыленных гомо- и гетерозигот.

- Определить частоту мутирования аллелей Cg2 и Ср2+ в генотипах С%2/С%2, Сг2/С^2+ и Сг2+/Сг2+ и дать объяснение систематическому появлению соматических и генеративных мозаиков по гену С^2.

- Экспериментально выявить генетический Фактор или факторы, контролирующие нестабильность гетерохронной мутации С^2 и провести генетический анализ взаимодействия аллелей и Cg2+ с различными типами цитоплазмы.

- Выделить в потомстве гетерохронной мутации С?2 максимально возможное количество других мутантных локусов, возникающих спонтанно с высокой частотой или индуцировать их путем гибридизации с маркерными линиями кукурузы.

- Выяснить причастность гетерохронной мутации Сг2 к мутационным событиям в других локусах генома кукурузы.

Научная новизна. Впервые обосновано представление о гетерохронии как об особой генетической системе со своими многообразными закономерностями. Прежде всего следует отметить, что на выражение гетерохронного фенотипа С£2 влияет доза гена и генетический фон линии, на котором экспрессируются аллели С£2. Впервые показано, что проявление и выражение гетерохронного фенотипа С&2 зависит от генотипа цитоплазмы. Более того цитоплазматический геном некоторых линий полностью подавляет экспрессию аллелей С(?2.

Впервые, на примере С&2 гена, установлено, что гзтерохронкые

мутации пролонгирующие фазу ювенильного развития у кукурузы могут Сыть нестабильными, как и другие локусы, отвечающие за синтез пигментов или биохимический состав эндосперма. Впервые представлены доказательства генетического контроля нестабильности Сд;2 локуса у кукурузы.

Выделено шестнадцать мутаций в линиях носителях аллелей Сд2 и С&2+, как аллельных ухе известным мутациям, так и не аллельных, что является показателем размеров спектра генетической изменчивости у этих линий.

Установлено, что генетический фон линий содержит регуляторные элементы пяти наиболее хорошо известных мутаторных систем (01, Ас, Еп, 1!ч и МгЬ) и транспозиционный элемент, расположенный в непосредственной близости от Их локуса.

Теоретически проанализированы и обобщены данные о путях и перспективах научного и прикладного использования гетерохронной мутации Се2, генетической системы контроля нестабильности локуса и выделенных в потомстве гетерохронной мутации С?2 других мутантов.

Практическая ценность. Созданный в процессе, проведения исследований ценный генофонд самоопыленных линий носителей аллелей С%2 и Се2+, в том числе и носители других мутаций, представляют собой ценный селекционный материал в создании гибридов кукуруэы для возделывания в средней полосе России. Наиболее простой путь использования гетерохронной мутации Сг2 - это создание многостебельных силосных гибридов. Для этого необходимо будет интродуцировать аллели С^2 в линии районированных гибридов т.е. создать аналоги отцовских форм, геном цитоплазмы которых полностью супрессировал бы гетерохронный фенотип Сй2. Соответственно геном цитоплазмы материнских линий при гибридизации должен быть способен индуцировать экспрессию гетерохромного фенотипа. Такая генетическая система семеноводства многосте-

бельных силосных гибридов может быть наиболее эффективна, так как вписывается в уже существующую.

Разработанная мутаторная система генетического контроля нестабильности гетерохронной мутации Сц2 имеет не только большое теоретическое значение, но и прикладное, так как реверсии от С%2 к Сг2+, а затем мутирование от Сд2+ к Сд2 сокращают фазу ювенильного развития настолько, что она может стать намного короче, чем у исходного родителя. Это явление может быть использовано для сокращения длины вегетационного периода т.е. возможно позволит адаптировать уже существующие высокопродуктивные гибриды и, тем самым несколько отодвинуть на север ареал возделывания кукурузы на силос или даже на зерно.

Некоторые из выделенных мутантов переданы в генетический фонд Всероссийского института растениеводства км. Н.И. Вавилова /г.Санкт-Петербург/ и могут использоваться для изучения разных аспектов генетики кукурузы.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались и обсуждались на Республиканской конференции.- "Создание и использование идентифицированных генетических коллекций основных с/х культур", (КкЕИнев, 1979); I Всесоюзном совещании по генетики развития растений, (Ташкент, 1680); Всесоюзной конференции "Экологическая генетика растений и животных", (Кишинев, 1931); IV съезде МОГиС, (Кишинев, 1981); IV съезде ВОГиС им. Н.И. Вавилова, (Кишинев, 1981); 1 Всесоюзной конференции по прикладной радиобиологии, (Кишинев, 1981); Всесоюзной конференции "Адаптация и рекомбиногенез у культурных растений", (Кишинев, 1982); Научной конференции "Геном растений", (Черновцы, 1983); На Всесоюзном совещании "Экспериментальный мутагенез в интродукции, акклиматизации и селекции растений", (Саранск, 1983); Научной конференции "Чувствительность организмов к мутагенным факторам и возникновение мутаций-новые направления в мутагенезе растений".

(Вильнюс, 1986); Всесоюзной конференции "Рекомбиногепез его вначение в эволюции и селекции", (Кишинев, 1986); V съезде МОГиС, (Кишинев, 1987), I Всесоюзном совещании по применению физического и химического мутагенеза в с/х, (Кишинев, 1987); III Всесоюзной конференции по экологической генетики растений и животных, (Кишинев, 1987); V съезде ВОГиС, (Москва, 1987); Всесоюзном совещании "Генетические основы интродукции и селекции растений", (Саранск, 1987); Научной конференции "Состояние и перспективы развития генетики и селекции в Литве", (Вильнюс, 1989); Научной конференции "Частная генетика растений", (Киев, 1989); Всесоюзной конференции "Генетика развития растений и животных", (Ташкент, 1990); Научной конференции "Проблемы теоретической и прикладной генетики в Казахстане", (Алма-Ата, 1990).

Структура и объем диссертации. Диссертация имеет объем 249 страниц машинописного текста, в том числе 52 таблицы, 21 рисунок, 11 схем и список литературы /22 стр./. Обзор литературы содержит одну главу. Экспериментальная часть состоит из 9-ти глав, разделенных на подглавы.

Глава 1. О гетерохронных мутациях у кукурузы. Обзор литературы.

Первое сообщение о доминантной гетерохронией мутации Teopod появилось в 1925 году /Llndstrom, 1925/. В дальнейаем в различных научных учреждениях мира было выявлено 10 .случаев спонтанного мутирования к гетерохронному фенотипу Teopod или Corngrass в посевах кукурузы /Llndstrom, 1925; Singleton, 1947, 1951; Josephson, 1959; Peterson, 1959; Боровский, 1979/. В некоторых случаях гетерохронии© мутации возникали после облучения пыльцы гамма лучами в дозе 1500 рентген /Лысиков, 1964; Pasztor, 1978/, или в результате нанесения на рыльца початков смеси пыльцы разных видов растений /Губернатор, 1966/. В настоящее время пять из них (Cgl 3S-35, Cg2 3-, Tpl 7L-46,

Tp2 10L-48 и ТрЗ 3S), изучаются на генетическом уровне /Poethig-, 1988а; Freeling at al., 1992; Conway & Poethig, 1993; Кривов и др. 1993/.

Гетерохронный фенотип начинает формироваться после вступления растения кукурузы в период вегетативного роста и выражается прежде всего в экспрессии ювенильных признаков в течение аномально длинного периода роста побега. Предполагается, что пролонгированная экспрессия программы ювенильного развития не блокирует взрослую программу так как некоторые фаэоспецифические (форма клеток и толщина кутикулы) признаки экспрессируются промежуточным образом в зрелых листьях /Conway & Poethig, 1993/. Существование мутаций, специфически воздействующих на одну или другую фазу, предполагает, что эти фазы контролируются по меньшей мере двумя независимыми генетическими программами, которые взаимодействуют, специфизируя вегетативную морфологию побега /Poethig, 1990/. Все эти мутации глубоко влияют как на вегетативное, так и на репродуктивное развитие и приводят; (1) к увеличению числа вегетативных почек; (2) увеличению числа почек производящих початки, побеги и воздушные корни; (3) увеличению числа листьев, производящих эпидермальный воск; (4) уменьшению размера листьев и междоузлий; (5) уменьшению размера початка и метелки; (6) трансформации репродуктивных структур в вегетативные. /Galinat 1966, 1987; Poethig, 1988а/.

Варьирование в выражении гетерохронного фенотипа (Cg, Tpl, Тр2, ТрЗ) определяется генетическим фоном, т.е. генами модификаторами. /Singleton, 1951; Galinat, 1952; Poethig. 1988а/. Galinat /1952/ подразделял гены модификаторы на "плюс" - уменьшающих фенотипическую экспрессию Cg или Тр. Эти модификаторы имеют некоторую собственную экспрессию в отсутствии Cg гена, в которой они полностью ингибируют кущение. Модификаторы "плюс" накапливаются в некоторых эксперимен-

тальных линиях в виде фенотипических реверсий экспрессии Cg гена от доминантной к рецессивной. Когда уровень (-) "минус" модификаторов низкий, доминирование Cg неполное и при расщеплении в F2 в Cg/Cg растениях оно более крайнее, чем в растениях Cg/+ /Galinat 1952/.

Среди растений кукурузы, несущих ген Cg, часто появляются растения-мозаики, которые демонстрируют определенные различия в морфологии между двумя початками, произошедшими от разных междоузлий корнграссного растения /Galinat 1966/. Brink предполагал, что корн-грассный локус, включает изменение фазы процесса развития, что указывает на существование сложного мутационного (или парамутационного) механизма. Однако он поднял вопрос, что эти результаты могут быть связаны с физиологическими различиями цитоплазмы яйцеклетки. Galinat /1967/ тестировал это предположение и получил дополнительные факты о том, что ' различия в морфологии между початками передаются по наследству. Соматический мозаицизм, многочисленные гены модифицирующие выражение гетерохронного фенотипа, накапливающиеся в виде фенотипических реверсий экспрессии Cg гена от доминантной к рецессивной, позволяют предполагать, что гетерохронная мутация Cg2 находится под контролем мутаторной системы подобной, Dt, Ac-Ds, En/Spm, Uq и др.

Глава 2. Материал и методы исследования.

В качестве исходного материала прежде всего испольвовалась гетерохронная мутация Cg2, полученная в 1962 году в Мз после г облучения пыльцы линии ВИР-44 в дозе 1500 рентген, которая поддерживалась путем свободного опыления, самоопыления и отбора, а также целый ряд мутаций, выделенных в потомстве гетерохронной мутации Cg2.

Для определения характера проявления и выражения гетерохронной мутации Cg2 в гомо и гетероэиготах, а также группы сцепления и для

- Ii -

создания иэогенных линий проводились скрещивания как с маркерными, так и самоопыленными линиями. Большая часть маркерных линий получена из ВИР /г.Санкт-Петербург/ от к.б.н. А.П.Подольской, а самоопыленных линий кукурузы из Института генетики АН FM от к.б.н. С.Т. Чалыка.

Тестирование на наличие в геноме Dt, En, Uq, Mrh, Ас проводилось с помощью линий (MERL - mobile element reception line), которые несли аллели a-dt, a-m(r), a-ruq, a-m(r)h, c-m-1 с соответствующим рецептором. Все эти аллели становились нестабильными, если тестируемая линия несла соответствующий регуляторный элемент. MERL линии были любезно предоставлены профессором P.A. Peterson (Государственный университет штата Айова, США).

Кукуруза выращивалась по общепринятой агротехнике. Изоляция початков и метелок, а затем и опыление проводилось с помощью пергаментных изоляторов. Все растения кукурузы с варьирующим выражением Cg2 фенотипа (Cg2w - слабое выражение, Cg2m - умеренное выражение, Cg2s - сильное выражение) а также мозаичная по Cg2 гену кукуруза, у которой при подавляющем числе мутантных побегов один или несколько (обычно - центральный) имели wt или близкий к wt фенотип при распределении кукурузы по фенотипическим классам относили к Cg2. К кукуру-8е wt кроме себе подобных относили также кукурузу с хорошо развитым мужским соцветием, у которой на удлиненной ножке початок заканчивался колосом, а иногда и хорошо развитой метелкой с несколькими початками (их обозначили Cg2-br, ветвь-branch). К кукурузе wt отнесли также моз(+). У этих растений среди большинства побегов wt иногда встречались мутантные Cg2-w, Cg2-m, Cg2-s обычно - боковые.

Для описания явления нестабильности использовали: (а) величина нестабильности - доля растений, в которых произошли мутантные события, по отношению к общему числу проверенных по потомству растений кукурузы; (б) частота мутаций в соматических тканях - это доля рас-

гений - мозаиков по отношению к общему числу исследованных растений; (в) частота мутирования в половых (генеративных) клетках - доля му-тантных гамет среди множества проанализированных.

Определение мутаторной активности генетического фона гетерох-ронной мутации Се2 проводилась также путем обработки пыльца маркерной линии т 5Ь препаратом донорной ДНК (Картель 1982).

Вся экспериментальная работа выполнена автором самостоятельно. Методический и концептуальный анализ нестабильности проводился совместно с д.б.н. М.Д. Голубовским.

Цифровой материал обработан статистически методом дисперсионного анализа по Урбаху и на ЭВМ СМ-4. Достоверность различий между сублиниями С&2 и гетерозиготами между собой оценивалась по критерию Фишера. Характер расщепления по маркерным генам оценивался методом Х-квадрат, а частоту рекомбинации вычисляли по методу максимального правдоподобия по программам разработанным в Институте генетики АН ЯМ.

Глава 3. Генетическая характеристика гетерохронной мутации Сг2.

Гетерохронная мутация С?2 ыоногенна, как и Се 33-35. Чтобы отличить генотипы Се2/Сг2 и Сг2/с%2, проводили посемейный индивидуальный анализ растений по потомству. Гомозиготы при самоопылении производили мутантные или подавляющее большинство мутантных растений, а гетерозиготы - выщепляли, кроме кукурузы с Се2 фенотипом, растения иЬ в соотношении 3:1. Среди мутантных растений в следующем поколении были выявлены гетерозиготы и гомозиготы Сд2/Сд2 в соотношении 2:1.

Экспрессивность гетерохронного фенотипа С^2 зависит от дозы гена, так как вероятность встретить растение Сд2/Сг2 в линии N0 143 в 6, а в линии Ко 220 в 10 раз выше среди кукурузы, проявляющей резкий

Таблица 1

Зависимость экспрессивности гетерохронной мутации Cg2 от дозы гена

1 Фенотипы 1 1 CK2/Cg2 Cg2/+ 1

|Линии анализируемых | кол-во X | кол-во % 1

I No растений | растений | | растений 1

| 143 Cg2-m 9 75 48 96 |

C&2-s 3 25 2 4 I

| 220 Cg2-m 12 60 67 95.7 |

Cg2-s 8 40 3 4,3 | 1

мутантный фенотип Cg2-s (табл. 1). Отсюда следует, что две дозы Cg2 усиливают выраженность мутантного фена, а в гетерозиготах Cg2/cg2 аллель дикого тгаа cg2 супрессирует экспрессию Cg2 фена. По-видимому, Cg2 кодирует продукт антагонистичный генной активности cg2 алле-ля, т.е. Cg2 обладает антиморфической функцией.

Гетерохронная мутация Cg2 чувствительна не только к дозе гена, но и к чужеродному генетическому фону, так как у гибридов Fi выражение Cg2 фена обычно слабее, чем у родительского растения кукурузы. В некоторых гибридных комбинациях (например Cg2 + /+ sr и Cg2 + + + +/ + о2 v5 га gl) потомство фенотипически не отличается от кукурузы wt, но образует 1-3 боковых побега. В целом выражение Cg2 фенотипа у самоопыленных гетерозигот в F2, а также доля кукурузы с Cg2 фенотипом в потомстве прямо зависила от выражения Cg2 фена в Fi. Поэтому у этих двух гетерозигот расщепление в F2 фактически не отличалось от соотношений 1 Cg2 : 3 wt и 1 Cg2 : 15 wt соответственно.

Реципрокные скрещивания, с линиями входящими в районированные гибриды, убедительно продемонстрировали, что проявление мутации Cg2

зависит от направления скрещивания т.е. от генотипа цитоплазмы. Особо следует отметить реципрокные скрещивания между Сг2 вб Ьш2 и линиями Со 125 и ВИР-44. В комбинациях ВИР-44 х Сд2 еэ Ьш2 и Со 125 х С&2 гэ Ьт2 не выявлено ни одного растения с Се2 фенотипом ни в Р1, ни в самоопыленном потомстве Перенос аллелей С^2 этих гибридных комбинаций на цитоплазму линий Рад. карл. СЭЛА. Р2 и Р7 не дал ожидаемых результатов, так как растений с С^2 фенотипом не обнаружено.

Попытка путем систематического экзогенного введения раствора (ЗАЗ в верхнюю воронку листа изменить корнграссный фенотип у растений кукурузы Сд2/Сд2 на не корнграссный показала, что экспрессия Сд2 гена в большей степени определяется генетическим фоном, так как несмотря на то, что растения стали почти в 2 раза выше, боковые побеги не образовывались и увеличилась длина листа, ширина листа почти не изменилась и мужские соцветия по прежнему были редуцированы до размеров маленького колоска и встречались только у отдельных растений.

Глава 4. О нестабильности аллелей С&2 и Сг2+.

В ходе индивидуального анализа по потомству начиная с 1пг, стали появляться семьи, у которых расщепление на С^2 : достоверно отличалось от теоретически ожидаемого соотношения 3:1, как правило, отклонения возникали вследствии избытка кукурузы чЬ и дефицита растений с мутантным фенотипом С^2 (Табл. 2). Поэтому фактически соотношение мутант : иЬ более соответствовало 1:1, а в ряде случаев и 1 : 3 вместо ожидаемого 3:1. Более того,единичные растения кукурузы систематически появлялись в потомстве самбопыленных гомозигот Се2/Сг2, а единичные растения с С&2 фенотипом возникали в самоопыленном потомстве С^2+/С^2+ (Табл. 3). Индивидуальный анализ по потомству отдельных растений кукурузы возникающих спонтанно у го-

Таблица 2

Характер расщепления початков с отдельных мутантных растений в линии

Но 143 (генотип Сг2/+)

1 |Поко- Число Соотношение 1 1

|ление початков Фактическое 1 Теоретическое |С У М М А X2 |

1 1 се2 | 1 иЬ | | С&2 1 1

1 1П1.2 21 10 46 14 42 Бб 1 1,5 !

1 19 24 10,8 32.2 43 8,4**1

1 -б 5 2,8 8.2 11 5,1* |

11пз 271 101 342 110,8 332,2 443 1.1 1

1 б 3 2,2 6.8 9 8,3**|

1 10 5 - 3,8 11,2 15 13,9**|

1 11 5 4 12 16 16,3**1

1 б 5 2,8 8.2 11 5,1* |

1 10 11 5,2 15,8 21 5,7*

1 1П4 241 121 346 116.8 350.2 467 0,2 |

1 18 22 10 30 40 8,5**|

11 14 6.2 18,8 25 ■4,8* |

1 8 8г 4 12 16 5,3* |

1 5 4 2,2 6,8 9 4,5* |

1 19 27 11,5 34,5 46 6,5* |

1 1П5.б 171 162 462 156 468 624 0.3 |

1 16 25 10,2 30,8 41 4.3* |

1 12 16 7 21 28 4.7* | 1

- объединены семьи со сходным характером расщепления *,** Отклонения достоверны на Р-0,05 и 0,01, соответственно •

Таблица 3

Соотношение мутантных растений 'и дикого типа в потомстве гомозигот (С£2/Се2) в линии Ко 143

1 |Поколение 1 1 ..... 1 Число | початков| 1 Фенотипические классы 1 1 I Соотношение|

Сд2ш Се2э |моэ(+)|моз(Сд) 1 1 1 С& : 1 |

1 1Г)2 9 3 . 67 11 3 19 100 : 6 I

1 1пз 8 3 60 5 0 0 65 : 3 I

1 1Г)4 11 3 116 40 6 17 179 : 9 I

1 1П5 13 4 413 55 2 101 571 : 6 I

1 1Пб | 5 1 207 1 0 1 209 : 1 1

мозигот (Сг2/Сг2) показал, что они являются носителями аллелей Сг2+.

Такое поведение аллелей Се2 и Сг2+ невозможно объяснить неполным проявлением, так как если бы ген Сд2 обладал неполной пенетрант-ностью, то отклонение от теоретически ожидаемого соотношения, а также появление мутантов в потомстве растений гсЬ и единичных растений в потомстве мутантов обязательно во всех семьях и должно характеризоваться постоянной величиной. Генетический анализ по потомству гетерохронной мутации С&2 в течении девяти поколений целиком противоречит предположению о неполной пенетрантности гетерохронной мутации Сг2, так как соотношение мутант : иЬ при самоопылении постоянно меняется из поколения в поколение (рис. 1).

Скорее всего гетерохронная мутация Сд2 нестабильна и аллели Cg2+ мутируют к Се2, который в свою очередь ревертирует к Св2+. Бурный мутационный процесс Сг2 —> С&2+ и от С&2+ —> Сд2, который может начинаться с первого деления зиготы и проходит не только в генеративных, но и в соматических клетках, наводит на мысль, что вы-

кружами показывает число растений определенного фенотипа в потомстве данного початка. Если от одного растения анализировали несколько початков, то соответствующие линии исходят из одной точки лучали. Цифры с двумя звездочками указывают число початков, данные по расщеплению которых ввиду их сходства объеденены.

росшее растение кукурузы является всего лишь отражением частых переходов Cg2 —-> Cg2+ и от Cg2+ ---> Cg2, которые происходили в митозе при дроблении зиготы. Поэтов в потомстве гетерохронной мутации Cg2 появляется кукуруза, у которой побеги, выросшие из одного зерна, различаются по фенотипу. У таких растений часть побегов может фено-типически не отличаться от wt, в то время как остальные могут быть отнесены по степени выражения либо к Cg2-m, либо к Cg2-s. В некоторых случаях, среди побегов одного и того ке растения кукурузы можно было найти все фенотипические классы, представленные здесь от wt до C&2-s. Доля таких растений в различных отводках родословных варьирует в зависимости от генотипа родительского растения, т.е. связана с дозой нестабильного гена Cg2.

Фенотилическне различия между побегами, выросшими из одного зерна навели на мысль, что початки, самоопыленные на одном растении, могут произвести достоверно различимое расцепление в потомстве (табл. 4). Действительно иногда имеют место события, когда два и более самоопыленных на одном растении початка характеризуют это растение крайне противоречиво. Так, на одном растении кукурузы с мутант-ным фенотипом было самоопылено 11 початков и все они характеризовали материнское растение как Cg2/Cg2+, sa исключением одного, который судя по расщеплению представлял это же растение (28 2/3) как гомозиготу (Cg2/Cg2) по гену Cg2. У двух других растений было самоопылено и проанализировано по потомству 3 и 2 початка. В обоих случаях одна из семей достоверно отклонялась от теоретически ожидаемого расщепления 3:1.

Всего среди растений кукурузы, несущих аллели Cg2 или Cg2+, проанализирована по расщеплению потомства 91 семья, полученная путем самоопыления на одном растении более 2 початков. Из таблицы 5 видно, что среди гомозигот (Cg2/Cg2) можно в три раза чаще, чем у гетерози-

Таблица 4

Различия по генотипу н характеру расщепления початков,'самоопыленных на одном растении с мутантнш фенотипом в 143 линии

1 1 | N0 растения и Соотношение Г" 1 1 1 1

| початка | Фактическое I Теоретическое 1С У М М А| X2 I

1 1 1 1 С&2 | шЬ 1 1 <%2 • 1 1 1 1

| 23 2/3 растение

| 38 10 21 7,8 23,2 31 0,9 |

1 41 4 25 7,2 21,8 29 1.9 |

1 42 8 17 6,2 18,8 25 0,7 |

| 85 6 10 4 12 16 1.3 |

I 47 4 9 3,2 9.8 13 0,2 |

I 46 3 6 2,2 6,8 9 0.3 |

| 44 0 24 6 18 24 8,0**|

I 40 9 14 5,8 17,2 23 2.4 |

| 36 ,2 10 3 9 12 0,4 |

I 43 • 6 14 5 15 20 0-.3 |

1 37 2 13 3,8 11,2 15 1.1 1

| 1002 растение

I 16 б 9 3,8 11,2 15 1.8 |

1 15 6 9 3,8 11,2 15 1.8 |

1 14 22 18 10 30 40 8.5**|

| 1003 растение

| 87 8 8 4 12 16 5,3* |

I 86 I 5 8 3,2 9,8 13 1,3 | 1

*,** Отклонения достоверны на Р-0,05 и 0,01, соответственно

Таблица 5

Суммарные данные по анализу генотипа початков, самоопыленных на одном растении у гомозигот и гетерозигот

I-;-1

|Генотип Число Характер расщепления у Число !

|растения растений разных початков початков |

| сходный различный I

I с&/се2 4 13 ю |

| Сг2/+ 16 12 4 5? 1

| +/+ 11 10 1 24 |

I_______I

гот (Сд2/Св2+), 'встретить генеративный мозаицизм. Выявленные генеративные мозаики подтверждают, что гетерохронная мутация Сд2 - высоко нестабильна и мутации могут происходить при первых делениях эитоты.

Глава 5. Анализ нестабильных аллелей Сд2 и Сд2+.

5.1. Теоретическая модель, объясняющая появление соматических и генеративных мозаиков и феноменологию наследования Ск2 и Ск2+. При анализе родословных были получены три.основные группы фактов, которые указывали на нестабильность аллелей Сд2 и С&2+; 1) нарушение менделевских соотношений и результаты анализа по.потомству выщепляю-щихся в отдельных скрещиваниях аномальных по фенотипу растений; 2) различие в генотипе отдельных початков с одного, растения и 3) частое появление растений - мозаиков и анализ генотипа мутантных и ий побегов у одного и того же растения - мозаика.

Для теоретического объяснения феноменологии нестабильности ге-

Таблица 6

Соотношение растений с Л и С?2 фенотипом в потомстве самоопыленных Се2/+ и Се2/Се2 при разных степенях мозаицизма генеративной ткани

1 1 Мозаицизм гаметофита|Соотноше- Расщепление 1 при самоопылении |

|N генотипы клеток даю- |ние гамет -

щих гаметы и их 1 ген 0 т и п ы фенотипы |

соотношение ICg I : wt Cg/Cg Cg/+ +/+ Cg2 : wt |

Cg/+ +/+ ГЕТ0Р03ИГ0ТЫ Cg/+

Ii- 100% 0 1 : 1 1 : 2 : 1 3 : 1 1

is. 15/16 1/16 15 : 17 225 : 510 : 289 2,5 : 1 1

|3. 7/8 1/8 7 : 9 49 : 126 : 81 2.2 : 1 |

|4. 3/4 1/4 3 : 5 9 : 30 : 25 1.6 : 1 |

|5. 1/2 1/2 1 : 3 1 : 6 : 9 1 : 1.3|

|6. 1/4 3/4 1 : 7 1 : 14 : 49 1 : 3.3|

|7. 1/8 7/8 1 : 15 1 : 30 : 225 1 : 7.2|

|8. 1/16 15/16 1 : 31 1 : 62 : 961 1 : 15,2|

Cg/Cg Cg/+ Г 0 М 0 3 И Г 0 Т Ы Cg/Cg

Ii- 7/8 1/8 15 : 1 225 : 30 : 1 255 : 1 |

is. 3/4 1/4 7 : 1 49 : 14 : 1 63 : 1 |

|3. 1/2 1/2 3 : 1 9 : 6 : 1 15 : 1 |

1/4 3/4 5 : 3 25 : 30 : 9 6.1 : 1 1

|5. 1/8 7/8 • 9 : 7 . 81 : 126 : 49 4.2 : 1 |

|6. 1 1/16 15/16 17 : 15 289 : 510 : 225 3.5 : 1 | i

терохронной мутации Сд2 на основании закона Харди-Вайнберга разработана модель (Табл. 6). согласно которой весь имеющийся фактический материал распределяется в зависимости от степени мозаицизма генеративной ткани, т.е. вависиг от того на какой стадии деления еиготы произошло мутационное событие. Модель построена на том, что мутации от С£2 —> Сг2+ и от —> С£Г2 в Сд2/Сд2, Сй2/Сд2+ и С£2+/Се2+ происходят, по-видимому, в течении всего онтогенеза растения, но только те и8 них приводят к появлению отклонений от теоретически ожидаемого соотношения 3 : 1 у гетерозигот (С&2/Сг2+) и появлению единичных растений VI у или растений с гетерохронным феноти-

пом у Сг2+/Сг2+, которые произошли во время первых делений виготы. Такое предположение объясняет сразу все три группы фактов.

Модель работает только в геноаах специально стселектированных линий при условии, что степень мозаицизма по С&2 гену в мужской и женской спорогенной ткани, а также скорость деления генеративных клеток и жизнеспособность мужских и женских гамет не отличается друг от друга. Тогда зигота, начавшая онтогенез как Сд2/Сд2+, в ходе развития смутирует в направлении от С#2 —> Сг2+ и генеративная ткань будет состоять из клеток 1/16 Сг/+ и 15/16 +/+. При самоопылении такого растения ожидается расщепление по генотипу 1 Се2/Сд2 : 62 Сг2/С&2+ : 961 Сд2+/С?2+ или 1 С&2 : 15 по фенотипу. Такое же расщепление возможно, если у Сд2+/Сд2+ одна из аллелей смутирует на стадии 16 клеток Сг2+ —> Сд2 (Табл. 6). В целом весь фактически имеющийся материал хорошо соответствует теоретически ожидаемым соотношениям, построенным на явлении мутирования по гену Сг2.

Если семьи распределить по времени мутирования, то есть по стадиям деления еиготы, то основная масса самоопыленных початков расщепляется с достаточной степенью вероятности в соотношении 3 : 1 в обеих линиях по 57 яггук (Табл. 7). Мутации в основном идут на стадии

Таблица 7

Распределение вариантов отклонения в расщеплении, вызванное мутациями С&2 —> Сд2+ или Сд2+ — >Сд2 в потомстве и Сд2/С^2+-.

I ( !

Мутационные события и | Расщепление Число початков в линиях стадии онтогенеза |-

се

угЪ

143

220

1.Мутаций нет или они происходят на поздних стадиях

2.Мутации Сд2 —> Сд2+ на стадии 2-8 инициальных клеток

3.Повторные мутации на ранних стадиях

С^2 —> Сг2+

4.Стации на стадии 2-8 инициальных клеток; Сг2+ —> Сд2 в гетеро-виготах и от С^2 —> Сг2+ в гомозиготах

ВСЕГО

от(2,2-1,3):1 до 1 : 1,3

1 : (3,1-15)

(6-15)

57

11

57

13

75

78

2-8 инициальных клеток (11 и 13 штук). Повторные мутации на ранних стадиях - явление редкое. Небольшое число (3-4 початка) зафиксированных случаев мутирования с^2 ---> С&2+ у гомозигот Се2/С^2 или мутирования С&2+ —-> С&2 у гетерозигот Сг2/Се2+ скорее говорит не об

3

1

3

4

4

1

4

уникальности таких событий, а о недостаточной величине выборки, чтобы их отметить (Табл. 7).

5.2. Величина нестабильности и частота мутирования аллелей в генотипах Ск2/Се2, С%2/Ся2+ и Се2+/Се2+. Мутирование аллеля Ся2 в направлении —> Cg2+ у мутантных гомозигот оценивали по выщеплению в потомстве единичных растений кукурузы мЬ или мозаиков. Появление ыо-заиков при самоопылении гомозигот Се2/Ся2 возможно только в том случае, если исходное растение-генеративный мозаик и часть генеративной ткани гетерозиготна по гену Сг2. При подсчете семей к генотипическо-му классу гомозигот относили только те, соотношение клеток генеративной ткани которых соответствует 7/8 Сц2/Сд2 : 1/8 С£2/Се2+; 3/4 Се2/Сг2 : 1/4 Се2/Сг2+; 1/2 Сг2/Сг2 : 1/2 Сг2/Сг2+ (Табл. 6). Всего было выделено 29' гомозигот (Св2/Се2). Среди них у 16 в потомстве выделились единичные растения яЬ или мозаики. Следовательно у 55Х гомозигот (Се2/Сг2) происходили мутации в направлении Сд2—> Сг2+, затрагивая соматические и генеративные клетки.

Если в потомстве гетерозиготного растения Сд2/С&2+ наблюдаются достоверные отклонения от ожидаемого ЗСк : в сторону wt, то это указывает на мутирование в инициальных клетках в направлении Сд2—> С£2+. Подсчитав общее число таких случаев, можно грубо оценить частоту мутирования аллеля С^2 у гетерозигот. Мутирование С<г2 --->Ся2+ на стадии 2-8 инициальных клеток в линии N0 143 отмечено в 11/75 или в 15% случаев, а для линии N0 220-13/78 или 177. случаев. Отклонения в противоположную сторону типа 6С^2 : 1у<1 или 15Се2 : Ш возможны у гетерозигот в случае мутаций С^2+ ---> С%2 на ранних стадиях онтогенеза (Табл. 6) и такие случаи (Табл. 4, данные по гетерозиготному растению 28-2/3) несомненно происходят и их можно отличить от возможного мутирования С?2 ---> Сг2+ у гомозигот С&/С%2.

Доминантность мутации Сд2 и ее полная пенетрантность в генотипе исследуемых линий позволяет провести оценку степени нестабильности алледя Сг2+ у кукурузы иЬ. Эту оценку можно провести двумя способами: а) появление растений-мозаиков с доминантными мутантными побегами в потомстве самоопыленных гомозигот Сд2+/С^2+ указывает на мутации в инициальных клетках побега в направлении С&2+ —> С^2; б) появление в этом же случае полностью мутантных растений в потомстве свидетельствует о мутациях С&2+ —> С%2 в зародышевых клетках.

Спонтанное мутирование в потомстве кукурузы ч/Ь, характеризуется прежде всего величиной нестабильности, определяемой как доля растений в потомстве которых произошло мутантное событие С^2+ —> Сд2 (в результате выщепились полные мутанты), составляет 11/38=28,9% для растения N0 220 и 17/60-28,3% для растения N0 143. Частоты мутирования в соматических клетках определялись как доля растений,в потомстве которых происходили мутационные события С&2+ —> (в результате выщепились мозаики)- соответственно составили 59/1078=5,5% для аллеля Сд2+220 и 244/1638=14,9% для аллеля С£2+143.

Частота мутирования в генеративных клетках составила для аллеля 0^2+143 - 1,8%, так как среди 1638 потомков от самоопыления кукурузы Сг2+/Сг2+ было обнаружено 57 растений доминантного фенотипа С^2. Отсюда - 1-57/1638 или 0,965; д2=0,965=0,932, р=0,0175 или 1,8%; Аналогично была расчитана частота мутирования аллеля Сд2+220 - 3,6%. Таким образом, оба аллеля высоко нестабильны з соматических и генеративных клетках и имеют сходные параметры мутирования. Аллель С^2+ 143 почти в 3 раза чаще мутирует в соматических клетках, чем аллель Се2+220. В то время как аллель Сд2+ 220 в два раза чаще мутирует в генеративных клетках, чем аллель Сд2+143.

; 5.3. Анализ генотипа растений мозаиков. Генетический анализ феноти пически отличающихся друг от друга побегов убедительно продемонстри

ровал их различие по генотипу. Так, из 16 изученных побегов v/t у растений M03(Cg2) линии 143, 12 дает потомство, в котором в основном преобладают растения wt. Следовательно, фенотип вегетативных частей растения и генотип гаметофита совпадают, по крайней мере, в 75% случаев. В остальных 3 случаях побеги wt дали расщепление 3 Cg2 : 1 wt.

Самоопыление побега Cg2 на растении моз (Cg2) и последующая проверка по потомству в основном дают расщепление, близкое к 3 Cg2 : 1 wt. При самоопылении побегов кукурузы wt у моз(+) в потомстве вы-щепляется в основном кукуруза wt, класс мутантов представлен только моз (Cg2). Появление мозаиков свявано с высокой частотой мутирования аллеля Cg2+143 в соматических клетках у растений кукурузы Cg2+/Cg2+-14,9Х. Следовательно, при самоопылении побегов wt у мсз(+) доля му-тантных растений в потомстве не намного отличается от той, которая появляется при самоопылении кукурузы 'wt. Поэтому при подсчете расщепления на фенотипические массы моз(+) относили к кукурузе wt. 5.4. Аллельные производные гетерохронной мутации Cg2. В результате самоопыления растений No 143 и No 220 все потомство распалось на множество вариантов, которые отличаются по степени выражения Cg2 и характеру мутирования, - частоте и направлению мутирования, а также по тканеспецифичности мутационных событий. Варианты фенотипической экспрессии гена Cg2 могли возникнуть в основном двумя путями, которые дополняли друг друга: (а) путем расщепления линии на подлинии; (б) вследствие мутирования от Cg2 —> Cg2+ и от Cg2+ —> Cg2, что привело к появлению различных аллельных производных гетерохронной мутации Cg2. Поэтому для фенотипически отличающихся друг от друга различных вариантов будут использоваться термины ."аллельные производные", "аллельные состояния" или аллели гена Cg2.

Генетический анализ нестабильных аллелей Cg2 и Cg2+ показал, что поведение их ничем не отличается от других нестабильных аллелей

кукурузы. Db'ccrtan частота нутирозанта, соматический п генеративный моваицием, широкий спектр спескфнческнх аллелышх производных все это могло быть связано с перемещением мобильного генетического элемента, т.е. наблюдаемые мутации от Cg2 —> Cg2+ и Cg2+ —> Cg2 могут быть связаны с инсерцияыи и зксцнзиямй транспозиционного элемента в Cg2 локус. Это предположение стало рабочей гипотезой, которая была проззрена в целой серии последовавши затем экспериментов.

Глава 6. Генетический контроль нестабильности Cg2 локуса.

6.1. Аллели Cg2+: происхождение, поведение и взаимодействие с геномом цитоплазмы. Генетически стабальные линии, носители аллелей Cg2+, по-видимо!^у, возникли в результате перемещения генетических элементов и ¡и геном содержит либо рецепторы, либо регуляторы йогой ыута-торной системы. Проверка этого предположения показала, что при гибридизации носителей аллелей Cg2+ между собой в некоторых случаях потомство Fi состоит не только из кукурузы wt, но и Cg2 (табл. 8). Кукуруза с Cg2 фенотипом зарьирует в выражении, а некоторые растения являются мозаиками по CgZ гену и состоят из центрального побега wt и боковых мутантных, у которых метелка редуцирована в колосок. Доля таких растений в потомстве доходила до 50Х и зависила не только от введения в геном соответствующей Cg2+ аллели, но и генотипа цитоплазмы.. Теперь стало очевидно, что Cg2+ может мутировать к Cg2 при условии что: 1) Аллели Сд2+ должны быть в компаунде друг с другом. 2) Если полученная таким образом зигота имеет соответствующий генотип цитоплазмы, т.е. содержит второй генетический элемент (внехромо-сомный генетический нлдуктор нестабильности аллелей Cg2+), то аллели Cg2+ вновь становятся нестабильными и мутируют от Сд2+ —> Cg2) как в соматичеагах. так и в генеративных клетках с высотой частотой. '

Таблица 8

Частота мутирования в локусе С£2. при гибридизации между собой линий носителей мутантных аллелей у б*-!. 43, бг*-220 и га*-220, Ьг*-220, уз*-253, уб*-253 Ргга-143

I Комбинации I

Кол-во Фенотипические классы Носители Суша початк. »Л Сг2* Сг2т Сг2Б т(Сд2)Сг2 в X

|Ьг*-220 X уБ*-253 3 110 1 0,9 111

|уз*-253 X Ьг*-220 1 96 96

|Ьг*-220 X уэ*-253Ргг* 4 101 101

¡уз*-253Ргг* X Ьг*-220 1 18 14 3' 48,6 35

|Ьг*-220 X БГ*-220 2 45 45

|эг*-220 X Ьг*-220 3 95 95

|уз*-253Ргг* х бг*-220 1 3 3

|зг*-220 х уэ 253Ргг 5 98 95

|уз*-143 х гг*-220 5 12 1 7.7 13

|зг*-220 X уБ*-143 3 164 164

|зг*-220 х узл-253 • 2 164 164

|уз*-143 X уз*-253Ргг* 2 47 7 37 6 51\ 5 97

|уз*-143 X уз*-253Ргг* 3 63 63

|уБ*-253Рп> X УБ*-143 4 43 43

|уз*-253 х УБ*-143 2 76 3 43 14 44,1 136

|уз*-253 X УБА-143 4 85 85

Iуг*-143 х уз*-253 3 100 100

|уз*-143 X Ьг*-220 2 90 90

|Ьг*-220 X уз*-143 3 77 77

Ргг* -этот аллель выделен в потомстве растения N0 143.

Таблица 9

Индивидуальный анализ по потомству растений с Сд2 фенотипом и выделенных в Гг при гибридизации уз*-143 х уз*-253 Ргг*-143

1 |N0 семьи фенотип самоопыленного растения Соотношение Сг2 . Сумма 1 • X2 |

| 9046 Сг2я 22 46 68 66,О*" 1

| 9055 м(с?2) иг 41 25 66 5,9* |

| 9048 »г 45 15 60 0 I

| 9049 н 8 24 32 42,7*" |

| 9044 и 3 57 65 125.3*" |

| 9054 и 7 60 67 148,9** |

| 9058 н 16 18 34 14,1-** |

| 9047 1 ....... и 44 23 67 3,1 | 1

*,** Отклонения достоверны на Р=0,05 и 0,01, соответственно

Самоопыление некоторых растений кукурузы, полученных от скрещивания уб*-253 Ргг*-14Й х Ьг*-220 показало, что потомство растений с Сд2 фенотипом, как и следовало ожидать, расщепилось в соотношении 3 Сд2 : 1 »И:, а кукуруза иЬ произвела только растения у^. Однако в другой комбинации уэ*-143 х уз*-253 Ргг*-143 проверка по потомству дала убедительное доказательство, что аллели Сд2+ вновь мутируют от Сд2+ —> С&2 почти во всех семьях (табл.9), т.е. путем гибридизации специально подобранных линий можно резко увеличить частоту мутирования Сд2+ -—> Ср2. Так. носитель аллеля уз*-9196, скрещивался в качестве початкового родителя с пыльцевым родителем линией С(?2+ йб Ьт2 81, у которой аллель Сг2+, мутирует к Сг2 с частотой 10-15% в результате: 17 растений кукурузы имело Cg2 фенотип; 4 - Сг2-т ; 1 -

Так как потомство почта ва 1002 било с С&2 фенотипом, то ыодно предположить что у одного кэ партнеров аллель Сд2+ почти на 1002 мутировал к С&2. Индивидуальный анализ по потомству 8 гибридных растений кукурувы ив £2 указывает на то, что все они Сд2/С&2+, у которых аллель Сд2+ мутирует к С&2, а аллель С£2 ревертирует к С&2+.

Появление у ког-шаундов Се2+/С%2+ в Р1 свьиэ 502, а гаюгда к до 1002 растений с С&2 фенотипом убедительно попало, что природа этих нутационных переходов совершенно не похатл на мутационные события, которые наблюдаэтся в маркерных локусах в результате инсерций и ексцизий Ас-Пз, или других хоросо известных мобильных элементов. Тем более, что мутирование в Сд2 локусе связано с генотипом цитоплазмы. Поэтому реверсии Сд2 —> не имеют ничего общего с реверсиями, которые происходят в результате эксшшии мобильного элемента из ло-куса и их точнее будет называть псевдореверсияыи (Сгг+ргеийо). 6.2. Характер взаимодействия аллелей С&2+ с внехромосомнкм индуктором нестабильности: рецепторы и регуляторы. Гибридизация мутантов, выделенных в потомстве гетерохронной мутации с маркерная линиями показала, что цитоплазма некоторых из них явно содержит внехроыо-со:.1ны11 генетический индуктор нестабильности аллелей Сд2+, о чем убедительно свидетельствует скрещивание ее Ьг2 х бг*-220", когда доля ыутантных растений составила 51,72 и ни одного мутанта не было выявлено, когда 8а мать была В8ята линия эг*-220 (табл. 10). Аналогично при гибридизации дэ Ьгг2 х Ьг*-220.

Эти тест скрещивания указывают преаде всего на то, что внехро-ыосомный генетический индуктор мутационных событий Сд£+ —> Сд2 взаимодействует с аллелью Се2+ даже если она находится в компаунде с аллелью дикого типа взятой'из лзэбой линии кукурубы. Внехромосом-ный генетический индуктор, который в атом случае является регулятором, индуцирует мутационные события Сд2+ —> С&2 путем взаиыодейс-

Таблица 10

Частота мутирования в локусе С%2 при гибридизации линий носителей мутантных аллелей уз*-143, зг*-220 и га*-220, Ьг*-220, уб*-253, уз*-253 Ргг*-143 с маркерными линиями

I )

Комбинации Кол-во Фенотипические классы Носители Сумма| початк. С^2т Сг2з т(Св2)Се2 в % |

уб*-253Ргг* х их эЬ 4 84 84

игх бЬ х уБ*-253Ргг* 1 '8 8

Ьг*-220 х их бЬ 2 29 29

их БЬ х Ьг*-220 1 5 5

гг*-220 х т бЬ 1 . 115 115

т бЬ х бг*-220 1 26 26

уб*-143 х гзЬп2 3 41 41

гБЬт2 х уБ*-143 2 193 193

дб Ьт2 х бг*-220 1 42 41 3 1 51,7 87

бг*-220 х 83 Ьт2 3 225 225

дэ Ьт2 х Ьг*-220 1 29 1 21 6 2 50,8 59

Ьг*-220 х дг Ьт2 1 27 27

дэ Ьт2 х уб*-253Ргг* 1 34 23 5 3 47,7 65

дэ Ьт2 х уб*-253 1 93 93

Ьп Ьу ьг х у253 1 и 7 1 1 45,0 20

1д д12 Ьу4 гз2 СЬ

П х уб*-253 1 7 7

3 у16 шбЗ х уБ*-253 1 12 3 1 25,0 16

3 у16 тз8 X уз*-253 1 54 54

3 у16 тгв х уг*-143 1 58 58

твия с одной из соответствующих ревертантных аллелей Cg2+. Такое поведение Cg2+pseudo, когда она выступает в роли рецептора, может быть связано с наличием рецепторного элемента в локусе или рядом с ним. 6.3. Влияние генотипа цитоплазмы на нестабильность аллелей Cg2+. Цитоплазма линий F2, F7, МК01, ВИР-44, Со 125, 092 ослабляет выражение гетерохронного фенотипа Cg2 и приводит к неполной пенетрантности. Поэтому, лишь в комбинации 092 х ys 253 Ргг*-143 среди 135 растений кукурузы, был отмечен один случай появления кукурузы с Cg2 фенотипом. Результаты этих тест скрещиваний показали, что аллель Cg2+ pseudo в компаунде с cg2 аллелью даже на генетическом фоне самоопыленных линий иногда способен мутировать к CgZ, если попадет на соответствующий тип цитоплазмы.

Глава 7. Мутагенный эффект генетического фона мутации Cg2.

7.1. Высокая частота и спектр спонтанного мутирования в потомстве гетерохронной мутации Cg2. Нестабильность гетерохронной мутации Cg2 сопровождается систематическим появлением мутаций в других локусах не сцепленных с Cg2. Мутаторная активность в потомстве гетерохронной мутации Cg2 была выявлена сразу в Ini. но в линиях No 143 и- No 220 первые мутанты были изолированы только в 1пз. Всего в потомстве растения No 143 было выделено пять мутантов Ргг* 3,6 х 10~2 и 2 х Ю-3, ys* 4 х 10~3, zb* 1 х Ю-3, zn* 1 х 10~3. al* 1 х Ю-3. В потомстве растения 220 выделено три мутанта J*. sr* га*, появившиеся с частотой 7,3 х 10"5 и br* 1 х 10~3. Таким образом в потомстве гетерохронной мутации Cg2 выделено 5 рецессивных хлорофильных мутаций, обозначенных как ys*-143, zb*-143, zn*-143, al*-143, j*-220, аллельная j 8L-80, а также мутация, у которой на листьях было множество тонких и коротких белых полос фенотипически напоминающих sr 1S-0, а метелка

га 71-32. Однако вновь возникшая мутация не аллельна ни первой, ни второй мутации из коллекции ВИР. Доминантная мутация, затрагивающая окраску перикарпия Ргг*-143 и рецессивная мутация Ьг*-220, у которой листья и початки из-за сильно укороченных междоузлий расположены почти супротивно не аллельна ни Ьг 11-81. ни Ьг2 11-64, ни ЬгЗ 5-.

Высокая частота появления мутаций на генетическом фоне гетеро-хронной мутации Сг2. наряду с индуцированием нестабильности путем гибридизации между собой линий носителей аллелей С^2+рзеис1о и внех-ромосомных генетических элементов, и спонтанное мутирование с высокой частотой аллелей Св2 и Сг2+, наводило на мысль о взаимосвязи мутационных процессов в Сг2-локусе с появлением описанных выше мутаций. Поэтому дальнейший исследования проводились в целом по трем направлениям: (1) генетический анализ ранее выделенных мутантов. (2) индуцирование мутаций в маркерных локусах и генетический анализ, выделенных мутантов, особенно нестабильных. (3) поиск в потомстве мутации С(?2 регуляторных элементов известных мутаторных систем 01. Ас, Еп, ич, МгЬ и определение типа цитоплазмы самих тестерных линий. 7.2. Генетический анализ мутантов, выделенных в потомстве гетерох-ронной мутации Срг2. Гибридизация линий носителей, различных рецессивных мутаций для тестирования их на способность индуцировать в мутабильность в С&2 локусе, позволила также проверить поведение этих мутаций в компаунде друг с другом. У мутаций уз*-143 и уз*-253 проявление в основном близко к теоретически ожидаемым 25%. Однако в гомозиготе у носителей этих мутаций может сильно снижаться жизнеспособность; У рецессивных мутаций Ьг*-220 и гг*-220 процент проявления варьировал от 6,5% и 3,5% до 17,9% и 4,4% соответственно. Гибридизация показала также отсутствие сцепления между аллелями, участвовавшими в расщеплении, т.е. выделенные в потомстве гетерохронной мутации Сд2 аллели уз*-143, уг*-253 и Ргг не сцеплены с С?2 локусом.

Хлорофильные рецессивные мутации с продольными желтыми полосами на листьях фенотипически похожие на ys 5L-75, способны в некоторых случаях при гибридизации с линиями, выделенными в потомстве Cg2, наследоваться через цитоплазму. Хлорофильные мутации систематически возникают при гибридизации между собой подлиний, выделенных из линии No 220. Так, при гибридизации br*-220 х sr*-220 в 1992 году в F2 была выделена мутация ys*-9196. Остальные мутации ys-*307, ys-*308, ys-*309 и ys-*310 возникли и были выделены при скрещивании ys-*253 х sr-*220 в Fi. Реципрокные скрещивания для определения аллельности этих мутаций друг другу и мутациям ys 3L-69 и ys 5L-75 показали, что ys-*308, ys-*309 аллельны ys-*253. Кроме того стало известно, что ys-*309 аллелен также ys 3L-69, a ys*-9196 аллелен ys 5L-75. 7.3. Мутагенный эффект гибридизации носителей гена Cg2 с маркерными линиями. Для того чтобы выяснить насколько линии, носители аллелей Cg2 и Cg2+ способны эффективно индуцировать мутации, а также с целью выяснения характера проявления и выражения Cg2 в гетеровиготе, а затем и определения сцепления с маркерными генами, были проведены тест-скрещивания в результате которых предполагалось получить, а потом и выделить ряд рецессивных мутаций по Зй хромосоме. Таким образом были получены мутации по dl 3S-44 и га2 3S-49. В скрещивании Cg2 х d было испытано 4 Cg2/+ и 3 Cg2/Cg2 растения кукурузы, в Fi в одной из 11 гибридных семей среди 39 растений Cg2/+ одно оказалось носителем мутации dwarf 3S-44. В скрещивании Cg2 х га2 lg2 среди 6 тестированных растений (5 Cg2/+ и 1 Cg2/Cg2) в -5 тестированных Cg2/+ семьях кукурузы в Fi (все 5 семей образовались при гибридизации с растением No 220 10/1) появилось от одного-до трех носителей га2, которые легко идентифицировались по метелке и початку. В целом при гибридизации Cg2m с маркерной линией lg2 га2 среди 69 растений с корнграссным фенотипом и «it у 7 произошли мутации в локусе га2 3-49.

Другим событием, косвенно подтверждающим причастность мутации С%2 к появлению новых мутаций была гибридизация Cg2 220-377-214 х 1й2 в12 у4. В результате в ¥% в 7 из 22 испытанных семей возникли многочисленные носители хлорофильной мутации, у которой начиная с фазы 4-5 листа все последующие листья тлели поперечные желто-белые регулярные полосы. Вновь возникшая мутация была обозначена гЬ*-220. Больпое число растений носителей гЬ*-220 указывает на то, что рецессивная мутантная аллель возникла в Г1, а в наблюдалось расщепление по этой аллели. Анализ кроссинговера вновь возникшей мутации с маркерными генами в12 у4 показал, что гЬ*-220 находится в фазе отталкивания и расположена на 3% дистальнее 2-11. 7.4. Индуцирование нестабильности в Ух локусе. Высокая частота спонтанного мутирования в локусах не сцепленных с Се2 и индукция мутационных событий в маркерных локусах путем гибридизации с носителями аллелей Cg2 убедительно продемонстрировала высокую мутаторную активность линий носителей аллелей Сг2 и Сг2+. Однако необходимо было получить нестабильные мутации в других локусах генома, которые были бы удобной моделью для молекулярно-генетического анализа генетических компонентов, ответственных за мутаторную активность. Для этого были проведены тест-скрещивания с£2 бИ их х Cg2 БЬ Ш и cg2 зЬ wx х С?2+ БИ Мх в результате которых, среди гибрэдных зерен после окрашивания их К1 были обнаружены зерна с кирпично - красными пятнами на темно-синим фоне. Всего было проверено 64 168 зерен с генотипом Ш\пх\т, из них у 4099 были обнаружены \й<-мозаичные мутанты, которые имели не более 1-3 ккрпичко-красных пятен на темно-синим фоне. Частота появления Ш - мозаичных верен в среднем составила 6.4 х 10~2. Однако в отдельных семьях частота мутирования достигала 29 х 10"2 и даже выше. Соответственно при обратном скрещивании С^2 Бй Ш х с?2 зй т и Cg2+ БЬ Ух х бЬ их, не было обнаружено ни одного зерна Их-т.

Появление моэаичных по Ых локусу верен с таким паттерном как правило вызвано эксцизиями транспозиционного элемента (ТЭ), расположенного проксимальнее Wx локуса у хромосом привносимых тестируемыми растениями кукурузы. Поэтому расщепление гетерозигот Шх\их сопровождается не только появлением Ш-т верен, ко и достоверными отклонениями от соотношения 3 Их : 1 *х. Эксцизия ТЭ может приводить к утрате короткого плеча 9й хромосомы. То. что делеции таких размеров возможны наводит на мысль появление в одной ив семей среди 210 кремнистых верен кроме 12 Ух-ш также двух верен бЬ их/б!! Их. Вероятно такие события могли бы отмечаться гораздо чаще, если бы мутации в ткани эндосперма происходили в более ранней стадии развития. ТЭ в линиях носителях аллелей С£2 и Сд2+ может быть причиной многих мутационных событий, о которых уже говорилось выше, так как способность ТЭ индуцировать мутации в других локусах хорошо известна. 7.5. Мутагенный эффект экзогенной ДНК, выделенной из растений С$2/+. В этом эксперименте предпринята попытка выявления высокой мутаторной активности генетического фона линий носителей аллелей С%2 и Сд2+ путем обработки пыльцы линии *гх гИ экзогенной ДНК, выделенной из кукурузы, содержащей аллели С&2 и нанесение этой пасты на рыльца той же линии *х гЬ. Предполагалось, что в пыльцевые верна гораздо чаще проникают регуляторные последовательности,чем структурные гены. Ожидалось появление кукурузы с Сд2 фенотипом или нестабильных мутаций.

В результате обработки в М1 у 8 растений получены початки, из которых на двух было отмечено появление мутантных зерен. Это выглядело как окрашенные отдельные клетки алейронового слоя. Характер распределения этих клеток очень похоже на 9Б. Соотношение ОЬ : бесцветные в этих початках соответственно было 10 И. : 3 бесцветные и 5 01: : 2 бесцветные. ВМг было выявлено еще одно растение, носитель этой же мутации, так как початок на нем имел верна с тем же са-

мым паттерном распределения окрашенных точек в соотношении 7 Dt : 16 бесцветных. В целом потомство растений, выращенных ив Dt верен в основном состоит только иэ Dt, а потомство бесцветных - только из бесцветных верен. Однако отмечены единичные случаи, когда потомство, выращенное иэ бесцветных верен, при самоопылении давало початки с Dt зернами, а при самоопылении растений, выращенных из Dt верен, наблюдались достоверные отклонения от теоретически ожидаемого соотношения 3 : 1 либо ва счет избытка бесцветных верен, либо их дефицита.

Индуцирование Dt мутации могло произойти путем включения регулятора, похожего на Dt элемент в геном.рецепиента, при этом аллель, контролирующий синтез антоциана, уже содержал рецепторный элемент, реагирующий на Dt-подобный элемент эксцизией. Тогда в Mi на бесцветном фоне алейрона некоторые клетки окрашивались в фиолетовый цвет. Интеграция рецепторного элемента в аллель, контролирующую синтез антоциана у рецепиента, вряд ли возможна так как включение рецептора в аллель не вызывает появления dotted подобного паттерна. Одновременная интеграция в геном регулятора и рецептора событие маловероятное.

Тест скрещивания верен с бесцветным алейроном с MERL линиями, которые содержали рецепторы a-ruq, (Uq) и a-(mrh), (Mrh) указывает на активизацию или появление регуляторных элементов Uq и Mrh, так как у некоторых гибридных початков часть семян имела алейрон с окрашенными пятнами или полностью окрашенный алейрон. У wx sh(контроль), зерен с окрашенными пятнами в алейроновом слое не наблюдалось.

Глава 8. Генетические свойства мутаторной системы, контролирующей мутационные переходы Cg2 ---> Cg2+ и Cg2+ —> Cg2.

Накопленные экспериментальные данные показывают, что гетеро-хронная мутация Cg2 может спонтанно и систематически подвергаться

псевдореверсиям к Cg2+ и вновь мутировать от Cg2+ —> Cg2. Псевдо-ревертантные события от Cg2+ —> Cg2 могут быть индуцированы путем гибридизации специально подобранных линий, так как существует несколько аллелей Cg2+, способных ревертировать к Cg2 при взаимодействии с определенным типом цитоплазмы. Таким образом генетическая система контролирующая продолжительность ювенильной фазы развития может быть разложена на две составляющие части: I. Состоит из аллелей Cg2+ и цитоплазматического индуктора гетерохронного фенотипа Cg-2. Взаимодействие этих двух компонентов приводит к спонтанным переходам Cg2+ —> Cg2 и Cg2 —> Cg2+ с очень высокой частотой и индуцирует псевдореверсии от Cg2+ —> Cg2 при гибридизации. II. Состоит из аллелей Cg2 и цитоплазматического супрессора гетерохронии (csh - cltoplasmlc supresión heterohronll). В результате взаимодействия этих двух классов генетических компонентов происходит ослабление экспрессии гетерохронного фенотипа Cg2, иногда до полного исчезновения и не проявления мутантных признаков в следующем Поколении.

Генетическая система контроля продолжительности фазы ювениль-ного развития у кукурузы скорее всего не обладает мутаторной активностью. Целый ряд мутаций, выделенных в потомстве гетерохронной мутации Cg2, по-видимому связан с ТЭ. расположенным в смежных с Wx до-кусом сайтах или вследствии активности хорошо известных мутаторных систем Dt, En, Uq, Mrh и Ас (Табл* 11). Это стало очевидно после гибридизации линий ys*-143, sr*-220 и га*-220, br*-220, Cg2+220, ys*-253, ys*-253 Ргг*-143 с MERL (Moblle Element Receptor Unes), которые содержали рецепторные элементы в А и С локусах a-dt(Dt), a-m(r)(En), a-ruq(Uq), a-m(r)h(Mrh) и c-m-l(Ac).

Полученные от этих скрещиваний початки содержали верно, алейроновый слой которого либо имел полностью окрашенный алейрон, либо отдельные пятна или был абсолютно бесцветным. Как видно из таблицы И

Таблица 11

Результаты тестирования линий носителей аллелей Cg2 и Cg2+, а также MKD1 и ш sh на наличие регуляторных элементов Dt, Ac, En, Uq, Mrh.

1 I Тестируемые -—--—----1 Количество початков с регуляторными элементами |

I линии Dt Dt Aç,Aç,+ En, En + ug.ug.t Mrh,Mrh,+ |

1 Dt + + Ас,+ En,+ + Uq.+ ,+ Mrh, + ,+ |

1 |Cg2 gs bn2 gl 2 5 4 2 1

|Cg2/Cg2 143 5 1 5 1 |

|Cg2+/Cg2+ J 1 а 2 1 4 3 1

| Cg2+/Cg2+ 5369 2 4 1 4 1

|Cg2m-s 2 2 7 6 |

|br*-220 4 5 8 9 1 7 I

|sr*-220 6 5 8 6 9 1

|ys*-253 9 6 9 9 9 1

|ys*-143 1 1 1 9 1 4 6 б I

IMK01 4 4 б I

|wx sh 2 6 1 7 9 .6 |

все линии за исключением Cg2+/Cg2+ 5369 имеют все 5 семейств регуляторных элементов искомых мутаторных систем. Однако среди выросших из этих зерен растений кукурузы, не было ни одного фенотипически похожего на носителя аллеля Cg2.

Вполне очевидно, что присутствие в потомстве гетерохронной мутации Cg2 транспозиционных элементов широко испольвуемых в транспо-зон tagging является более весомой причиной высокой мутаторной активности линий носителей аллелей Cg2 и Cg2+, чем генетическая система контроля мутационных переходов Cg2 —> Cg2+ и Cg2+ —>Cg2.

Глава 9. 0 генетической идентичности гетерохронных мутаций Сд2 и Сд ЗБ-Зб.

Предполагалось, что Сд2 подобно иввестным гетерохронным мутациям, локализована в 3-й, 7-й или 10-й хромосомах. Тем не менее был проведен большой объем скрещиваний с набором маркерных линий, который охватывал практически весь геном кукурузы. Например с маркером

Таблица 12

Данные по расщеплению самоопыленной гетерозиготы Сг2 +/+ га2

1 Фенотипические классы i

I Родительские Кроссоверные Сумма % Рекомбинации|

| Cg2 + + га2 Cg2 га2 + +

| 239 65 61 55 420 29,9 + 2,8 | •

Мангельсдорфа, а также di 3S-44, га2 3S-49, 1&2 3L-101, о2 7S-16, ral 7S-24, gil 7L-32, 7L-36 и g 10L-50. Здесь представлены только результаты скрещивания линий носителей аллелей Cg2 с маркерной линией га2 3S-49 (табл. 12). В этом скрещивании было отмечено сцепление т.е. Cg2 расположен в Зй хромосоме как и мутации Cg 3S-35 и ТрЗ 3S. 9.2. Об адлельности между Cg2 и Cg 3S-35. Тест на аллелизм между Cg2 и Cg 3S-35 проводился путем гибридизации Cg2/Cg2 х Cg/+. В случае не аллельности этих двух мутаций в Fi, можно было ожидать гетерозиготы двух типов Cg2 +/+ Cg и Cg2 +/+ +. Действительно, в Fi иэ 113 растений кукурузы соответственно 56 имели сильный мутантный фенотип корн-грасс и были похожи на Cg 3S-35, а остальные отличались от кукурузы wt только метелкой (боковые веточки на метелке отсутствовали).

Ожидалось, что в ?г при самоопылении растений с сильным мутантным фенотипом корнграсс (Сг2 +/+ Сг). если и Сд2 аллельны, потомство будет представлено только носителями гетерохронной мутации корнграсс. а если не аллельны, то корнграссные и растения кукурузы >»1 будут появляться в соотношении близком 15 : 1, а при самоопылении растений со слабым мутантным фенотипом (С?2 +/+ +), расщепление на Сд2 и иЬ будет соответственно 3:1. Фактически потомство растений кукурузы с сильным и слабым мутантным фенотипом расщепилось в соотношении 3 : 1. Фенотипическая дискретность Г1 и появление в потомстве самоопыленяых гетерозигот С#2 +/+ Сд кукурузы говорит о том. что гетерохронные мутации С%2 и Сд ЗБ-Зб не аллельны друг другу.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что экспрессивность гетерохронной мутации Се2, которая приводит к пролонгированию ювенильной фазы и модификации последующих стадий развития - зависит от дозы гена и генетического фона. Пенетрантность гетерохронного фенотипа Сд2 прямо зависит от степени выражения мутантного фенотипа в Га.'

2. Гетерохронная мутация Се2 на чужеродных генетических фонах может вести себя как полудоминантный ген, а в некоторых случаях и как рецессивный. Так генетический фон маркерных линий га2 1^2. Ьт, 8. 1г г12 у4, Ьг эй в13 и Ьт4 супрессировал С?2 фенотип в такой степени, как если бы они содержали по одному или два рецессивных гена супрессора. Генетический фон 1а, эг и о2 у5 га г1 супрессировал Сд2 фен в еще большей степени, так как доля растений кукурузы с Сг2 фенотипом в ?г составляла для первых двух линий 1/4 часть, а для последней 1/15. Генетический фон 11 линий (1)5, Рг01а, Р2, Т7, Со125, 346, ВИР-44, N 384, МК01, 092 и Рад, карл США) также отличался друг

- 42 -

от друга по степени супрессии CgZ фенотипа.

3. Впервые, на примере CgZ гена, показано, что гетерохронные мутации могут быть нестабильными. Нестабильность Cg2 характеризуется; высокой частотой мутирования псевдоревертантных аллелей от Cg2+ к CgZ и псевдореверсиями от CgZ —> Cg2+; высокой степенью генеративного и соматического мозаицизма; широким спектром аллельных производных CgZ гена, отличающихся друг от друга по фенотипу, частоте и направлению мутирования и по тканеспецифичности мутационных событий.

4. Доказано, что на генетическом фоне специально отселектиро-ванных линий мутационные события в CgZ локусе происходят спонтанно с очень высокой частотой. Разработана модель, которая объясняет как моэаичность соматических и генеративных тканей приводит к отклонениям от обычного моногибридного расщепления. Эта модель основывается на учете регулярной нестабильности аллелей Cg2 и Cg2+ в равных генотипах: у гомозигот CgZ/CgZ ген Cg2 мутирует от CgZ —> Cg2+ среди 552 растений, у гетерозигот Cg2/Cg2+ эта величина достигает 15-17%. В гомозиготах Cg2+/Cg2+ величина нестабильности достигает приблизительно 28-292, а частота мутирования аллеля Cg2+ (Cg2+ —> Cg2) в соматических клетках колеблется от 5,5 до 15%, а в половых 1,8-3,6%.

5. Впервые предложена модель генетического контроля продолжительности фазы ювенильного развития у кукурузы. Мутаторная система состоит иэ аллелей CgZ и Cg2+, взаимодействующих с соответствующими генотипами цитоплазмы. В результате такого взаимодействия при гибридизации у аллелей Cg2+ происходит реконструкция гетерохронного фенотипа Cg2 у 502, а иногда и 1002 потомков Fi. 0 взаимодействии аллелей CgZ с различными генотипами цитоплазм судили по супрессии CgZ фенотипа в Fi. Отмечены случаи, когда 1002 потомства имело фенотип кукурузы wt (дикий тип). Реверсий к CgZ не было ни в Fz. ни в результате переноса аллелей CgZ на другую цитоплазму.

6. В потомстве растений N0 143 и N0 220, носителей нестабильных аллелей и Сд£+, был выделен целый ряд мутаций. Среди них доминантная мутация Ргг*-143 с частотой З.бхЮ"2 и 2,0 х 10~3 и рецессивные мутации а1*-143 - 9,0 х 10"3, уз*-143, гЬ*-143, гп*-143 с частотой 1,0 х Ю-3 в потомстве растения N0 143. В потомстве растения N0 220 появились рецессивные мутации Ьг*-220 с частотой 1,0 х Ю"3, а также ]*-220 и гг*-220 га*-220 с частотой 7,3 х 10~5.

7. в результате гибридизации между линиями несущими аллели Сг2, С^2+ и маркерными линиями в Р1 были индуцированы мутации в маркерных локусах (11 33-44 и га2 33-49, а при скрещивании Сг2 дэ ЬсЯ х 1г г12 у4 была выделена хлорофильная мутация гЬ-*220, которую локализовали на 3% дистальнее 23-11.

8. Генетический анализ мутаций, выделенных в потомстве гетерох-ронной мутации Сг2, показал, что почти все они обладают низкой пе-нетрантностыо. Так при самоопылении гетерозиготы эг-*220 +/+ Ьг-*220 доля носителей аллели бг*-220 не превысила 4,4%, а аллели Ьг*-220 от 6,5% до 17,9% вместо ожидавшихся 25%. Тесты на аллелизм между мутациями уэ показали, что мутации уг-*308 и уб-*309 аллельны уз-*253, а уэ-*309 аллелен уг ЗЬ-69 и уз*-9196 алделен уэ 51.-75.

9. Мутаторная активность, отмеченная в потомстве гетерохронной мутации Сд2, связана с генетическим фоном, так как в геномах линий носителей аллелей Сг2 и Сд2+ содержаться регуляторные элементы 01, Ас, Еп, и Мгй. Кроме них в коротком плече 9й хромосомы расположен транспозиционный элемент, который с- частотой 10~2 вырезается в смежных с Их локусом сайтах.

10. Доказано, что ДНК, выделенная из растений носителей аллелей Св£, обладает мутаторным эффектом, так как в результате обработки пыльцы экзогенной ДНК была индуцирована нестабильность фенотипически неотличимая от 01, контролируемой нестабильности в а1>локусе.

11. Хроническое воздействие гиббереллина от стадии проростков до выбрасывания метелки модифицирует выражение мутантного фена Cg2. У обработанных растений кукурузы Cg2/Cg2 отсутствуют боковые побеги и они почти в два pasa выше контрольных растений. Однако единственный побег имеет такие же очень маленькие початки, мужские соцветия и узкие листья, как и у контрольных растений кукурузы.

12. Установлено, что гетерохронная мутация Cg 3S-35 не аллельна исследованной мутации Cg2. Анализ расщеплений от скрещивания мутации Cg2 с маркерными генами по 1,2,3,4,5,7,8 и 10 хромосомам показал, что ген Cg2 расположен в третей хромосоме.

РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Гетерохронные мутации кукурузы могут быть использованы в создан™ высокоурожайных силосных гибридов непосредственно как источники многостебельности и многопочатковости. Для этого необходимо будет ввести в геном аллели Cg2+pseudo, а початковые родители кроме цыс будут содержать также соответствующий внехромосомный генетический элемент. Тогда при гибридизации таких линий мевду собой будут получены гибридные семена, из которых вырастет многостебельная, мно-гопочатковая гибридная кукуруза. У созданного таким образом силосного многостебельного гибрида побеги будут оканчиваться не метелками, а редуцированными колосками т.е. произойдет увеличение доли женского соцветия ва счет мужского.

2. При создании простого гибрида, дающего в Fi кустистые мно-гопочатковые растения кукурузы, целесообразно, чтобы отцовская форма имела обильно пылящую метелку. Идеальным типом метелки для осыпания пьшьцы является пирамидальная обильно ветвящаяся метелка известная как ramosa. Это рецессивные мутации ranosa, которые могут кспользо-

ваться как мужские родители в производстве семян. В потомстве гетерохронной мутации Cg2 выделен (га*-220) новый ген, источник феноти-шиески похожий на ral 7L-32. но не аллельный ей. Новый ген га*-220 экспрессируется только в метелке.

3. "Отзывчивость гетерохронной мутадии Cg2 на экзогенное введение гпббереллина (GA3) указывает на нарушение сложившегося сильного апикального доминирования и на катастрофическое изменение распределения питательных веществ в растении. Большинство самоопыленных линий несут гены супрессоры, которые эффективно дублируют производство генного продукта доминантной мутации Cg2. Эти гены супрессоры скорее всего зкспрессируются в геноме кукурузы и в отсутствии аллелей Cg2. Если эти гены легко удастся выявлять и локализовывать на генетическом фоне гетерохропных мутаций Cg2 и Tpl, то ими можно будет легко манипулировать, накапливая в необходимом количестве и составе в выбранных нами инбредах и, получат в результате высокоурожайные гибриды.

4. Гетерохронкая мутация Cg2 пролонгирует фазу ювенильного развития. Наблюдаемые псевдореверсии в результате которых происходит укорачивание периода ювенильного развития можно использовать в се-лекщ'ш на создачие более скороспелых гибридов кукурузы, так как в результате реверсий от Cg2 —> Cg2+, как правило, не точно восстанавливается продолжительность ювенильного развития исходной линии и наблюдается большая вариабильность по этому признаку. Такой подход позволит выделить высокопродуктивные Cg2+ псевдоревертанты.

По материалам диссертащш опубликованы следующие работы: 1. Крисов Н.В., Лысиков В.Н. Особенности наследования морфологических призншюв '-утащи типа "Корнграсс". //Тез. докл. научн. конф. "Создание и использование идентифицированных генетических коллекций основных с/.ч культур". Кишинев, 1979. С. 17-18.

2. Крквов H.B.. Лысиков В.H. Изучение индуцированных мутантов типа Корнграсс и Теопод. // Tes. докл. I Всесоюзное совещание "Генетика развития растений." Ташкент, 1980. С. 56-57.

3. Лысиков В.Н., Кривов Н.В., Голубовский М.Д. О возможности использования мутаций предкового типа в адаптационной селекции. // Тез. докл. Всес. конф. "Экологическая генетика растений и животных." Кишинев, 1981. С. 35-36.

4. Кривов Н.В., Лысиков В.Н. Идентификация мутантов типа Корнграсс. // Tes. докл. IV съевд МОГиС, Кишинев, 1981. С. 86.

5. Кривов Н.В. Экспрессивность гена CgZ. //Тез. докл. IV съезд ВОГиС им. Н.И. Вавилова, Кишинев, 1982. С. 245.

6. Лысиков В.Н., Кривов Н.В. Индуцирование инсерционных мутаций у кукурузы. // Тез. докл. I Всесоюзная конференция по прикладной радиобиологии, Кишинев, 1981. С. 75.

7. Кривов Н.В., Лысиков В.Н. Стабильность Cg2 как эндогенно индуцированный процесс. // Тез. респ. конф. "Адаптация и рекомбиногенез у культурных растений." Кишинев, 1982. С. 58.

8. Лысиков В.Н., Кривов Н.В. Генетическое изучение потомства радиационной макромутации типа Корнграсс. // Экспериментальный мутагенез в интродукции, акклиматизации и селекции растении, Саранск, 1983. С. 120-124.

9. Лысиков В.Н., Кривов Н.В., Голубовский М.Д. Генетический анализ макромутации корнграсс у кукурузы. // Генетика, 1984, т.20, No 1, С. 90-99.

10.Кривов Н.В., Лысиков В.Н. Нестабильная ыакромутация Cg2, вызывающая вспышку наследственной изменчивости. // Известия АН МССР, 1985

. N0 6, С. 39-43.

11.Кривов Н.В. Нестабильность ыакромутации Cg2 у кукурузы с точки зрения инсерционного мутагенеза. // Чувствительность организмов к

мутагенным факторам и возникновение мутаций-новые направления в мутагенезе растений. Вильнюс, 1986. С. 33-35.

12.Кривов Н.В., Лысиков В.Н. Корнграсс-новая оригинальная мутаторная система кукурузы. // Матер. Всес. конф. "Рекомбиногенеэ его значение в эволюции и селекции. Кишинев, 1986. С. 97-100.

13.Кривов Н.В., Лысиков В.Н. Влияние гиббереллина на фенотипическую экспрессию макромутации кукурузы Cg2. // V съезд МОГиС, Кишинев, 1987 С. 211.

14.Кривов Н.В. О генах супрессирующих радиационную макромутацию CgZ. I Всесоюзное совещание по применению физического и химического мутагенеза в с/х, Кишинев, 1987. С. 14.

15.Кривов Н.В., Лысиков В.Н. Определение группы сцепления для радиационной макромутации Cg2. // I Всесоюзное совещание по применению физического и химического мутагенеза в с/х, Кишинев, 1987. С. 15.

16.Лысиков В.Н., Кривов Н.В. Объяснение генетической нестабильности по гену Cg2 с позиций инсерционного мутагенеза // V съезд ВОГиС, Москва, 1987, т. 4, ч. 1. С. 256.

17.0садчий В.М. Кривов Н.В. Анатомическое строение листового аппарата макромутации "Корнграсс" у кукурузы. // Известия АН МССР.1987, No 3. С. 8-11.

18.Лысиков В.Н., Кривов Н.В. Ген корнграсс-2 (Cg2) как источник генетической нестабильности и мутаторной активности. // Генетические основы интродукции и селекции растений, Саранск, 1987. С. 92-98.

19.Кривов Н.В., Лысиков В.Н. Влияние генетического фона маркерных линий на проявление и выражение макромутации Сд2. // Известия АН МССР, 1988, N0 2, С. 20-24.

20.Кривов Н.В. Особенности контроля нестабильности у макромутации Cg2. // Состояние и перспективы развития генетики и селекции в

Литве, Вильнюс, 1989

21.Кривов H.B. Мутаторная система, контролирующая нестабильность в локусе Cg2. // Tee. докл. конф. "Частная генетика растений." Киев,

1989. С. 114-116.

22. Харитонова М. К., Кривов Н.В., Лысиков В.Н. Генетические изменения у растений кукурузы под действием экзогенной ДНК. // Тез. докл. конф. "Частная генетика растений." Киев, 1989. С. 103-104.

23.Кривов Н.В., Сеитова А., Ананьев Е.В. Электрофоретический анализ линий, содержащих генетические компоненты, контролирующие нестабильность в локусе Cg2 у кукурувы. // Тез. докл. конф. "Генетика развития растений и животных." Ташкент, 1990. С. 91.

24.Харитонова М.К., Кривов Н.В. Активация эквогенной ДНК одного из генов, контролирующих синтез пигментов в алейроне у кукурувы. // Тез. докл. конф. 'Тенетика развития растений и животных." Ташкент,

1990. С. 182.

25.Кривов Н.В. Мутаторная система, контролирующая нестабильность в локусе Cg2 по типу гибридного дисгенеза. // Тез. докл. конф. "Проблемы теоретической и прикладной генетики в Казахстане." Алма-Ата, 1990.

26.Русановская Е.Г., Кривов Н.В., Лысиков В.Н. О факторах,-осложняющих картирование гена Cg2. // Цитология и генетика. 1990, т. 24, No 5, С. 21-25.

27.Кривов Н.В. Новая мутаторная система контролирующая нестабильность Cg2 локуса. //Известия АН РМ 1991, No 6, С. 23-27.

28.Tumanova L.G.. N.A. Vlkonskaya, Krlvov N.V. Wx locus in maize plants carrying unstable macromutation Cg2. // Mai2e Genetics Coop. Newsletters, 1992. No 66, p. 53-54.

29.Krlvov N.V. Mutator system-controlled instability in the Cg2 locus. // Maize Genetics Coop. Newsletters, 1992. No 66, p. 54-56.

30.Krivov N.V. Mutation system inducing instability in the Cg2 locus. // Maize Genetics Coop. Newsletters. 1992. No 66. p. 56.

31.Krivov N.V., Lyslkov V.N. New induced heterochrony Cg2 mutation. // Maize Genetics Coop. Newsletters, 1992. No 66. p. 56.

32.Krivov N.V., Lyslkov V.N. Cg2 macromutatlort linkage data. // Maize Genetics Coop. Newsletters, 1993. No 67, p. 65-66.

33.Krivov N.V. A test for allelism between Cg2 and Cg. // Maize Genetics Coop. Newsletters, 1993. No 67, p. 66-67.

34.Кривов H.B., Голубовский М.Д., Лысиков В.Н. Нестабильность макромутации "корнграсс" у кукурузы: модель и эксперимент. // Генетика 1993. Т. 29. No 1. С. 99-113.

35.Krivov N.Y.. Lyslkov V.N. The influence of chronic glbberelIn treatment on the expression of the heterochronic mutation Cg2. // Maize Genetics Coop. Newsletters.. 1994. No 68. p. 48.

36.Krivov N.V. Expressivity of the heterochronic mutation Cg2 and Its correlation with gene dose. // Maize Genetics Coop. Newsletters. 1994. No 68, p. 48.

37.Krivov N.Y. The Interaction between genes suppressing heterochronic mutant Cg2 manifestation and the cytoplasm genome. // M^ize Genetics Coop. Newsletters, 1994. No 68, p. 48-49.

38.Krivov N.V. The effect of genetic background on the expression of maize heterochronous mutation Cg2. //In: Conferentei I natlonale "Probleme actúale ale geneticll, blotehnologle si ameliorarii". Chlsinau, 1994. C. 33.

39.Haritonova M.K., Krivov N.V., Lyslkov V.N. Testing the marker line wx sh carrying a mutation phenotyplcally resemblolng Dt (9S) for the presence In its genome of regulatory elements Uq and Mrh following pollen treatment with exogenous DNA. // Maize Genetics Coop. Newsletters, 1995. No 69, p. 85.

,40.Haritonova M.K., Krivov N.V., Lysikov V.N. The genetic behavior of unstable alleles controlling aleurone layer color following pollen treatment with exogenous DNA. // Maize Genetics Coop. Newsletters, 1995. No 69, p. 86.

41.Krivov N.V. Interaction of Cg2+ revertants with the cytoplasm genome and between themselves. // Maize Genetics Coop. Newsletters. 1995. No 69, p. 8?.