Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ КАРОТИНОИДОВ У MYCOBACTERIUM CAROTJSNUM

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ КАРОТИНОИДОВ У MYCOBACTERIUM CAROTJSNUM"

Академия наук СССР Институт микробиологии

На правах рукописи

ЗОБНИНА Валентина ' Павловна

ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ КАРОТИНОЙДОВ У МТСОВАСТЙКЛШ САНОТШША

Микробиология - 03.00.07 {Диссертация написана на руссксм языке)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1074

академий впк ссср яясютт кикробиологии

На прим ргмшок

805ЯИНА Вялввтпяа Павлова»

«издшагачвсш роль карошкэдоэ у -

МГООЕАОТШШЖ САЕОТИЯШ

f

Микробиология - 03,00,07 /Джооерттдяя наалсш« на рувсжом яяша/

isicptfepif

дквоертаадя на сококаяд» yiüttoii «мпвня

кояздцата ¿«алсгкодшкх

Ковкв& -

ЗЭ7*

Работа выполнена а Института микробиологии АН СССР. Научный руководитель - доктор биологических наук И.Л,Работнова.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук В.Г.Какаревич, кандидат биологических наук Е.П.Феофилова.

Диссертация направлена на официальная отзыв в Институт биохимии И ФИЗИОЛОГИИ микроорганизмов АН СССР, I г.Пущине на Оке, .

Автореферат разослан " .

Запита диссертация состоится "^2. " г.

час. ЗР шт. на заседаний Ученого Совета Института микробиологии АН СССР, Москва В-312, Профсоюзная) 7а, корпус 2.

С диссертацией ножио ознакомиться.» библиотеке Института микробиологии АН СССР,

Ученья секретарь Ученого Совета ИНШ АН СССР, от,научный сотрудник, канд.биоп.иаук \У1

(Л.К.Осницкая)

ВВЕДЕНИЕ

В последние годы уделяется большое внимание микробиологическому получению наротиноидов. •

Интерес к изучении этой группы соединений вызван преэде всего тем, что некоторые каротивоиды являются предиеотдрвпаками витамина А, который« как известно, кмеет большое физиологическое значение для организмов человека и животных.

В связи с этим чрезвычайно важно использование добавок каротиновдных препаратов, как предшественников витамина А в корм сельскохозяйственный животным. Несомненный интерес может представить также использование каротнноидинс пигментов В качестве пищевых жирорастворимых красителей вместо применяемых до сих пор в пищевой промышленности органических красителей.

Получение каротиноидов из растительного сырья не монет удовлетворить растущие потребности народвого хозяйства,, а потому синтез каротиноидов с ломоты» микроорганизмов приобретает все большее значение, .

Особенно целесообразным было бы микробиологическое получение каротиноидиых препаратов на основе нелицевого 'сырья -углеводородов нефти и природного газа.

Среди сапрофитных микобактерий широко распространены формы, содержащие варотиноиднне пигменты и способные использовать в качестве источника углерода такое дешевое.сырье' как природный газ«

Каро*иноиды выполняют различные функции в живой клетке. Однако .следует отметить, что Функции каротиноидов наиболее хорошо изучены для растений и фотосянтеэирувцих бактерий.

У фотосинтезируюадх бактерий'каротиноидй способны погло-

иать лучистую Бнергвю в синей области спектра, » передавать -•в на хлорофилл (Clayton , , 1953; Максимова, 1959, Кондратьева, 1972)* Существует точка зрения, что харотпжшды могут составлять один из участков s цепи окислит ел ьно-восотаяователь-. них реакций, ведуцнх к ойразованив кислорода в процессе фотосинтеза у водорослей (Сапожников, 1964).

По некоторый данный каротиноады некоторых растений и фо~ • тосинтззирущих бактерий участвуют в реакцигас фстофо сформирования, идущих с образованием АТФ ( Eaitschefsky ( 1Э69), Установлено, что каротиюиды участвуют в защите от гфотоокис- ■ лнтелького повреждения целых клеток и клеточных компонентов у. фото'-и нефотосинтезируюииа микроорганизмов (stonier ,1960; Kuniaava « Stanior jl958;, itotbev« , Sistre*,' 1959). Накоплен ряд данных, позволяющих обсуждать участие ка-ротиноидов а половой диморфизме и в процессе размножения птамиов низших грийов порядка uucovaiua (Феофилова, 1970),

Но последним данный каротиноиди,-способствуя стабилизации бактериальных ueuopâH, защищаи» метку не только от дев-' ствиа.слега, но н ох некоторых химических, соединении {Saltón a lïrltisbam-Ud-Dto,

Некоторые авторы обнаружили зависимость иежду солевой устойчивость» некоторых микроорганизиов и наличием каротшои-дов в их клетках ( Титею \ ïervis ,.1968)*.

Однако следует отметить,'что физиологическая роль «аро-т я его идо в для нефотосинтезируюшос микроорганизмов остается до сих пор невыясненной.

В связи о этим целью нашеЦ работы являлось:

1. Изучение защитной роли карогиясгвдоа от действия огона и перекиси водорода? метано кисляю wer о итамма üycobaot. carotenum • ■

2. Изучение возможности участия каротиновдов в дыхании , Hycobac-b« carotfenun .

3. Изучение защипой роли каротиноидов от повышенной ва-сояеняости среды поваренной солью. '

Объекты,», мет од и, исследования '

Осяовяая райота была выполнена со мтамыом Mycobacterium caxoteaum и получен на ни аз него сод действйен н -

метил- и' нитро- ^ -нитроэогуавидина пигнентньшинутавтами (белым, желтым и оранжевым). 1

Культуры выраадвали ва глюкозо-аспарагииовой среда Годвина в колбах со 100 tut среды или на агар и зов ав вой среде1 в чайках Петри. ' . •

! Определение видовой принадлежности культур проводили по тестам, предложенным в определителе Нраспльвикова (1948). Выращивание на метане (сетевом) осуществляли ваагаривоваяной и жидкой среде Буивелла м Гааоа в атмосфере метановоздушной смеси при соотношении кетан:воздух*1:3.

Количественный учет бактерий производили в камере Горя-ева, биомасс; определяй» яефзломегричасяя в пересчетом ва вео сухой биокассы по стандартной кривой или непосредственным взвешиванием доведенной до постоянного веса пробы. Скорость растворения кислорода определяли сульфитным методом { Ооораг et. а1 t I94A), Интенсивность дыхания определяли в аппарате Барбурга (Умбрейт о соавторами* 1951).

Нуклеиновые кислоты фракционировали по методу ймидта в

Танштадзера (Спирин 1958),.РНК определили спентрофотомет-ричесвй- 'Скврч:^ 1958), ДНК - по.методу Дите в модификации Барюна ( ВигЬоп ( 1956), белок - по методу Ноури < Ьоину» ■1951), лолисахариди - с ацтроновии реактквоы (Уа^цева, Афанасьева, .1958), ли лмды - весовым и е то дои ( ГоДсЬ 1 1957).

Разделение липидов на фракции проводили методом хрена-тографии в тонютм слой. Количественный состав линидог по фракциям определяли методой препаративной хроыатографии в тонкаи слое в сочетании с гравиметрическим методом ( гмшагек • , 1964).

Каталазную активность интактных клеток устанавливали по перкаиганатноыу методу [юнниксека { Вогл1сЬзсп 195'3),

Активность, пероисидази интактных клеток определили с бенэидином по истоду Ьояркина (1951).

.Качественный состав цитохроиов определяли на дифференциальном спектрофотометре тина приборов Чанса (Ьорисои, Мйхова, 1964, 1966), Количественно цитохромы измеряли в суспензиях интантиых клеток на дифференциальном спектрофотометре при комнаткой, температуре и температуре жидкого азота.

Общее количество киротйновдов огу'едеяяли измерением Ьи-" тическок плотности экстракта пигментов в метаноле на ФЭК-52 при 455 1Ш (фильтр 6 3) с последующим переводом в икг - каротина но стандартной кривой. Пигменты гипофаэи экстрагировали метанолом из общего оке г рама пигментов,'переведенных з петролейвык эфир и подверг«утих предварительно омылению 5% КОН. - - .

* Качественный состав пигментом элифазы определили хром»- " тографически на бумаге, пропитанной 0,5% раствором формамида

х систеках содержащих-от одного до семи процентов ацетока х петролейном эфире.

, Озонирование проводили на озонаторе, фирма "СЕО" - Франция, модель №. -" . : РШЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ■

I, Получение пигментных; мутантов и изучение их . ворч'юлогических и аизиолог^-бнохкцичеоких свойств сравнительно с исходны» штанном Mycobacterium» саго t спид.

Определялось летальное и мутагенное действие 11 -метил- к нитро- н нитрозог$анидина на метанокислаюдвЙ;штЬди

' KycobdOter.lujii aarotenuni.

Установлено, что ни т розог? а ни дин в концентрации WoV^1"

оказывает срасвительна невысокое летальное действие в »

клетки, взятые я логарифмической фазе роста.

При экспозиции «статена в течение часа.выживаемость - f.!ycobaeterium . carotenwtt снизилась ДО WJi

(рис.1). - При атом наблюдалось появление главный .образом оранжевых мутантов более интенсивно окрашенных к с гладким.типом колоний в отличие от исходных складчатых. . .

Как видно из рис.1 при часовой экспозиции мутагена количество оранжевых мутантов достигло 20^ от общего количества-клеток. Появление белого и желтого мутантов было единичным.

При'сравнении мутантов с исходным штаммом ло признакам, првдлохешшц в определителе Крв с и льни нова оказалось, что белый мутант обнаружил почти полную идентичность .с исходным итаммом flycobactsrlum carftonum по морфологии клеток и коло-

ний, по отношению к сахара«, солям органических кислот и слир--там. Белый мутант, как и исходная культура не образовывал а»-

Рис Л. Действие ни тр о зогаан иди и а на выживаемость в появление пигментных мутантов у ¡^уеоъ^сь. сигоЬспал). "

Рис. 1« I. Выживаемость {%). 2- Количество мутантов с повышенным синтезом варотиноидов

миака, сероводорода и иалода» .не восстанавливал нитраты, клет-

- ■ ' ' '

чатку не разлагал, желатину не раэжихал, крахмал не гидролизо-вал, не отличался, от исходного штамма по степени"иепрониза-ции молока, Единственное отличие белого мутанта - появление -слабой киспотоустокчивоств»

У оранжевого и хелюго "мутантов также не обнаружено изменений, выходящих за пределы вида* Эти мутанты отличались от исходного штамма по типу колонии (колонии были гладкие и блестящие, в отличие от складчатых колоний 'исходного штамма) и способность» развиваться при повышенных {до концентрациях

<MlC(L . Оранжевый путам кроив того более активно, по срав-

*

веник с исходный штаммом, усваивал лактозу.

Все три полученные мутанта (белой, желтый и оранжевый), как и (¡сходный штама iiycobactoriuB caxotenum ^усваивали метан в качестве -единствен иод« источника углерода,

Ь'ило установлено, что »сходный каротвноидный штамм и его белый »утаят при .культивировании в атмосфере метана в коа-бах на качалке дают на пятые сутки одинаковый выход биомасс» ' (около 0,7 г/л сухой биомассы).

Нутанты практически не отличались о« исходного штамма по скорости роста на гшонозо-аспарагвновой среде Гудвина-' t 0,12-0,13.час"1).

/

Это обстоятельство говорит з пользу предположения о необязательности карОТИЯОЙДОВ ДЛЯ разив ожени Я J¿yeobacteritim

earotenum *

Некоторые авторы С Tsukamura- ( 1963; KoniCek;" ,

Me lele ' 1968) наблюдали у исследуемых пня мвкобактерий изменение чувствительности к свету под действием УФ-лучей.

Нами было установлено, что у мутантов (оранжевого и желтого ) пигментная система оказалась, как и у неходкого штамма .Mycobacteíium carotenunt , не чувствйгеягной к саэ-

ту.

Полученные мутанты оказались устойчивыми и не изменяли свои окраску при поддержании в коллекции в течение 3-х лет»

П. Этнический достав клеток ia>nnli"''1?i",1i'" cajotenujn и, erg ригментаых мутантов.

Было установлено, по характеру спектров поглощения яя-

тактных клеток, что пигмента исходного мтамма и его мутантов

(оранжевого и желтого) имеют каротиноиднув ирироду (рис.2).

. 10 ' , У исходного штамма и мутантов (оранжевого в желтого) найлвда-ется наличие одного главного иахсинума в двух слабо вырешенных максимумов поглощения в синей области спектра, что характерно для каротиноидов»

Рис,2. Спектры поглощения суспензий клеток МусоЪасЬ. саюа^чт - - и его мутантов,

ШуйоЪнсС. слгоЬепии П. Оранжевый нутант. Ш. аелтыа мутант . п. Белый мутант.

Качественная реакция Карр-Прайеа подтвердила, что внутриклеточными пигмввтами мусбъисъапшц «аго^еииш и его мутантов (оранжевого и желтого), действительно, являотся ка-ротиноиды.

Обнаружено ташке, что различия в о кр ас ке м сходно го . . втайна и его мутантов обусловлены разниц количественный содер-

• * '

жанием кароЛшоидов в их клетках, а не изменением качественного состава пигментов* 4

Из тайл.1 ВИДНО, ЧТО ИСХОДНЫЙ штамм ЦуСоЪаеЪегАит

оа^етш на пятые сутки культивирования синтезировал 310 * . -мкг на г сухой биомасс» каротиноидов, в клетках оранжевого мутанта каротиноидов оказалось в 1,5 раза больше, а у желтого -в З'раэа меньше но сравнению с исходник штампом. На долю ксантофиллов, как видно из таблицы I, у исходного штамма, оранжевого и желтого мутантов приходится около 70£ от оСнего количества каротиноидов. •

Таблица X.

Общее количество каротиноидов и содержание ксантофиллов у МусоЪа<^ог±ша елгоъеоит . И его мутантов

Обиее Еюличе- Ксантофиллы

кул'ичм 0120 я ^ от общего

адльтура ноидоя количества

мкг/г сухов каротиноидов -биомассы

Î.lycobanteriùa carotonum

310 75

Оранжевый мутант 165 70

Желтый мутант 100 69

Хроматографическое разделение смеси пигментов эпифазы на бумагб, пропитанной формалидом, показало, что у исходного-штамма, оранжевого и желтого мутантов выявляется наличие только jî-каротина. .

+ *

Мутанты существенно ие отличались от исходного штамма Mycobacterium carotemuo ПО количестве белка В КЛвТКМ (табл.2).

Дефицитные по каротиноидзм формы (белый и желтый мутанты) содержали меньше ДНК по сравнению с богатыми каротинов- - . дани исходным штаммом я оранжевый мутантом (табл.2). Как вид-

ц<пвз таблицы.количеотво ДНК у белого и желтого мутантов сни-вилось до сравнен»» с исходным( штаммом соответственно на 43% и на 36%.

■ Таблица 2

Содержание ДНК. РНК. белка, полисахаридов в клетках МусоЬ=с1ег1ии- сого-Ьепию и его пигментных мутантах

Содержание в ъ/ж сухой *

биомассы_

белок полисахарид»

Культура iií

llycobact.* carotcnum I&.3 92,V 296j5 120

Оранжевый Мутант 18,53 159,5 SQ8 ■ 13?

Желтый мутант . 10,2 \90,1 271 131

Белый мутант 9,2 72,0 296,5 83,3

По количеству РНК желтый мутант существенно не отличался от ИСХОДНОГО штамма l^cobactcriuw carotuftun , тогда как у белого мутанта обнаружено снижение, содержания РНК (на 23,6%), количества РНК у оранжевого мутанта оказалось выше по сравнению с исходным штампом (на 57,6%) (табл.2),

Лолисахамидов в клетках белого мутанта оказалось на 31$ меньше, тогда как у оранжевого и желтого мутантов отмечено, напротив, увеличение содержания полисахаридов (на - у ' оранжевого и на Sí - j желтого мутанта).

Обнаружено более высокое содержание липидов у обеднен-них каротиноидами форм (желтого и белого мутантов) по сравнении с богатыми верстиноидами исходным штаммом и оранжевым мутантом (табл.З), Как видно нэ таблицы,общее количество липи-дов в % os сухого веса клеток у исходного штамма и оранжевого мутанта равнялось соответственно 17,6; 16,тогда как у желтого в белого Цутаитов оно было более высоким и равнялось со-

ответственно - 27,2! 22,4$.

Таяиа образом наблюдается тенденция к обратной связи между содержанием карохивоидов и липидоа. .

Таблица 3

Общее количество липидов в клетках »сходного яхаиыа ' ЦусоЬасЪег1иш1 саго^тип В его мутантов.

Количество липи-

Культура До» л % от сухого

веса клеток

ЧусоЪлс1;. сагоЪевшв 1 17,6

Оранжевый мутант 16,3

. Желтый мутант 27*2 , ■

Белый мутант 22»4

Полученные данные иогут представить интерес как дополнительные о свнэи липо- и каротиногекеза, . '

^ связи с тем, что синтез каротивоидоя и стеринов идет по общей схеме до стадии фарне г и лпирофосфата, можно,было бы ожидать, что при блокирование синтеза (еаротиноидов не будет конкуренции га фарнеаилпврофосфат стериков и каротиноидов, и возможно увеличение содержания стеринов у дефицитных по каро-тивоидам форм.

При сравнения количественного состава лииндоа по фракциям было установлено (табл.4), что хотя содержание стеринов и стеряжмых эфиров в суше, деПетжягельво, увеличилось у дефицитных по каротвноидаи желтого и белого мутантов, однако у них наблюдалось более значительное увеличение количества фос-фолюпидов; количество триглицеридо» в составе их яипидов так- . же увеличилось, хотя и менее значительно.

Таким образом у полученных мутантов с измененным количеством каротиноидов оказалось измененным в содержание Линидов,

- 14

ДНК, РНК и. полисахаридов.

111. О влиянии некоторых Физико-химических факторов. , ~ и состава с рады на каротиногенйз у микобактерий.

Было испытано влияние различных факторов (света, аэра" ции»температуры, состава среды) на содержание каротиаоидов у ряда сапрофитных микобактерий, с целью получения обедненных каротииоидами форм.

Б результата проведенных исследований не удалось найти условия культивировании, я которых был бы существенно И специфически .снижен синтез каротвноидов.

■ Поэтому дальнейшие исследования защитного действия каро-тимоидов против рада неблагоприятных факторов проводили при сравнении окрашенного, штаныа Мусobacfceriшв carotenuii я его бесцветного мутанта, полученного под действием витрозо-гуанидвна. ...

ХУ. Исследование устойчивости к действию H^Og и О l.iycotiactpriuij с dio t опии й его

^ ... —3——■—■----—*— ■ -................—■

бескаротиноидиого мутанта.

УСТОЙЧИВОСТИ К ВоОл .

г Исследовали выживаемость каротиноидного штамма L^oobact carotenu« и его белого мутанта при обработке 0,IJ6 Н^С^ (рис.3)» Из рисунка 2 видно, что исходный каротиао-адный штамм обнаружил более высокую устойчивость к действию НД по сравнение с белым мутантом..

Пожне предположить, что повышенная устойчивость к действии H¡p2 каромномдного штамма, по сравнение с бескаротико-вдным мутантом,может определяться наличием в.исходном штамма ' каротииоидов, которые;являясь лепсоокисляююшисн веществами, , связываются с tt¿0¿ и в какой-то степени снижают токсическое

Таблица 4-. 1 ■

Количественный coûtai лшпидоа по фракциям . L'jcooacteriffis с aro tenue И его цутантоз.

• 'Количественной состав липк^ов по фракция^ i ' | ' iim

' .'.Ij'cobaс t, çеrat êeue¡ оранжевый мутант ¡ яелтай иугаят ; <5елыЙ иутадг

- ¡в >.от на |s ¡¡ь от TFJTHa Гв oír !в 'ва i в > от ! в > на '. ; оOmero !вес сухой!Обаего ¡вес 'общего !вес сухой 'общего 'вес су; шл-ва !<5иоиасса ! кол-ва .'сухой , кол-ïa »биомасса 'кол-ва }хой •'ли иди { шпидов »биомассы ;лкпйдов ! ! липвдов№о»ас-J____j____I____¡^____i_________i _ JÇB____

^осфошвды 29,6 ■ 5,2* 31,8 5,18 .39,2 10,7 54,0 7,6

Стервкы 18,3 . 3,22 26,4' 4,3 ■2.1,5 5,9"' 22,6 5,06

ТрЕглидериди 37,5 ■ 6,6 31Л 5,12 26,1 7,02 32,2 7,21

CîepcEOîae эфиры 14,5 2,5 10,5 1,7 13,4 3,66 П,5 ¿,58

действие перекиси водорода ва клетку.

Однако предполагать, что только каротиноиды определят различия В устойчивости к Н2О2. цусаЪасЬеПшз сагоЪеаша и его белого мутанта биао Сы неверно.

Микроорганизмы обладает и другими занятными возможностями против действия В^О^« " Общеизвестно, что каталаэа, разлагая Нг(>2»предохраняет живые организмы от ее высокотоксического действия. Пероксидаэа также способна, хотя и менее интенсивно, чем каталаэа, участвовать в разложении Н^О^. В связи о »твм представляло интерес сравнить варотииоидиый штамм Муйоьасъепшя селении •» его белый мутант по активности ка-

I а лазы и перексидааъ) для выяснения, не определяются ли различия в устойчивости к действию Н^О, ' каротикоидного штамма' и его белого мутанта различиями я активности этих .ферментов.

Сравнительное изучение каталаэной активности Цусо-bact. carotenuai ' и его пигментных мугантол - белого, желтого и оранжевого,'показало (табл.5), что по каталаэно0 активности исходный штамм к его белый мутант оказались практически одинаковыми. -

Каталазнан активность у желтого мутанта оказалась на 37,3^5 ниже, чем у исходного штампа, у оранжевого мутанта обнаружено снижение активности ката лазы на

Таблица 5

.КаТ&ЛаЗН&Я И ПбрОНСИДаЗНаЯ aKTUBHOCTb Mycobacterium c&rotanum И -еГО мутаНТОВ,

- Т Каталазная 1 активность Упероксиказная 'активность

Культура ! иг"1 ! белки-| секи 1 i ! \ мг"1 белка- сек-1 !-------- t

' tlycobact. carotonuw Желтый мутант Белый мутант Оранжевый мутант 4 30,4 w.s 19,8 100 62,7 85,6 ад,а 30,6 27,2 VI,Ъ ' 21,6 100 70,5 .1X3 56

Пероксидазнан активность Стайл.5) у белого мутанта оказалась- несколько более высокой (на 12,8%), тогда как у желтого н оранжевого мутантов'обн&ружено снижение активности персу-ксидазы соответственно на 29и по сравнению с исходных штаммом, ^

Таким образом, до каталаэной активности исходный штамм ЫусоЪасЪеПии сагоЬепшц и белый «утаит не различались, а

перокс9дазная активность у исходного штамма, более устойчивого к Ь2°г* сказалась даже ниже чек у белого мутанта. На этом основании монско^о определенность» сказать» что фермента - каталаэа и пероксидаза, которые считаются протекторными от действия , не играют роли й обусловливании повышенной устойчивости к Н^О^ исходного каротиноидного штамма.

Полученные результаты представляют также интерес я связи с тем, что данные по изменению активности этих ферментов и мутантов микобактерий отсучузтьуют.

Представляло интерес сопоставить полученные нами ранее данные по содержанию других внутриклеточных компонентов (ДНК, РНК, белка, ли пи до в и полисахаридов) у цусоьасъепии ' саго^ешш и его,белого мутанта с устойчивостью к Как видно из табйицы исходный каротннондный штамм ЛусоЬа^еПит сагойепша* содержал ДНК больше на' РНК - (иа 22/5), полисахаридов - (на 31^5) по сравнению с белым мутантом.

На основании этих данных даяно предположить, что повышенная устойчивость к действию'Н202 исходного каротиноидного штамма до сравнению о Оескаротиноидгши мутантом мокет определяться не только наличием каротиноидов. Она возможно связана также с более высоким содержанием в его клетках нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) и полисахаридов. „ .

. Как уже отмечалось, в клетках исходного каротикондного ятамма более устойчивого к действию Н^', общее количество липидов оказалось на б,156 ниже, чем у белого мутанта ^табл.З), На этом основании можно заключить» что повышенная устойчивость к действию Н20^ *. мусйъ^с-ьеп^ип сси-оьепиа кв опредеян-ется общим содержанием липидов. Такой вывод можно сделать,

если придерживаться точки зрения авторов/ которые считают, что ли лиды, являясь легкоокйсляешии ве «ест вам и могут взаимодействовать с Н2О2 и активными радикалами и оказывать защитное действие от радиации (Алексеева 1958; Заикина с соаьт, 1974). /

Б связи с тем, что по мнению некоторых авторов (Тарусов и др.1%6) липиды, напротив, не обнаруживают защитного действия от радиации н окислительные процессы, развивающиеся в ли-~ . пидах, ведут к образованию токсических перекисных продуктов, не исключено, что. повышенная устойчивость :.1.усоЬас1-ог1шп сагоъеаит к иоле1! определяться также меньшим ко-

личеством-липидов в его клетках.

Устойчивость, к действии озона МусоЬисЬ. ctiroterL.ua_и его белого мутанта.,

Исследовали выживаемость каротиномодного штамма ' [.'усоЪас^чаши салх^елцт и его белого мутанта при обработке огоном в концентрации 12 иг/л. На рис. 4 видно, что исходный каротиноидный штамм обнаружил более высокую устойчивость к действию озона по сравнению с белым мутантом.

В процессе озонирования окрашенный штамм полностью обесцвечивался. Проследив изменения, происходящие под действием озона в спектр» поглощения клеток Ыусоьаоьиг1ил1

оагсгЬспиш , установили постепенное исчезновение максимумов поглощения, характерных для каротиноидов, Через 20-'минут происходит полное разрушение каротиноидои во всех клетках 1лусоЪас^ег1шп сагоЪипиш . Выживаемость, начиная с этого момента (рис.4) начинает падать более быстро. Так, если в промежуток времени от 15-20 минут выживаемость упала на

временя о эони ро вани я, I Мусойас*. сагоЪепиш П Белый мутант

то с 20 до 25 минут (каротнноиды к этому времени полностью разрушены) ухе на - 40%,-Таким образом, большая выживаемость исходного каротиноидного штамма по сравнен!;» с белым мутантом» а также более резкое падение выживаемости каротиноидного »таима Цу соЬас Ье г 1ит сагсЛегШзв ) Йачиная с МО™ мента полного рааруяеная каротяноидов в клетках, могут служить доказательством того, что каретиномды, защипают глетку от токсического действия оаона. Каротивовды, вероятно, принимав часть оаона на себя. и благодаря этому снимают его ток-

сичеоков действие на другие компоненты клетки, то есть выступают как антиокислители.

' Обесцвечвваые; под действием озона клетки ЦусоЪа<^епиа «аг^епит давт при высеве на агариэованную среду Гудви-на окрашенные не нацененные, по сравнении о исходным штампом, колонии. Значит, хотя в результате озонирования наротиноиды разрушатся полностью, энзвматический механизм для их обратного восстановления иди нового синтеза сохраняется.

Кроме каротиноидов различия в устойчивости к озону исходного варотиноидного штамма иусаЬа^ег1иш сагоъепиа и его белого мутанта, как и в случае с перекисью водорода, могут быть обусловлены содержанием ДНК, РНК и полисахаридов.

. . У* К вопросу о поли кзротиноидов в окислительных.

процессах нефотостнтезируюших микроорганизмов.

Изучали возможность участия каротиноидов МусоЪа«. саго I опит в о кис лиг ельно-восстановите лышх процессах.

Наши опыты показали (табл.6), что по интенсивности дыхания кароти ной дные формы - исходный штамм ыусоЬасъшйшо

. мутант

сиго^спшп И оранжевый существенно не отличаются от бес кароти но и дно го белого мутанта*

Таблица 6

' Интенсивность дшания ^усоЪие^Иш сягоЪопшп и его мутантов.

Культура

Поглощение 0?, мкл/г ояоиассы

в час

Выделение

ыкЗ/г биомассы в час

Процент ингибирова-ник кем" потребления

МусоЪасЪ.сагбЪелша 36,6 27,6

Оранжевый мутант 39 26,2

Белый мутант * 42,6 35,4

36

41,2

38,5'

Икгибирование дыхания циан истек калием (таОл.ё), являющимся, как известно, специфический ингибитором цитохромонси-даэы, показало, что ингвбироваяие дыхания цианидом у кароти-ноидных'форм (у исходного штамма и оранжевого мутанта), и у бескаротинопдкого белого мутанта было одинаковым, что вероятно! может быть доказательством того, что каротиноиды не способны подключаться в дыхательную цепь liycobacterlum corotenuri ■ на уровне цигохроноксядаэи. в случае способности каротияоядо<~ подключаться в дыхательную цель при ингибировании цитохрокок-сидазы, следовало бы, вероятно, ожидать более значительного ингибиювания дыхания у бескаротинеиднога мутанта.

Было проведено сравнительное определение количественно* -го содержания цвтохромов а , Ъ и с , обнаруженная: в Mef* "в* Мусоbacterium . caroteaua « его мутантов (табл. 7). Из таблицы видно »»ЧЮ содержание цигахромол а ,ъ .и с у мутантов оказалось более низким, чем у исходного штамма llycobactorium c.3rotemjm *

Таблица 7

Содержание автохромов в единицах оптической плотностей -10 на I мг сухой биомассы

~ " "кулйур! ~ " " т " т "

_ _ _ j . _ J*0 _ ] 605_ _

f.'yeobact. oarotenum 5,1

Оранжегый мутант 2,72

leлтыЙ мутант — 3,23

Белый мутант 4,8

5,78 3,06

■'1,67 / 1,105

2,72 0,884

■¿о ,

Можно было бы предположить, что шиенсиввости дыхания у исходного штамма и оранжевого мутанта оказались равными за счет большего содержания каротиновдов у оранжевого мутанта, т.е. в результате, способности карозиноидов подключаться в дыхательную цепь вместо цитохромов. Однако у бескаротиноидно-го мутанта при одинаковой дыхательной активности с исходный штаммом обнаружилось снижение содержания цитохромов £ и а*. Так чю на'осыовании сопоставления содержания каротиноидов, цитохроиов и активности дыхания у наших объектов нельзя сказать что-нибудь определенное об участии каротином до в в окис-литольиьж процессах в случае пониженного содержания некоторых цитохромов.

По гипотезе Саха (19ЭТ) каротиноиды участвуют в фермен-* тативных окислениях в виде органических перекисей. Молекулярный кислород в присутствии перокйидазы ирисоедикяется по месту двойной связи. Образующаяся органическая перекись, легко отдавал кислород, окисляет другие органические соединения.

В ниших опытах , проведенных ранее,не оило обнаружено корреляции ммду соло ржание и яаротшгокдов н активностью перо-ксидазы (табл.5).

Из таблицы видно, что хотя у исходного карстиноидного штамма ..у^оьасье^им саг^йотт активность нерокевдззы оказалась, действительно выше, чеы у желтого мутанта с меньшим содержанием карртикондом, однако у белого Оескаротиноид-ного мутанта пероисидазнап активность была выие^ем у содержащих каротинеиды исходного штамма и оранжевого иутакта.

Такое отсутствие связи между содержанием каротиноидов и активностью пероксидады дает возможность предположить, что

каротйнокды 1ряд ли принимает участие в окислительных процессах э виде органических* перекисей. ' .

JI, Сравнение ус^рйчиво^тд к р^эличныц ронцедтрацияи ИаС1 исходного дтамма Uyoobacteriwa ' carotonum ■ и его иутвятов - белого, желтого н оранжевого

У некоторых микроорганизмов обнаружена корреляция между солевой устойчивостью к наличием каротиноидов ( титег, Je eels » 1968).

Нами было предпринято исследование устойчивости к различным концентрадама^ог I до 7?) исходного втамма " МусobQCterlum earotemim .И мутантов - белого, жеятого и ОраЯ-хевого при юракивавии а течение двух суток на иясопепгонном бульоне в колбах на качалко (рвс.5)д_

На рисунке видно, что содержание в среде NaOl не влияло на рост исходного штамма f.íycobaetoilíem . earotenwü и его мутантов, a Had активировали рост %cot>act., caroteaum я белого мутанта приблизительно одинаково (более чем в 6 рае). -- 1

При содержании 5-7% HaCl рост исходного каротиноид-НОГО втамма Hycobaet в rium carotenua я белого мутанта ингибвроваяся поднос»»« ввгибированяв оранжевого и желтого мутантов (Шло менее значительным,

Таьим образом нами не обнаружено строгой корреляции между содержанием каротиноидов и устойчивостью к Kaci . Исходный каротиноиодный штамм , Mycobacterium carotenum обнаружил тахуа же слабув устойчивость к Waci , как и бес-каротиноидный белы! мугая*, а келтый Иутант, содержаний меньшее количество каротиноидов г оранжевый мутант, о увеличен-

м

/

X

/ /

и

У

I /

контроль К^СХ 2,5)6" 2ЬС1 ; Ка'Л 7% 1ГаС1

Ряс.5. Влияние 11аС1

5>ег® 2, Оргшже вый - мутант

3. Желтый мутант, ВелиЦ мутант.

ним но сравнению с исходным штаммом содержание)! ка рот и нов до в, обнаружили повышенную устойчивость к КаС1 , ,

. • в У' в о д и . .' ' .

' I, При воздействии на метанокисляящвй штамм МусоЪасс, скгоЬепшп н -метил- ц<-нитро- н иитровогуаяидином получено три устойчивые пигментные мутанта (белый, желтый и оранжевый), Установлено, что различия в окраске исходного штамма и мутантов определяются разным количественным содержанием каротиноидов в их клетках.

2. Установлено,, что в составе пигментов цусоЪае-ь. саго^шж * оранжевого и желтого мутантов преоблада-'

ют ксантофиллы» содержание которых составляет около 70% от общего содержания каротиноидол. Из эяифааных пигментов у них обнаружено присутствие -каротина. Пигментная система исходного штамма и мутантов оказалась не чувствительной к све-

*у.

3. Полученные пигментные мутанты существенно не отличались ОТ ИСХОДНОГО штамма КУСОЬасЬоглит сагоЬетшг ПО МОрфОлогическим, куяьтуральным и физиолого-биохимическим признакам, предложенным в определителе Красильникоза, а также ло скорости роста на глювозо-аспарагикСвоЙ Гуд вина, по активности усвоения метана и по интенсивности дыхания.

<и Проведено сравнительное изучение химического состава клеток (ДНК, РНК, белка, липвдов, полисахаридов) в клетках пусоьасъепит сагс^ешлв _ И его мутантов. Установлено, что богатые каротиковдами, исходный штамм и оранжевы Мутант ' содержат больше ДНК по сравнению с дефицитными по каротинои-дам желтым и белым^мутантами.

5, Мутанты" йе отличались от исходного штамма ^усо-ЬасЬеПит сахч^епим 'по количеству белка в клетках.

У белого мутанта наблюдалось уменьшение, по сравнению с исходным птаммом, количества полисахаридов на 31%, у оранжевого и желтого мутантов отмечено, напротив, некоторое-увеличение в содержании внутриклеточных полисахаридов (на 14% -у оранжевбго мутанта и на 9% - у йелоГо мутанта).

6. Общее количество suпидов оказалось больше у дефицитных по каротиномдам форм (у желтого и белого мутантов), чем

3 богатых, каротйноидами исходного штамма и оранжевого мутанта. Установлено, что увеличение общего количества липидов у них обусловлено, главный образом, увеличением в составе ж липидов фосфоляпидоз, а также стеринов.

7. Обнаружена повышенная устойчивость к действию H¿0¿ и оеона каротиноалного штамма rjycobacteriuia carotejiuai

по ораввенис с бескаротйноидкым мутантом, Установлено, что повышенная устойчивость к и озону исходного штамма, возможно , обусловлена не одним, а несколькими факторами - наличием харэтиноидов, более высоким содержанием нуклеиновых кислот (ДНК и PUK) в полисахаридов.

8. Предполагается, что каротиновды нефотооиитезирующего микроорганизма ÜycobacteriuJa Carotenum Не СПОСОбНЫ подключаться в дыхательную цепь на уровне цитохромоксидаэы* при икгибированви последней кем , а также подключаться в дыхательную цепь яри условии снижения содержания в клетках некоторых цигохромов, Предполагается га ¡аса, что наротиноиды вряд ли могут принимать участие в окислительных процессах в виде органических перекисей.

с пи с о к

работ, опубликованных по тема диссертации

1. Зобнина В.П., Астафьева Э.Н., 1Э70, Индуцирование .

Я-иетил- W китро- и - нитроэогуанидином пигментных мутаций у Иуаobacteriiun carotemnn . Микробиология, т, 39. вып. 6, стр. 1014.

2. Зобнина В.П., Морковина Э.А. 19?I. Влияние озона На выживаемость каротиноидного итамма Mycobacterium carotenuró и его белого нутанта, полученного под воздействием нитрозо-гуенидина, Микробиология, 40, вып. I, стр.93.

3. Зобнина В,П., Сахарова 3.В., Чояяк А.М., Ьороиекая A.A., Работном ИД. Исследование устойчивости "к K20g Мусо-

bectei-ium carotenun и его бескаротиноидного иутакта. Микробиология (в печати)^

Материалы доложены на п Республиканской конференции молодух ученых "Микроорганизмыпродуценты биологически активных веществ", Киев, апрель, 1974, г.

3.2I20p. Т.200 экз. "Знание";