Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Детоксикация тяжелых металлов (кадмия) на примере приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis

ВАК РФ 03.02.08, Экология (по отраслям)

Автореферат диссертации по теме "Детоксикация тяжелых металлов (кадмия) на примере приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis"

На правах рукописи

/I -¿¡еухГае* гй/'

ЖУКОВСКАЯ Авианна Фаязовна

ДЕТОКСИКАЦИЯ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ (ЬСАДМИЯ) НА ПРИМЕРЕ ПРИМОРСКОГО ГРЕБЕШКА М12иНОРЕСТЕЫ

ГЕББОЕЫБШ

03.02.08-Экология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

з і ші

Владивосток - 2012

005045244

Работа выполнена в лаборатории морской экотоксикологии в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанский океанологический институт им. В.И. Ильичева Дальневосточного отделения Российской академии наук

Научный руководитель доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Челомин Виктор Павлович

Официальные оппоненты: Санина Нина Михайловна

доктор биологических наук, профессор, профессор кафедры биохимии, микробиологии и биотехнологии Школы естественных наук ФГАОУ ВПО «Дальневосточный федеральный университет» (ДВФУ)

Подгурская Ольга Владимировна

кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории Физиологии.

ФГБУН Институт биологии моря им. A.B. Жирмунского (ИБМ ДВО РАН)

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки

Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина Российской академии наук

Защита состоится «15» июня 2012 г. в 13:00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.056.02 при ФГАОУ ВПО «Дальневосточный федеральный университет» по адресу: 690091, г. Владивосток, ул. Октябрьская, 27, ауд. 435

Отзывы на автореферат просим направлять по адресу: 690091, г. Владивосток,

ул. Октябрьская, 27, каб. 417, кафедра экологии ШЕН ДВФУ.

Факс (423) 245-94-09 E-mail: inarineecologv@ramb1er.ru. res-water@vandex.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ФГАОУ ВПО «Дальневосточный федеральный университет»

Автореферат разослан «15» мая 2012г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук """ Ю.А. Галышева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Антропогенное воздействие на водоемы сопровождается поступлением в водную среду токсикантов различного происхождения и разного химического состава. Среди них токсины, образующиеся в результате жизнедеятельности организмов, таких как, например, сине-зеленые водоросли; пестициды, поверхностно-активные вещества и многие другие, в том числе и тяжелые металлы (ТМ. При изучении их влияния на организм морских беспозвоночных весьма существенным является вопрос о том, какие звенья системы метаболизма в организме гидробионтов обуславливают их резистентность в условиях интоксикации.

Среди морских беспозвоночных приморский гребешок Mizuhopecten yessoensis способен извлекать и концентрировать в мягких тканях кадмий, без какого-либо видимого патологического эффекта, даже из чистых вод, в которых концентрации этого ТМ не превышают допустимого фона. Это уникальное свойство приморского гребешка свидетельствует о том, что двустворчатый моллюск М. yessoensis имеет хорошо развитые механизмы адаптации к высоким концентрациям кадмия в окружающей среде.

Существует общее мнение, что у организмов различного уровня организации в процессе эволюции сформировался механизм детоксикации ТМ, в основе которого лежит связывание и изоляция токсичных ионов металлов, препятствующее их взаимодействию с чувствительными биоструктурами клетки (Shelton et al., 1986; Fowler, 1992; Metían et al., 2008). При этом, основную роль в этом механизме осуществляют специальные белки (стресс-белки) — металлотионеины (МТ), которые были найдены во всех организмах, как в беспозвоночных, так и в позвоночных, включая млекопитающих (Klaverkamp, Duncan, 1987; Saito, 1995; Hansen et al., 1997; Vergani et al., 2005). Однако на сегодняшний день мало известно о механизмах устойчивости приморского гребешка М. yessoensis к кадмию, опосредованных кадмий-связыващими белками.

Цель работы: исследовать основные биохимические механизмы адаптации приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis к кадмию.

Задачи исследования:

1. Исследовать внутриклеточное распределение кадмия и идентифицировать Cd-связывающие белки в пищеварительной железе приморского гребешка М. yessoensis и некоторых видов двустворчатых моллюсков (Mytilus trossulus, Peromelia venulosa. Mercenaria síimpsoni).

2. Выявить влияние аккумуляции кадмия на изменение концентрации Cd-связывающих белков в клетках пищеварительной железы приморского гребешка М. yessoensis и сравнить с другими представителями двустворчатых моллюсков (М trossulus, Р. venulosa, М. stimpsoni).

3. Идентифицировать и охарактеризовать биохимические механизмы адаптации приморского гребешка М. yessoensis к кадмию.

4. Выявить особенности в механизмах адаптации к кадмию у годовалых и двухгодовалых особей приморского гребешка М. yessoensis.

Научная новизна работы: Впервые показано, что приморский гребешок М. yessoensis обладает уникальным механизмом адаптации к кадмию представленным двумя высокомолекулярными белками 72 и 43 кДа. Белок 72 кДа является гликопротеином. Впервые охарактеризованы биохимические механизмы адаптации неполовозрелых особей приморского гребешка к высоким концентрациям кадмия в окружающей среде. Впервые показана способность кадмий-связывающих белков приморского гребешка поглощать свободные радикалы.

Практическая значимость. Результаты исследования применимы для комплексного биологического мониторинга акваторий, т. е. оценки состояния биоты как результата антропогенного вмешательства. Результаты работы могут быть использованы

профессорско-преподавательским составом ВУЗов РФ в специализированных лекционных циклах, рассматривающих вопросы биохимической адаптации и биохимической токсикологии.

Положения, выносимые на защиту:

1. У приморского гребешка обнаружена высокоэффективная биохимическая система детоксикации тяжелых металлов, которая представлена комплексом кадмий-связывающих белков (72 и 43 кДа), центральное место среди которых принадлежит гликопротеину 72 кДа. Основной кадмий-связывающий белок 72 кДа является уникальным, не встречающимся в других представителях беспозвоночных. По характеристикам его можно отнести к МТ - подобным белкам.

2. На примере ранних возрастных групп показано, что неполовозрелые особи M.yessoensis обладают хорошо развитой системой адаптации к тяжелым металлам (кадмию). Адаптация неполовозрелых особей приморского гребешка достигается за счет связывания металлов с белком не только 72 кДа и с белком 43 кДа, но и с белком с молекулярной массой 120 кДа, который характерен только для данной возрастной группы.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии» (ТИБОХ ДВО РАН, Владивосток 2004г); 15-ом международном симпозиуме «Экология 2006» (Болгария 2006 г.); молодежных конференциях ТОЙ ДВО РАН (Владивосток, 2008, 2009 гг.); IX и X Дальневосточных школах по актуальным проблемам химии и биологии (ТИБОХ ДВО РАН, 2005, 2006 гг.); 2-ой научной конференции стран СНГ «Современные проблемы физиологии и биохимии водный организмов» (Республика Карелия, 2007 г.); международных научных конференциях «Физиомар 08» (Франция, Брест 2008г.), и на международной конференции «17th International Pectinid Workshop» (Испания, 2009 г), на семинарах лаборатории Морской экотоксикологии ТОЙ ДВО РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 22 работы, в том числе 6 статей, две из них в ведущих рецензируемых научных журналах, входящих в перечень ВАК. '

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 124 страницах, состоит из введения, 5 глав и выводов, содержит 29 рисунков, 4 таблицы и список литературы, включающий 176 наименований, из которых 153 на иностранном языке.

Личный вклад. Автор лично принимал участие в лабораторных и полевых работах, где занимался отбором проб. Также автором была выполнена основная часть подготовки проб для биохимического анализа. Результаты, изложенные в диссертации, получены лично автором, либо на равных правах с соавторами. Все расчеты и интерпретация данных выполнены лично автором.

Благодарности. Автор выражает огромную благодарность своему научному руководителю, д.б.н. В.П. Челомину за всестороннюю помощь в процессе работы над рукописью, искреннюю признательность всему коллективу лаборатории морской экотоксикологии, отдельная благодарность к.б.н. H.H. Бельчевой за неоценимый вклад в развитие и помощь в постановке методик. Отдельные слова благодарности автор приносит сотрудникам ИБМ ДВО РАН: сотруднику лаборатории физиологии, к.б.н. В.Я. Кавуну за сбор материала и помощь в сборе материала, сотруднику лаборатории фармакологии к.б.н. В.В. Кумейко за консультации и методическую помощь, также сотруднице лаборатории сравнительной цитологии И.Ю. Петровой за неоценимую помощь в подготовке проб.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ В главе представлен обзор токсикологических и биохимических аспектов аккумуляции кадмия. Дана краткая характеристика роли металлсвязывающих лигандов в механизме защиты организма против токсичности кадмия. Подробно освещены современные данные и обобщены полученные на сегодняшний день знания о МТ. Рассмотрены вопросы, касающиеся биохимии МТ, их классификация, эволюционные и функциональные аспекты. Особое внимание уделено экологическому состоянию Залива Петра Великого с точки зрения антропогенного загрязнения.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Основным объектом исследования послужил широко распространенный в зал. Петра Великого представитель класса двустворчатые моллюски (Bivalvia) вид -приморский гребешок Mizuhopecten yessoensis. Также в работе использованы широко распространенные в зал. Петра Великого массовые виды двустворчатых моллюсков {Mylilus trossulus, Peronidia venulosa, Mercenaria stimpsoní). Объекты исследований собраны водолазным способом как из экологически чистых акваторий, так и из мест испытывающих интенсивную антропогенную нагрузку.

Для проведения экспериментов по изучению видовых особенностей в адаптации к кадмию и исследования разнообразия Cd-связывающих белков в видах двустворчатых моллюсков животные были собраны в заливе Петра Великого из экологически чистых мест.

Для идентификации основного кадмий-связывающего компонента пищеварительной железы приморского гребешка особи данного вида были отобраны из акваторий с разной степенью загрязнения и, как следствие, разной степени нагрузки кадмием: из загрязненной акватории Амурского залива (Японское море) г. Владивостока вблизи нефтебазы (район первая речка), и из экологически чистой акватории залива Посьета Японского моря.

Для экспериментов по [пучению возрастных особенностей системы адаптации к кадмию у приморского гребешка годовалые и двухгодовалые особи М. yessoensis были отобраны из экологически чистой акватории бухты Северная (Славянский Залив). Перед каждой серией опытов моллюски адаптировались в проточных аэрируемых аквариумах в течение 5-7 дней. После адаптации моллюски подвергались обработке CdCU (100-300 мкг/л) в течение недели с ежедневной сменой воды. Из всех экспериментальных групп отбирали по 5 особей моллюсков.

Для биохимических анализов была использована пищеварительная железа. Выделение и очистка кадмий-связывающего белка проводили согласно методике разработанной и хорошо зарекомендовавшей себя для выделения МТ и МТ-подобных белков из морских беспозвоночных (Roesijadi et. al., 1989; Tompson and Sutherland, 1992). Cd-связывающие белки, после очистки методом высокоскоростной проточной жидкостной хроматографии (FPLC-fast protein liquid chromatography) на колонке Superosa 12, подвергали ионно-обменной хроматографии (Mono Q 10/10) и денатурирующему электрофоретическому разделению по модифицированному методу Лэммли (Laemmli, 1970) в SDS-полиакриламидном геле. Для определения концентрации белка использовали метод Лоури (Lowry et al., 1951). Для определения содержания GSH использовали модифицированный метод Элмана (Moron et al., 1979). Для определения качественного состава углеводов использовали метод газожидкостной хроматографии. Количественное содержание углеводов определяли фенол-серным методом. (Dubois et al., 1956). Аминокислотный состав белков определяли на аминокислотном анализаторе.

Содержание металлов в гомогенатах и отдельных белковых фракциях анализировали атомно-абсорбционной спектроскопией (Никаноров и др., 1985; Julshamn, Andersen, 1983). Оценка общей антирадикальной (АО) активности проводилась по способности образца ингибировать (восстанавливать) радикал-катион ABTS+ (Re Roberta et al., 1999). Значения антиоксидантной активности исследуемых образцов выражали как миллимолярную концентрацию тролокса на мг белка. Определение активности ферментов каталазы (ЕС 1.11.1.6) и rSH-редуктазы (ЕС 1.6.4.2) проводили согласно стандартным методикам (Regoli et al., 1995). Определения активности фермента супероксиддисмутазы (ЕС 1.15.1.1) проводили согласно стандартному методу (Paoletti, Aldinucci, 1986)'

ГЛАВА 3. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ Cd-СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ Результаты экспериментов по количественному определению Cd-связывающих белков не выявили в моллюсках P. venulosa и М. stimpsoni, не подвергавшихся воздействию кадмия, металл-связывающих белков (рис. 1). Этот факт дает основание полагать, что в нормальном состоянии эти белки либо отсутствуют, либо их уровень чрезвычайно низок. В то же время, у контрольных моллюсков М. yessoensis и у М. trossulus присутствие металл-связывающих белков достоверно регистрируется. После пребывания экспериментальных моллюсков (100 мкг Cd/л), уровень Cd-связывающих белков (Cd-CB) у приморского гребешка в клетках пищеварительной железы увеличивается более чем в 3 раза, а у мидии тихоокеанской - в 7 раз. При этом белки, связывающие кадмий, обнаружены у P. venulosa, но не зарегистрированы в М. stimpsoni. Подобные результаты свидетельствуют о том, что у трех исследованных моллюсков (приморского гребешка, мидии и перонидии) в ответ на аккумуляцию кадмия индуцируется синтез металл-связывающих белков.

Рис. 1. Содержание Cd-связывающих белков в

-12-

н 2

-- т □ Контрольные пищеварительной железе двустворчатых моллюсков

-- Ш Экспериментальные

-ч__ Ч

М. yessoensis М. trossulus Р. venulosa М. stimpsoni

В результате эксперимента обнаружено, что в цитоплазматических белках пищеварительной железы моллюска М. ужзоепз/'я в распределении кадмия проявляются два ярко выраженных пика: в области высокомолекулярных белков (ВМБ) и в области белков с низкой молекулярной массой (НМБ). При этом важно отметить, что данные пики совпадают с максимумами содержания ЭН групп в белках. Из этого следует, что Cd концентрируется во фракциях белков, относительно обогащенных сульфгидрильными группами. Сопоставление с маркерами показало, что основной Cd-cвязывaющий ВМБ имеет молекулярную массу порядка 60 кДа, а второй минорный пик - менее 3 кДа. Введение в гомогенат и элюирующий буфер восстанавливающего агента - дитиотриэтола (ДТТ) не оказало влияния на количественное распределение и хроматографическое поведение данных Cd-CБ. Из этого следует, что белок с молекулярной массой 60 кДа не является продуктом окислительной полимеризации низкомолекулярного белка.

При разделении цитоплазматических белков у М. 1го$$и1и$ выделяются три пика локализации связанного кадмия. Первый пик, содержащий небольшое количество С<1, элюируется из хроматографической колонки со свободным объемом, что позволяет нам отнести его к категории ВМБ с массой > 70 кДа. Второй пик, связывающий основное количество цитоплазматического кадмия, выходит из колонки с белками, имеющими молекулярный вес около 22 кДа. В области низкомолекулярных компонентов небольшой пик связанного кадмия сосредоточен во фракции белков с молекулярной массой менее 3 кДа. Введение в элюирующий буфер ДТТ оказывало влияние только на содержание кадмия в ВМБ. Учитывая это обстоятельство, можно предположить, что в этой фракции присутствует белок, образовавшийся в результате полимеризации Сс1-связывающего белка 22 кДа. В отличие от ВМБ и НМБ, белковый пик 22 кДа выражен только в режиме регистрации при 254 нм, появляется у мидий в процессе аккумуляции кадмия и не выявляется в клетках пищеварительной железы у контрольных моллюсков. Таким образом, белок 22 кДа, по-видимому, выполняет основную роль в связывании кадмия у мидии тихоокеанской.

У дальневосточного представителя семейства теллинид Р. \enulosa металлсвязывающий белок обнаруживается только в ответ на поступление в организм кадмия. Для этого моллюска характерно присутствие в цитоплазматической фракции пищеварительной железы двух белковых зон, в которых локализуется кадмий. Первый пик, расположенный в зоне ВМБ, соответствует белкам с молекулярным весом порядка 70 кДа. Второй пик кадмия приходится на белки, имеющие диапазон молекулярных масс от 7 до 10 кДа.

В распределении кадмия среди цитоплазматических белков у М. ¡Итрзош выявлены две зоны, в которых локализован клеточный кадмий. Первая - минорная, расположенная во фракции ВМБ, элюируется, как и у предыдущих моллюсков, со свободным объемом и соответствует белкам с молекулярной массой около 70 кДа. Другая зона, в которой сосредоточен, практически, весь цитоплазматический Сс1, локализована в области компонентов с молекулярным весом не более 3 кДа. В отличие от ВМБ, этот Сс1-связывающий низкомолекулярный компонент обогащен БН группами и имеет очень низкое поглощение при 280 нм. Таким образом, в отличие от гребешка, мидии и перонидии у мерценарии основным Сс1-связывающим компонентом пищеварительной железы является низкомолекулярный тиол, предположительно глутатион (ГБН).

ГЛАВА 4. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА ДВУХ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ КАДМИЙ-СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ ПРИМОРСКОГО ГРЕБЕШКА МНиНОРЕСТЕЫ Г£550£Л«/5

Результаты показали, что 70% всего аккумулированного пищеварительной железой кадмия содержится в цитоплазматической фракции (фракция А), при этом, на долю этой же фракции приходится более 90% всего белка. После многоэтапного фракционирования (температурное осаждение, осаждение органическим растворителем), доля кадмия во фракции Б (фракция, полученная после 80% ацетонного осаждения) составляет более 50%, а доля белка составляет от 15 до 20% от всего белка, находящегося в цитоплазме клетки.

Фракцию О, ресуспендированную в 0.02 М Тп5-НС1 буфере рН 8.5, разделили методом БРЬС. Получено два кадмий-содержащих пика (Рис. 2), соответствующих высокомолекулярным белкам. Основная часть кадмия локализуется в первом и втором элюированном пике (пик 1 и пик 2) у гребешков из экологически чистой акватории, тогда как у животных из района нефтебазы кадмий локализуется в пике 1 (Табл. 1).

Рис. 2. Хроматографический профиль фракции О пищеварительной железы приморского гребешка М. уе$5оет1з из акваторий с различным содержанием кадмия в среде

залив Посьета (фоновый район) район Первая речка (загрязненный район)

Таблица 1. Сравнение распределения кадмия (мкг) в фракциях 80% ацетонного осадка элюированных _БРЬС в приморском гребешке М уезаоетай_

НАЗВАНИЕ ПРОБЫ Сё, мкг Zn, ми- Си, мкг

Фоновый район Загрязненный район Фоновый район Загрязненный район Фоновый район Загрязненный район

Пик 1 0.11±0.05 3.4±0.21 0.18±0.012 0.2±0.01 0.05±0.0027 0.1±0.089

Пик 2 0.11±0.03 0.32±0.021 0.13±0.014 0.03±0.0013 0.04±0.0015 0.03±0.002

Пик 3 0.01±0.002 0.1±0.01 - 0.07±0.0036 - 0.02±0.0013

Согласно полученным результатам белок, соответствующий пику 1 является основным кадмий-связывающим белком, и способен связывать кадмий в экологически неблагоприятном районе до 30 раз больше, чем в экологически чистой акватории. Белок, соответствующий пику 2, также связывает кадмий, но в меньшем количестве (0.32 мкг) и способен аккумулировать кадмий в значительно меньшей степени. Пик 3 не рассматривался как основной кадмий-связывающий белок, из-за незначительного сродства к кадмию (0.01 мкг). Однако исследование содержания кадмия в пике 3 в гребешках из загрязненной акватории показало, что количество кадмия в пике 3 увеличилось в 10 раз, что значительно выше, чем в пике 2 (в 3 раза). Из чего можно сделать предположение, что существует пул низкомолекулярных компонентов в области 10 кДа, которые, возможно, являются кадмий-связываюишми лигандами, принимающими участие в связывании кадмия при возникновении стрессовой ситуации в окружающей среде, когда концентрации кадмия в морской воде превышают допустимые нормы.

Анализ содержания микроэлементов показал, что кроме кадмия, в полученных белках содержатся и такие физиологически важные металлы, как Си и Ъп. Соотношение Сс1:гп:Си в пике 1 и пике 2, а, следовательно, можно предполагать и в кадмий-связывающих белках, составляет 2:3.5:1 и 3:3:1 для гребешков из зал. Посьет. Для гребешков из района нефтебазы это же соотношение в пике 1 составляет 34:2:1, а в пике 2 соотношение С(±гп:Си составляет 5:3.5:1.

Соотношение адсорбции в кадмий-содержащих белках при X 254 и X 280 нм составляет около 2, что существенно ниже, чем это же соотношения для классических МТ.

В дальнейшем, идентифицированные гель-хроматографией кадмий-связывающие белки были разделены ионообменной-хроматографией (Рис. 3). Идентифицированы два белка, которые и являются ранее полученными белками гель-хроматографией. Таким образом, после многоэтапного фракционирования (температурная обработка, осаждение органическим растворителем) получена достаточно чистая фракция, содержащая два кадмий-связывающих белка. Дальнейшую идентификацию белков проводили БОБ-электрофорезом в полиакриламидном геле. Было получено две полосы, которые соответствуют полипептидам с массой 72 и 43 кДа (Рис. 4). Для анализа на аминокислотный состав взяли белок соответствующий пику 1. Результаты показали, что в составе молекулы обнаружены ароматические аминокислоты, такие как тирозин (1-57), фенилаланин (3.91), основные аминокислоты гистидин (0.87), аргинин (3.69). Интересным является тот факт, что в составе молекулы обнаружен цистеин (4.72), однако основными аминокислотами являются глутаминовая и аспарагиновая кислоты.

кВа

68 43

1 2

Рис. 3. Ионно-обменная хроматография основных Рис. 4. Молекулярная масса С<1-

кадмий-связывающих белков приморского гребешка связывающих белков приморского

М. уеззоепзк гребешка № уеззоепзя. 1-стандарты,

2- проба 10 мкл, 3-проба 20 мкл

В кадмий-связывающем белке были обнаружены углеводы, на долю которых приходится до 35-40 % общей массы, что свидетельствует о том, что исследуемая молекула - гликопротеин. Качественный анализ углеводного состава Сс1-связывающего белка позволил выявить в молекуле следующие моносахара: манноза, глюкоза, фукоза и ксилоза в сравнимых количествах и в меньшей степени рамноза и арабиноза, а также аминопроизводные моносахаров глюкозамин и галактозамин, и частично метилированные гексозамины.

ГЛАВА 5. БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАЗНОВОЗРАСТНЫХ ГРУПП ПРИМОРСКОГО ГРЕБЕШКА МаиНОРЕСТЕЫ УЕЗБОЕМБН В АДАПТАЦИИ К

КАДМИЮ

В пищеварительной железе у контрольной группы годовалых особей приморского гребешка 80% всего аккумулированного кадмия содержится в цитоплазматической

фракции (фракция А), при этом на 1 мг белка приходится около 0.03 мкг кадмия. После многоэтапного фракционирования (температурное осаждение, осаждение органическим растворителем), доля цитоплазматического кадмия во фракции (фракция О), полученной после 80%-ного ацетонного осаждения составляет 8%. Также показано, что на 1 мг белка приходится до 0.5 мкг кадмия. У особей, находящихся в условиях повышенного содержания кадмия в среде в цитоплазматической фракции пищеварительной железы содержится только 50% аккумулированного кадмия. При этом на 1 мг белка приходится около 0.3 мкг кадмия. На долю 80%-ного ацетонного осадка приходится до 50% всего кадмия, содержащегося в цитоплазме, что составляет 15 мкг кадмия на 1 мг белка.

Анализ содержания микроэлементов показал, что кроме кадмия пищеварительная железа годовалых особей содержит и такие физиологически важные металлы, как Си и гп. При этом на долю термостабильных, устойчивых к органическим растворителям белков приходится значительная доля цинка. Соотношение Сс1:2п:Си фракции Б составляет 1:3:1. Эксперимент по аккумуляции кадмия показал изменение в соотношении кадмия, цинка и меди (14:4:1), по сравнению с контролем (Рис. 5). Однако необходимо отметить, что у гребешков после инкубации с кадмием, количество цинка в исследуемых белках фракции О также увеличивается, что, по-видимому, связано с интенсивной индукцией пула белков в ответ на повышенное содержание кадмия в окружающей среде.

мкгШмг мм-Шмг

белка белка

:И щ Ж

о.г 4

\ ■;:;;;'

0,03 1 г~¥- г1- цоз г*"

□ фракция А Ш фракция О

14,5

4,4 1

Г 09 Тйа

□ фракция А ЕШ фракций

Рис. 5. Субклеточное распределение Сс1, Ъа Си в пищеварительной железе контрольной (А) и экспериментальной (В) групп годовалых особей приморского гребешка М. уеыоети

Во фракции Э идентифицированы три кадмий-содержащих пика, соответствующих белкам с высоким молекулярным весом в области 120 кДа, 72 кДа и 43 кДа. Найдено, что все три идентифицированных белка связывают кадмий, как в контрольной, так и в экспериментальной группах исследуемых моллюсков (Рис. 6). Получено, что в естественных условиях в годовалых особях М. уе^оегай кадмий связывается главным образом с белком 43 кДа (9 мкг). Однако в особях, подвергнутых обработке кадмием, происходит перераспределение токсичного кадмия с белка 43 кДа (0.6 мкг) на белок 120 кДа (6 мкг). Интересно, что белок с молекулярным весом 72 кДа не менял своего сродства к кадмию вне зависимости от условий эксперимента.

Изучение АО свойств показало значительное различие в значениях как между кадмий-связывающими белками в контрольных моллюсках, так и при сравнении контрольной группы с экспериментальной группой гребешков (Рис. 7). В естественной среде обитания кадмий-связывающие белки связывают аккумулированный кадмий и имеют следующие показатели АО: для белка 120 кДа - 86 ммоль Тролокса/мг белка, для белка 72 кДа - 114 ммоль Тролокса/мг белка и для белка 43 кДа - 109 ммоль Тролокса/мг

белка. В экспериментальных условиях для этих же белков значения АО изменились (Рис. 7 В): для белка 120 кДа - 50 ммоль Тролокса/мг белка, для белка 72 кДа - 124 ммоль Тролокса/мг белка и для белка 43 кДа - 72 ммоль Тролокса/мг белка. Наибольшей АО активностью в пищеварительной железе приморского гребешка обладает кадмий-связывающий белок 72 кДа как при фоновом, так и при высоком содержании кадмия в среде. Интересно, что в условиях нагрузки кадмием этот белок не принимает участия в аккумуляции этого металла, и доля связанного кадмия с белком сравнима с контролем. Получено так же, что после инкубации с кадмием кадмий-связывающие белки, принимающие основное участие в связывании кадмия (120 кДа и 43 кДа) имеют более низкие значение АО активности по сравнению с контролем. Отмечено, что кадмий-связывающий белок 120 кДа обладает более низкими показателем АО активности в обоих условиях эксперимента.

СМ, М1

Рис. 6. Распределение кадмия среди кадмий-связывающих белков пищеварительной железы годовалых особей приморского гребешка М. уеззоепз15

□ контроль

□ ЭКЕПфИГ*еНГ

А В

Рис. 7. Соотношение между содержанием кадмия и антиоксидантной активностью в кадмий-связывающих белках пищеварительной железы годовалых особей приморского гребешка М. уезюеши, А - контрольная группа, В - после обработки кадмием (СсЮг, 300 мкг/л)

Таким образом, впервые исследована способность годовалых особей приморского гребешка М. уемое/и/.? к аккумуляции кадмия в природных популяциях и лабораторных

условиях. Результаты данного исследования продемонстрировали, что годовалые особи приморского гребешка М. уевьоетгв способны накапливать в пищеварительной железе кадмий вне зависимости от условий эксперимента. Кроме того, в данном исследовании идентифицированы три высокомолекулярных термостабильных устойчивых к органическим растворителям белковых компонента в пищеварительной железе, участвующих в связывании кадмия (120 кДа, 72 кДа и 43 кДа).

Исследование механизмов адаптации у двухгодовалых особей приморского гребешка показало отличие в распределении и накоплении кадмия среди цитоплазматических белков от результатов, полученных для годовалых гребешков того же вида. Обнаружено, что в пищеварительной железе контрольной группы приморского гребешка около 30% кадмия содержится в цитоплазматической фракции, при этом на 1 мг белка приходится 0.07 мкг кадмия. Доля цитоплазматического кадмия во фракции О составляет около 5%, на 1 мг белка приходится 0,02 мкг С<1 У особей, находящихся в условиях повышенного содержания кадмия в среде в цитоплазматической фракции пищеварительной железы содержится около 70% кадмия, что свидетельствует о роли цитоплазматических белков в аккумуляции кадмия в ткани пищеварительной железы у приморского гребешка. При этом на 1 мг белка приходится 0.5 мкг кадмия, что соответствует годовалым гребешкам (0.3 мкг Сд на 1 мг белка). На долю 80% ацетонного осадка приходится только 6% всего кадмия, содержащегося в цитоплазме, что составляет 0.15 мкг кадмия на 1 мг белка.

Кроме кадмия, пищеварительная железа двухлетних особей М. уеьзоепя^я содержит Си и Соотношение Сс1:гп:Си во цитоплазме составляет 2:2:1. На долю

термостабильных, устойчивых к органическим растворителям белков приходится значительная доля кадмия и соотношение Сс1:2п:Си составляет 4:1:1. Эксперимент по аккумуляции кадмия показал изменение в соотношении металлов. Так в цитоплазме соотношение Сс1:гп:Си составляет 7:3:1, а во фракции 37:1:1 (Рис. 8).

мкгМУмг мкгМэ'мг

(Хта

□ фракция А Ш ({равцняО

Д15 і

т т

0.034 0,034

О фзашия А ШфякцияО

А В

Рис. 8. Субклеточное распределение Сс1, Zn, Си в пищеварительной железе контрольной (А) и экспериментальной (В) групп двулетних особей приморского гребешка М. уезяоеюгз

Дальнейшее исследование показало, что фракция Б, двух исследуемых групп гребешков содержит три кадмий-связывающих пика, соответствующих белкам с высоким молекулярным весом в области 120 кДа, 72 кДа и 43 кДа, что соответствует результатам подобного эксперимента у годовалых особей М. уеззоепзія. Найдено, что не все три идентифицированных белка связывают токсичный кадмий. В контрольной и в экспериментальной группах исследуемых двухгодовалых моллюсков основную роль в

связывании кадмия принимает белок 72 кДа. Белок 120 кДа не участвует в связывании кадмия ни в одной из исследуемых групп. Незначительная часть кадмия связывается с белком 43 кДа в экспериментальной группе животных (Рис. 9). Таким образом, роль белков 120 кДа и 43 кДа теряется, начиная с двухлетнего возраста, т.е. вероятнее, что с наступлением половозрелое™ у данного вида функция связывания кадмия у белка 120 кДа исчезает совсем уже с двухлетнего возраста. Тогда как к 5-7 летнему возрасту, функция связывания кадмия у белка с молекулярной массой 43 кДа элиминируется и белок принимает незначительную роль в связывании кадмия.

асе- '

Рис. 9. Распределение кадмия (мкг) среди кадмий-связывающих белков пищеварительной железы двухгодовалых особей приморского гребешка М. уехьоетя

Изучение АО свойств кадмий-□ контрогъ связывающих белков двухгодовалых и эксперимент гребешков показало, что в среде с фоновым содержанием кадмия только два из трех обнаруженных белков, обладают антирадикальной

активностью и имеют следующие

120 кОа 72МЭа 43Юа Значения: ДЛЯ бвЛКЭ 72 кДа - И4

ммоль Тролокса/мг белка и для белка 43 кДа - 109 ммоль Тролокса/мг белка. В экспериментальных условиях у белка 120 кДа значение антирадикальной активности резко поднимается до 59 ммоль Тролокса/мг белка. Значение АО активности для белка 43 кДа понижается с 114 до 53 ммоль Тролокса/мг белка (Рис. 10). Наибольшей АО активностью в пищеварительной железе двухгодовалых особей обладает кадмий-связывающий белок 43 кДа, но основным белком, связывающим кадмий, является белок 72 кДа. Белок 72 кДа обладает АО активностью вне зависимости от уровня кадмия в окружающей среде, т.е. в отличие от годовалых особей приморского гребешка в условиях нагрузки кадмием этот белок не принимает участия в АО защите клетки. Белок 120 кДа нельзя считать кадмий-связывающим для двухгодовалых особей, однако необходимо учитывать его роль в АО защите клетки.

0,56

120 кйа 72 кОа 43 кРа

ед. Тролокса на мг белка 120 09 100

□ Ой

80

• АО 20 активность

С6, мкг 7 6 5 4 3 2 1 0

ед. Тролокса на мг белка

6 А 11Л

1

в 50

1

1£ Ш И

140

120

I

100 ,80 60 40 20 < 0

• АО

активность

120 кОа 72 кОа 43 кРа

А В

Рис. 10. Соотношение между содержанием кадмия и антиоксидантной активностью в кадмий-связывающих белках пищеварительной железы двухгодовалых особей приморского гребешка М. уе53оею!$, А - контрольная группа, В - после обработки кадмием (СйСЬ.ЗОО мкг/л)

ВЫВОДЫ

1. Найдено, что среди исследованных видов двустворчатых моллюсков наиболее высокое сродство к кадмию присуще Cd-связывающим белкам пищеварительной железы приморского гребешка Mizidiopecten yessoensis. Mytilus trossulus и Peronidia venulosa способны аккумулировать кадмий за счет белков МТ-типа. Mercenaria síimpsoni не аккумулирует кадмий и Cd-связывающие белки в пищеварительной железе не выявлены.

2. Распределение кадмия среди термостабильных цитоплазматических белков в приморском гребешке М. yessoensis показывает, что этот металл связывается с высокомолекулярными белками (72 и 43 кДа). Основным Cd-связывающим белком является гликопротеин с молекулярной массой 72 кДа, который по своим биохимическим характеристикам существенно отличается от металлотионеинов и известных металлотионеин - подобных белков.

3. Установлено, что Cd-связывающие белки пищеварительной железы приморского гребешка М. yessoensis вне зависимости от возраста связывают и физиологически важные металлы Zn и Си. При этом в особях приморского гребешка из экологически чистой акватории основной металл, связанный с исследуемыми белками -цинк. При повышенном содержании кадмия в окружающей среде происходит перераспределение металлов в кадмий-связывающих белках. Основным связанным металлом становится кадмий.

4. Обнаружено, что Cd-связывающие белки пищеварительной железы приморского гребешка М. yessoensis способны поглощать кислородные радикалы, а, следовательно, являются одним из компонентов антиоксидантной защиты в приморском гребешке.

5. Показано, что в неполовозрелых особях приморского гребешка М. yessoensis присутствуют три высокомолекулярных белка, участвующих в связывании кадмия (120 кДа, 72 кДа и 43 кДа). Белок 120 кДа характерен только для данной возрастной группы. Однако функция связывания кадмия элиминируется уже у двухгодовалых особей как в условиях повышенной нагрузки кадмием, так и в благоприятных условиях обитания вида.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах

1. Жуковская А.Ф.. Бельчева H.H., Челомин В.П. Идентификация и частичная характеристика двух высокомолекулярных кадмий-связывающих белков приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis // Вестник МГОУ, 2011. Серия «Естественные науки». №3. С. 36-42.

2. Nina N. Belcheva, Maxim V. Zakhartsev, Nadezhda V. Dovzhenko, Avianna F. Zhukovskava. Victor Ya. Kavun, Victor P. Chelomin. Anthropogenic Pollution Stimulates Oxidative Stress in Soft Tissues of Mussel Crenomytiliis grayanus (Dunkerl853) // Ocean Sei. J. 2011. Vol.46. №2. P. 85-94.

Статьи, опубликованные в других периодических изданиях и монографиях

3. Слободенюк А.Ф. (Жуковская А.ФУ. Бельчева H. Н., Челомин В.П. Сравнительное исследование Cd-связывающих белков некоторых видов двустворчатых моллюсков. «Scientific articles. Ecology 2006». Science Invest Burgas, Bulgaria. 2006. P. 19-28.

4. Avianna F. Slobodenvuk. Nina N. Belcheva, V.P. Chelomin. Comparative study of Cd-binding proteins of different species of BIVALVES. Интернет журнал Electronic Journal "International Research Publication", Bulgaria. 2006.

5. H.H. Бельчева, А.Ф. Жуковская. В.П. Челомин. Биохимические маркеры в оценке загрязнения залива Петра Великого. II. Ферменты биотрансформации как индикаторы загрязнения органическими ксенобиотиками. Современное состояние и тенденции

изменения природной среды залива Петра Великого Японского моря / Отв. ред. д.г.-м.н А С Астахов, к.г.н. В.Б. Лобанов, М.: ГЕОС, 2008. С. 156 - 176.

6. H.H. Бельчева, Н.В. Довженко, В.Я. Кавун, А.Ф. Жуковская. А.Ф. Силиня, В.П. Челомин. Биохимические маркеры в оценке загрязнения залива Петра Великого. I. Влияние тяжелых металлов на процессы окислительного стресса. Современное состояние и тенденции изменения природной среды залива Петра Великого Японского моря / Отв. ред. дг-мн АС Астахов, к.г.н. В.Б. Лобанов, М.: Геос. 2008. С. 139-157.

А.Ф. Жуковская. В.П. Челомин. Особенности механизма адаптации годовалых особей приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis к кадмию / Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов. Том 1. Экологическая физиология и биохимия водных организмов. 2010. Сборник научных статей. Петрозаводск: Карельский научный центр РАН. С. 49-55.

Работы, опубликованные в материалах региональных, всероссийских и международных

конференций

8- А.Ф. Слободенюк (Жуковская Л.Ф.У Н. Н. Бельчева. Биохимическая характеристика основного кадмий-связывающего белка пищеварительной железы приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis II Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии. Тезисы докладов научной конференции, посвященной 40-летию Тихоокеанского института биоорганической химии. Владивосток' ДВО РАН, 2004. С. 63.

9 А.Ф. Слободенюк (Жуковская А.Ф.). H.H. Бельчева. Идентификация и выяснение некоторых свойств кадмий-связывающего компонента из пищеварительной железы приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis И VII Региональная конференция по актуальным проблемам экологии, морской биологии и биотехнологии студентов, аспирантов, молодых преподавателей и сотрудников вузов и научных организаций Дальнего востока России. Тезисы докладов. Владивосток: Изд-во Дальневосточного Государственного Университета, 2004.

10- А.Ф. Слободенюк (Жуковская А.ФЛ В.П. Челомин, С В. Томшич, H.H. Бельчева. Углеводный и аминокислотный состав нового Cd-связывающего гликопротеида из пищеварительной железы приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis II IX Дальневосточная школа по актуальным проблемам химии и биологии. 2005.

11. Довженко Н.В., Бельчева H.H., Челомин В.П., Столетняя, Слободенюк А.Ф. (Жуковская—А.Ф), А.В Пономарев О.В Возрастная изменчивость компонентов антиоксидантной системы приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis II Современные проблемы водной токсикологии. Тезисы докладов международной конференции. Борок, 2005

J2- А. Ф. Слободенюк (Жуковская А.Ф.). В.П. Челомин, Н.Н Бельчева, В В. Кумейко. Особенности внутриклеточного распределения кадмия в клетках пищеварительной железы приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis // X Международная молодежная Школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии. МЭС ТИБОХ, Владивосток 2006.

13- А. Ф. Слободенюк (Жуковская А.Ф.1. В.П. Челомин, H.H. Бельчева. Участие высокомолекулярных металлсвязывающих белков в аккумуляции кадмия в пищеварительной железе приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis II Океанологические исследования. Тезисы докладов конференции молодых ученых океанологического института им. В.И. Ильичева ДВО РАН. Владивосток: ТОЙ ДВО РАН, 2007. С. 126.

14. Слободенюк А.Ф. (Жуковская А.Ф.).. Челомин В.П., Бельчева Н.Н, Кумейко В В. Исследование механизмов аккумуляции и детоксикации кадмия у приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis (Bivalvia) II Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов. Материалы 2-ой научной конференции с участием стран СНГ. Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2007. С. 143-144.

15. Жуковская А.Ф.. Челомин В.П., Бельчева Н.Н. Механизмы адаптации приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis к кадмию II Океанологические исследования. Тез. III конф. молодых ученых ТОЙ ДВО РАН: Владивосток: ТОЙ ДВО РАН, 2008. С. 79.

16. Avianna F. Zhukovskava. Viktor P. Chelomin, Nina N. Belcheva. Adaptation biochemical mechanisms to cadmium in the far eastern scallop Mizuhopecten yessoensis И Physiomar 08: abstr. Brest, France. 2008. P 86.

17. Avianna F. Zhukovskava. Nina N. Belcheva, Viktor P. Chelomin. The role of high molecular weight proteins in response to cadmium in the scallop // Beyond observations to achieving understanding and forecasting North Pacific: Forward to the FUTURE: abstr. PICES 17th Annual Meeting. Dalian. 2008. P. 27.

18. Довженко H.B., Бельчева H.H., Жуковская А.Ф. Возрастные изменения биохимических показателей в тканях жабр и пищеварительной железы приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis И Инновации в науке и образовании. Мат. VI Межд. Науч. Конф. Калининград, 2008. С. 125-127.

19. А.Ф. Жуковская. Н.Н. Бельчева, В.П. Челомин. Исследование механизма адаптации к кадмию у разновозрастных групп приморского гребешка // Океанологические исследования. Тез. IV конф. молодых ученых ТОЙ ДВО РАН. Владивосток: ТОЙ ДВО РАН, 2009. С. 79.

20. Avianna F. Zhukovskaya, Nina N. Belcheva, Viktor P. Chelomin. Cadmium accumulation and Cd-binding proteins in the scallop Mizuhopecten yessoensis II 17th International Pectinid Workshop: abstr. Spain 2009. P. 76-77.

21. А.Ф. Жуковская. Н.Н. Бельчева, E.E. Солодова, В.П. Челомин. Особенности механизма адаптации годовалых особей приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis к кадмию // Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов. 3-я Международная конференция. Петрозаводск, 2010. С. 59.

22. А.Ф. Жуковская. Н.Н. Бельчева, В.П. Челомин. Биохимические особенности разновозрастных групп приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis к адаптации к кадмию // Современные проблемы гидроэкологии. IV Международная научная конференция, посвященная памяти профессора Г.Г. Винберга. Санкт-Петербург, 2010. С. 66.

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Специальность: 03.02.08 - экология

Подписано к печати 05.04.2012 г. Формат 60x84/16 Объем 1,0 уч.-изд.-л. Тираж 100 экз. Заказ №. 106

Отпечатано с авторского оригинал-макета в ТОЙ ДВО РАН 690041, г. Владивосток, ул. Балтийская, 43

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Жуковская, Авианна Фаязовна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Кадмий. Токсикология и биохимические аспекты аккумуляции кадмия.

1. 2. Роль металлсвязывающих лигандов в механизме защиты организма против токсичности кадмия.

1.3. Биохимия металлотионеинов. Определение, классификация. Функциональные аспекты. Эволюция МТ.

1. 4. Экологическое состояние залива Петра Великого.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Район работ.

2.2. Характеристика объекта исследования.

2.3. Описание эксперимента.

2.4. Биохимические методы исследования.

2.4.1. Выделение и очистка кадмий-связывающего белка (Roesijadi et al.,

1989; Tompson and Sutherland 1992).

2.4.2. Определение молекулярной массы SDS-электрофорезом.

2.4.3. Определение белка.

2.4.6. Определение аминокислотного состава.

2.4.7. Определение металлов.

2.4.8. Определение общей антирадикальной активности.

2.4.9. Определение каталазной активности (ЕС 1.11.1.6).

2.4.10. Определение глутатионредуктазной активности (ЕС 1.6.4.2).

2.4.11. Определение супероксиддисмутазной активности (ЕС 1.15.1.1).

ГЛАВА 3. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ Cd-СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЖОВ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ.

3.1. Cd-связывающие белки пищеварительной железы двустворчатых моллюсков.

3.2. Распределение Cd в цитоплазматических белках.

3.2.1. Приморский гребешок (Mizuhopecten yessoensis).

3.2.2. Мидия тихоокеанская (Mytilus trossulus).

3.2.3. Перонидия жилковатая (Peromelia venulosa).

3.2.4. Мерценария Стимпсона (Mercenaria stimpsoni).

ГЛАВА 4. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ЧАСТИЧНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДВУХ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ КАДМИЙ-СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЖОВ ПРИМОРСКОГО ГРЕБЕШКА MIZUHOPECTEN YESSOENSIS.

ГЛАВА 5. БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАЗНОВОЗРАСТНЫХ ГРУПП ПРИМОРСКОГО ГРЕБЕШКА MIZUHOPECTEN YESSOENSIS В АДАПТАЦИИ К КАДМИЮ.

5.1. Особенности механизма адаптации годовалых особей приморского гребешка М. yessoensis к кадмию.

5.2 .Особенности механизма адаптации двухлетних особей приморского гребешка М. yessoensis к кадмию.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Детоксикация тяжелых металлов (кадмия) на примере приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis"

Актуальность работы.

Антропогенное воздействие на водоемы сопровождается поступлением в водную среду токсикантов различного происхождения и разного химического состава. Среди них: метаболиты и токсины, образующиеся в результате жизнедеятельности организмов, таких как, например, сине-зеленые водоросли; а также пестициды, поверхностно-активные вещества и многие другие, в том числе и тяжелые металлы (ТМ) как результат активного антропогенного вмешательства. При изучении их влияния на организм, весьма существенным является вопрос о том, какие звенья системы метаболизма в организме гидробионтов обуславливают их резистентность в условиях интоксикации.

Наиболее уязвимым и показательным звеном действия различных поллютантов являются морские беспозвоночные. Занимая литоральное и бентальное место на океаническом шельфе, данная группа организмов является наиболее подверженной флуктуациям в солености, в значении температуры и кислородной доступности. В результате сдвигов в функционировании биохимических регуляторных систем, сопровождающихся, как правило, либо активацией процессов, либо, наоборот, затуханием, особо остро встает вопрос об уязвимости биохимического аппарата, либо, наоборот, о механизмах адаптации к абиотическим, биотическим факторам и антропогенным факторам. Что касается проблемы антропогенного загрязнения водной среды, то особую тревогу экотоксикологов вызывает рост в биосфере концентраций ТМ, не использующихся биологическими системами для поддержания жизни. К этой категории металлов относится высокотоксичный металл кадмий. Однако существует общее мнение, что у организмов различного уровня организации в процессе эволюции сформировался механизм детоксикации, в основе которого лежит связывание и изоляция токсичного иона кадмия, препятствующее взаимодействию его с чувствительными биоструктурами клетки (ЗЬекоп е1 а1.,

1986; Fowler, 1992; Metían et al., 2008). При этом, основную роль в этом механизме осуществляют специальные белки (стресс-белки) -металлотионеины (МТ), которые были найдены во всех организмах, как в беспозвоночных, так и в позвоночных, включая млекопитающих (Klaverkamp, Duncan, 1987; Saito, 1995; Hansen et al., 1997; Vergani et al., 2005).

Среди морских беспозвоночных приморский гребешок Mizuhopecten yessoensis способен извлекать и концентрировать в мягких тканях кадмий, без какого-либо видимого патологического эффекта, даже из чистых вод, в которых концентрации этого ТМ не превышают допустимого фона (Evtushenko Z.S. et al., 1986). Это уникальное свойство приморского гребешка свидетельствует о том, что двустворчатый моллюск М. yessoensis имеет хорошо развитые механизмы адаптации к высоким концентрациям кадмия в окружающей среде. Однако на сегодняшний день мало известно о механизмах устойчивости приморского гребешка М. yessoensis к кадмию, опосредованных кадмий-связыващими белками.

Цель работы: исследовать основные биохимические механизмы адаптации приморского гребешка М. yessoensis к кадмию.

Основные задачи исследования:

1. Исследовать внутриклеточное распределение кадмия и идентифицировать Cd-связывающие белки в пищеварительной железе приморского гребешка М. yessoensis и некоторых видов двустворчатых моллюсков (Mytilus trossulus, Peronidia venulosa, Mercenaria stimpsoni).

2. Выявить влияние аккумуляции кадмия на изменение концентрации Cd-связывающих белков в клетках пищеварительной железы приморского гребешка М. yessoensis и сравнить с другими представителями двустворчатых моллюсков (М trossulus, Р. venulosa, М. stimpsoni).

3. Идентифицировать и охарактеризовать биохимические механизмы адаптации приморского гребешка М. yessoensis к кадмию.

4. Выявить особенности в механизмах адаптации к кадмию у годовалых и двухгодовалых особей приморского гребешкаМ уе55отш.

Научная новизна работы: Впервые показано, что приморский гребешок М. обладает уникальным механизмом адаптации к кадмию, представленным двумя высокомолекулярными белками 72 и 43 кДа. Белок 72 кДа является гликопротеином. Впервые охарактеризованы биохимические механизмы адаптации неполовозрелых особей приморского гребешка к высоким концентрациям кадмия в окружающей среде. Впервые показана способность кадмий-связывающих белков приморского гребешка поглощать свободные радикалы.

Практическая значимость. Результаты исследования применимы для комплексного биологического мониторинга акваторий, т. е. оценки состояния биоты как результата антропогенного вмешательства.

Результаты работы могут быть использованы профессорско-преподавательским составом ВУЗов РФ в специализированных лекционных циклах, рассматривающих вопросы о проблеме биохимической адаптации и биохимической токсикологии.

Основные защищаемые положения

1. У приморского гребешка обнаружена высокоэффективная биохимическая система детоксикации тяжелых металлов, которая представлена комплексом кадмий-связывающих белков (72 и 43 кДа), центральное место среди которых принадлежит гликопротеину 72 кДа. Основной кадмий-связывающий белок 72 кДа является уникальным, не встречающимся в других представителях беспозвоночных. По характеристикам его можно отнести к МТ - подобным белкам.

2. На примере ранних возрастных групп показано, что неполовозрелые особи М. уе88оет15 обладают хорошо развитой системой адаптации к тяжелым металлам (кадмию). Адаптация неполовозрелых особей приморского гребешка достигается за счет связывания металлов с белком не только 72 кДа и с белком 43 кДа, но и с белком с молекулярной массой 120 кДа, который характерен только для данной возрастной группы.

Личный вклад. Автор лично принимал участие в экспериментальных лабораторных и полевых работах, где занимался отбором проб. Также автором была выполнена основная часть подготовки проб для биохимического анализа. Результаты, изложенные в диссертации, получены лично автором либо на равных правах с соавторами. Все расчеты и интерпретация данных сделаны лично автором.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 22 работы, в том числе 6 статей, две из них в ведущих рецензируемых научных журналах, входящих в перечень ВАК.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии» (ТИБОХ ДВО РАН, Владивосток 2004г); 15-ом международном симпозиуме «Экология 2006» (Болгария 2006 г.); молодежных конференциях ТОЙ ДВО РАН (Владивосток, 2008, 2009 гг.); IX и X Дальневосточных школах по актуальным проблемам химии и биологии (ТИБОХ ДВО РАН, 2005, 2006 гг.); 2-ой научной конференции стран СНГ «Современные проблемы физиологии и биохимии водный организмов» (Республика Карелия, 2007 г.); международных научных конференциях «Физиомар 08» (Франция, Брест 2008г.), и на международной конференции «17th International Pectinid Workshop» (Испания, 2009 г), на семинарах лаборатории Морской экотоксикологии ТОЙ ДВО РАН.

Благодарности. Автор выражает огромную благодарность своему научному руководителю, д.б.н., ст.н.с. В.П. Челомину за всестороннюю помощь в процессе работы над рукописью, искреннюю признательность всему коллективу лаборатории Морской экотоксикологии, отдельная огромная благодарность к.б.н. Бельчевой H.H. за неоценимый вклад в развитие и помощь в постановке методик, а так же за ценные рекомендации и консультации. Отельные слова благодарности автор приносит сотрудникам ИБМ: сотруднику лаборатории физиологии к.б.н. В.Я. Кавуну за сбор материала и помощь в сборе материала, сотруднику лаборатории фармакологии к.б.н. В.В. Кумейко за консультации и методической помощи, также сотруднице лаборатории сравнительной цитологии И.Ю. Петровой за неоценимую помощь в подготовке проб.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 124 страницах, состоит из введения, 5 глав и выводов, содержит 29 рисунков, 4 таблицы и список литературы, включающий 176 наименования, из которых 153 на иностранном языке.

Заключение Диссертация по теме "Экология (по отраслям)", Жуковская, Авианна Фаязовна

ВЫВОДЫ

1. Найдено, что среди исследованных видов двустворчатых моллюсков наиболее высокое сродство к кадмию присуще Cd-связывающим белкам пищеварительной железы приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis. Mytilus trossulus и Peronidia venulosa способны аккумулировать кадмий за счет белков МТ-типа. Mercenaria stimpsoni не аккумулирует кадмий и Cd-связывающие белки в пищеварительной железе не выявлены.

2. Распределение кадмия среди термостабильных цитоплазматических белков в приморском гребешке М. yessoensis показывает, что этот металл связывается с высокомолекулярными белками (72 и 43 кДа). Основным Cd-связывающим белком является гликопротеин с молекулярной массой 72 кДа, который по своим биохимическим характеристикам существенно отличается от металлотионеинов и известных металлотионеин - подобных белков.

3. Установлено, что Cd-связывающие белки пищеварительной железы приморского гребешка М, yessoensis вне зависимости от возраста связывают и физиологически важные металлы Zn и Си. При этом в особях приморского гребешка из экологически чистой акватории основной металл, связанный с исследуемыми белками - цинк. При повышенном содержании кадмия в окружающей среде происходит перераспределение металлов в кадмий-связывающих белках. Основным связанным металлом становится кадмий.

4. Обнаружено, что Cd-связывающие белки пищеварительной железы приморского гребешка М. yessoensis способны поглощать кислородные радикалы, а, следовательно, являются одним из компонентов антиоксидантной защиты в приморском гребешке.

5. Показано, что в неполовозрелых особях приморского гребешка М. yessoensis присутствуют три высокомолекулярных белка, участвующих в связывании кадмия (120 кДа, 72 кДа и 43 кДа). Белок 120 кДа характерен только для данной возрастной группы. Однако функция связывания кадмия элиминируется уже у двухгодовалых особей как в условиях повышенной нагрузки кадмием, так и в благоприятных условиях обитания вида.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Жуковская, Авианна Фаязовна, Владивосток

1. Аникиев В.В., Перепелица С.А., Шумилин E.H. Оценка влияния антропогенных и природных источников на пространственное распределение тяжелых металлов в донных осадках залива Петра Великого, Японское море // Геохимия. 1993. № 9. С. 1328-1340.

2. Будников Г.К. Тяжелые металлы в экологическом мониторинге биологических систем // Соросовский образовательный журнал. 1998. № 5. С. 23-29.

3. Ващенко М.А. Загрязнение залива Петра Великого Японского моря и его биологические последствия// Биология моря. 2000. Т. 26. № 3. С. 149159.

4. Виноградов А.П. Среднее содержание химических элементов в главных типах изверженных пород земной коры // Геохимия. 1962. № 7. С. 555-571.

5. Государственный доклад «О состоянии окружающей природной среды Российской Федерации в 1998 году». М.: Государственный центр экологических программ. 1999. 574 с.

6. Деревянко А.П. Российское Приморье на рубеже третьего тысячелетия (1858— 1998 гг.). Владивосток: Дальнаука. 1999. 445 с.

7. Долговременная программа охраны природы и рационального использования природных ресурсов Приморского края до 2005 г. Экологическая программа. Часть 2. Владивосток: Дальнаука. 1992. 276 с.

8. Евсеев Г.А., Яковлев Ю.М. Двустворчатые моллюски дальневосточных морей. Владивосток: ПК Поликон. 2006. 120 с.

9. Жуковская А.Ф., Бельчева H.H., Челомин В.П. Идентификация и частичная характеристика двух высокомолекулярных кадмий-связывающих белков приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis II Вестник МГОУ. Серия «Естественные науки». №3. 2011. С. 36—42.

10. Информационные ресурсы ТОЙ. Океанография. Природопользование, состояние и тенденции изменений морской среды прибрежных районов России в Японском море. Оценка воздействия на природную среду и биоресурсы залива Петра Великого, http://www.pacificinfo.ru/.

11. Лукьянова О.Н. Молекулярные биомаркеры. Владивосток: Изд-во ДВГАЭУ, 2001. 196 с.

12. Никаноров A.M., Жулидов A.B., Покаржевский А.Д. Биомониторинг тяжелых металлов в пресных экосистемах. Л.: Гидрометеоиздат. 1985.

13. Ноздрюхина J1.P., Нейко Е.М., Ванджура И. П. Микроэлементы и атеросклероз. М.: Наука. 1985. 221 с.

14. Огородникова A.A. Эколого-экономическая оценка воздействия береговых источников загрязнения на природную среду и биоресурсы залива Петра Великого. Владивосток: ТИНРО-Центр. 2001. 193 с.

15. Патин С.А., Морозов Н.П. Микроэлементы в морских организмах и экосистемах//М.: Пищепромиздат. 1981. 153 с.

16. Перепелица С.А. Оценка антропогенного воздействия на распределение микроэлементов в прибрежной зоне залива Петра Великого. Автореф. дис. канд. геогр. наук. Владивосток: ТИТ ДВО РАН. 1994. 24 с.

17. Подорванова Н.Ф., Ивашинникова Т.С., Петренко B.C., Хомичук JI. С. Основные черты гидрохимии залива Петра Великого (Японское море). Владивосток. 1989. 201 с.

18. Силина А.В., Овсянникова И.И. Многолетние изменения в сообществе приморского гребешка и его эпибионтов в загрязненной части Амурского залива Японского моря // Биология моря. 1995. Т. 21. № 1. С. 59-66

19. Христофорова Н.К., Шулькин В.М., Кавун В.Я., Чернова Е.Н. Тяжелые металлы в промысловых и культивируемых моллюсках залива Петра Великого. Владивосток: Дальнаука. 1993. 296 с.

20. Челомин В.П. Экотоксикологические аспекты биоаккумуляции кадмия (на примере морских двустворчатых моллюсков). Автореф. дис. док. биол. наук. Владивосток: ТОЙ ДВО РАН. 1998.

21. Челомин В.П., Бельчева Н.Н., Захарцев М.В. Биохимические механизмы адаптации мидии Mytilus trossulus к ионам кадмия и меди // Биол. моря. 1998. Т. 24. №5. С. 319-325.

22. Abel J., Ruiter N. Inhibition of hydroxy 1-radical-generated DNA degradation by metallothionein // Toxicol. Lett. 1989. Vol. 47. P. 191-196.

23. Aksnes A., Njaa L.R. Catalase, glutathione peroxidase and superoxide dismutase in different fish species // Сотр. Biochem. Physiol. 1981. Vol. 69 b. P. 893-896.

24. Albergoni V., Piccinni E. Biological response to trace metals and their biochemical effects // Trace Element Speciation in Surface Waters and Its Ecological Implications. Ed. by Albergoni V., L.: Academic Press. 1983. P. 159-175.

25. Bauman J.W., Liu J., Liu Y.P., Klaassen C.D. Increase in metallothionein produced by chemicals that induce oxidative stress // Toxicol. Appl. Pharmacol. 1991. Vol. 110. P. 347-354.

26. Bebiano M., Serafim M. and Rita M. Involvement of metallothionein in cadmium accumulation and elimination in the clam Ruditapes decussata // Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1994. Vol. 53. P. 726732.

27. Berger В., Hunziker P.E., Hauer C.R., Birchler N., Dallinger R. Mass spectrometry and amino acid sequencing of two cadmium-binding metallothionein isoformsfrom the terrestrial gastropod Arianta arbustorum // Biochem J. 1995. Vol. 311. №3. P. 951-957.

28. Binz P.-A., Kagi J.H.R. Molecular Evolution of Metallothioneins: Contributions from coding and non-coding Regions/ Second European Meeting of the Protein Society in Cambridge (UK). 1997.

29. Boyle E.A., Sclater F., Edmond J.M. On the marine geochemistry of cadmium // Nature. 1976. Vol. 263. P. 42-44.

30. Bremner I., Beattie J.H. Metallothionein and trace minerals // Ann. Rev. Nutr. 1990. Vol. 10. P. 63-83.

31. Brown B.E. The form and function of metal-containing «granules» in invertebrate tissues // Biol. Rev. 1982. Vol. 57. P. 621-627.

32. Bruland K. W. Trace elements in seawater // Chemical Oceanography. Vol. 8. Eds. by Riley J.P., Chester R., L.: Acad. Press. 1983. P. 157-220.

33. Cai L., Cherian M.G. Zinc-metallothionein protects from DNA damage induced by radiation better than glutathione and copper- or cadmium-metallothioneins // Toxicol. Lett. 2003. Vol. 136. P. 193-198.

34. Canterford G.S., Canterford D.R. Toxicity of heavy metals to the marine diatom Ditylum brightwelli (West) Grunow: correlation between toxicity and metal speciation // J. Mar. Biol. Ass. U.K. 1980. Vol. 60. P. 243-253.

35. Capasso C., Nazzaro F., Marulli F., Capasso A., La Cara F., Parisi E. Identification of a high-molecular-weight cadmium-binding protein in copper-resistant Bacillus acidocaldarius cells // Res. Microbiol. 1996. Vol. 147. № 4. P. 287-296.

36. Carpene E. Metallothionein in marine mollusks // Ecotoxicology of Metals in Invertebrates, Eds. by Dallinger R., Rainbow P.S., L.: Lewis Publ., 1993. P. 55-72.

37. Chandran R., Sivakumar A., Mohandass S., Aruchami M. Effect of cadmium and zinc on antioxidant enzyme activity in the gastropod Achatina filica II Comp. Biochem. Physiol. 2005. Vol. 140 C. P. 422^126.

38. Chelomin V.P., Bobkova E.A., Lukyanova O.N., Chekmasova N.M. Cadmium-induced alterations in essential trace element homoeostasis in the tissues of scallop Mizuhopecten yessoensis II Comp. Biochem. Physiol. 1995. Vol. 110. № 3. P. 329-335.

39. Chen M.L. and Failla M.L. Degradation of zinc-metallothionein in monolayer culture of rats hepatocytes // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1989. Vol. 191. P. 130-138.

40. Cherian G., Jayasurya A., Bay B.H. Metallothioneins in human tumors and potential roles in carcinogenesis // Mutat. Res. 2003. Vol. 533. P. 201-209.

41. Choudhuri S., McKim J.M.Jr., Klaassen C.D. Role of hepatic lysosomes in the degradation of metallothionein // Toxicol. Appl. Pharmacol. 1992. Vol. 115. P. 64-71.

42. Coombs T.L., George S.G. Mechanisms of immobilization and detoxication of metals in marine organisms // Physiology and Behavior of Marine Organisms. Eds. by McLusky D.S., Berry A.J., Oxford: Pergamon Press. 1978. P. 179-187.

43. Dallinger R. Strategies of metal detoxification in terrestrial invertebrates// Ecotoxocology of Metals in invertebrates. Eds. by Dallinger R., Rainbow P.S., L.: Lewis Publ., 1993. P. 245-289.

44. Dallinger R., Berger B., Gruber C., Sttirzenbaum S. Metallothioneins in Terrestrial Invertebrates: Structural Aspects, Biological Significance, and Implications for their Use as Biomarkers // Cell. Mol. Biology. 2000. Vol. 46(2). P. 331-346.

45. Dalton T., Paria B.C., Fernando L.P., Huet-Hudson Y.M., Dey S.K., et al. Activation of the chicken metallothionein promoter by metals and oxidative stress in cultured cells and transgenic mice // Comp. Biochem. Physiol. 1997. Vol. 116. P. 75-86.

46. Depledge M.N., Aagaard A., Gyorkos P. Assessment of trace metal toxicity using molecular, physiological and behavioral biomarkers // Mar. Biol. Bullet. 1995. Vol. 31. P. 19-27.

47. Dohi Yoshiko, Ohba Kunihiro, Yoneyama Yashimasa. Purification and properties of two cadmium-binding glycoproteins from the hepatopancreas of a whelk, Buccinum tenuissimum II Biochimica et Biophysica Acta. 1983. Vol. 745. P. 50-60.

48. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A. and Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances // Anal. Chem. 1956. Vol. 28. P. 350-356.

49. Durnam D.M, Perrin F., Gannon F., Palmiter R.D. Isolation and characterization of the mouse metallothionein-I gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. No.77(11) P. 6511-6515.

50. Eaton A. Marine geochemistry of cadmium // Mar. Chem. 1976. Vol. 4. P. 141-154.

51. Ellman, G.L. Tissue sulphhydryl groups // Arch. Biochem. Biophys. 1959. Vol. 82. P. 70-77.

52. Erk M., Ruus A., Ingebrigtsen K., Hylland K. Cadmium accumulation and Cd-binding proteins in marine invertebrates a radiotracer study // Chemosphere. 2005. Vol. 61. P. 1651-1664.

53. Evans I.M., Gatehouse L.N., Robinson N.J., Croy R.R.D. A gene from pea (Pisum sativum L.) with homology to metallothionein genes // FEBS Lett. 1990. Vol. 262. P. 29-32.

54. Everaarts J.M. Uptake and release of cadmium in various organs of the common mussel, Mytilus edulis (L.) // Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1990. Vol. 45. P. 560-567.

55. Evtushenko Z.S., Belcheva N.N., Lukyanova O.N. Cadmium accumulation in organs of the scallop Mizuhopecten yessoensis—II. Subcellular distribution of metals and metal-binding proteins // Comp. Biochem. Physiol. 1986. Vol. 83 C. №2. P. 377-383.

56. Feldman S.L., Failla, M.L., Cousins R.J. Degradation of rat liver metallothioneins in vitro // Biochim. Biophys. Acta. 1978. Vol. 544. P. 638-646.

57. Fenik S.I., Solodushko V.G., Kaliniak T.B., Blium I.B. The role of Cd-binding proteins and phytochelatins in the formation of cadmium resistance in Nicotiana plumbaginifolia cell lines // Tsitol. Genet. 2007. Vol. 41. № 1. P. 915.

58. Fowler B.A. Mechanisms of kidney cell injury from metals // Environmental Health Perspective. 1992. Vol. 100. P. 57-63.

59. Fox H.M., Ramage H.A. Spectrographic analysis of animal tissues // Proc. R. Soc.1.nd. Ser. B. 1931. Vol. 108. P. 157-173. Fridovich I. Overview: biological sources of O2" // Methods in Enzymology. 1984. V. 105. P. 59-61.

60. Gabbot P.A., Bayne B.L. Biochemical effects of temperature and nutritive stress on

61. Han S.J., Park J.S., Lee I.S. Accumulation and elimination of cadmium and zinc in the Asian periwinkle Littorina brevicula // J. Environ. Sci. Health. A Tox. Hazard Subst. Environ. Eng. 2003. Vol. 38. P. 965-974.

62. Hansen C., Ablett E., Green A., Sturm R.A., Dunn I.S., Fairlie D.P., West M.L., Parsons P.G. Biphasic response of the metallothionein promoter to ultraviolet radiation in human melanoma cells // Photochem. and Photobiol. 1997. Vol. 65. №3. P. 550-555.

63. Hart B.A., Gong Q., Eneman J.D., Durieux-Lu C.C., Kimberly P., Hacker M.P. Increased oxidant resistance of alveolar macrophages isolated from rats repeatedly exposed to cadmium aerosols // Toxicology. 1996. Vol. 107. P. 163-175.

64. Janssen H.H., Scholz N. Uptake and cellular distribution of cadmium in Mytilus edulis II Mar. Biol. 1979. Vol. 55. P. 133-141.

65. Kagi J.H.R, Schaffer A. Biochemistry of metallothionein // Biochemistry. 1988. Vol. 27. P. 8509-8515.

66. Kagi J.H.R. and Valli B.L. Metallothionein: A cadmium and zinc-containing protein from equine renal cortex // J. Biol. Chemistry. 1960. Vol. 235. P. 3460-3465.

67. Kagi J.H.R., Kojima Y. Chemistry and biochemistry of metallothionein. Metallothionein II. Eds. by Kagi J.H.R., Kojima Y., Basel: Birkhauser Verlag. 1987. P. 25-61.

68. Kang Y.-J., Enger M.D. Glutathione is involved in the early cadmium cytotoxic response in human lung carcinoma cells // Toxicology. 1988. Vol. 48. P. 93101.

69. Kershaw W.C., Klaassen C.D. Degradation and metal composition of hepatic isometallothioneins in rats // Toxicol. Appl. Pharmacol. 1992. Vol. 112. P. 2431.

70. Klaverkamp J.F. and Duncan D.A. Acclimation to cadmium toxicity by white suckers: cadmium binding capacity and metal distribution in gill and liver cytosol // Env. Toxicol. Chem. 1987. Vol. 6. P. 275-289.

71. Maret W. The function of zinc metallothionein: A link between cellular zinc and redox state // J. Nutr. 2000. Vol. 130. P. 1455-1458.

72. Margoshes M., Vallee B., L. A cadmium protein from equine kidney cortex // J. Amer. Chem. Soc. 1957. Vol. 79. P. 4813-4814.

73. Marigomez J.A., Cajaraville M.P., Angulo E. Cellular cadmium distribution in the common winkle, Littorina littorea exposed to cadmium// Histochemistry, 1990. Vol. 94. P. 191-199.

74. Mason A.Z., Nott J.A. The role of intracellular biomineralized granules in the regulation and detoxification of metals in gastropods with special reference to the marine prosobranch Littorina littoreall Aquat. Toxicol. 1981. Vol. 1. № 34. P. 239-256.

75. Masters B.A., Quaife J., Erickson J.C., Kelly E.J., Froelick G.J., Zambrowicz B.P., Brinster R.L., Palmiter R.D. Metallothionein III is expressed in neurons that sequester zinc in synaptic vesicles // J. Neurosci. 1994. Vol. 14. P. 5844-5857.

76. Mates J.M., Sanchez-Jimenez F. Antioxidant enzymes and their implications in pathophysiological processes // Frontiers in Bioscience. 1999. Vol. 4. P. 339345.

77. McKim J.M.Jr., Choudhuri S., Klaassen C.D. In vitro degradation of apo-, zinc-, and cadmium-metallothionein by cathepsins B, C, and D // Toxicol. Appl. Pharmacol. 1992. Vol. 116. P. 117-124.

78. Mello-Filho A.C., Chubatsu L.S., Meneghini R. V79 Chinese-hamster cells rendered resistant to high cadmium concentration also become resistant to oxidative stress // Biochem. J. 1988. Vol. 256. P. 475^79.

79. Metian M., Bustamante P., Oberhansli F., Teyssie J.-L., Warnau M. Interspecific comparisons of Cd bioaccumulation in European Pectinidae (Chlamys varia and Pecten maximus) // Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 2007. Vol. 353. P. 58-67.

80. Metian M., Warnau M., Cosson R.P., Oberhansli P., Bustamante P. Bioaccumulation and detoxification processes of Hg in the king scallop Pecten maximus: field and laboratory investigations // Aquatic Toxicology. 2008. Vol. 90. P. 204-213.

81. Miles A.T., Hawksworth G.M., Beattie J.H., Rodilla V. Induction, regulation, degradation, and biological significance of mammalian metallothioneins // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2000. Vol. 35. P. 35-70.

82. Min K.S., Nishida K., NakaharaY., Onosaka S. Protective effect of metallothionein on DNA damage induced by hydrogen peroxide and ferric ionnitrilotriacetic acid // Metallothionein IV. Ed. C. Klaassen. Basel: Birkhauser Verlag, 1999. P. 529-534.

83. Mosleh Y.Y., Paris-Palacios S., Biagianti-Risbourg S. Metallothioneins induction and antioxidative response in aquatic worms Tubifex tubifex (Oligochaeta, Tubificidae) exposed to copper// Chemosphere. 2006. Vol. 64. P. 121-128.

84. Mullins J.E., Fredrickson R.A., Fuentealba I.C., Markham R.J. Purification and partial characterization of a cadmium-binding protein from the liver of rainbow trout (Onchorynchus mykiss) // Can. J. Vet. Res. 1999. Vol. 63. № 4. P. 225-9.

85. Chem. 1983. Vol. 258. P. 13063-13069. Nolan C.V., Duke E.J. Cadmium accumulation and toxicity in Mytilus edulis: involvement of metallothioneins and heavy-molecular weight protein // Aquat. Toxicol. 1983. Vol. 4. P. 153-163.

86. OBrien P., Salacinski H.J. Evidence that the reactions of cadmium in the presence of metallothionein can produce hydroxyl radicals // Arch. Toxicol. 1998. Vol. 72. P. 690-700.

87. Park L, Min D, Kim H, Park J, Choi S, Park Y. The combination of metallothionein and superoxide dismutase protects pancreatic (3 cells from oxidative damage // Diabetes Metab Res Rev. 2011. Vol. 27. №. 8. P. 802-808.

88. Pavicic J., Raspor P., Martincic D. Quantitative determination of metallothionein-like proteins in mussels. Methodological approach and field evaluation // Marine Biology. 1993. Vol. 115. P. 435-444.

89. Pedersen S.A., Kristiansen E., Andersen R.A., Zachariassen K.E. Isolation and preliminary characterization of a Cd-binding protein from Tenebrio molitor (Coleoptera) // Comp. Biochem. Physiol. 2007. Vol. 145. № 3. P. 457-463.

90. Petering D.H., Fowler B.A. Discussion summary. Role of metallothionein and related proteins in metal metabolism and toxicity: problems and perspectives // Environ. Health Perspect. 1986. Vol. 65. P. 217-224.

91. Phillips D.J.H. Toxicity and accumulation of cadmium in marine and estuarine biota// Cadmium in the Environment. Part 1, Ed. by Nriagu J.O., N.Y.: Wiley-Interscience, 1980. P. 425-569.

92. Posthuma L., Straalen N.M. Heavy metal adaptation in terrestrial invertebrates: a review of accurrence, genetics, physiology and ecological consequences // Comp. Biochem. Physiol. 1993. Vol. 106 C. P. 11-38.

93. Pulido P., Kagi H.R., Valli B.L. Isolation and some properties of human mettollothinein // Biochemistry. 1966. Vol. 5. P. 1768-1777.

94. Quesada A.R., Byrnes R.W., Krezoski S.O., Petering D.H. Direct reaction of H2O2 with sulfhydryl groups in HL- 60 cells: zinc-metallothionein and other sites // Arch. Biochem. Biophys. 1996. Vol. 334. P. 241-250.

95. Rainbow P.S., Dallinger R. Metal uptake, regulation and excretion in freshwater invertebrates// Ecotoxicology of Metals in Invertebrates, Eds. by Dallinger R., Rainbow P.S., Chelsea: Lewis Publishers. 1993. P. 119-131.

96. Ramana Kumari M.V., Hiromatsu M., Ebadi M. Free Radical scavenging actions of Metallothionein Isoforms I and II // Free Rad. Res. 1998. Vol. 29. P. 93-101.

97. Ray S. Bioaccumulation of cadmium in marine organisms // Ezperientia. 1984. Vol. 40. P. 14-23.

98. Ray S., Jerome V.E., Thorne J.A. Copper, zinc, cadmium and lead in scallops (Placopecten magellanicus) from chaleur bay, New Brunswick // Marine Environ. Quality Comm. 1984. E:22. P. 1-15.

99. Richards R.I., Heguy A., Karin M. Structural and functional analysis of the human metalIothionein-IA gene: Differential induction by metal ions and glucocorticoids // Cell. 1984. Vol. 37. № 1. P. 263-272.

100. Rie M.T., Lendas K.A., Callard I.P. Cadmium: tissue distribution and binding protein induction in the painted turtle Chrysemys picta II Comp. Biochem. Physiol. 2001Vol. 130 C. P. 41-51.

101. Robbins A.H., McRee D.E., Williamson M. Refined crystal structure of Cd, Zn metallothionein at 2.0 A resolution // J. Mol. Biol. 1991. Vol. 221. P. 12691293.

102. Roesijadi G. Metallothionein induction as a measure of response to metal exposure in aquatic animals // Environ. Health Perspect. 1994. Vol. 2. P. 1-96.

103. Roesijadi G., Fowler B.A. Purification of invertebrate metallothioneins // Methods in Enzymology. 1991. Vol. 205. P. 263- 73.

104. Roesijadi G., Kielland S.L., Klerks P. Purification and properties of novel molluscan metallothioneins // Archiv. Biochem. Biophys. 1989. Vol. 273. P. 403-413.

105. Sabolic I., Ljubojevic M., Herak-Kramberger C.M., Brown D. Cd-MT causes endocytosis of brush-border transporters in rat renal proximal tubules // Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 2002. Vol. 283. P. 1389-1402.

106. Saito S. Limitations of zinc and metallothionein accumulation in rat livers following zinc administration // Research Communications in Molecular Pathology and Pharmacology. 1995. Vol. 88. № 1. P. 99-106.

107. Sato S., Okabe M., Kurasaki M., Kojima Y. Metallothionein in the ovaries of laying hens exposed to cadmium//Life Sci. 1996. Vol. 58. № 18. P. 1561-1567.

108. Schmidt C.J., Hamer D.H. Cloning and sequence analysis of two monkey metallothionein cDNAs // Gene. 1983. № 24(1). P. 137-146.

109. Scholz N. Accumulation, loss and molecular distribution of cadmium in Mytilus edulis II Helgoland. Wiss. Meerresunters, 1980. Vol. 33. P. 68-78.

110. Tapiero H., Townsend D.M., Tew K.D. Trace elements in human physiology and pathology. Copper // Biomed. Pharmacother. 2003. Vol. 57. P. 386-398.

111. Thomas J.P., Bachowsk G.J., Girotti A.W. Inhibition of cell membrane lipid peroxidation by cadmium- and zincmetallothioneins // Biochim. Biophys. Acta. 1986. Vol. 884. P. 448-461.

112. Thompson J.A.J., Sutherland A.E. A comparison of methods for sample clean-up prior to quantification of metal-binding proteins // Comp. Biochem. Physiol. 1992. Vol. 102. № 4B. P. 769-772.

113. Tkalin A.V., Belan T.A., Shapovalov E.N. The state of the marine environment near Vladivostok, Russia // Mar. Pollut. Bull. 1993. Vol. 26. № 8. P. 418422.

114. Tkalin A.V., Lishavskaya T.S., Shulkin V.M. Radionuclides and trace metals in mussels and bottom sediments around Vladivostok // Mar. Pollut. Bull. 1998. Vol. 36. № 7. P. 551-554.

115. Tkalin A.V., Presley B.J., Booth P.N. Spatial and temporal variations of trace metals in bottom sediments of Peter the Great Bay, the Sea of Japan // Environ. Pollut. 1996. Vol. 92. №1. P. 73-78.

116. Vasak M., Romero-Isart N. Metallothioneins. In: King RB (ed.). Encyclopedia of Inorganic Chemistry. 2nd ed. John Wiley & Sons. NewYork. 2005. P. 32083221.

117. Vasak M. and Kagi. In Metal Ions in Biological systems (Sigel, H. ed.) 1983. Vol. 15. Marcel Dekker, New York. P. 213.

118. Vasak M. and Meloni G. Metallothioneins in biochemistry and pathology. http://www.worldscibooks.com/medsci/6663.html.

119. Vergani L., Grattarola M., Borghi C., Dondero F., Viarengo A. Fish and molluscan metallothioneins. A structural and functional comparison // The FEBS Journal. 2005. Vol. 272. P. 6014-6023.

120. Viarengo A., Burlando B., Ceratto N., Panfoli I. Antioxidant role of metallothioneins: a comparative overview // Cellular and Molecular Biology. 2000. Vol. 46 (2). P. 407-417.

121. Viarengo A., Pertica M., Canesi L., Biasi F., Cecchini G., Orunesu M. Effects of heavy metals on lipid peroxidation in mussel tissues // Mar. Environ. Res. 1988. Vol. 24. P.355.

122. Wang H., Zhang Q., Cai B. Solution structure and dynamics of human metallothionein-3 (MT-3) // FEBS Lett. 2006. Vol. 580. P. 795-800.

123. Webb M., Cain K. Function of metallothionein // Biochem. Pharmacol. 1982. Vol. 31. P. 137-142.

124. Wong K.-L., Klaasen C.D. Relationship between liver and kidney levels of glutathione and metallothionein in rats // Toxicology. 1981. Vol. 19. P. 39-47.

125. Yoshida N., Ishii K., Okuno T., Tanaka K. Purification and characterization of cadmium-binding protein from unicelluar alga Chlorella sorokinian II Curr. Microbiol. 2006. Vol.52. P. 460-463.

126. Zapata-Vivenes E., Nusetti O. Protection of glycolytic enzymes by metallothioneins from oxidative damage in the digestive gland of green lipped mussel Perna viridis II Journal of Shellfish research. 2007. Vol. 26. № 2. P. 335-344.

127. Zaroogian G., Jackim E. In vivo metallothionein and glutathione status in an acute response to cadmium in Mercenaria mercenaria brown cells // Comp. Biochem. Physiol. 2000. Vol. 127 C. P. 251-261.

128. Zheng H., Liu J., Liu Y., Klaassen C.D. Hepatocytes from metallothionein-I and II knock-out mice are sensitive to cadmium- and fórí-butylhydroperoxide induced cytotoxicity//Toxicol. Lett. 1996. Vol. 87. P. 139-145.