Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимический полиморфизм глутатионпероксидазы эритроцитов человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тургиева, Диляра Аскеровна

Список принятых сокращений

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Биохимия глутатионпероксидазы.

1.1.Х» Строение и функции фермента.

1.1.2. Механизм реакции.

1.1.3. Кинетика глутатионпероксидазы

1.1.4. Субстратная специфичность глутатионпероксидазы

1.1.5. Ингибиторы глутатионпероксидазы.

1.1.6. Функция глутатионпероксидазы в эритроцитах

1.2, Наследственные энзимопатии эритроцитов человека и их молекулярные механизмы

1.2Д. Наследственная недостаточность Ш эритроцитов человека.

1.2.2. Биохимический полиморфизм ГД . . . ».

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

2.2.1. Скрининг-^ест для выявления недостаточности Ш 36 2.2*2. Количественное определение И и других ферментов в гемолизате.

2.2.3. Очистка глутатионпероксидазы из эритроцитов . •

2.2.4. Исследование кинетики и физико-химических свойств глутатионпероксидазы

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУ2ЩЕНИЕ

ЗЛ. Исследование активности глутатионпероксидазы в эритроцитах здоровых людей

3.2. Модификация скрининг-метода

3.3. Выявление носителей недостаточности Ш ♦

3.3.1. Исследование образцов крови в Масаллинском районе.

3.3.2. Исследование образцов крови в Таузском районе

3.3.3. Исследование образцов крови в г. Баку

3.4. Исследование нормальных молекулярных вариантов глутатионпероксидазы эритроцитов человека

3.4.1. Выделение ГП из эритроцитов донорской крови

3.4.2. Изучение кинетических и физико-химических свойств Ш.

3.5. Идентификация мутантных аллелей Ш.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биохимический полиморфизм глутатионпероксидазы эритроцитов человека"

Для понимания особенностей структуры и функции генома высших организмов» находящегося в последние годы в центре внимания исследователей в области биохимии, молекулярной биологии и других смежных наук, высоко информативны исследования мутационно изменённых белков. Одних только форм заболеваний, основанных на мутационных изменениях в каком-либо одном генетическом локусе насчитывается более 2500. Изменение структуры или дефицит белка - продукта мутантного гена - главная причина последующих нарушений обмена веществ и функции организма.

Среди наследственных заболеваний особое место занимают заболевания системы крови и, в частности, эритроцитопатии; число носителей важнейших аномалий гемоглобина в настоящее время превышает 100 млн., а дефицита фермента Г6ФД - 300 млн.человек (Токарев Ю.Н. и др.) /25/. Интвнсивные и плодотворные исследования эритроцитар-ных энзимопатий, которые проводятся в последние годы в нашей стране Идельсоном Л.И. /5,6/, Бочковым Н.М. /3/, Левиным Г.С./П/, Ермильченко Г.В. /4/, Краснопольской К.Д»/9/, Лысенко А.Я. /13/, Инасаридзе Е.В. /7/, Салиевым К.К. /23/, Махмудовой М.Н. /14/ и др. , свидетельствуют о распространенности и важности изучения этой патологии.

Особый интерес в этом отношении представляет Азербайджан. Исследования Краснопольской К.Д. /8,10/, Мехтиева Н.Х. /15-18/, Мовсум-заде К.М. /19,20/, Лысенко А.Я. /12/, Бенедиктова И.Н./1/ и др. показали не только высокую частоту распространения, но и разнообразие эритроцитарных энзимопатий в республике.

Большинство известных до сих пор наследственных энзимопатий вызывают нарушение гликоливического процесса, пентозо-фосфатного цикла и системы глутатиона. Хотя пентозон$осфатный цикл в клетке метаболизирует только 10% глюкозы до лактата, он имеет важную функцию доставки редуцированного глутатиона, защищающего структуру эритроцита, в том числе гемоглобин и мембраны, от окисных и перекисных воздействий. Глутатионпероксидаза в цепи системы глутатиона катализирует реакцию между глутатионом и перекисью с образованием воды и глутатиона окисленного, тем самым поддерживая постоянный уровень восстановленного глутатиона. Естественно, дефицит этого фермента ведёт к накоплению перекисей, постоянно образующихся в клетке, тем самым способствуя разрушению эритроцитов с развитием гемолитической анемии.

Б литературе описаны случаи развития острых гемолитических 1физов, связанных с наследственным дефицитом Ш /78,122,123,153/. Болезнь в большинстве случаев провоцируется приёмом ряда лекарственных препаратов /42,43,114,123/, сочетается с гипербийируби-немией, повышенным образованием телец Гейнца, желтухой и т.д. Б связи с этим, своевременное выявление носителей мутантных аллелей ГП имеет большое значение для проведения лечебно-профилактических мер. Однако сведения о Ш-недостаточности очень ограничены, нечётко выяснена связь дефицита фермента с гемолитической анемией, отсутствуют исследования по выявлению и изучению частоты распространения ГП-дефицита и, наконец, совершенно не изучена биохимическая картина молекулярного дефекта фермента.

Цель и основные задачи исследований В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы явилось изучение частоты распространения и биохимического полиморфизма Ш эритроцитов человека в Азербайджанской ССР. Б конкретные задачи исследований в±одило: - определение активности ГП у здоровых лиц, проживающих в Азербайджане;

- определение частоты распространения ГП-дефекта;

- установление наследственного характера дефицита фермента;

- разработка методов идентификации молекулярных вариантов;

- изучение биохимического полиморфизма Ш;

- установление связи между ГП-дефицитом и гемолитической анемией.

Научная новизна

Впервые, путём массового обследования населения районов и г.Баку в Азербайджане установлен факт наличия ГП-энзимопатии в республике; показаны высокая фенотипическая - 3,3% и генная -0,0166% частоты распространения ГП-недостаточности; путем анализа родословных подтвержден наследственный характер дефицита. Предложена собственная модификация скринирующего метода определения активности фермента для массового обследования населения; разработаны методы выделения и очистки ГП из эритроцитов, а также методы идентификации молекулярных вариантов фермента. Установлены отличительные физико-химические свойства двух изоферментов. Изучены ЭФ-подвижность, константы Михаэлиса для двух субстратов, термостабильность и рН-зависимость восьми мутантных форм Ш. Показана связь между Ш-дефищтом и гемолитической анемией»

Теоретическая и практическая ценность

Изучение эритроцитарной ГП-недостаточности имеет большое теоретическое значение.Широкое распространение и высокий полиморфизм ГП-недо статочно сти могут быть использованы в качестве модели для исследования генетической гетерогенности наследственных заболева--ний. Явление полиаллелизма играет важную роль в наследственной патологии человека, т.к. фенотипическое проявление различных мутантных аллелей одного и того же гена очень разнообразно. В зависимости от мутаций, возникших в белковой молекуле, клиническое проявление варьирует от состояния,близкого к норме, до несовместимого с жизнью. Наиболее приемлемым подходом к исследованию этого явления служит определение физико-химических и кинетических изменений продукта аномального гена - фермента ГЛ.

Практическая значимость полученных результатов заключается в установлении факта наличия эритроцитарной ГП-энзимопатии у жителей Азербайджана, в выявлении районов с высокой частотой распространения ГД-недостаточности, а также в установлении связи между наследственным дефицитом И в эритроцитах и гемолитическими анемиями, что важно в диагностике и изучении патогенеза гемолитических анемий.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Тургиева, Диляра Аскеровна

ВЫВОДЫ

I, Установлен факт наличия глутатионпероксидазной энзимо-патии эритроцитов в Азербайджане с высокими фенотипической и генной частотами: средняя фенотипическая частота составила 3,3$, генная - 0,0166 .

2» Установлен наследственный характер дефицита глутатион-пероксидазы в эритроцитах человека путём анализа родословных.

3« Разработаны методы идентификации молекулярных вариантов глутатионпероксидазы эритроцитов человека; получены нормативы для электрофоретической подвижности, константы Михаэлиса для глутатиона и перекиси, термостабильности и рН-зависимости для двух изоферментов глутатионпероксидазы эритроцитов человека и выявлены отличительные свойства двух форм фермента.

4. Установлена гетерогенность мутантных образцов глутатионпероксидазы, которые отличаются от нормы по степени активности фермента, сродству к глутатиону и перекиси, электрофоретической подвижности и термостабильности. Выявлено два типа мутаций: а) с высокой электрофоретической подвижностью, низким сродством к глутатиону и перекиси и низкой термостабильностью; б) с нормальной электрофоретической подвижностью, нормальным сродством к глутатиону и низкой Км в отношении перекиси, а также пониженной термостабильностью.

5. Показана связь между дефицитом глутатионпероксидазы в эритроцитах и гемолитической анемией.

6. Модифицирован скриниругощий тест определения активности глутатионпероксидазы в эритроцитах, удобный при массовом обследовании населения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящая работа посвящена изучению биохимического полиморфизма ГП-энзимопатии у населения Азербайджана. Для установления наличия и частоты распространения Ш-энзимопатологии проведено массовое обследование населения Масаллинского и Таузского районов республики и г.Баку полуколичественным скринирующим методом. При выборе метода для массового обследования населения принималось во внимание применимость теста при измерении активности ГП в образцах крови человека, экспедиционные условия исследования, а также учитывалось количество использованных дорогостоящих и дефицитных реактивов. Б имеющейся литературе описано несколько методов флюоресцентных пятен для определения ГП в эритроцитах /39, 40,88,90,96,134/. Однако большинство методов применимы только для измерения активности фермента в эритроцитах животных при оценке концентрации селена в крови. Скринирующий тест определения активности ГП в эритроцитах людей предложенЕ>оац*>€ою-5ка-- УОТГОЪЪКС* У. /40 и Учитывая большой расход, в основном, кристаллической глутатион-редуктазы (10 ед/мл) в инкубационной смеси по методу

КеЩЗ , нами для массового обследования населения на активность ГП модифицирован метод модификация включала замену цельной гепаринизированной крови, взятой в пробирки, образцами крови, взятых на фильтровальную бумагу, что удобно в условиях экспедиции при транспортировке (активность фермента сохраняется в течение 10-12 дней); изменена молярная концентрация НАДФН в реакционной смеси (0,024 М вместо 0,015 М в конечной концентрации).

Достоинством метода является также его относительная независимость от содержания эритроцитов в цельной крови - время дефлюоресценции не зависит от гематокрита в пределах 45-25$.

Разработанная модификация скринирующего метода может .' быть использована при массовом обследовании с целью диагностирования дефицита ГП в эритроцитах человека.

Для выявления лиц с недостаточностью ГП обследовано 3054 человека, У 102 показана сниженная активность фермента (от 5,3 до 13,55 ед/г Нв) при норме от 14,06 до 23,9 ед/г Нв, что было подтверждено неодно!фатной спектрофотометрической оценкой» Б результате исследования установлены фенотипическая и генная частоты по каждому району: в Масаллинском районе из 1200 обследованных в образцах крови 43 человек подтверждён дефицит активности ГП, фенотипическая частота 3,5833$и генная 0,0173$; в Та-узском районе из 354 человек у семи показана низкая активность ГП с фенотипической частотой 1,9774$ и генной - 0,098$; из 1500 обследованных в г.Баку в эритроцитах 52 человек выявлен дефицит фермента, т.е. фенотипическая частота распространения недостаточности ГП жителей г.Баку составила 3,4388$ и генная - 0,017$. Жители г.Баку (студенты БУЗов) - приезжие, уроженцы различных районов республики; по географическому расположению эти районы и, соответственно, обследованные разделены на четыре группы. Распределение частоты распространения ГО-энзимопатии представлено в следующем виде: в I группе обследованных, уроженцев северных районов республики, фенотипическая частота составляла 3,0$, генная - 0,013$; во второй группе ( уроженцы центральной части Азербайджана) фенотипическая частота распространения ГП-недоста-точности составляла 3,2$, генная - 0,016$; в третьей группе (уроженцы юго-восточной части республики) - фенотипическая частота составила 4,0$ и генная - 0,02$; в четвёртой группе (уроженцы южных районов) фенотипическая частота распространения ГП-недостаточности - 3,5555$ и генная 0,0177$.

Т.о., в результате обследования 3054 человек, проживающих в различных районах республики, показано гетерозиготное носитель-ство ГП-энзимопатии в Азербайджане с фенотипической частотой распространения в среднем3,33% и генной - 0,0165%. Дефицит фермента в различных районах распределён относительно равномерно и составляет от 1,9% (Таузский район)до 4% (г. Баку, Ш группа обследованных), хотя некторая закономерность распределения частоты мутантного гена Ш у жителей обследованных районов наблюдается: у жителей более южных районов республики частота дефекта Ш в два раза выше (в Масаллинском районе фенотипическая частота 3,58%, в Ш группе обследованных - 4,0%), чем у лиц, проживающих в северной части (Таузский район;.- 1,9%),

Вполне вероятно, что частота распространения мутантного аллеля Ш связана с высокой инбредностью и эндогамностью браков в исследуемых популяциях» Средний процент родственных браков в Масаллинском районе составил около 40%, а в некоторых селах доходил до 88,4%; коэффициент инбридинга в - Масаллинской популяции 0,0171, тогда как в Таузском районе - 0,0062. /19,21/.

Результаты массового обследования, свидетельствующие о наличии и частоте распространения мутантного гена Ш невозможно сопоставить с литературными, т.к. подобного рода исследования в СССР и,в частности, в Азербайджане не проводились. Единственная работа, проведенная в этом направлении, представлена Вв-и'Ыбъ!. /36,37/ Автор обследовал 1137 человек афро-американского происхождения и по результатам электрофоретической подвижности судил о частоте мутантного гена популяции. В образцах крови 33 человек (2,8%) им показана быстромигрирующая форма фермента. Автор считает мутационные изменения белка генетически детерминированными и полагает, что только исследование очищенного фермента позволит правильно определить его свойства.

Генетически обусловленный характер дефекта Ш показав и в наших исследованиях. Путём анализа родословных у 102 носителей ГП-дефицита во всех случаях установлен наследственный характер дефекта; у 61,7$ пробандов носителем мутантного аллеля Ш были оба родителя, у 26,4$ - дефицит наблюдался в эритроцитах отца и в 11,76$ - И-недостаточность передавалась от матери. Наследственный дефицит ферментов в эритроцитах во всех случаях проявлялся в первом же поколении, у пяти пробандов дефект фермента удалось проследить в трёх поколениях»

Идентификацию нормальных и мутантных аллелей ГП проводили по кинетическим и физико-химическим свойствам фермента. Учитывая отсутствие методических рекомендаций для идентификации молекулярных вариантов ГП, критерии для дифференциации мутантных аллелей были выбраны по примеру прочих энзимопатий. Изучены электрофоре тиче екая подвижность, константы Михаэлиса в отношении глу-татиона и Ь -бутилгидроперекиси, термостабильность и рН-оптимум в нормальных и мутантных препаратах ГП. Молярные концентрации субстратов для .определения температурный режим для установления термостабильности фермента, а также подбор рН-среды для етрегъотмм определения рН-оптимума ^экспериментально. Ш выделяли и очищали из 12 образцов донорской крови и восьми образцов, полученных от лиц с дефицитом активности фермента и диагнозом гемолитическая анемия. Выделение и очистку ГП проводили по методу игегзШ X /зо/ с некоторыми изменениями. Модификация включала две дополнительные стадии очистки - сульфатаммонийное фракционирование после стадии колоночной хроматографии и препаративный электрофорез, ,

Во всех образцах донорской 1фови показаны два изофермента - быстро движущаяся ГП-А и медленная В-форма. Изучены для двух форм субстратов (Г-ЗН и ТВН), термостабильность и рН-оп-тимум отдельно для ГП-А и ГП-В в нормальных образцах. Показаны отличительные свойства изоферментов. А- и В-формы, кроме заряда, отличаются различным сродством к субстратам, разницей в термостабильности и рН-зависмости: ГП-А более термоустойчива и активна в щелочной среде (рН-оптимум для ГП-А - 9, для Ш-В - 8), а также обладает большим сродством к субстратам по сравнению с ГП-В для глутатиона ГП-А 4 мМ, ГП-В -41 мМ; для ТВН ГП-А -71/1 М, Ш-В - ЗОб^М).

В исследованиях учитывались возможные неточности или артефакты, в связи с чем проведены повторные опыш при определении наиболее существенных характеристик, широко применяемых для дифференцирования молекулярных вариантов - активность фермента, электрофоретическая подвижность и константы Михаэлиса в отношении субстратов. Наличие двух форм ГП, а также результаты , характеризующие ГП-А в нормальных образцах сравнимы с литературными данными /30/.

Идентификацию аномальных вариантов ГП проводили по свойствам фермента, выделенного из эритроцитов восьми человек с наследственным дефицитом ГП. Пробанды, в основном, дети от 5 до XI лет; шесть человек азербайджанцы, один тат, одна армянской национальности. Активность фермента в эритроцитах обследованных варьировала от 7,85 до 12,03 ед/г Нв. Анализ родословных показал во всех случаях наследственный характер дефицита. В четырёх случаях дефект фермента передавался от обоих родителей, в трёх от отца и в одном случае носителем мутантного гена была мать; в четырёх семьях установлена кровно-родственная связь между родителями. Обследование 17 сибсов пробандов показало у 58,8$ также низкую активность Ш.

Мутантные формы ГП идентифицировали по электрофоретической подвижности, константам Михаэлиса для глутатиона и перекиси, термостабильности и рН-зависимости. Сопоставляя свойства нормальных и мутантных образцов Ш, получили следующие результаты: в восьми аномальных образцах методом диск- электрофореза в ПААГе получили одну форму ГП, в трёх случаях фермент обладает высокой электрофоретической подвижностью (образцы 1,2 и 3); в этих же образцах показано низкое сродство к глутатиону при незначительных отклонениях от нормы величины Км (2,8-6,0 мМ) у остальных пробандов (колебания в отношении глутатиона в нормальных образцах 3,3-5,0 мйО.В пяти аномальных препаратах ГП (образцы 3,5,6,7,8) наблюдали более низкое сродство фермента к £-бутил-гидроперекиси ; величина (ТЕК) в образцах 1,2 и 4 составила 80, 74 и БОрМ, соответственно, при колебаниях Км для ТШ 60,6-80уЧМ в нормальных образцах. .

Результаты определения термостабильности мутантных препаратов ГП показали, что все образцы менее термоустойчивы, чем нормальные - 50% падение активности ферментов на 15 мин показано при 40°С, тогда как в нормальных образцах аналогичное снижение активности в тех же условиях наблюдали при 50°С.

Значения рН-оптимума во всех случаях приближаются к нормальным образцам; максимальная активность ферментов в трёх случаях (образцы 2,7,8) проявлялась в ' рН-среде 9, а в остальных -значение рН-оптимума колеблется от 8,5 до 9,5. Оптимальной об. .-ластью для нормальных образцов является область рН 9.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тургиева, Диляра Аскеровна, Баку

1. Бенедиктов И.Н., Аагинова Р.И. Определение частоты дефицита активности Г6ФД у коренного населения Азербайджана. "Проблемы гематол.11, М., 1974, J£1., с.55-56.

2. Бойтлер Э. Нарушение метаболизма эритроцитов и гемолитическая анемия. "Медицина", М., 1981.

3. Бочков Н.П. Прогресс в медицинской генетике. "Медицина1,1 М., 1978.

4. Ермильченко Г.В., Соловьева Н.П. Изучение частоты дефицита активности Г6ФД в крови у лиц из популяций Архангельской области. "Проблемы гематол.", М., 1973, ЛИ, с.23-26.

5. Идельсон Л.И., Дидковский H.A., Ермильченко. Гемолитические анемии. "Медицина", М., 1975.

6. Идельсон Л.И., Котоян Э.Р. Распространение дефицита активности эритроцитов среди населения Армении. "Проблемы гематол.", М., 1970, №2, с.39-44.

7. Инасаридзе Е.В. 0 распространении наследственности дефицита фермента Г6ФД в эритроцитах Грузинской ССР. В кн. Материалы 27-й научной сессии Грузинской НИИ гематологии и переливания крови. Тбилиси, 1975, с.38Ф-385.

8. Краснопольская К.Д., Мовсум-заде K.M., Сотников E.H. Закономерность распространения аллелей в Азербайджанской1. ССР."Генетика", 1980, №9.

9. Левин Г.С., Бахрамов С.М., Фарманкулов Х.К., Махмудова М.А.»Распространение гемоглобинопатии и дефицита Г6ФД эритроцитов среди некоторых областей Узбекской ССР. "Проблемы ге-матол.", 1974, JH0, с.26-29.

10. Лысенко А.Я., Абрашин-Нучков Р.Г., Аленсеева М.И. и др. Распространение наследственного дефицита активности Г6ФД эритроцитов в Азербайджанской ССР."Проблемы гематол.", 1973, MI,с.16-21.

11. Лысенко А.Я., Ермолин Г.А., Таджилсулов М.И., Андрианов А.Н. Первое обследование жителей Дагестана (аварцы) на наличие дефицита Г6ФД. В кн."Современные методы диагностики и терапии болезней крови". Под ред.Лысенко А.Я. М., 1977,с.II0-III.

12. Махмудова М.А. Клинико-лабораторная диагностика и гемогеография недостаточности Г6ФД эритроцитов в Узбекской ССР. Автореферат дис.канд.мед.наук. М., Ташкент, 1980.

13. Мехтиев Н.Х., Мовсум-заде K.M., ТУргиева Д.А. Частота распространения дефицита эритроцитарной глутатион-пероксидазы среди популяций Массалинского района Азербайджанской ССР. Материалы I Всесоюзного съезда гематологии. СССР, Баку, 1979.

14. Мехтиев Н.Х., Мовсум-заде K.M., Цаликова Т.П., Турги-ева Д.А., Аббаслы A.A. Активность глутатион-пероксидазы и Г6ФД эритроцитов человека. Деп.ВИНИТИ 9 июня 1980г., №228880.

15. Мехтиев Н.Х., Мовсум-заде K.M., Цаликова Т.И., Тургиева Д.А., Аббаслы A.A. Обратная коррелятивная связь между" ' \у' активностью глутатион-редуксазы, глутатион-пероксидазы. У1объединенный симпозиум биохимического общества СССР и ГДР.

16. Мехтиев Н.Х., Тургиева Д.А. Два случая наследственной недостаточности глутатио-пероксидазы эритроцитов человека. Изв.АН Аз.ССР, серия биологич.наук, 1981, ЖЗ, с.94-98.

17. Мовсум-заде K.M., Расулов Э.М., Аскерова Т.А. Исследование генетической гетеногенности Г6ФД недостаточности и талассимии в Азербайджанской ССР. Известия АН Аз.ССР, серия биологич.наук, 1980, №5.

18. Мовсум-заде K.M. Выживаемость носителей аллелей в условиях отсутствия малярии. Генетика, 1982, №7, с.1169-1172.

19. Мовсум-заде K.M., Расулов Э.М. Популяционно-генетичес-кая структура населения двух сел Таузского района Азерб.ССР. Изв.АН Азерб.ССР. Серия биологич. наук (в печати).

20. Розенфельд Е.Л. Молекулярные основы наследственных энзимопатий. 1У Всесоюзный биохимический съезд. Тезисы симпози-альных докладов. Из-во "Наука", М., 1979.

21. Салиев К.К., Саттарова Д.А. ,Чуканин Н.И. и др. Распространение недостаточности Г6ФД эритроцитов среда этнических групп населения ферганской долины. "Проблемы гематол.", 1977, №8, с.59-60.

22. Тадпев Т. Врожденные и приобретенные энзимопатии. М., "Медицина", 1980.

23. Токарев Ю.Н., Холлан С.Р., Корраля-Альмонте К.Ф. Наследственные анемии и гемоглобиопатии. Изд-во "Медицина", 1983.

24. Шатская Т.Л., Краснопольская К.Д., Захарова Т.В. Закономерность распространения аллелей в Азербайджане. Идентификация мутантных форм Г6ФД. "Генетика", 1978, №12,с.2217-2225.

25. Arnold H., Blume E.G., Loehr G.W. Glucose phosphate isomerase deficiency with congenital nonspherocytic hemolytic anemia: a new variant (Type Nordhorn) II. Purification and biochemical properties of the defective enzyme. Pediatr.Res.,1-74, 8,26-30.

26. Awasthi I.G.,Beutler E., Srivastova S.K. Purification and properties of human erythrocyte glutathione peroxidase.

27. J. Biol. Ghem." 1-75,N.3,250,5144-5149.

28. Awasthi Joseph., Dao Dat D., Kai Anjana K., Srivastava Satish K. Purification and properties of glutathione peroxidase from human placenta. "Biochem.J." 1979 N.2,177,471-476.

29. Baugham M.A., Valentine W.N., Paglia D.E. Hereditary hemolitic anemia assosiated with glucosephosphate isomerase (GPU) deficiency- a new enzyme defect of human erythrocytes. Blood,1968,32,236-249.

30. Beutler E., Blume K.G., Kaplan Y.G., Lohr B.,Ramot B., Valentine W.N. International committe of standardization in Haemotology: Recomended Methods for red cell enzyme Analysis. British J. of Haematology,1977,35,331.

31. Beutler E., Matsumote Ethnic variation in red cell, glutathione peroxidase activity. Blood,1975,1,46.

32. Beutler E.,Sigalova W.H., Muir W.A. et al. Glucosephosphate isomerase (GPI) deficiency: GPI eljiria. Ann.J.Hum.genet, 1975,27,62.

33. Beutler E., West C., Beutler B. Electrophoretic polymorphism of glutathione - peroxidase. Hum.genet. 1974,38,163.37« Beutler E., West G. Red cell glutathione peroxidase polymorphism in afro-americans. Am.J. Hum.Genet. 1974,26,255258.

34. Blume K.G., Busch D., Arnold H., Jochr G.W. Klinische Untersuchungen zur Hereditaeren Nichtspaerolytaeren Haemolytischen Anaemic bei Pyruvatkinasemangel der Erythrocytes Klin. Wochenschr. ,1971, 49, 228-230.

35. Board P.G., Peter D.W. A simple test for glutathione-peroxidase and slenum deficiency. Vet. Rec.,1976,99,144-145.

36. Boguslawska-Jarowska J., Kaplan J.C. A simple screening test for glutathione peroxidase activity in red cells. Clin.Chem. Acta, 1969,3,459-463.

37. Boivin P., Dematrial M.C., Galand C., Faradji M. Deffe-rens d'activité de la glutathione peroxidase erythrocytaire se Ion la sexe duz la souris et chez l'homme. Noew.Rev.Fr.Hematol, 1971,11,164.

38. Boivin P., Galand C., Hakim I., Blery M. Deficit eu glutathione-peroxidase erythrocyraise et anemia hemolytique médicamenteuse. Une nouvella observation Now. Press.Med.,78,1970, 78,171.

39. Boivin P., Galand 0., Hakim J., Roge J.,Cineroult N., Anemie hemolytique avec deficit glutathione-peroxidase chez un adulte. Enzymol. biol. Clin.,1969,10,68-80.

40. Bracci R., Calabri G., Bettim P., Princi P. Glutathione peroxidase in human leucocytes. Clin. Chem., Acta, 1970, 29(2) 345-348.45» Briggs G.E., Haldane J.B.S. A note on the Konetic of enzyme action. Biochem.J. 1925,19,338-339.

41. Bowman H.S., Mc. Kusick V.A., Dronamraju. K.R. Pyruva-tekinose deficient hemolytic anemia in anamish isolate. Am.J. Hum. Genet.,1965,17,1-S.

42. Carson P.E., Erischer H. Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency and related disorders of the pentose phosphate path way. Amer.Med.,1966,41,774-761.

43. Cecil R., Mc Phel J.B. A kinetic study of the reactions on some disulphides with sodium sulphite. Biochem.,J.,1955, 60,496-506.

44. Chin. Danny T.Y.,Tappel M.L. Purif. and prep, of rat lung soluble glutathione peroxidase Biochem.,Biophys. Acta,1-76, 3,445,558-566.

45. Christophersen B.O. Eormayion of monohydroxynolyenic fallyacids from lipid peroxides by a glutathione peroxidase. Biochem. biophys. Acta (anest) 1968,164,35-46.

46. Christopherseil B.O. Reduction of linolenie and hydroperoxide by glutathione peroxidase. Biochem. biophys. Acta, 1969,176,463-470.

47. Christophersen B.O. Reduction of X-rays-induced DNA and thymine hydroperoxides by rat liver glutathione peroxidase in ery. Biochem. biophys. Acta,1969,186,387-389.

48. Cohen G. Hochstein P. Glutathione peroxidase .The primary agent for the elemination of hydrogen peroxide in erythrocytes. Biochemistry. 1963,2,1420-1428.

49. Demus Oole At.,Swierczewski E. Glutathione peroxidase in rat liver during development I. Localisation and characterization of the Enzyme in the subcellular liver fractions of newborn and adult rat. Biol. Neonat. 1969,14,211-218.

50. Dixon M., Webb E.C. Enzymes p.63 off London: Longmans Green Co.,1967

51. Flohe L. Untersuchungen zur Glutathione peroxidase. Biochemische Diplomarbeit,Tübingen,1966.59* Flohe L. Die glutathione peroxidase: Enzymologie und bi biologische Aspekte. Kein. Wochenschrif.,1971,49,669-683.

52. Flohe L. Glutathione-peroxidase: fact and fiction. Oxygen free radicals and tissue damage. Simp. London 1978, Amsterdam,1979,95-113 Discuss , 113-122.

53. Flohe L., Brand J. Some hints to evoid pitfalls in quantitative determination of glutathione peroxidase (Ec.1.11.1 ) Klin.Chem. 1970,8,156-161.

54. Flohe L., Brand I. Kinetics of glutathione peroxidase. Biochem. biophys. Acta,1969,191,541-549.

55. Flohe L., Eisle B., Wehdel A. Glutathione-peroxidase I. Reindars-tellung and Molekulargewichtsbestimmungen. Hoppe-Seylers L. physio1. Chem. 1971,352,151-158.

56. Flohe L., Günzler W.ü., Schock H.H. Glutathione-peroxidase a selenoenzynie "FEBSZeft" 1973,^.1,132-134.

57. Flohe L., Günzler W., Lung G., Schaich E., Schneider F. Glutathion-Peroxidase II. Substratspezifität und Hemmbarkeit durch Substratanaloge. Hoppe: Seylers J.physiol. Chem.,1971,352, 159-189.

58. Flohe L., Löschern G., Günzler W.A., Eichele E. Glutathione peroxidase V. The kinetic mechanism Hoppe Seyler's Physiol. Chem. 1972,555,987.

59. Flohe L., Schleger W., Schleger E. Zur Frage der Identität von Glutathion-peroxidase aus Erythrocyten und Leber (Contraction Factor I) der Ratte Z. clin. chem. 1970,8,149-155.

60. Flohe L., Schaich E., Yoelter W., Wendel A., Glutathion-peroxidase III. Spektrare Gharacteristika und Versuche zum Reaktiousme-chanismus. Hoppe-Seylers. Z. physioih. Chem. 1971, 552,170-180.

61. Forstrom John, Lakowski Jack J., Tappel AI Z. Identification of the catalytic site of rat liver glutathione-peroxidaseas selenocysteine. "Biochemistry", 1978,17,15,2659-2644.

62. Forstrom J.W., Tappel AI Z. Donor substrate specificity and thiol reduction of glutathione disulfideperoxidase.

63. Galiazzo F., Quadro G., Margi C., Päse U. A study of some inhibitors of glutathione-peroxidase from rat liver. "LAB",1981,N.1 ,61-64.

64. Ganter H.E. Corcoran G. Selenotrisulfided II Gross linking of reduced pancreatic ribonoclease with slenium. Biochemistry, J., 1969,2557.

65. Ganter H.E., Oh S.H., Chitharangan D.,Hoekstra W.G. Studies on selenium in glutathione-peroxidase Fed. Proc.,1974, 33,694.

66. Gerli G.G., Beretta M., Blanchi A., Peläegatta A., Agostoni A. Erithrocyte superoxide dismutase,catalase and glu-tathio e peroxidase in^-thalassaemia. Scand.J. Haematol.,1980, 25,87-92.

67. Gharib H., Fairbanks V.F., Bartholomew L.A. Hepatic failure with acanthocyresis: association with hemolitic anemia and deficiency of erythrocyte glutathione peroxidase. Msyo. Glin. Prac., 1969,44,96

68. Gross R.T., Bracci R., Rudolph N., Schroeder E., Kochen J. A. Hydrogen peroxidase toxicity and detoxification in erythrocytes of new-born infants Blood, 1967,29,481-493.

69. Giinzler W Vergin H., Miiller J., Flohe L. Glutathione peroxidase 71. Die Reaktion der Glutathione peroxidase mit verschiedenen Hydroperoxiden "Hoppe-Seyler*s J. physiol. Cheiji." 1972, N.6,353,1001-1004.

70. Hochstein, Utley H. Hydrogen peroxide detoxication by glutathione peroxidase and catalase in rat liver homogenates. Molec. Pharmacol. 1968,4,574-57981. Hoekstra W.G et al Biochemical role of selenium in1.ace Element metabolism in animals 1974, V.2, 61.

71. Holmberg N.J. Purification gnd properties of glutathione peroxidase from bovine lens. Exp. Eye. Res.,1968,7,570-575»

72. Hopkins K., Tudhope G.P. Glutathione peroxidase in humai red cells in health and disease. Brit. J. Haematol. 1973,25, 563-569.

73. Jacob H.S., Jandl J.H. Effects of sulphydryl inhibition on red blood cells I. Mechanism of hemolysis J. Clin.y. noest, 1962,41,779-792.

74. Jacob H.S., Juglar S.H., Jandl T.H. Oxidative hemolysis and erythrocytes metabolism in hereditary acotalasia.

75. J. Clin. Invest. 1965,44,1187-1199.

76. Jacob H.S. Jandl J.H. Effects of sulphydryl inhibition on red blood sells III. Glutathione in the regulation of the hexose monophosphate #ath way. J.Biol.Chem. 1966,241,4243-4250.

77. Jagi Kunio, Kondo Naomi, Ohkawa Hiroshi,0hishi Nobuno. A simple med procedure for the purification of glutathione peroxidase from bovine erythrocytes."Bmochem.Int.n,1980,N. 3, 1,245-252.

78. Irgensen P.P., Hyldgaard, Jensen J.,Moustgaard J. Glutathione peroxidase activity in porcine blood. Acta,Vet. Scand.,1977,18,323-334.

79. Joshido Munchiro, Ywaku Kimikazu,Jasumoto Kyoden. Purification and immunochemical analysis of rat liver glutatione peroxidase. "Biol.Chem.",1982, N.1, 46,41-46.

80. Kelly Sally, Schedl Baure L. Glutathione peroxidose in dried blood spots. "Experiental" 1978,34,12,1560-1562.

81. Klayman D.L. Selenols and their derivatives excluding selee nides in Organic Selenium Compound Their. Chemistry and Biol. Klayman D.L. and Suhther H.H. Eds. Int. New-York.1973,157.

82. Kosower E.M. Kosower N.S. Gluthathione peroxidase:

83. Lin Tzong-Shim, Hultin H.O. Glutathione peroxidase of skaleted muscle. "J. Food. Biochem.",1978,N.1,2,39-47.

84. Little C. Steroid hydroperoxides as substrates for glu- ■ tathione peroxidase. "Biochem. et biophys. Acta", 1972,N.2,284, 375-381.

85. Little C., O'Brien P.I. Arch. Biochem.,1967,122,406.

86. Little 0., O'Brien P.I. An intracellular GSH-peroxi-dase with a lipid peroxide substrate. Biochem. biophys. Res. Com. 1968,31,145-150.

87. Little 0., OlineskuR., Reid K.G., O'Brien P.I. Properties and regulation of glutathione peroxidase. J.Biol.Chem., 1970,245,3632-3636.

88. Little C., Olinescu R.I., O'Brien P.I. Inhibition of glutathione peroxidase by coenzyme A. Biochem. Biophys.Res.Comm., 1970,41,287.

89. Loos, Roos D., Weening R., Houweri I., Familin deficiency of glutathione reductase in human blood cells.Blood,1976,1, 48,53-62.

90. Lyons D.E., Wilhelmsen E.C. Tappel A1 Z. Rapid,high -yield purification of rat liver glutathione peroxidase by high performace liquid chromatography. "J. Liquid Cromatgr.", 1981, N.1-1,4,2063-2071.

91. Mc Kenzie R.L., Rea. H.M., Thomson C.D.,Robinson PAD. Selenium concentration and glutathione peroxidase activity in blood .of new Lealand infants and children. Am.J.Clin.Natrition,1978, 31,1413-1418.

92. Mc.Kusick V.A. Mendelian Inheritance in man. Catalogs of autosomal domenant,autosomal recissive and x-linked phenotypes. Baltimore and London. The Johns Hopkins University. Press, 1975*

93. Michaelis L., Menten M.L. Kinetic der Invertin-Wirkung. Biochem. L., 1913,49,333-369.

94. Mills G.C. Hemoglobin catabolism I Glutathione peroxidase, an erythrocyte enzyme which protects Hemoglobin from oxidative breakdown. J. Biol. Chem., 1957,229,189-197.

95. Mills G.C. The purification and properties of glutathione peroxidase of erythrocytes. J. Biol. Chem., 1959,234,502-509.

96. Mills G.C. Glutathione peroxidase and destruction of hydrogen peroxidase in animal tissues. Arch.Biol.Biophys. 1960, 1,86-90.

97. Miwa S., Nakoshima K., Atijoshi D., Nemura U.,Mirachima IT., Emi I. • Heterozygons erythrocyte glutathione peroxidase deficiency associated with neonotal hyperbilirubinemia found in a Japanese family. Acta,Haematol.,Jap. 1974,37,266-271.

98. Miwa S., Nakashima K., Ariyoshi E. Four new pyruvate kiB se (PK) variants and a classical P.K. deficiency. Br. J. Haematol-*-, 1975,29,157-159.

99. Miwa S., Nakashima K., Tajiri M. Three cases in two fami lies with congenital nonsperocytic hemolytic anemia due to defective glucosephosphate isomerase: GPI Matsumoto. Acta.Haematol. 1 Jap. 1975, 38,238-247.

100. Miwa S., Nishina 0?. Studies of pyruvate kinase (PK) deficiency 1. Clinical,hematological and erythrocyte enzyme studies. Acta, Haematol. Jap.,1974,37,1-16.

101. Moser K. Die kongenitalen enzymo-plnischen hämolytischen Anämien. Wien.Clin.Wschr., 1969,81,249-258.

102. Mueller-Sayano A., De Roura E.T., Duke P.P. Pyruvate kinase deficiency and legulcers. Blood. 1976,47,807-815.

103. Nakamura Watary. Hosoda Syun, Hagashi Kazuko. Purification and properties of rat liver glutathione-peroxidase. "Biochem. et biophys. Acta", 1974, N.2,558,251-261.

104. Neheles T.F., Boles T.A., Erythrocyte glutathione peroxidase deficiency and hemolitic disease of newborn infant.

105. J. Pediatr., 1968,72,N.3,319-324.

106. Neheles I.E., Martin H., Steinberg H., Conneron D. Erythrocyte glutathione-peroxidase deficiency. Br.J. of Haemato-logy, 1970,19, N.5, 605-612.

107. Neheles I.E., Maldono law, Bacquet -Chadian A., Allen D Homozygous erythrocyte glutathione-peroxidase deficiency. Clinical and biochem. studies. Blood., 1969,33,N.2,164-169.

108. Nifca S., Olinescu R. Studies on the SH SH equilib-rim in biological median. The specificity of thiols as substrate of glutathione peroxidase in tissues. Reff.round.biochem. ,1974,4-, 277-282.

109. Oh Sang-Hwan, Ganther H.,Hoekstra W.G. Selenime as a component of glutathione peroxidase isolated from bovine blood. "Biochemistry", 1974,13,N. 9,1825-1829.126. Olinesku R.

110. Rev. round. Biochem. 1971,8,231.

111. Olinesku K., Nitas,Ababel L. Influince of hemoglobin on the properties of glutathione peroxidase. Rev.roum.Biochem.,1974, 1,11,61-70.

112. Paglia D.E., Paredes R., Valentine W.N., et al. Unique phenotypic expression of glucose phosphate isomerase deficiency. Am. J. Hum. Genet., 1975,27,62-70.

113. Paglia D.E., Valentine W.N. .Studies on the quantitative and qualitative characterization of erythrocyte glutathione -peroxidase."J.Lab.and Clin.Med.,1967,1,70,158-169.

114. Paglia D.E. Valentine W.N. Hereditory glucosephosphate isomerase deficiency. Am.J.Olin.Pathol.,1974,62,740-751.

115. Paneker N.V., Yyer G.Y.N. Erythrocyte catalase and detoxication of hydrogen peroxide. Canad.J.Biochem.,1965,43, 1029-1039.

116. Pamker N.V., Yyer G.J.N. Protective factors in the detoxication of hydrogen peroxide in erythrocytes. Canad.J.Biochem. 1969,47,405-410.

117. Paul R.G., In Boyer P.D. Lardy H., Myrback K: Peroxidases. The enzymes v.8, New-York-London. Academic Press, 1963, v.8,p.227-274.

118. Rooz Mooz E., Meister A. Tripeptide (glutathione) synthetase. Purification properties and mechanism of action. Biochemistry, 1967,6,1722-1734.

119. Rotilio G., Rigo A., Bracci R., Bagnoli P., Sargenti-ne I., Brunori M. Determination of red blood cell superoxide dismutase and glutathione peroxidase in newborns in relation of neonotal hemolysis. Clin.Chem. Acta, 1977,81,131-134.

120. Rotruck J.T., Pope A.L., Genther H.E., Swenson A.B., Hateman D.G., Hoekstra W.G, Biochemical role a component of glutathione-peroxidase. "Science". 1973,179,4073,588-590.

121. Sass M.D. Glutathione synthesis in cell-free preparations from erythrocytes of different ages. Clin.chem.Acta", 1968,22,207-210.

122. Saunders B.C., Holmes-Siede A.G., Stark B.P. Peroxidases. London: Butterworths. 1964.

123. Schmider F., Flohe L. Untersuchungen über Eigenschaften und Mechanismus der Glutathion: HgOg oxydoreduktase (E.C.1.11.1.9.) Hoppe-Seylers L. Physiol. Chem. 1967,348,12451250.

124. Schneider F., Flohe L. Untersuchungen über die Glutathione: H^Og oxjidoreductase (glutathione-peroxidase) Hoppe-Seylers L. physiol. Chem. 1967,348,540-552.

125. Schroeter W. Koch H.H., Wonneberger B. Kalinowsky W. Glucose phosphatate isomerace deficiency with congenital nous-pherocytic hemolytic anemia: a new variant (Type Nord horn) 1 Clinical and genetic studies. Pediatr. Res. 1974,8,18-25.

126. Schroeter W., Tillmann W. Membrane-localized pyruvate kinase of red blood cells in hemolytic anemia associated with pyruvate kinase deficiency. Klin.Wochenschr.,1975,Bd.53, 1101-1106.

127. Snoke J.E. Isolation and properties of yeast glutathione syntherase. J. biol. Chem.,1955,213,813-824.

128. Snoke I.W. Bloch K. in: Colowick S.,Lazarow A., Pa-cher F., Schwartz D.R., Stadtman E., Waeisch H. The Biosynthesis of glutathione. Glutathione. New-York. Academic Press. 1954, p.129-137.

129. Snoke I.E., Janari S. Synthesis of glutathione from y-glutamylcysteine. J.biol.Chem. 1953,201,573-586.

130. Srivastava S.K., Beutler E. The transport of oxidized glutathione from the erythrocytes of various species in the presence of Chromate. Biochem.J.,1969,114,833-837.

131. Srivastova S.K., Bentier E. Permeability of normal and glucose-6-phosphate dehydrogenase toglutathione. Biochem. biophys. Res. Commun., 1967,28,659-664.

132. Steinberg M., Bromer M.J.,Necheles T.F. Acute hemolitic anemia associated with erythrocyte glutathione peroxidase dificiency. Am.J.med., 1971,50,542-546.

133. Steinberg M., Necheles T.F. Erythrocyte glutatione peroxidase deficiency. Clinical and biochem. studies. Blood, 1969,33,164-170.

134. Stults. Purif. and character of rat liver glutathione peroxidase. Dissert, abstr.international. 1976,6,37.

135. Tanaka K.K., Paglia D.E. Pyruvate kenase deficiency. Semin. Hematol.,1971,8,367-395.

136. Tursz T., Bernard J.F., Werdier F., Boivin P. Sulphemoglobine et deficit en glutatione-peroxidase. Nouv.Press. Med.,1974,3,1487.

137. Van Biervliet i.P., Vlug A., Bartstro H.,Hotteveel i.i., G.A.M. de Vaan, G.E.Y. Staal. A new variant of glucosephosphate deficiency. Humangenetic. 1975,30,35-40.

138. Van Biervliet I.P.G., Van Clulligen-Boersma L.,Staal A.E.I. New variant glucose phosphate isomerase deficiency (GPI-utract). Clin.Chem. Acta, 1975,65,157-165.

139. Verschuer 0. Lehrbuch der Humangenetic Munich. Urban and Schwarzberg. 1959.

140. Wendel A., Flohe I. Yur permeabilität der Erythrocy-tenmembcsn für Glutathion. J.kin. chem., 1970,8,441.

141. Weber U., Harther P., Flohe I. Alkylmercantogruppen zum Schutz der SH-Fimktion des Cysteins II Thiol-Disulfid-Aus-tausch unsymmetrischer Disulfide des Cysteins. Hoppe-Scylers L. Phusiol. Chem. 1970,351,1389-1394. .

142. Walter R., Schlesinger D.H.,Schwartz L.L. Chromatog-graphic Separation of isolongs sulphur and selenium containing amino acids. Reductive scisson of the selenium-selenium bond by mercaptans and selenols. Anal.Biochem. 1969,27,231.

143. Wijnen L.M.M., Monteba-van Heuvel M., Pearson P.Lp, Meera Khan P. Assignment of a gene for glutathione peroxidase to human chromosome 3. "Cytogenet. and Cell Genet." 1978, N.1-6, 22,232-235.