Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Апоптоз и оксид азота в регенерации травмированной слизистой оболочки верхнечелюстного синуса
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология
Автореферат диссертации по теме "Апоптоз и оксид азота в регенерации травмированной слизистой оболочки верхнечелюстного синуса"
На правах рукописи
ЕДРАНОВ Сергей Сергеевич
АП0ПТ03 И ОКСИД АЗОТА В РЕГЕНЕРАЦИИ ТРАВМИРОВАННОЙ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ВЕРХНЕЧЕЛЮСТНОГО СИНУСА
03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук
9 ЯНВ 2014
Владивосток - 2013
005544379
Работа выполнена на кафедре гистологии, эмбриологии и цитологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Научный консультант:
доктор медицинских наук, профессор Мотавкин Павел Александрович Официальные оппоненты:
Швалев Вадим Николаевич, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздрава России, профессор-консультант, ведущий научный сотрудник.
Тимошин Сергей Серафимович, доктор медицинских наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Дальневосточный государственный медицинский университет» Минздрава России, заведующий Центральным научно-исследовательским объединением.
Пущина Евгения Владиславовна, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт биологии моря им. В.А. Жирмунского» Дальневосточного отделения РАН, старший научный сотрудник лаборатории цитофизиологии.
Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова» Минздрава России
Защита состоится «о? » оя _2014 года в «. -/О _» часов на заседании диссертационного совета Д 208.007.01 при ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Минздрава России (690950, г. Владивосток, пр-т Острякова, 2). Тел.: (423) 242-97-78; факс: (423) 245-17-19, электронный адрес: mail@vgmu.ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» (690950, г. Владивосток, пр-т Острякова, 2).
Автореферат разослан « .11» М _ 2013 года
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, доцент
/Н.Ю. Матвеева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Нарушение целостности верхнечелюстного синуса является широко распространенной самостоятельной патологией, сопровождающей, в силу анатомических особенностей строения, различные типы переломов костей скуло-орбито-верхнечелюстного комплекса (Зуев В.П., Гусев Э.П., 1988; Трунин Д.А., 2001). Так, при проведении имплантации на верхней челюсти с поднятием дна гайморовой пазухи возникают две проблемы: с одной стороны - воспаления верхнечелюстной пазухи после синус-лифтин-га, которое регистрируется в 3-20% случаев (Maksoud М.А., 2001; Schwartz-Arad D., 2004), а с другой - патология околоносовых пазух, которая ограничивает показания к данной операции (Costa F. et al., 2007). Исследования на экспериментальной модели показали структурную перестройку эпителия пазухи после репарации. Однако, объяснить это лишь прямым травматическим повреждением тканей не возможно, так как в процесс перестройки вовлекались клетки, расположенные на значительном расстоянии от перелома.
Современная концепция патогенеза травматического повреждения рассматривает два основных взаимосвязанных механизма гибели клеток: апоптоз и некроз (Ярилин A.A., 1998; Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю., 2001; Пальцев М.А., 2002; Калиниченко С.Г., Матвеева Н.Ю., 2007; Sloviter R., 2002; Marretta R.M., Ales F., 2010; Khoury M.P., Bourdon J.C., 2011). Понимание этих процессов исторически происходило не одновременно. Начиная с работ Вирхова (1859), было проведено детальное морфологическое описание смерти клетки, названной некрозом, под которым понимали необратимые изменения тканей (см. Серов В.В., 2001). По мере развития гистологических методов исследования, позволивших описывать детали процесса клеточной гибели, стало ясно, что некроз представляет собой не одномоментный, а растянутый во времени процесс. В 1885 г. Флеммингом был описан хроматолиз - процесс быстрого исчезновения образовавшихся при распаде клеток фрагментов ядра (Flemming W., 1885). Позднее Вейгерт ввел термины аутолиз, пикноз и кариолизис (Weigert К., 1890). Со временем стали появляться гипотезы о существовании естественного механизма смерти клеток, позволяющего поддерживать качественные и количественные показатели клеточных популяций на оптимальном, генетически детерминированном уровне. Подобный механизм элиминации клеток детально описал Глуксман в середине прошлого века (Gluksmann А., 1951), но только в 70-х годах в работах Керра было впервые введено понятие программированной гибели клеток или апопто-за (Kerr J.F. et al., 1972).
Изучение апоптоза при травматическом повреждении и регенерации слизистой оболочки является перспективным и с точки зрения возможности влияния на патологический процесс (Khoury М.Р., Bourdon J.C., 2011).
В то время как некроз представляет собой необратимую гибель клетки, смерть в результате апоптоза на определенных этапах может быть задержана или предупреждена (Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю., 2001). Поэтому особую актуальность приобретают исследования механизмов активации
апоптоза, его временного и пространственного распространения в клеточной популяции ткани.
Оксид азота (N0), обладая широким спектром регуляторного, фармакологического и токсического действия влияет на процессы клеточной смерти, физиологической и репаративной регенерации. N0 является одним из главных факторов клеточной сигнализации и межклеточного взаимодействия. Он участвует в регуляции тонуса сосудистой стенки, угнетает агрегацию тромбоцитов и их адгезию к клеточной стенке, стимулирует ангиогенез, обладает цитотоксическим действием, участвуя таким образом в противомикробном, противовирусном и противоопухолевом иммунитете. В зависимости от условий NO может активировать или подавлять апоптоз, избирательно воздействуя на определенные типы клеток (Калиниченко С.Г., Матвеева Н.Ю., 2007; Choi В.М. et al., 2002).
Вместе с тем нельзя исключить и нейрогенные влияния, неизбежно возникающие при травме стенок гайморовой пазухи. В случае перелома, верхняя челюсть с костями носа отламывается от скуловых костей. В результате этого травмируются подглазничный и верхний альвеолярный нервы, что проявляется нарушением всех видов поверхностной чувствительности и встречается в 100% случаев при данном поражении (Крюков К.И., 2005).
Повреждение чувствительной иннервации вызывает в тканях нейроди-строфические изменения (Григорьева Т.А., 1951), явления воспалительного характера, нарушение морфо-функциональной специфичности клеток, их некроз и апоптотическую гибель (Князев Г.Г., 1992).
Установлено, что начальный период апоптоза при деафферентации индуцируется экспрессией фактора роста нервов, который при взаимодействии с рецептором р75 запускает механизмы клеточной смерти (Banasiak K.J. et al., 2000). Необратимую активацию этого процесса при перерезке нервов опосредуют проапоптотические ферменты - эффекторные каспазы и р53 (Li C.Q. et al., 2002).
Так, при деафферентации слухового нерва апоптоз нейронов слуховых ядер отмечается уже в первые сутки после нанесения травмы (Матвеева Н.Ю. и др., 2006), а перерезка зрительного нерва у мышей активирует апоптоз более 90% популяции ганглиозных нейронов сетчатки (Калиниченко С.Г., Матвеева Н.Ю., 2007). Менее известны механизмы программированной гибели клеток в ответ на деафферентацию периферических нервов.
С этих позиций приобретают особую актуальность данные, характеризующие роль апоптоза и оксида азота при деафферентации и в посттравматической репарации слизистой оболочки.
Цель настоящей работы состояла в установлении роли апоптоза и оксида азота в репаративных процессах травмированной слизистой оболочки верхнечелюстного синуса.
В работе решались следующие задачи:
1. Создать экспериментальную модель деафферентации средней зоны лица и верхнечелюстного синуса на лабораторном животном - белая крыса;
2. Исследовать топографию конститутивной и индуцибельной изоформ NO-синтазы (NOS) и NADPH-диафоразы (NADPH-d) в слизистой оболочке гайморовой пазухи у человека и крысы в норме и на разных этапах регенерации;
3. Дать оценку клинико-морфологическим изменениям при репарации верхнечелюстного комплекса у человека после травмы и установить их связь с динамикой распространения апоптоза;
4. Исследовать качественные и количественные характеристики апоптоза клеток слизистой оболочки верхнечелюстного синуса при деафферентации и механическом повреждении у крыс;
5. Установить топографию и распределение Вс1-2- и р53-иммунореактивных клеток на разных этапах регенерации слизистой оболочки у человека и крысы;
6. На основе полученных результатов и данных литературы представить обобщенную модель взаимоотношений NO-синтезирующих, про- и антиапопто-тических факторов при травме и воспалении поврежденной слизистой оболочки;
7. Обосновать закономерности развития апоптоза и механизмов цитотокси-ческого и протективного действия оксида азота в репарации слизистой оболочки верхнечелюстной пазухи.
Научная новизна. В настоящей работе проведено комплексное исследование топографии и активности NO-синтезирующих ферментов и факторов апоптоза в поврежденной слизистой оболочке верхнечелюстного синуса человека и крысы.
Впервые продемонстрированы клинико-морфологические критерии и стадии репарации скуловерхнечелюстного комплекса у человека на разных сроках после травмы и неправильно консолидированного перелома.
Впервые представлена экспериментальная модель деафферентации средней зоны лица и верхнечелюстного синуса.
Впервые установлен феномен апоптоза клеток слизистой оболочки верхнечелюстного синуса при деафферентации и экспериментальной травме костей черепа у крысы.
Впервые изучена динамика NADPH-диафоразы и индуцибельного изо-фермента NO-синтазы в клетках слизистой оболочки и проведен сравнительный анализ изменений, связанных с их апоптозом при хроническом риноси-нусите у человека.
Впервые исследована связь апоптоза с механизмами цитотоксического и протективного действия оксида азота в период восстановления слизистой оболочки после травмы.
Теоретическое и практическое значение работы. Изучены топография и активность нитроксидсинтезирующих ферментов и факторов апоптоза в условиях репаративной регенерации слизистой оболочки верхних дыхательных путей и полости рта для выяснения роли модулирующих цитопротективных и цитотоксических эффектов и обоснования рациональной терапии стоматологических заболеваний.
Создана адекватная экспериментальная модель деафферентации верхнечелюстного синуса, имеющая реальные перспективы для дальнейших исследований в стоматологии и отоларингологии, разработки новых патогенетически ориентированных программ терапии острого и хронического синуситов, а также рекомендаций по реабилитации пациентов после травм костей лицевого черепа, гайморотомии, реконструктивных операций на средней зоне лица, в том числе дентальной имплантации и синуслифтинга.
Степень достоверности и апробация результатов. Степень достоверности результатов проведенного исследования определяется соответствием его дизайна критериям доказательной медицины, анализом репрезентативных выборок, достаточным объемом наблюдений с использованием современных разноплановых методов исследования. Примененные статистические методы адекватны поставленным задачам, а сформулированные положения, выводы и практические рекомендации аргументированы и логически вытекают из анализа полученных данных
Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Тихоокеанских научно-практическая конференциях ВГМУ (Владивосток, 2004,2005, 2006, 2007, 2008), Приморских краевых ежегодных конференциях «Хирургия лица» (2006, 2007, 2008), имплантологических коференцих «Восток-Запад» (Владивосток, 2010, 2011), «Должановских чтениях» (Воронеж, 2011), IV научной конференции «Микроциркуляция в клинической практике» памяти проф. В.В. Куприянова, (Москва, РУДН, 2012).
Положения, выносимые на защиту:
1. Травматические и деафферентационные повреждения верхнечелюстного синуса вызывают селективные морфологические и цитохимические альтерации клеток различных слоев слизистой оболочки;
2. Апоптоз является постоянным компонентом вторичного повреждения слизистой оболочки и имеет специфическую динамику на разных стадиях хронического воспаления;
3. Динамика изменения Т1ШЕЬ-иммунореактивных клеток, а также локализация ИАБРН-диафоразы и индуцибельной ЫО-синтазы в слизистой оболочке верхнечелюстного синуса видоспецифичны и зависят от этиологии повреждающего фактора.
4. Репаративные и цитотоксические процессы в слизистой оболочке обусловлены кооперативным взаимодействием различных популяций N0-синтезирующих, р53- и Вс1-2-иммунореактивных клеток.
Публикации результатов работы. По теме исследований опубликована 1 монография и 30 научных работ, (в том числе 13 в журналах, включенных в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертации на соискание ученой степени доктора и кандидата наук», входящих в международные базы цитирования).
Работа выполнена на кафедре гистологии, эмбриологии и цитологии ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет». Все экспериментальные данные получены автором лично или при его непосредственном участии. Отдельные этапы работы выполнялись в содружестве с сотрудниками НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова СО РАМН, сотрудниками ЦНИЛ и кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии Тихоокеанского государственного медицинского университета.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 165 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, двух глав, отражающих результаты собственных исследований и их обсуждение, заключения и выводов. Список литературы содержит 390 источников (103 отечественных и 287 зарубежных авторов). Диссертация иллюстрирована 102 рисунками и 10 таблицами.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Характеристика объектов исследования. Все исследования выполнены согласно правилам этического комитета Тихоокеанского государственного медицинского университета.
Основной раздел работы составили экспериментальные исследования, выполненные на материале 125 нелинейных крыс-самцов массой 250-300 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария. Изучали состояние N0-синтезирующих энзимов, молекулярных анти- и проапототических факторов и динамику апоптоза в слизистой оболочке верхнечелюстного синуса у крыс при травме костей лицевого отдела и перерезке верхнечелюстного нерва на 1, 3, 7, 14 и 21-е сутки. Контролем служили интактные животные. Операции проводились под общим неингаляционным обезболиванием, для исключения раздражающего действия наркотизирующего препарата на респираторную слизистую оболочку (табл. 1). Животных анестезировали с помощью внутри-брюшинного введения пентобарбитала (60 мг/кг).
Материал слизистой оболочки верхнечелюстных пазух человека получали в ходе операционного вмешательства по поводу реконструкции скуло-верхнечелюстного комплекса после свежей травмы и неправильно консолидированного перелома на разных сроках. Кроме того, исследовали 37 образцов биопсий от 11 больных с диагнозом «гнойно-полипозный хронический ри-носинусит». Контрольную группу составили здоровые лица, не имевшие в анамнезе ЛОР-патологии. Материал в контрольной группе забирали при проведении операции по поднятию дна гайморовой пазухи (синуслифтинг) при
Таблица 1
Количество наблюдений, выполненных по сериям экспериментов различными методами
Объект исследования Кол-во наблюдений, абс. Всего, абс.
NADPH-d iNOS Р53 Bel-2 TUNEL
Травма ВЧС* (крыса) 15 10 10 10 15 60
Деафферентация (крыса) 12 11 10 12 10 55
Хр. риносинусит (человек) 3 4 - - 4 11
Травма ВЧС (человек) 2 3 - - 2 7
Контроль (крыса) 2 2 2 2 2 10
Контроль (человек) 1 1 1 1 1 5
* ВЧС - верхнечелюстной синус.
ее непреднамеренном разрыве (табл. 1). Гисто- и иммуноцитохимическое исследование начинали не позднее 3-6 часов после извлечения материала.
Методы исследования. При моделировании травматического перелома верхнечелюстного синуса животным на фоне анестезии наносили однократную компрессию в подглазничной области зажимом типа Бильрот без повреждения целостности кожных покровов. Для подтверждения однотипности наносимой травмы животным, участвующим в эксперименте, использовали методы расчета прикладной механики: аналитическое определение перемещений и напряжений при изгибе. Наносимая в эксперименте травма, для всех животных, являлась однотипной и усилие компрессии составляло 2,4 кг. Для диагностики перелома использовали метод визиографии с помощью рентгеновского аппарата Evolution X 3000 2С фирмы Asepti с компьютерным датчиком Schick. У травмированных животных в горизонтальной проекции определялись множественные повреждения костей лицевого отдела: перелом наружной стенки пазухи, перелом скуловой кости и дуги, перелом верхней челюсти с изменением конфигурации подглазничного канала и компрессией п. infraorbitalis.
Экспериментальная травма верхнечелюстного нерва. Вызванные в результате деафферентации нейротрофические расстройства моделировали односторонним пересечением верхнечелюстного нерва в месте его выхода из полости черепа в крыловидно-небную ямку. Для этой цели выбирался участок нерва расположенный за скуловой костью в подглазничной борозде. Оперативный доступ выполнялся на участке верхнего этажа преддверия полости рта от скуловой уздечки до последнего верхнего моляра. При помощи специально изготовленного крючка с плоской заточкой, изгибом по отношению к оси % и диаметром изгиба 3 мм, тупым путем раздвигалась клетчатка и в рану выводился верхнечелюстной нерв. При разделении нерва на центральный и периферический отрезки крючок самопроизвольно освобождался. Операционная
рана обрабатывалась раствором слабого антисептика, в качестве повязки использовалась кератопластическая мазь. Общее время операции, без учета введения в наркоз, составляла 30-40 с.
Гистохимия NADPH-диафоразы. Гистохимическая реакция локализации активности нейрональной NADPH-диафоразы (NO-синтазы) основана на образовании формазана в присутствии экзогенного NADPH (Норе В.Т. et al., 1991; Dinerman J.L. et al., 1994).
Слизистую оболочку извлекали на стекло и фиксировали 1 час при температуре 4°С в 4% растворе параформальдегида, приготовленном на 0,1 M Na-фосфатном буфере (рН 7,4), после чего промывали в 15% растворе сахарозы в течение 2 суток с 7-8-кратной сменой раствора. Срезы толщиной 15-20 мкм изготавливали в криостате, монтировали на предметные стекла и высушивали в токе холодного воздуха, подаваемом вентилятором. Высушенные срезы помещали в инкубационную среду и термостатировали 1 час при 37 °С. Состав инкубационной среды: 50 мМ Трис-буфер, 0,2 % Тритон Х-100 (Sigma), 0,8 мг/мл (3-NADPH (Sigma), 0,4 мг/мл НСТ; рН 8,0 (Hope В.Т., Vincent S.R., 1989). После инкубации срезы троекратно промывали в дистиллированной воде, обезвоживали в спиртах и заключали в бальзам.
Иммуноцитохимия iNOS, р-53 и Bcl-2. Локализацию активности индуци-бельной формы NO-синтазы (iNOS) выявляли с использованием монокло-нальных антител (Sigma) и набора реактивов для иммунопероксидазной реакции (Immuno-detection kit, ICN). Участки слизистой оболочки размером 0,5x1 см фиксировали в течение суток при 4°С в 10% нейтральном формалине. Из залитого в парафин материала изготавливали срезы толщиной 10 мкм. Депарафинированные срезы промывали в течение 5 мин в трис-НС1-буфере (рН 7,6) и в течение 20 мин обрабатывали смесью 50 % этанола и 0,3 % перекиси водорода для блокирования неспецифического фона эндогенной пероксидазы.
Инкубацию с первичной антисывороткой (Sigma), разведенной в отношении 1:500, проводили при комнатной температуре во влажной камере в течение 30 мин. После промывки срезов трис-буфером (5 мин) наносили вторичные антитела (Immuno-detection kit) и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Далее образцы повторно промывали трис-буфером и на 10 мин переносили в раствор следующего состава: 3 мл трис-буфера (рН 7,6), 50 мкл 3 % перекиси водорода и 1 мг 3,3-диаминобензидина тетрагидрохлори-да. Затем срезы тщательно отмывали в трис-буфере, монтировали на предметные стекла, обезвоживали и заключали в бальзам по общепринятой методике.
Для иммуноцитохимической идентификации Вс1-2 и р-53 срезы инкубировали в течение 9 часов при комнатной температуре с кроличьими поликло-нальными первичными антителами против Bcl-2 (Chemicon) и мышиными моноклональными антителами против р-53 (Chemicon), разведенными в отношении 1:200 в фосфатном буфере, и нормальной сывороткой козы. После промывки срезы в течение 1 часа инкубировали в растворе соответствующих био-тинилированных вторичных антител, выработанных у козы при разведении
1:100 (Vector Laboratories), а затем в растворе авидин-пероксидазного комплекса (Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories BA-2000) в течение 1 часа. Обработку заканчивали выявлением пероксидазы ABC-комплекса с помощью 0,03 % раствора диаминобензидина и 0,01 % перекиси водорода в течение 10-20 мин. Затем срезы обезвоживали и заключали в бальзам по обычным правилам.
Иммуноцитохимическая идентификация апоптоза методом TUNEL. Метод TUNEL (terminal deoxynucleotidil transferase-mediated dUTP nick end-labeling) дает неплохие результаты по избирательному выявлению апоптотических клеток, имеющих признаки фрагментации ДНК (конденсированный хроматин, пикноз, кариорексис), основанного на выявление фрагментированных цепочек ДНК. Деградация ДНК сводится к образованию межнуклеосомных фрагментов, содержащих примерно 180 пар нуклеотидов. Подобные фрагменты содержат большое количество свободных З'ОН-групп, которые при взаимодействии с реагентами TUNEL связываются с дигоксигенин-нуклеотидами, образующими маркерный продукт иммуноцитохимической реакции.
Образцы слизистой оболочки погружали в 4% раствор параформальде-гида, приготовленного на 0,1М фосфатном буфере (рН 7,4) и фиксировали в течение 3-4 часов при 4°С. После фиксации материал промывали в течение суток вОДМ фосфатном буфере (рН 7,4) с 7-8-кратной сменой раствора, а затем погружали в 15% забуференный раствор сахарозы. Срезы толщиной 20 мкм изготавливали на криостате, дополнительно фиксировали в охлажденном растворе этанол-уксусной кислоты в течение 5 мин при -20 °С, после чего промывали дважды по 5 мин в фосфатном буфере. Для выявления TUNEL-окрашенных структур использовали набор реактивов ApopTag® Direct In Situ Apoptosis Detection Kit (Chemicon). После отмывки первичных антител препараты погружали в раствор коньюгированного с пероксидазой антидигокси-генина, приготовленный в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. В качестве хромогена использовали раствор Vector NovaRed substrate (Vector Laboratories). Ядра клеток докрашивали 1% раствором метилового зеленого. Срезы обезвоживали, просветляли в ксилоле и заключали в бальзам. Часть срезов инкубировали в растворе Бар-фрагмента вторичных антител свиньи против иммуноглобулинов кролика, конъюгированных с FITC (Dako) в разведении 1:100. Срезы промывали в фосфатном буфере, монтировали на предметные стекла, заключали в глицерин и просматривали в фильтре FITC-типа (В1 450-490 нм) через микроскоп Polyvar.
Электронномикроскопическое исследование слизистой оболочки верхнечелюстного синуса проводили по стандартной прописи. Перфузировали 2,5 % раствором холодного глутаральдегида с последующей обработкой участков слизистой оболочки в растворе четырехокиси осмия, обезвоживали в спирте восходящей крепости, ацетоне и заливали в Эпон-812. Кроме того, для улучшения качества материала и выявления ультраструктурных особенностей были применены несколько методик обработки ткани (двойная фиксация 3 % глютаральдегидом и 1 % четырехокисью осмия, только 1 % четырехокисью
осмия, с каждым фиксатором две модификации буфера - 0,15М фосфатный и 0,1М какодилатный, с добавлением сахарозы). Срезы готовили на ультратоме LKB-3, контрастировали в 2% спиртовом растворе уранилацетата и свинца. Препараты просматривали под трансмиссионным электронным микроскопом JEM-100B при увеличении от 4000 до 150000 и ускоряющем напряжении 80 кВ.
Для количественной оценки результатов исследования в каждом гистохимическом препарате выбирали срез стандартной толщины. Препараты изучали с помощью светового микроскопа Cari Zeiss, в окуляр которого была вставлена сетка с равновеликими квадратами, позволяющая подсчитать все клетки слизистой оболочки, прореагировавшими с субстратами инкубационной среды. Содержание позитивно окрашенных элементов определяли как разность между суммой клеток, окрашенных толуидиновым синим, и суммой клеток, выявляемых при окрашивании на NADPH-d, iNOS, Bcl-2 и р-53.
Визуализацию изображений всех микропрепаратов на компьютере получали с помощью видеосистемы, смонтированной на микроденситометре Vickers М-85. Цифровую обработку изображений проводили с помощью программ Adobe Photoshop CS5 и Microsoft Excel 2010. Активность NADPH-d определяли по плотности гистохимического преципитата и выражали в единицах оптической плотности (ЕОП).
Подсчет TUNEL-позитивных ядер клеток слизистой оболочки проводили с помощью окуляр-морфометрической сетки на участках слизистой оболочки размерами 100x100 мкм. Апоптотический индекс (АИ) определяли как отношение общего числа TUNEL -позитивных ядер (Njunel) к количеству клеток, окрашенных толуидиновым синим и имеющих видимое непикнотизирован-ное ядро (NT), по формуле: АИ = (NtunelX 100)/Nt.
Статистическую обработку данных по распределению TUNEL-, Bcl-2-, p-53-, iNOS- и NADPH-d-позитивных клеток проводили с применением профессионального пакета Biostat, который включал вариационную статистику, определение t-критерия Стьюдента, линейный корреляционный анализ (Автандилов Г.Г., 1990). Числовые данные представлены как средняя и ее ошибка (М±т).
Результаты исследования и их обсуждение
В спектре эндогенных и экзогенных факторов, влияющих на жизнеспособность клеток при травмирующем воздействии, апоптозу отводится решающая организующая роль. Апоптоз запускается в момент травмы как механизм отсроченного вторичного повреждения ткани и представляет собой физиологическую гибель клеток, необходимую для обновления клеточного пула органов, дифференцировки и развития (Пальцев М.А., 2002; Barrett G.L., 2000). Апоптоз предохраняет ткани от возможных последствий при сублетальных повреждениях, недостаточных для прямого уничтожения клетки путем некроза (Ярилин А.А., 1998; Sloviter R., 2002). При таком слабом повреждении избирательное уничтожение небольших клеточных популяций способствует оздоровлению органа. Однако если незначительные альтерации охватывает
обширные очаги повреждения, например, при гипоксии или ишемии, то апоп-тоз превосходит по своей силе репарационный потенциал ткани и фактически способен «выключать» поврежденную зону или весь орган (Dubikov A.I., Kalinichenko S.G., 2010). Многочисленные исследования последних лет показали, что часто именно апоптоз, а не некроз, лежит в основе инфаркта миокарда, острой почечной недостаточности, инсульта, травмы головного мозга и других заболеваний, связанных с высокой смертностью; апоптоз обычно развивается при действии менее сильного повреждающего фактора, который запускает внутренние энергозависимые механизмы самоуничтожения клетки (Симоненко В.Б. и др., 2000; Скворцова В.И., 2001; Серов В.В., 2001; Новицкий В.В. и др., 2008; Oppenheim R.W., 1999).
В неповрежденной клетке процесс апоптоза находится под строгим генетическим контролем. Апоптоз развивается в результате взаимодействия различных трофических факторов и инициируется генной индукцией, меняющей метаболические условия ближайшего микроокружения (Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю., 2001). Одним из участников реализации программы гибели клетки является семейство белков Вс1-2, в состав которого входят ингибиторы и активаторы апоптоза. К числу активаторов принадлежат такие протеины как Ьах, bak, bcl-xS; ингибиторов - bd-xL, bd-2, Md-1 (Калиниченко С.Г., Матвеева Н.Ю., 2007; Zhou F. et al., 2011). Bcl-2 блокирует митохондриальный путь запуска апоптоза путем гетеродимеризации с белком Ьах, который при этом утрачивает свою активность. Вах способствует выходу из межмембранного пространства митохондрии в цитозоль клетки цитохрома С, что приводит к активации цистеино-вых протеаз - каспаз, которые в свою очередь вызывают лизис клеточных белков и опосредуют фрагментацию ДНК (Lindsay J. et al., 2011).
NO-ергические механизмы апоптоза при экспериментальной травме и деафферентации слизистой оболочки верхнечелюстного синуса
Согласно нашим наблюдениям травмирование костей черепа, повреждение целостности максиллярного нерва у крыс или хронический риносинусит у человека вызывает ярко выраженную апоптотическую реакцию со стороны клеток слизистой оболочки верхнечелюстного синуса. При односторонней перерезке верхнечелюстного нерва TUNEL-позитивные клетки превалировали в эпителиальном слое постепенно «смещаясь» в глубокие отделы слизистой оболочки (табл. 2). В поздние сроки эксперимента основное большинство маркированных клеток локализуются в подслизистой основе, где они концентрируются, главным образом, в периваскулярных пространствах. Интенсивная флюоресценция ядер апоптотических клеток, окрашенных с помощью метода TUNEL, показывает признаки фрагментации ДНК. Последние выглядят как флюоресцирующие точки (апоптотические тельца), которые сливаясь, образуют кольца, полукольца, а также сплошные однородные конгломераты. Они локализуются на месте расположения ядра, равномерно распределяются в цитоплазме, смещаются к цитоплазматической мембране, либо группируются у
Таблица 2
Апоптотический индекс клеток слизистой оболочки максилярной пазухи крыс при односторонней деафферентации
Структура* Срок эксперимента, сутки Контроль
1 3 7 14 21
Эпителий 300,5±29,9 116,8±42,1 89,2±24,1 59,6±18,5 38,5±22,6 -
Клетки СП 53,9±5,9 49,1 ±9,4 92,4±11,2 108,б±32,1 33,1±9,1 -
Клетки ПС 26,6±2,5 77,8±12,3 88,1 ±5,9 55,8±13,4 47Д±11,6 -
* СП - собственная пластинка (слизистой оболочки), ПС - подслизистый слой.
Таблица 3
Динамика распределения р53- и Вс1-2-иммунореактивных клеток в слизистой оболочке верхнечелюстного синуса крысы после деафферентации
Структура Маркер Интенсивность реакции по дням, ЕОП
1 3 7 14 Контроль
Эпителий 57,8±2,1 7б,2±4,1 29,0±3,0 18,0±2,6 0
СП р53 42,0±4,0 89,2±4Д 59,6±3,5 38,5±2,0 0
ПС 84,0±2,0 97,0±2,1 137,0±3,8 176,0±2,6 14,0±2,9
Эпителий 35,0±2,9 67,0±4,2 83,0±1,3 103,0±2,6 12,0±3,1
СП Вс1-2 63,0±2,1 89,2±2,1 59,6±1,5 38,5±2,0 7,4±2,9
ПС 24,0±4,2 32,0±2,4 27,0±2,2 17,0±2,0 11,0+2,1
одного из полюсов клеточной сомы. В подслизистой основе отмечается флюоресценция ядер единичных фибробластоподобных клеток, формирующих скопления или кластеры.
Топография Т1ЖЕЬ-позитивных элементов существенно дополнялась распределением р53- и Вс1-2-позитивных элементов, локализация которых не совпадала и зависела от срока нанесения травмы. В 1-е сутки эксперимента единичные р53-иммунореактивные клетки выявлялись в эпителиальном слое. Затем их количество начинало увеличиваться, достигая максимума на 14-21-й день после травмы. Картина распределения Вс1-2-иммунореактивных клеток имела противоположную тенденцию. В 1-3-и сутки они обнаруживаются практически повсеместно, с преимущественной локализацией в эпителилаль-ном слое и периваскулярных пространствах подслизистой основы. В позднем периоде после перерезки верхнечелюстного нерва их локализация существенно не менялась, однако интенсивность иммунореактивности значительно по-вышлась в подслизистом слое (табл. 3). Можно полагать, что экспрессия Вс1-2 в отсроченный период деафферентации лимитирует количество апоптотиче-ских клеток, создает благоприятный фон для пролиферации, выживания и активного функционирования соответствующих слоев слизистой оболочки.
Как известно, активация р53 дает мощный апоптогенный сигнал, в реализации которого задействованы различные механизмы стимуляции каспаз (Hayashi Т. et al., 1998; Chao С. et al., 2000). В нормальных клетках уровень экспрессии р53 невысок, поскольку этот белок обладает очень коротким периодом полужизни (порядка нескольких минут). Можно полагать, что экспрессия Вс1-2 в отсроченный период деафферентации лимитирует количество апопто-тических клеток, создает благоприятный фон для пролиферации, выживания и активного функционирования соответствующих слоев слизистой оболочки.
Морфологическая гетерогенность TUNEL-иммунореактивных клеток, вероятно, детерминирована различным механизмом их программированной гибели. В этой связи предполагается наличие альтернативных путей, запускающих апоптоз (Rich Т. et al., 2000). Один из них, митохондриальный, индуцируется выработкой транскрипторного фактора р53, дефект которого ведет к опухолеподобной пролиферации эпителиоцитов (Oppenheim R.W., 1999). Другой механизм апоптоза развивается в лимфоцитах и блокируется фактором Вс1-2 (Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю., 2001). Поскольку основной мишенью молекулы Вс1-2 является митохондрия, то можно предполагать заинтересованность преимущественно митохондриального пути апоптоза при деафферентации верхнечелюстного нерва. В митохондриальном апоптозе молекула р53 играет важную роль в изменении стабильности мембраны митохондрий и, непосредственно, запуске программированной клеточной смерти (Heffernan-Stroud L.A., Obeid L.M., 2011).
Вместе с тем нельзя исключить и нейрогенные влияния, неизбежно возникающие при перерезке максиллярного нерва. Установлено, что при деафферентации слухового нерва апоптоз нейронов слуховых ядер отмечается уже в первые сутки после нанесения травмы (Матвеева Н.Ю. и др., 2006), а перерезка зрительного нерва у мышей активирует апоптоз более 90% популяции ганглиоз-ных нейронов сетчатки (Калиниченко С.Г., Матвеева Н.Ю., 2007). Очевидно, нарушение баланса между интенсивностью клеточной пролиферации и апоптозом может влиять на эффективность регенераторных процессов при повреждении. Прерывая контакты с нервными волокнами, клетки лишаются трофической поддержки и погибают (Калиниченко С.Г., Мотавкин П.А., 2005). Согласно собственным данным при интенсивной экспрессии Вс1-2 в раннем периоде после травмы верхнечелютного нерва отмечается низкая экспрессия р53 и, соответственно, низкий апоптотический индекс. Однако в отсроченный период после травмы резко возрастает экспрессия р53 и критически снижается экспрессия Вс1-2, что сопровождается интенсивным апоптозом клеток слизистой оболочки.
Апоптоз является общебиологическим феноменом, позволяющим регулировать численную популяцию ткани, избавляя ее от устаревших или утративших свое функциональное значение клеточных элементов (Kuan C.-Y. et al., 2000). Поэтому иммуноцитохимически выявляемые с помощью метода TUNEL свидетельства апоптоза могут быть обнаружены в тканях интакт-ной слизистой оболочки - незначительное число эпителиоцитов, а также
Таблица 4
Активность апоптоза в слизистой оболочке верхнечелюстного синуса крысы после травмы (на 1 мм2)
Структура* Срок эксперимента, сутки Контроль
1 3 7 14 21
Эпителий 56,9±13,1 149,9±53,8 26,9±4,7 16,9±5,5 85,5±27,4 14,6±4,6
Клетки СП 62,1±12,4 38,9±6,3 20,9±4,2 15,2±4,7 20,5+6,1 35,7±16,7
Клетки ПС 25,3 ±5,6 25,1±8,4 30,8±7,1 29,8±8,8 30,2±9,7 20,4±5,3
Клетки ФО 52,4± 11,3 87,2±20,2 133,2±24,8 153,7±18,3 156,6±26,1 58,6±13,1
* ФО - фиброзная основа.
популяция фибробластов собственной пластинки, подслизистой и фиброзной основы слизистой оболочки неизменно присутствали в тканях контрольных животных (табл. 4).
Выраженность апоптоза в тканях травмированной слизистой оболочки имела двухфазную динамику с максимумом на 3-й и 21-е сутки. В этом случае трудно идентифицировать, какая популяция эпителиоцитов (реснитчатых или бокаловидных) страдала в большей мере. Апоптотические ядра визуализировались во всей толще многорядного эпителия и на протяжении слизистой оболочки имели тенденцию к очаговым группировкам. Наряду с участками, содержавшими активно погибающие клетки, встречались зоны, где выраженность апоптоза была минимальна и находилась на контрольных уровнях (табл. 4). Кроме того, встречались участки, где в процесс были вовлечены исключительно, клетки, ядросодержащие сегменты которых располагались в поверхностных слоях эпителиального пласта.
Апоптоз клеточных элементов собственной пластинки и подслизистой основы сопровождался последовательной активацией процесса в тучных клетках, а затем в цитоплазме фибробластов. В 1-3-и сутки в подслизистой появлялось большое число тучных клеток, маркированных иммуноцитохимически. На 3-й сутки после травмы обнаружено увеличение количества апоптотиче-ски измененных клеток, находящихся на 2-3-й стадии фрагментации ядра, с распадом некоторых клеток на апоптозные тельца, расположенные группой, без окружающей лейкоцитарной реакции. Как и в предыдущий срок, часто регистрировались активированные базофилы и тучные клетки, содержавшие плотно упакованные, а также внеклеточно расположенные гранулы.
На 7-е сутки после травмы морфологическая картина в целом была аналогична предыдущему сроку. Тем не менее, можно отметить более активную плазмоцитарную реакцию в слизистой оболочке гайморовой пазухи, уменьшение степени дегрануляции тучных клеток и выброса гранул, содержащих биогенные амины, в соединительную ткань. При этом нарастало количество компактно расположенных коллагеновых волокон.
Таблица 5
Активность ЫАОРН-с! в слизистой оболочке верхнечелюстного синуса крысы при односторонней деафферентации
Структура* Срок эксперимента, сутки Контроль
1 3 7 14 21
Эпителий, ЕОП 64,0±4,8 93,4±9,6 50,6+5,1 102,0±5,9 59,4±4,6 60,3+6,1
Сосуды, ЕОП 52,2±3,2 120,6±4,2 46,8±1,3 53,2±6,7 36,7±4,2 52,0±3,1
ТК СП, % 61,4±7,3 20,0±8,5 36,5±7,7 0 62,0+1,6 0
ТКПС, % 47,6±6,6 36,1 ±4,5 46,9±2,1 0 39,3±16,1 0
* ТК СП - тучные клетки собственной пластинки (слизистой оболочки), ТК ПС -тучные клетки подслизистого слоя (доля положительно окрашенных элементов).
На 21-е сутки выявлены остаточные явления посттравматического процесса, которые характеризовались наличием немногочисленных групп апоп-тозных телец и внеклеточно расположенных секреторных гранул, а также фибробластической реакцией и разрастанием коллагеновых волокон. Присоединялась пролиферация мононуклеарных клеток (макрофаги, лимфоциты), что подтверждало местную (тканевую) иммунную реакцию.
Итак, распространенность апоптоза неодинакова на разных сроках деафферентации и травмы и коррелирует с появлением в клетках активности ¡N05. Согласно собственным наблюдениям, продукция N0 свойственна всем тканям слизистой оболочки, однако участие отдельных типов клеток в поддержании его баланса не одинакова. Превалирующими элементами здесь выступают эпителиальные клетки, гладкие миоциты сосудов, тучные клетки и нервные волокна подслизистой основы.
На тканевую деафферентацию реагировали все NADPH-d-пoзитивныe элементы слизистой оболочки (табл. 5). В ряде случаев в толще слизистой оболочки можно было увидеть клубки, формируемые тонкими диафоразопози-тивными аксонами, которые имели неровные контуры и неравномерное окрашивание.
В первые сутки после перерезки верхнечелюстного нерва наблюдалось резкое сморщивание и уплотнение эпителиального пласта на фоне избыточной активности iNOS. Если в течение первых суток изменения, наблюдаемые на стороне, противоположной месту пересечения нерва, не отличались от контроля, то, начиная с 3-х суток эксперимента, происходила динамическая перестройка активности фермента в тканях слизистой оболочки как ипси-, так контралатеральной пазух. Уже в 1-е сутки после деафферентации на NADPH-d/iNOS начинали активно реагировать тучные клетки с признаками частичной или полной дегрануляции.
Если в течение 1-х суток изменения, наблюдаемые на стороне, противоположной месту пересечения нерва, не отличались от контроля, то, начиная
Таблица 6
Активность ИАВРН-с! в слизистой оболочке верхнечелюстного синуса крысы при односторонней деафферентации (на противоположной стороне)
Структура Срок эксперимента, сутки
1 3 7 14 21
Эпителий, ЕОП 62,3±5,8 53,1 + 10,1 56,1±8,6 64,7+16,2 46,4+6,7
Сосуды, ЕОП 50,2+4,5 60,4±9,3 64,2±7,2 54,8±б,1 53,2±6,7
ТК СП, абс./мм2 170,6+18,1 986,2+79,6 431,5+89,2 973,0±60,2 380,8+62,1
в т.ч. % 0 81,30±6,3 12,8±5,9 20,1 ±4,7 25,0± 14,4
ыАПРн-а+ абс. 0 801,8±62,1 55,3±25,5 195,8±45,7 95,2±54,8
ТК ПС, абс./мм2 128,2±11,2 317,8+101,3 331,0±95,6 568,3±88,8 530,9+90,1
в т.ч. % 0 66,6±8,7 38,0+12,3 29,1±3,2 36,7±9,4
ыАОРн-а+ абс. 0 211,5±27,7 125,7±40,7 165,3±18,2 195,0±49,9
Контроль: эпителий - 60,3±6,1 ЕОП, сосуды - 52,013,1, ТК СП - 148,4±13,4/мм2 (в т.ч. ЫАОРН-а+ - 0), ТК СП - 114,6±9,6/мм2 (в т.ч. КАОРН-с1+ - 0).
с 3-х суток, происходила динамическая перестройка активности фермента в тканях слизистой оболочки как ипси-, так контралатеральной пазухи (табл. 6). Это довольно рельефно проявлялось в отношении покровного эпителия, где на стороне повреждения активность фермента возрастала больше чем в 1,5 раза по сравнению с контролем, а на противоположной стороне приобретала некоторую тенденцию к уменьшению.
На стороне, противоположной месту операции, активность фермента в средней оболочке сосудов, вне зависимости от их расположения и диаметра просвета, колебалась в пределах нормальных значений (табл. 6). Как и в контрольных образцах, основная доля ферментативной активности приходилась в этом случае на нервный аппарат сосуда. Он был представлен плотным сплетением волокон с ровными контурами, которые формировали своеобразные муфты в наружной и средней оболочке сосуда. Наряду с терминальными ветвлениями в стенке артерий, вен и капилляров, оставались сохранными и пучки нервных волокон, проходящие в межуточной ткани.
Изменения в активности ¡N05, хотя и не столь явно выраженные, но заметные, происходили и на стороне противоположной повреждению и носили, вероятно, компенсаторный характер. Поверхностные отделы эпителиальная пласта реагировали на деафферентацию уже в 1-е сутки - заметно утолщалась зона, содержавшая iNOS-пoзитивныe клетки, а также увеличивалась оптическая плотность преципитата реакции (табл. 7, 8). Тенденция к усилению экспрессии iNOS сохранялась до конца срока наблюдения и даже на 21-е сутки активность фермента примерно в 3 раза превышала показатели нормы. При детальном анализе препаратов становилось очевидным, что несмотря на
Таблица 7
Активность ¡ЫОБ в слизистой оболочке верхнечелюстного синуса крысы при односторонней деафферентации
Структура Срок эксперимента, сутки Контроль
1 3 7 14 21
Эпителий, % 22,7±2,3 29,9±4,3 55,б±7,1 49,3±7,4 20,1 ±5,3 13,8±3,6
Эпителий, ЕОП 62,6±9,4 69,5±1,5 31,5±3,5 82,5±8,5 67,0±8,8 24,1±6,2
ТК СП, абс./мм2 12,8±3,3 19,5±3,0 18,4±6,1 9,3±3,5 41,5±4,9 3,1±1,4
ТК ПС, абс./мм2 4,2±0,9 22,5± 11,6 22,9±8,4 16,5±2,7 10,8±3,9 б,2±2,2
Таблица 8
Активность ¡ЫОЭ в слизистой оболочке верхнечелюстного синуса крысы при односторонней деафферентации (на противоположной стороне)
Структура Срок эксперимента, сутки Контроль
1 3 7 14 21
Эпителий, % 14,4±3,9 23,3±2,4 10,3±1,0 45,8±3,3 27,5±4,0 13,8±3,6
Эпителий, ЕОП 31,2±6,5 35,5±2,9 44,7±8,2 74,0+5,9 37,0±9,1 24,1 ±6,2
ТК СП, абс./мм2 24,1 ±8,4 26,4±5,9 21,б±7,1 58,8±12,1 41,7±12,7 3,1±1,4
ТК ПС, абс./мм2 8,4±0,9 12,6±3,5 29,8±6,5 42,2± 11,2 55,2±10,8 6,2±2,2
вовлеченность в процесс практически всего эпителиального пласта максимальная активность сохранялась именно в его поверхностных зонах. Наиболее ярко этот процесс проявлялся в популяции бокаловидных клеток. Как и в случае с диафоразой, индукция NOS имела очаговый характер. На некоторых участках слизистой оболочки (довольно протяженных) можно было наблюдать полное отсутствие iNOS-иммунореактивности.
В эпителиальном пласте на стороне, противоположной повреждению, наблюдалось динамическое повышение числа и активности иммунопозитивных элементов с максимумом на 14-е сутки (табл. 8). Заинтересованность определенного типа эпителиоцитов в индукции фермента в этом случае проследить достаточно трудно. Складывалось впечатление, что в первые 2 недели после деафферентации на контралатеральной стороне активно экспрессировали фермент клетки мерцательного типа, причем основная масса фермента была сосредоточена у них в апикальной части. Между тем к 14-м суткам в эпителии появлялись зоны, где iNOS маркировала большинство бокаловидных эпителиоцитов. Несмотря на отсутствие прямого повреждения в тканях контралатеральной стороны были заметны признаки локального дистрофического процесса, представленного на данных препаратах участками с разрушенным, десквамированным и неравномерно окрашенным эпителием, что в совокупности формировало рваный рельеф поверности слизиситой оболочки.
Популяция тучных клеток соединительнотканных слоев максимальную активность проявляла к 14-му дню (табл. 7, 8). В течение предшествующих суток результаты морфометрии свидетельствовали о наличии постепенной нарастающей динамики в популяции iNOS-синтезирующих мастоцитов с наиболее явным всплеском активности (на 1-3-и сутки) в тканях собственной пластинки. В отличие от ипсилатеральных структур на стороне, противоположной повреждению, iNOS-иммунореактивные тучные клетки дегранулиро-вали. Признаками этого процесса могут служить иммунопозитивные скопления гранул на периферии клетки, а также зоны опустошения, расположенные в центре мастоцита.
Характерной особенностью реакции тканей противоположной пазухи на деафферентацию являлась активация экспрессии фермента во внутренней и средней оболочках кровеносных сосудов, наиболее заметная на 21-е сутки после повреждения (табл. 8). Можно полагать, что причины индукции фермента в слизистой оболочке инициированы дегенеративными, метаболическими и ишемическими изменениями, которые неизбежно возникают вследствие де-афферентации. Индукция NO-синтазы обратима и носит адаптивный характер (Manea А., 2010). Как правило, с момента индукции и до начала наработки NO проходит несколько часов и именно в течение этого периода происходит транскрипция и экспрессия белковых субъединиц энзима (Beckman J.S., 1996). В свою очередь последствия индукции энзима связаны с деструктивными и/ или протективными влияниями NO на ближайшее микроокружение (Калини-ченко С.Г. и др., 2009).
Таким образом, полученные нами данные позволяют заключить, что:
♦ формирование очагов повреждения в слизистой оболочке крыс в результате деафферентации верхнечелюстного нерва возникает уже в ближайший период после травмы;
♦ морфологоческие изменения в слизистой оболочке отражаются на реактивности тучных клеток, которые начинают экспрессировать индуцибельную изоформу NOS и дегранулируют на стороне повреждения;
♦ дистрофически измененные нервные волокна имеют пониженную активность NADPH-d;
♦ NO-синтезирующие клетки и волокна опосредуют трофические (протектив-ные) и/или токсические эффекты оксида азота в период восстановления после экспериментальной травмы верхнечелюстного нерва.
Изменение активности NO-синтаз при травматическом повреждении слизистой оболочки
Изменения, происходившие в тканях слизистой оболочки при травматическом повреждении, значительно отличались от тех, что наблюдались в случае деафферентации. В первую очередь обращала на себя внимание гиперактивность нервного аппарата и тучноклеточной популяции на фоне снижения активности гистохимической реакции на NADPH-d в эпителиальном слое. Этот
Таблица 9
Активность ЫАБРН-с! в слизистой оболочке верхнечелюстного синуса крысы при травматическом повреждении
Структура Срок эксперимента, сутки
1 3 7 14 21
Эпителий, ЕОП 34,3±5,5 70,5±5,0 27,8±6,7 54,3±1,4 32,3±7,0
Сосуды, ЕОП 31,2±7,2 30,1±5,8 48,6±5,2 37,5±10,0 52,8±9,6
ТК СП, абс./мм2 626,0± 121,2 1325,0± 189,8 304,0±29,0 587,0± 196,0 548,3±196,0
в т.ч. ЫАПРН-а+, % 70,3+7,2 69,1 ±4,1 46,7±3,3 39,7±4,8 33,7±4,2
ТК ПС, абс./мм2 584,1±65,0 697,0± 124,9 383,3±35,8 961,3±152,9 528,3± 196,3
в т.ч. ЫАОРН-а+, % 60,6±8,1 46,б±4,5 4,0±1,2 42,0±5,0 32,9±12,9
Контроль: эпителий - 60,3±6,1 ЕОП, сосуды - 52,0±3,1, ТК СП - 148,4±13,4/мм2 (в т.ч. ЫАИРН-а+ - 0), ТК СП - 114,6±9,6/мм2 (в т.ч. ЫАОРН-с1+ - 0).
низкий уровень активности фермента в эпителии сохранялся до 14 суток и возвращался к исходным показателям лишь к концу эксперимента (табл. 9).
Изменение состояния тучноклеточного аппарата, как и в случае с деаф-ферентацией, имеет различное течение в тканях собственной пластинки и подслизистой основы. Четырехкратное увеличение популяции тканевых базо-филов собственной пластинки наблюдается уже в 1 сутки, при этом большая их часть (70,31 %) приобретают гистохимическую активность при реакции на ИАОРН-диафоразу. В среднем в состоянии дегрануляции находятся лишь 2025 % диафораза-позитивных мастоцитов, однако часто можно наблюдать большие участки ткани, где в местах расположения тучных клеток остаются лишь скопления гранул.
Динамика активности тучных клеток подслизистой основы имеет двухфазное течение, первоначально достигая максимальных значений к 3-м суткам. В дальнейшем (до 7 суток) общее число базофилов сокращалось вдвое, и лишь единичные клетки в этот период являются диафоразопозитивными. Второй пик активности регистрировался к концу 2-й недели эксперимента, когда общее число базофилов в 8 раз превышало контрольные цифры, около половины из них (42 %) демонстрировали ЫАБРН-диафоразную активность и активную дегрануляцию.
Связанные с травмой изменения в экспрессии ¡ЫОБ наблюдались в эпителии, тучноклеточной популяции и эндотелии кровеносных сосудов (табл. 10). В остальных тканевых структурах на всем протяжении патологического процесса у крыс П^ОБ не выявлялась.
Уже в течение 1-х суток посттравматического периода происходили изменения в экспрессии ИчГОБ клетками эпителиального пласта (табл. 10) - площадь, занимаемая 1МОЗ-позитивными структурами несколько увеличивалась, хотя оптически регистрируемая активность фермента резко снижалась (фермент
Таблица 10
Активность ¡N05 в слизистой оболочке верхнечелюстного синуса крысы при травме
Структура Срок эксперимента, сутки Контроль
1 3 7 14 21
Эпителий, % 21,2±3,3 40,5+6,4 31,7±2,4 38,9±4,6 15,3±3,8 13,8±3,б
Эпителий, ЕОП 14,7±2,8 35,3±5,9 81,8±14,4 41,3±3,4 29,3±4,3 24,1 ±6,2
ТК СП, абс./мм2 12,7±3,1 16,9±6,6 28,9±3,5 9,2±0,9 13,5±1,2 3,1±1,4
ТК ПС, абс./мм2 12,2±1,2 14,4±6,1 17,2±3,0 28,0±2,2 30,1 ±3,2 6,2±2,2
как бы «растекается» в тоще эпителиального пласта). В собственной пластинке слизистой оболочки, начиная с 1-х суток и вплоть до 7-го дня эксперимента, происходило постепенное нарастание числа iNOS-позитивных элементов. Преобладающее большинство их - тучные клетки. Начиная с 14-го дня и до конца эксперимента число экспрессирующих iNOS гистиоцитов постепенно снижается до нормальных показателей. Этот факт отличал тучноклеточную популяцию собственной пластинки от таковой в подслизистой основе - в этом слое динамическое увеличение количества iNOS-экспрессирующих клеток сохраняло тенденцию к нарастанию до самого конца эксперимента (табл. 10). Начиная с 7-го дня в них были заметны признаки дегрануляции - продукт иммуноцитохимической реакции приобретал грубозернистые очертания и зачастую глыбками накапливался на периферии цитоплазмы.
Данные клинических и биохимических исследований показывают, что описанные механизмы модуляторного действия NO сходным образом функционируют во всех тканях, где отмечается развитие посттравматической гибели клеток (Dubikov A.I., Kalinichenko S.G., 2010). Роль NO в этих процессах сводится, главным образом, к цитотоксическому действию молекулы на мишень (Raff М.С. et al., 1993). Однако последовательность «включения» этих факторов не всегда совпадает с динамикой активности NO-синтаз, что позволяет предполагать наличие альтернативных, цитопротективных и противоапоптоти-ческих, эффектов моноксида азота. Они неразрывно связаны с трофическим эффектом NO в условиях гипоксии, травмы или воспаления. Так, NO могут секретировать формирующиеся аксоны, прорастающие в окружающую ткань в процессе восстановления после травмы (Wilkins А., Compston А., 2005). В серии работ (Tzeng S.F., Huang H.Y., 2003; Estevez A.G. et al., 2006) было показано, что NO функционирует в этих условиях как нейротрофин, подобно фактору роста нервов и мозговому нейротрофическому фактору. Взаимосвязь функциональных пулов NO и нейротрофинов продемонстрирована при регенерации утраченных клеток эпителия и соединительной ткани кожи и слизистой оболочки кишечника (Raap U., Kapp А., 2010). Предполагается, что эти эффекты поддерживаются NO-опосредованной вазодилятацией и положительным влиянием газа на процессы метаболической компенсации повреждения.
Характеристика апоптоза и N0-синтезирующих систем при патологии верхнечелюстного синуса человека
Повреждение стенки верхнечелюстного синуса после свежей травмы и реконструкции неправильно консолидированного перелома вызывает в слизистой оболочке альтеративно-экссудативное воспаление, наиболее выраженное в зонах, непосредственно прилежащих к линии перелома. Посттравматический воспалительный процесс затрагивает все структуры слизистой оболочки и характеризуется выраженным расстройством кровоснабжения, нарушением гистоархитектоники, изменением секреторной активности слизистых желез. Тучноклеточная реакция прослеживается на всех ключевых стадиях, в каждой из которых она имеет свои особенности. Полученные результаты позволяют выделить основные закономерности посттравматического воспалительного процесса слизистой оболочки верхнечелюстного синуса при повреждении его стенок: ранний посттравматический период - до 3-х суток; острый посттравматический верхнечелюстной синуит - с 4-х по 14-е сутки; период хронизации воспалительного процесса - 14-21-е сутки.
Период острого воспаления проявляется нарастающими деструктивными изменениями всех структур слизистой оболочки. Это вероятно связано с нарушением трофических процессов и присоединением риногенной бактериальной флоры. Можно предположить, что необходимым условием для развития микробного воспаления, в данном случае, является снижение дренажных функций максиллярного отверстия (вследствие отека слизистой или смещения костных отломков) и формирование застойных явлений в пазухе. На этом этапе воспаления происходило нарастание отека слизистой оболочки пазухи, который прогрессировал вплоть до 7-х суток. К концу 1-й недели соединительная ткань была инфильтрирована преимущественно лимфоцитами и макрофагами. Наличие макрофагов, осуществляющих завершающую санацию зоны повреждения, говорит о стабилизации воспалительного процесса. В эпителии пазухи формировалось подобие сосочковых выростов с фиброзом подлежащей ткани. В этот период происходило практически полное истощение туч-ноклеточной популяции, восстановление которой начиналось только к концу 2-й недели после травматического повреждения.
Спустя две недели после травмы наблюдалась скудная инфильтрация соединительной ткани преимущественно эозинофилами, в то же время выявлялись признаки репарации в виде формирования пролифератов фибробластов в очагах старых обширных кровоизлияний. Отмечено образование полипов в области значительного повреждения слизистой оболочки. К 14-м суткам обнаружены признаки начинающейся регрануляции тучных клеток и появление юных форм, возможно, из камбиального резерва. Это позволяет предположить, что к концу 2-й недели посттравматического периода включаются механизмы купирования воспалительного процесса.
Завершающий этап посттравматических изменений в слизистой оболочке верхнечелюстного синуса можно характеризовать как период хронизации
Таблица 11
Активность ¡N08 и выраженность апоптоза в слизистой оболочке гайморовой пазухи при травме и хроническом риносинусите
Структура Количество иммунореактивных клеток, абс./мм2
ÍNOS + TUNEL+
Контроль Травма Синусит Контроль Травма Синусит
Эпителий 0 26,9±3,1 54,9±3,8 2,3±4,7 17,9±5,5 35,4±2,3
СП 0 62,1 ±2,4 43,9±6,2 4,4±4,2 15,2±4,7 23,5±6,1
ПС 0 25,3±1,5 23,1±3,4 8,2±2,1 19,8±8,8 30Д±3,6
ТК 0 52,4±1,3 77,2±2,2 6,2±3,8 43,5±3,1 116,6+6,1
воспалительного процесса. К концу 3-й недели на фоне исчезающей многоряд-ности мерцательного эпителия регистрировались участки со снижением его высоты. Отмечено выраженное уменьшение количества бокаловидных клеток. Выявлены признаки метаплазии многорядного эпителия в многослойный плоский и фиброзное перерождение подслизистой основы.
При исследовании материала гайморовой пазухи после реконструкции ску-ловерхнечелюстного комплекса или при хроническом риносинусите установлена значительная редукция ЫАВРН-<1-позитивных фибробластов и тучных клеток в глубоких слоях слизистой, однако в эпителиальном слое и подслизистой основе подобных изменений выявлено не было. N0 здесь синтезировали в основном клетки поверхностных слоев. Связанные с травмой и воспалением изменения в экспрессии ¡N05 наблюдались в эпителии, тучноклеточной популяции и эндотелии кровеносных сосудов (табл. 11). В остальных тканевых структурах на всем протяжении патологического процесса 1Ж)5 не выявлялась. Максимальная активность энзима была сосредоточена в верхней порции эпителиоцитов и проявлялась интенсивным, гомогенным окрашиванием их цитоплазмы.
При травме и хроническом риносинусите со стороны клеток слизистой оболочки верхнечелюстного синуса регистрировалась ярко выраженная апоп-тотическая реакция. Однако специфика повреждающего воздействия влекла за собой появление уникального паттерна распределения апоптотических клеток. Так, при травме апоптотические ядра визуализировались во всей толще многорядного эпителия и на протяжении слизистой оболочки имели тенденцию к очаговым группировкам. Наряду с участками, содержавшими активно погибающие клетки, встречались зоны, где выраженность апоптоза была минимальна и находилась на контрольных уровнях (табл. 11). Кроме того, встречались участки, где в процесс были вовлечены исключительно клетки, ядро-содержащие сегменты которых были расположены в поверхностных слоях эпителиального пласта. В условиях хронического воспаления апоптотические клетки, напротив, доминировали в глубоких уровнях подслизистой основы и, по всей видимости, относились к фибробластоподобным и тучным элементам.
Таким образом, при травме и хроническом риносинусите в гайморовой пазухе человека установлено усиление активности индуцибельного изофермента NO-синтазы и повышение апоптотического индекса в клетках слизистой оболочки. При переломе верхней челюсти апоптотические ядра визуализируются во всей толще многорядного эпителия и на протяжении слизистой оболочки имеют тенденцию к очаговым группировкам. Однако в условиях хронического воспаления апоптотические клетки доминируют в глубоких уровнях под-слизистой основы и относятся к фибробластоподобным и тучным элементам. Возможно, наиболее важным в этой серии исследований явилось следующее наблюдение: оказалось, что снижение количества NADPH-d-позитивных ла-броцитов и фибробластов сопровождалось нарастанием в них апоптотического индекса. Напротив, NADPH-d-позитивные эпителиоциты оставались резистентными к повреждеющим воздействиям в условиях хронического воспаления и практически не подвергались апоптозу.
Данные, полученные в настоящей работе, суммированы на рисунке (с. 23), где указаны также динамика наработки NO, про- и антиапоптотических факторов в острый и отсроченный период посттравматической репарации и хронического воспаления. Как следует из схемы, распространенность апоптоза коррелирует с началом активной наработки NO и р53. Напротив, превалирование продукции Вс1-2 совпадает с падением синтеза NO. Однако и в этом принципиальном положении есть исключения. Так, хронический синусит у человека характеризуется гетерогенным вовлечением NO-ергических клеток в апоптоз. Фибробласты и тучные клетки имеют здесь высокий апоптотический индекс, хотя и демонстрируют относительно низкую активность NOS. Между тем, эпителиальные клетки при массивном синтезе NO подвергаются апоптозу в значительно меньшей степени. Аналогичный феномен наблюдался среди популяции тучных клеток на 21-е сутки после экспериментальной травмы пазухи у крыс.
Причины, ведущие к смещению апоптогенного действия NO на противоположное представляются наиболее дискуссионными. Предлагается несколько сценариев развития этих событий. NO способен стимулировать развитие апоптоза через непосредственное влияние молекулы на экспрессию р53 и цитокины (Choi В.М. et al., 2002). Необходимо отметить, что подобные эффекты NO «срабатывают» только при его высоких концентрациях и массивной индукции NOS. С другой стороны, низкая активность энзима и соответствующие низкие показатели выработки NO могут активировать индукцию трофических факторов и, таким образом, предотвращать развитие апоптоза (Choi В.М. et al., 2002).
Показано, что при травме и/или хроническом воспалении NO способен усиливать потенциал мембраны митохондрий и изменять химическую структуру цитохрома С. В результате этого происходит повреждение структуры цитохрома и высвобождение его из митохондрий, что в свою очередь активирует каспазу-3 (Bauer G. et al., 2000). In vitro установлено разрушающее действие оксида азота на клеточную ДНК (Nitsch D.D. et al., 1997). Вместе с тем гистохимические исследования почек ш vivo выявили значительное нарастание
' i х ^ i x
0 ф ^^ 0
Ж | N0 | | N0 | | N0 Í J N0 t f - j
ÍOÍ |@i l® i tA^ fAi tu: JO; {©; JO;
\ф\ |фi }ф: 1®¿ 1®¿ 1Ф!
10! 10! 10! 10! 101
Хронический синусит
О ^^
I
I ♦
«t
Рис. Взаимоотношение между синтезом оксида азота, наработкой про- и антиапопготических факторов к эпителии (Э), фибробластах (Ф) и тучных клетках (ТК) слизистой оболочки нсрхисчслюстиой пазухи при грамме и дсафферен гации у крысы и хроническом синусите у человека; интенсивность апоптоза (А) отражена на основании исследования с помощью метода TUNEL
интенсивности апоптоза в клетках, где была наиболее выражена экспрессия индуцибельной NO-синтазы (Chertin В. et al., 2002). Это свидетельствует о действии iNOS и провоспалительных цитокинов, вырабатываемых макрофагами, в качестве триггерного механизма развития апоптоза, что приводит к клеточной альтерации. С другой стороны, имеются данные об антиапоптозном действии оксида азота. Согласно этим исследованиям, оксид азота стабилизирует каспазы, препятствуя их активации и блокируя Fas-индуцированный путь программированной гибели клеток (Mannick J.B. et al., 1999).
Несмотря на то, что ключевая роль апоптоза в реализации физиологических процессов, связанных с поддержанием клеточного гомеостаза, не вызывает сомнений, показано, что апоптоз не является обязательной составляющей в реализации большинства типовых патологических процессов. В этом можно убедиться на примере воспалительной реакции (Ярилин A.A., 2010; Lutz J. et al., 2003). Хотя для воспаления характерно повреждение тканей, гибель клеток при этом происходит преимущественно по механизму некроза и сопровождается выходом содержимого клеток в межклеточное пространство, что может стать причиной гибели соседних клеток и расплавления тканей. Однако на завершающих этапах воспаления апоптозу принадлежит важная роль, поскольку в этот период происходит устранение вовлеченных в воспаление клеток, выполнивших свои функции (Steller Н., 1995).
Необходимо отметить, что исследования различных путей регуляции апоптоза способствуют более глубокому и полному пониманию молекулярных механизмов формирования различных форм повреждения ткани, что, в свою очередь, необходимо для разработки новых подходов к коррекции этих состояний. Так, ведутся активные разработки фармакологического применения низкомолекулярных ингибиторов каспаз. Использование олигонуклеотидов-ингибиторов гена, отвечающего за выработку белка Вс1-2, уже находится в стадии клинических испытаний в онкологии (Симоненко В.Б. и др., 2000; Liaudet L. et al., 2000). Несомненно, исследования в области гистофизиологии апоптоза открывают широкие возможности для регуляции репаративных процессов после повреждения.
Результаты и выводы настоящей работы позволяют заключить, что развитие апоптоза и степень наработки оксида азота в клетках слизистой оболочки максиллярной пазухи у человека и крыс представляет взаимозависимый механизм. Активность NO-синтаз является значимым фактором, который определяет апоптогенное и/или антиапоптотическое действие оксида азота в разные сроки после травматического повреждения. Можно выделить два основных направления развития этого процесса: предотвращение вторичного повреждения клеток путем влияния оксида азота на апоптоз, и второе - стимуляция трофики и регенераторных способностей слизистой оболочки. Ингибирова-ние апоптоза может способствовать регенерации, а его стимуляция в перспективе - оказывать цитопротективное влияние при вторичном повреждении продуктами воспалительных реакций.
Выводы
1. Перерезка верхнечелюстного нерва ведет к деафферентации средней зоны лицевого отдела головы крысы и является адекватной моделью для исследования нейрогенных влияний, неизбежно возникающих при травме стенок гайморовой пазухи.
2. В слизистой оболочке максилярной пазухи человека и крыс NADPH-диафораза имеет однотипное распределение и селективно маркирует различные тканевые элементы. Наличие энзима установлено в цитоплазме призматических эпителиоцитов и бокаловидных клеток, фибробластах и тучных клетках подслизистой основы, эндотелии микрососудов и нервных волокнах.
3. Экспериментальная перерезка верхнечелюстного нерва ведет к альтерации активности NADPH-диафоразы, формируя очаги повреждения в слизистой оболочке максилярной пазухи в ближайший период после травмы. Процесс сопровождается закономерными изменениями экспрессии ¡NOS в клетках эпителия и тканевых базофилах собственной пластинки и подслизистой основы.
4. Индуцибельная изоформа NOS экспрессируется в тучных клетках, которые активно дегранулируют на стороне повреждения. Колебания активности iNOS здесь сопровождаются репаративными изменениями в слизистой оболочке, что свидетельствует об участии тучных клеток в поддержании трофических (протективных) и/или токсических эффектов оксида азота в период восстановления после травмы верхнечелюстного нерва.
5. Перерезка верхнечелюстного нерва ведет к повышению активности NADPH-d/iNOS в слизистой оболочке конралатеральной пазухи. Всплеск активности регистрируется в эпителиоцитах и тучных клетках на 7-14-е сутки эксперимента. На 21-е сутки после перерезки нерва iNOS превалирует в кровеносных сосудах противоположной стороны. Динамика исследованных ферментов отвечает сигнальной функции оксида азота, которая может компенсировать дефицит нейрогенных и трофических влияний поврежденного нерва.
6. Перерезка верхнечелюстного нерва первоначально провоцирует развитие в слизистой оболочке верхнечелюстного синуса резко выраженной туч-ноклеточной реакции, а затем дистрофически-дегенеративных изменений и воспалительной реакции за счет лимфоцитарно-макрофагальных клеток. Де-афферентация и травма челюстно-лицевой области являются стрессорными факторами, вызывающими повреждение клеток по типу апоптоза.
7. Интенсивная флюоресценция ядер апоптотических клеток, окрашенных с помощью метода TUNEL, показывает признаки фрагментации ДНК. Они превалируют в эпителиальном слое на 1-7-е сутки после перерезки верхнечелюстного нерва. На 14-21-е сутки эксперимента апоптотические клетки локализуются в подслизистой основе, где они концентрируются главным образом в периваскулярных пространствах. В подслизистой основе апоптозу подвергаются фибробласты, формирующие скопления или кластеры.
8. Перерезка верхнечелюстного нерва инициирует в клетках слизистой оболочки апоптотическую гибель, которая соотносится с балансом р53- и Вс1-2-иммунореактивности. Нарушение этого баланса может влиять на эффективность регенераторных процессов при повреждении. При интенсивной экспрессии Вс1-2 в раннем периоде после травмы верхнечелютного нерва отмечается низкая экспрессия р53 и, соответственно, низкий апоптотический индекс. В отсроченный период после травмы резко возрастает экспрессия р53 и критически снижается экспрессия Вс1-2, что сопровождается интенсивным апоптозом клеток слизистой оболочки. Постравматическая регенерация протекает одновременно с уменьшением плотности апоптотических эпителиоци-тов и нарастанием апоптотического индекса в глубоких слоях слизистой оболочки на поздних сроках деафферентации.
9. При травматическом переломе костей верхнечелюстного синуса у крыс возникает индукция NADPH-d/NOS в микрососудах слизистой оболочки. Это дополнительное образование оксида азота за счет активности эндотелиальной NOS ассоциировано с повышением активности iNOS в нервных волокнах, цитоплазме эпителиоцитов и тучных клеток.
10. Травматическое повреждение слизистой оболочки сопровождается нарушением целостности внутренней оболочки сосудов вследствие массивного апоптоза эндотелиальных клеток. Высокая активность здесь конститутивной и индуцибельной NOS позволяет рассматривать NO как мощный апоптоген-ный фактор. Значение этого механизма усиливается в отсроченный период после травмы.
11. Выраженность апоптоза при травме имеет двухфазную динамику с максимумом на 3-й и 21-е сутки с наибольшим апоптотическим индексом в фибро-бластах соединительной ткани подслизистой основы и адвентиции. Выраженность апоптоза имеет сходную картину с динамикой активности NADPH-d/ NOS. В травмированной гайморовой пазухе человека оксид азота синтезируют клетки поверхностных слоев слизистой оболочки. Наличие высокого индекса апоптоза коррелирует здесь с высокой иммунореактивностью к р53, что при полном отсутствии Вс1-2 усиливает апоптогенные эффекты оксида азота.
12. В условиях хронического воспаления у человека апоптотические клетки доминируют в глубоких уровнях подслизистой основы и относятся к фи-бробластоподобным и тучным клеткам. При этом NADPH-d-позитивные эпи-телиоциты остаются высокоустойчивыми к повреждеющим воздействиям, в отличие от фибробластов и тучных клеток, количество которых снижается на 18-25% вследствие апоптоза и некроза.
13. Суммарный эффект моделируемой травмы и хронического воспаления у человека можно оценить как сумму первичной гибели тканей слизистой оболочки и вторичного распространенного повреждения - апоптоза - вблизи места травмы и на отдалении. Активность исследованных энзимов является значимым фактором, который определяет анти- и проапоптотическое действие оксида азота в разные сроки после повреждения.
Список основных работ, опубликованных по теме диссертации
Статьи в журналах из списка, рекомендованного ВАК:
1. Едранов, С.С. Люминесцентная цитодиагностика репарации слизистой оболочки деафферентированной верхнечелюстной пазухи в эксперименте / С.С. Едранов, A.A. Коновко, Н.Г. Плехова // Морфология. - 2008. - Т. 133, № 2. - С. 44.
2. Едранов, С.С. Реакция тучных клеток слизистой оболочки поврежденного верхнечелюстного синуса белой крысы / С.С. Едранов, A.A. Коновко, A.B. Овчинникова // Тихоокеанский мед. журнал. - 2008. - № 1. - С. 58-60.
3. Рева, Г.В. Динамика морфологических изменений нейронов тройничного ганглия при компрессионной травме верхнечелюстного нерва крысы / Г.В. Рева, К.И. Крюков, Е.А. Коцюрбий, С.С. Едранов // Бюл. эксперимент, биол. и мед. - 2008. - Т. 145, № 5. - С. 597.
4. Едранов, С.С. Нитроксидсинтаза тучных клеток слизистой оболочки мак-силлярной пазухи крыс при травме верхнечелюстного нерва / С.С. Едранов // Тихоокеанский мед. журнал. - 2011. - № 4. - С. 53-56.
5. Едранов, С.С. Апоптоз как фактор организации посттравматического воспаления / С.С. Едранов // Тихоокеанский мед. журнал. - 2012. - №2. -С. 100-104.
6. Едранов, С.С. Апоптоз как механизм повреждения слизистой оболочки максиллярной пазухи крыс при экспериментальном пересечении верхнечелюстного нерва / С.С. Едранов, П.А. Мотавкин // Бюл. эксперимент, биол. и мед. - 2012. - Т. 153, № 4. - С. 518-523.
7. Едранов, С.С. Межклеточные мессенджеры в регуляции репаративных процессов и апоптоза / С.С. Едранов // Вестник новых мед. технологий. -2012. - Т. XIX, № 1. - С. 19-21.
8. Едранов, С.С. Характеристика апоптоза и NO-синтазы в слизистой оболочке гайморовой пазухи человека при травме и хроническом воспалении / С.С. Едранов // Российский стоматологический журнал. - 2012. - № 3. -С. 13-16.
9. Едранов, С.С. Роль основного фактора роста фибробластов в ангиогенезе и репарации слизистой оболочки при травме и хроническом воспалении / С.С. Едранов // Ангиология и сосудистая хирургия. - 2012. - Т. 18, прил. -С. 34.
10. Едранов, С.С. Роль оксида азота в повреждении и репарации слизистой оболочки верхнечелюстной пазухи / С.С. Едранов // Российский стоматологический журнал. - 2012. - № 6. - С. 38-42.
11. Едранов, С.С. Экспериментальная модель травмы и посттравматической реорганизации слизистой оболочки верхнечелюстного синуса / С.С. Едранов // Российский стоматологический журнал. - 2012. - № 6. - С. 7-11.
12. Едранов, С.С. Динамика апоптоза и его регуляция при травме верхнечелюстного синуса / С.С. Едранов, Цой Хак Бон, И.П. Хетеева // Тихоокеанский мед. журнал. - 2013. - № 1. - С. 12-16.
13. Едранов, С.С. Клиническая морфология посттравматического воспаления и репарации скуло-верхнечелюстного комплекса / С.С. Едранов, Цой Хак Бон, И.П. Хетеева // Российский стоматол. журнал. - 2013. - № 2. - С.13-16.
Монографии:
1. Едранов, С.С. Посттравматический гайморит: вопросы патогенеза. Экспериментальное и клиническое исследование / С.С. Едранов. - Владивосток: Медицина ДВ, 2013. - 167 с.
Работы, опубликованные в материалах международных конференций,
всероссийских конференций с международным участием и сборниках трудов:
1. Едранов, С.С. Реакция тучных клеток твердой мозговой оболочки при травме лицевого отдела головы белой крысы / С.С. Едранов, И.В. Ковалева, A.A. Коновко, К.И. Крюков // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: тез. докл. VII Тихоокеанской науч.-практ. конф. студентов и молодых ученых с международным участием (20 апр. 2006 г.) / под ред. С.С. Юдина. - Владивосток, 2006. - С. 19-20.
2. Едранов, С.С.. Определение наличия микрофлоры верхнечелюстного синуса в норме и при переломе его костных стенок у белой крысы / С.С. Едранов, Д. Семченко, A.A. Коновко, К.И. Крюков // Акт. проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: тез. докл. VII Тихоокеанской науч.-практ. конф. студентов и молодых ученых с международным участием (20 апр. 2006 г.) / под ред. С.С. Юдина. - Владивосток, 2006. - С. 44-45.
3. Едранов, С.С. Микробиологические аспекты развития альвеолита / С.С. Едранов, К.И. Крюков, P.P. Гогян, P.C. Аверин // Акт. проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: тез. докл. VII Тихоокеанской науч.-практ. конф. студентов и молодых ученых с международным участием (20 апр. 2006 г.) / под ред. С.С. Юдина. - Владивосток, 2006. - С. 35.
4. Едранов, С.С. Использование различных антимикробных средств для профилактики и лечения альвеолита / С.С. Едранов, К.И. Крюков, P.P. Гогян, P.C. Аверин // Акт. проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: тез. докл. VII Тихоокеанской науч.-практ. конф. студентов и молодых ученых с международным участием (20 апр. 2006 г.) / под ред. С.С. Юдина. - Владивосток, 2006. - С. 35-36.
5. Едранов, С.С. Количественный и качественный анализ нейронов тройничного узла при компрессионной травме лицевого отдела головы крысы / С.С. Едранов, Е.А. Коцюрбий // Здоровье и образование в XXI веке: мат. VII международной науч.-практ. конф. (23-26 ноября 2006 г.) - М., 2006. - С. 276.
6. Едранов, С.С. Реакция микрососудов слизистой оболочки травмированной верхнечелюстной пазухи в эксперименте / С.С. Едранов, A.A. Коновко, Л.М.
■н
Сомова// Хирургия лица: сб. мат. 2-й Приморской краевой науч.-практ. конф. (22 декабря 2006) / под ред. С.С. Едранова. - Владивосток, 2006. - С. 48-51.
7. Едранов, С.С. Ультраструктура тучных клеток слизистой оболочки верхнечелюстной пазухи в условиях деафферентации / С.С. Едранов, А.А. Конов-ко, Л.М. Сомова // Хирургия лица: сб. мат. 3-й Приморской краевой науч.-практ. конф. (26 декабря 2007 г.) / под ред. С.С. Едранова. - Владивосток, 2007. - С. 47-50.
8. Едранов, С.С. Ультраструктурные изменения тканевых элементов тройничного ганглия в ответ на компрессию верхнечелюстного нерва у крыс / С.С. Едранов, К.И. Крюков, Б.П. Тихонов, В.В. Киршанский // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: тез. докл. VIII Тихоокеанской науч.-практ. конф. студентов и молодых ученых с международным участием (24 апр. 2007 г.) / под ред. М.Ю. Петраковой, М.В. Матвей-чук. - Владивосток: Медицина ДВ, 2007. - С. 27-28.
9. Едранов, С.С. Экспериментальная деафферентация головы белой крысы / С.С. Едранов, А.А. Коновко, И.В. Ковалева, К.И. Крюков // Акт. проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: тез. докл. VIII Тихоокеанской науч.- практ. конф. студентов и молодых ученых с международным участием (24 апр. 2007 г.) / под ред. М.Ю. Петраковой, М.В. Матвейчук. -Владивосток: Медицина ДВ, 2007. - С. 25-26.
Список сокращений
АИ - апоптотический индекс;
ВЧС - верхнечелюстной синус;
ЕОП - единицы оптической плотности;
ПС - подслизистый слой;
СП - собственная пластинка (слизистой оболочки);
ТК - тучные клетки;
ФО - фиброзная основа;
iNOS (inducible nitric oxide synthase) - индуцибельная нитроксидсинтаза;
NADPH (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) - никотинамидаденин-
динуклеотидфосфат;
NADPH-d (NADPH-diaphorase) - никотинамидадениндинуклеотидфосфат-
диафораза;
NOS (nitric oxide synthase) - нитроксидсинтаза;
TUNEL - terminal deoxynucleotidil transferase-mediated dUTP nick end-labeling.
ЕДРАНОВ Сергей Сергеевич
АПОПТОЗ И ОКСИД АЗОТА В РЕГЕНЕРАЦИИ ТРАВМИРОВАННОЙ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ВЕРХНЕЧЕЛЮСТНОГО СИНУСА
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук
Подписано в печать 18.10.2013 г. Формат 60x90/16. Усл. печ. л. 2. Тираж 100 экз. Заказ 496.
Отпечатано на участке оперативной полиграфии типографии «Рея»
690075, г. Владивосток, Адм. Юмашева, 126
Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора медицинских наук, Едранов, Сергей Сергеевич, Владивосток
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации
На правах рукописи
Едранов Сергей Сергеевич
АПОПТОЗ И ОКСИД АЗОТА В РЕГЕНЕРАЦИИ ТРАВМИРОВАННОЙ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ВЕРХНЕЧЕЛЮСТНОГО СИНУСА
03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология
Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук
Научный консультант — доктор медицинских наук, профессор П.А. Мотавкин
Владивосток 2013
Оглавление
Введение...............................................................................................................4
Глава 1. Обзор литературы...............................................................................10
1.1. Анатомо-физиологическая характеристика
верхнечелюстного синуса.......................................................................10
1.2. Анатомо-гистологическая характеристика
околоносовых пазух крысы ...................................................................16
1.3. Оксид азота в репарации и реорганизации слизистых оболочек.......21
1.3.1. Оксид азота как трофический фактор ............................................21
1.3.2. Идентификация оксида азота в слизистой оболочке верхнечелюстной пазухи .................................................................23
1.4. Феномен апоптоза...................................................................................30
1.4.1. Механизм апоптоза ..........................................................................30
1.4.2. Молекулярные факторы апоптоза в условиях физиологической и репаративной регенерации............................35
1.5. Межклеточные мессенджеры в регуляции
репаративных процессов и апоптоза ....................................................42
Глава 2. Материал и методы исследования....................................................49
2.1. Экспериментальная модель посттравматического синусита ................49
2.2. Моделирование травматического перелома
верхнечелюстного синуса.........................................................................52
2.3. Клинический материал...............................................................................56
2.4. Детекция NADPH-диaфopaзы и ¡N08 ......................................................61
2.5. Идентификация апоптоза...........................................................................63
Глава 3. Нитроксидергические механизмы апоптоза
при экспериментальной травме .........................................................68
3.1. Топография МАБРН-диафоразы и ¡N08 в слизистой оболочке верхнечелюстного синуса при односторонней деафферентации.........68
3.2. Топография ИАБРН-диафоразы и {N08 в слизистой оболочке верхнечелюстного синуса при переломе костей черепа .......................80
3.3. Апоптоз в слизистой оболочке верхнечелюстного синуса
при односторонней деафферентации ......................................................87
3.4. Апоптоз в слизистой оболочке верхнечелюстного синуса
при переломе костей черепа.....................................................................92
Глава 4. Апоптоз и нитроксидсинтезирующие системы
при патологии верхнечелюстного синуса человека ......................104
4.1. Клинико-морфологическая характеристика стадий посттравматического воспаления и репарации
слизистой оболочки верхнечелюстного синуса ...................................104
4.2. Топография NADPH-диафоразы и iNOS в слизистой оболочке верхнечелюстного синуса в условиях травмы
и хронического воспаления ....................................................................107
Заключение ......................................................................................................111
Список сокращений ........................................................................................125
Список литературы .........................................................................................126
Введение
Актуальность проблемы. Нарушение целостности верхнечелюстного синуса - широко распространенная самостоятельная патология, сопровождающая различные типы переломов костей скулоорбитоверхнечелюстного комплекса (Бесшапочный С.Б., Краснолобов В.М., 1976; Бутюкова В.А., 1977; Бутюко-ваВ.А. и др.,1979; Бесшапочный С.Б., 1984, 1990; ЗуевВ.П., Гусев Э.П., 1988; Трунин Д.А., 2001; Pape К., 1969). При синус-лифтинге возникают две проблемы: с одной стороны - послеоперационный гайморит, развивающийся в 3—20% случаев, а с другой - предсуществующая патология околоносовых пазух, которая ограничивает показания к данной операции (Maksoud М.А., 2001; Schwartz-Arad D. et al., 2004; Costa F. et al., 2008). Исследования на экспериментальной модели доказали структурную перестройку эпителия верхнечелюстной пазухи при посттравматической репарации (Едранов С.С., 2005; Едранов С.С. и др., 2005). Однако, объяснить это лишь прямым травматическим повреждением тканей невозможно, так как в процесс вовлекались клетки, расположенные на значительном расстоянии от места перелома.
Современная концепция гибели клетки базируется на двух основных механизмах: апоптозе и некрозе (Ярилин A.A., 1998; Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю., 2001; Пальцев М.А., 2002; Матвеева Н.Ю. и др., 2006; Калиничен-ко С.Г., Матвеева Н.Ю., 2007; SloviterR., 2002; Marretta R.M., Ales F., 2010; KhouryM.P., Bourdon J.C., 2011). Понимание этих процессов исторически происходило не одновременно. Начиная с работ R. Virchow (1859) было выполнено детальное морфологическое описание смерти клетки, названной некрозом, под которым понимали необратимые изменения тканей. По мере развития гистологических методов исследования стало ясно, что некроз представляет собой не одномоментный, а растянутый во времени процесс (Серов В.В., 2001). В 1885 году W. Flimming был описан хроматолиз - процесс быстрого «растворения» образовавшихся при распаде фрагментов ядра. В 1890 году С. Weigert ввел термины «аутолиз», «пикноз» и «кариолизис». Со временем стали появляться гипотезы о существовании естественного механизма клеточной смерти, позволя-
ющего поддерживать качественные и количественные показатели клеточных популяций на оптимальном, генетически детерминированном уровне. Подобный механизм элиминации клеток детально описал A. Gluksmann в середине прошлого века, но только в 70-х годах XX столетия, в работах J.F. Kerr было впервые введено понятие программированной гибели клеток или апоптоза (Kerr J.F. et al., 1972).
В то время как некроз представляет собой необратимую смерть клетки, апоптоз на определенных этапах может быть задержан или предупрежден (Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю., 2001). Поэтому особую актуальность приобретает анализ механизмов активации апоптоза, его временного и пространственного распространения в клеточной популяции. Изучение апоптоза при травматическом повреждении и регенерации слизистой оболочки является перспективным и с точки зрения возможности влияния на патологический процесс (Khoury М.Р., Bourdon J.C., 2011).
Оксид азота, обладая широким спектром регуляторного, фармакологического и токсического действия влияет на процессы клеточной смерти, физиологической и репаративной регенерации (Lipton S.A., 1999; Ushmorov A. et al., 1999; PrastH., PhilippuA., 2001). Это соединение является одним из главных факторов клеточной сигнализации и межклеточного взаимодействия (Vincent S.R., 1994; Pelligrino D.A. et al., 1996; Yoshioka Y. et al., 2003). Оксид азота регулирует тонус сосудистой стенки, угнетает агрегацию тромбоцитов и их адгезию к эндотелию, стимулирует ангиогенез, обладает цитотоксическим действием, участвуя таким образом в механизмах противомикробного, противовирусного и противоопухолевого иммунитета. В зависимости от условий он может активировать или подавлять апоптоз, избирательно воздействуя на определенные типы клеток (Калиниченко С.Г., Матвеева Н.Ю., 2007; Бершова Т.В. и др., 2009; Dawson, Snyder, 1994; Dawson W.L., 1995; Glockzin S. et al., 1999; Choi B.M. et al., 2002).
Вместе с тем нельзя исключить влияния на процессы репаративной регенерации и нейрогенных механизмов. При травме стенок гайморовой пазухи, в
случае перелома верхняя челюсть с костями носа отделяется от скуловых костей. В результате этого в 100% случаев травмируются подглазничный и верхние альвеолярные нервы, что ведет к нарушениям всех видов поверхностной чувствительности (Крюков К.И., 2008).
Нарушения иннервации вызывают в тканях нейродистрофические изменения, явления воспалительного характера, нарушения морфофункциональной специфичности клеток, их некроз и апоптотическую гибель (Григорьева Т.А., 1966; Князев Г.Г., 1992; Keller J.N. et al., 1998).
Установлено, что начальный период апоптоза при деафферентации индуцируется экспрессией фактора роста нервов, который при взаимодействии с рецептором р75 запускает механизмы клеточной смерти (Frade J.M., Barde Y.A., 1999; BanasiakA.G. et al., 2000; Friedman W.J., 2000). Необратимую активацию этого процесса при перерезке нервов опосредуют проапоптотические ферменты - эффекторные каспазы и ген ТР53 (Thornberry N.A., Lazebnik Y., 1999; Li J. et al., 2002; ItohK. et al., 2004). Так, при пересечении слухового нерва апоптоз нейронов слуховых ядер отмечается уже в первые сутки после травмы, а перерезка зрительного нерва у мышей активирует апоптоз более 90% ганглиозных нейронов сетчатки (Матвеева Н.Ю., 2006; Калиниченко С.Г., Матвеева Н.Ю., 2007; Frade J.M. et al., 1997, 1999; Kalinichenko S.G., Matveeva N.Yu., 2008). Менее известны механизмы программированной гибели клеток в ответ на пересечение периферических нервов (Мотавкин П.А. и др., 1994).
С этих позиций приобретают особую актуальность данные, характеризующие апоптоз и патогенетическую роль оксида азота при посттравматической регенерации слизистой оболочки.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в установлении роли апоптоза и оксида азота в репаративных процессах травмированной слизистой оболочки верхнечелюстного синуса.
В соответствии с избранным направлением были сформулированы следующие задачи исследования:
1. Создать экспериментальную модель деафферентации средней зоны лица и верхнечелюстного синуса на лабораторном животном - белая крыса;
2. Исследовать топографию конститутивной и индуцибельной изоформы N0-синтазы и КАБРН-диафоразы в слизистой оболочке гайморовой пазухи у человека и крыс в норме и на разных этапах регенерации.
3. Дать оценку клинико-морфологических изменений при репарации верхнечелюстного комплекса у человека после травмы и установить их связь с динамикой распространения апоптоза.
4. Исследовать качественные и количественные характеристики апоптоза клеток слизистой оболочки верхнечелюстного синуса при деафферентации и механическом повреждении у крыс.
5. Установить топографию и распределение Вс1-2- и р53-иммунореактивных клеток на разных этапах регенерации слизистой оболочки у человека и крыс.
6. На основе полученных результатов и данных литературы представить обобщенную модель взаимоотношений Ж)-синтезирующих, про- и антиа-поптотических факторов при травме и воспалении поврежденной слизистой оболочки.
7. Обосновать закономерности развития апоптоза и механизмов цитотоксиче-ского и протективного действия оксида азота в репарации слизистой оболочки верхнечелюстной пазухи.
Научная новизна. В настоящей работе проведено комплексное исследование топографии и активности ТчЮ-синтезирующих ферментов и факторов апоптоза в поврежденной слизистой оболочке верхнечелюстного синуса человека и крысы.
Впервые продемонстрированы клинико-морфологические критерии и стадии репарации скуловерхнечелюстного комплекса у человека на разных сроках после травмы и неправильно консолидированного перелома.
Впервые представлена экспериментальная модель деафферентации средней зоны лица и верхнечелюстного синуса.
Впервые установлен феномен апоптоза клеток слизистой оболочки верхнечелюстного синуса при деафферентации и экспериментальной травме костей черепа у крысы.
Впервые изучена динамика МАБРН-диафоразы и индуцибельного изофер-мента ИО-синтазы в клетках слизистой оболочки и проведен сравнительный анализ изменений, связанных с их апоптозом при хроническом риносинусите у человека.
Впервые исследована связь апоптоза с механизмами цитотоксического и протективного действия оксида азота в период восстановления слизистой оболочки после травмы.
Теоретическая и практическая значимость работы. Изучены топография и активность нитроксидсинтезирующих ферментов и факторов апоптоза в условиях репаративной регенерации слизистой оболочки верхних дыхательных путей и полости рта для выяснения роли модулирующих цитопротективных и цитотоксических эффектов и обоснования рациональной терапии стоматологических заболеваний.
Создана адекватная экспериментальная модель деафферентации верхнечелюстного синуса, имеющая реальные перспективы для дальнейших исследований в стоматологии и отоларингологии, разработки новых патогенетически ориентированных программ терапии острого и хронического синуситов, а также рекомендаций по реабилитации пациентов после травм костей лицевого черепа, гайморотомии, реконструктивных операций на средней зоне лица, в том числе дентальной имплантации и синуслифтинга.
Положения, выносимые на защиту:
1. Травматические и деафферентационные повреждения верхнечелюстного синуса вызывают селективные морфологические и цитохимические альтерации клеток различных слоев слизистой оболочки;
2. Апоптоз является постоянным компонентом вторичного повреждения слизистой оболочки и имеет специфическую динамику на разных стадиях хронического воспаления;
3. Динамика изменения ТТМЕЬ-иммунореактивных клеток, а также локализация МАБРН-диафоразы и индуцибельной 1\Ю-синтазы в слизистой оболочке верхнечелюстного синуса видоспецифичны и зависят от этиологии повреждающего фактора.
4. Репаративные и цитотоксические процессы в слизистой оболочке обусловлены кооперативным взаимодействием различных популяций N0-синтезирующих, р53- и Вс1-2- иммунореактивных клеток.;
Степень достоверности и апробация результатов. Степень достоверности результатов проведенного исследования определяется соответствием его дизайна критериям доказательной медицины, анализом репрезентативных выборок, достаточным объёмом наблюдений с использованием современных разноплановых методов исследования. Примененные статистические методы адекватны поставленным задачам, а сформулированные положения, выводы и практические рекомендации аргументированы и логически вытекают из анализа полученных данных
По теме исследований опубликована 1 монография и 30 научных работ, 13 из которых - в изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией для публикации результатов диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук.
Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Тихоокеанских научно-практических конференциях ВГМУ (Владивосток, 2004-2008), Приморских краевых ежегодных конференциях «Хирургия лица» (2006-2008), Имплантологических коференциях «Восток-Запад» (Владивосток, 2010, 2011), Должановских чтениях (Воронеж, 2011), IV научной конференции «Микроциркуляция в клинической практике» памяти проф. В.В. Куприянова (Москва, Университет дружбы народов, 2012).
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Анатомо-физиологическая характеристика верхнечелюстного синуса
Верхнечелюстная (гайморова) пазуха - парная придаточная полость носа, располагающаяся в толще верхней челюсти и являющаяся самой большой из всех околоносовых пазух. Получила свое название от имени британского хирурга Nathaniel Highmore (1613-1685), впервые описавшего ее патологию.
Форму верхнечелюстной пазухи человека можно сравнить с трехгранной пирамидой, основание которой составляет внутренняя, или носовая, стенка, а верхушка направлена к скуловой кости. Помимо основания, пазуха имеет три поверхности: верхнюю - глазничную, передненаружную — лицевую и заднена-ружную, обращенную к подвисочной и крылонебной ямкам.
Правая и левая пазухи, как правило, асимметричны - левая больше правой, их высота у взрослого человека колеблется от 2,3 до 4,3 см, ширина - от 1,9 до 3,0 см, объем - от 4,2 до 20,5 см3 (Михалойц Н.И., 1938). Линейные размеры и объем гайморовых пазух у мужчин превышают таковые у женщин (Костомано-ва Н.Е., 1957, 1960). У детей верхнечелюстная пазуха развивается по мере роста лицевого скелета и к 10 годам имеет те же взаимоотношения с соседними анатомическими структурами, что и у взрослых.
Слизистая оболочка пазухи выстлана многорядным мерцательным эпителием с бокаловидными клетками, который лежит на собственной пластинке, содержащей слизистые железы. Бокаловидные клетки диаметром 5-10 мкм, продуцирующие слизь, расположены в эпителиальном пласте неравномерно. Альвеолярные и альвеолярно-трубчатые железы, вырабатывающие слизь и серозный секрет, расположены в собственной пластинке и подслизистом слое. Их толщина достигает 75-100 мкм, а диаметр - 0,2-0,4 мм (Бабияк В.И. и др., 2002).
В последнее время особое внимание уделяется строению структур боковой стенки носа и остиомеатального комплекса - системы анатомических образований в области переднего отдела средней носовой раковины (от ostium - отверстие, meatus - ход). Остиомеатальный комплекс и включает в себя следующие
структуры: латеральную поверхность средней носовой раковины, крючковид-ный отросток (формирует медиальную стенку воронки), воронку (принимающую слизь из верхнечелюстной пазухи, передней группы клеток решетчатой и лобной пазух и распределяющую воздух для циркуляции по этим синусам), отверстие верхнечелюстной пазухи (которое открывается в передненижнюю часть воронки), переднеэтмоидальные в�
-
Едранов, Сергей Сергеевич
-
доктора медицинских наук
-
Владивосток, 2014
-
ВАК 03.03.04
- Структурно-функциональные изменения слизистой оболочки верхнечелюстной пазухи при хронических одонтогенных синуситах и их хирургическая коррекция
- Структурные изменения слизистой оболочки верхнечелюстного синуса при его механической травме (экспериментальное исследование)
- Фотодинамическая терапия острых и хронических верхнечелюстных синуситов
- Участие регуляторных пептидов в поддержании тканевого гомеостаза слизистой оболочки желудка
- Влияние травмирования семян на посевные качества и урожайность нута в Нижнем Поволжье
