Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействия ферментов гликогенолиза в условиях молекулярного краудинга

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Чеботарева, Наталья Александровна

Актуальность исследований. Взаимодействия между молекулами лежат в основе всех биохимических процессов. Развитие новых представлений, новой техники и новых методик играет большое значение для более глубокого понимания этих взаимодействий. Отличительная особенность живых систем состоит в том, что биохимические процессы протекают в среде, содержащей высокие концентрации макромолекул (50-400 мг/мл) [Zimmerman and Minton, 1993]. При этом важно подчеркнуть, что концентрации макромолекул одного сорта относительно невелики. Однако в совокупности макромолекулы, присутствующие в клетке, занимают значительную часть объема среды (до 40%), вследствие чего доступный объем в клетке сокращается. Подобные условия в клетке обозначаются как макромолекулярный краудинг (crowding). Этот термин означает неспецифическое влияние исключенного объема на биохимические и биофизические процессы. «Молекулярный краудинг» более точно означает «эффект исключенного объема», потому что главная его характеристика - это взаимная непроницаемость всех молекул растворенных веществ. Влияние исключенного объема на гидродинамические и термодинамические свойства растворов компактных глобулярных белков можно объяснить с помощью моделей, рассматривающих молекулы белка как жесткие частицы сферической формы. Исключается объем, который недоступен центру сферы. Было предсказано теоретически и показано экспериментально значительное влияние краудинга на скорости и равновесия биохимических реакций [Zimmerman and Minton, 1993; Minton, 2001; Ellis, 2001, Ellis and Minton 2003; Чеботарева и др., 2004]. Любые реакции, приводящие к увеличению доступного клеточного объема, будут стимулироваться в условиях краудинга. К таким реакциям относятся ассоциация макромолекул, образование мультиферментных комплексов, фолдинг белков и нуклеиновых кислот с образованием компактных структур, образование агрегатов и амилоидных тел включения при некоторых заболеваниях (болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и др.).

Условия краудинга в клетке могу г создаваться не только присутствием макромолекул, но и высокими концентрациями осмолитов — соединений, которые накапливаются живыми организмами в ответ на стресс (осмотический, химический или термический). Осмолиты - это низкомолекулярные органические соединения, такие как полиолы, некоторые аминокислоты и метиламины. Накоплено много экспериментальных данных по защитному действию осмолитов, однако молекулярные механизмы их действия в значительной степени остаются невыясненными.

Для понимания биохимических процессов, происходящих в живой клетке, необходимо имитировать условия краудинга в экспериментах in vitro. В настоящей работе для имитации условий молекулярного краудинга использовали высокие концентрации природных осмолитов.

Главными объектами исследования в настоящей работе были ключевые ферменты гликогенолиза - гликогенфосфорилаза Ъ и киназа фосфорилазы.

Седиментационный анализ остается одним из наиболее действенных методов исследования макромолекулярных взаимодействий. Метод основывается на равновесной и неравновесной термодинамике и позволяет получить характеристики гидродинамических свойств белков, мультиферментных комплексов и взаимодействий типа белок-лиганд. В настоящей работе седиментационный анализ является одним из основных методов исследования.

Целью нашей работы было изучение взаимодействия ферментов тликотенолиза в условиях молекулярного краудинга, создаваемого высокими концентрациями осмолитов. В соответствии с данной целью в работе решались следующие конкретные задачи: охарактеризовать взаимодействие белок-лиганд в случае ассоциирующей ферментной системы гига димер-тетрамер, изучить роль пиридоксаль-5'-фосфата как конформационного кофактора фосфорилазы Ъ (РЫ>),

• исследовать тепловую и химическую (под действием гуанидин-гидрохлорида) денатурацию РЫ>,

• исследовать влияние краудинга на взаимодействие типа белок-лиганд на примере.ЕЫ> и аллостерического ингибитора, FAD; исследовать взаимодействие киназы фосфорилазы (PhK) с FAD,

• исследовать влияние краудинга на ассоциацию фосфорилазы Ъ, изучить влияние краудинга на ассоциацию киназы фосфорилазы, на ее взаимодействие с гликогеном и с белковым субстратом, фосфорилазой Ъ,

• изучить эффект молекулярного «ограничения» (confinement), создаваемого в обращенных мицеллах, на олигомерное состояние фермента.

Для достижения поставленных целей было необходимо провести компьютеризацию аналитической ультрацентрифуги, модель Е, и использовать новейшее математическое обеспечение для седиментационного анализа.

Научная новизна и практическая значимость. Впервые проведены систематические исследования влияния молекулярного краудинга на ключевые ферменты гликогенолиза: фосфорнлазу b и киназу фосфорилазы. In vitro условия краудинга имитировались высокими концентрациями осмолитов. Установлено влияние краудинга на взаимодействия типа белок-лиганд и белок-белок, на реакцию изомеризации макромолекул и образование надмолекулярных структур. Показано стимулирующее действие осмолитов (триметиламин-]М-оксида и бетаина) на ассоциацию киназы фосфорилазы с образованием надмолекулярных структур. Впервые было исследовано взаимодействие FAD с киназой фосфорилазы. Показано, что FAD связывается с киназой фосфорилазы. В условиях молекулярного краудинга FAD ингибирует ассоциацию киназы фосфорилазы. Разработана новая методика для седиментационного анализа взаимодействий белок-лиганд в случае ассоциирующей ферментной системы типа димер-тетрамер.

Выполненные исследования имеют фундаментальное значение, поскольку реальное функционирование биохимических систем протекает в условиях краудинга. Практическую ценность может представлять использование условий краудинга для стабилизации белков при решении биотехнологических задач или для кристаллизации белка. Исследования такого рода помогут в дальнейшем найти подходы к разработке новых методов лечения таких серьезных заболеваний, как болезни Паркинсона и Альцгеймера, связанные с образованием неспецифических белковых ассоциатов.

На защиту выносятся следующие основные положения:

Для ферментов метаболизма гликогена молекулярный краудинг является фактором, оказывающим существенное влияние на такие биохимические реакции, как ассоциация, изомеризация, взаимодействие ферментов с гликогеном и специфическими лигандами. • Молекулярное «ограничение» (разновидность краудинга), моделируемое системой обращенных гидратированных мицелл аэрозоля ОТ в октане, влияет на олигомерное состояние белка, включая образование надмолекулярных комплексов (на примере фосфорилазы Ь). Термоденатурация фосфорилазы b протекает по диссоциативному механизму, то есть включает стадию обратимой диссоциации димера на мономеры и следующую за ней стадию необратимой денатурации мономера. Осмолиты оказывают стабилизирующее действие при денатурации фосфорилазы b под действием GuHCl.

Пиридоксаль-5'-фосфат в молекуле PhЬ играет роль конформационного кофактора, стабилизирующего активную структуру нативного фермента и регулирующего сродство к субстратам и эффекторам.

Апробация работы. Результаты работы в качестве устных и стендовых докладов были представлены на: II и III Съездах Биохимического Общества РАН (Москва, 1997; С.-Петербург, 2002), Международном симпозиуме по Структуре, стабильности и фолдшпу белков (Москва, 1998), II Международном симпозиуме «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии» (Дубна, 2001), Международном симпозиуме "Hydro 2000. The 6th UK Analytical Ultracentrifuge Users Meeting" (Glasgow, 2000), Международной конференции по биокатализу (Москва, 2000), Euroconference "Advanced in Analytical Ultracentrifugation and Hydrodynamics" (Autrance, France, 2002), EMBO workshop "Biological Implications of Macromolecular Crowding". (Avila, Spain, 2003), Intermolecular Associations in 2D & 3D. The Biochemical Society, London. (Nottingham, 2003), III Съезде биофизиков России, (Воронеж, 2004), 7th UK Ultracentrifuge Conference. A British Biophysical Society Meeting (Oxford, 2004), 11th, 14th and 15th International Symposium on Analytical Ultracentrifugation, (Potsdam, 1999, Lausanne, 2005, London, 2006).

Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль в выборе направления исследований, в постановке и решении конкретных задач, обсуждении, оформлении и обобщении полученных результатов. Седиментационные исследования, расчеты и объяснение результатов проведены лично автором. Соавторы принимали участие в проведении экспериментов и обсуждении результатов. В исследованиях, проведенных в соавторстве с зарубежными коллегами, личный вклад автора заключался в постановке задачи, в проведении эксперимента, в обсуждении и оформлении полученных результатов. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, основная идея которых принадлежит автору диссертации и в получении которых роль автора была определяющей.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 обзоров, 36 статей в российских и международных журналах и 9 статей в сборниках.

Глава 1. Седиментационный анализ взаимодействий белок-лиганд для ассоциирующей ферментной системы типа димер-тетрамер

Нами [Чеботарева и др., 1990; Chebotareva et al., 1991] предложена новая методика, позволяющая контролировать положение равновесия между олигомерными формами фермента и рассчитывать степени насыщения индивидуальных форм фермента лигандом. Метод основан на одновременном использовании шлирен-оптической системы и абсорбционной сканирующей оптической системы аналитической ультрацешрифуги Spinco, модель Е. Метод использован для изучения связывания FMN с PhЪ в условиях существования равновесия димер о тетрамер (в присутствии 1 мМ AMP, 17 °С). Доли димерной и тетрамерной форм определяли с помощью шлирен-системы.

Димерная и тетрамерная формы Ph/> представлены наг -шлирен-седиментограмме в виде двух частично накладывающихся друг на друга пиков (рис. 1.1 А). Площадь под пиком соответствует концентрации данной олигомерной формы. Для оценки относительных долей димерной и тетрамерной форм фермента шлирен-седиментограмму описывали эмпирическим уравнением суммы двух Гауссовых функций. Константу ассоциации равновесия 2D <г> Т рассчитывали по формуле: #ass = (1-у)/2у2 [Р]0, где у доля димерной формы, [Р]0 - молярная концентрация фермента в расчете на димер. Для определения концентрации свободного FMN и количества FMN, связанного димерной и тетрамерной формами РЫ>, использовали абсорбционную оптическую систему (рис. 1.1Б). Выбранная длина волны (471 нм) соответствовала изобестической точке для спектров поглощения свободного и связанного флавина. Быстро движущаяся граница соответствует седиментации комплекса тетрамерной формы Phb с FMN, а медленно движущаяся граница -седиментации комплекса димерной формы. Phb с FMN.

Рис. 1.1. Шлирен-седиментограммы РЪЬ (7,6 мг/мл) в присутствии 72 мкМ FMN (А). Седиментация комплексов FMN с димерной и тетрамерной формами фермента (Б, регистрация с помощью абсорбционной сканирующей системы при 471 нм). Скорость вращения ротора 60 ООО об/мин. 50 мМ глицил-глициновый буфер, рН 6,8; 1,0 мМ AMP, 0,1 М КС1,17 °С).

Плато у мениска (AAj), формирующееся после оседания комплексов фермента с лигандом, дает возможность рассчитать концентрацию свободного лиганда [L], по формуле: [L] = [L]oAAi/Ao, где [L]o - общая концентрация FMN, А0 - соответствующее ей оптическое поглощение, определяемое независимо. Подобным образом вычисляется концентрация лиганда, связанного димерной формой фермента, [L]D, с использованием оптического поглощения (ДА?), соответствующего медленно движущейся границе: JL]D = [ЦЛА2/А0. Концентрация FMN, связанного тетрамерной формой, [L] , вычислялась по формуле: [L]T = [L]0 - [L]° - [L],

Предложенный метод позволяет построить зависимость величины кажущейся константы ассоциации от концентрации свободного FMN (рис. 1.2), а также функции насыщения димерной и тетрамерной форм PhZ> (рис. 1.3). 10"^ м"

FMN}, мкМ

Рис. 1.3. Функции насыщения димерной (1) и тетрамерной (2) форм фосфорилазы b FMN [Chebotareva et al., 1991] Условия те же, что и в подписи к рис. 1.1.

10 20 [FMNJ, мкМ

Рис. 1.2. Зависимость кажущейся константы ассоциации рановесия димер теграмер, от концентрации свободного FMN (в присутствии 1 мМ AMP) [Chebotareva et al., 1991]. Условия re же, что и в подписи к рис. 1.1.

Степень насыщения димера FMN рассчитывали как отношение концентрации лиганда, связанного димерной формой фермента (эта величина определена с помощью абсорбционной оптической системы), к молярной концентрации димерной формы Phb (эта величина определена с помощью шлирен-седиментограммы). Аналогичным способом рассчитывалась степень насыщения тетрамера FMN. Рис. 1.3 показывает зависимости степени насыщения (Y) димера (1) и тетрамера (2) ог концентрации свободного лиганда. Эти зависимости имеют гиперболическую форму. Предполагалось, что лиганд-связывающие центры каждой олигомерной формы являются эквивалентными и независимыми. Константы диссоциации для комплексов димерной и тетрамерной форм Phft с FMN найдены равными 10,0 ±0,5 и 79 ±8 мкМ соответственно. Полученные значения констант диссоциации характеризуют сродство олигомерных форм PhZ> к FMN в условиях насыщения аллостерического активаторного центра AMP.

Интересно отметить, что AMP при относительно высоких концентрациях смещает равновесие димер-тетрамер в сторону димерной формы (рис 1.4). Увеличение концентрации AMP от 1 мМ до 10 мМ приводит к 3-5-кратному снижению Xasj. Согласно данным микрокалориметрии, равновесного диализа и рентгеноструктурного анализа при использовании высоких концентраций AMP связывается во втором аллостерическом центре (ингибиторном центре) с меньшим сродством. Таким образом, связывание AMP в ингибиторном центре приводит к ослаблению связей между димерами в тетрамерной форме. Такое действие AMP полностью аналогично действию флавинов.

Тот факт, что аллостерический активатор AMP при относительно низких концентрациях способствует ассоциации PhЪ, тогда, как связывание лигандов в аллостерическом ингибиторном центре (флавины, AMP при относительно высоких концентрациях) приводит к противоположному эффекту, позволяет рассматривать способность к ассоциации в качестве теста на изменения конформации молекулы фермента индуцированные агатостерическими эффекторами.

Рис. 1.4. Шлирен-седиментограммы Phi (7,3 г/л) в присутствии 10 мМ AMP (верхняя седиментограмма) и 1 мМ AMP. (нижняя седиментограмма). Скорость вращения ротора 56 ООО об/мин. 50 мМ глицил-глициновый буфер, рН 6,8, 0,1 МКС1,18 °С).

Глава 2. Роль PLP как конформационного кофактора фосфорилазы

Четвертичная структура хопофермента, апофермента и фермента, реконструированного с аналогами PLP. Для характеристики роли кофактора, пиридоксаль-5'-фосфата (PLP), в поддержании нативной конформации PhZ> мы провели сравнительный анализ четвертичной структуры холофермента, апофермента и фермента, реконструированного с аналогами PLP, взаимодействия их с субстратом (гликогеном) и аллостерическим ингибитором (FMN).

PLP, входящий в состав каталитического центра, располагается в сильно гидрофобном окружении и его альдегидная группа связана в форме Шиффова основания с остатком Lys-680 (рис. 2.1).

Рис. 2.1. Схематическое изображение активного центра Ph& Красным цветом показана молекула PLP. Синим цветом показаны аминокислотные остатки С-концевого домена, принимающие участие в связывании кофактора, зеленым цветом -аминокислотные остатки N-концевого домена. Альдиминная связь PLP с Lys-680 показана желтым цветом, молекулы воды изображены крестиками [Johnson et al., 1989].

Восстановление альдиминной связи при помощи боргидрида натрия (NaBH4) необратимо фиксирует PLP на ферменте с сохранением 60% исходной активности фосфорилазы. Отщепление PLP от Vhb в мягких условиях приводит к образованию полностью неактивного апофермента, легко диссоциирующего на мономеры. Понижение температуры и повышение концентрации белка вызывает ассоциацию апофермента. Согласно данным седиментационного анализа в интервале температур 15-35 °С при концентрации до 1 мг/мл апо-PhA существует в виде мономера (коэффициент седиментации s2o,w = 5,1 - 5,3 S), при 10 °С в виде димера (,?2о,« = 7,4 S) (таблица 2.1). РЫ> в отсутствие AMP представлена димерной формой (,v°2o,w = 8,7 S) и не зависит от температуры.

Таблица 2.1. Седиментационный анализ олигомерного состояния апофосфорилазы Ь (0,05 М jg-глнцерофосфатный буфер, рН 6,8).

Температура, Концентрация Коэффициент седиментации

С апофермента, мг/мл s20,w> S

10 1,0 7,

15 1,0 5,1 16,

20 0,5 5,

0,8 5,

1,0 4,

2,1 6,3 16,

6,7 8,0 24,

25 1,0 5,

5,4 6,8 12,

30 1,0 5Д

35 1,0 4,

Рис. 2.2. Изотермы связывания нативной Phi, арофермснта и фермента, реконструированного с PLP, гликогеном со средней молекулярной массой 5,5-106 Да. Данные представлены в координатах {г, [Е]}, где г - количество Phi (в молях димеров фермента), адсорбированной 1 г гликогена. А - нативная PhЬ (1), апофермент (2) в 0,05 М p-глицерофосфатном буфере, рН 6,8. Б - нативная Ph& (i), Phfe, реконструированная с PLP (2), в 0, 05 М глицил-глициновом буфере, рН 6,8, 20 °С [Чеботарева и др., 1995].

Согласно данным седиментационного анализа апо- и холо-формы фермента значительно различаются по сродству к гликогену и FMN. При расчете константы диссоциации (Ка№) комплекса Phi-гликоген использовали уравнение: г = rmJ(\+K&J[E\), где г - количество молей PhZ>, связанных 1 г гликогена, rmax - адсорбционная емкость гликогена и [Е] -равновесная концентрация фермента. Адсорбционную емкость принимали одинаковой по отношению к холо- и апоферменту (rmax = 3,6-10"6 моль связанных димеров фермента на 1 г гликогена или 0,71 г РЫ? на 1 г гликогена). Сродство апоформы к гликогену в

5 раз ниже, чем сродство холофермента (рис. 2.2А) [Чеботарева и др., 1994; 1995]. Микроскопическая константы диссоциации, Kiiss, комплекса FMN-апофосфорилаза составляет 240 ± 70 мкМ, а для комплекса FMN-РЫ» - 6,8 ± 0,3 мкМ (20 °С, рН 6,8) (табл. 2.2) (Чеботарева и др. 1995]. Из сопоставления констант диссоциации апоформы и нативного фермента следует, что сродство к FMN у апофермента в 35 раз ниже, чем у РЬЬ. Приведенные данные указывают на то, что удаление кофактора приводит к определенным структурным перестройкам в молекуле РИА, в частности, в области контакта мономеров в димере, в области центра запасания гликогена и в области ингибиторного аллостерического центра.

Реконструкция Ph& из апоформы и PLP приводит к восстановлению сродства фермента и к гликогену (рис. 2.2Б), и к FMN (табл. 2.2).

Таблица 2.2. Сродство реконструированных форм РЫ> к FMN (20 °С, 50 мМ глицилглициновый бу<])ер, рН 6,8) [Чеботарева и д р., 1995]

Форма фермента Константы диссоциации комплексов с FMN, A'fe, мкМ

Нативная Phb Апофермешг Phb, реконструированная с PLP Phb, реконструированная с аналогом I Phb, реконструированная с аналогом II Phb, реконструированная с аналогом III 6,8 ± 0,3 240 i 70 8,7 ± 0,4 26,0 + 1,5 140 ± 13 260 ±

Данные получены методом скоростной седиментации.

Мегодом седиментационного анализа было проведено исследование переходов на уровне четвертичной структуры и сродства к гликогену и FMN для фермента, реконструированного с аналогами PLP по пятому положению, что позволило получить дополнительные данные о роли PLP в фосфорилазе как конформационного кофактора [Чеботарева и др., 1994; 1995].

Изученные аналоги содержали в пятом положении вместо -СН20Р(0)(0Н)2 следующие заместители: -СН2СН2СООН (аналог I), -транс-СНСНСООН (аналог II), -ОСООН (аналог Ш). Как и следовало ожидать, реконструированные с этими аналогами формы фермента каталитической активности не проявляли. По способности к ассоциации эти формы существенно отличались от нативной Рhb и фермента, реконструированного с PLP (табл. 2.3). Известно, что в условиях насыщения аллостерического актжваторного центра AMP, Phb представляет собой ассоциирующую систему типа димер 3== тетрамер [Курганов и др., 1994]. При 17 °С константа ассоциации, для нативной Рhb равна 2,4-104 М"1 (табл. 2.3) [Chebotareva et al., 1991]. Фермент, реконструированный с PLP, не отличается по величине ATass от исходной формы. Для фермента, реконструированного с аналогами I, II и III, равновесие димер<-утетрамер сильно сдвинуто в сторону тетрамерной формы (табл. 2.3) [Чеботарева и др., 1995]. Таким образом, фермент, реконструированный с аналогами I, II и III, существенно отличается от нативного по способности ассоциировать в тетрамер. Природа заместителя в 5-ом положении практически не влияет на способность Phi связывать гликоген [Чеботарева и др., 1994; 1995]. Совершенно иная картина наблюдается для связывания аллостерического ингибитора FMN. Как видно из табл. 2.2, сродство фермента, реконструированного с аналогами I, И и III, к FMN значительно ниже, чем сродство к этому эффектору в случае нативного фермента, причем для аналога III оно так же мало, как и для апофермента 240 ± 70 мкМ.

Таблица 2.3. Влияние реконструкции на способность Phi к ассоциации, индуцируемой AMP (17°, 50 мМ глицил-глициновый буфер, рН 6,8)

Форма фермента Константа ассоциации для равновесия димер-тетрамер, КЮ5, М"

Нативная Phb 2,4

РЫ>, реконструированная с PLP 2,4

Phb, реконструированная с аналогом I 2,0

Ph6, реконструированная с аналогом II 7,0

Phft, реконструированная с аналогом III Преимущественно тетрамер

Данные получены методом скоростной седиментации.

Совокупность этих данных указывает на важную роль PLP в поддержании четвертичной структуры и определенной конформации фермента, необходимой для взаимодействия с субстратом и аллостерическими ингибиторами.

Термостабилъностъ хопофермента, апофермента и фермента, восстановленного боргидридом Ыа. Чтобы охарактеризовать роль PLP в поддержании нативной структуры фермента, был проведен сравнительный анализ термостабильности нативной РЫ> и ее апоформы методом ДСК. Обнаружено существенное смещение положения максимума на кривой зависимости избыточного теплопоглощения (ДСр) от температуры в сторону более низких

ДСр, кДж моль*1К"'

56,8°С температур для апоформы (на 8.6 °С) по сравнению с холоформой (рис. 2.3). Термостабильнссгь реконструированного с PLP фермента (рис. 2.3, кривая 5) практически совпадает с таковой для исходного ферменга. Для Phi, реконструированной с аналогами PLP,

Рис. 2.3. Зависимости избыточного теплопоглощения, ЛСр, от температуры для холо-РЫ> (/), апо-Phb (2) и реконструированного с PLP (3) фермента (концентрация фермента во всех образцах составляла 0,7 мг/мл). 30 мМ Hepes-KOH буфер, рН

60 t, °с 7,0. Скорость сканирования 1 град/мин. содержащими в 5-положении остатки -СН2-СН2-СООН и -транс -СН=СН-СООН, полного восстановления {ЛСР; t}-профиля, характерного для холофермента, не происходит. Можно предположить, что основной причиной меньшей термостабильности апоформы Phb является то, что она легче переходит в мономерное состояние. Тем не менее, очевидно, что PLP оказывает общее стабилизирующее действие на нативную РЫ>.

Изучение термостабильности РЫ>, восстановленной NaBH4, дало дополнительное подтверждение участия PLP в стабилизации нативной конформации РЫ>.

Седиментациониый анализ восстановленной NaBH4 Phb (0,92 мг/мл) при 53 °С показывает, что восстановленный фермент седиментирует как развернутый мономер (sM,w = 3,6 S, рис. 2.4), в то время как нативная Phb при той же концентрации белка и той же температуре представлена, в основном, димерной формой (см. гл. 3). Таким образом, при повышении температуры восстановленная Phi диссоциирует на мономеры легче, чем нативный фермент.

Меньшая термостабильность восстановленной NaBEU Phft но сравнению с исходным ферментом была подтверждена также данными ДСК, согласно которым максимум на кривой зависимости ЛСР от t для восстановленной формы Ph£ находится при 54,2 °С, т.е. при более низкой температуре, чем для нативного фермента (56,8 °С) [Kurganov et al., 2000].

Стабильность холофермента и фермента, восстановленного боргидридом, по отношению к гуанидилгидрохлориду (GuHCl). На уменьшение прочности связей между субъединицами в димере Ph6 после обработки фермента боргидридом указывают также результаты изучения денатурации PhZ> под действием GuHCl. Диссоциация на мономеры в случае восстановленной Phi> наблюдается при меньших концентрациях GuHCl по сравнению с нативной Phb. Согласно данным седиментационного анализа при 2-часовой инкубации с 0,2 М GuHCl нативный фермент остается в форме димера (20 °С, рН 6,8; Рhb 0,4 мг/мл), а для восстановленной формы фермента в этих условиях доля мономера составляет 30%.

Таким образом, наряду с непосредственным участием в катализе, PLP выполняет роль конформационного кофактора, стабилизируя активную димерную структуру фермента и регулируя сродство Phb к субстратам и эффекторам.

Рис. 2.4. Седиментация восстановленной PhЪ (0,92 мг/мл) при 53 °С. Скорость вращения ротора 48000 об/мин. Время седиментации - 26, 33,38,51 и 54 мин.

Глава 3. Тепловая и химическая (под действием GuHCl) денатурации Phi

Седиментационный анализ диссоциации Phb при повышенной температуре. Использование аналитического ультрацентрифугирования для изучения тепловой денатурации олигомерных белков позволяет охарактеризовать олигомерное состояние белка и сделать заключение о наличии стадии диссоциации при переходе белка из нативного состояния в денатурированное. Седиментацию Phi при повышенных температурах изучали с использованием абсорбционной сканирующей оптической системы аналитической ультрацентрифуги Spinco, модель Е («Вескшап»). Ячейки с раствором фермента помещали в ротор, предварительно нагретый до заданной температуры. С этого момента регистрировали время инкубации Phi при выбранной температуре. Первое сканирование проводили в процессе разгона ротора на малых скоростях его вращения (3000 об/мин) после 5 мин инкубации фермента. Коэффициент седиментации приводили к стандартным условиям (растворитель с плотностью и вязкостью воды при 20 °С), используя формулу: где «I - коэффициент седиментации при заданной температуре (t), rjt и rj2o -значения вязкости воды при температуре t и 20 °С, tj^ij^ - отношение вязкости растворителя к вязкости воды, V2o - удельный парциальный объем фермента при 20 °С, p20,w ~ плотность воды при 20 °С, /\soi - плотность растворителя при температуре t; V ( - удельный парциальный объем фермента при температуре 1. Седиментационные исследования, проведенные при 53 °С, показали, что после 5-минутной инкубации Phi приблизительно 50% фермента агрегирует и осаждается при малых скоростях вращения ротора (3000 об/мин). Это свидетельствует об относительно высокой молекулярной массе образовавшихся агрегатов. При дальнейшем разгоне ротора до максимальной скорости (60 000 об/мин) осаждения каких-либо агрегированных форм не наблюдалось. На рис. 3.1 представлены седиментограммы, полученные в разные моменты времени после достижения скорости 60 000 об/мин для различных концентраций фермента: 0,3 (А), 0,46 (Б), 0,92 (В) и 2,5 мг/мл (Г). При относительно высоких концентрациях фермента (рис. 3.1 Б-Г) на седиментограммах наблюдаются две границы. Если для медленно седиментирующей границы коэффициент седиментации (s2o,w) мало изменялся при варьировании концентрации фермента (5,1 - 5,4 S), для быстро седиментирующей границы наблюдалось отчетливое снижение величины по мере уменьшения концентрации белка (от 7,9 S при [Е]0 = 2,5 мг/мл до 6,9 S при [Е]о = 0,46 мг/мл). Для нативной димерной формы Phi при 20 °С значение i2o,w составляет 8,2 S. Поэтому мы полагаем, что быстро движущаяся граница седиментации для Phi при 53 °С для достаточно высоких концентраций белка (рис. 3.1 Г) соответствует димерной форме фермента. Снижение величины ,y2o>w для быстрой границы с уменьшением величины [Е]0 можно объяснить исходя из предположения о существовании быстро устанавливающегося равновесия между димерной (D) и мономерной (М) формами фермента. Увеличение доли мономерной формы при разбавлении раствора белка должно приводить к снижению величины s2o,w а вследствие быстрых переходов мономер-димер обе формы седиментируют единой границей со значением коэффициента седиментации, близким к средневесовому.

Учитывая, что апофосфорилаза b существует в виде мономера с коэффициентом седиментации, равным 5,1 S (см. табл. 2.1), можно считать, что медленно седиментирующая граница Phb при [Е]0 = 0,46; 0,92 и 2,5 мг/мл соответствует мономерной форме фермента. Мы полагаем, что эта мономерная форма фермента седиментирует как отдельная граница в силу того, что она соответствует денатурированному состоянию фермента (Mde„), не способному к ассоциации в димеры. При концентрации Ph£>, равной 0,3 мг/мл (рис. 3.1А), для основной границы седиментации s20,w = 5,5 S, что соответствует мономерной А форме фермента. Как видно из рис. 3.1 А при увеличении времени седиментации граница для денатурированного мономера приобретает сложный вид, указывающий.на .увеличение полидисперсности седиментирующего вещества.

Оценка коэффициента седиментации для нижнего участка седиментационной границы дает величину, равную 4,4 S, что, по-видимому, соответствует денатурированной форме фермента с большей степенью разворачивания полипептидной цепи. Кроме того, профиль границы указывает на присутствие в системе агрегатов.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что инкубация Phi при 53 °С в течение 30-50 мин вызывает частичную диссоциацию димерной формы фермента на мономеры, протекающую в две стадии: обратимый переход D 2М и необратимая денатурация М —> Mden, сопровождающаяся разворачиванием полипептидной цепи мономерной формы [Kurganov et al., 2000].

Рис. 3.1. Седиментация фосфорилазы b при 53 °С. Концентрация Phb (мг/мл): А - 0,3; Б - 0,46; В -0,92 и Г - 2,5. Скорость вращения ротора 60 ООО об/мин. Направление седиментации слева направо. Время седиментации после достижения максимальной скорости: А - 6, 14, 20, 25 и 33 мин; Б - 10, 15,21,27 и 34 мин;В- 12, 18,23,29 и 36 мин; Г - 7, 13, 18, 22 и 27 мин.

Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) Phb. Использование метода ДСК для изучения тепловой денатурации белков позволяет охарактеризовать тепловой эффект при переходе белка из нативного состояния в денатурированное. В случае необратимо денатурирующих белков этот метод дает возможность оценить энергию активации процесса денатурации. Теоретические исследования, проведенные в работе [Sanches-Ruiz, 1992], показали, что в том случае, когда олигомерный белок обратимо диссоциирует на субъединицы, подвергающиеся необратимой денатурации, положение максимума на кривых зависимости избыточного теплопоглощения (ДСР) от температуры смещается в сторону более высоких температур с ростом концентрации белка. Как свидетельствуют данные, представленные на рис. 3.2, увеличение концентрации Phi от 0,5 до 6 мг/мл приводит к повышению температуры, соответствующей максимальному значению АСр, от 56,6 до 57,4 °С. Поглощение тепла при переходе Ph Ъ из нативного состояния в денатурированное, соответствует площади под кривой зависимости ДСР от температуры и составляет 1290 кДж/моль субъединиц фермента. Таким образом, результаты исследования тепловой денатурации фосфорилазы Ъ методом ДСК подтверждают вывод о диссоциации фермента при высоких температурах.

Влияние специфических лигандов на термоденатурацию фосфорилазы Ь. Методом ДСК показано влияние специфических лигандов на зависимость АСр от температуры. В отсутствие лигандов кривая избыточного теплопоглощения Ph b (0,57 мг/мл) имеет асимметричную форму с максимумом 56,8 °С. Для всех изученных лигандов, которые использовались при концентрациях близких к насыщению, температура максимума {АСР, t} -профиля увеличивалась в следующем порядке: 57,4 °С для субстрата (20 мМ глюкозо-1-фосфата), 58,1 °С для активатора (3 мМ AMP), 58,3 °С для конкурентного ингибитора (100 мМ глюкозы), 59,1 °С для аллостерического ингибитора (10 мМ глюкозо-6-фосфата) и 59,6 °С для аллостерического ингибитора (1 мМ FMN). Максимальный защитный эффект обнаружен для FMN. Следует отметить, что защитное действие AMP не связано с возможной ассоциацией димеров в тетрамеры, поскольку седиментационные исследования Phb (5,2 мг/мл) при температуре выше 45 °С не выявили тетрамерной формы Phi. По-видимому, защитное действие лигандов связано с их способностью

Рис. 3.2. Зависимости избыточного теплопоглощения (ДСр) фосфорилазы Ъ от температуры при следующих концентрациях белка (мг/мл): 1 - 0,5; 2~\;3-2\4-6. 30 мМ Hepes-KOH буфер, рН 7,0. препятствовать диссоциации димеров на мономеры. Это предположение подтверждают данные седиментационного анализа. Сравнение седиментационного поведения Phb (0,57 мг/мл) при 49 °С в отсутствие лигандов и в присутствии 1 мМ AMP показало, что в отсутствие AMP фермент существует в виде димера и мономера (s2o,w = 7,9 и s20,w = 5,8 S, соответственно), а в присутствии 1 мМ AMP - в виде димерной формы (s2o,w = 8,0 S). При объяснении эффекта специфических лигандов на тепловую денатурацию РЫ> следует учитывать, что процесс денатурации включает стадию обратимой диссоциации D 2М. Тот факт, что AMP и глюкозо-6-фосфат связываются в области контакта субъединиц, объясняет их способность препятствовать диссоциации на мономеры. Так как ингибиторный центр связывания FMN расположен в щели между двумя доменами субъединицы Phb, мономер, по-видимому, сохраняет способность связывать FMN. Следует отметить, что алоформа Phb, которая существует в виде мономера, способна связывать FMN, но сродство флавина к апоформе гораздо меньше, чем к холоферменту. Защитное действие FMN, по-видимому, связано с FMN-индуцированнымиконформационпыми изменениями в мономерах, способствующими их ассоциации в димеры.

Таким образом, данные седиментационного анализа и ДСК свидетельствуют, что тепловая денатурация Phfe происходит по диссоциативному механизму, включающему стадию обратимой диссоциации на мономеры с последующей денатурацией изолированных мономеров.

Диссоциативный характер денатурации Phb под действием гуанидин-гидрохлорида (GuHCl) подтвержден данными скоростной седиментации. Диссоциация Phfr (0,4 мг/мл) на мономеры показана при концентрациях (0,3-0,7) М GuHCl. При увеличении концентрации GuHCl от 0 до 0,7 М коэффициент седиментации фермента снижается от j2c,w = 8,3 S до 5,0 S, что соответствует димерной и мономерной форме РЫ>. Помимо этого появляются денатурированные формы с ,y2o,w = 3,4 S. При 1 М GuHCl происходит агрегация фермента.

Согласно предсказаниям теории краудинга, осмолиты в высоких концентрациях должны сдвигать равновесие N D (где N - нативный белок, a D — денатурированный) в сторону нативного белка. При исследовании влияния осмолитов на кинетику химической денатурации РЫ> гуанидингидрохлоридом показано защитное действие ТМАО, бетаина, пролина и глицина. В рамках теории активированного комплекса стабильность фермента характеризуется изменением свободной энергии активации (А (У0*) процесса денатурации, а стабилизирующий эффект -изменением величины ДА G„ = ЛС*0[М- A G0* или A AG* = - RTln(£/£0), где A Gl и A G*„om - изменение свободной энергии активации, кп н к - константы скорости инактивации Yhb в 0,7 М GuHCl в отсутствие и в присутствии осмолита соответственно.

Мерой стабилизации белка является тангенс угла наклона прямой на графике зависимости \п{к!к^) от концентрации осмолита (рис. 3.3). Наиболее выраженный стабилизирующий эффект оказывают ТМАО и бетаин, наименее выражен эффект глицина (таблица 3.1)

In(к/к0)

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 [Осмолит], М

Рис. 3.3. Защитное действие осмолитов — ТМАО (1), бетаина (2), пролина (3), глицина (4) - при инактивации фосфорилазы Ъ под действием 0,7 М GuHCl при 25 °С.

Таблица 3.1. Стабилизирующий эффект осмолитов при инактивации Phb под действием 0,7 М GuHCl [Еронина и др., 2005]

Осмолит АД G*. кДж/моль

ТМАО 26,

Бетаин 24,

Еролин 12,

Глицин 6,

Исследование механизмов защиты белков при денатурации имеет фундаментальное значение для понимания фолдинга, стабильности и функций белков, а также представляет интерес для биотехнологии, эволюционной биологии и медицинской биохимии.

Глава 4. Взаимодействие киназы фосфорилазы с FAD

Известно, что некоторые ферменты белок-гликогенового комплекса в скелетных мышцах связывают флавины. Нами было детально исследовано взаимодействие флавинов (рибофлавина, FMN и FAD) с Phfe [Chebotareva et al., 2001; Курганов и др., 1994]. Все исследованные флавины имели высокое сродство к Phb и оказывали ингибирующее действие на фермент, причем наиболее сильным действием обладал FMN. Известно, что FMN оказывал сильное ингибирующее действие на гликогенсинтазу из скелетных мышц кролика [Судаков и Соловьева, 1989]. Поэтому представляло интерес изучить возможность взаимодействия флавинов с другими ферментами белок-гликогенового комплекса, в частности, с РЖ, ключевым регуляторным ферментом гликогенолиза. В качестве флавина нами был выбран FAD, поскольку он является преобладающей формой флавинов в животных тканях.

Изучение взаимодействуя PhK с FAD методом седиментации. На рис. 4.1 представлены седиментограммы киназы фосфорилазы в присутствии FAD. Длина волны 450 нм соответствует максимуму поглощения FAD. Так как при згой длине волны поглощение фермента пренебрежимо мало, то седиментирующая граница (с

15i- коэффициентом седиментации 19S) соответствует образовавшемуся комплексу РЖ с FAD. 010I- Для анализа олигомерного состояния PhK седиментацию фермента в присутствии и в отсутствие FAD регистрировали также при длине волны 280 нм (рис. 4.2). На рис. 4.2А представлено дифференциальное распределение коэффициента седиментации c(s) PhK в присутствии FAD. Средний коэффициент седиментации был определен путем интегрирования распределения ф) и составлял 17,1 S. После приведения к стандартным условиям ^o.w = 19,4 S. Из представленных данных следует, что фермент находится в мономерной форме. Для сравнения показано также ф) распределение PhK в отсутствие флавина при 20 °С (рис. 4.2Б).

Из рисунка видно, что.помимо мономерной формы (23 S) присутствуют димерная и более высокомолекулярные формы фермента. Меньший коэффициент седиментации мономерной формы киназы фосфорилазы в присутствии FAD (19,4 S) по сравнению со значением 23 S свидетельствует об изменении конформации фермента при связывании FAD. г, см

Рис. 4.1. Связывание FAD с юшазой фосфорилазы. Седиментограммы комплекса FAD-PhK. Направление седиментации слева направо. Скорость вращения ротора 48 ООО об/мин, время седиментации 12, 24 и 36 мин. Длина волны 450 нм. мМ Hepes, pll 6,8. 0,1.мМ Са2+, 1. мМ Mg2+, 20 "С. Концентрация фермента 1,1 мг/мл, концентрация FAD 9,7 мкМ.

Влияние FAD на ассоциацию PhK в условиях молекулярного краудинга. Поскольку высокие концентрации ТМАО, имитирующие условия краудинга в клетке, вызывают ассоциацию PhK, представляло интерес выяснить, влияет ли FAD на ассоциацию PhK в присутствии ТМАО. На рис. 4.3 представлены кинетические кривые ассоциации PhK в присутствии 1 М ТМАО. Кинетические кривые регистрировали турбидиметрическим методом. Кинетику ассоциации PhK, индуцируемую ТМАО, изучали в отсутствие и в присутствии FAD (12,5-63,0 мкМ). Как видно из рис. 4.3А FAD препятствует ассоциации PhK.

Рис. 4.2. Дифференциальное распределение с($) PhK (1 мг/мл) в присутствии 9,7 мкМ FAD (А) и в отсутствие FAD (Б). Скорость вращения ротора 44 000 об/мин (А) и 30 000 об/мин (Б). Длина волны 280 нм. 40 мМ Hepes, рН 6,8, 0,1 мМ Са2+, 10 мМ Mg2>; 17 °С (А), 20 °С (Б).

Рис. 4.3. Влияние FAD на ассоциацию киназы фосфорилазы, индуцируемую 1 М ТМАО в 40 мМ Hepes, рН 6,8 (22° С). А - Кинетические кривые изменения оптического поглощения при 600 нм (Лйоо)> полученные при различных концентрациях FAD: 0 мкМ (/), 12,5 мкМ (2) и 63 мкМ (3). Процесс ассоциации инициировали добавлением ионов кальция и магния к раствору, содержащему PhK (56 мкг/мл), 1 М ТМАО и различные концентрации FAD. Конечные концентрации Са2+и Mg2+ составляли 0,1 и ЮмМ соответственно. Б-Зависимость относительной начальной скорости ассоциации PhK (v/v0) от концентрации FAD. v0 и v -начальные скорости ассоциации PhK в отсутствие и в присутствии FAD, соответственно.

Для каждой кинетической кривой была определена начальная скорость изменения поглощения при 600 нм, которая характеризует скорость ассоциации фермента. На рис. 4.3Б показано, что величина относительной начальной скорости ассоциации PhK (w/w0) снижается с увеличением концентрации FAD. В исследованиях по включению 32Р в фосфорилазу Ь в ходе киназной реакции в отсутствие и в присутствии различных концентраций FAD было показано (Макеевой В.Ф.), что FAD не оказывает влияния на ферментативную активность PhK по отношению к ее белковому субстрату - фосфорилазе Ь.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Чеботарева, Наталья Александровна

выводы

1. Для ключевых ферментов глнкогенолиза (фосфорилазы Ъ и киназы фосфорилазы) молекулярный краудинг является фактором, оказывающим существенное влияние на взаимодействия типа белок-лиганд, белок-белок, конформационные переходы и образование надмолекулярных структур и, как следствие, на механизмы функционирования ферментов in vivo.

2. Обнаружено влияние молекулярного краудинга, создаваемого осмолитами -триметиламин-Ъ1-оксидом (ТМАО), бетаином или пролином - на аллостерические свойства фосфорилазы Ь. При взаимодействии фосфорилазы Ь с аллостерическим ингибитором, FAD, в условиях краудинга происходит конформационный переход димерной молекулы, в результате которого появляются кооперативные взаимодействия флавин-связывающих центров фермента.

3. Количественная оценка эффекта молекулярного краудинга, создаваемого высокими концентрациями ТМАО, на ассоциацию фосфорилазы Ъ, индуцируемую AMP, позволила установить, что равновесие димер-тетрамер фосфорилазысдвигается" i~ сторону тетрамерной формы в присутствии осмолита. Относительно небольшое увеличение степени ассоциации фосфорилазы Ь в присутствии осмолита по сравнению с эффектом, рассчитанным теоретически, означает, что влияние молекулярного краудинга на равновесие димер-тетрамер частично компенсируется сдвигом равновесия в реакции изомеризации димера Т R (где Т - неактивная, R - активная конформация димера) в сторону более компактной, неассоциирующей Т-конформации.

4. Предложена новая методика для седиментационного анализа взаимодействий белок-лиганд в случае ассоциирующей ферментной системы типа димер-тетрамер, в качестве которой выбрана фосфорилаза Ъ, ассоциирующая в присутствии AMP. Одновременное использование двух оптических систем аналитической ультрацентрифуги (абсорбционной и шлирен-оптики) позволило количественно охарактеризовать влияние FMN, аллостерического ингибитора, на равновесие димер-тетрамер фосфорилазы b и оценить взаимодействие FMN с димерной и тетрамерной формами фермента.

5. Установлено стимулирующее влияние молекулярного краудинга, создаваемого высокими концентрациями ТМАО и бетаина, на ассоциацию киназы фосфорилазы с образованием надмолекулярных структур. Пролин препятствует ассоциации вследствие специфического взаимодействия с ферментом. Обнаружено, что а-кристаллин - белок, обладающий шапероноподобной активностью, — и пролин подавляют ассоциацию киназы фосфорилазы в условиях краудинга.

6. Выявлено, что связывание FAD с киназой фосфорилазы ингибирует ассоциацию фермента как в термодинамически идеальных условиях, так и в условиях молекулярного краудинга. Высказано предположение о роли белок-гликогеновых частиц как «депо» флавинов.

7. Показано, что молекулярный краудинг усиливает образование надмолекулярных структур при взаимодействии киназы фосфорилазы с гликогеном, но препятствует взаимодействию киназы фосфорилазы с фосфорилазой Ъ. Предполагается, что специфические взаимодействия киназы фосфорилазы и фосфорилазы Ъ с гликогеном в живой клетке, которые усиливаются в условиях краудинга, компенсируют негативное влияние краудинга на взаимодействие киназы фосфорилазы со своим белковым субстратом.

В. Влияние молекулярного «ограничения» (разновидность краудинга) на олигомерное состояние фермента показано на примере фосфорилазы Ъ, включенной в обращенные гидратированные мицеллы аэрозоля ОТ в октане. Уменьшение размера полости мицелл приводит к диссоциации фермента в относительно мягких условиях, а увеличение размера полости - к образованию надмолекулярных структур, которые в условиях молекулярного краудинга имитируют образование надмолекулярных комплексов ферментов in vivo.

9. Показано, что наряду с непосредственным участием в катализе, пиридоксаль-5'-фосфат выполняет роль конформационного кофактора фосфорилазы Ь, стабилизируя активную димерную структуру фермента и регулируя сродство фосфорилазы Ъ к субстратам и эффекторам.

10. Выявлено защитное действие молекулярного краудинга, создаваемого осмолитами, на инактивацию фосфорилазы b под действием гуанидингидрохлорида. Установлено, что термоденатурация и денатурация под действием гуанидингидрохлорида фосфорилазы b протекают по диссоциативному механизму, то есть включают стадию обратимой диссоциации активного димера на неактивные мономеры и следующую за ней стадию необратимой денатурации мономера.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ, Программы поддержки ведущих научных школ РФ, Программы «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН, INTAS, BBSRC Reserch Grant "Molecular crowding and thermodynamic non-ideality prediction for macromolecule-ligand interactions".

Заключение

Согласно современным представлениям все биохимические процессы в живой клетке протекают в условиях молекулярного краудинга, оказывающего заметное влияние на скорость и равновесие различных реакций и стимулирующего образование более компактных структур. К таким процессам относятся белок-белковые взаимодействия, конформационные переходы биомакромолекул, фолдинг и агрегация белка, а также образование мультиферментных комплексов и надмолекулярных структур. Предполагается, что краудинг играет заметную роль в такой важной физиологической функции клетки, как поддержание постоянного объема клетки.

Область биологии, касающаяся функционирования биомакромолекул в условиях краудинга, т.е. в условиях, максимально приближенных к существующим в живых системах, несмотря на активный и все более возрастающий интерес к ней биохимиков, биофизиков и физиологов во всем мире, находится в настоящее время лишь на начальных этапах своего развития. Это связано с двумя главными методическими трудностями, касающимися выбора нейтральных краудинг-агентов, пригодных для создания условий, имитирующих состояние краудинга в оегке, и ограниченностью экспериментальных методов, доступных в настоящее время для изучения поведения и функционирования биомакромолекул в этих условиях.

В настоящей работе впервые систематически изучены свойства ключевых ферментов гликогенолиза (фосфорилазы b и киназы фосфорилазы) в условиях молекулярного краудинга, имитируемого in vitro добавлением к реакционной смеси таких природных осмолитов, как ТМАО, бетаин и др. Были разработаны новые методические приемы седиментационного анализа, позволившие количественно оценить влияние краудинга на ассоциацию и изомеризацию изученных ключевых ферментов гликогенолиза. Установлено влияние краудинга на взаимодействия типа белок-лиганд и белок-белок, на реакцию изомеризации макромолекул и образование надмолекулярных структур. Обнаружено влияние краудинга, создаваемого высокими концентрациями осмолитов (ТМАО и бетаина), на ассоциацию киназы фосфорилазы и ассоциацию фосфорилазы Ь. Показано, что ТМАО и бетаин стимулируют ассоциацию киназы фосфорилазы в присутствии Са2+ и Mg2+ с образованием надмолекулярных структур (с коэффициентами седиментации 23 700 и 21 800 S), включающих сотни молекул фермента. Установлено влияние краудинга на образование надмолекулярных структур при взаимодействии киназы фосфорилазы с высокомолекулярной матрицей - гликогеном - и на образование надмолекулярных структур при включении фосфорилазы Ъ в гидратированные обращенные мицеллы. Влияние высоких концентраций ТМАО и бетаина на ассоциацию ферментов гликогенолиза, а также на взаимодействие этих ферментов с гликогеном согласуется с теоретически предсказанными эффектами молекулярного краудинга.

Обнаружено влияние краудинга на взаимодействие фосфорилазы b с аллостерическим эффектором (FAD). При взаимодействии фосфорилазы Ъ с FAD в условиях краудинга происходит конформационный переход димерной молекулы, в результате которого появляются кооперативные взаимодействия флавин-связывающих центров фермента.

Поскольку константы связывания лигандов белками меняются в условиях краудинга, то можно ожидать, что краудинг будет оказывать влияние на взаимодействие лекарственных препаратов с белками-мишенями. Известно, что фосфорилаза является мишенью для испытания противодиабетических препаратов [Oikonomakos, 2002]. Проведенные нами исследования показывают, что эффекты краудинга должны учитываться при испытании новых лекарственных препаратов.

Оценивая возможную практическую значимость исследований протекания биохимических процессов в условиях краудинга для медицины, следует принимать также во внимание, что целый ряд заболеваний (таких как нейродегенеративные болезни) связаны с образованием нефункциональных белковых агрегатов, формирование которых стимулируется в условиях краудинга.

Защитный стабилизирующий эффект осмолитов при стрессах различной природы (при термическом, химическом или осмотическом стрессе), как правило, объясняется эффектом исключенного объема. В настоящей работе показано защитное действие молекулярного краудинга, создаваемого осмолитами (ТМАО, бетаином, пролином и глицином), при инактивации фосфорилазы b под действием гуанидингидрохлорида.

Приемы стабилизации белков, основанные на использовании эффектов краудинга, могут быть использованы при решении биотехнологических задач и при разработке методов хранения белковых препаратов медицинского назначения.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Чеботарева, Наталья Александровна, Москва

1. Zimmerman S.B. and Minton A.P. Macromolecular crowding: biochemical, biophysical, and physiological consequences. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 1993,22,27- 65.

2. Fulton A.B. How crowded is the cytoplasm? Cell, 1982, 30, 345-347.

3. Ellis R.J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated., Trends Biochem. Sci. 2001,26,597-604.

4. Minton A.P. The influence of macromolecular crowding and macromolecular confinement on biochemical reactions in physiological media. J. Biol. Chem. 2001, 276, 10577-10580.

5. Ellis R.J. and Minton A.P. Join the crowd. Nature, 2003,425, 27-28.

6. Bolen, D.W., Baskakov, I.V. The osmophobic effect: natural selection of a thermodynamic force in protein folding. J. Mol Biol, 2001, 310, 955-963.

7. Yancey P.H., Clark M. E., Hand S.C., Bowlus R.D., Somero G.N. Living with water stress: evolution of osmolyte systems. Science, 1982, 217, 1214-1222.

8. Davis-Searles, P.R., Saunders, A.J., Erie, D.A., Winzor, D.J.; and Pielak, G.J. Interpreting the effects of small uncharged solutes on protein-folding equilibria Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 2001, 30,271-306.

9. Судаков С.Ю., Соловьева Г.А. Взаимодействие гликогенсинтазы скелетных мышц кроликас флавинмононуклеотидом. Биохимия, 1989,54, 1478-1484.

10. Jacobsen М.Р., Winzor D.J. Studies of ligand-mediated conformational changes in enzymes by difference sedimentation velocity in the Optima XL-A ultracentrifuge. Prog. Colloid Polym. Sci., 1997, 107,82-87.

11. Wills P.R., Winzor D.J. Thermodynamic analysis of "preferential solvation" in protein solutions Biopolymers, 1993,33,1627-1629.

12. Ogston AG, Winzor DJ. Treatment of thermodynamic nonideality in equilibrium studies of associating solutes. J. Phys. Chem. 1975,79:2496-500

13. Nichol LW, Jef&ey PD, Winzor DJ. 1976. Molecular covolumes of sphere and ellipsoid of revolution combinations. J. Phys. Chem., 80:648-649.

14. Johnson, L.N., Hajdu, J., Acharya, K.R., Stuart, D.I, McLaughlin, P.I., and Barford, D. In-Allosteric Enzymes (Herve, G, ed.) Boca Raton: CRC Press, pp. 1989, 81-127.

15. Sanches-Ruiz J.M. Theoretical analysis of Lumry-Eyring models in differential scanning calorimetiy. Biophys. J., 1992,61,921-935.16 .Stafford W.F. Methods for obtaining sedimentation coefficient distributions. In: Analytical

16. Ultracentrifugation in Theory and Experiment (Harding S.E., Rowe A.J., Horton J.C. eds), 1992, 359-393.

17. Minton A.P. Implication of macromolecular crowding for protein assembly. Curr. Opinion Struct. Biol., 2000,10, 34-39.

18. Hall D., Minton A.P. Macromolecular Crowding: qualitative and semi-quantitative, quantitative challenges. Biochim. Biophys. Acta, 2003, 1649,127-139.

19. Brusharia RJ, Walsh D.A. Phosphorylase kinase: the complexity of its regulation is reflected in the complexity of its structure. Frontiers Biosci., 1999, 4,618-641.

20. Schuck P. Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modeling. Biophys. J., 2000,78, 1606-1619.

21. Chan K.F, Graves D.J. Rabbit skeletal muscle phosphorylase kinase. Interactions between sub-units and influence of calmodulin on different complexes. J. Mol. Biol., 1982, 257: 5939-5947.

22. Shearwin KE, Winzor DJ. Effect of sucrose on the dimerization of a-chymotrypsin: allowance for thermodynamic nonideality arising from the presence of a small insert solute. Biophys. Chem., 1988, 31, 287-294.

23. Shtilerman M.D., Ding T.T., Lansbury P.T., Jr. Molecular crowding accelerates fibrillization of alpha-synuclein: could an increase in the cytoplasmic protein concentration induce Parkinson's disease? Biochemistry, 2002,41, 3855-3860.

24. Martin J. Chaperonin function — effects of crowding and confinement. J. Mol. Recognition 2004, 425, 27-28.

25. Eggers D.K., Valentine, J.V. Molecular confinement influences protein structure and enhances thermal protein stability. Protein Science, 2001, 10, 250-261.

26. Eicke H.-F., and Rehak, J. Helv. Chim. Acta. 1976,59. p. 2883-2891.

27. Levashov AV, Khmelnitsky YL, Klyachko NL, Chernyak VYa, Martinek K. Ultracentrifugation of reversed micelles in organic solvent: new approach to determination of molecular weight and effective size of proteins. Anal Biochem. 1981,118, 42-46.

28. Хмельницкий Ю.А., Левашов A.B., Клячко H.Jl., Черняк В.Я., Мартинек К. Ферменты, включенные в обращенные мицеллы поверхностно-активных веществ в органических растворителях. Биохимия. 1982,47, с. 86-99.

29. Kabanov AV, Klyachko NL, Nametkin SN, Merker S, Zaroza AV, Bunik VI, Ivanov MV, Levashov AV. Engineering of functional supramacromolecular complexes of proteins (enzymes) using reversed micelles as matrix microreactors. Protein Eng. 1991, 4, 10091017.

30. Клячко П.Л., Пшежецкий A.B., Кабанов A.B., Вакула С.В., Мартинек К., Левашов А.В. Катализ ферментами в агрегатах поверхностно-активных веществ. Оптимальная конструкция матрицы ПАВ. Биол. мембраны. 1990, 7, с. 467-472.

31. Johnson, L.N., Hajdu, J., Acharya, K.R., Stuart, D.I., McLaughlin, P.I., and Barford, D. In: Allosteric Enzymes (Herve, G., ed.) Boca Raton: CRC Press, pp. 1989, 81-127.

32. Oikonomakos N.G. Glycogen phosphorylase as a molecular target for type 2 diabetes therapy. Curr Protein PeptScL, 2002, 3, 561-586.

33. Barford D., Johnson L.N. The molecular mechanism for the tetrameric association of glycogen phosphorylase promoted by protein phosphorylation. Protein Sci. 1992, 1, 472493.

34. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ1. Обзоры

35. Чеботарева Н.А. Курганов Б.И. Адсорбция ферментов структурными белками мышц. Успехи биологической химии, 1989, т. 30, с. 46-67.

36. Курганов Б.И., Клинов С.В., Чеботарева Н.А. Взаимодействие мышечной гликогенфосфорилазы с флавинами. Успехи биологической химии, 1994, т. 34, с. 83-101

37. Chebotareva N.A., Klinov S.V., Kurganov B.I. Regulation of muscle glycogen phosphorylase by physiological effectors. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews, 2001, v. 18, p. 265-297.

38. Ливанова Н.Б., Чеботарева H.A., Еронина Т.Б., Курганов Б.И. Пиридоксаль-5'-фосфат как каталитический и конформационный кофактор мышечной гликогенфосфорилазы Ъ. Биохимия, 2002, т. 67, № 10, с. 1317-1327.

39. Чеботарева Н.А., Курганов Б.И., Ливанова Н.Б. Биохимические эффекты молекулярного краудинга. Биохимия, 2004, г. 69, JVs 11, с. 1522-1536.

40. Статьи в рецензируемых журналах

41. Kurganov B.I., Tsetlin L.G., Chernov N.N., Chebotareva N.A., Yakovleva I.M., Veresotskaya, Rudakova I.P. Water-insoluble esters of dihydroriboflavin as inhibitors of enzyme reactions. Journal of Chemical and Biochemical Kinetics, 1991, v. l,№l,p. 3946.

42. Chebotareva NA, Kurganov BI, Lyubarev AE, Davydov DR, Pekel ND. Interaction of flavin mononucleotide with dimeric and tetrameric forms of muscle phosphorylase b. Biochimie. 1991, v. 73, № 11, p. 1339-1343.

43. Еронина Т.Б., Курганов Б.И., Ливанова Н.Б., Бушуева М.В., Чеботарева Н.А., Поглазов Б.Ф. Кинетика ассоциации мышечной гликогенфосфорилазы Б, индуцируемой аллостерическим активатором. Доклады АН СССР, 1991, т. 319. с. 238-241.

44. Eronina, Т.В., Livanova, N.B., Teplova, M.V., Chebotareva, N.A., Kurganov, B.I. Self-association of muscle glycogen phosphorylase induced by the allosteric activator. Journal of Biochemical Organization, 1992, v. 1, №2,160-163.

45. Kurganov, B.I., Schors, E.I., Livanova, N.B., Chebotareva, N.A., Eronina, T.B, Andreeva, I.E, Makeeva, V.P., Pekel, N.D. Effect of flavins on the rate of proteolytic digestion of muscle glycogen phosphorylase b. Biochimie, 1993, v. 75, № 6, p. 481-485.

46. Курганов Б.И., Щорс Е.И., Ливанова Н.Б, ЕронинаТ.Б., Чеботарева Н.А. Медленные конформационные переходы в мышечной гликогенфосфорилазе Ь, индуцируемые специфическими лигандами. Биохимия, 1994, т. 59, № 4, 559-665.

47. Kurganov, B.I, Klinov, S.V, Schors, E.I., Chebotareva, N.A. Slow step in activation of muscle glycogen phosphorylase b by adenosine 5-monophosphate. Biochemistry and Molecular Biology International, 1995, v. 36,№ l,p. 155-161.

48. Курганов Б.И, Щорс Е.И, Чеботарева Н.А., Юганов С.В. Медленная активация мышечной гликогенфосфорилазы b при инкубации фермента с аденозин-5'-монофосфагом. Биохимия, 1995, т. 60, № 1,88-104.

49. Курганов Б.И., Мицкевич Л.Г, Федуркина Н.В, Чеботарева Н.А. Кинетика диссоциации неактивных тетрамеров мышечной гликогенфосфорилазы на активные димеры. Биохимия, 1996, т. 61, № 5, с. 901 -907.

50. Корнилаев Б.А., Курганов Б.И., ЕронинаТ.Б., Чеботарева Н.А., Ливанова Н.Б., Орлов В.Н., Черняк В.Л. Механизм тепловой денатурации мышечной гликогенфосфорилазы Ь. Молекулярная биология, 1997, т. 31, № 1, с. 98-107.

51. Chebotareva, N.A., Lyubarev, А.Е., Kurganov, B.I. Study of self-association of muscle glycogen phosphorylase b by sedimentation equilibrium method. Biochem. Soc. Trans., 1998, v. 26, №4, p. 766-769.

52. Чеботарева H.A., Любарев A.E., Курганов Б.И., Калмыков П.В., Магретова Н.Н., Черняк В.Я., Поглазов Б.Ф. Изучение ассоциации мышечной гликогенфосфорилазы Ъ методами равновесной седиментации. Доклады РАН, 1998, т. 358, № 4, с. 552-554.

53. Andreeva I.E., Makeeva V.F., Kurganov B.I., Chebotareva N.A., Livanova N.B. A tentative mechanism of the ternary complex formation between phosphorylase kinase, glycogen phosphorylase b and glycogen. FEBSLetL 1999, v. 445, № 1, p. 173-176.

54. Андреева И.Е., Макеева В.Ф., Курганов Б.И., Чеботарева Н.А., Ливанова Н.Б. Кинетика взаимодействия киназы фосфорилазы из скелетных мышц кролика с гликогеном. Биохимия, 1999, т. 64, № 2, с. 159-68.

55. Kurganov B.I., Chebotareva N.A. Sedimentation analysis of muscle glycogen phosphorylase b entrapped in hydrated reversed micelles of aerosol ОТ in octane. Biochemistry and Molecular Biology International, 1999, v. 47, № 2, p. 319-26.

56. Chebotareva N.A., Kurganov B.I., Burlakova A.A. Sedimentation velocity analysis of oligomeric enzymes in hydrated reversed micelles of surfactants in organic solvents. Progr. Colloid Polym. ScL 1999, v. 113, p. 129-134.

57. Чеботарева H.A., Курганов Б.И. Олигомерное состояние мышечной гликогенфосфорилазы b в системе обращенных мицелл аэрозоля от в октане. Биологические мембраны, 2000,т. 14, № 1, с. 67-73.

58. Kurganov, B.I., Kornilaev, В.А., Chebotareva, N.A., Malikov, V.P., Orlov, V.N., Lyubarev, A.E., Livanova, N.B. Dissociative mechanism of thermal denaturation of rabbit skeletal muscle glycogen phosphorylase b. Biochemistry, 2000, v. 39, p. 13144-13152.

59. Еронина Т.Б., Чеботарева Н.А., Ливанова Н.Б., Курганов Б.И. Кинетика денатурации гликогенфосфорилазы Ъ из скелетных мышц кролика гуанидингидрохлоридом. Биохимия. 2001, т. 66, № 1, с. 555-562

60. Chebotareva N. A., Harding S. Е., Winzor D. J. Ultracentrifugal studies of the effect of molecular crowding by trimethylamine N-oxide on the self-associasion of muscle glycogen phosphorylase b.Eur. J. Biochem. , 2001, v. 268, № 3, p. 506-513.

61. Chebotareva N.A., Andreeva I. E., Makeeva V. F., Livanova N. В., Kurganov В. I. Effect of molecular crowding on self-association of phosphorylase kinase and its interaction with phosphorylase b and glycogen. J. MoL Recognit. 2004, v. 17, p. 426-432.

62. Chebotareva, N.A., Kurganov, B.I., Harding, S.E., Winzor, D.J. Effect of osmolytes on the interaction of flavin adenine dinucleotide with muscle glycogen phosphorylase b. Biophysical Chemistry. 2005, v. 113, p. 61-66.

63. Chebotareva N.A., Meremyanin A.V., Makeeva V.F., Kurganov B.I. Self-association of phosphorylase kinase under molecular crowding conditions. Progr. Colloid Polym. Sci. 2006, v. 131, p. 83-92.

64. Макеева В.Ф., Чеботарева H.A., Андреева И.Е., Ливанова Н.Б., Курганов Б.И. Взаимодействие киназы фосфорилазы из скелетных мышц кролика с флавинадениндинуклеотидом. Биохимия, 2006, т. 71, с. 808-814.1. Статьи в сборниках

65. Цетлин Л.Г., Чеботарева Н.А., Курганов Б.И., Малахова Э.А. Новые подходы к изучению ингибиторных свойств эфиров дигидрорибофлавина. Там же, с. 81 -96.

66. Kurganov, B.I., Eronina, T.B., Livanova, N.B., Teplova, M.V., Chebotareva, N.A. Kinetics of association of muscle glycogen phosphorylase b induced by the allosteric activator. Там же, pp. 219-225.

67. Андреева И.Е., Макеева В.Ф., Чеботарева Н.А., Курганов Б.И. Упорядоченный механизм связывания киназы фосфорилазы и гликогенфосфорилазы на гликогеновых частицах. Там же, с. 27-31.

68. Еронина Т.Б, Чеботарева Н.А, Ливанова Н.Б., Курганов Б.И. Денатурация и агрегация гликогенфосфорилазы b из скелетных мышц кролика в присутствии гуанидингидрохлорида. Там же, с. 57-61.1. Тезисы докладов

69. Чеботарева Н.А, Андреева И.Е., Макеева В.Ф, Курганов Б.И. Влияние молекулярного краудинга на ассоциацию ферментов гликогенолиза. III Съезд биохимического общества. Тезисы научных докладов. С.-Петербург. 2002. с. 122.

70. Chebotareva N.A, Kurganov B.I. Sedimentation analysis of binding of flavins by glycogen. Euroconference "Advances in Analytical Ultracentrifugation and Hydrodynamics. " 8-11 June 2002. Autrance, France, p. 25.