Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Факторы, определяющие субстратную специфичность 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз Escherichia coli и человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Факторы, определяющие субстратную специфичность 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз Escherichia coli и человека"

На правах рукописи

СИДОРЕНКО ВИКТОРИЯ СЕРГЕЕВНА

ФАКТОРЫ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ СУБСТРАТНУЮ СПЕЦИФИЧНОСТЬ 8-ОКСОГУАНИН-ДНК-ГЛИКОЗИЛАЗ ESCHERICHIA COLI И ЧЕЛОВЕКА

03 00 04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□озlTOsaj

Новосибирск - 2008

003170993

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной

медицины СО РАН

Научный руководитель Научный консультант

Официальные оппоненты

Ведущая организация

к б н Жарков Дмитрий Олегович

д х н, профессор

Невинский Георгий Александрович

д х н, профессор Карпова Галина Георгиевна

к б н Синицина Ольга Ивановна

Институт химической кинетики и горения СО РАН

Защита состоится « J9.» UWHSL 2008 г. в асов

на заседании диссертационного совета Д 003 045 01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу 630090, Новосибирск, просп Акад Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

С авторефератом можно ознакомиться на сайте www niboch nsc ru

Автореферат разослан « » JJ-tfJt^ 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета к х н , доцент

Коваль В В

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Окислительные повреждения оснований, очень часто встречающиеся в ДНК, играют важную роль в онкогенезе, старении и многих патологических процессах За удаление небольших поврежденных оснований из ДНК отвечают ферменты ДНК-гликозилазы В число самых распространенных повреждений ДНК входит окисленное производное гуанина — 8-оксогуанин Это окисленное основание выщепляется 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазами Рр§ и 0001 у про- и эукариот, соответственно Правильное функционирование системы репарации 8-оксогуанина в клетках препятствует процессам мутагенеза и канцерогенеза Субстратной специфичности ДНК-гликозилаз посвящено большое количество работ во всем мире, однако на сегодняшний день многие определяющие ее факторы слабо изучены Представляется, что на активность и специфичность ДНК-гликозилаз в клеточном окружении могут влиять ионная сила, наличие ионов магния, полиамины, краудинг-агенты, аналоги гетероциклических оснований, посттрансляционные модификации, механизмы поиска поврежденных оснований в ДНК, взаимодействие с другими участниками системы репарации и природные аминокислотные замены Влияние вышеприведенных факторов практически не исследовано для ферментов репарации ДНК, в частности Fpg и ОбО 1

Цель настоящем работы заключалась в изучении факторов, влияющих на субстратную специфичность ферментов 0001 и Рр§ В ходе исследования необходимо было решить следующие задачи:

• изучить влияние условий реакции ионной силы, присутствия ионов М§2+, краудинг-агентов, полиаминов и т п на активность и на субстратную специфичность ферментов 0001 и Рр§,

• изучить влияние АП-эндонуклеазы человека (АРЕХ1) на активность и субстратную специфичность фермента 0001,

• изучить процессивность реакции расщепления различных субстратов ферментами Рр§ и 0001 и возможный вклад процессивности в субстратную специфичность этих ферментов,

• изучить влияние некоторых полиморфных и имитирующих фосфорилирование аминокислотных замен на активность и субстратную специфичность фермента 0001,

• изучить субстратную специфичность ферментов, которые в целом гомологичны белку Рр£, но отличаются от него последовательностями некоторых высококонсервативных в семействе Рр§ мотивов

Научная новизна и практическая ценность работы Работа представляет собой первое систематическое исследование на количественном уровне различных факторов, влияющих на субстратную специфичность ДНК-гликозилаз Впервые было показано, что корректное функционирование ферментов Fpg и OGG1 обеспечивается при концентрации ионов магния и ионной силы близких к физиологическим Известно, что АП-эндонуклеаза человека (АРЕХ1) способна стимулировать активность OGG1, однако непосредственного взаимодействия между ферментами обнаружено не было В данной работе было показано непосредственное взаимодействие белков OGG1 и АРЕХ1, следствием которого являлось увеличение ферментативной активности OGG1 на его биологически важных субстратах Предложена новая методика количественного анализа процессивности ферментов, специфичных к определенному участку ДНК, в частности ДНК-гликозилаз, и проведено сравнение процессивности действия Fpg и OGG1 при расщеплении разных субстратов Впервые изучена субстратная специфичность полиморфных (A288V, D322N, S326C) и фосфомиметических вариантов OGG1 (S231E, S232E, S231/232E, S280E, S326E), как по отношению к основанию напротив 8-oxoGua, так и к активности данных форм на высокомолекулярной облученной ДНК Впервые из Mycobacterium tuberculosis клонирован, выделен и охарактеризован гомолог эндонуклеазы VIII (Nei) и Fpg Е coh — Mi/-Nei2, который по субстратной специфичности оказался наиболее близким к Nei

Публикации и апробация работы По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы Результаты работы были представлены на VI международной конференции по процессам узнавания нуклеиновых кислот (NACON VI, Шеффилд, Великобритания, 2004), международной конференции «Chemical and biological problems of proteomics» (Новосибирск, 2004), XXX конгрессе Федерации европейских биохимических обществ и IX конференции Международного союза биохимии и молекулярной биологии (Будапешт, Венгрия, 2005), международной конференции «Химическая биология» (Новосибирск, 2005), IX международном симпозиуме по радиационным повреждениям ДНК (Анталья, Турция, 2006), международной конференции «Физико-химическая биология», посвященной 80-летию со дня рождения акад ДГ Кнорре (Новосибирск, 2006), Второй научной конференции «Молекулярная генетика, биофизика и медицина» «Бреслеровские чтения-П» (Санкт-Петербург, 2006) и III международной конференции «Фундаментальные науки — медицине» (Новосибирск, 2007)

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения результатов и их обсуждения, описания материалов и методов исследования, заключения, выводов и списка цитированной литературы Работа изложена на 160 страницах, содержит 35 рисунков и 16 таблиц Библиография содержит 357 литературных источников

Содержание работы Влияние ионов Mg2+ и ионной силы на специфичность 8-оксогуанин-ДНК-гликозплаз Е. coli и человека

Для того чтобы исследовать зависимость активности и специфичности OGG1 и Fpg к основанию напротив 8-oxoGua от общей ионной силы и присутствия дивалентных катионов, была проведена серия экспериментов, в которой оба фактора варьировали, изменяя концентрации KCl и MgCU Анализ активности ферментов по отношению к субстратам 8-oxoGua Cyt и 8-oxoGua Ade в таких факториальных экспериментах вели по расщеплению субстрата в одной временной точке

При повышении ионной силы и концентрации Mg2+ активность OGG1 и Fpg снижалась (рис 1) Однако активность обоих ферментов снижалась сильнее на субстрате 8-oxoGua Ade, чем на субстрате 8-oxoGua Cyt Повышение концентраций солей до физиологических значений приводило к тому, что 8-oxoGua выщеплялся из пары с Cyt в -10-50 раз эффективнее по сравнению с его выщеплением из пары с Ade (рис 1А, Б для Fpg и В, Г для ДНК-гликозилазной активности OGG1)

Для более подробного анализа влияния Mg2+ на специфичность фермента Fpg были определены параметры стационарной кинетики Км и кся реакции расщепления 8-oxoGua Cyt и 8-oxoGua Ade в условиях наибольшей и наименьшей специфичности фермента Присутствие Mg2+ уменьшало Км реакции расщепления 8-oxoGua Cyt ферментом Fpg и увеличивало Км для расщепления субстрата 8-oxoGua Ade (табл 1) С другой стороны, Mg2+ уменьшал kcal для расщепления обоих субстратов, что, возможно, связано с индукцией конформационных изменений в ДНК, связанной с ферментом Fpg

Из-за высокого сродства к продукту реакции — АП-сайту — фермент OGG1 характеризуется низким числом оборотов, что позволило в разных типах экспериментов определить константы химических стадий реакции OGG1 (к2) и константу высвобождения продукта реакции из комплекса с ферментом (к3) Значения констант к2 и ку сведены в табл 2 Для расщепления субстрата 8-oxoGua Cyt эти

значения при изменении условии реакции варьировали незначительно. С другой стороны, увеличение ионной силы или концентрации приводило к значительному снижению к2 и кт, в реакции расщепления субстрата 8-охоОиа:Аёе.

iiiii

1

* ж

ч

lllllll

э»*

dilbl

ж ißsiCШ

Щ1\ IP

< AV'-vi'

W Л

iftti

V- Ä?™,

i*«.50 0 ш

ж ^

■ ' Jprffek'

л tf»№,.

ш

" MC

vvi'li'Mlt-

i№t

v-¿c

Рис. 1 Активность и специфичность ферментов Fpg и 0GG1 в присутствии различных концентраций MgJ+ и KCl. А-В, расщепление субстратов ферментом Fpg; Г-Е, ДНК-гликозилазная активность OGG1; Ж-И, АП-лиазная активность OGG1. Приведены зависимости количества продукта реакции расщепления 8-oxoGua:Cyt (А, Г и Ж). 8-oxoGua:Ade (Б. Д и 3) содержащих субстратов и С/А специфичности (В, Е и И) от концентраций солей. [Р] — концентрация продукта реакции. Масштаб осей на графиках А, Г и Ж отличен от масштаба осей на графиках Б, Д и 3. Концентрации ферментов и субстратов оставались неизменными во всех реакционных смесях. Приведены средние значения 2 независимых экспериментов.

Табл. 1 Кинетические константы расщепления субстратов, содержащих пары 8-oxoGua:Cyt и 8-oxoGua:Ade, ферментом Fpg в присутствии и в отсутствие Mg2+

Субстрат MgCI2 мМ К м нМ Acut мин"' ксщ/Км нМ"'мин"'

8-oxoGua:Cyt 0 10 26 ±6 17 ± 2 6,1 ± 1.2 1,2 ±0.2 0,24 0,068

8-oxoGua:Ade 0 10 490 ± 150 700 ±340 3,3 ±0.7 1,0 ±0.4 0,0066 0,0015

Показано среднее и стандартное отклонение 3 независимых экспериментов

Табл. 2 Константы скорости расщепления субстратов, содержащих пары 8-oxoGua Cyt и 8-oxoGua Ade, ферментом OGCI в различных условиях

SovoGua Cyt 8-oxoGua'Ade

Условия ki h h h

Mim"' Mllll"' Mllll"' MIHI"'

0 мМ МП 0 мМ MgCI, 0 50 ± 0 09 021 ±0 II 0,97 ± 0 49 0,011 ±0 008

0 мМ KCl 20 мМ MgCI, 1,1 ± 0 4 0 22 ± 0,03 0 023 ± 0 008 0,0020 ±0,0013

150 мМ KCl 0 мМ MgCI, 1,3 ±0,6 0,47 ± 0,06 0,25 ±0 10 0,0016 ±0,0004

Показано среднее и стандартное отклонение 3-5 независимых экспериментов

Кроме этого было исследовано действие других анионов (KGIu), полиаминов (спермин, спермидин), краудинг-агентов (PEG 4000 и PEG 8000) и малых гетероциклических соединений (кофеин и биотин) на специфичность Fpg и OGG1, при этом во всех случаях влияние было минимальным Таким образом оказалось, что на С/А-специфичность данных ферментов главным образом влияют два фактора — ионная сила и концентрация ионов Mg2+ В целом С/А-специфичность Fpg и OGG1 была наибольшей при значениях ионной силы и концентрации MgCU близких к физиологическим

Взаимодействие OGG1 с АРЕХ1 и влияние этого взаимодействия на специфичность OGG1

На сегодняшний день остается слабо изученной координация работы ферментов начальных стадий ЭРО (ДНК-гликозилазы и АП-эндонуклеазы) между собой Рядом исследователей показано, что АП-эндонуклеаза человека (АРЕХ1) стимулирует реакцию, осуществляемую OGG1, однако механизм такого усиления не был детально исследован В литературе предлагались два основных возможных варианта взаимодействия АРЕХ1 и OGG1 во-первых, OGG1 может спонтанно диссоциировать из комплекса с продуктом реакции, после чего АРЕХ1 гидролизует ДНК по высвободившемуся АП-сайту (механизм секвестрирования продукта) и предотвращает повторное связывание OGG1 с продуктом реакции, во-вторых, АРЕХ1 может связываться с комплексом OGGl/ДНК и непосредственно вытеснять OGG1 из него Опубликованные данные не дают ответа на вопрос, каким образом АП-эндонуклеаза активирует ДНК-гликозилазу

Взаимодействие OGG1 и ЛРЕХ1

Ранее не было исследовано влияние каталитически активного и каталитически неактивного, но сохраняющего способность связывать

ДНК фермента АРЕХ1 на ДНК-гликозилазную и АП-лиазную активность OGG1 Так как активность фермента АРЕХ1 зависит от Mg2+, была подробно исследована стимуляция OGG1 АП-эндонуклеазой как в условиях активности APEX 1 (5 мМ MgCl2), так и в условиях, когда фермент неактивен (2 мМ ЭДТА) Максимальная стимуляция наблюдалась в условиях каталитической активности АРЕХ1 (рис 2А, Б), однако, когда фермент АРЕХ1 был неактивен, усиление активности OGG1 также наблюдалось как в случае определения ДНК-гликозилазной, так и АП-лиазной реакции (рис 2В, Г) Таким образом, показано усиление активности OGG1 во всех исследованных условиях реакции

Рис 2 Активность OGG1 в отсутствие (•) и в присутствии (О) АРЕХ1 А — ДНК-гликозилазная активность OGG1 в присутствии Mg2+, Б — АП-лиазная активность OGG1 в присутствии Mg!+, В — ДНК-гликозилазная активность OGG1 в отсутствие Mg!\ Г — АП-лиазная активность OGG1 в отсутствие Mg24 [Р] — величина расщепления субстрата Масштаб осей на всех графиках один и тот же Приведены средние значения 2 независимых экспериментов

В случае если стимуляция OGG1 АП-эндонуклеазой проходит согласно механизму секвестрирования продукта, то увеличение активности OGG1 после его связывания с 8-oxoGua Cyt содержащим субстратом не должно зависеть от наличия свободного участка ДНК для связывания АРЕХ1 Следовательно, если фермент АНРЕХ1 расщепляет АП-сайт после диссоциации OGG1, степень стимуляции не должна зависеть от позиции повреждения Оказалось, что для стимуляции фермента OGG1 белком АРЕХ1 наблюдается ярко выраженный позиционный эффект в том случае, когда звено 8-oxodGuo было удалено на 4 нт от 5'-кониа поврежденной цепи и на 10 нт от 5'- и З'-концов стимуляции активности фермента OGG1 в присутствии АРЕХ1 не обнаруживается Если звено 8-oxodGuo находилось в середине ОДН или ближе к его 3'-концу, наблюдалась хорошая стимуляция Данные результаты свидетельствуют против механизма спонтанной диссоциации OGG1

OGGbflHKl Г250С1Э/1С25'У " APEX1 -2SOG13//C25 * 'F23//C23 -F12//C12' -G12//C12' -12GW12C

-БСА -АРЕХ1

6 7 8 9

Рис. 3 Электрофореграмма разделения различных продуктов связывания АП-эндонуклеазы АРЕХ1 с кованентным комплексом OGGl^HK. А — ковапентный комплекс OGGl-ДНК был приготовлен из 23-звенного субстрата с последующей стабилизацией формальдегидом при связывании APEXI. Дорожка I — несвязанный 23-звенный ОДН; дорожка 2 — несвязанный 12-звеннын ОДН; дорожка 3 — 12-звенный ОДН в присутствии APEX 1 ; дорожка 4 — несвязанный 23-звенный ОДН с THF; дорожка 5 — ОДН с THF в присутствии АРЕХ1; дорожка 6 — ковалентный комплекс OGGl'flHK; дорожка 7 — ковалентный комплекс OGG1 'ДНК в присутствии АРЕХ1; дорожка 8 — ковапентный комплекс OGGl-ДНК в присутствии APEXI и немеченого THF содержащего ОДН; дорожка 9 — ковалентный комплекс OGG1 'ДНК в присутствии АРЕХ1 и немеченого 12-звенного ОДН Стрелками указана подвижность: I — несвязанный ОДН длиной 10 или 12 ht.; II — несвязанный ОДН длиной 23 или 25 нт.: III — комплекс APEX 1/ОДН; IV — комплекс OGGlOflH; V — комплекс APEX 1/OGG1-ОДН; VI — дно карманов геля. Б — радиоавтограф нитроцеллюлознон мембраны после связывания радиоактивно меченого комплекса OGGI-ДНК с продуктами разделения смеси APEXI, БСА и DenV. Дорожка 1 — маркеры молекулярной массы, окрашивание кумасси голубым; дорожка 2 — БСА (верхняя полоса), APEXI (средняя полоса) и DenV (нижняя полоса), окрашивание кумасси голубым; дорожка 3 — БСА (верхняя полоса), АРЕХ1 (средняя полоса) и DenV (нижняя полоса), радиоавтограф после переноса на мембрану и связывания с радиоактивно меченым комплексом OGGl-ДНК

Непосредственного взаимодействия между APEXI, OGG1 и ДНК ранее не было зарегистрировано, что, скорее всего связано с использованием системы, содержащий все три компонента по отдельности. В данной работе был получен ковалентный комплекс OGGl'flHK обработкой NaBH4 основания Шиффа, образующегося в ходе катализа ферментом OGG1. При добавлении АРЕХ1 к ковалентному комплексу OGGî^HK с последующей стабилизацией формальдегидом при помощи метода задержки в геле наблюдалось образование полосы с подвижностью ниже подвижности комплекса OGGl'flHK (рис. ЗА, дорожка 7). При добавлении конкурентного немеченого дцОДН, содержащего пару THF:dCyd, к смеси OGGl-ДНК и АРЕХ1 тройной комплекс исчезал (рис. ЗА, дорожка 8), в то время

как присутствие неповрежденного немеченого дцОДН не влияло на его образование диОДН с восстановленным АП-сайтом (рис ЗА, дорожка 9), Данные наблюдения свидетельствуют о том, что АРЕХ1 специфически распознает структуру комплекса OGGI с ДНК, содержащей АП-сайт, и связывается с ним с образованием сравнительно лабильного тройного комплекса

В качестве дополнительного независимого метода детекции взаимодействия между АРЕХ1, OGG1 и ДНК было использовано связывание на нитроцеллюлозной мембране После переноса на мембрану АРЕХ1, бычьего сывороточного альбумина и эндонуклеазы V фага Т4 (DenV), ренатурации и инкубации с радиоактивно меченым ковалентным комплексом OGGl'flHK наблюдали полосу, соответствующую по подвижности APEX 1 (рис ЗБ, дорожка 3) Таким образом, связывание на мембране подтверждает идею о том, что белок АРЕХ1 способен образовывать тройной комплекс с OGG1 и ДНК

На следующем этапе исследовали влияние АРЕХ1 на кинетические константы реакции, катализируемой OGG1 (к2 и kt) Наличие АРЕХ1 в реакционной смеси приводило к незначительному снижению константы скорости реакции выщепления поврежденного основания (/t2набл = 2,5 миндля OGG1 и 1,1 мин"1 для OGG1 в присутствии АРЕХ1) В присутствии АРЕХ1 возрастала более чем на порядок (к3 = 0,04мин"' для OGG1 и 0,48 мин"' для OGG1 в присутствии АРЕХ1) Таким образом, представленные данные свидетельствуют о том, что белок АРЕХ1 практически не влияет на константу скорости реакции, каталитизируемой ферментом OGG1, но обладает способностью активно вытеснять OGG1 из комплекса с продуктом

Специфичность стимуляции OGG1 в присутствии АРЕХ1 Для анализа специфичности стимуляции OGG1 белком АРЕХ1 было исследовано расщепление ферментом OGG1 в присутствии АРЕХ1 ряда ОДН-субстратов, содержащих разные модифицированные основания и пары оснований При расщеплении 8-oxoGua Cyt содержащего субстрата ферментом OGG1 наблюдали фазу всплеска, характерную для ферментов, обладающих высоким сродством к продукту реакции, и хорошую стимуляцию АП-эндонуклеазой (рис 4А) При расщеплении ферментом OGG1 дцОДН-субстрата 8-oxoGua Ade в отсутствие АРЕХ1 на кинетических кривых не наблюдалось фазы всплеска (рис 4Б) и эффективной стимуляции в присутствии АРЕХ1 Стационарная скорость реакции, определенная из линейной фазы кривых накопления продукта для OGG1 в отсутствие АРЕХ1, больше для субстрата 8-oxoGua Ade, чем для 8-oxoGua Cyt,

однако эти скорости нельзя сравнивать непосредственно Более эффективная стимуляция АП-эндонуклеазой АРЕХ1 активности OGG1 по отношению к субстрату 8-oxoGua Cyt, чем к 8-oxoGua Ade, может вносить дополнительный вклад в имеющую большое биологическое значение С/А-специфичность OGG1

У) 20 10 о

40

S "О

X

Е" 20

10 о

40

30 30 10 о

О S to is 20 s 10 IS » S to IS О

Время мин

Рис 4 График зависимости накопления продукта катализируемой OGG1 реакции расщепления разных субстратов от времени в отсутствие (•) и в присутствии (О) АРЕХ1 А — 8-o\oGua Cyt Б — 8-oxoGua Ade, В — 6-OMe-8-oxoGua Cyt Г — 8-oxoAde Cyt (• О) и 8-oxoAde Thy (Ш, □) Д — 8-o\oHyp Cyt, E — 8-oxoHyp Thy, Ж — 8-oxoPu Cyt 3 — 8-MeOGua Cyt, И — 8-NH2-Gua Cyt (• О) и 8-NHrGua Ade (■, □) Масштаб осей на всех графиках один и тот же Приведены средние значения и стандартные отклонения 3 независимых экспериментов

Сравнение активности OGG1 в реакции расщепления всех исследованных субстратов позволяет разделить их на две группы — с ярко выраженной фазой всплеска и без фазы всплеска (рис 4) Оказалось, что в первую группу входят основания, которые обычно рассматривают как «хорошие» субстраты OGG1 (8-oxoGua Cyt, 6-OMe-8-oxoGua Cyt, 8-oxoAde Cyt, 8-oxoHyp Cyt), вторая же группа включает «плохие» субстраты (8-oxoGua Ade, 8-oxoAde Thy, 8-oxoHyp Thy, 8-oxoPu Cyt, 8-MeOGua Cyt, 8-NH2-Gua Cyt, 8-NH2-Gua Ade) Интересно, что стимуляция расщепления «хороших» субстратов ферментом OGG1 в присутствии АРЕХ1 более выражена, чем стимуляция расщепления «плохих» субстратов Отсутствие стимуляции (8-oxoAde Thy, 8-oxoPu Cyt) или слабая стимуляция (8-

А f B-oxoGua Cyt Б 8-oxoGua Ada В 6 OMe 8-oxoGua Cyt

Г CV^S^-tf' &-0K0Ade Cyt * 9-oxohyp Cyt jç • oxoHyp"rhy

Ж 8 oxoPu-Cyt 3 8 MeOGua Cyt И В-NM Gue Cyt 8 NH -Gua Ade

oxoGuaAde, 8-oxoHyp Thy) фермента OGG1 белком APEX1, служит еще одним подтверждением механизма прямого вытеснения

Таким образом, стимуляция OGG1 в присутствии АРЕХ1 может служить значительным дополнительным фактором, увеличивающим специфичность данной ДНК-гликозилазы на ее биологически важных субстратах

Процессивность ДНК-гликознлаз и ее вклад в субстратную специфичность

Поиск поврежденных звеньев ДНК среди огромного избытка нормальных оснований представляет непростую задачу для ДНК-гликозилаз и других ферментов репарации ДНК В настоящем исследовании разработан новый метод анализа коррелированного расщепления субстратов для исследования процессивности ДНК-гликозилаз, основанный на использовании олигонуклеотидов и позволяющий не только полностью контролировать структуру субстрата, но и количественно оценить вклад коррелированного расщепления поврежденных субстратов ДНК-гликозилазами или другими ферментами, которые распознают специфические модификации или последовательности ДНК

Коррелированное расщепление ДНК и субстратная специфичность ферментов Fpg и OGG1

Для исследования коррелированного расщепления субстратов использовали ОДН-субстрат, содержащий два звена dGuo и радиоактивную метку между ними, полученный у[32Р]-АТР фосфорилированием и последующим лигированием двух ОДН с одним dGuo-звеном каждый Расщепление субстрата только по одному из звеньев dGuo приводит к образованию 32Р-меченых фрагментов длиной 32 или 27 нт (Р32 и Р27, соответственно), а расщепление по обоим звеньям dGuo дает 32Р-меченый фрагмент длиной 19нт (Р19) Если концентрация фермента намного меньше концентрации субстрата, можно считать, что соотношение начальной скорости накопления Р)9 к суммарной скорости образования Р32, Р27 и Р19 равно vi9/(v;9+v32+v27) Данное соотношение представляет собой вероятность того, что молекула фермента после выщепления одного основания Gua выщепит следующее основание Gua в той же молекуле или "вероятностью коррелированного расщепления" (Рсс, probability of correlated cleavage) Pa представляет собой количественный параметр, позволяющий сравнивать эффективность коррелированного расщепления для одного и того же субстрата в разных условиях или для разных субстратов с одинаковым расстоянием между поврежденными основаниями

Для получения количественных данных по коррелированному расщеплению субстратов ферментами Fpg и OGG1 и определению влияния механизма поиска на специфичность этих ферментов к основанию напротив 8-oxoGua, исследовали зависимость Рсс расщепления субстратов, содержащих пары 8-oxoGua Cyt, 8-oxoGua Ade или АП dCyd (данный субстрат использовали только для анализа коррелированного расщепления ферментом Fpg) (рис 5Б, Рис 6Б) Типичные кривые накопления продуктов реакции в условиях стационарной кинетики расщепления субстратов ферментами Fpg и OGG1 представлены на (рис 5 А, рис 6А)

Рис 5 Коррелированное расщепление субстратов ферментом Fpg А — график зависимости накопления продуктов разной длины от времени при расщеплении ферментом Fpg субстрата 10G20'20G20//C40' (8-oxoGua Cyt ЮОмМ KCl) Символами обозначены продукты Р„ (•) и Р27+Р12 (О показана суммарная концентрация продуктов во избежание перекрывания символов) Приведены средние значения (■, —), АП dCyd ( i •*•) и 8-oxoGua Ade (□, —) от концентрации KCl и стандартные отклонения 3-4 независимых экспериментов Б — зависимость Рсс в реакции расщепления ферментом Fpg субстратов 8-o\oGua Cyt

В случае, если величина PCQ действительно отражает процессивность, ее значение будет понижаться при увеличении ионной силы раствора, так как неспецифические ДНК-белковые взаимодействия носят в основном электростатический характер и легко экранируются малыми ионами В случае Fpg значение Рсс уменьшалось практически линейно на участке 0-200 мМ KCl, а при 400 мМ KCl наблюдалось только малоэффективное расщепление по одному из звеньев 8-oxodGuo или по одному из АП-сайтов Данные результаты согласуются с предположением, что Fpg при низкой ионной силе перемещается по ДНК по механизму одномерной диффузии, а при повышении ионной силы способен переходить к дистрибутивному поиску Интересно, что в случае субстрата 8-oxoGua Ade Pa была выше, чем для 8-oxoGua Cyt, во всем диапазоне концентраций KCl, в особенности при высокой ионной силе (рис 5Б) Таким образом, изо всех исследованных субстратов коррелированное

расщепление 8-oxoGua'Cyt было наиболее чувствительно к электростатическому экранированию

Общая картина реакции для фермента OGG1 напоминала реакцию в случае Fpg (Р32 и Р27, рис 6А) В целом процессивность OGG1 при расщеплении 8-oxoGua Cyt была ниже, чем процессивность Fpg, до концентрации KCl 100 мМ Однако фермент OGG1 по сравнению с Fpg был менее чувствителен к повышению ионной силы (рис 6Б) Интересно, что практически при всех значениях ионной силы значение Рсс для субстрата 8-oxoGua Ade было выше, чем для 8-oxoGua Cyt ___

0 --■ --■ ' fli-'-'-■-«-J

О 2 4 I « 10 О 100 200 300 400

Время, мин KCl мМ

Рас 6 Коррелированное растепление субстратов ферментом OGGI А — график зависимости накопления продуктов разноП длины от времени при расщеплении ферментом OGG1 субстрата 10G20*20G20//C40 (8-oxoGua Cyt, 100 мМ KCl) Символами обозначены продукты Р(•) и Р27+Р12 (О, показана суммарная концентрация продуктов во избежание перекрывания символов) Приведены средние значения и стандартные отклонения 3-4 независимых экспериментов Б — зависимость Ра в реакции расщепления ферментом OGG1 субстратов 8-o\oGua Cyt (■ —) и 8-oxoGua Ade (□ —) от концентрации KCl

Полученные для Fpg и OGG1 данные позволяют сделать вывод, что при значениях ионной силы, близких к физиологическим (>150 мМ KCl), оба фермента после выщепления 8-oxoGua из пар 8-oxoGua Cyt с большой вероятностью высвобождают продукт Однако в случае субстрата 8-oxoGua Ade, вероятность того, что ферменты продолжат поиск поврежденных звеньев ДНК без диссоциации, остается достаточно высокой Таким образом, процессивный механизм поиска не вносит вклада в С/А-специфичность ферментов OGG1 и Fpg

Перемещение фермента между поврежденными звеньями ДНК может проходить по механизму скольжения или перепрыгивания Введение бреши в субстратную ДНК позволяет оценить минимальный вклад скольжения в транслокацию фермента по ДНК Для определения вклада механизма скольжения исследовали способность Fpg и OGG1 расщеплять субстраты 8-oxoGua Cyt, в которых в комплементарную немеченую цепь на участке между поврежденными основаниями была введена брешь размером в одну фосфатную группу В присутствии

бреши не наблюдалось значительного статистически достоверного уменьшения значений Рсс, что указывает на низкий вклад механизма скольжения в движение данных ферментов по ДНК

Субстратная специфичность полиморфных и фосфомиметических вариантов белка OGG1 На субстратную специфичность ферментов могут влиять аминокислотные замены и посттрансляционные модификации Полиморфизмы гена OGG1 ассоциируют с различными заболеваниями человека, в том числе онкологическими В число задач настоящего исследования входило определение влияния на активность и субстратную специфичность ДНК-гликозилазы OGG1 аминокислотных замен, которые, во-первых, встречаются в популяции человека (A288V, D322N, S326C) или, во-вторых, имитируют фосфорилирование OGG1 по остаткам Ser или Thr (S231E, S232E, S231/232E, S280E, S326E, в качестве таких фосфомиметических мутаций обычно используют замену остатка Ser/Thr остатком Glu в сайте фосфорилирования)

Активность и субстратная специфичность мутачтных форм OGG1 при расщеплении олигонуклеотидных субстратов Для изучения влияния аминокислотных замен на активность и субстратную специфичность OGG1 были определены значения констант kcat и Км для реакции расщепления субстратов 8-oxoGua Cyt и 8-oxoGuaAde ферментом OGG1 дикого типа и его мутантными формами Подсчет отношения констант специфичностей (ksp ~ кш/Км) для субстратов 8-oxoGua Cyt и 8-oxoGua Ade позволяет оценить, во сколько раз фермент более эффективен на одном из этих субстратов, чем на другом Интересно, что OGGI-D322N из исследованных полиморфных вариантов OGG1 проявлял наибольшую С/А-специфичность (табл 3, табл 4) При подсчете соотношения kSfl для 8-oxoGua Cyt к ksp для 8-oxoGua Ade оказалось, что значение С/А-специфичности всех фосфомиметических мутантных форм близко к специфичности OGG1 дикого типа (табл 4)

Табл. 3 Значения АГМ, ксА и А,,, для расщеплении ОДН субстрата, содержащго пару 8-охоСиа Су и ферментом ОСС1 дикого типа и его ми мутантнымн формами

Фермент АГм н,М Ас»! мин^хЮ2 (М иМ 'хмин'1 х!02 А<Ф|ОСС1|/^я|||*п......

дикий тип 3,39 ±0 57 3.0 ±0,1 0,89 1

А288У 8 62± 1,18 5,5 ± 0,3 0 64 1,39

0322Ы 6,11 ± 1,16 2 8 ± 0,1 0,46 1 93

Б326С 3 38 ±0 83 2 2 ± 0,1 0 65 1.37

5231Е 5,66 ± 1,17 4 2 ± 0 2 0,74 1,20

Б232Е 9 21 ± 1 46 3 9±0 2 0 42 2,12

8231/232Е 10 1 ± 1,07 4 1 ± 0 2 0,40 2.23

5280Е 7 42 ± 1 62 2 9 ± 0 2 0 40 2,23

5326Е 7.50 ± 1 36 3 2 ± 0 1 0,43 2,07

Приведены средние значения и стандартные отклонения 3-5 независимых экспериментов

Табл 4 Значения А'м, А„, и Ач, для расщеплении ОДН субстрата, содержащго пару 8' охоСиа.Л(1с, ферментом ОСС1 дикого типа и его ми мутантнымн формами

Фермент нМ мин 1 х102 А"с,|/А'м (*.п) нМ'1 х мин"1 хЮ2 А)р|ОСС||/Ач,|мпа1|||

дикиП тип 23.1 ±4,82 4 1 ± 0 3 0,18 1 4,94

А288У 17 5 ±3.54 3,2 ± 0 2 0,18 0,97 3,56

0322Ы 22 1 ±5,51 0.9 ± 0 1 0 04 4,53 11,5

Б326С 12,6 ±2 60 1,6 ± 0 1 0,12 1 44 5 42

5231Е 14,1 ±4,01 2,0 ±0,1 0 14 1,25 5,29

5232Е 23 4 ± 3,78 2 3 ± 0 1 0 10 1 81 4,20

Б231/232Е 25.0 ±4 57 2 4 ± 0,1 0 10 1,82 4,00

5280Е 18,1 ±3 40 1,6± 0 1 0 09 2,05 4,44

5326Е 23 60 ±2,17 1 6± 0,0 0 07 2,62 6,14

Приведены средние значения и стандартные отклонения 3-5 независимых экспериментов

Активность и субстратная специфичность мутантных форм ОО.71 при расщеплении высокомолекулярной ДНК Для определения спектра окисленных субстратов ферментов Fpg и 0001 использовали высокомолекулярную ДНК, обработанную у-излучением Все исследованные формы 0001 выщепляли из высокомолекулярной ДНК основания Рару-Оиа и 8-охоОиа, за исключением 0001-83260, который удалял из ДНК Рару-Оиа, но не 8-охоОиа, при этом мутантные формы 0001 не приобретали какой-либо принципиально новой субстратной специфичности (рис 7 А, Б)

Для всех фосфомиметических форм (Ю01 значения для выщепления Рару-Оиа и в особенности 8-охоОиа были понижены, при этом способность выщеплять Рару-Оиа была менее затронута по сравнению с 8-охоОиа (рис. 7В, Г). В целом полученные данные согласуются с результатами по расщеплению дцОДН, содержащих 8-охоОиа:Су1.

Рис. 7 Вьицепление ферментом OGG1 и его мутантными формами оснований 8-oxoGua и Fapy-Gua из высокомолекулярной ДНК, поврежденной у-излучением. А — зависимость выщепления 8-oxoGua (О), Fapy-Gua (•) и Fapy-Ade (■) ферментом OGG1 от времени. Б — зависимость выщепления 8-oxoGua (О), Fapy-Gua (•) и Fapy-Ade (■) ферментом Fpg от времени. В — константы специфичности k%f = kaJKM для реакции выщепления Fapy-Gua ферментом OGG1 и его мутантными формами. Г — константы специфичности Asp для реакции выщепления 8-oxoGua ферментом OGG1 и его мутантными формами.

Также в настоящей работе была исследована активность фосфомиметических форм OGG1 в присутствии и в отсутствие АРЕХ1. Для всех форм способность к стимуляции ферментом АРЕХ1 была значительно снижена по сравнению с OGG1 дикого типа.

Клонирование и характеризация гомолога Nei и Fpg из М. tuberculosis

Белки Fpg и Nei принадлежат к одному структурному семейству, и уровень их гомологии достаточно высок. Однако сравнение последовательностей и структур этих ферментов из разных видов позволяет выявить элементы, которые могут вносить вклад в субстратную специфичность Fpg и Nei (рис. 8). Для белков Fpg такими специфическими элементами являются N-концевая консенсусная последовательность Pro-Glu-Leu-Pro-Glu (специфический элемент I), интеркалирующая триада Met-73-Arg-108-Phe-110 (11, здесь и далее

Mt Li-Neil

Mtu-Nei2

Mtu-Fpgl

Eco—Fpg

Mtu-Fpg2

Eco-Nei

Mtu-Neil

Mtu-Nei2

Mtu-Fpgl

Eco-Fpg

Mtu-Fpg2

Eco-Nei

Mtu-Neil

Mtu-Nei2

Mtu-Fpgl

Eco-Fpg

Mtu-Fpg2

Eco-Nei

Mtu-Neil

Mtu-Nei2

Mtu-Fpgl

Eco-Fpg

Mtu-Fpg2

Eco-Nei

Mtu-Neil

Mtu-Nei2

Mtu-Fpgl

Eco-Fpg

Mtu-Fpg2

Eco-Nei

Mtu-Neil

Mtu-Nei2

Mtu-Fpgl

Eco-Fpg

Mtu-Fpg2

Eco-Nei

BGDTVWHTAATLRRH1AGRTLTRCDIR----------VPRFAAVDLTGEWDEVISRG 49

IGHTLHRLARLHQRRFAGAPVSVSSPQG---------R FADS AS ALNGRVLRRASAWG 50

fepVEWRRGLQAHVTGRTITEVRVHHPRAVRRHDAGPADLTARLRGARINGTDRRG ""

¡svetsrrgiephlvgatilhawrn-

-grlrwpvseeiyrlsdqpvlsvqrra 55

kS|gpeirraadnleaaikgkpltdvwfafp-

-QLKPYQSQLIGQHVTHVETRG 51

BHLFIR-TGTAS-------IHSHLC«DGSWRVGNRPVRVDHRARIILEANQQEQAIRVVG 101

SHLFHHYVGGPV-------VHVHLMYGTFTEWARPTDG------WLPEPAGQVRMRMVG 97

BYLWLTLNTAGVHRPTDTALWHLjœG--QMLLGAVPCAAHVRISALLDDGTVLSFADQ 117

gYLLLELPEG--------WII IHLf^GSLRILPEELPPEKHDHVDLVMSNGKVLRYTDP 107

-----------------------------------------------------MAGTPQP 1

Ë^LLTHFSNDLT-------LYSHNQfYGVMRWDTGEEPQTTRVLRVKLQTADKTILLYS 104

* ++-ИШ

VptlG-------LLEVIDRHM--DGAWAKLGPDLLADDWDPQRAAANLIVA—PDRPIAE 150

AE|GTDLRGPTVCESIDDGE--VADWARLGPDPLRSDANPS-SAKSRITK—SRRP1GA 152

|T|G----GWLLADLVTVDGSWPVPVAHLARDPLDPRFDCD-AWKVLRR--KHSEL|R 170

|R|G----AWLWTKELEGHN-----VLTHLGPEPLSDDFNGE-YLHQKCAK—KKTAlip 155

|A,|G---------------------------PDALDVSTDDL—AGLLAG—NTGRI|T 35

ÂSDI---------EMLTPEQLTTHPFLQRVGPDVLDPNLTPEWKERLLSPRFRNRQFAG 1S5

+ +(II) + (III)

***********

ÍNELCFVSGVLPTAPVSAVADP-----------RRLVTRARD-ML 196

¡RNELLFRHRIDPQRPGRGIGEPEFDAAWNDLVSLMKVGLRRG-KI 211 jDEALWRAKVNGAHVAATLRCRRLGAVLHAAADVMREALAKGGTS 230 jjSESLFAAGIHPDRLASSLSLAECELLARVIKAVLLRSIEQGGTT 215 pDEILHVAKIS PFATAGKLSGAQLTCLHEAKASVLSDAVRRSVGQ 95 ¡RVEILWQVGLTGNHKAKDLNAAQLDALAHALLEIPRFSYATRGQV 215 *+<IV)

wvnrfrwnrcttgdtragrrlwvygragqi iwrpehdhglpsylpdrprtyvyrrage fdslyvnvngesgyfer—sldaygrege: lkdflq-s dgkpgy faq--elovygrkge

GAAMLKGEKRS--------GLRVHARTGLPi

denkhhgalfr---------fkvfhrdgep

*********

r************

ladrrmsrllk 158

Рис. 8 Выравнивание последовательностей белков групп Fpg и Nei из Е. coli и их гомологов из М. tuberculosis. Черным цветом и звездочками выделены остатки, высококонсервативные во всех белках Fpg и Nei и принимающие участие в катализе или связывании ДНК. Первый из протяженных блоков гомологии (Leu-157-Tyr-170 по нумерации £co-Fpg) соответствует центральной части мотива «спираль—два поворота— спираль», второй (Cys-243-Gln-267 по нумерации Eco-Fpg) — мотиву цинкового пальца. Знаками + выделены остатки специфических элементов Fpg или Nei: 1 — участок N-концевой спирали, примыкающий к каталитическому дипептиду Pro-Glu, Il — интеркалирующие остатки, III и IV — специфические остатки, ответственные за правильную ориентацию цинкового пальца. Остатки, специфические для Fpg, обозначены белыми буквами на темно-сером фоне, а специфические для Nei — черными буквами на светло-сером фоне. При нумерации остатков не учитывается инициирующий остаток Met, который в зрелой форме белка отщепляется.

нумерация соответствует позициям в белке Е. coli), остаток Lys-155 (III) и остаток Ala (или другой малый незаряженный аминокислотный

остаток) в позиции 171 (IV), в то время как для белков Nei в число специфических элементов входят N-концевая консенсусная последовательность Pro-Glu-GIy (специфический элемент I), интеркалирующая триада Gln-69-Leu-70-Tyr-71 (II), остаток Ala (или другой малый незаряженный аминокислотный остаток) в позиции 155 (Ш) и остаток Arg в позиции 171 (IV). В связи с этим представляет интерес вопрос, насколько сохранность этих элементов важна для определения спектра оснований, выщепляемых белками семейства Fpg/Nei, а также для других функций этих ферментов. Хорошую систему для анализа такого рода представляют собой гомологи Fpg и Nei из микобактерий, геномы которых обычно содержат несколько генов, гомологичных генами fpg и nei Е. coli.

расщ H,Ura Ura расш 8-oxoAde 8-oxoGua

«омпл. AATCGAATCG компп А А Т С G А А Т С G Ml¿/-Net2 - + + **■- + + + + Mfu-Nei2 - + +■++-+ + + +

расщ. Ade

_ 8-oxoAde H.Ura froxoAde HzUra АП

коыпл А А T С G 8-oxoAde fl-oioGna 6-o/oAoe 8-oxoGua Ura АП

№u.Nai2 -«- + + + - + + + Mm. Ne¡2 - + + + + - +

Рис. 9 Электрофореграммы разделения продуктов расщепления разных субстратов ферментом M¡/-Nei2. Показано расщепление дц субстратов, содержащих: А — HiUra (дорожки 1-5) и Ura (6-10) напротив Ade (дорожки 1,2, 6, 7), Thy (3, 8), Cyt (4, 9) и Gua (5, 10); Б — 8-oxoAde (дорожки 1-5) и 8-oxoGua (6-10) напротив Ade (дорожки I, 2, 6, 7), Thy (3. 8), Cyt (4. 9) и Gau (5, 10); В — АЛ-сайт (дорожки 1-5) и Ade (6-9) напротив Ade (дорожки 1, 2), Thy (3), Cyt (4), Gua (5), 8-oxoAde (6, 7), 8-oxoGua (8). HjUra (9) и оцОДН (Г), содержащего 8-oxoAde (дорожки 1, 2), 8-oxoGua (3), H2Ura (4), Ura (5) и АП-сайт (6, 7).

Поиск в геноме М. tuberculosis обнаружил несколько последовательностей, гомологичных генам fpg и nei Е. coli. Полипептид Mtu-Nei2 в большей степени гомологичен £co-Nei, но несет некоторые структурные элементы, характерные для Eco-Fpg (рис. 8). Последовательность mtu-nei2 была клонирована в плазмидный вектор для последующего анализа, рекомбинантный белок был экспрессирован в Е. coli и выделен. Для сравнения субстратной специфичности Mtu-Nei2 с другими ферментами семейства Fpg/Nei была исследована способность Mtu-Nei2 расщеплять дц- и оцОДН-

субстраты, содержащие разные поврежденные звенья и разные основания напротив повреждения (рис 9) Как и гомологичные ферменты из Е coli, Mtu-Nei2 проявлял высокую АП-лиазную активность по отношению к АП-содержащим субстратам (рис. 9В, дорожки 2-5) Фермент эффективно выщеплял из дцОДН остатки H2Ura, при этом более предпочтительным субстратом был ОДН H2Ura Gua, что в целом напоминает специфичность £co-Nei по отношению к основанию напротив H2Ura (рис 9А, дорожки 2-5) Также фермент был способен расщеплять, хотя и с меньшей эффективностью, дцОДН, содержащие звенья 8-oxoGua и Ura (рис 9А дорожки 7-10, Б дорожки 7-10) Наблюдалось также расщепление оцОДН, содержащих звенья АП, H2Ura, 8-oxoGua, 8-oxoAde и Ura, хотя и с меньшей эффективностью, чем дцОДН (рис 9Г)

Таким образом, Mw-Nei2 по субстратной специфичности ближе к £co-Nei, чем Eco-Fpg По-видимому, наличие N-концевой консенсусной последовательности Pro-Glu-Gly, малого незаряженного аминокислотного остатка в позиции 151 и остатка Arg в позиции 168, достаточно для сдвига субстратной специфичности от окисленных пуриновых к пиримидиновым основаниям

Выводы

1) Проведено исследование зависимости специфичности 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз Е coli (Fpg) и человека (OGG1) к основанию напротив 8-оксогуанина (8-oxoGua) от состава реакционной смеси Показано, что специфичность обоих ферментов по отношению к корректному субстрату 8-oxoGua Cyt повышается при значениях ионной силы и концентрации ионов Mg2+, близких к физиологическим значениям В случае Fpg увеличение специфичности достигается за счет уменьшения значений Км для корректного субстрата и увеличения для некорректного субстрата (8-oxoGuaAde), а в случае OGG1 — за счет увеличения для корректного субстрата значений константы скорости реакции разрыва /V-гликозидной связи (к2) и константы скорости высвобождения апурин-апиримидинового (АП) продукта реакции (Л3) и уменьшения этих значений для некорректного субстрата

2) Показано, что стимуляция активности OGG1 в присутствии АП-эндонуклеазы человека АРЕХ1 происходит по механизму непосредственного вытеснения OGG1 из комплекса с

продуктом При расщеплении корректных биологически значимых субстратов стимуляция протекает эффективнее, чем в случае некорректных субстратов

3) Разработана новая методика анализа процессивности ДНК-гликозилаз Показано, что Fpg и OGG1 катализируют процессивное расщепление субстратов, содержащих 8-oxoGua и АП-сайты Процессивность действия уменьшается с возрастанием ионной силы раствора Целостность фосфодиэфирного остова двуцепочечной ДНК не влияет на процессивность действия Fpg и OGG1 Процессивность Fpg и OGG1 при расщеплении субстратов 8-oxoGua Ade выше, чем при расщеплении субстратов 8-oxoGua Cyt, что указывает на отсутствие вклада фактора процессивности в обеспечение корректной специфичности ферментов

4) Определены кинетические параметры реакции, катализируемой мутантными формами OGG1 природными полиморфными вариантами A288V, D322N и S326C и фосфомиметическими мутантными формами S280E, S231E, S232E, S231E/S232E и S326E Активность большинства мутантных форм несколько снижена по сравнению с ферментом дикого типа, однако фермент OGG1-D322N обладает повышенной специфичностью к основанию Cyt напротив поврежденного основания Активности всех форм OGG1 при выщеплении 2,6-диамино-4-оксо-5-формамидопиримидина из высокомолекулярной ДНК сходны, в то время как активность практически всех мутантных форм по отношению к 8-oxoGua заметно снижена, а у белка OGG1-S326C отсутствует АП-эндонуклеаза АРЕХ1 стимулирует активность фосфомиметических мутантных форм в меньшей степени, чем фермента OGG I дикого типа

5) Проведено клонирование паралога генов fpg и эндонуклеазы VIII (nei) Mycobacterium tuberculosis (Mtu-nei2) Получен суперэкспрессирующий штамм Е coli, из которого выделен белок A/fM-Nei2 Фермент Miu-Ne i2 проявляет высокую активность по отношению к ДНК-субстратам, содержащим остатки дигидроурацила и АП-сайты, а также способен с меньшей эффективностью расщеплять субстраты, содержащие остатки 8-oxoGua и урацила Субстратная специфичность фермента Mtu-Nei2 сходна с субстратной специфичностью Nei Е coli

Основные результаты работы опубликованы в работах:

1. Sidorenko V S , Nevmsky G А , Zharkov D О (2007) Mechanism of interaction between human 8-oxoguanine-DNA glycosylase and AP endonuclease DNA Repair, б, p 317328

2. Sidorenko V S , Mechetin G V , Nevmsky G A , Zharkov D О (2008) Correlated cleavage of single- and double-stranded substrates by uraciI-DNA glycosylase FEBS Lett, 582, p 410-414

3. Sidorenko V S , Nevmsky G A , Zharkov D О (2008) Specificity of stimulation of human 8-oxoguanine-DNA glycosylase by AP endonuclease Biochem Biophys Res Commun , 368, p 175-179

4. Сидоренко В С , Рот М А , Филипенко М J1, Невинский Г А , Жарков Д О , (2008) Новые ДНК-гликозилазы из Mycobacterium tuberculosis Биохимия 73, стр 542-552

Изд лиц ИД №0460 от 20 02 2001 Подписано к печати и в свет 14 05 2008 Формат бумаги 60x84/16 Бумага №1 Гарнитура "Times New Roman" Печать офсетная Печ л 1 1 Уч -изд л 1.0 Тираж 100, Заказ № 71 Институт неорганической химии им А В Николаева, СО РАН Просп Акад Лаврентьева, 3, Новосибирск, 630090

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сидоренко, Виктория Сергеевна

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Окислители и антиоксид анты.

2.2. Повреждения ДНК.

2.2.1. Урацил и другие продукты дезаминирования оснований ДНК.

2.2.2. Продукты электрофильного присоединения.

2.2.3. Апурин-апиримидиновые сайты.

2.2.4. Фотопродукты.

2.2.5. Окисленные пиримидиновые основания.

2.2.6. Окисленные пуриновые основания.

2.2.6.1. 8-оксогуанин и формамидопиримидиновое производное гуанина

2.2.6.2. 8-оксоаденин и формамидопиримидиновое производное аденина

2.3. Биологические последствия окислительных повреждений ДНК.

2.4. Репарация.

2.4.1. Общий механизм эксцизионной репарации оснований.

2.4.2. ДНК-гликозилазы.

2.4.3. Каталитический механизм ДНК-гликозилаз.

2.4.4. GO-система.

2.4.5. Формамидопиримидин-ДНК-гликозилаза (Fpg или MutM).

2.4.6. Эндонуклеаза VIII (Nei).

2.4.7. 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаза человека, OGG1.

2.4.8. АП-эндонуклеазы.

2.4.9. Коррелированный поиск повреждений в эксцизионной репарации оснований.

2.4.10. Белок-белковые взаимодействия в процессе эксцизионной репарации оснований.

2.4.11. Полиморфные варианты гена OGG1 и риск возникновения онкологических заболеваний.

2.4.11.1. Полиморфные варианты OGG1.

2.4.11.2. Функциональность полиморфных вариантов OGG1.

2.4.11.3. Эпидемиологические исследования ассоциации OGG1 с онкологическими и другими заболеваниями.

3. Материалы и методы.

3.1. Реактивы.

3.2. Дезоксирибоолигонуклеотиды.

3.3. Ферменты.

3.4. Штаммы бактерий.

3.5. Сайт-направленный мутагенез OGG1.

3.6. Выделение 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы человека (OGG1).

3.7. Выделение АП-эндонуклеазы человека (АРЕХ1).

3.8. Определение концентрации белка.

3.9. Гель-электрофорез и количественный обсчет результатов экспериментов

3.10. Введение Р метки по 5'-концу дезоксирибоолигонуклеотидов.

3.11. Стандартные условия отжига комплементарных цепей олигонуклеотидов

3.12. Определение концентрации активной формы OGG1.

3.13. Влияние ионной силы и ионов Mg2+ на специфичность OGG1 и Fpg.

3.14. Определение кинетических параметров Fpg и OGG1.

3.15. Определение влияния OGG1 на активность АРЕХ1.

3.16. Взаимодействие OGG1 с АП-эндонуклеазами и ДНК-гликозилазами.

3.17. Моделирование каталитической схемы OGG1 по методу Монте-Карло.

3.18. Препаративный синтез ковалентного комплекса OGG1 с дуплексами, содержащими 8-oxoGua.

3.19. Регистрация взаимодействия комплекса ДНК«СЮ01 с АРЕХ1, Apnlp и Nfo.

3.20. Взаимодействие комплекса ДНК«СЮ01 cAPEXl на нитроцеллюлозных мембранах.

3.21. Получение конкатемерной ДНК.

3.22. Определение механизма вытеснения OGG1 АП-эндонуклеазой.

3.23. Получение субстратов для экспериментов по коррелированному расщеплению.

3.24. Коррелированное расщепление субстратов.

3.25. Клонирование генов mtu-nei2 и mtu-fpg2 из М. tuberculosis.

3.26. Комплементация генами mtu-nei2 и mtu-fpg2 мутантных фенотипов Е. coli

3.27. Экспрессия и выделение белка Mtu-Nei2.

3.28. Определение активности препаратов Mtu-Nei2.

3.29. Образование ковалентных комплексов Mtu-Nei2 с поврежденной ДНК. 72 4. Результаты и их обсуждение.

4.1. Влияние ионов Mg2+ и ионной силы на специфичность 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз Е. coli и человека.

4.1.1. Влияние ионной силы и дивалентных катионов на активность и специфичность OGG1 и Fpg.

4.1.2. Влияние органических анионов на специфичность Fpg и OGG1.

4.1.3. Отсутствие влияния полиаминов, краудинг-агентов и некоторых аналогов пуринов на активность и специфичность OGG1 и Fpg.

4.1.4. Влияние условий реакции на специфичность 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз: заключение.

4.2. Взаимодействие OGG1 с АРЕХ1 и влияние этого взаимодействия на специфичность OGG1.

4.2.1. Стимуляция активности OGG1 в присутствии АРЕХ1.

4.2.2. Активность OGG1 в присутствии АРЕХ1 для субстратов с различным положением 8-oxoGua:Cyt.

4.2.3. Активность OGG1 в присутствии АП-эндонуклеаз из S. cerevisiae и

Е. coli.

4.2.4. Влияние других ДНК-гликозилаз и АП-лиаз на активность OGG1.

4.2.5. Образование тройного комплекса между OGG1, ДНК и АП-эндонуклеазами.

4.2.6. Влияние АРЕХ1 на основные кинетические параметры OGG1.

4.2.7. Расщепление АП-эндонуклеазой APEX 1 субстрата, содержащего аналог АП-сайта, в присутствии OGG1.

4.2.8. Специфичность стимуляции OGG1 в присутствии АРЕХ1.

4.3. Процессивность ДНК-гликозилаз и ее вклад в субстратную специфичность.

4.3.1. Коррелированное расщепление одноцепочечных и двуцепочечных субстратов урацил-ДНК-гликозилазой Е. coli (Ung).

4.3.2. Коррелированное расщепление ДНК и субстратная специфичность фермента Fpg.

4.3.3. Коррелированное расщепление ДНК и субстратная специфичность фермента OGG1.

4.3.4. Коррелированное расщепление ферментами Fpg и OGG1 субстратов, содержащих брешь.

4.3.5. Коррелированное расщепление ДНК мутантными формами Fpg.

4.3.6. Процессивность при вытеснении АП-эндонуклеазой фермента OGG1 из комплекса с продуктом.

4.3.7. Влияние процессивности на специфичность 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз: заключение.

4.4. Субстратная специфичность полиморфных и фосфомиметических вариантов белка OGG1.

4.4.1. Активность и субстратная специфичность мутантных форм OGG1 при расщеплении олигонуклеотидных субстратов.

4.4.2. Активность и субстратная специфичность мутантных форм OGG1 при расщеплении высокомолекулярной ДНК.

4.4.3. Стимуляция активности мутантных форм OGG1 АП-эндонуклеазой АРЕХ1.

4.4.4. Субстратная специфичность полиморфных и фосфомиметических вариантов белка OGG1: заключение.

4.5. Клонирование и характеризация гомологов Nei и Fpg из М. tuberculosis

4.5.1. Комплементация мутантого фенотипа Е. coli.

4.5.2. Выделение и характеризация рекомбинантного белка Mtu-Nei2.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Факторы, определяющие субстратную специфичность 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз Escherichia coli и человека"

Молекула ДНК, главный носитель генетической информации, может повреждаться различными агентами физической и химической природы. Окислительные повреждения оснований, очень часто встречающиеся в ДНК, играют значительную роль в онкогенезе, старении и многих патологических процессах. Целостность ДНК после таких повреждений восстанавливается системой репарации ДНК, чаще всего путем эксцизионной репарации оснований (ЭРО). На ранних этапах ЭРО участвуют специфические ферменты двух классов — ДНК-тУ-гликозилазы, распознающие повреждение в ДНК и выщепляющие поврежденное основание, и АП-эндонуклеазы, расщепляющие ДНК по вновь образованному апурин-апиримидиновому (АП-) сайту.

Субстратной специфичности ДНК-гликозилаз посвящено большое количество работ во всем мире. Во всех организмах присутствует несколько ферментов из этой группы: так, у Escherichia coli насчитывается 8 ДНК-гликозилаз, а у человека — 11. Одни ДНК-гликозилазы обладают очень узкой субстратной специфичностью, например, удаляя из ДНК только основания урацила (Ura), в то время как другие способны выщеплять очень широкий спектр поврежденных оснований (например, практически все встречающиеся в природе окисленные пиримидиновые основания). Установление структуры многих ДНК-гликозилаз и их комплексов с поврежденной ДНК за последние 15 лет привело к идентификации важных для субстратной специфичности взаимодействий между аминокислотными остатками активных центров этих ферментов и поврежденными основаниями, а также к пониманию того, что фермент-субстратный комплекс в ходе реакции претерпевает ряд конформационных изменений. В последнее время также становится ясным, что субстратная специфичность ДНК-гликозилаз может по крайней мере частично определяться не только взаимодействиями в активном центре в михаэлисовском комплексе, но и структурными и динамическими особенностями фермент-еубстратного комплекса на ранних стадиях узнавания поврежденного звена ДНК еще до принятия комплексом каталитически компетентной конформации.

Проблема субстратной специфичности ферментов в целом и ДНК-гликозилаз в частности не исчерпывается установлением структуры фермент-субстратного комплекса или даже серии структур, приближенных к комплексам, последовательно образующимся в ходе реакции. В случае ДНК-гликозилаз, например, это подчеркивается тем, что для одного и того же фермента может наблюдаться большая разница в субстратной специфичности при использовании разных методов анализа. В частности, в ряде случаев многие поврежденные основания могут выщепляться из олигонуклеотидных субстратов, но не из поврежденной высокомолекулярной ДНК. Очевидно, что на субстратную специфичность ДНК-гликозилаз как in vitro, так и in vivo может влиять множество факторов, не очевидных из структуры, полученной методами рентгеноструктурного анализа или ядерного магнитного резонанса. В конечном итоге субстратная специфичность любой ДНК-гликозилазы определяется кинетическими факторами и зависит от относительных скоростей выщепления тех или иных оснований. Конкретные условия проведения реакции, различные белок-белковые взаимодействия, посттрансляционная модификация, аминокислотные замены, структура и динамика белка в областях, не взаимодействующих непосредственно с поврежденным основанием могут по-разному влиять на константы скорости отдельных стадий реакции для разных субстратов и тем самым вносить значительный вклад в субстратную специфичность. Для систематического изучения подобных факторов идеально подошла бы ДНК-гликозилаза, способная использовать несколько субстратов с разной эффективностью, причем корректная субстратная специфичность имела бы непосредственное отношение к биологической функции фермента.

Одним из самых распространенных окисленных оснований ДНК является 8-оксогуанин (8-oxoGua). Его способность образовывать энергетически выгодную пару с Ade приводит к тому, что при репликации напротив возникшего при окислении ДНК остатка 8-oxoGua ДНК-полимеразами часто включается dAMP, что после второго цикла репликации приводит к трансверсиям G—>Т. Репарация 8-oxoGua у прокариот и эукариот осуществляется с помощью специальной ферментативной системы (GO-системы), центральными элементами которой являются 8-оксогуанин-ДНК-7У-гликозилазы: Fpg у прокариот и OGG1 у эукариот. Эти белки не гомологичны на уровне последовательности и обладают совершенно разной третичной структурой. Тем не менее, как Fpg, так и OGG1 эффективно удаляют основание 8-oxoGua из пары с Cyt и гораздо хуже используют субстраты 8-oxoGua:Ade, выщепление 8-oxoGua из которых может приводить к трансверсиям G—>Т в тех случаях, когда такая пара возникла при включении dAMP напротив 8-oxoGua при репликации. Пары 8-oxoGua:Ade репарируются с участием других ДНК-гликозилаз. Таким образом, специфичность ферментов Fpg и OGG1 к основанию напротив 8-oxoGua выступает как ключевой фактор корректного функционирования GO-системы. Помимо 8-oxoGua, оба фермента способны удалять из поврежденной высокомолекулярной ДНК основания 2,6-диамино-4-оксо-5-формамидопиримидина, a Fpg — еще и остатки 4,6-диамино-5-формамидопиримидина; также описано удаление этими многих модифицированных пуриновых оснований из олигонуклеотидных субстратов.

Белок Fpg гомологичен эндонуклеазе VIII — прокариотической ДНК-гликозилазе, удаляющей из ДНК окисленные пиримидиновые основания, но значительно отличается от нее по субстратной специфичности. В свою очередь белок OGG1 входит в суперсемейство эндонуклеазы III, которая также специфична по отношению к окисленным пиримидинам.

Цель настоящей работы заключается в изучении факторов, влияющих на субстратную специфичность ферментов OGG1 и Fpg. В ходе исследования необходимо было решить следующие задачи:

• изучить влияние условий реакции: ионной силы, присутствия ионов Mg2+, краудинг-агентов, полиаминов и т. п. на активность и на субстратную специфичность ферментов OGG1 и Fpg;

• изучить влияние АП-эндонуклеазы человека (АРЕХ1) на активность и субстратную специфичность фермента OGG1;

• изучить процессивность реакции расщепления различных субстратов ферментами Fpg и OGG1 и возможный вклад процессивности в субстратную специфичность этих ферментов;

• изучить влияние некоторых полиморфных и имитирующих фосфорилирование аминокислотных замен на активность и субстратную специфичность фермента OGG1;

• изучить субстратную специфичность ферментов, которые в целом гомологичны белку Fpg, но отличаются от него последовательностями некоторых высококонсервативных в семействе Fpg мотивов.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Сидоренко, Виктория Сергеевна

6. выводы

1) Проведено исследование зависимости специфичности 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз Е. coli (Fpg) и человека (OGG1) к основанию напротив 8-оксогуанина (8-oxoGua) от состава реакционной смеси. Показано, что специфичность обоих ферментов по отношению к корректному субстрату 8-oxoGua:Cyt повышается при значениях ионной силы и концентрации ионов Mg2+, близких к физиологическим значениям. В случае Fpg увеличение специфичности достигается за счет уменьшения значений Км для корректного субстрата и увеличения для некорректного субстрата (8-oxoGua:Ade), а в случае OGG1 — за счет увеличения для корректного субстрата значений константы скорости реакции разрыва TV-гликозидной связи (кт) и константы скорости высвобождения апурин-апиримидинового (АП) продукта реакции (кз) и уменьшения этих значений для некорректного субстрата.

2) Показано, что стимуляция активности OGG1 в присутствии АП-эндонуклеазы человека АРЕХ1 происходит по механизму непосредственного вытеснения OGG1 из комплекса с продуктом. При расщеплении корректных биологически значимых субстратов стимуляция протекает эффективнее, чем в случае некорректных субстратов.

3) Разработана новая методика анализа процессивности ДНК-гликозилаз. Показано, что Fpg и OGG1 катализируют процессивное расщепление субстратов, содержащих 8-oxoGua и АП-сайты. Процессивность действия уменьшается с возрастанием ионной силы раствора. Целостность фосфодиэфирного остова двуцепочечной ДНК не влияет на процессивность действия Fpg и OGG1. Процессивность Fpg и OGG1 при расщеплении субстратов 8-oxoGua:Ade выше, чем при расщеплении субстратов 8-oxoGua:Cyt, что указывает на отсутствие вклада фактора процессивности в обеспечение корректной специфичности ферментов.

4) Определены кинетические параметры реакции, катализируемой мутантными формами OGG1: природными полиморфными вариантами A288V, D322N и S326C и фосфомиметическими мутантными формами S280E, S231E, S232E, S231E/S232E и S326E. Активность большинства мутантных форм несколько снижена по сравнению с ферментом дикого типа, однако фермент OGG1-D322N обладает повышенной специфичностью к основанию Cyt напротив поврежденного основания. Активности всех форм OGG1 при выщеплении 2,6диамино-4-оксо-5-формамидопиримидина из высокомолекулярной ДНК сходны, в то время как активность практически всех мутантных форм по отношению к 8-oxoGua заметно снижена, а у белка OGG1-S326C отсутствует. АП-эндонуклеаза АРЕХ1 стимулирует активность фосфомиметических мутантных форм в меньшей степени, чем фермента OGG1 дикого типа.

5) Проведено клонирование паралога генов fpg и эндонуклеазы VIII (nei) Mycobacterium tuberculosis (Mtu-nei2). Получен суперэкспрессирующий штамм Е. coli, из которого выделен белок Mfw-Nei2. Фермент M/w-Nei2 проявляет высокую активность по отношению к ДНК-субстратам, содержащим остатки дигидроурацила и АП-сайты, а также способен с меньшей эффективностью расщеплять субстраты, содержащие остатки 8-oxoGua и урацила. Субстратная специфичность фермента Mtu-Nei2 сходна с субстратной специфичностью Nei Е. coli.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Функционирование GO-системы основано на дискриминации ДНК-гликозилами пар 8-oxoGua:Cyt и 8-oxoGua:Ade. Ферменты Fpg и OGG1 с гораздо большей эффективностью удаляют 8-oxoGua из первой пары оснований, чем из второй. Кроме специфичности к основанию напротив 8-oxoGua, Fpg и OGG1 способны выщеплять характерный для каждого фермента спектр повреждений, при этом часто наблюдается ситуация, когда субстратная специфичность ферментов при использовании ОДН гораздо шире по сравнению с высокомолекулярной ДНК. Факторы, влияющие на субстратную специфичность ДНК-гликозилаз, практически не исследованы. Так, на предпочтение ДНК-гликозилазами (в частности Fpg и OGG1) одних субстратов другим могут влиять ионы Mg2+, полиамины, ионная сила раствора, органические анионы, краудинг-агенты, аналоги пуриновых оснований, посттрансляционная модификация, а также другие ферменты и вспомогательные белки ЭРО. Механизм поиска специфичных для каждого фермента субстратов среди огромного избытка немодифицированных оснований ДНК также может влиять на субстратную специфичность ферментов. Кроме этого одну из главных ролей в осуществлении специфических функций ферментов играют консервативные мотивы и отдельные аминокислотные остатки. Например, при наличии подгрупп с разной субстратной специфичностью внутри структурных семейств ферментов элементы, консервативные внутри всего семейства, преимущественно ответственны за общие каталитические функции, а мотивы и аминокислоты, консервативные внутри определенной подгруппы — для специфических в данной подгруппе свойств.

Настоящая работа представляет собой исследование различных факторов, ответственных за специфичность ДНК-гликозилаз Fpg и OGG1. В результате оказалось, что основной вклад в обеспечение С/А-специфичности обоих ферментов вносят ионная сила, концентрация Mg в реакционной смеси и, в случае OGG1, стимуляция АП-эндонуклеазой АРЕХ1. Аминокислотные замены, наблюдаемые в природных вариантах OGG1, а также имитирующие фосфорилирование белка, влияли на его С/А-специфичность в заметно меньшей степени, однако ранее не исследованный вариант OGG1-D322N обладал повышенной специфичностью по сравнению с ферментом дикого типа. С другой стороны, такие факторы, как присутствие органических анионов (глутамат), полиаминов, краудинг-агентов и некоторых гетероциклических соединений (кофеин, биотин), а также механизм процессивного поиска повреждений не влияли па С/А-специфичность исследованных ферментов. Что же касается специфичности OGG1 по отношению к поврежденным основаниям, на нее оказывала значительное влияние стимуляция АРЕХ1, а также некоторые аминокислотные замены, как полиморфные, так и фосфомиметические. В случае белков семейства Fpg значительный вклад в субстратную специфичность по отношению к поврежденным основаниям, по-видимому, вносят некоторые консервативные мотивы. В частности, присутствие N-концевой консенсусной последовательности Pro-Glu-Gly, малого незаряженного аминокислотного остатка в позиции 151 и остатка Arg в позиции 168, по-видимому, достаточно для сдвига субстратной специфичности от окисленных пуриновых к пиримидиновым основаниям.

От субстратной специфичности различных ДНК-гликозилаз в конечном итоге зависит их способность эффективно удалять из ДНК продукты ее повреждения при генотоксическом стрессе. Исследование разных факторов, обуславливающих эту специфичность, в конечном итоге важно для понимания механизмов функционирования защитно-репарационных систем живых организмов in vivo. В настоящей работе показана необходимость учитывать при исследованиях субстратной специфичности не только структуру ДНК-белковых комплексов, как это часто делается в последнее время, но и разнообразные дополнительные факторы, которые могут значительно модифицировать относительную скорость удаления поврежденных оснований ДНК-гликозилазами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сидоренко, Виктория Сергеевна, Новосибирск

1. Barnabas J., Schwartz R.M., Dayhoff M.O. (1982) Evolution of major metabolic innovations in the Precambrian. Orig. Life, 12, p. 81-91.

2. Burrows C.J., Muller J.G. (1998) Oxidative nucleobase modifications leading to strand scissioa Chem. Rev., 98, p. 1109-1151.

3. Василенко Н.Л., Невинский Г.А. (2003) Пути накопления и репарации остатков дезоксиуридина в ДНК клеток низших и высших организмов. Биохимия, 68, р. 165183.

4. Frederico L.A., Kunkel Т.A., Shaw B.R. (1990) A sensitive genetic assay for the detection of cytosine deamination: Determination of rate constants and the activation energy. Biochemistry, 29, p. 2532-2537.

5. Friedberg E.C., Walker G.C., Siede W., Wood R.D., Schultz R.A., Ellenberger Т., DNA Repair and Mutagenesis. 2006, Washington, D.C.: ASM Press. 1118 pp.

6. Туе B.-K., Chien J., Lehman I.R., Duncan B.K., Warner H.R. (1978) Uracil incorporation: A source of pulse-labeled DNA fragments in the replication of the Escherichia coli chromosome. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 75, p. 233-237.

7. Karran P., Lindahl T. (1980) Hypoxanthine in deoxyribonucleic acid: Generation by heat-induced hydrolysis of adenine residues and release in free form by a deoxyribonucleic acid glycosylase from calf thymus. Biochemistry, 19, p. 6005-6011.

8. Singer В., Kusmierek J.T. (1982) Chemical mutagenesis. Annu. Rev. Biochem., 51, p. 655-691.

9. Gros L., Ishchenko A.A., Saparbaev M. (2003) Enzymology of repair of etheno-adducts. Mutat. Res., 531, p. 219-229.

10. Lawley P.D., Brookes P. (1963) Further studies on the alkylation of nucleic acids and their constituent nucleotides. Biochem. J., 89, p. 127-138.

11. Rydberg В., Lindahl T. (1982) Nonenzymatic methylation of DNA by the intracellular methyl group donor S-adenosyl-L-methionine is a potentially mutagenic reaction. EMBO J., 1, p. 211-216.

12. Marnett L.J. (2000) Oxyradicals and DNA damage. Carcinogenesis, 21, p. 361-370.

13. Lindahl Т., Nyberg B. (1972) Rate of depurination of native deoxyribonucleic acid. Biochemistry, 11, p. 3610-3618.

14. Atamna H., Cheung I., Ames B.N. (2000) A method for detecting abasic sites in living cells: Age-dependent changes in base excision repair. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 97, p. 686-691.

15. Lindahl Т., Andersson A. (1972) Rate of chain breakage at apurinic sites in double-stranded deoxyribonucleic acid. Biochemistry, 11, p. 3618-3623.

16. Takeshita M., Chang C.-N., Johnson F., Will S., Grollman A.P. (1987) Oligodeoxynucleotides containing synthetic abasic sites: Model substrates for DNA polymerases and apurinic/apyrimidinic endonucleases. J. Biol. Chem., 262, p. 1017110179.

17. Ravanat J.-L., Douki Т., Cadet J. (2001) Direct and indirect effects of UV radiation on DNA and its components. J. Photochem. Photobiol., B63, p. 88-102.

18. Franklin W.A., Doetsch P.W., Haseltine W.A. (1985) Structural determination of the ultraviolet light-induced thymine-cytosine pyrimidine-pyrimidone (6-4) photoproduct. Nucleic Acids Res., 13, p. 5317-5325.

19. Purmal A.A., Kow Y.W., Wallace S.S. (1994) Major oxidative products of cytosine, 5-hydroxycytosine and 5-hydroxyuracil, exhibit sequence context-dependent mispairing in vitro. Nucleic Acids Res., 22, p. 72-78.

20. Vaisman A., Woodgate R. (2001) Unique misinsertion specificity of poll may decrease the mutagenic potential of deaminated cytosines. EMBOJ., 20, p. 6520-6529.

21. Steenken S. (1989) Purine bases, nucleosides and nucleotides: Aqueous solution redox chemistry and transformation of their radical cations and e- and OH adducts. Chem. Rev., 89, p. 503-520.

22. Culp S.J., Cho B.P., Kadlubar F.F., Evans F.E. (1989) Structural and conformational analyses of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine. Chem. Res. Toxicol., 2, p. 416-422.

23. Cadet J., Douki Т., Gasparutto D., Ravanat J.-L. (2003) Oxidative damage to DNA: Formation, measurement and biochemical features. Mutat. Res., 531, p. 5-23.

24. Olinski R., Gackowski D., Rozalski R., Foksinski M., Bialkowski K. (2003) Oxidative DNA damage in cancer patients: A cause or a consequence of the disease development? Mutat. Res., 531, p. 177-190.

25. Suzuki J., Inoue Y., Suzuki S. (1995) Changes in the urinary excretion level of 8-hydroxyguanine by exposure to reactive oxygen-generating substances. Free Radic. Biol. Med., 18, p. 431-436.

26. ESCODD (European Standards Committee on Oxidative DNA Damage), Gedik C.M., Collins A. (2005) Establishing the background level of base oxidation in human lymphocyte DNA: Results of an interlaboratory validation study. FASEB J., 19, p. 82-84.

27. Floyd R.A. (1990) Role of oxygen free radicals in carcinogenesis and brain ischemia. FASEB J., 4, p. 2587-2597.

28. Lu Т., Pan Y., Kao S.-Y., Li C„ Kohane I., Chan J., Yankner B.A. (2004) Gene regulation and DNA damage in the ageing human brain. Nature, 429, p. 883-891.

29. Boiteux S., Laval J. (1983) Imidazole open ring 7-methylguanine: An inhibitor of DNA synthesis. Biochem. Biophys. Res. Commun., 110, p. 552-558.

30. Patro J.N., Wiederholt C.J., Jiang Y.L., Delaney J.C., Essigmann J.M., Greenberg M.M. (2007) Studies on the replication of the ring opened formamidopyrimidine, FapydG in Escherichia coli. Biochemistry, 46, p. 10202-10212.

31. Asagoshi K., Terato H., Ohyama Y., Ide H. (2002) Effects of a guanine-derived formamidopyrimidine lesion on DNA replication: Translesion DNA synthesis, nucleotide insertion, and extension kinetics. J. Biol. Chem., 277, p. 14589-14597.

32. Evans J., Maccabee M., Hatahet Z., Courcelle J., Bockrath R., Ide H., Wallace S. (1993) Thymine ring saturation and fragmentation products: Lesion bypass, misinsertion and implications for mutagenesis. Mutat. Res., 299, p. 147-156.

33. Chen Y.-H., Bogenhagen D.F. (1993) Effects of DNA lesions on transcription elongation by T7 RNA polymerase. J. Biol. Chem., 268, p. 5849-5855.

34. Basu A.K., Essigmann J.M. (1988) Site-specifically modified oligodeoxynucleotides as probes for the structural and biological effects of DNA-damaging agents. Chem. Res. Toxicol., 1, p. 1-18.

35. Shibutani S., Takeshita M., Grollman A.P. (1991) Insertion of specific bases during DNA synthesis past the oxidation-damaged base 8-oxodG. Nature, 349, p. 431-434.

36. Grollman A.P., Moriya M. (1993) Mutagenesis by 8-oxoguanine: An enemy within. Trends Genet., 9, p. 246-249.

37. Wiederholt C.J., Greenberg M.M. (2002) Fapy-dG instructs Klenow excT to misincorporate deoxyadenosine. J. Am. Chem. Soc., 124, p. 7278-7279.

38. Ober M., Miiller H., Pieck C., Gierlich J., Carell T. (2005) Base pairing and replicative processing of the formamidopyrimidine-dG DNA lesion. J. Am. Chem. Soc., 127, p. 18143-18149.

39. Guschlbauer W., Duplaa A.-M., Guy A., Teoule R., Fazakerley G.V. (1991) Structure and in vitro replication of DNA templates containing 7,8-dihydro-8-oxoadenine. Nucleic Acids Res., 19, p. 1753-1758.

40. Delaney M.O., Wiederholt C.J., Greenberg M.M. (2002) Fapy-dA induces nucleotide misincorporation translesionally by a DNA polymerase. Angew. Chem. Int. Ed., 41, p. 771-773.

41. Kamiya H., Ueda Т., Ohgi Т., Matsukage A., Kasai H. (1995) Misincorporation of dAMP opposite 2-hydroxyadenine, an oxidative form of adenine. Nucleic Acids Res., 23, p. 761766.

42. Barone F., McCulloch S.D., Macpherson P., Maga G., Yamada M., Nohmi Т., Minoprio A., Mazzei F., Kunkel T.A., Karran P., Bignami M. (2007) Replication of 2-hydroxyadenine-containing DNA and recognition by human MutSa. DNA Repair, 6, p. 355-366.

43. Johnson R.E., Yu S.-L., Prakash S., Prakash L. (2003) Yeast DNA polymerase zeta (Q is essential for error-free replication past thymine glycol. Genes Dev., 17, p. 77-87.

44. Kusumoto R., Masutani C., Iwai S., Hanaoka F. (2002) Translesion synthesis by human DNA polymerase r\ across thymine glycol lesions. Biochemistry, 41, p. 6090-6099.

45. Kamiya H. (2003) Mutagenic potentials of damaged nucleic acids produced by reactive oxygen/nitrogen species: Approaches using synthetic oligonucleotides and nucleotides. Nucleic Acids Res., 31, p. 517-531.

46. Ohtsuka E., Matsuki S., Ikehara M., Takahashi Y., Matsubara K. (1985) An alternative approach to deoxyoligonucleotides as hybridization probes by insertion of deoxyinosine at ambiguous codon positions. J. Biol. Chem., 260, p. 2605-2608.

47. Hill-Perkins M., Jones M.D., Karran P. (1986) Site-specific mutagenesis in vivo by single methylated or deaminated purine bases. Mutat. Res., 162, p. 153-163.

48. Wuenschell G.E., O'Connor T.R., Termini J. (2003) Stability, miscoding potential, and repair of 2'-deoxyxanthosine in DNA: Implications for nitric oxide-induced mutagenesis. Biochemistry, 42, p. 3608-3616.

49. Ванюшин Б.Ф. (2005) Ферментативное метилирование ДНК в эпигенетическом контроле генетических функций клетки. Биохимия, 70, с. 488-499.

50. Pfeifer G.P. (2006) Mutagenesis at methylated CpG sequences. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 301, p. 259-281.

51. Shearman C.W., Loeb L.A. (1977) Depurination decreases fidelity of DNA synthesis in vitro. Nature, 270, p. 537-538.58