Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение, изучение и использование перспективных штаммов ассоциативных ризобактерий в РСО-Алания

ВАК РФ 03.02.14, Биологические ресурсы

Автореферат диссертации по теме "Выделение, изучение и использование перспективных штаммов ассоциативных ризобактерий в РСО-Алания"

На правах рукописи

Пухаев Андрей Робертович

ВЫДЕЛЕНИЕ, ИЗУЧЕНИЕ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПЕРСПЕКТИВНЫХ ШТАММОВ АССОЦИАТИВНЫХ РИЗОБАКТЕРИЙ В РСО-АЛАНИЯ

03.02.14 - биологические ресурсы

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Владикавказ - 2012

1 2 МІР Ш

005019898

Работа выполнена на кафедре агроэкологии и защиты растений ФГБОУ ВПО «Горский государственный аграрный университет».

Научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук, профессор

Фарниев Александр Тимофеевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Биттиров Анатолий Мурашевич

кандидат биологических наук, доцент Блиева Лариса Заурбековна

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Северо-Кавказская государственна

гуманитарно-технологическая академия»

Защита диссертации состоится «Об» мая 2012 г. в 13 ч. на заседании диссертаці онного совета Д 220.023.04 при ФГБОУ ВПО «Горский государственный аграрнь университет» по адресу: 362040, РСО-Алания, г. Владикавказ, ул. Кирова, 37, Го ский ГАУ, зал заседаний диссертационного совета. Тел./факс: (8672) 53-99-26; mail: ggaubiores@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Горский гос дарственный аграрный университет», с авторефератом на официальном сай www.gorskigau.ru

Текст объявления о защите диссертации и автореферат диссертации отправлены Минобрнауки РФ по адресам: vak2.ed.gov.ru и referat_vak@mon.gov.ru «Ок» anpej 2012 г.

г.

С.А. Гревцова

Автореферат диссертации разослан апреля 2012

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Изучение вопросов биоразнообразия, экологии ризосфер-ных бактерий, принципов взаимодействия с растениями-макросимбионтами и механизмов стимуляции роста растений является важной проблемой. Проведение таких исследований позволит создавать новые микробные препараты для разных природно-климатических условий с определенными свойствами, прогнозировать эффективность их применения, поможет более точно выявить роль бактериальных препаратов в повышении продуктивности агрофитоценозов.

Известно, что эффективность препаратов на основе ассоциативных ризобактерий значительно меняется в зависимости от почвенно-климатических условий места их применения. Поэтому следует ставить вопрос о перспективе «зонального подхода» в разработке биопрепаратов, который подразумевает при их создании использование в качестве основы эффективных аборигенных штаммов PGPR (от Plant Growth-Promoting Rhizobacteria - ризосферные бактерии, способствующие росту растений), изолированных в данной местности и адаптированных к природным условиям этой природной зоны.

Цель и задачи исследований. Целью исследований было выделение ассоциативных ризобактерий из ризосферы злаковых трав различных природных зон РСО-Алания, их изучение, отбор перспективных штаммов, создание на их основе микробных препаратов, адаптированных к различным агроклиматическим условиям, и определение эффективности их применения в растениеводстве.

В задачи исследований входило:

- сбор и выделение ассоциативных бактерий из ризосферы злаковых трав разных природных зон РСО-Алания;

- изучение и отбор перспективных штаммов ассоциативных ризобактерий;

- определение в лабораторных условиях ростстимулирующей, фунгистатиче-ской, фосфатмобилизующей, азотфиксирующей активности и других свойств воздействия PGPR на растения;

- идентификация и депонирование перспективных штаммов PGPR;

- создание микробных препаратов на основе отобранных штаммов;

- определение эффективности применения новых бактериальных препаратов в растениеводстве.

Научная новизна исследований состоит в том, что впервые в условиях вертикальной зональности из ризосферы диких злаков, произрастающих в разных природных зонах РСО-Алания, изолированы и отобраны перспективные штаммы PGPR, изучены их свойства, созданы на. их основе новые микробные препараты и определена эффективность их применения в растениеводстве.

Основные научные положения, выносимые на защиту:

1. Аборигенные штаммы ассоциативных ризобактерий.

2. Свойства новых перспективных штаммов PGPR.

3. Идентификация и депонирование штаммов PGPR.

4. Эффективность применения новых бактериальных препаратов в растениеводстве.

Практическая значимость исследований заключается в том, что созданные н вые микробные препараты - штамм 17-1, штамм 38-22, штамм 33-3, адаптированнь к природным условиям Северного Кавказа, улучшают рост и развитие, повыша болезнеустойчивость и продуктивность культурных растений: озимой пшеницы I 10-20%, зерновых бобовых культур на 15-20%, многолетних бобовых трав на 3 40%.

Представленная работа является составной частью плана научн исследовательских работ Горского государственного аграрного университета ( 01.2.00708210 и 01.2.00708213).

Реализация результатов исследований. Депонированные перспективнь штаммы PGPR и препараты на их основе испытываются в Географической се опытов Всероссийского НИИ сельскохозяйственной микробиологии (г. Санк Петербург), а также используются в научно-исследовательской работе аспирантов студентов ФГБОУ ВПО «Горский ГАУ» (г. Владикавказ).

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были дол жены и одобрены на:

- двух выставках: «Выставка достижений молодых ученых РСО-Алания», орг низованная Минмолодежи РСО-А и Советом молодых ученых и специалистов пр Главе РСО-А, г. Владикавказ, 30.03.2010 г.; «Межвузовская выставка работ молодь ученых РСО-А», организованная Партией «Единая Россия» и ФГБОУ «Горски ГАУ», г. Владикавказ, 16.07.2011 г.

- заседаниях кафедры агроэкологии и защиты растений ФГБОУ ВПО «Гора ГАУ», г. Владикавказ, 2003 - 2011 гг. и заседаниях лаборатории экологии ризосфе ных микроорганизмов ВНИИСХМ, г. Санкт-Петербург, 2003-2004 гг.;

- семи международных научных конференциях (Владикавказ, 2006-2008, 201 гг., Краснодар, 2009 г.) и одной всероссийской конференции (Владикавказ, 20011 г.

- ежегодных - Итоговых научно-практических конференциях в ФГБОУ ВП «Горский ГАУ», г. Владикавказ, 2008 - 2011 гг.

Результаты исследований подтверждены патентом РФ №2321252 «Способ би логической защиты растений», получено 2 решения о выдаче патента 2009140638/10 «Способ биологической защиты и повышения продуктивности оз! мой пшеницы» и № 2010150196/10 «Способ защиты озимых зерновых культур корневых гнилей и карликовой ржавчины».

По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе 4 в издани рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, получен 1 патент на изобретение.

• Объем и структура работы. Диссертация изложена на 191 странице компь терного набора и состоит из введения, 6 глав, выводов и предложений производств Работа иллюстрирована 36 таблицами, 17 рисунками. Список литературы включа 336 источников, в том числе 197 иностранных авторов.

Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам лаборатории эколог симбиотических и ассоциативных ризобактерий ВНИИСХМ: зав. лаб. к.б.н. А. Кожемякову, к.б.н. Т.А. Поповой и д.б.н. A.A. Белимову за методическую помощь предоставленную возможность проведения лабораторных исследований.

2. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность поиска и изучения ассоциативных ризо-сферных бактерий стимулирующих рост растений (PGPR) в разных природных условиях РСО-Алания, сформулированы научная новизна, практическая значимость и основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы приведены сведения о свойствах ризосферных бактерий, влиянии на них абиотических и биотических факторов внешней среды, механизмах взаимодействия с растением-макросимбионтом и фитопатогенньши микроорганизмами. Показаны возможность и особенности практического использования эффективных штаммов PGPR и эффективность применения биопрепаратов на их основе в растениеводстве.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследований были ризосферные бактерии, выделенные с корней дикорастущих злаков: пырея ползучего (Elytrigia repetís L.), полевицы (Agrostis sp.), ячменя заячьего (Hordeum leporiiim L.), костра (В rom us sp.), тимофеевки (Phleum sp.), ежи сборной (Dactylis glomerata L.).

Изоляцию ризобактериальных сообществ проводили в 2003-2005 гг. из ризопла-ны злаковых трав, собранных в фазе цветения-колошения в засушливой и умеренно засушливой подзонах равнинной зоны, в подзонах достаточного и повышенного увлажнения предгорной зоны, горно-лесном, субальпийском и альпийском поясах горной зоны РСО-Алания.

Накопительные культуры диазотрофных ризобактерий получали высевом гомо-гената отмытых корней в полужидкую модифицированную безазотную среду Добе-рейнер - DN (Barber et al., 1976). Выделение, очистку и поддержание чистых культур проводили на твердой среде ДАС (O.A. Берестецкий и др., 1985).

В качестве эталонных штаммов в различных тестах использовали промышленные штаммы ВНИИСХМ: Flavobacterium sp. L-30-II-1, Azospirillwn lipoferum 137, Pseudomonasputida Bm3, Alkaligenes xylosoxidans СтЗ и Pseudomonas sp. ПГ-5.

Ростстимулирующую активность изолятов изучали модифицированным методом точечного тестирования на твердой среде БиНИИ (Н.С. Егоров, 1983) с тест-объектом водорослью Chlorella vulgaris 157.

Фунгистатическую активность определяли методом лунок (Н.С. Егоров, 1983) на среде Чапека для микроскопических грибов (Й. Сэги, 1983).

Способность бактерий продуцировать биологически активные вещества и токсины определяли методом замачивания семян по H.A. Красильникову (1966).

Фосфатрастворяющую активность изучали на среде Пиковской (Johri et al, 1999) с 1,7% агара и добавлением 0,15% свежеосажденного ортофосфата кальция по методу Геттерсона в модификации Муромцева (Д.Г. Звягинцев, 1991).

Способность штаммов продуцировать индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) оценивали инкубированием стационарно в течение 6 суток в жидкой среде DAS с до-

бавлением 0,05% L-триптофана. Количество ИУК определяли колориметрически реактивом Сальковского (Patten, Glick, 2002).

Азотфиксирующую (нитрогеназнуго) активность определяли методом редукци ацетилена на газовом хроматографе во флаконах с полужидкой средой DN с яблоч ной кислотой и введением ацетилена 10% от газовой фазы.

АЦК-дезаминазную активность изучаемых ризобактерий определяли по их спо собности использовать АЦК в качестве единственного источника азота на агаризо ванной среде ДАС.

Устойчивость к тяжелым металлам (Cd и Со) определяли на твердой среде ДА с усиленным в 10 раз фосфатным буфером и содержащей 10 ¡лМ, 100 |лМ и 1000 р кадмия и кобальта.

Полевые опыты (2004-2006 гг.) с озимой пшеницей сорта У манка проводили АО «Ногир» на выщелоченных черноземах в соответствии с Методикой госсортоис пытания (1989) и Методикой исследований эффективности препаратов ризосферны диазотрофов (A.A. Завалин и др., 1998). Повторность опыта трехкратная, размеще ние вариантов рендомизированное. Общая площадь делянки - 66 м2, учетная - 50 м* Новые препараты нарабатывались по A.B. Хотяновичу (1991). Вегетирующие расте ния озимой пшеницы в фазе кущения-начала выхода в рубку опрыскивали водно суспензией препаратов из расчета 2 л/га и нормой расхода рабочей жидкости 40 л/га. Аналогично вносили азот в виде раствора карбамида из расчета 45 кг/га д.в.

Распространенность, развитие болезней озимой пшеницы и биологическую эф фективность биопрепаратов изучали по общепринятым методикам в фазу молочно восковой спелости пшеницы на флаговых листьях (К.В. Новожилов, 1985; А.Ф. Чен кин, 1994).

Статистическую обработку данных проводили в программе MS Excel по Б." Доспехову (1985).

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Выделение и скрининг эффективных штаммов PGPR

Из ризопланы диких злаков, собранных в разных природных зонах РСО-Алани на высотах от 110 до 3500 м н.у.м., было выделено 86 сообществ диазотрофных ас социативных ризосферных бактерий (АРБ). В процессе «рассева» из них было из лировано 316 культур (изолятов) бактерий.

На первом этапе работы из общего числа отбирали небольшое количество пе спективных изолятов АРБ, наиболее полно отвечающих предъявляемым требовани ям. С этой целью был проведен скрининг бактерий на основании их способност стимулировать рост одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris 157 и п давлять фитопатогенный гриб Fusarium graminearum - возбудитель фузариоза коло са.

По результатам скрининга из 316 изолятов АРБ для дальнейших исследовани было отобрано 30 изолятов, обладающих высокой ростстимулирующей и фунгист тической активностью, а также комплексом этих свойств.

3.1.1. Роетстимулирующая активность изолятов ризобактсрий

Согласно результатам данного эксперимента протестированные ризобактерии по способности стимулировать рост зеленой водоросли Chlorella vulgaris 157 (табл. 1) можно условно разделить на 2 группы:

1) Штаммы-стимуляторы. Большинство штаммов, а именно - 20, характеризовалось большими зонами стимуляции хлореллы от 8 до 16 мм.

Нередко вокруг колоний тестируемых бактерий проявлялись сразу 2-3 зоны стимуляции, что подтверждает предположение о том, что бактерии могут синтезировать сразу несколько видов ростовых веществ. Некоторые штаммы, такие как 11-15, 11-16, 11-91, 26-44, 31-31, 31-32 и 33-3 по способности стимулировать Chlorella vulgaris 157 (зоны от 12 мм) не уступали, а в некоторых случаях даже превосходили эталонные штаммы ВНИИСХМ Azospirillwn lipoferum 137 и Flavobacterium sp. L-30. Несколько меньшее влияние на рост хлореллы (зоны 8-11 мм) оказывали штаммы 11-14, 11-41, 11-42, 11-91, 11-92, 25-5, 32-31,36-6,38-21,38-22, 39-11 и 67-92 Штаммы 26-41, 26-42, 26-43, 31-33 и 32-32 оказывали на рост хлореллы слабое воздействие, зоны усиленного роста водоросли были в пределах 4-7 мм.

2) Штаммы-ингибиторы 11-12, 17-1 и 18-5 характеризовались широкими зонами ингибирования, вызванными продукцией антифунгальных метаболитов, высокие концентрации которых ингибировали хлореллу; штаммы 11-11, 26-436, 39-13, 67-91 образовывали меньшие зоны подавления, переходящие в зоны стимуляции, вызванные синтезом высоких концентраций ростстимулирующих веществ.

Таблица 1. Роетстимулирующая и фуншстатическая активность отобранных штаммов PGPR

п=4

Штамм Зона стимуляции, Chlorella vulgaris, мм Зона ингибирования Fusarium graminea-rum, мм Штамм Зона стимуляции, Chlorella vulgaris, MM Зона ингибирования Fusarium graminea-rum, мм

11-11 -2+3±1,14 4±0 26-44 +12±0 T

11-12 -19±0 6±0 31-31 +16±1,14 0

11-14 +8±0 0 31-32 +13±0 0

11-15 + 14±0 0 31-33 +6±0 0

11-16 +14±0 0 32-31 +8±0 T

11-41 + 11±0 0 32-32 +7±0 0

11-42 +9±0 0 33-3 +19±2,56 0

11-91 + 12±0 0 36-6 +10±0 T

11-92 +11±0 Т 38-21 +8±1,14 0

17-1 —16±1.14 10±1,14 38-22 + 10±0 0

18-5 -24±1,14 12±0 39-11 +9±0 0

25-5 +10±0 2±0 39-13 -3+6±0 3±0

26-41 +5±0 0 67-91 -3+12±0 1±0

26-42 +4±0 0 67-92 +10±0 T

26-43 +7±0 0 Azospirillum lipoferum 137 +12±0 8±0

26-436 -4+4±0 0 Flavobacterium sp. L-30 +14±1,14 6±0

Примечание: - - ингибирование роста хлореллы; + - стимуляция роста хлореллы; Т - толерантность к фузариуму; 0 - нулевая фуншстатическая активность к фузариуму

3.1.2. Антифунгалъная активность штаммов ризобактерий.

Из 30 протестированных бактерий только 7 штаммов проявили антагонизм в от ношении Fusarium graminearum. Максимальные зоны ингибирования роста гриба 10-12 мм отмечены у штаммов 17-1 и 18-5, что свидетельствует о высоком уровн антифунгальной активности. Штаммы 11-11, 11-12, 25-5, 39-13 и 67-91 проявил! слабое фунгистатическое действие. Их зоны подавления были в пределах 1-6 мм Еще 5 штаммов (11-92, 26-44, 32-31, 36-6, 67-92) не оказали какого-либо влияния н' рост фузариума, однако проявили толерантность по отношению к грибу - лунки н заросли мицелием.

На втором этапе исследований для отбора наиболее эффективных штаммов мь тестировали их по фунгистатической активности к спектру фитопатогенных грибов фосфатмобилизующей, азотфисирующей, АЦК-дезаминазной активности, способ ности положительно влиять на рост высших растений, и другим важным показате лям.

3.1.3. Фунгистатическая активность к спектру фитопатогенных грибов

У пяти наиболее активных штаммов (11-12, 17-1, 18-5, 25-5 и 39-1.3) изучал! фунгистатическую активность к фитопатогенным грибам (табл. 2).

Таблица 2. Фунгистатическая активность штаммов PGPR к спектру фитопатогенных грибов

п=

Зоны подавления роста патогена, мм

Штамм Fusarium graminearum Fusarium ох-ysporum Fusarium solani Sclerotinia 1 libozi 1 j Rhizoctonia I solani Alternaria consartiale Pénicillium sp. Macrosporium sn.

11-12 6±1,14 4±0 2±0 5±0 3±0 2±0 0 с

17-1 10±0 5±0 5±0 9±1,14 5±0 с T 0

18-5 12±0 4±0 3±0 10±0 7±0 11±1,14 0 с

25-5 2±0 1±0 2±0 3±0 2±0 1±0 2±0 2±0

39-13 3±0 1±0 5±0 2±0 T T 0 0

A. lipoferum 137 8±0 4±0 2±0 2±0 4±0 2±0 0 0

Flavobacte-rium sp. L-30 6±0 4±0 4±0 0 6±0 2±0 0 0

Примечание: т - толерантность к фитопатогену; с - стимуляция роста фитопатогена; 0 - нулевая фунгистатическая активность

Наибольшим спектром действия обладал штамм 25-5. Он подавлял рост всех видов патогенов, но характеризовался малыми зонами подавления их роста - от 1 д 3 мм. Несколько меньший спектр действия, но высокую антифунгальную актив ность с зонами 3-11 мм проявили штаммы 17-1 (по отношению к graminearum, охукчрогит, К яокті, 5. ІіЬогі, К^оіапі) и 18-5 (по отношению к Р. 2гатіпеатт, /•

oxysporum, F. solani, S. libozi, R.solani, A. consartiale), a также штамм 11-12 с меньшими зонами ингибирования 2-6 мм (по отношению к F. graminearum, F. oxysporum, F. solani, R.solani, A. consartiale). Штамм 39-13 незначительно подавлял рост 4 (по отношению к F. graminearum, F. oxysporum, F. solani, S. libozi) из 8 патогенов.

Наиболее сильно подавлялся рост F. graminearum штаммами 18-5 (12 мм), 17-1 (10 мм) и 11-12 (6 мм); F. oxysporum - штаммами 17-1 (5 мм), 18-5 и 11-12 (по 4 мм); F. solani - штаммами 17-1 и 39-13 (по 5 мм); Sclerotinia libozi - штаммами 18-5 (10 мм), 17-1 (9 мм) и 11-12 (5 мм); R. solani - штаммами 18-5 (7 мм) и 17-1 (5 мм). Против фитопатогенов Pénicillium sp, и Macrosporium sp. биоконтрольный активностью обладал только штамм 25-5 с зонами подавления 2 мм.

3.1.4. Синтез индолил-3-уксусной кислоты.

Изучаемые ризобактерии характеризовались довольно высоким уровнем продуцирования ИУК (до 194,99 мкг/мл). Так, 15 из 34 штаммов синтезировали большее количество ИУК, чем производственный штамм ВНИИСХМ Azospirillum lipoferum 137 (табл.3).

Таблица 3. Уровень продуцирования ИУК и нитрогеназная активность штаммов

PGI'R

п=5

Штамм Количество ИУК, мкг/мл Нитрогена-за, нМ Штамм Количество ИУК, мкг/мл Нитрогена-за, нМ

11-11 49,81±2,81 6,65±0,40 26-44 150,49±4,23 39,9±2,17

11-12 9,01±0,79 19,0±1,46 31-31 28,08±1,95 47,5±2,49

11-14 63,59±3,13 24,7±2,25 31-32 12,72±2,18 43,7±3,08

11-15 103,33±5,10 2,85±1,29 31-33 137,77±3,16 5,7±0,68

11-16 - 2,85±0,81 32-31 0 5,7±0,77

11-41 58,29±1,33 0 32-32 114,45±5,37 6,65±0,87

11-42 94,32±5,09 9,5±0,92 33-3 16,43±1,05 8,55±0,81

11-91 17,70±1,60 7,6±0,94 36-6 194,99±5,69 5,7±0,70

11-92 4,77±1,20 0 38-21 3,18±0,69 49,4±1,82

17-1 9,54±0,99 19,0±1,46 38-22 156,85±5,20 9,5±1,07

18-5 10,39±1,11 9,5±0,53 39-11 4,24±1,01 1,9±0,80

25-5 57,76±2,98 5,7±1,31 39-13 40,27±1,24 7,6±0,93

26-41 19,08±1,79 3,8±0,73 67-91 94,85±2,55 5,7±1,20

26-42 15,19±1,43 5,7±1,43 67-92 12,93±1,29 5,7±0,66

26-43 35,94±1,72 3,8±1,06 Azospirillum lipoferum 137 31,79±1,08 6,65±0,41

26-436 15,90±2,53 3,8±1,04 Flavobacte-rium sp. L-30 296,73±4,78 9,5±0,44

К активным продуцентам ИУК можно отнести штаммы 11-15, 11-42, 26-44, 3133, 32-32, 36-6, 38-22, 67-91, продуцирующие от 100 до 200 мкг/мл ИУК. Меньше синтезировали ИУК штаммы 11-11, 11-14, 11-41, 25-5, 26-43, 39-13 (36-64 мкг/мл), очень мало-штаммы 11-12, 11-91, 11-92, 17-1, 18-5,26-41,26-42, 26-436,31-31,31-

32, 33-3, 38-21, 39-11, 67-92. Штамм 32-31 не способен продуцировать ИУК. Однак ни один из изученных штаммов по этому показателю не превзошел эталон - Flavo bacterium sp. L-30.

3.1.5. Нитрогсназная (азотфиксирующая) и фосфатрастворяющая актив ность.

В проведенном опыте обнаружена невысокая активность нитрогеназы все. штаммов. Тем не менее, азотфиксирующая активность штаммов 38-21, 31-31, 31-3 26-44,11-14, 17-1, 11-12 доходила до 19,0-49,4 нМ редуцированного этилена в сутк и была в 2-5 раз выше, чем у производственных штаммов (6,5-9,5 нМ).

Было установлено, что на седьмые сутки инкубации наивысшей способность растворять ортофосфат кальция (зона растворения Са3(Р04 )2 > 6 мм) обладало штаммов: 11-12, 11-41, 17-1, 18-5, 32-32, 39-И, 67-91 и 67-92"(табл. 4). Максималь ными уровнями растворения были отмечены штаммы 11-41 (с зонами растворени фосфата 10,5 мм) и 18-5 (10 мм). Средней активностью (зона растворения 3-6 мм характеризовалось 15 штаммов (11-42, 11-92, 25-5, 26-41, 26-42, 26-43, 31-31,31-3 31-33, 32-31, 33-3, 38-21, 38-22, 39-11, 39-13), низкой (зона растворения < 3 мм) -штаммов (11-11, 11-14, 11-15, 26-436, 26-44) и нулевой активностью - 2 штамма (11 91 и 36-6). Такая ситуация наблюдалась уже на третьи сутки.

3.1.6. 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат (АЦК) дезаминазная активность и устойчивость к тяжелым металлам

Установлена высокая толерантность изучаемых штаммов наравне с устойчивы ми к кадмию референсными Pseudomonas putida ВтЗ и Alkaligenes xylozoxidans Cm (табл. 4).

Из 30 штаммов пятнадцать проявили устойчивость к высокой концентраци кадмия в среде (1000 микромоль). Это следующие штаммы: 11-11, 11-12, 11-14, 11 15, 11-41, 11-92, 17-1, 18-5,25-5,26-41,26-436, 26-44,39-13, 67-91 и 67-92. Наиболе чувствительными к кадмию оказались штаммы 26-43 и 32-32, рост которых на сре де, обогащенной ионами кадмия, не наблюдался, а также 11-42, 31-31, 31-32 и 33-3 характеризовавшиеся слабым ростом. К кобальту исследуемые бактерии оказалис более чувствительными, чем к кадмию. Так, если при низком содержании в сред ионов кобальта (ЮцМ) хороший рост показали 19 штаммов из 30, то к средним кон центрациям (100|дМ) был устойчив только штамм 11-41, а штаммы 11-12, 26-42, 26 436, 26-43ж, 26-44, 39-13 и 67-91 характеризовались слабым ростом. Наиболее ус тойчивыми к обоим тяжелым металлам оказались штаммы 11-41, 11-12, 26-41, 26 436,26-44,67-91,39-13.

Было установлено, что только 8 штаммов являются АЦКД-положительным! Это штаммы 11-12, 11-92, 17-1, 18-5, 26-436, 31-31, 38-21 и 39-2. Наличие АЦК дезаминазы у ризобактерий дает основание предполагать о возможности примене ния этих штаммов в качестве PGPR, повышающих устойчивость растений к стрес совым факторам окружающей среды и для биоремедиации загрязненных почв.

Следует отметить, что штаммы, обладающие АЦК-дезаминазой, кроме штаммо 31-31 и 39-11, наравне с референсными оказались высокоустойчивыми к ионам кад мия. К кобальту же все изучаемые бактерии были более чувствительными. Так, эта лонный штамм A. xylozoxidans СтЗ характеризовался слабым ростом, а P. putid ВтЗ - отсутствием роста даже при минимальной концентрации кобальта в среде

тогда как перспективные АЦКД-положительные штаммы 11-12, 11-92, 17-1, 18-5, были устойчивы, а штаммы 11-12 и 26-436 могли расти и при более высоком уровне ионов кобальта. Особого упоминания заслуживает АЦКД-отрицательный штамм 1141 самый устойчивый и к кадмию, и к кобальту.

Таблица 4. Устойчивость ризобактерий к тяжелым металлам (кадмию и кобальту)

п=5

Штамм Концентрация (цМ)

Сс1 Со

10 100 1000 10 100 1000

11-11 ++ ++ ++ ++ - -

11-12* ++ ++ ++ ++ + -

11-14 ++ ++ ++ ++ - -

11-15 ++ ++ ++ ++ - -

11-16 ++ ++ + + - -

11-41 ++ ++ ++ ++ ++ -

11-42 + - - ++ - -

11-91 ++ + - -н- - -

11-92* ++ ++ ++ ++ - -

17-1* ++ ++ ++ ++ - ■ -

18-5* ++ ++ ++ ++ - -

25-5 ++ ++ ++ ++ - -

26-41 -н- ++ ++ ++ + -

26-42 ++ + - + - -

26-43 - - - ++ - -

26-436* ++ -н- ++ ++ + -

26-44 ++ ++ -н- ++ + -

31-31* + - - - - -

31-32 + - - - - -

31-33 ++ - - + - -

32-31 ++ - - - - -

32-32 - - - + - -

33-3 + - - - - -

36-6 ++ ++ + ++ - -

38-21* ++ + + + - -

38-22 ++ - - ++ - -

39-11* -н- - - + - -

39-13 ++ ++ 1 + ++ + -

67-91 ++ ++ ++ ++ + -

67-92 ++. ++ ++ + - -

Р. ршШа ВтЗ* ++ -н- ++ - - -

А. ху1оюх1с1ап<; СтЗ * ++ ++ ++ + - -

Примечание: * наличие АКЦ-дезаминазы; ++ хороший рост; +- слабый рост;

- отсутствие роста

3.1.7. Идентификация и депонирование перспективных штаммов PGPR

По данным лабораторных тестов из 30 штаммов было отобрано несколько пер спективных. После оценки их эффективности в полевых опытах с озимой пшенице! и другими сельскохозяйственными культурами три высокоэффективных штамм было идентифицировано методом секвенирования 16S rRNA как Pseudomonas fluo rescens штамм 17-1; Sphingomonas spiritivorum штамм 38-22 и Xanthomonas sp штамм 33-3.

Эти штаммы были депонированы во Всероссийской государственной коллекци непатогенных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (CIAM) ГН Всероссийского НИИ сельскохозяйственной микробиологии (г. Санкт-Петербург под следующими регистрационными номерами:

«ВНИИСХМ 622Д» - Pseudomonas fluorescens штамм 17-1 - изолирован из ри зопланы ячменя заячьего, депонирован как ростстимулирующий, высокоэффектив ный при инокуляции семян и обработке вегетирующих растений зерновых культур а также обладающий высокой антифунгальной активностью по отношению к фито патогенным грибам;

«ВНИИСХМ 620Д» - Sphingomonas spiritivorum штамм 38-22 - изолирован и ризопланы ячменя заячьего, депонирован как ростстимулирующий, активно проду цирующий ИУК, высокоэффективный при инокуляции семян и обработке вегети рующих растений зерновых и кормовых культур;

«ВНИИСХМ 621Д» - Xanthomonas sp. штамм 33-3 - изолирован из ризопланы полевицы, депонирован как ростстимулирующий, высокоэффективный при иноку ляции семян и обработке вегетирующих растений зерновых культур.

3.1.8. Группировка выделенных штаммов ризобактернй

Нами проведены тесты по изучению влияния штаммов с различными свойствами на рост проростков и корней при инокуляции семян высших растений (кресс-салата, брюквы столовой и озимой пшеницы). Полученные данные свидетельствуют о различном воздействии разных штаммов на рост и развитие сельскохозяйственных культур.

Анализ данных по изучению качеств, присущих выделенных нами PGPR штаммов, позволяет разделить их по биохимической активности на 3 основные группы (табл. 6):

1. Бактерии-стимуляторы роста растений - штаммы-продуценты биологически активных веществ ростовой природы, стимулирующие рост хлореллы и способствующие удлинению проростков и корней растений не менее чем на 15% относительно контрольного варианта: 11-41,26-44, 32-32, 33-3, 36-6, 38-22.

2. Биоконтрольные агенты - штаммы-антагонисты, активно подавляющие один или несколько фитопатогенов, но при этом существенно не ингибирующие рост растений. Бактериальные штаммы 11-12, 17-1 и 18-5 обладают высокой антифунгальной активностью, широким спектром действия и в разведении 1:100 и 1:1000 мало влияют на рост растений.

3. Бактерии комплексного действия - штаммы комплексного действия с сочетанием средних уровней антифунгальной и ростстимулирующей активности. К таким штаммам относятся 25-5 и 39-13, которые стимулировали рост инокулированных растений от 20 до 50% относительно контроля и подавляли один или несколько фи-

-гепатогенных грибов, таких как F. gramimarum, F. oxysporum, F. solani, Sclerotinia libozi, R. solani, Pénicillium sp., Macrosporium sp.

Таблица 6. Реакция культурных растений на PGPR штаммы

п-15.,.20

Штамм Кресс-салат Брюква столовая Пшеница

ростстимулирующие штаммы

11-41 + + -

26-44 + - +

32-32 + + +

33-3 + - +

36-6 + +

38-22 + + +

биоконтрольные штаммы

11-12 + - +

17-1 + + +

18-5 + + -

штаммы комплексного действия

25-5 + + +

39-13 + + +

67-91 + - -

Примечание: + положительная реакция; - отрицательная реакция

Лабораторные тесты позволили оценить возможность применения этих штаммов на культурных растениях: кресс-салате, брюкве столовой и пшенице. Так, например, кресс-салат хорошо отзывался на бактеризацию всеми перечисленными штаммами, за исключением штамма 36-6. Брюква столовая и озимая пшеница тоже отзывчивы на инокуляцию штаммами РвРЯ, однако при выращивании брюквы, возможно, следует отказаться от применения штаммов 26-44, 33-3, 67-91 и 11-12, а при возделывании пшеницы - от 11-41, 18-5 и 67-91, так как рост этих растений в определенной степени угнетался бактериальными метаболитами. Кроме того, следует отметить, что штаммы 32-32, 38-22, 17-1,25-5 и 39-13 улучшали рост всех указанных культур.

3.2. Определение эффективности перспективных РвРЯ штаммов

3.2.1. Биологическая эффективность РСРЯ штаммов против болезней озимой пшеницы

В полевых опытах с озимой пшеницей самую высокую биологическую эффективность против мучнистой росы имели варианты с обработкой штаммом 17-1 (65,3%), 18-5 (54,6%); флавобактерином (54,2%) и ризоагрином (47,7%) (рис. 1). Меньшую биологическую эффективность показали штаммы 38-22 (35,5%), В-335 (34,7%) и штамм 26-44 (31,6%). На других вариантах, где применялись штаммы 366, 33-3, 39-13, 25-5 и 31-3, биологическая эффективность была значительно ниже. Здесь она в разные годы колебалась от 16,0 до 32,3%. Следует отметить и то, что вариант N45 имел отрицательные показатели биологической эффективности (-9,4%). По-видимому, внесение азотных удобрений (N45) стимулирует развитие мучнистой росы на посевах озимой пшеницы.

Рисунок I. Биологическая эффективность РвРЯ штаммов против болезней озимой пшеницы, в среднем за 2004-2006 гг.

Против септориоза на флаговых листьях самые высокие показатели биологической эффективности имели варианты с применением PGPR штаммов: 17-1, 18-5, флавобактерина и ризоагрина - 71,9%, 67,2%, 64,6% и 59,7% соответственно по сравнению с контрольным вариантом. Средний уровень биологической эффективности показали штаммы 38-22 (49,4%), 33-3 (48,4%) и 26-44 (41,3%). На вариантах с[ применением штаммов В-335, 36-6, 25-5, 39-13 и 31-3 биологическая эффективность была значительно ниже и составила 31,3, 31,1, 18,7,20,5 и 11,9% соответственно.

Внесение азотных удобрений (N45) также снижало устойчивость растений озимой пшеницы к септориозу, но значительно (в 2,3 раза) меньше, чем к мучнистой росе.

Наибольшая биологическая эффективность штаммов PGPR против возбудителей фузариоза колоса озимой пшеницы была на варианте с применением штамма 17-1-1 83,0%). Варианты с применением штаммов 18-5, флавобактерина, ризоагрина, 38-22 и 26-44 имели несколько меньшую биологическую эффективность, но все же значительно сдерживали развитие фузариоза колоса. Биологическая эффективность их со- I ставляла 71,8%, 67,8%, 55,2%, 54,8% и 45,3% соответственно. На вариантах с применением штаммов В-335, 31-3, 36-6, 39-13, 33-3 и 25-5 биологическая эффектов-f ность была на уровне 13,6 - 33,5%.

На развитие фитопатогенов существенное влияние оказывали климатические условия конкретного года исследований. Так, внесение азотных удобрений (N45) провоцировало развитие фузариоза колоса сильнее в холодном и с большим количеством осадков 2004 году, чем в относительно сухие и теплые 2005 - 2006 годы.

В заключение следует отметить, что биологическая эффективность, как результат взаимодействия всех трех звеньев простейшей биологической системы триотро-фа - РОРЯ-растение-фитопатоген, в значительной степени отражает степень воздействия ризосферных бактерий на растение и патоген, и наоборот. По результатам трехлетних исследований высокую фунгистатическую активность против мучнистой росы, септориоза и фузариоза колоса показали варианты с применением штаммов 17-1, 18-5, флавобактерина и ризоагрина. Несколько меньшую биологическую эффективность имели варианты с применением штаммов 38-22, 26-44 и В-335. Остальные ризобактерии имели низкую биологическую эффективность. Биоконтрольная активность изучаемых штаммов в разные по климатическим условиям годы характеризовалась различной эффективностью. Установлено также, что внесение азотных удобрений (вариант N45) провоцирует развитие септориоза и фузариоза колоса по сравнению с контрольным вариантом.

3.2.2. Влияние бактериальных препаратов на урожайность озимой пшеницы

Было установлено, что урожайность озимой пшеницы широко варьировала по годам исследований и по вариантам опыта. Так, в 2004 году она колебалась от 2,27 т/га в контроле до 3,03 т/га (НСР05 - 0,22) на варианте N45, в 2005 году от 3,71 до 4,79 т/га (НСРоз - 0,51) на тех же вариантах и в 2006 году от 2,76 до 3,47 т/га на 8 варианте (штамм 26-44) (НСР05 - 0,45) (табл. 7). Следовательно, наименьший урожай по всем вариантам опыта был получен в 2004 году, наибольший - в 2005 году. Это можно объяснить влиянием температуры и количеством выпавших осадков.

2004 год по количеству выпавших осадков был самым влажным, но температурные условия, сложившиеся осенью 2003 года и весной 2004 года были неблагоприятные. Отклонения температуры от многолетней нормы составили +2,2 - +3,3 С. Кроме того, в мае 2004 года выпало осадков всего 42,2% от многолетней нормы и острозасушливые условия в этот период отрицательно повлияли на урожайность озимой пшеницы по всем вариантам опыта. Несмотря на это, в 2004 году по всем вариантам опыта, кроме 8 (26-44), получены достоверные прибавки урожая. Наибольшими они были на вариантах 2 (N45), 8 (В-335) и 6 (17-1) - 0,76; 0,29 и 0,27 т/га соответственно, а наименьшими на вариантах 8 (26-44); 7 (18-5) и 9 (38-22) - 0,15; 0,22 и 0,24 т/га соответственно. Следует отметить, что 2 вариант (N45) по прибавке урожая превосходил все остальные варианты достоверно. Применение бактериальных препаратов дало прибавку урожая от 0,22 до 0,29 т/га, но по эффективности между собой эти препараты достоверно не различались.

В 2005 году по урожайности сложилась аналогичная 2004 году ситуация: по всем вариантам опыта она была значительно выше. В то же время по урожайности варианты 2 (N45) и 5 (В-335) сравнялись, прибавки составили 1,08 и 0,95 т/га (НСР05 -0,51), то есть разница между ними в пределах ошибки опыта. Внесение азотных удобрений (N45) по своей эффективности превосходил только 3 вариант (ризоагрин). Прибавки варианта 2 (N45) и вариантов с применением бактериальных удобрений

достоверно одинаковые.

По средним данным трех лет исследований наибольшую прибавку дало внесение азотных удобрений (N45) - 0,84 т/га, довольно высокие прибавки получены при применении бактериальных препаратов В-335, 38-22, 26-44, 18-5, 17-1 -0,65; 0,58; 0,59; 0,47 и 0,44 т/'га соответственно.

Таблица 7, Влияние бактериальных препаратов на урожайность озимой пшеницы

о\

Варианты 2004 г. 2005 г. 2006 г. Среднее

урожайность, т/га прибавка урожайность, т/га прибавка урожайность, т/га прибавка урожайность, т/га прибавка

т/га % т/га % т/га % т/га %

1. контроль 2,27 0 0 3,71 0 0 2,76 0 0 2,91 0 0

2. Ы45 3,03 0,76 33,5 4,79 1,08 29,1 3,44 0,68 24,6 3,75 0,84 28,9

3. ризоагрин 2,49 0,22 9,7 4,00 0,29 7,8 3,21 0,45 16,3 3,23 0,32 11,0

4. флавобактерин 2,53 0,26 11,5 - - - 3,18 0,42 15,2 2,86 0,34 13,5

5. В-335 2,56 0,29 12,8 4,66 0,95 25,6 3,45 0,69 25,0 3,56 0,65 22,3

6. 17-1 2,54 0,27 11,9 4,29 0,58 15,6 3,22 0,46 16,7 3,35 0,44 15,1

7. 18-5 2,49 0,22 9,7 4,42 0,71 19,1 3,23 0,47 17,0 3,38 0,47 16,2

8. 26-44 2,42 0,15 6,6 4,60 0,89 24,0 3,47 0,71 25,7 3,50 0,59 20,3

9. 38-22 2,51 0,24 10,6 4,64 0,93 25,1 3,33 0,57 20,7 3,49 0,58 19,9

10. 33-3 - - - - - - 3,26 0,50 18,1 3,26 0,50 18,1

11.36-6 - - - 4,44 0,73 19,7 3,14 0,38 13,8 3,79 0,55 17,0

12. 25-5 - - - 4,21 0,50 13,5 - - - 4,21 0,50 13,5

13.39-13 2,72 0,45 19,8 4,14 0,43 11,6 - - - 3,43 0,44 14,7

14. 31-3 2,33 0,06 2,6 - - - - - - 2,33 0,06

НСРоз =0,22 НСР05 =0,51 НСР05 =0,45

Следовательно, все применяемые бактериальные препараты по сравнению с контрольным вариантом были высокоэффективны при возделывании озимой пшеницы и незначительно уступали по эффективности варианту с внесением азотных удобрений (Ы45).

3.3. Использование новых микробных препаратов для повышения продуктивности бобовых культур

Горох. Предпосевная обработка семян и вегетирующих растений гороха микробными препаратами штаммов 17-1, 38-22, а также их смесью повысила устойчивость растений к болезням, при этом формировался более мощный симбиотический аппарат, количество фиксированного азота воздуха повышалось с 44 кг/га до 67,3 кг/га, что способствовало повышению урожайности гороха до 3,2 т/га. Прибавки урожая составили 0,17 - 0,38 т/га.

Соя. Обработка семян и вегетирующих растений сои микробными препаратами повышала их устойчивость к болезням и способствовала получению стабильных экологически чистых урожаев. При этом наиболее эффективной являлась обработка семян и вегетирующих растений штаммом 17-1 и смесью штаммов 17-1+38-22, что позволило получить прибавки урожая от 0,14 до 0,40 т/га.

Клевер. Микробные препараты при инокуляции семян клевера перед посевом и опрыскивании вегетирующих растений проявили различную эффективность на разных сортах. Наиболее отзывчивым на бактеризацию оказался сорт Владикавказский, прибавки зеленой массы на обработанных вариантах составили: 2,67-4,76 т/га или 2,58-4,60%.

Люпин. Инокуляция семян люпина перед посевом жидкими препаратами ризо-сферных бактерий оказывала определенное влияние на формирование симбиотиче-ского аппарата люпина. Так, инокуляция люпина сорта Деснянский штаммом 38-22 увеличивала количество клубеньков на одном растении в фазу цветения в 1,8 раза, штаммом 18-5 - в 1,5 раза, а штаммом 33-3 - в 1,2 раза. Биопрепараты оказали влияние и на величину массы клубеньков на одном растении. В фазу цветения на вариантах с применением штаммов 38-22, 18-5 и 33-3 - она увеличилась в 2,8, 1,8 и 1,3

раза, соответственно.

Козлятник восточный. Применение микробных препаратов при возделывании козлятника восточного повышает устойчивость растений к болезням. Так, препараты штаммов 38-22 и 17-1 при их совместном применении на фоне инокуляции значительно повышали устойчивость растений козлятника восточного к болезням -биологическая эффективность составляла 90% и более.

Кроме того, применение микробных препаратов 17-1 и 38-22 на фоне ризотор-фина для предпосевной обработки семян и вегетирующих растений обеспечило прибавку урожая зеленой массы от 6,6 до 18,1 т/га. Максимальная урожайность была получена при двукратной обработке смесью микробных препаратов 17-1 + 38-22 на фоне ризоторфина - 68,2 т/га, прибавка составила 36,1%.

3.4. Экономическая эффективность применения микробных препаратов при возделывании озимой пшеницы

При расчете экономической эффективности возделывания озимой пшеницы с применением микробных препаратов было установлено, что чистый доход от применения бактериальных препаратов колебался от 980 (ризоагрин) до 2250 руб./га

(штамм 38-22). Наибольшим он был при применении препаратов штамма 38-22 2250 руб./га и В-335 - 2090 руб./га, наименьшим - при применении ризоагрина - 98 руб. и флавобактерина 1100 руб./га. Чистый доход от применения азотных удобре ний составил 3376 руб./га.

Рентабельность применения азотных удобрений (N45) составила 203%, а приме нения новых микробных препаратов 17-1 и 18-5 - 201% и 200% соответственно.

Рентабельность варианта с применением азотных удобрений (N«) незначительн превышает рентабельность вариантов с применением новых микробных препарате 17-1, 18-5 и 38-22. Однако учитывая экологичность этих препаратов, считаем и, применение при возделывании озимой пшеницы более предпочтительным.

Кроме того, следует иметь в виду и тот факт, что при увеличении урожайного озимой пшеницы от внесения минеральных и бактериальных удобрений на 1 тонну 1 гектара, на столько же или больше увеличивается количество корневых и пожнив ных остатков, что по агрономической ценности соответствует дополнительном) внесению 4 т/га полуперепревшего навоза и способствует стабилизации, а в некото рых случаях и повышению плодородия почвы.

Выводы

1. Из ризосферы дикорастущих злаков, произрастающих в условиях вертикаль ной зональности Северного Кавказа, выделены и изучены 30 перспективных штам mobPGPR.

2. Выделенные штаммы обладают фитостимулирующей способностью и стиму лируют рост хлореллы (штаммы 11-15, 11-16, 11-91, 26-44, 31-31, 31-32 и 33-3), ози

' мой пшеницы (штаммы 11-41, 39-13, 11-12, 26-44, 32-32, 33-3 и 38-22), брюквы сто ловой (штаммы 11-41, 25-5, 39-13, 38-22, 36-6, 17-1 и 32-32), кресс-салата (штаммь 11-41, 39-13, 11-12, 26-44, 32-32 и 38-22).

3. Максимальную антифунгальную активность по отношению к фитопатогенным грибам проявляли штаммы 11-12, 17-1 и 18-5.

4. Наибольшее количество индолил-3-уксусной кислоты продуцировали штаммы 11-15, 11-42, 26-44, 31-33, 32-32, 36-6, 38-22, 67-91 - до 200 мкг/мл.

5. Наибольшей азотфиксирующей активностью характеризовались штаммы 17-1, 11-12,11-14, 26-44, 31-32, 31-31,38-21.

6. Высокую устойчивость к средним (lOOjxM) и высоким (ЮООцМ) концентрациям кадмия в среде проявило около половины изученных штаммов. К средним концентрациям кобальта (ЮОцМ) наиболее устойчив был штамм 11-41; штаммы 11-12, 36-42, 26-436, 26-43ж, 26-44, 39-13 и 67-91 характеризовались меньшей устойчивостью. К высоким концентрациям кобальта оказались чувствительны все изученные штаммы.

_ 7. Из отобранных и изученных 30 перспективных PGPR штаммов идентифицированы и депонированы во Всероссийской государственной коллекции непатогенных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (CIAM) ГНУ Всероссийского'НИИ сельскохозяйственной микробиологии (г. Санкт-Петербург) 3 штамма: Pseudomonas fluorescens 17-1 (обладает высокой супрессирующей активностью к .. фитопатогенным грибам), Sphingomonas sp. (Flavobacterium) 38-22 (стимулятор роста растений, продуцирует большое количество ИУК), Xanthomonas sp. 33-3 (стиму-

лятор роста растений, синтезирует неидентифицированные вещества с ростстиму-лирующей активностью и небольшое количество ИУК).

8. Применение новых микробных препаратов - штаммов 17-1, 18-5 и 38-22 снижало распространение и степень развития: мучнистой росы на 40,9 и 11,4%, 35,2 и 9,2%, 25,0 и 6,3% соответственно; септориоза - на 40,8 и 12,7%, 38,1 и 11,8%, 28,1 и 8,8% соответственно; фузариоза колоса - на 9,1 и 3,9%, 6,8 и 3,2%, 4,2 и 2,1% соответственно.

9. Применяемые бактериальные препараты были эффективны при возделывании озимой пшеницы и незначительно уступали по эффективности варианту с внесением азотных удобрений (N45).

10. Высокие прибавки урожая были получены при применении бактериальных препаратов 38-22, 18-5, 17-1 - 0,58 т/га или 19,9%; 0,47 т/га или 16,2% и 0,44 т/га

или 15,1% соответственно.

11. Применение бактериальных препаратов 17-1, 38-22 и их смесей повышало болезнеустойчивость, азотфиксирующую активность и продуктивность: гороха (прибавки урожая составили 0,17-0,38 т/га) сои (0,14-0,4 т/га) и клевера (2,58-4,76 т/га).

Предложения производству

1. На основе вновь выделенных перспективных штаммов РйРЛ рекомендуем для растениеводства производить бактериальные препараты, адаптированные к природным условиям Северного Кавказа.

2. Для повышения продуктивности озимой пшеницы, получения экологически чистого урожая 3,5 т/га следует в фазу кущения-выхода в трубку обрабатывать веге-тирующие растения бактериальными препаратами (штаммы 38-22,18-5 и 17-1) в дозе 2 л/га (400 л/га раствора).

3. Для повышения продуктивности бобовых культур и получения экологически чистых урожаев: гороха - 3,2 т/га и сои - 2,3 т/га следует семена перед посевом ино-кулировать смесью штаммов 17-1 и 38-22 дозой 300 мл на гектарную норму семян и опрыскивать вегетирующие растения в фазу начала бутонизации дозой 2 л/га (400 л/га раствора).

Список опубликованных работ по материалам диссертации Публикации в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ:

1. Пухаев А.Р. Эффективность новых штаммов ассоциативных ризобактерий на посевах озимой пшеницы. / А.Р. Пухаев, А.Т. Фарниев, А.П. Кожемяков // Земледелие. - 2009. -№ 8-С. 40-41.

2. Фарниев А .Т. Кормовая продуктивность сои при использовании микробных препаратов. / А.Т. Фарниев, М.А. Плиев, Х.П. Кокоев, А.Р. Пухаев // Кормопроизводство. - 2010. -№11-С. 6-9.

3. Шхаев А.Р. АЦК-дезаминазная активность РСРЙ. штаммов и их устойчивость к тяжелым металлам. / А.Р. Пухаев, А.Т. Фарниев, А.П. Кожемяков // Известия ФГОУ ВПО «ГТАУ». - 2011. - Часть 1. - Т. 48 - С. 65-68.

4. Фарниев А.Т., Пухаев А.Р. Биологическая эффективность РвРЯ штаммов против болезней озимой пшеницы. / А.Т. Фарниев, А.Р. Пухаев // Известия ФГОУ ВПО «ГГАУ». -2012. - Часть 1-2. - Т. 49 - С. 80-84.

Публикации в других изданиях:

5. Пухаев А.Р. Поиск и изучение перспективных ассоциативных ризобактерий из р ных природных зон РСО-А для инокуляции сельскохозяйственных культур. / А.Р. Пуха Т.А. Попова, А.Т. Фарниев, А.П. Кожемяков // В кн. «Герценовские чтения», факульт биологии РГПУ им. А.И. Герцена. - 2005. - С.-Пб., - С. 29-30.

6. Пухаев А.Р. Изучение эффективности почвоудобрительных биопрепаратов на осн ве производственных и экспериментальных штаммов ризосферных бактерий на посев озимой пшеницы в условиях лесостепи РСО-А. / А.Р. Пухаев, Т.А. Попова, А.Т. Фарни А.П. Кожемяков, М.Т. Березова // Материалы Международной научно-практической ко ференции «Актуальные вопросы применения удобрений в сельском хозяйстве». - 2006. Владикавказ. - С. 161-163.

7. Фарниев А.Т. Влияние биопрепаратов на рост, развитие и урожайность озимой пш ницы. / А.Т. Фарниев, J1.M. Базаева, А.Р. Пухаев // Материалы IV Международной коиф ренции «Актуальные и новые направления сельскохозяйственной науки». - 2008. - Влад кавказ. - С. 25-26.

8. Пухаев А.Р. Фосфатмобилизующие PGPR-штаммы как основа для создания биопр паратов. / А.Р. Пухаев, А.Т. Фарниев // Материалы IV Международной конференции «А туальные и новые направления сельскохозяйственной науки». - 2008. - Владикавказ. -145-146.

9. Пухаев А.Р. К теоретическим вопросам использования PGPR в практике сельско хозяйства / А.Р. Пухаев // Известия ФГОУ ВПО «ГГАУ». - 2008. часть 2 - том 45 - С 1 14.

10. Пухаев А.Р. Изучение фитостимулирующей активности ассоциативных PGP штаммов. / А.Р. Пухаев // Материалы Международной конференции «Молодые ученые А ропромышленному комплексу». - 2008. - Владикавказ. - С. 14-15.

11. Фарниев А.Т. Эффективность применения микробных биопрепаратов на пос вах сои. / А.Т. Фарниев, М.А. Плиев, Х.П. Кокоев, А.Р. Пухаев // Труды Всероссиской н учно-производственной конференции «Новые направления в решении проблем АПК основе современных ресурсосберегающих технологий». -2010. - Владикавказ. - С. 13-14.

12. Фарниев А.Т. Роль микробных препаратов в повышении продуктивности г роха. / А.Т. Фарниев, Х.П. Кокоев, А.Р. Пухаев //Материалы Международной научн технической конференции «Новые направления в решении проблем АПК на основе совр менных ресурсосберегающих инновационных технологий». - 2011. - Часть. 2. - Владика каз. - С. 68-70.

13. Сабанова A.A. Роль микробных препаратов в повышении плодородия почв продуктивности козлятника восточного. / A.A. Сабанова, А.Р. Пухаев, М.К. Салбиева Материалы VII Международной конференции молодых ученых «Актуальные и новые ш правления сельскохозяйственной науки». - 2011. - Владикавказ. - С. 166-168

14. Пухаев А.Р., Фарниев А.Т. Щедрина Д.И. Способ биологической защит картофеля. Патент РФ № 2321252. / Пухаев А.Р., Фарниев А.Т. Щедрина Д.И. // - 2008

Сдано в набор 03.04.12г., подписано в печать 04.04.12г. Гарнитура Тайме. Печать трафаретная. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ №219.

Типография ООО НГ1КП «МАВР», Лицензия Серия ПД№0И07, 362040, г. Владикавказ, ул. Августовских событий, 8, тел. 44-19-31

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пухаев, Андрей Робертович, Владикавказ

ел 12-3/1203

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ

ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ГОРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

ВЫДЕЛЕНИЕ, ИЗУЧЕНИЕ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПЕРСПЕКТИВНЫХ ШТАММОВ АССОЦИАТИВНЫХ РИЗОБАКТЕРИЙ

В РСО-АЛАНИЯ

На правах рукописи

Пухаев Андрей Робертович

Специальность 03.02.14. - биологические ресурсы

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.с.-х.н., профессор А.Т. Фарниев

Владикавказ - 2012

4.3. Влияние бактериальных препаратов на поражаемость озимой пшеницы фузариозом колоса......................................................95

4.4. Биологическая эффективность PGPR штаммов против болезней озимой пшеницы.....................................................................99

5. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ................106

5.1. Влияние бактериальных препаратов на рост и развитие озимой пшеницы..............................................................................106

5.2. Влияние бактериальных препаратов на структуру урожая и продуктивность озимой пшеницы.............................................116

5.3. Влияние бактериальных препаратов на урожайность озимой пшеницы..............................................................................122

6. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НОВЫХ МИКРОБНЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ КУЛЬТУР................................126

6.1. Влияние микробных препаратов на болезнеустойчивость и продуктивность зерновых бобовых культур.................................126

6.2. Влияние микробных препаратов на продуктивность многолетних бобовых трав........................................................................132

6.3. Влияние микробных препаратов на продуктивность озимой пшеницы..............................................................................138

6.4. Влияние микробных препаратов на формирование симбиотического аппарата вики озимой............................................................140

7. ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ МИКРОБНЫХ ПРЕПАРАТОВ ПРИ ВОЗДЕЛЫВАНИИ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ.............143

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.....................................................................148

ВЫВОДЫ............................................................................151

РЕКОМЕНДАЦИИ ПРОИЗВОДСТВУ........................................153

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ...............................154

ПРИЛОЖЕНИЯ.....................................................................155

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

ВВЕДЕНИЕ............................................................................4

1. АССОЦИАТИВНЫЕ РИЗОСФЕРНЫЕ БАКТЕРИИ И ИХ ВЛИЯНИЕ НА ПРОДУКТИВНОСТЬ РАСТЕНИЙ (обзор литературы)...........................10

1.1. Взаимодействие ризосферных микроорганизмов и растений........10

1.2. Ризосферные бактерии способствующие росту растений............12

1.3. Механизмы стимуляции роста растений штаммами РОРЯ............14

1.3.1. Механизмы прямой стимуляции роста растений....................16

1.3.2. Механизмы косвенной стимуляции роста растений..................24

1.4. Биопрепараты основе РОРЯ и перспективы их использования......33

2. УСЛОВИЯ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ.................................39

2.1. Природно-климатическая характеристика зон исследований....39

2.2. Материалы и методика исследований...................................53

2.2.1. Объекты исследований...................................................54

2.2.2. Полевые исследования...................................................58

3. ПОИСК, ВЫДЕЛЕНИЕ И СКРИНИНГ АССОЦИАТИВНЫХ РИЗОСФЕРНЫХ БАКТЕРИЙ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В РАСТЕНИЕВОДСТВЕ....................................................................60

3.1. Выделение и скрининг эффективных штаммов РОРЯ.................60

3.2. Идентификация и депонирование перспективных штаммов РОРЯ.77

3.3. Группировка выделенных штаммов ризобактерий.....................84

4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ ПРОТИВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ БОЛЕЗНЕЙ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ...........................86

4.1. Влияние бактериальных препаратов на поражаемость озимой пшеницы мучнистой росой.........................................................87

4.2. Влияние бактериальных препаратов на поражаемость озимой пшеницы септориозом............................................................91

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Современная экологическая обстановка диктует необходимость создания высокоэффективных агротехнологий оперативного воздействия на культурные растения с целью получения стабильно высоких урожаев качественной растительной продукции. В связи с этим разработка и применение экологически безопасных микробных препаратов с адаптоген-ными фитопротекторными свойствами является актуальной задачей для исследователей. В настоящее время все более широкое применение в сельском хозяйстве находят микробные препараты, выступающие в роли альтернативы минеральным удобрениям и химическим пестицидам. К таковым относятся препараты на основе штаммов PGPR (от Plant Growth-Promoting Rhizobacteria - ризосферные бактерии, способствующие росту растений), обладающие комплексом полезных свойств и благотворно влияющие на рост, развитие и продуктивность растений.

Изучение вопросов биоразнообразия, экологии ризосферных бактерий, принципов взаимодействия с растениями-макросимбионтами и механизмов стимуляции роста растений является важной проблемой. Проведение таких исследований позволит создавать новые микробные препараты для разных природно-климатических условий с определенными свойствами, прогнозировать эффективность их применения, поможет более точно выявить роль бактериальных препаратов в повышении продуктивности агрофитоценозов.

Рациональным агротехническим приемом при использовании разработанных новых препаратов является некорневая обработка посевов, так как при внесении в почву они частично могут закрепляться в составе органического вещества, включаться в органоминеральные комплексы и, как следствие, терять свою активность и доступность для растений.

Известно, что эффективность препаратов на основе ассоциативных ри-

зобактерий значительно меняется в зависимости от почвенно-климатических

условий места их применения. Поэтому следует ставить вопрос о перспекти-

4

ве «зонального подхода» в разработке биопрепаратов, который подразумевает при их создании использование в качестве основы эффективных аборигенных штаммов PGPR, изолированных в данной местности и адаптированных к природным условиям этой местности.

Цель и задачи исследований. Целью исследований было выделение ассоциативных ризобактерий из ризосферы злаковых трав различных природных зон РСО-Алания, их изучение, отбор перспективных штаммов, создание на их основе микробных препаратов и определение эффективности их применения в растениеводстве.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Сбор и выделение ассоциативных бактерий из ризосферы злаковых трав разных природных зон РСО-Алания.

2. Изучение и отбор перспективных штаммов ассоциативных ризобактерий.

3. Определение в лабораторных условиях ростстимулирующей, фунги-статической, фосфатмобилизующей, азотфиксирующей активности и других свойств воздействия PGPR на растения.

4. Идентификация и депонирование перспективных штаммов PGPR.

5. Создание микробных препаратов на основе отобранных штаммов PGPR.

6. Определение эффективности применения новых бактериальных препаратов в растениеводстве.

Научная новизна исследований состоит в том, что впервые в условиях вертикальной зональности из ризосферы диких злаков произрастающих в разных природных зонах РСО-Алания изолированы и отобраны перспективные штаммы PGPR, изучены их свойства, созданы на их основе новые микробные препараты и определена эффективность их применения в растениеводстве.

Основные научные положения, выносимые на защиту:

1. Аборигенные штаммы ассоциативных ризобактерий.

2. Свойства новых перспективных штаммов PGPR.

3. Идентификация и депонирование штаммов PGPR.

4. Эффективность применения новых бактериальных препаратов в растениеводстве.

Практическая значимость исследований заключается в том, что созданные новые микробные препараты - штамм 17-1, штамм 38-22, штамм 333, адапти-рованные к природным условиям Северного Кавказа, улучшают рост и развитие, повышают болезнеустойчивость и продуктивность культурных растений: озимой пшеницы на 10-20%, зерновых бобовых культур на 1520%, многолетних бобо-вых трав на 30-40%.

Представленная работа является составной частью плана научно-исследовательских работ Горского государственного аграрного университета (№ 01.2.00708210 и 01.2.00708213).

Реализация результатов исследований. Депонированные перспективные штаммы PGPR и препараты на их основе испытываются в Географической сети опытов Всероссийского НИИ сельскохозяйственной микробиологии (г. Санкт-Петербург), а также используются в научно-исследовательской работе аспирантов и студентов Горского ГАУ (г. Владикавказ).

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены и одобрены на:

- выставках:

1. «Выставка достижений молодых ученых PCO-А», организованной Минмолодежи РСО-А и Советом молодых ученых и специалистов при Главе РСО-А, г. Владикавказ, 30.03.2010 г.

2. «Межвузовская выставка работ молодых ученых РСО-А», организованная Партией «Единая Россия» и ФГБОУ «Горский ГАУ», г. Владикавказ, 16.07.2011 г.

- заседаниях кафедры агроэкологии и защиты растений ФГБОУ «Горский ГАУ», г. Владикавказ, 2003 - 2011 гг. и заседаниях лаборатории экологии ризосферных микроорганизмов ВНИИСХМ, г. Санкт-Петербург, 2003 -2004 гг.;

- международных и всероссийских конференциях: Международная научно-практическая конференция «Актуальные вопросы применения удобрений в сельском хозяйстве», Владикавказ, 2006 г.; IV и VII Международная кон-ференция молодых ученых, аспирантов и студентов «Актуальные и новые направления сельскохозяйственной науки», Владикавказ, 2008, 2011 г.; Международная конференция молодых ученых и аспирантов «Молодые ученые агропромышленному комплексу», Владикавказ, 2008 г.; Всероссийская научно-производственная конференция «Новые направления в решении проблем АПК на основе современных ресурсосберегающих технологий» Владикавказ, 2010 г.; Международная научно-производственная конференция «Новые направления в решении проблем АПК на основе современных ресурсосберегающих инновационных технологий», г. Владикавказ, 2011 г.;

- и на ежегодных Итоговых научных практических конференциях в ФГБОУ «Горский Государственный аграрный университет», г. Владикавказ, 2008-2011 гг.;

Результаты исследований подтверждены патентом РФ №2321252 «Способ биологической защиты растений», получено 2 решения о выдаче патента № 2009140638/10 «Способ биологической защиты и повышения продуктивности озимой пшеницы» и № 2010150196/10 «Способ защиты озимых зерновых культур от корневых гнилей и карликовой ржавчины».

По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе 4 в изданиях рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, получен 1 патент на изобретение.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 191 странице компьютерного набора и включает введение, обзор литературы, место, методику исследований, собственные исследования и обсуждение полученных результатов, заключение, выводы, предложения производству и библиографический список. Работа иллюстрирована 36 таблицами, 17 рисунками. Библиографический список включает 336 источников, в том числе 197 зарубежных авторов.

Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам лаборатории экологии симбиотических и ассоциативных ризобактерий ВНИИСХМ: зав. лаб. к.б.н. А.П. Кожемякову, к.б.н. Т.А. Поповой и д.б.н. A.A. Белимову за методическую помощь и предоставленную возможность проведения лабораторных исследований. Особую благодарность автор выражает своему руководителю д.с.-х.н., профессору А.Т. Фарниеву за внимание и помощь при работе над диссертацией.

1. АССОЦИАТИВНЫЕ РИЗОСФЕРИЫЕ БАКТЕРИИ И ИХ ВЛИЯНИЕ НА ПРОДУКТИВНОСТЬ РАСТЕНИЙ (обзор литературы)

1.1. Взаимодействие ризосферных микроорганизмов и растений

Почва представляет собой сложную экосистему со множеством экологических ниш, населенных огромным количеством микроорганизмов разных систематических и трофических групп, участвующих в биогеохимическом круговороте биогенных элементов и материи. От почвенных микробов напрямую зависит плодородие почвы, продуктивность и состояние произрастающих на ней растений (В.Б. Петров, В.К. Чеботарь, 2011а; Расе, 1997; Ваг-еа et al., 2004).

Определенно установлено, что два функциональных царства организмов - высшие растения и микроорганизмы тесно связаны между собой трофическими и информационными связями, и что высшие растения являются основным фактором, определяющим и активизирующим развитие и функционирование микробной системы почвы (О.Д. Сидоренко, 2001; Lynch, 1990).

Исследованиями многих ученых было обнаружено, что наиболее интенсивно взаимодействие почвенных микробов с растениями, а также между собой происходит в местах соприкосновения корня с почвой - специфической динамической среде - ризосфере, которая включает корневую систему растения с находящейся под ее влиянием прилегающей почвой (Hiltner, 1904; Lynch, 1990; Kennedy, 1998; Bowen, Rovira, 1999).

Так, например, корни одного растения пшеницы, пронизывающие значительный объем почвенных горизонтов, имеют суммарную длину около 71000 м и большую поверхность соприкосновения с почвой (Pavlychenko, 1937).

Ризосфера отличается от неризосферной почвы высокой численностью микробного населения, динамичностью и интенсивностью микробной актив-

ности. Впервые это явление было открыто Хилтнером в 1904 году и получило название «ризосферный эффект» (Hiltner, 1904; Kennedy, 1998).

Сложные взаимоотношения микроорганизмов прикорневой области с высшими растениями осуществляются, прежде всего, посредством их метаболитов (JI.B. Кравченко, Т.С. Азарова, 1976; JI.B. Кравченко и др., 2003; Hashidoko, 2005).

Определяющим фактором ризосферного эффекта являются корневые выделения (экссудаты) и корневой опад высших растений, которые стимулируют развитие популяций активной ризосферной микрофлоры вокруг корневой системы (Whipps, 1990; Werner, 1998; Toal et al., 2000; Morgan, Whipps, 2001).

Корневой опад и выделения за вегетацию в зависимости от вида растения достигают 20-60% от суммы углерода ассимилированного в процессе фотосинтеза и составляют 1,5-6,0 тонн углерода на 1 гектар. У пшеницы это значение может составлять 20-50% (Whipps, Lynch, 1983; Kuzyakov, Schneckenberger, 2004; Johnson et al., 2006)

Экссудаты, поступающие в почву в процессе онтогенеза растений, состоят из низкомолекулярных соединений: Сахаров, органических кислот и аминокислот, которые являются для ассоциированных с корнем гетеротрофных микробов легкодоступным для усвоения энергетическим, структурным и сигнальным материалом (JI.B. Кравченко, 1985; Lynch, Whipps, 1990; Bolton et al., 1992; Farrar et al., 2003).

В свою очередь, микроорганизмы при утилизации корневых выделений повышают экскреторную способность корней, синтезируют биологически активные вещества, такие как регуляторы роста растений, иммуноактивато-ры, аллелопатики и могут в той или иной степени влиять на рост растений и развитие фитопатогенов (JI.B. Кравченко и др. 2003, 2004; Merharg, Killham, 1995; Persello-Cartieaux et al., 2003). Все это в комплексе обеспечивает хорошее развитие растительно-микробных ассоциаций в динамичных условиях среды.

По данным научных исследований количественный и качественный состав экссудатов может существенно варьировать в зависимости от видовых и сортовых особенностей, физиологического состояния и стадии роста и развития растения, условий его выращивания, биотических и абиотических факторов почвы и окружающей среды (Grayston et al., 1996; Neumann, Romheld 2001). Следовательно, можно предположить, что ризосфера различных растений разных почвенно-климатических зон будет отличаться видовой и качественной ризобактериальной композицией.

Распределение микроорганизмов в ризосфере следует определенным закономерностям: микроорганизмы колонизируют только 4-10% корневой поверхности и сосредотачиваются микроколониально в местах экссудации непосредственно (Rovira et al., 1974). В таких богатых энергией экологических нишах наблюдается усиленный рост микроорганизмов, конкуренция и различные виды взаимодействий между микробами, а также с корнями растений-хозяев (Metting, 1992; Whipps, 2001).

1.2. Ризосферные бактерии, способствующие росту растений

Совокупность корневой системы растений с почвой представляет собой сложную экологическую нишу, заселенную множеством видов микроорганизмов с различными пищевыми потребностями и биохимическими свойствами (Lynch, 1990; Kennedy, 1998). Это, главным образом неспорообразу-ющие грамотрицательные бактерии, составляющие почти 99% бактериального населения ризосферы. Здесь доминируют представители родов Pseudomonas, Bacillus, Enterobacter, Corynebacterium, Serratia (Ю.М. Возняковская, 1969; Д.Г. Звягинцев, 1989).

Бактерии, активно колонизирующие корни растений и ризосферную почву, и адаптированные к специфическим условиям ризосферы, получили название «ризосферные бактерии» или «ризобактерии». В природе встречаются нейтральные, вредные и полезные ризобактерии. В конце 70-х гг. XX

12

столетия ризобактерий, оказывающих на растения положительный эффект, стали обозначать термином «PGPR» - от англ. Plant Growth-Promoting Rhizo-bacteria - ризосферные бактерии, способствующие росту (стимулирующие ро