Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов escherichia coli 0157 и их применение в диагностике

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов escherichia coli 0157 и их применение в диагностике"

На правах рукописи

Молофеева Надежда Ивановна

ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ОСНОВНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БАКТЕРИОФАГОВ ESCHERICHIA COLIO151 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В ДИАГНОСТИКЕ

03.00.07 микробиология 03.00.23 биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов - 2004

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Васильев Дмитрий Аркадьевич кандидат ветеринарных наук, доцент Золотухин Сергей Николаевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

профессор Игнатов Олег Владимирович доктор ветеринарных наук профессор Русалеев Владимир Сергеевич

Ведущая организация: Ульяновский государственный университет

Защита диссертации состоится ИН^^СсЛ- 2004 года в "// часов на

заседании диссертационного совета Д 220.061.04 в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И.Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И.Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335.

Ж

Автореферат разослан и/си>1- 2004,

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Л.В.Карпунина

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Escherichia coli являются распространенными возбудителями инфекционных заболеваний желудочно-кишечного тракта у животных и человека (Покровский и др., 1989; Cantey, 1993;Тугаринов, Пирожков, Малахов, 2001).

В последнее время в научной литературе появилось большое число сообщений о заболеваниях людей» протекающих в тяжелой форме, вызванных E.coli 0157, которые образуют шигаподобный вероцитотоксин (Riley, Remis, Helgerson,1985; Покровский и др., 1989; Ратинер, Бондаренко, 1998). Вспышки этой инфекции зарегистрированы во многих странах Северной и Южной Америки, Австралии, Европы, Азии, Африки и в нашей стране. Эшерихии серогруппы 0157 вызывают у молодняка животных диарею, геморрагический энтероколит и отечную болезнь у поросят (Тугаринов, Пирожков, Малахов, 2001). Так как основным резервуаром инфекции является крупный и мелкий рогатый скот, свиньи, реже лошади, олени, птица, то особенно опасны для людей пищевые продукты, полученные от этих животных (Armstrong, Hollingsworth, Morris, 1996; Easton, 1997), а также растительные продукты, выращенные на полях, куда мог вывозиться необеззараженный навоз от животных-носителей этой серогруппы эшерихии (Cielask et al., 1993). По данным J. Turtle et al. (1999) в ноябре 1992 года - феврале 1993 года наблюдалась вспышка (более 700 случаев) на Западе США, вызванная Rcoli O157:H7, связанная с гамбургерами, приготавливаемыми в ресторанах. Исследования показали, что для заражения человека достаточна инфицирующая доза, не превышающая 700 бактерий.

Эффективность профилактических мероприятий во многом зависит от своевременной диагностики болезни у сельскохозяйственных животных, поэтому совершенствованию методов лабораторной диагностики вышеуказанной инфекции уделяется большое внимание. Современные методы иммунодиагностики (ИФА), предлагаемые для индикации этих бактерий, хотя и являются высокоспецифичными и чувствительными, но сложность методик, высокая стоимость оборудования и реактивов делает их пока недоступными для большинства лабораторий. В лабораторной практике для индикации микроорганизмов в патологическом материале и объектах внешней среды, а также для их быстрого типирования, предложены бактериофаги (Гольдфарб, 1961; Ганюшкин, 1988; Русалиев, 1990; Кольпикова, Бакулов, Котляров, 1990, 1992). Методы фагодиагностики просты в постановке, специфичны, не требуют больших затрат времени, материалов и общедоступны.

Цель исследования. Разработка параметров и технологических приёмов по индикации и идентификации Ecoli 0157 с помощью реакции нарастания титра фага (РНФ).

Задачи исследования. В связи с этим при выполнении работы решались следующие

задачи:

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ | БИБЛИОТЕКА ( С. Петербург ¿-/ i I 9Э ЮОфжЭМ I

1.Выделить и селекционировать бактериофаги, активные в отношении штаммов Exoli

2.Изучить основные биологические свойства (морфология негативных колоний, литическая активность и ее. спектр, специфичность, температурная устойчивость, устойчивость к хлороформу) селекционированных изолятов.

3. Подобрать оптимальный набор выделенных фагов и сконструировать на их основе новый биопрепарат - диагностикум.

4. Разработать схему выделения и ускоренной идентификации бактерий Exoli 0157 с использованием выделенных фагов.

5. Разработать схему ускоренной индикации бактерий Exoli 0157 в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ и использованием созданного биопрепарата.

6. Разработать технологические параметры получения биопрепарата для фагодиагностики.

Научная новизна работы.

Впервые были выделены бактериофаги активные в отношении штаммов Е. coli 0157.

- Изучены основные биологические свойства выделенных фагов. Доказана

эффективность использования селекционированных бактериофагов для индикации и

идентификации Ecoli 0157.

- Разработаны технологические параметры по получению диагностического

биопрепарата фага и схема постановки РНФ.

Практическая значимость работы. Выделены и селекционированы специфичные бактериофаги, активные в отношении патогенных штаммов эшерихий серологической группы 0157. Два выделенных и изученных штамма депонированы в лаборатории бактериальных инфекций ВГНКИ, признаны перспективными и рекомендованы для изготовления диагностического и лечебно-профилактического препарата. Разработана «Временная инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии индикаторных бактериофагов Exoli 0157 Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА».

Для врачей бактериологов написаны «Методические рекомендации по ускоренной индикации методом реакции нарастания титра фага (РНФ) энтерогеморрагической кишечной палочки Exoli 0157 в патологическом материале, пищевых продуктах, кормах и объектах внешней среды» и «Методические рекомендации по выделению и фаготипированию энтерогеморрагической кишечной палочки. Ecoli 0157 из патологического материала, кормов, пищевых продуктов и объектов внешней среды с применением диагностических бактериофагов Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА», одобрены ученым советом и утверждены ректором академии 16.02.04 г.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1. Схема выделения бактериофагов Е. coli 015 7.

2. Биологические свойства выделенных бактериофагов E.coli 0157.

3. Сконструирована из отобранных фагов нового биопрепарата - диагностикума.

4. Разработка схемы выделения и ускоренной идентификации бактерий Ecoli 0157 с использованием выделенных фагов.

5. Разработка схемы ускоренной индикации бактерий Ecoli 0157 в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ и использованием созданного биопрепарата.

6. Разработка технологических параметров получения биопрепарата для фагодиагностики E. coli 0157.

Работа выполнена в соответствии с комплексным планом научной работы кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.

Апробация работы. Результаты основных исследований, подтверждены актом комиссионных испытаний в ВГНКИМ (от 30.05.02.) и УГСХА (от 27.01.03.). Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях УГСХА (2000, 2001, 2002), семинарах Ульяновского областного управления ветеринарии (2001), на международной научно - практической конференции (Воронеж, 2002).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 166 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы (229 источников, в том числе ПО отечественных). Работа иллюстрирована 25 таблицами, 8 рисунками, 1 схемой и дополнена приложениями.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Штаммы: В работе использованы как гомологичные - 6 штаммов E.coli серологической группы 0157, так и гетерологичные - 67 штаммов E.coli, в том числе 12 штаммов получены из лаборатории ООИ центра санэпиднадзора Ульяновской обл, 56 штаммов E.coli выделены нами из хозяйств Московской, Ульяновской и Самарской областей. Помимо этого, при определении специфичности бактериофагов использовались 71 штамм бактерий других родов: Proteus, Citrobacter, Morganella, Klebsiella, Salmonella, Staphylococcus, Pseudomonas, Bacillus, полученные из музея кафедры. Они обладали титгяпгыми для данных культур биологическими свойствами. Объектами исследования

явились фаги Rcoli 0157, выделенные нами из объектов внешней среды хозяйств Ульяновской и Самарской областей.

Питательные среды. Для бактериологического исследования использовали питетельные среды: мясо-пептонный бульон (МПБ) (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), мясо-пептонный агар (МПА) (НПО «Питательные среды», г. Махачкала); среды: Симонса (НИИ питательных сред, г. Махачкала), Эндо (ГНЦ прикладной микробиологии, г. Оболенск), сорбитол E.coli О157:Н7 агар (ГНЦ прикладной микробиологии, г. Оболенск), Клиглера (НИИ питательных сред, г. Махачкала), Гисса с индикатором Андраде (глюкоза, лактоза, сахароза, маннит, арабиноза, рамноза, дульцит, раффиноза, ксилоза, адонит, инозит, салицин) (НПО «Питательные среды» г. Махачкала), Fluorocult E.coli O157:H7 Agar (фирма Merck).

Набор эшерихиозных агглютинирующих серогрушювых 0-коли сывороток (Армавирская биофабрика).

Приборы и оборудование. Термостаты ТС-80М-2; микроскопы МБИ-3, электронный. микроскоп JEM-100B (Япония), микроскоп МИР-12т, лупа бинокулярная. МБС-9, ультратермостаты УТ-15У4,2; вакуумный насос Mezmolnice (Чехословакия), бактериальные фильтры L-3 свечи Шамберлана, центрифуги лабораторные ОПн-8УХЛ4,2 и ЦЛС-3; аппарат ультрафиолетового облучателя крови «Изольда» с ртутной лампой ДРБ8-1; холодильники бытовые, колбы мерные, пипетки пастеровские, пипетки мерные на 1,0; 2,0; 5,0; 10 см3, флаконы ёмкостью 50, 100 см3, стёкла покровные, стёкла предметные, чашки Петри, пробирки, стандарты мутности на 0,5 и 1,0 млрд. микробных клеток.

Методы. В работе использовались методы приведенные в «Методических указаниях по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных», утвержденные Департаментов ветеринарии МСХ и П РФ 27.07.00 и в «Методических указаниях по методам выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки Exoli О157:Н7», МУК 4.2.992-00 утвержденные Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 4.11.2000. Исследования фагов проводили общепринятыми методами: АДдамс (1961), Д.М.Гольдфарб (1961), PLM. Габрилович (1973), АЛЛономарева, О.Г.Андреевой и Т.НАртамоновой (2002).

Результаты исследований и их обсуждение Поиск и селекции бактериофагов

Для выполнения цели диссертационных исследований необходимо было первоначально выделить и изучить искомый бактериофаг, поэтому первым этапом нашей работы была попытка выделить бактериофаги E.coli 0157 из имеющихся у нас штаммов бактерий Kcoli 0157. Мы надеялись обнаружить лизогенные культуры, так как бактериофаги, выделенные из таких культур, обладают более выраженной специфичностью (Жугова, 1985).

Выделить бактериофаги из имеющихся у нас культур Exoli 0157 мы пробовали различными методами. Все изученные нами штаммы исследовались как индикаторные и как «лизогенные».

В первой серии опытов на культуры, исследуемые как «лизогенные», воздействовали индуцирующим фактором, затем фильтровали через бактериальные свечи Шамберлана L-3 (Ревенко, 1978). В качестве индуцирующего фактора применяли воздействие на бактерии ультрафиолетовыми лучами, в течение 30 секунд при помощи прибора «Изольда» с ртутной лампой ДРБ8, 18,0%, мощности которой приходится на область 254 нм. Полученный фильтраг исследовали па наличие фага на имеющихся культурах ELcoli 0157 методом агаровых слоев. По данным наших исследований, можно сделать вывод, что культуры Е coh 0157 штаммы РЛ. №904, №35150, №43895, №51659, XLI в опытах при воздействии па них ультрафиолетовыми лучами не проявили лизогенных свойств.

Во второй серии опытов использовали методику, предложенную СЛурия, Д. Дарнелл (1970), для выделения бактериофагов энтеробактерий из культур Ecoli 0157 без воздействия на них индуцирующего фактора. Проведя эти исследования нам не удалось выделить бактериофаги E.coli 0157 из имеющихся у нас штаммов бактерий E.coli 0157.

Резюмируя полученные данные, можно утверждать, что мы не обнаружили явления лизогении у имеющихся штаммов бактерий.

Мы решили перейти к методу выделения бактериофагов E.coli 0157 из объектов внешней среды (Адельсон, 1962). Для этого мы использовали сточные воды в свиноводческих хозяйствах и молочно-товарных фермах в различных хозяйствах Ульяновской и Самарской областей. При исследовании 26 образцов, удалось выявить из 4 образцов присутствие искомого фага по наличию на газоне индикаторной культуры E.coli 0157, негативных колоний. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1

Источники выделения бактериофагов Kcoli O157

№ Название фага Лизис бактерий Kcoli 0157 Из чего выделен Место и год выделения

1. Е-61 УГСХА РЛ, 43895,51659, XLI Сточные воды МТФ УЧХОЗ, 2000

2. Е-2 УГСХА РЛ, 43895,51659, XLI Сточные воды МТФ УЧХОЗ, 2000

3. Е-3 УГСХА 904,43895,51659, XLI Сточные воды СТФ УЧХОЗ, 2001

4. Е-4 УГСХА 904,43895,51659, XLI Сточные воды СТФ УЧХОЗ, 2001

5. Е-67 УГСХА РЛ, 904,35150, Сточные воды МТФ САМАРА,

43895, 51659, XLI 2001

Для получения чистой линии фага проводили до пяти пассажей из изолированных негативных колоний по методике, описанной Dvdbeio, Vogt (1954) и использованной-И.М.Габриловичем (1992), С.Н. Золотухиным (1994).

В результате проведённых опытов нами были выделены и изолированы методом прогревания 5 штаммов фагов Kcoli 0157 Е-61 УГСХА, Е-2 УГСХА, Е-3 УГСХА, Е-4 УГСХА, Е-67 УГСХА. Фаг Е-4 УГСХА при хранении при температуре 2-4°С в течение 3 месяцев потерял свою активность и в дальнейших исследованиях не использовали..

Характеристика фагов Kcoli 0157 Изучение биологических свойств фагов проводили по методам, предложенным А-С.Тихоненко (1968); Т.Г.Чинашвили-(1968); И.М.Габрилович (1973); D.Reanney Н.-WAckermann (1982). Исследовались следующие свойства фагов Exoli серологической группы 0157: а) морфология негативных колоний; б) литическая активность; в) спектр литической активности; г) специфичность действия; д) температурная устойчивость; е) устойчивость к хлороформу; ж) литический фермент, з) электронная микроскопия. а) Морфология негативных КОЛОНИЙ >

Морфология негативных колоний изучалась при посевах фагов методом агаровых сло5в по Грация на питательном агаре. Учёт производился через 18-20 часов инкубации при температуре 37°С. Негативные колонии, образуемые изученными бактериофагами, разделены нами: на три типа по классификации Тихоненко (1968). Колонии типа «а» образуют округлые негативные колонии с ровными краями, от 1,5 до 2,5 мм в диаметре. У двух бактериофагов (Е-61 УГСХА и Е-2 УГСХА) отмечались негативные колонии типа «а». Один бактериофаг (Е-3 УГСХА) образовывал крупные, полупрозрачные негативные колонии с ровными краями, центр с вторичным ростом индикаторной культуры, от 2,5 до 3,0 в диаметре - тип «в». Тип «с» образовывал один бактериофаг (Е-67 УГСХА), прозрачные негативные колонии, округлые с ровными краями, от 0,5 до 1,0 мм в диаметре.

б) Литическая активность бактериофагов E.coli 0157

Литическую активность селекционированных бактериофагов проводили по методу Аппельмана и Грация (Д.М.Гольдфарб, 1961). Определение активности фага Е-61 УГСХА по методу Аппельмана составила 10-7, фага Е-2 УГСХА составила 10-5, фага Е-3 УГСХА составила 10-7, фага Е-67 УГСХА составила 10"7. Результаты изучения литической активности выделенных фагов по Грация представлены в таблице 2 и титр составлял от 1,0х109 до 3,2x10" фаговых корпускул в 1 мл.

Таблица 2

Литическая активность бактериофагов KcoU O1S7 по Грация

№ Фаги Титр

1. Е-61 УГСХА 3,2x10*

2. Е-2 УГСХА 1,0 хЮ9

3. Е-3 УГСХА 2,0x10'

4. Е-67 УГСХА 1,5x10®

в) Спектр литической активности бактериофагов E.coli 0157 Спектр литической активности является характерной особенностью фага, и им пользуются для его идентификации (М .Адаме, 1961). Для изучения спектра литической активности четырех селекционированных фагов (Е-61 УГСХА, Е-2 УГСХА, Е-3 УГСХА, Е-67 УГСХА) мы использовали 6 референс штаммов Ecoli 0157 (шт. РЛ, №904, №35150, №43895, №51659 и ХЫ) и проводили его методом нанесения фага на газон бактериальной культуры (Ганюшкин, 1988). Результаты опыта представлены в таблице 3.

Таблица 3

Спектр литической активности эшерихиозных фагов по отношению к штаммам бактерий E.coli O157.

№ Фаги Кол-во испытал, штаммов Из них чувствит. к фагу Лизируемые. штаммы % лизируемых штаммов

1 Е-61 УГСХА 6 4 РЛ.43895,516 66,6

59Д1Л

2. Е-2 УГСХА 6 4 РЛ,43895.516 66,6

59ДЫ

3. Е-3 УГСХА 6 4 904,43895,516 66,6

59.Х1Л

4. Е-67 УГСХА 6 6 РЛ.904, 100

35150.43895

51659, ХЫ

Исследования показали, что наиболее широким спектром литической активности по отношению к изучаемым культурам обладает штамм фага Е-67 УГСХА, который лидировал все имеющиеся у нас штаммы Exoli 0157, что составляет 100%. г) Специфичность действия бактериофагов E.coli O157

Эта способность, фагов определяется прежде всего сродством < их к фаговым рецепторам лизируемых бактерий и используется в практике для дифференциации бактерий. Изучение специфичности четырех бактериофагов Exoli 0157 (Е-61 УГСХА» Е-2 УГСХА, Е-3 УГСХА, Е-67 УГСХА) проводили по отношению к представителям полевых штаммов Exoli -67 штаммов, Proteus -36 штаммов, Citrobacter -12 штаммов, Morganella -6 штаммов, Klebssiella -4 штамма, Salmonella -6 штаммов, Staphylococcus. -3 штамма, Pseudomonas aweginisa -2 штамма, Bacillus cereus -2 штамма. Установлено, что фаги не лизировали ни одну из испытуемых бактерий Exoli других серогрупп и неактивны к представителям бактерий других видов, поэтому можно сделать вывод о том, что селекционированные фаги являются специфичными по отношению к Exoli 0157.

д) Температурная устойчивость бактериофагов Kcoli 0157

Степень устойчивости бактериофагов к инактивирующим температурным факторам, имеет таксономическое значение. Исследования по изучению термочувствительности селекционированных бактериофагов были проведены по методикам, предложенным МАдамс (1961); Д.М. Гольдфарб (1961); И.М.Габрилович (1973). Результаты исследования представлены в таблице 4.

Таблица 4

Температурная устойчивость бактериофагов E.coli Q157_

Температура, °С ФАГИ

Е-61 УГСХА Е-2 УГСХА Е-3 УГСХА Е-67 УГСХА

60-63 1,2x10s 3,7x10" 2,3x10" 3x10"

64-66 3,2x10" 4,5x10" 1,2x10" 1,8x10"

67-70 2,5x10" 3,1x10" 2,4x10" 1,8x10"

71-73 1,4x10" 1,3x10* 2,3x10" 1,4x10"

74-76 6,2x10s 3,1x10" 2,6x10" 1,0x10"

77-80 5,3x10" 1,7x10" 2,6x10s 3x10"

81-83 1,5x10" 1,2x10" 3,4x10" 4,1x10"

84-«5 3,1x10* 1x10' 8x10' 2,5x10'

86-88 4±1,2 - 1±0,1 1,5x10'

88-90 - - - -

Контроль фага 4x10" 5x10" 1x10" 1x10"

Контроль культуры Рост бактерий Рост бактерий Рост бактерий Рост бактерий

Полученные данные свидетельствуют о выраженной устойчивости фагов к воздействию температуры в 80° С.

е) Устойчивость выделенных бактериофагов к воздействию хлороформа

Обычно бактериофаги устойчивее к хлороформу, чем клетки микроорганизмов, поэтому данный химический агент является хорошим средством для освобождения фаголиз.ата от жизнеспособных бактерий. Определение чувствигельности бактериофагов и бактерий' проводили путемЛ обработки фаговой суспензии и бульонной культуры эшерихий хлороформом в соотношении 1:10 при постоянном встряхивании. Обработка бактерий E.coli 0157 индикаторных штаммов РЛ, №904, №51659 в течение 17 минут хлороформом приводила к их полной инактивации. Бактериофаги проявили выраженную устойчивость к воздействию хлороформа. При его воздействии на фаголизаты в течение 40 минут существенного уменьшения активных фаговых корпускул в 1 мл не наблюдалось.

ж) Изучение наличия литического фермента

Литические ферменты бактериофагов играют существенную роль в процессе фаговой инфекции; Литический фермент проявляется на плотной питательной среде вокруг негативных колоний, обработанных хлороформом. Отмечено, что характер ореолов имеет таксономическое значение для ряда бактериофагов (Габрилович, 1973; Жугова, 1985; Васильев, Померанцев, 2001). Определение свободного литического фермента определяли по методике описанной Д.М. Гольдфарбом и ВАЗуевым (1963). По показателям образования литического фермента бактериофаги E.coli 0157 мы распределили в 2 группы. В 1 - отнесли фаг Е-61 УГСХА и Е-2 УГСХА, по характеру проявления свободного литического фермента они одаотшшы и образуют вокруг негативных колоний ореолы крупных размеров от 5 до 7 мм, а фаг Е-3 УГСХА и Е-67 УГСХА образуют ореолы мелких размеров от 2,6 до 3,3 мм. з) Электронная микроскопия

Для электронно-микроскопических исследований в качестве исследуемого материала использовали лизаты бульонных культур К coli 0157 с бактериофагами Е-61 УГСХА, Е-2 УГСХА, Е-3 УГСХА, Е-67 УГСХА.

Электронно-микроскопические исследования проводили по методике, предложенной АЛЛономаревым, О.ГАндреевой и Т.Н.Артамоновой (2002). Методика отработана для работы с вирусами животных и успешно применяется при подготовке препаратов для электронной микроскопии. В результате проведенных исследований было установлено, что вирионы фага имеют структуры, состоящие из головки в форме растянутого многогранника с отростком. У основной массы вирионов чехол находится в растянутом состоянии, что характерно для интактных частиц. Чехол отростка на всем протяжении прямой и имеет цилиндрическую форму. Концевая структура отростка ограничивается базальной мембраной, от которой отходят короткие нити. Единичные вирионы имеют отросток в сокращенном состоянии, то есть чехол отростка укорачивается и

расширяется. При этом просматривается внутренний стержень отростка. Вирусные частицы имеют следующие размеры: диаметр головки: 68 нм, высота -106 нм и длина отростка - 135 нм. Отношение высоты головки к ее диаметру равно 1,55, что позволяет заключить о растянутости многогранника частиц данного фага (рис.1).

Рис.1. Электронная микроскопия. Морфология бактериофага Е-67 УГСХА х 102000

Таким образом, в соответствии с морфологическими параметрами изучаемые фаги согласно Международной классификации и номенклатуре вирусов относятся к семейству Myoviride (FA. Murphy и др., 1995), а по классификации А.С.Тихоненко - к V морфологической группе: «Фаги с отростком сложного строения, чехол которого способен к сокращению» (Тихоненко,1968).

Разработка схемы ускоренной идентификации бактерий Kcoli O157 с использованием бактериофагов

Используя строгую специфичность селекционированных нами бактериофагов по отношению к патогенным штаммам Kcoli 0157 мы разработали схему выделения и ускоренной идентификации этих микроорганизмов и сравнили ее со схемой бактериологического исследования патологического материала, изложенной в действующих «Методических указаниях по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных», утвержденные Департаментом ветеринарии МСХ и П РФ 27.07.00. Результаты исследований представлены на схеме 1.

Схема 1. Выделение и ускоренная идентификация Е coh 0157 с помощью селекционированных нами бактериофагов (I) в сравнении со схемой бактериологического исследования, изложенной в "Методических указаниях по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных (П)

]

II

Итого-120 часов (5 суток)

Результат исследований считали положительным, если на месте нанесения одного или трех штаммов фагов на газоне сплошного роста культуры образовывалась прозрачная зона лизиса с вторичным ростом фагорезистентных микроорганизмов или без него, а также рост негативных колоний фага. Отрицательным считали результат при отсутствии лизиса на газоне роста исследуемой культуры микроорганизмов и отсутствии лизиса в контроле. При положительном результате культуру относили к виду ЕхоН 0157. В результате проведенных исследований из всех 12 проб фекалий были выделены исходные культуры эшерихий, принадлежащих к серогруппе 0157, о чем свидетельствовали результаты изучения их ферментативных и антигенных свойств.

Предлагаемая нами схема позволяет выделить и идентифицировать ЕхоН 0157 за 48 часов (2 суток), тогда как срок бактериологического исследования по схеме изложенной в «Методических указаниях по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных» составил 120 часов (5 суток) при большей затрате посуды и реактивов.

Разработка оптимальных условий постановки РИФ ' При разработке оптимальных условий постановки РНФ необходимо прежде всего: а) иметь биопрепарат из штаммов бактериофагов, обладающих строгой специфичностью и наибольшим спектром литической активности; в) определить количественный показатель реакции, имеющий диагностическое значение; с) определить оптимальное время, обеспечивающее полноценное взаимодействие фага с бактериями. Нами было установлено, что спектр активности бактериофагов Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА равен 100%, они обладают высокой литической активностью по Аппельману 10"7 и по Грациа от 1,5х109 до 3,2хЮ9, а также высокой температурной устойчивостью до 80° С и проявили 100 % устойчивость к воздействию хлороформа в течение 40 минут.

Определение количественного показателя реакции, имеющего диагностическое значепие Для определения параметров постановки РНФ и разработки количественного показателя реакции, имеющего диагностическое значение, проводили по методу, предложенному ВДТимаковым и Д.М.Гольдфарбом (1962). Проведены эксперименты с использованием МПБ контаминировашюго 18 часовыми референс культурами Е.соИ 0157 штаммом РЛ (для фага Е-61 УГСХА) и штаммом №51659 (для фага Е-67 УГСХА) от 101 до 105 м.кУмл. В качестве контроля использован интактный МПБ.

Учет результатов проводили через 12-16 часов инкубирования. С этой целью подсчитывали число негативных колоний фага, выросших на плотной питательной среде в

опытной пробе и в контроле (контроль титра фага). Оценку РНФ проводили согласно таблицы 5. В случае наличия в исследуемом материале свободного фага число корпускул фага на чашке подсчитывали и вычитали из числа корпускул индикаторного фага в опытных чашках. Разницу сравнивали с контролем. При высоком титре свободного фага (сплошной лизис индикаторной культуры) реакция не учитывалась. РНФ, оцененная как сомнительная, не имела диагностического значения.

Таблица 5

Показатели увеличения титра фата в РНФ.

Увеличение количества частиц бактериофага в опытной пробе по отношению к его контролю - Оценка результатов

Увеличение до 2,5 раз Увеличение до 5 раз Увеличение в 5 и более раз Отрицательная. Сомнительная Положительная

По результатам проведенных опытов установлено, что количество фаговых частиц более чем в 5 раз превышает количество фаговых частиц в контрольных пробах при контаминации МПБ Kcoli 0157 в концентрации 103 м.к/мл.

Установление оптимального времени, обеспечивающего наиболее полноценное взаимодействие фага с бактериями

Для решения указанной задачи необходимо было провести эксперименты на тест-объекте по выявлению наиболее эффективного временного показателя взаимодействия фага и индикаторной культуры при сохранении остальных параметров (температурный режим, концентрация бактериальной культуры и фаговых корпускул в 1 мл) постановки РНФ. В качестве тест-объекта использовали МПБ, контаминированный Rcoli 0157, оптимальное время экспозиции выбирали из шести следующих параметров:

- в предварительном подращивании исследуемого материала в течение 5,16, 24 часов при температуре 37° С, после добавления фагов смесь выдерживали в течение 5 часов при температуре 37°С;

- в увеличении времени контакта исследуемого материала с фагом до 10,16 и 24 часов при температуре 37 С.

Дня изучения чувствительности РНФ в зависимости от времени подращивания МПБ, контаминировали E.coli 0157 в концентрации от 101 до 1х105 млс/мл и инкубировали в термостате при температуре 37° С в течение 5, 16, 24 часов. Результаты исследования представлены в таблице 6.

Таблица 6

Чуствительность РИФ в зависимости от времени подращивания исследуемого материала, контаминированного бактериями КеоИ O157

Варианты исследований Минимальное количество эшерихий, обнаруживаемое с помощью Время, затраченное на проведение исследований (в часах)

Фаги № п Длительность подращивания исследуемого материала РНФ бак. метод РНФ бак. метод

часы МПБ МПБ МПБ МПБ

Е-61 1 5 10' 10« 22 96

УГС 2 16 10* н.о 32 н.о

ХА 3 24 КГ* н.0 40 • н.о

У-67 1 5 10* 104 22 96

УГС 2 16 102 н.о 32 н.о

ХА 3 24 10* н.о 40 н.о

Установлено, что при подращивании материала в-течение 5-ти часов позволяет обнаружить эшерихии с помощью РНФ в концентрации 103 м.к./мл. При подращивании исследуемого материала в течение 16 часов чувствительность реакции повышается и позволяет обнаружить бактерии в количестве 102 м.к/мл. На проведение исследования затрачивается 32 часа. Бактериологическим методом это же количество эшерихии обнаружить не удавалось. При подращивании исследуемого материала в течение 24 часов чувствительность- реакции не увеличивается, также позволяет обнаружить бактерии в количестве 102 м.к/мл. На проведение этого варианта реакции необходимо 40 часов.

Во втором варианте опыта МПБ, контаминированный Е.еоИ 0157 штаммами РЛ и №51659 от 101 до 1х105 м.кУмл не подращивали, а увеличивали время контакта материла с фагом до 10,16,24 часов. Результаты представлены в таблице 7.

Таблица 7

Чуствительность РИФ в зависимости от времени инкубирования _исследуемого материала с фагами_

Варианты исследований > Минимальное количество эшерихий, обнаруживаемое с помощью Время, затраченное на проведение исследований (в часах)

Фаги № п Длительность подращивания исследуемого материала РНФ бак. метод РНФ. бак. метод

часы МПБ МПБ МПБ МПБ

Е-61 1 10 10' 104 22 96

УГС 2 16 10' н.о 32 н.о

ХА 3 24 10* н.о 40 н.о

Е-67 1 10 10' 104 22 96

УГС 2 16 10* и.о 32 н.о

ХА 3 24 10* н.о 40 н.о

Примечание: н.о. - не обнаружено.

По результатам изучения чувствительности РНФ в зависимости от времени инкубирования исследуемого материала с фагом установлено, что увеличение времени до 10-ти часов позволяет обнаружить эшерихии с помощью РНФ в концентрации 103 м.к7мл-При инкубировании исследуемого материала с фагом в течение 16 часов чувствительность реакции повышается, что позволяет обнаружить бактерии в количестве 102 м.к/мл. На проведение исследования затрачивается 32 часа. Бактериологическим методом это же количество эшерихии обнаружить не удавалось. При инкубировании с фагом исследуемого материала в течение 24 часов чувствительность реакции.не увеличивается и позволяет обнаружить бактерии в количестве 102 м.к/мл. На проведение этого варианта реакции необходимо 40 часов. Бактериологическим методом КсоН 0157 удавалось обнаружить в концентрации 104 м.к./мл на проведение данного метода затрачивается 96 часов.

На основании наших данных, считаем, что наиболее эффективными являются режимы РНФ при 5 часовой экспозиции исследуемого материала с фагом, когда удается провести индикацию бактерий в количестве 103 в миллилитре исследуемого субстрата, на исследование которого затрачивается 16-18 часов, поэтому данный режим используем в дальнейших исследованиях, хотя наиболее эффективным по чувствительности является инкубирование исследуемого материала с фагом в течение 16 часов на которое затрачивается до 32 часов.

Разработка схемы постановки РНФ с предлагаемым диагностическим набором бактериофагов с образцами объектов внешней среды (водопроводная вода, комбикорм,

фекалии)

В последние годы исследователи уделяют большое внимание проблеме обнаружения патогенных микроорганизмов в объектах внешней среды: в воде, кормах и фекалиях. Эти субстраты, подвергающиеся постоянному загрязнению выделениями больных животных и людей, в эпизоотологическом и эпидемиологическом отношениях заслуживают особого внимания. По мнению ряда исследователей Exoli 0157 не только длительное время сохраняют свою жизнеспособность в объектах внешней среды, но и способны размножаться в них.

Поэтому разработка и внедрение в практику более простых и надежных методов обнаружения данного возбудителя в объектах внешней среды не теряют своей актуальности.

Для определения возможности использования РНФ для обнаружения Exoli 0157 в объектах внешней среды исследовали образцы воды, комбикорма и фекалий.

Пробы водопроводной воды в объеме 10 мл вносили в колбы и контаминировали Kcoli 0157 штамм РЛ и №51659 в концентрации 105; Ю4; 103; 102; 101 м.к./мл, заливали МПБ из расчета 10 мл бульона на 1 мл воды. Для контроля использовали колбу с пробой воды, не контаминированной бактериями E.coli 0157. Исследования проводили по методу, предложенному ВД.Тимаковым и Д.М Гольдфарбом (1962). Учет результатов проводили согласно показателям таблицы 5. По результатам проведенных опытов установлено, что увеличение титра фагов Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА более чем в 5 раз произошло уже при концентрации 103 микробных клеток эшерихий в 1 мл водопроводной воды.

Комбикорм массой 5-10 г растирали в стерильной фарфоровой ступке, коятаминировали Exoli 0157 штамм РЛ или №51659 в концентрации 105; 104; 103; 10г; 101 м.к./мл и вносили в стерильные колбы объемом 100 мл, заливали МПБ из расчета 10 мл бульона на 1 г. Брали колбу с пробой комбикорма не контаминированного бактериями Exoli 0157. Дальнейшие исследования проводили пометоду, предложенному ВД.Тимаковым и Д.МГольдфарбом (1962). Учет результатов проводили согласно показателям таблицы 5. По результатам проведенных опытов установлено, что увеличение титра фагов Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА более чем в 5 раза произошло уже при концентрации 103 микробных клеток эшерихий в 1 г комбикорма.

Фекалии массой 5-10 г растирали в стерильной фарфоровой ступке, контаминировали их Е coli 0157 в концентрации от 105; I04; 105; 10J; 101 м.к. и заливали МПБ из расчета 10 мл бульона на 1 г. Брали колбу с пробой фекалий не контаминированной бактериями Exoli 0157. Исследования проводили по вышеуказанному методу. Учет результатов проводили согласно показателям таблицы 5. По результатам проведенных опытов установлено, что

увеличение титра фагов Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА более чем в 5 раза произошло уже при концентрации 103 микробных клеток эшерихий в 1 г фекалий.

Нами установлено, что увеличение титра фагов Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА более чем в 5 раза произошло уже при концентрации 103 микробных клеток эшерихий в 1 мл взвеси водопроводной воды, комбикорма и фекалий.

Разработка схемы постановки РНФ с предлагаемым диагностическим набором бактериофагов с образцами мяса

Согласно литературным данным, заражение людей Kcoli 0157 происходит чаще всего при употреблении > пищевых продуктов, в том числе мясных, которые не подверглись достаточной термической обработке, поэтому разработка методов вышеуказанных микроорганизмов в мясе и в других продуктах питания имеет актуальное значение (Bitzan et al, 1993).

Кусочки свинины массой 5-10 г растирали в стерильной фарфоровой ступке, контаминировали Kcoli 0157 штаммами РЛ и №51659 в концентрации 105 1 04; 103; 102; 101 м.кУг и вносили в колбы объемом 100 мл, заливали МПБ из расчета 10 мл бульона на 1 г. Для контроля использовали пробу мяса, не контаминированного бактериями Ecoli 0157. Дальнейшие исследования проводили по методу, предложенному ВДТимаковым и Д.МГольдфарбом (1962). Учет результатов проводили согласно показателям таблицы 5.

По результатам проведенных опытов установлено, что увеличение титра фагов Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА более чем в 5 раза произошло уже при концентрации 103 микробных клеток эшерихий в 1 г мяса.

Основываясь на полученных данных, можно отметить, что РНФ является высокочувствительным методом индикации, позволяющим обнаружить E.coli 0157 даже в тех биосубстратах, которые содержат обильную сопутствующую разнообразную микрофлору и выделение культуры в чистом виде очень затруднено.

ВЫВОДЫ

1. Из объектов внешней среды было выделено 5 расе фагов активных по отношению к эшерихиям серогруппы 0157.

2. Четыре селекционированных штамма фагов Е-61 УГСХА, Е-67 УГСХА, Е-2 УГСХА, Е-3 УГСХА имели титр 10"$-10"7 по Алпельману и 1,0хЮ9 - 3,2x10* по Грациа, обладали выраженной специфичностью к штаммам E.coli 0157 (не лизировали Exoli гетерологичных серогрупп, представителей родов Proteus, dtrobacter, Morganella, Salmonella, Klebsiella, Staphylococus, Pseudomonas, Bacillus), сохраняли литическую активность в течение 12 месяцев, были устойчивы к нагреванию до 80° С.в течение 30 минут и действию 10% раствора хлороформа в течение 40 минут наблюдения.

3. Выделенные фаги Е-61 УГСХА, Е-67 УГСХА, Е-2 УГСХА, Е-3 УГСХА в

соответствии с морфологическими параметрами согласно Международной классификации и номенклатуре вирусов относятся к семейству Myoviride, а по классификации А.С.Тихоненко - к V морфологической группе: «Фаги с отростком сложного строения, чехол которого способен к сокращению».

4. Два фага Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА имели совместный спектр литической-активности по отношению к изученным штаммам эшерихий серогруплы 0157 равный 100% и были предложены для конструирования диагностического набора.

5. Разработана схема выделения и ускоренной идентификации бактерий E.coli 0157 с использованием выделенных фагов.

6. Разработана схема ускоренной индикации Exoli 0157 в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ с использованием созданного биопрепарата.

' 7. Разработаны технологические параметры изготовления- и контроля набора бактериофагов для индикации Rcoli 0157 и диагностики эшерихиоза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Предложены 2 штамма эшерихиозных бактериофагов Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА активных по отношению к бактериям Exoli OI57 , обладающие строгой специфичностью, широким диапазоном литической активности. Фаги депонированы в ВГНКИ ветеринарных препаратов (справка о депонировании фага Е-61 УГСХА — Phagum Esherichia coli 0157 Е-61 УГСХА - ДЕЛ от 29.05.2002г и фага Е-67 УГСХА - Phagum Esherichia coli 0157 Е-67 УГСХА - ДЕП от 29.05.2002г) и признаны перспективными для конструирования диагностических и лечебно-профилактических препаратов.

2. Идентификацию Ecoli 0157 предлагаем проводить с помощью набора диагностических колифагов, согласно «Методическим рекомендациям по выделению и фаготипированию энтерогеморрагической кишечной палочки Exoli 0157 из патологического материала, пищевых продуктов и объектов внешней среды с применением диагностических бактериофагов Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА», утвержденные ученым советом и ректором УГСХА 16.02.2004.

3. Индикацию Ecoli 0157 в объектах ветеринарного надзора предлагаем проводить с помощью РНФ с применением набора индикаторных бактериофагов Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА согласно "Методическим рекомендациям по ускоренной индикации, методом РНФ энтерогеморрагической кишечной палочки Exoli 0157 в патологическом материале, пищевых продуктах, кормах и объектах внешней среды", утвержденные ученым советом и ректором УГСХА 16.02.2004.

4. Изготовление и контроль диагностического набора бактериофагов необходимо проводить согласно "Временной инструкции по изготовлению и контролю лабораторной серии эшерихиозных бактериофагов Exoli 0157, Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА»,

утвержденной ученым советом и ректором УГСХА 16.02.2004.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1.Золотухин С.Н., Молофеева НА,Васильев ДА., Каврук Л.С. (ВНИИВС). Изучение чувствительности Escherichia coli 0157 к колифагам. // Вестник УГСХА, - 2001. - С. 59-62. 2.3олотухин С.Н., Молофеева Н.И., Васильев ДА Разработка оптимального метода выделения диагностического препарата. // Вестник УГСХА, - 2002. - С. 32-35. 3. Золотухин СМ., Молофеева Н.И., Бульканова ЕА, Васильев ДА. Чувствительность к антибиотикам патогенных и непатогенных штаммов эшерихий, выделенных из объектов внешней среды и патологического материала при желудочно-кишечных заболеваниях молодняка животных. // Материалы международной научно-практической конференции. Воронеж, - 2002. - С.276-277.

4.3олотухин С.Н., Молофеева Н.И., Васильев Д.А. Изучение некоторых биологических свойств выделенных бактериофагов Escherichia coli. //Вестник УГСХА, - 2002.- С. 36-38. 5.3олотухин С.Н., Молофеева Н.И., Васильев Д.А. Влияние некоторых факторов внешней среды на бактериофаги E.coli 0157 и штаммы клеток хозяев. // Материалы научно-производственной конференции. - 2003. - С. 219-222.

Подаиеаио в печать /У- Off. О ц

Формат 60x84Viî

Бумаге тииогр. №

Гарнитура Тип-Тайме i

Уся.печ.п. /.О

Заказ 5~0 Тираж 1°°

Ризограф УГСХА

432601, г.Улытовск, бульвар Новый Венец. 1

04-1400$

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Молофеева, Надежда Ивановна

ВВЕДЕНИЕ

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Эпидемиология и эпизоотология заболеваний, вызываемых бактериями E.coli 0157.

1.2. Резервуар и распространение инфекции.

1.3. Патогенез.

1.4. Лабораторная идентификация E.coli 0157.

1.5. Устойчивость

1.6. Бактериофаги и их применение в лабораторной практике.

1.6.1.История открытия и области применения бактериофагов.

1.6.2.Фагоидентификация бактерий и фаготипирование.

1.6.3. Развитие фаговых корпускул в клетке хозяина.

I.6.4. Реакция нарастания титра фага (РНФ).

II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы и методы.

2.2. Результаты собственных исследований.

2.2.1. Сравнительная оценка используемых методов по изучению специфичности дифференциально-диагностических сред.

2.2.2. Поиск бактериофагов E.coli 0157 и селекция клонов фагов

2.2.3. Характеристика фагов E.coli 0157.

2.3. Разработка метода выделения и ускоренной идентификации

E.coli 0157 с использованием фагов.

2.4. Разработка оптимальных условий постановки РНФ

2.4.1.Определение количественного показателя реакции, имеющего диагностическое значение.

2.4.2. Установление оптимального времени, обеспечивающего наиболее полноценное взаимодействие фага с бактериями.

2.4.3. Использование РНФ для обнаружения E.coli 0157 в объектах внешней среды.

2.4.3.1. Исследование водопроводной воды, контаминированной

E.coli 0157 с помощью РНФ.

2.4.3.2 Исследование комбикорма, контаминированного E.coli с помощью РНФ.

2.4.3.3. Исследование проб фекалий, контаминированные E.coli с помощью РНФ.

2.4.4. Использование РНФ для обнаружения E.coli 0157 в пищевых продуктах.

2.4.4.1. Исследование мяса, контаминированного E.coli 0157 с помощью

2.5. Обсуждение.

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ЛИТЕРАТУРНЫХ

ИСТОЧНИКОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов escherichia coli 0157 и их применение в диагностике"

Актуальность работы

Escherichia coli являются распространенными возбудителями инфекционных заболеваний желудочно-кишечного тракта у животных и человека (Покровский и др., 1989; Cantey, 1993; Тугаринов, Пирожков, Малахов, 2001).

В последнее время в научной литературе появилось большое число сообщений о вспышках гастроэнтеритов у людей, протекающих в тяжелой форме, вызванных E.coli 0157, которые образуют шигаподобный веродито-токсин (Riley, Remis, Helgerson, 1983; Orskov, Orskov, Villar, 1987; Cryan, 1990; Bell, Goldoft, Griffin, 1994; Goldwater, Bettelheim, 1994; Whipp, Rasmus-sen, Cray, 1994; Anderson, de Jong, 1996; Armstrong, Hollingsworth, Morris, 1996; Easton, 1996; Ратинер и др., 1998). Заболевание, вызываемое этим серологическим вариантом эшерихий, может вызывать у детей и взрослых диарею, геморрагические колиты, гемолитический уремический синдром и тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру (Shinoda et.al, 1997). Вспышки этой инфекции официально зарегистрированы во многих странах Северной и Южной Америки, Австралии, Европы, Азии, Африки и в нашей стране. Эшерихий серогруппы 0157 вызывают у молодняка животных диарею, геморрагический энтероколит и отечную болезнь у поросят (Тугаринов, Пирожков, Малахов, 2001).

Так как основным резервуаром инфекции является крупный и мелкий рогатый скот, свиньи, реже лошади, олени, птица, то особенно опасны для людей пищевые продукты, полученные от этих животных (Armstrong, Hollingsworth, Morris, 1996; Easton, 1997), а также растительные продукты, выращенные на полях, куда мог вывозиться необеззараженный навоз от животных-носителей этой серогруппы эшерихий (Cieslak et al., 1993; Souichi et al., 1997). He исключается заражение обслуживающего персонала при непосредственном контакте с животными-колиносителями (Chalmers et al., 1997).

По данным J.Tuttle et al., (1999) в ноябре 1992 года - феврале 1993 года наблюдалась вспышка (более 700 случаев) на Западе США, вызванная Е. coli 0157:Н7, связанная с гамбургерами, приготавливаемыми в ресторанах.

Высокая смертность от этой инфекции, низкая инфицирующая доза и способность возбудителя передаваться несколькими путями (пищевой, водный, контактный) создают серьезную проблему для органов здравоохранения многих стран.

Эффективность профилактических мероприятий во многом зависит от своевременной диагностики болезни у сельскохозяйственных животных, поэтому совершенствованию методов лабораторной диагностики вышеуказанной инфекции уделяется большое внимание.

Для микробиологической практики отечественными и зарубежными учеными разработаны питательные среды для выделения указанной серо-группы эшерихий (Ратинер, Бондаренко, 1998). Но метод их выделения и идентификации с использованием предлагаемых сред сравнительно трудоемок, недостаточно чувствителен и требует много времени (4-5 суток).

Современные методы иммунодиагностики (ИФА), предлагаемые для индикации этих бактерий, хотя и являются высокоспецифичными и чувствительными, но сложность методик, высокая стоимость оборудования и реактивов для постановки этих реакций делает их пока недоступными для большинства ветеринарных лабораторий. Поэтому перед исследователями стоит задача изыскания более простых и доступных для любых лабораторий методов индикации и идентификации названных микроорганизмов.

В лабораторной практике для ускоренной индикации патогенных для животных и человека микроорганизмов в патологическом материале и объектах внешней среды, а также для их быстрого типирования, предложены индикаторные бактериофаги (Гольдфарб, 1961; Ганюшкин, 1988; Русалиев, 1990; Кольпикова, Бакулов, Котляров, 1990).

Методы фагодиагностики просты в постановке, специфичны, не требуют больших затрат времени, материалов и общедоступны.

Цель исследования. Разработка параметров и технологических приёмов по индикации и идентификации E.coli 0157 с помощью реакции нарастания титра фага (РНФ).

Задачи исследования:

1.Выделить и селекционировать бактериофаги, активные в отношении штаммов Е. coli 0157.

2.Изучить основные биологические свойства (морфология негативных колоний, литическая активность и ее спектр, специфичность, температурная устойчивость, устойчивость к хлороформу) селекционированных изолятов.

3. Подобрать оптимальный набор выделенных фагов и сконструировать на их основе новый биопрепарат - диагностикум.

4. Разработать оптимальную схему выделения и ускоренной идентификации бактерий E.coli 0157 с использованием выделенных фагов.

5. Разработать схему ускоренной индикации бактерий E.coli 0157 в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ и использованием созданного биопрепарата.

6. Разработать технологические параметры получения биопрепарата для фагодиагностики.

Научная новизна

- Впервые были выделены бактериофаги активные в отношении штаммов Е. coli 015 7.

- Изучены основные биологические свойства выделенных фагов. Доказана эффективность использования селекционированных бактериофагов для индикации и идентификации E.coli 0157.

- Разработаны технологические параметры по получению диагностического биопрепарата фага и схема постановки РНФ.

Практическая значимость

Выделены и селекционированы специфичные бактериофаги, активные в отношении патогенных штаммов эшерихий 0157. Два выделенных и изученных штамма депонированы в лаборатории бактериальных инфекций ВГНКИ, признаны перспективными и рекомендованы для изготовления диагностического и лечебно-профилактического препарата. Разработана «Временная инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии индикаторных бактериофагов E.coli 0157 Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА».

Для врачей бактериологов написаны «Методические рекомендации по ускоренной индикации методом реакции нарастания титра фага (РНФ) энте-рогеморрагической кишечной палочки E.coli 0157 в патологическом материале, пищевых продуктах, кормах и объектах внешней среды» и «Методические рекомендации по выделению и фаготипированию энтерогеморраги-ческой кишечной палочки E.coli 0157 из патологического материала, кормов, пищевых продуктов и объектов внешней среды с применением диагностических бактериофагов Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА», одобренны ученым советом и утверждены ректором академии 16.02.04 г.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1. Схема выделения бактериофагов Е. coli 0157.

2. Биологические свойства выделенных бактериофагов E.coli 0157.

3. Сконструирована из отобранных фагов нового биопрепарата — диагностикума.

4. Разработка схемы выделения и ускоренной идентификации бактерий E.coli 0157 с использованием выделенных фагов.

5. Разработка схемы ускоренной индикации бактерий E.coli 0157 в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ и использованием созданного биопрепарата.

6. Разработка технологических параметров получения биопрепарата для фагодиагностики E.coli 0157.

Апробация работы

Результаты основных исследований, подтверждены актом комиссионных испытаний в ВГНКИМ (от 30.05.02.) и УГСХА (от 27.01.03.). Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях УГСХА (2000, 2001, 2002), семинарах Ульяновского областного управления ветеринарии (2001), на международной научно - практической конференции (Воронеж, 2002).

Работа выполнена в соответствии с комплексным планом научной работы кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринар-но-санитарной экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 166 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы (229 источников, в том числе 110 отечественных). Работа иллюстрирована 25 таблицами, 8 рисунками, 1 схемой и дополнена приложениями.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Молофеева, Надежда Ивановна

выводы

1. Из объектов внешней среды было выделено 5 расе фагов активных по отношению к эшерихиям серогруппы 0157.

2. Четыре селекционированных штамма фагов Е-61 УГСХА, Е-67 УГСХА, Е-2 УГСХА, Е-3 УГСХА имели титр 10"5-10'7 по Аппельману и 1,0x109 - 3,2x109 по Грациа, обладали выраженной специфичностью к штаммам E.coli 0157 (не лизировали E.coli гетерологичных серогрупп, представителей родов Proteus, Citrobacter, Morganella, Salmonella, Klebsiella, Staphylococus, Pseudomonas, Bacillus), сохраняли литическую активность в течение 12 месяцев, были устойчивы к нагреванию до 80° С в течение 30 минут и действию 10% раствора хлороформа в течение 40 минут наблюдения.

3. Выделенные фаги Е-61 УГСХА, Е-2 УГСХА, Е-3 УГСХА, Е-67 УГСХА в соответствии с морфологическими параметрами согласно Международной классификации и номенклатуре вирусов относятся к семейству Myoviride, а по классификации А.С.Тихоненко - к V морфологической группе: «Фаги с отростком сложного строения, чехол которого способен к сокращению».

4. Два фага Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА имели совместный спектр литической активности по отношению к изученным штаммам эшерихий серогруппы 0157, равный 100%, и были предложены для конструирования диагностического набора.

5. Разработана схема выделения и ускоренной идентификации бактерий E.coli 0157 с использованием выделенных фагов.

6. Разработана схема ускоренной индикации E.coli 0157 в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ с использованием созданного биопрепарата.

7. Разработаны технологические параметры изготовления и контроля набора бактериофагов для индикации E.coli 0157 и диагностики эшерихиоза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Предложены 2 штамма эшерихиозных бактериофагов Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА активных по отношению к представителям E.coli 0157 , обладающие строгой специфичностью, широким спектром литической активности. Фаги депонированы в ВГНКИ ветеринарных препаратов (справка о депонировании фага Е-61 УГСХА - Phagum Esherichia coli 0157 Е-61 УГСХА -ДЕП от 29.05.2002г и фага Е-67 УГСХА - Phagum Esherichia coli 0157 Е-67 УГСХА - ДЕП от 29.05.2002г) и признаны перспективными для конструирования диагностических и лечебно-профилактических препаратов.

2. Идентификацию E.coli 0157 предлагаем проводить с помощью набора диагностических колифагов, согласно «Методическим рекомендациям по выделению и фаготипированию энтерогеморрагической кишечной палочки E.coli 0157 из патологического материала, пищевых продуктов и объектов внешней среды с применением диагностических бактериофагов Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА», утвержденные ученым советом и ректором УГСХА 16.02.2004.

3. Индикацию E.coli 0157 в объектах ветеринарного надзора предлагаем проводить с помощью РНФ с применением набора индикаторных бактериофагов Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА согласно "Методическим рекомендациям по ускоренной индикации, методом РНФ энтерогеморрагической кишечной палочки E.coli 0157 в патологическом материале, пищевых продуктах, кормах и объектах внешней среды", утвержденные ученым советом и ректором УГСХА 16.02.2004.

4. Изготовление и контроль диагностического набора бактериофагов необходимо проводить согласно "Временной инструкции по изготовлению и контролю лабораторной серии эшерихиозных бактериофагов E.coli 0157, Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА», утвержденной ученым советом и ректором УГСХА.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Молофеева, Надежда Ивановна, Ульяновск

1. Абдусаматов М.А. Сравнительное изучение реакции нарастания титра фага и бактериологического метода при диагностике брюшного тифа у больных и реконвалесцентов. // ЖМЭИ. 1960. - № I. - С. 23-27.

2. Аврех В.В. О понятии "Серологический тип бактериофагов". // В кн.: XIII Всесоюзный съезд гигиенистов, эпидемиологов, микробиологов и инфекционистов. Л. 1959. - Т.2. - С. 537-540.

3. Аврех В.В. О применении бактериофагов в диагностике сальмонеллезов. // ЖЭМИ. 1954. - №7. - С. 93-96.

4. Адаме М. Бактериофаги. Москва. -1961. - С. 521.

5. Адельсон Л.И. Бактериофаги, активные по отношению к энтеропатоген-ным кишечным палочкам. / Вопросы микробиологической диагностики и бактериофагии. -1962. С. 184-194.

6. Адельсон Л.И., Гуторова В.Д., Ключарева Г.Г. Современное состояние проблемы теории бактериофага и его практическое применение. // Тезисы докладов юбилейной научной сессии Ленинградского сан.-гиг. мед. ун-та. Л., 1958.

7. Азизбекян P.P. Изменение наследственности бактерий путем фаговой конверсии. // В кн. Микробиология. Т.З. (Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР). М., 1974. - С. 191-233.

8. Попхадзе М.З. Использование бруцеллезного фага для дифференциации бруцелл. // ЖМЭИ. 1968. № 2. - С. 119-124.

9. Алымова А.Ф., Гортинская В.В., Кузнецова А.П., Логинова Л.Л., Смирнова Е.А. Применение реакции нарастания титра фага в очагах брюшного тифа. Тр. Горьковского гос. мед. ин-та им. С.М.Кирова, - 1964. - T.XYIII. -С. 10-12.

10. Арский В.Г., Ахметов 3.3., Ясенский А.В. Применение реакции нарастания титра фага для диагностики хронической дизентерии. // Здравоохранение Таджикистана. 1961. -№ 2. - С. 5-11.

11. П.Архангельский И.И., Степанов Б.А. Фаготипирование патогенных стафилококков, выделенных из молока коров. // Ветеринария. 1966. №3. -С. 27.

12. Байрак В.А. Тесты патогенности и фаготипы стафилококков, выделенных при мастите коров.: Автореферат канд.дис. -М., 1970.

13. Бакулов И.А., Котляров В.М., Колпикова Т.И., Капырина А.И. О специфичности листериозных бактериофагов. // Ветеринария. -1990. №7. -С. 26-27

14. Башмаков Г.А. Индикация дизентерийных бактерий на поверхности методом реакции нарастания титра фага. // Военно-мед. журн. — 1961. № 4. - С. 39-42.

15. Быкова З.А. Некоторые свойства чумных фагов. Тр.Армянской противочумной станции. - 1964. - №3. - С. 171-175.

16. Васильев Д.А., Померанцев Д.А. Схема бактериологического выделения и идентификации Yersinia enterocolitica. // Методы частной бактериологии. Ульяновск - 1999. - С. 147-152.

17. Вилькомирская Т.С. О диагностическом значении реакции нарастания титра фага при дизентерии. // ЖМЭИ. 1971. - № 1. - С. 136-138.

18. Воронцова А.А. Применение метода реакции нарастания титра фага при эпидемиологическом и санитарном обследовании. // Тез. докл. на межин-стит.конф.по проблеме «Кишечные инфекции». М., 1961. - С. 127-128.

19. Висконти Р. Генетика бактериофага. // В кн.: Онтогенез вирусов. М., -1956.-141 с.

20. Габрилович И.М. Лизогения. Минск, 1970.

21. Габрилович И.М. Сравнительное изучение бактериофагов Morganella и Providencia. ЖМЭИ, 1998, №5, С.20-22.

22. Габрилович И.М. Биологические свойства бактериофагов Serratia mar-cences. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии.-1992.-С.10-12.

23. Габрилович И.М. Общая характеристика бактериофагов. // Основы бактериофагии. -Минск.-1973. -С.5-24.

24. Ганюшкин В.Я. Реакция нарастания титра фага при диагностике паратифа поросят. // Ветеринария. 1967. -№ 3. - С. 69-71.

25. Ганюшкин В.Я. Бактериофаги Salmonella choleraesuis, сравнительная характеристика и практическое применение.: Автореферат дис. докт. вет. наук. Ульяновск. - 1984. - С.84.

26. Ганюшкин В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их применение в ветеринарии. // Учебное пособие. Ульяновск. - 1988. - С.45.

27. Ганюшкин В.Я. Обследование свиней на носительство сальмонелл и фагопрофилактика. // Вопросы ветеринарной микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы. Ульяновск. - 1990. - С.20-28.

28. Ганюшкин В.Я., Кузнецова В.Н. Индикаторный сальмонеллезный бактериофаг СД1. // Авторское свидетельство №616800. 1978.

29. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. М.: Медгиз. 1961. - С. 297.

30. Гольдфарб Д.М., Кузнецова В.Н. Опыт применения реакции нарастания титра фага для диагностики дизентерии. // ЖМЭИ. 1957. - № 8. - 90-94.

31. Гольдфарб Д.М., Островская З.С. Индикация брюшнотифозной палочки в воде спомощью реакции нарастания титра фага. // ЖМЭИ. 1957. - № 5. -С. 17.

32. Гордина Р.В. Фаготипирование паратифозных В бактерий и действие на них бактериофагов.: Автореферат докт. дисс., М., 1954.

33. Гуторова Л.Д. Фаготипирование бреславской палочки. // ЖМЭИ. 1958. -№ 12.-С. 53-55.

34. Д Эррель. Бактериофаг и его значение для иммунитета. Госиздат, - М, -1926. - С. 223.

35. Д Эррель. Бактериофаг и феномен выздоровления. Тбилиси: Изд. Тбилисского государственного университета. 1935, - С. 139.

36. Давиденко Т.А., Зарицкий A.M. Фаготипирование S.typhimurium, выделенных в Киеве в 1966-1970 гг. // В кн.: Кишечные инфекции. Киев, -1972. - в.5, - С. 41.

37. Дегтярев Ю.А. Реакция нарастания титра фага и ее применение для диагностики брюшного тифа и выявление бактерионосителей. // Тез.докл.ин-та эпидемиол. и гигиены. Душанбе. - 1960, - С. 12.

38. Домарадский И.В., Мосолова О.Н., Денисенко Л.К. Методика быстрого обнаружения чумного микроба при помощи бактериофага. Иркутск, 1957.

39. Ершов Ф.И. Индикация дизентерийных бактерий с помощью РНФ. // В кн.: Изменчивость микроорганизмов и иммунитет. М. - 1959. - С. 188.

40. Золотухин С.Н. Бактериофаги M.morganii и их применение при желудочно-кишечных заболеваниях поросят.: Автореферат дис. канд. вет. наук. -Ульяновск, 1994.

41. Ивашура А.И. Патогенные бактерии в молоке здоровых и больных маститом коров и методы их индикации. Автореферат канд.дисс. М., 1967.

42. Иллютович А.Ю., Петрова З.С., Голубева Е.Е., Четверкина Р.С. Применение РНФ для индикации дизентерийных бактерий флекснера в организме зараженных кроликов. // Бюлл. эксп. биол. и мед. 1958. -№ 6. -С. 78.

43. Камбаратов П.И. Значение РНФ при распознавании сальмонеллеза. // ЖМЭИ. 1963. - № 6. - С. 35.

44. Камбаратов П.И. Клиническая оценка РНФ как метода лабораторной диагностики острой дизентерии. // ЖМЭИ. 1963. - № 4. - С. 29.

45. Капырина Н.А., Бакулов И.А. Идентификация возбудителя листериоза с помощью бактериофага. // Симпозиум «Профилактика и меры борьбы с лептоспирозом и листериозом с/х животных". Новочеркасск. 1972. — С. 76-78.

46. Кацитадзе Г.К. Применение брюшнотифозного фага Vi-I в РНФ. // ЖМЭИ. 1963. - № 3. - С. 126-127.

47. Кац-Чернохвостова Л.Я. Проблема фаготипирования брюшнотифозных и паратифозных микробов и ее эпидемиологическое значение. // ЖМЭИ. -1947.-№8.-С. 312-315.

48. Козелько О.А. Применение метода РНФ для контроля качества дезинфекции в очагах кишечных инфекций. // ЖМЭИ. 1961. - № 2. - С. 3640.

49. Колпикова Т.И., Бакулов И.А., Котляров В.М. Фаготипирование листе-рий. // Ветеринария. 1990. - №6. - С.31-32.

50. Корнилова Г.В. РНФ при индикации дизентерийных бактерий в воде в сопоставлении с бактериологическим методом. // Материалы 16 межоб-ластн.научн.-практ.конф.лабор.работников в Зап.Сибири в г. Томске. -1960.-С. 20-21.

51. Кременчук Г.А., Гицевич М.А., Бояршинова К.П. Применение реакции нарастания титра фага для исследования объектов внешней среды. // ЖМЭИ. 1961. - № 7. - С. 124.

52. Кривиский А.С. Вирусы против микробов. М., - 1962.

53. Крылова М.Д. Перспективы и возможности метода фаготипирования бактерий. // Материалы юбилейного симпозиума, посвящен. 50-летию Тбилисского НИИВС. Тбилиси. - 1974. - С. 276-280.

54. Крылова М.Д. Применение бактериофагов для типирования бактерий. // В кн.: Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. - М. - 1961. - С. 220.

55. Крылова М.Д. Схема фаготипирования нетоксигенных дифтерийных бактерий типа gravis. // ЖМЭИ. 1970. - № 12. - С. 16-22.

56. Крылова М.Д. Фаготипы бактерий. М., - 1963.

57. Кузнецова В.Н. Рациональная методика фагодиагностики дизентерии при массовых обследованиях. // Здравоохранение Таджикистана. М., Мед-гиз. - 1956. - С. 29.

58. Кузнецова В.Н. Хазанов М.И., Ремова Т.Н. Применение реакции нарастания титра фага для индикации дизентерийных бактерий в условиях внешней среды. // ЖМЭИ. 1960. - № 6. - С. 59.

59. Лебедев В.И. Опыт применения РНФ в эпидемиологической практике. // ЖМЭИ. 1963. - № 12. - С. 29.

60. Ленев С.В. Бактериофаги энтеропатогенных эшерихий, их биологические свойства и практическое применение: Автореферат дис. канд. биол. наук. -Москва. 1988.

61. Ленев С.В., Малахов Ю.А., Могильный Ю.И. Биологические свойства бактериофагов эшерихий. // Сборник научных трудов ВГНКИ ветпрепа-ратов. -Москва. -1985. С.78-84.

62. Лешкович Н.Л., Ермилова В.П. О диапазоне и специфичности действия чумных фагов 1701, 1710иих мутантов. // В кн.: Проблемы особо опасных инфекций. 1974. - в.2. - С. 38-41.

63. Лихачев Н.В. Метод диагностики паратифа свиней при помощи бактериофага. // Ветеринария. 1948. - № 7. - С. 32.

64. Лурия С., Дарнелл Д. Общая вирусология М., «Мир», -1970.

65. Мазурин Н.Д., Розина-Япкина Ц.С. РНФ при диагностике дизентерии. // ЖМЭИ.-1963. -№ 1.-С. 113-115.

66. Малов В.А., Бондаренко В.М., Пак С.Г. // Журн. микробиол. 1996. - № 1.-С. 91-96.

67. Матвеева С.М. РНФ в диагностике брюшного тифа. // Тез.докл.на меж-инстит.конф.по проблеме «Кишечные инфекции». М. - 1961. - С. 146147.

68. Мац Л.И. Вопросы санитарной бактериологии и вирусологии. М.:Медицина, 1965.

69. Методическими указаниями по бактериологической диагностике коли-бактериоза (эшерихиоза) животных", утвержденные Департаментом ветеринарии МСХ и П РФ, 2000.

70. Методические указания по методу выделения и идентификации энтеро-геморрагической кишечной палочки E.coli 0157:Н7, утвержденные главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, 2001.

71. Миляева Е.Н. Определение зараженности предметов бытовой обстановки дизентерийными микробами с помощью реакции нарастания титра бактериофага. // ЖМЭИ. - 1958. -№ 12. - С. 34.

72. Нурызгалиев С.Н. Фаготипирование стафилококков, выделенных от больных гнойными инфекциями. // Материалы 10 научн. Сесс. Алма-Атин. гос. мед. ин-та. Алма-Ата. 1978. - С. 55-57.

73. Никитюк Н.М. Фаготипирование Styphimurium, выделенных на различных территориях СССР. // ЖМЭИ. 1970. - № 1. - С. 53.

74. Островская З.С. Диагностика брюшного тифа у больных с помощью РНФ. // Аннотация научной работы АМН СССР. 1956. - С. 57-59.

75. Островская З.С., Папкова Б.Н. Ускоренный метод диагностики брюшного тифа Vi-фага. //ЖМЭИ. 1951. - № 2. - С. 37-40.

76. Островская Н.Н., Гольдфарб Д.М. К использованию метода нарастания титра фага для выявления бруцелл во внешней среде. // ЖМЭИ. 1961. -№5.-С. 145.

77. Павлова И.П. Изучение морфологии и биологических свойств фагов Bac.anthracis и Bac.cereus. // ЖМЭИ. 1971. - № 7. - С. 147.

78. Петров Ю.Л. // Арх. пат. 1991. - № 7. - С. 74-78.

79. Петрушина Л.И. Фаготипирование стафилококков, выделенных от больных маститом коров. // ЖМЭИ. 1967. - № 5. - С. 128.

80. Поддубный Ф.Н. Изучение специфичности и чувствительности РНТФ при индикации дизентерийных бактерий в воде. // ЖМЭИ. -1962. №1. -С. 29-31.

81. Покровский В.И., Полоцкий Ю.Е., Ющук Н.Д., Бондаренко В.М. // Журн. микробиол. 1989. - № 4. - С. 80-87.

82. Пономарев А.П., Андреева О.Г., Артамонова Т.Н. Электронно-микроскопическое выявление вирусов животных в некогцентрированных вируссодержащих суспензиях. // Вестник РАСХН. 2002. - №2. - С. 7477.

83. Понявин Б.Я. Изучение реакции нарастания титра фага в условиях практической лаборатории. // ЖМЭИ. 1960. -№ 6. - С. 135.

84. Ратинер Ю.А., Канарейкина С.К., Бондаренко В.М. // Журнал микробиологии. -1976. -№ 5.-С. 117-121.

85. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике. Киев: Урожай, - 1978. - С. 88.

86. Ревенко И.П. К диагностике рожи свиней. // Ветеринария. 1970. -№ 6

87. Рубашкина Б.К., Казакова С.Ф. Применение метода нарастания титра фага для исследования объектов внешней среды. // ЖМЭИ. 1959. -№6. - С. 110-112.

88. Руководство по эпидемиологии инфекционных болезней. / Под ред. В.И. Покровского. М., - 1993. - С. 61-78.

89. Русалиев В.М. Фагочувствительность консервированных культур Bacillus anthracis. // Ветеринария. -1990.- №9. С.39.

90. Русалиев B.C. Фагочувствительность аэробных спорообразующих бактерий. // Ветеринария. 1990. - №8. - С.29-30.

91. Сергиенко Ф.Е. Новый метод бактерюлопчно д1агностики за допомогою бактерюфага. // Мшробюл.журн .АН УССР. -1936. №1. - С. 85-112.

92. Стронговская Н.В. Сравнительное изучение РНФ для выявления носи-тельства дизентерийных бактерий: Автореферат дис. канд. мед. наук. -Симферополь. 1964.

93. Тимаков В.Д., Гольдфарб Д.М. Реакция нарастания титра фага (РНФ) -М., 1962.

94. Тимаков В.Д., Гольдфарб Д.М. Экспериментальное обоснование нового принципа обнаружения дизентерийных и брюшнотифозных бактерий с помощью фага. // ЖМЭИ. 1956. -№ 10. - С. 3-7.

95. Тимаков В.Д., Гольдфарб Д.М. Экспериментальное обоснование нового принципа обнаружения дизентерийных и брюшнотифозных бактерий с помощью фага. // ЖМЭИ. 1956. - № 10. - С. 3-7.

96. Тимаков В.Д., Гольдфарб Д.М. Об условиях взаимодействия фага и бактериальной клетки. //Вестник АМН СССР. 1958. - № 2. - С. 37.

97. Тихоненко А.С. Ультраструктура вирусов бактерий. М.: Наука, 1968. -89 с.

98. Тугаринов О.А., М.К.Пирожков, Ю.А.Малахов Сборник научных трудов. М.:ВГНКИ. - 2001. - Т.62. - С.68-75.

99. Цветков К.И. Применение специфического фактериофага для диагностики паратифозного аборта кобыл. // Ветеринария. 1941. -№ 6. - С. 46.

100. Чинашвили Т.Г. К механизму образования фагоустойчивых форм микроорганизмов. // В кн.: Вопросы молекулярной генетики микроорганизмов. М. 1968. - С.225.

101. Чиракадзе Л.Г., Чанишвили Т.Г. Типирование S.typhimurium при помощи селекционированных фагов. // ЖМЭИ. 1974. -№ 3. - С. 72-78.

102. Шантаренко И.В. Изучение РНФ как метода индикации бактерий дизентерии во внешней среде. // Тез.докл. и выступл.на 5 Всес. научн.конф.по санитарн.микробиол. М. - 1962. - С. 89-93.

103. Щеглова М.К. Некоторые свойства листериозного бактериофага. // ЖМЭИ. 1962. - № 1. - С. 99-102.

104. Энтеробактерии / Под ред. Голубевой И.В., Килессо В.А., Киселевой Б.С. и др. М., - 1985. - С. 57-87.

105. Abolmaaty A., Levin R.E., Abdallah М.А. Development of a spetrophotomet-ric immunoagglutinetion assay for quantition of IgG for Escherichia coli 0157. // Microbios. 1997. -V. 91, № 366. - P. 37-46.

106. Akiba M., Masuda Т., Samershima Т., Katsuda K., Nakazawa M. Molecular tyring of Escherichia coli 0157:H7 (H-) isolates from cattle in Japan. // Epidemiol. And Infect. -1999. V. 122, №2. - P. 337-341.

107. Akiba M., Sameshima Т., Nakazawa M. Tne shift of genetic subtypes of Escherichia coli 0157:H7 isolates from cattle. // Epidemiol, and Infec. 1999. -V.122, №2.-P. 343-346.

108. Andersson Y., de Jong B. Escherichia coli 0157 infections in Scotland. // Proc. Symp. Food Associated Pathogens, May 6-8, 1996. - P. 177 - 178.

109. Arlidge J. Investigation de Eschericif coli 0157:H7 en pacientes con gastroenteritis aguda. // The Guardian. February 26, - 1997.

110. Armstrong G.L., Hollingsworth J., Morris J.G. Persistence of Eschericia coli 0157:H7 in dairy cattle and the dairu farm environment. // Epidemiol. Rev. -1996.-V. 18.-P. 29-51.

111. Bell B.P., Goldoft M., Griffin P.M. Enteropathogenig Eschericia coli 0157 in Psitaciformes. // JAMA. -1994. V. 272. - P.1349 - 1353.

112. Beutin Lothar, Gleier Kerstin, Zimmermann Sonj, Geier Dorothee. Zur denti-fizierung von Verotoxin-bildenden (VTEC) und enterohamorragischen Escherichia coli (EHEC) auf Indikatornahrboden. // Klin. Lab. 1994. - V. 40, № 3. - P. 193-201.

113. Bielaszewiska M., Janda J., Slahova K. et al. Recent advances in verocyto-toxin-prod. E.coli infections / M.A.Karmali et al. Elsevier Sci. B.V., -1994. - P. 37 - 40.

114. Bitzan M., Ludwig K., Klemt M., Konig H., Biirex J., Muller Wiefel D.E. Eschencha coli 0157:H7 in range beef calves at weaning // Epidemiol, and Infec. 1993. - V. 110, № 2. - P. 183-196.

115. Bitzan M., Richardson S., Huang C. Colilert test for detection of Verotoxin -producing Escherichia coli 0157:H7. // Ibid. 1995 - P. 193 - 195.

116. Bolton F.J., Aird H. Verocytotoxin-producing Escherichia coli 0157: Public health and mianbioiogical significance. // Brit. J. Biomed. Sci. 1998. -V. 55, №2.-P. 127-135.

117. Boyce T.G., Swerdlow D.L., Griffin P.M. Colicinogenicity and enteropatho-genicity of Escherichia coli associated with gastroenteritis in man. // New Engl. J.Med. 1995. - V. 333. - P. 364 - 368.

118. Brooks Scott W., Cullor James S., Gardner Ian A.J. Escherichia coli 0157:H7 survival in ovine or bovine manure. // Agromed. 1998. V. 5, №3. -P. 3141.

119. Brotman M., Gianella R.A., Philip C. et al. Escherichia coli 0157:H7: prevention des accidents alimentaires. // Gastroenterology. 1995. - V. 108. -P. 1923-1934.

120. Bryant H.E., Athar M.A., Pai Ch.H. Toxin phenotype and plasmid profiles in the analysis of risk for Escherichia coli 0157:H7 hemolytic- uremic syndrome. // J. Infect.Dis. 1989. - Vol. 160. - P. 858-869.

121. Cantey J.R.Growth and processing conditions affecting acid tolerance in Escherichia coli 0157:H7. // Gastroent Clin. N. Amer. 1993. - V. 22. - P. 609622.

122. Carter A.O., Borczyk A.A., Carlson J.A. Escherichia coli 0157:H7 episode with a perspective on vero toxins. // New Engl. J.Med. 1987. - V. 317 - P. 1496- 1500.

123. Chalmers R.M., Salmon R.L., Willshaw G.A., Cheasty Т., Looker N., Davies I., Wray C. Vero-cytotoxinproducing Escherichia coli 0157 in a farmer handling horses. // Lancet. 1997. - V. 349, № 9068. - P. 1816.

124. Chapman P.A., Siddons Christine A., Zadik P.M., Jewes Linda. An improved selective medium for the isolation of Escherichia coli 0157. // J. Med. Microbiol. 1994. -V. 35, № 2. - P. 107—110.

125. Chart H., Cheasty Т., Cope D. et al. Escherichia coli 0157 a food-borne pathogen. // Epidem. Infect. 1991. - V. 107. - P. 349-356.

126. Cieslak Paul R., Barrett Timothy J., Griffin Patricia M., Censheimer Kathleen F., Beckett Geoff, Buffington Joanna, Smith M. Geoffrey. Escherichia coli 0157:H7 infection from a manured garden. // Lancet. 1993. - № 8867. - P. 367-368.

127. Cimolai Nevio, Blair Geoffrey K., Murphy James J., Fraser Graham G. . Impact of infection by verotoxigenic Escherichia coli 0157:H7 on the use of surgical services in a children's hospital. // Can. J. Surg. 1997. - V. 40, № l.-C. 28-32.

128. Clarke R.C., Wilson J.B., Read S.C. Recent advances in verocytotoxin-prod. E.coli infections. / M.A.Karmali et al. Elsevier Sci. B.V., - 1994. - P. 17 -24.

129. Cleary T.G. Adylt hemolytic uremic syndrome with renal microangiopathy. // Pediatr. Clin. North Am. 1988. -V. 35. - P. 485 - 501.

130. Coia J.E., Sharp J.C.M., Curnow J. Recent advances in verocytotoxin-prod.

131. E.coli infections / MA.Karmali et al. Elsevier Sci. B.V., 1994. - P. 41 - 44.

132. Cryan B. Escherichia coli 0157 and the Salmonella typhimurium of Sac-charomyces boulardii.// Scand. J. infect. Dis. 1990. - V. 22. - P. 1- 4.

133. Donnenberg M.S., Kaper J.B. Persistence of Escherichia coli 0157:H7 in dairy cattle and the dairy farm environment. // Infect. Immun. 1992. - V. 60. -P. 3953 -3961.

134. Doyle Michael P., Padhye Nisha; Wisconsin Alumni Research Foundation. Monoclonal antibody to enterohemorrhagic Escherichia coli 0157.H7 and 026:H11. -№ 559867; Заявл. 27.07.90; Опубл. 12.01.92; НКИ 590/387., 1992.

135. Easton Louise. Escherichia coli 0157: Occurrence, transmission and laboratory detection. // Brit. J. Biomed. Sci. 1997. -V. 54, № 1. - P. 57-64.

136. Faith N.G., Shere J.A., Brosch R., Arnold K.W., Ansay S.E., Lee M.-S., Lu-chansky J.B., Kaspar C.W. Prevalence ana cionai nature ot Escherichia coli 0157:H7 on dairy farms in Winsconsin. // Appl. nd Environ. Microbiol. -1996.-V. 62, №5.-P. 1519-1525.

137. Farmer J.J.III, Kelly M.T. Recent advances in verocytotoxin-prod. E.coli infections // Manual of clinical microbiology, 5-th ed./ A. Ballows. Washington, - 1991. - P. 360 - 383.

138. Gehring Andrew G., Patterson Deidre L. Use of a light-addressable potenti-ometric sensor for the detection of Escherichia coli 0157:H7. //Anal.Biochem.-1998.-V. 258, №2. P.293-298.

139. Goldwater P.N., Bettelheim K.A. Recent advances in verocytotoxin-prod. E.coli infections / M.A.Karmali et al. Elsevier Sci. B.V., - 1994. - P. 57 -60.

140. Graigie J., Felix A. Typing of tyfoid bacilli with Vi bacteriofage, suggestions for ist standartisation. Lancet. -1947. - V. 14, - P. 823.

141. Graigie J., Yan C. Demonstration of types of b tyfosus by mesns of preparations of typs. // Canad. Publ. Hith. J., 1938. V. 29, № 9. - P. 448.

142. Griffin P.M. Infection of the Gastrointestinal Tract. // Eds M. J. Blaser et al. -New York, 1995. - P. 739-761.

143. Griffin P.M., Bell B.P., Cieslak P.R. Recent in advances in verocytotoxin-prod. E.coli infections / M.A.Karmali et al. Elsevier Sci. B.V., - 1994. - P. 7

144. Griffin P.M., Tauxe R.V. Occurrence of shigatoxinogenic Escherichia coli 0157 cattle herds. // Epidemiol. Rev. 1991. - V. 13. - P. 60 - 98.

145. Hahcock D.D., Besser Т.Е., Kinsel M.L., Tarr P.I., Rice D.H., Paros M.G. The prevalence of Escherichia coli 0157 H7 in dairy and beef cattle m Washington State. // Epidemiol, and Infec. 1994. - V. 113, № 2. - P. 199-207.

146. Hahcock D.D., Besser Т.Е., Rice D.H., Herriott D.E., Tarr P.I. A longitudinal study of Escherichia coli 0157 in fourteen cattle herds. // Epidemiol, and Infec. 1997.-V. 118, №2. -P. 193-195.

147. Hayes Mire, Trevena W.Barrie. Escherichia coli the lesser known risk. //Safety and Health Pract.-1997.- V.15, №1. P.14-19.

148. Hammermueller J.D., Gyles C.I. Recent advances in verocyiotoxin-prod. E.coii infections / M.A.Karmali et al., Elsevier Sci. B.V., - 1994. - P. 113116.

149. Jackson M.P., O'Brien A.D. Recent advances in verocytotoxin-prod. E.coli infections. // Ibid. 1994 - P. 123 - 130.

150. Jenkins Claire, Chart Henrik . Antibodies to lipopolysaccharide of Escherichia coli serogroups 05 and 0165 in healthy adults. // Lancet. -1999. -V. 354, № 9179. P. 649-650.

151. Karch H. The large-sized plasmids of enterohemorrhagic Escherichia coli 0157 straing encode hemolysins which are presumably members.//eur. J. Clin.Microbiol.Dis. -1996. V. 15. - P. 276-280.

152. Karmali M.A. Enterohemorrhagic Escherichia coli 0157:H7 episode with a perspective on vero toxins. // Clin. Microbiol. Rev. 1989. - V. 2. - P. 15 -38.

153. Karmali M.A. Hemolytic-uremic syndrome and thrombotic thrombocitopenic purpura. / B.S.Kaplan et al. 1992. - P. 199 - 212.

154. Karmali M.A., Petric M., Lim C. Enteroaggregative Escherichia coli may be a new patogen causing acute and persistent diarrhea. // J. Infect. Dis. 1985. -V. 151.-P. 775-782.

155. Katznelson H., Sutton M. Rapid phage plague count method for the detection of bacteria as applied to the demonstration of internalug borne bacterial infections of seed. J. Bact., -1951. -V. 61, № 1. - P. 689.

156. Kelly J.K., Pai Ch.H., Jadusingh I.H. The large plasmids of Shiga-toxinproducing Escherichia coli are highly variable genetic elements. // Amer. J. clin. Path. 1987. - V. 88. - P. 78-82.

157. Ketti I. A study of Escherichia coli from farm animals during. // Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung. 1981. - V.28. - P. 393-398.

158. Kleanthous H., Smith H.R., Scotland S.M. Genetische Grundlangen der glau-kome. // Arch Dis. Child. 1990. - V. 65. - P. 722 - 727.

159. Knight Pamela. Les Escherichia coli hemorragiques provoquent un danger croissant. // Publ. trim. /Assoc. anciens eleves Inst. Pasteur. 1995. - V. 37, № 142.-P. 16-19.

160. Knutton S., Baldwin TJ., Haigh R.D. Recent advances in verocytotoxin-prod. E.coli infections / M.A.Karmali et al. Elsevier Sci. B.V., - 1994. -P. 215 -222.

161. Knutton S., Baldwin Т., Williams P.H. A tool for on farm food salety. // Infect. Immun. 1989. - V. 57. - P. 1290 - 1298.

162. Komatsu Masaru, Aihara Masanori, Nagasaka Yoko, Nakajima Hiroko, Iwa-saki Mizuho, Takahashi Motoyo, Shimakawa Tohru, Matsuo Shuji. / Kansen-shogaku zasshi = J. Jap. Assoc. Infec. Diseases. 1997. - V. 71, № 11. - P. 1124-1130.

163. Konovalchuk J., Speirs J.I., Stavric S. Variants of Shiga-like toxin II constitute a major toxin component in Escherichia coli 0157 strains from patients with haemolytic uraemic syndrome. // Infect. Immun. 1977. -V. 18. - P. 775 -779.

164. Kudoh Y., Kai A., Obata H. Recent advances in verocytotoxin-prod. E.coli infections / M.A. Karmali et al. Elsevier Sci. B.V., - 1994. - P. 53 -56.

165. Khoshoo K., Moudgol A., Vasuder A.S. Toxin phenotype and plasmid profiles in the analysis of risk for Escherichia coli 0157:Y7 asociated hemolytic-uremic syndrome. // Acta paediatscand. 1988. - V. 77. - P. 604-605.

166. Laegreid W.W., Elder R.O., Keen J.E. Prevalence of Eschencha coli 0157:H7 in range beef calves at weaning. // Epidemiol, and Infec. 1999. - V.123, № 2.-P. 291-298.

167. Levine M.M., Nataro J.P., Karch H. et al. Eliminating Eschencha coli 0157.H7 in frozen pepperoni pizza. // J. Infect. Dis. 1985. - V. 152 - P. 550

168. Levinthal С., Fisher A. Structural developmet of a bacteriae virus. Biochim. Biophys. Acta, 1952. - V. 9, № 4. - P. 419.

169. Linderberg R.B., Latta R.L. Phage typing of Ps.aeruginosa chinical and epi-demiologi considerations. // J. Infect. Diseases. 1974. - V. 130, № 5, - P. 32-34.

170. Lindgren S.W., Samuel J.E., Schmitt C.K., O'Brien A.D. Investigacion de Eschencha coli 0157:H7 en pacintes con gastroenteritis aduda. // Infect. Im-mun. 1994. - V. 62 - P. 623-631.

171. Luchansky John, Buege Dennis. Evaluation of colicins for inhibitory activaty against diarrheangenic Escherichia coli 0157:H7. // Meat fiid Poultry. 1998. -V. 44, №12. -P. 58-59.

172. Lyte Mark, Nguyen Kien T. Alteration of Escherichia coli 0157:H7 growth and molecular fingerprint by the neoroendocrine hormone noradrenaline. // Microbios. 1997. - V. 89, № 360. - P. 197-213.

173. MacDonald K.L, O'Leary M.J., Cohen M.L. Evaluation of the Colilert test for detection of Verotoxin -producing Escherichia coli 0157:H7 in water. // JAMA. 1988. - V. 259. - P. 3567 - 3570.

174. Mattar Salim, Mora Allyson, Bernal Nancy. Prevalencia de E. coli 0157: H7 en una poblacion pediatrica de Bogota D.C. con gaitroenteritis aguda. // En-ferm. infecc. у microbiol. clin. 1997. - V. 15, № 7. - P. 364-368.

175. McKee M.L., O'Brien A.D. Recent advances in verocytotoxin-prod. E.coli infections // Infect. Immun. 1996. -V. 64. - P. 2225 - 2233.

176. Mead Paul S., Griffin Patricia M. Eschenchia coli 0157:H7. // Lancet. 1998.- V. 352, №9135.-P. 1207-1212.

177. Mechie S.C., Chapman P.A., Siddons C.A. A fifteen month study of Escherichia coli 0157:H7 in a dairy herd. // Epidemiol, and Infec. 1997. - V. 118, № l.-P. 17-25.

178. Michels Christian Y., Bude Wido, Pfeiffer Rudolf Artur. Molecular typing of Eschenchia coli 0157:H7 isolates from cattle. // Dtsch. Arztebl. 1997. - V. 94. - P. 2435-2439

179. Moake J.L. Study of Escherichia coli 0157 in fourteen cattle herds. // Lancet.- 1994. V. 343. - P. 393 - 397.

180. Mobasseleh M., Gross S., McCluer R. Survival of Eschencha coli 0157:H7 fermented, dry sausage. // Gastroenterology. 1989. - V. 97. - P. 384 -391.

181. Mobassaleh M., Keusch G.T., Seall E. Recent advances in verocytotoxin-prod. E.coli infections / M.A.Karmali el al. Elsevier Sci. B.V., - 1994. - P. 159- 162.

182. Murphy F.A. Virus Taxonomy. Classification and Nomenclature of Viruses. // Spingerverlad Wien New York. 1995. - 586 c.

183. Nissen H., Halck A. Rasterelektronenmikroscopische Untersuchunge Haftung von Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes und Escherichia coli 0157:H7 an Edelstahlflaachen. Food Microbiol. 1998. - V.15, №3. - P. 273279.

184. Notermans S., Wernars K., Soentoro P.S., Dufrenne J., Jansen W. DNA hyr-bridization and latex agglutination for detection of heat- labile- and shig-liketoxin-producing Escherichia coli in meat. // Inf. J. Food Microboil. 1991. — V. 13, № 1.-P. 31-39.

185. O'Brier A.D., Karmali M.A., Scotland S.M. Recent advances in verocytotoxin-prod. E.coli infections / M.A.Karmali et al. Elsevier Sci. B.V., - 1994. -P. 147- 149.

186. Ohara-Nemoto Yuko, Kobayashi Masahiko, Kaneko Masaru. Enterohemor-rhagic Escherichia coli 0157:H7 episode in Japan with a perspective on vero toxins. // Kansenshogaku zasshi = J. Jap. Assoc. Ingec. Dieseases. 1997. -V. 71, № 12.-P. 1232-1237.

187. Orskov F., Orkov I., Villar J.F. Serotype 0157:H7 Escherichia coli from bovine and mead sources. // Lancet. 1987. - V. 2. - P. 276.

188. Oslik O., Strockbine NA. Diagnostic mol.microbiol. principles and applications / D.H. Persing et al. - Washington. - 1993. - P. 271 - 276.

189. Padhye Nisha V., Doyle Michael P. Rapid procedure for detecting entero-hemorrhagic Escherichia coli 0157:H7 in food. // Appl. and Environ. Microbiol. -1991. V. 57, № 9. - P. 2693-2698.

190. Paros M., Tarr P.I., Kirn H. Processing conditions affecting acid tolerance in Escherichia coli 0157:H7. // J. Infect. Dis. 1993. - V. 168. - P. 1300 - 1303.

191. Pohl P., Limbourg В., Stockmans A., Van Muylem K., Pierard D. Prevalence et caracteres des Escherichia coli 0157 isolees des bovins en Belgique. //Ann. med. vet. 1994. - V. 138, № 3. - P. 195-197.

192. Rice D.H., McMenamin K.M., Pritchett L.C., Hancock D.D., Besser Т.Е. Genetic subtyping of Escherichia coli 0157 isolates from 41 Pacific Northwest USA cattle farms. // Epidemiol, and Infec. 1999. - V. 122, № 3. - P. 479484.

193. Riley L.W., Remis R.S., Helgerson S.D. Enterohaemorrhagic Escherichia coli // New Engl. J. Med. 1983. - V. 308. - P. 681-685.

194. Robson W.L., Leung A.K., Brant R. Escherichia coli 0157:H7outbreak linked to commercially distributed dry cured salami.// Amer. J. Nephrol. -1993. -V. 3. -P. 194-197.

195. Robson W.L., Leung A.K., Kaplan B.S. Escherichia coli 0157:H7 the lesser known risk. // Curr. Probl. Pediat. 1993. - V. 23. - P. 16-33.

196. Robson W.L.M., Fick G.H., Jadavi T. Shiga-toxinproducing Escherichia coliare highly variable genetic elements. // Pediat. Nephrol. 1991. - V. 5. - P. 289-292.

197. Schalch Barbara, Stolle Andreas. Schnelle Untersuchung von rohem Fleisen auf das Vorliegen von E coli 0157. // Fleischwirtschaft. 2000. - V. 80, № 6, - P. 94-96.

198. Scotland S.M., Willshaw G.A., Smith H.R. Detection of serum and faecal antibodies in haemorrhagic caused by Escherichia coli 0157. // J. infect. Dis. -1990.-V. 162.-P. 1069-1074.

199. Shah Seema, Hoffman Richard, Shiliam Pam, Wilson Bruce. Prolonged fecal shedding of Escherichia coli 0157:H7 during an outbreak at a Day Care Cente.r // Clin. Infec. Diseases. 1996. - V. 23, № 4. - P. 835-836.

200. Shere J.A., Bartlett K.J., Kaspar C.W. Longitudian ctudy of Escherichia coli 0157:H7 dessemination on four dairy farms in Wisconsin. // Appl. and Environ. Microbiol. 1998. - V. 64, № 4. - P. 1390-1399.

201. Shinoda Sumio, Yamamoto Shigeo, Tomochika Kenichi, Miyoshi Shinichi. Инфекция, вызванная энтерогеморрагический Escherichia coli 0157:H7. // Jap. J. Toxicol, and Environ. Health. 1997. - V. 43, № 1. - P. 1-14.

202. Siddons C.A., Chapman P.A. Detection of serum and faecal antibodies in haemorrhagic colitis caused by Escherichia coli 0157 //J. Med. Microbiol. -1993. V. 39, № 6. - P. 408-415.

203. Siitonen A., Keskimaki M., Saari M. Characteristization of verizitotoxin-producing Escherichia coli 0157 isolates from patients with haemolytic uraemic syndrome in Western Europe. //Fortschrite der Med. (115) Monographic 84. - 1997. - P. 57.

204. Tesh V.L., Burns J.A., Owens J.W. Growth and processing conditions affecting acid tolerance in Escherichia coli 0157:H7. // Infect.Immun. 1993. - V. 61. - P. 3392-3402.

205. The Scotsman. Wachsmuth Escherichia coli in the United States. February2, 1997.

206. Tuttle J., Gomez Т., Doyle M.P., Wells J.G., Zhao Т., Tauxe P.V., Griffin P.M. Enterohemorrhagic Escherichia coli. // Epidemiol.fnd Infec., 1999. -V. 122,№2.-P. 185-192.

207. Twort F. Aninvestigstion on the nature of ultramucrose opic viruses. // Lancet. 1915.-V. 2, № 189.-P. 1241-1243.

208. Upton Pauline, Coia John E. Outbreak of Escherichia coli 0157 infection associated with pasteurised milk supply. // Lancet, 1994. - № 8928. - P. 1015.

209. Van Setten P.A., Verstraten H.C.G., Heuvel L.P.W.J. Recent advances in verocytotoxin-prod. E.coli infections / M.A.Karmali et al. Elsevier Sci. B.V.,- 1994.-P. 197-200.

210. Wadolkowaki E.A., Sung L.M., Burris J.A. Analysis of Escherichia coli 0157:H7 survival in ovine or bovine manure and manure slurry.// Infect, and Immun. 1990. -V. 58. - P. 3959-3965.

211. Wang H., Sharpe A.N. An imuno-capturing nd concentrating procedure for Escherichia coli 0157:H7 and its derection by epifluorescence microscopy. // Food Microbiol. 1998. - V. 15, № 6. - P. 559-565.

212. Watanabe T. The orig of R factors.-«Ann. N. Y. Acad. Sci.», 1971. - V. 176. - P. 126.

213. Watanabe H., Wada A., Inagaki Y. Outbreaks of enterohaemorrhagic Escherichia coli 0157-.H7 infection by two different genotype strains in Japan, 1996. // Lancet. 1996. - V. 348. - P. 831 - 832.

214. Waters John R., Sharp John C.M., Dev Vikram J. Infection caused by Escherichia coli 0157:H7 in Alberta, Canada, and in Scotland: A five-year review, 1987-1991. //Clin. Infec. Diseases. 1994.-V. 19, №5.

215. Whipp S.C., Rasmussen M.A., Cray W.C. Verotoxin producing Escherichia coli 0157 infections asociated with the consumption of yoghurt. // JAMA.1994.-V. 204.-P. 1168- 1175.

216. Whittam T.S., Wilson R.A. Analysis of the enterogemorrhagic Escherichia coli 0157 DNA region containing lambdoid phage gene p and Shiga-like toxin structural genes. // Infect. Immun. 1988. - V. 56. - P. 2467 - 2473

217. Wright D.J., Chapman P.A., Siddons C.A. Imunomagnetic separation as a sersitive method for isoiating Escherichia coli 0157 from food samples. // Epidemiol, and Infec. 1994. - V. 113, № 1. - P. 31-39.

218. Zadik P.M. Chapman P.A., Siddons C.A. Use of tellurite for the selection of verocytotoxigenic Escherichia coli 0157. // J. Med. Microbiol. 1998. - V. 39, № 2. - P.155-158.