Биологические свойства Escherichia coli серологических групп 01,0144 и 0157, регистрируемых как возбудители острых кишечных инфекций

Макарова, Мария Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биологические свойства Escherichia coli серологических групп 01,0144 и 0157, регистрируемых как возбудители острых кишечных инфекций
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биологические свойства Escherichia coli серологических групп 01,0144 и 0157, регистрируемых как возбудители острых кишечных инфекций"

На правах рукописи

МАКАРОВА Мария Александровна

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА Escherichia сой СЕРОЛОГИЧЕСКИХ ГРУПП Ol, 0144 И 0157, РЕГИСТРИРУЕМЫХ КАК ВОЗБУДИТЕЛИ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ

03 00 07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург - 2007

003173824

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель доктор медицинских наук

Нарвская Ольга Викторовна

Официальные оппоненты доктор медицинских наук, профессор

Тец Виктор Вениаминович

доктор медицинских наук, профессор

Сиволодский Евгений Петрович

Ведущая организация Федеральное государственное учреждение науки Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится б ноября 2007 года в _ часов на заседании

диссертационного совета Д 208 086 03 при ГОУВПО «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им ИИ Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (195067, Санкт-Петербург, Пискарёвский пр , д 47)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУВПО «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им ИИ Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Автореферат разослан «_»_2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук,

профессор

Бойцов А.Г

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Низкие темпы снижения заболеваемости эшерихиозами, увеличение числа серологических вариантов возбудителя, несущих генетические детерминанты вирулентности и резистентности к антибактериальным препаратам, значительная контаминация эшерихиями объектов окружающей среды представляют комплекс медико-социальных и экологических проблем

Согласно рекомендации ВОЗ Escherichia coli различных серологических групп и серовариантов, способные вызывать острые кишечные инфекции (ОКИ) у человека, называют диареегенными, в отличие от патогенных эшерихий - возбудителей заболеваний внекишечной локализации К числу последних относят уропатогенные для людей и патогенные для птиц штаммы эшерихий, в частности, Е coli Ol Kl (Barnes H , 2003, Vandemaele F , 2003, Ewers С , 2007)

За последние 20 лет перечень диареегенных эшерихий значительно пополнился представителями группы ЭГКП - энтерогеморрагических эшерихий (основной возбудитель - Е coli Ol 57 Н7), вызывающих тяжелое течение ОКИ и осложнения в виде гемолитико-уремического синдрома и почечной недостаточности (Levin М , 1987, Orth D , 2006, Степаншин Ю Г , 2005) В то же время, штаммы некоторых серологических групп эшерихий (например, Е coli 0144), ранее признанных возбудителями ОКИ, нередко выделяют и от практически здоровых лиц (Киселева Б С , 1975, Regina М , 1983, Kurazono Т , 2000, Rappelli Р, 2005)

В последние десятилетия установлено, что патогенные для человека Е coli отличаются от эшерихии - представителей нормальной микрофлоры кишечника наличием генов вирулентности в составе хромосомы, плазмид и бактериофагов Это определяет особенности эпидемиологии, патогенеза и клинических проявлений вызываемых заболеваний (Nataro J, 1998, Kobayashi К , 2002, Бондаренко ВМ, 2002, Johnson J , 2005) Однако результаты лабораторной диагностики, основанной на ограниченном числе фенотипических тестов, не позволяют с уверенностью оценить этиологическую значимость штаммов эшерихий с учетом их серологической принадлежности к определенной группе (варианту) или биовару

Накопленные данные свидетельствуют о необходимости углубленного изучения внутривидового разнообразия бактерий Е coli, определения факторов вирулентности или их генетических детерминант наряду с полным серологическим тонированием для окончательной идентификации эшерихий как возбудителей ОКИ ,

Цель исследования

Изучить биологические свойства штаммов Я coli серологических групп Ol, 0144 и Ol 57, циркулирующих на ряде территорий Северо-Западного Федерального округа, и оценить их этиологическую значимость при острых кишечных инфекциях

Задачи исследования

1 Выявить особенности этиологической структуры эшерихиозов на ряде территорий Северо-Западного Федерального округа

2 Изучить культуральные, биохимические и серологические свойства штаммов Е coli Ol, Ol44 и Ol57, выделенных от больных острыми кишечными инфекциями и здоровых лиц

3 Определить способность к инвазии и продукции токсинов у штаммов Е coli Ol, Ol44 и Ol57

4 Выявить у штаммов Е coli Ol, 0144 и 0157 генетические детерминанты, ассоциированные со способностью к адгезии, инвазии и токсинообразованию

5 Провести сравнительное изучение чувствительности к антибактериальным препаратам штаммов Е coli различных серологических групп - возбудителей острых кишечных инфекций и представителей нормальной микрофлоры кишечника

Личный вклад автора

Диссертация представляет собой анализ и обобщение результатов исследований, полученных автором лично В работах, выполненных в соавторстве, вклад автора является определяющим и заключается в исследовании биологических свойств эшерихий, обсуждении результатов в научных публикациях и докладах

Научная новизна

В основу работы положены обобщенные результаты исследований по изучению биологических свойств штаммов эшерихий, идентифицированных в практических лабораториях как возбудители ОКИ Итоги выполненных микробиологических, экспериментальных и молекулярно-генетических исследований позволили получить новые данные о гетерогенности популяции диареегенных эшерихий различных серологических групп

Дана комплексная характеристика основных биологических свойств и факторов патогенности штаммов эшерихий, циркулирующих в настоящее время, показана необходимость их использования, как важных критериев для обоснования этиологической значимости возбудителей ОКИ

Показано, что штаммы Е coh Ol, циркулирующие в последние годы, по антигенной структуре и наличию генов, контролирующих пиелонефрит-ассоциированные пили и продукцию аэробактина, принадлежат к высоко вирулентному для птиц и уропатогенному для человека серовару Е coli Ol K1 Н7

Выявлена циркуляция штаммов нового биовара 4 Е coh 0144, отличающегося от трех ранее известных ферментативными свойствами, серотиповой принадлежностью и отсутствием факторов патогенности, характерных для энтероинвазивных кишечных палочек (ЭИКП)

Впервые на территории Северо-Западного региона России показана циркуля-цияЕ coh 0157 Н7 и Е coh 0157 Н- - известных возбудителей группы ЭГКП Установлена неоднородность штаммов по комплексу факторов патогенности, серологическому варианту и генотипу

Установлено широкое распространение антибиотикорезистентноста у диарее-генных Е coli Результаты изучения репрезентативной коллекции штаммов дают углубленное представление о распространенности устойчивости и механизмах резистентности к Р-лактамным препаратам у представителей рода Escherichia

Практическая значимость

Установлено, что в настоящее время в качестве возбудителей ОКИ регистрируют штаммы Е coli серогрупп Ol и 0144, которые не содержат гены вирулентности диареегенных эшерихий

Показана диагностическая ценность определения серотиповой принадлежности и ведущих факторов патогенности диареегенных эшерихий При оценке этиологической значимости штаммов Е coli Ol и 0144, регистрируемых в настоящее время как возбудители ОКИ, необходимо подтверждение их принадлежности к конкретным био- и серовариантам

Детальная характеристика биологических свойств пггаммов Е coli Ol 57 позволила адекватно оценить наличие и состояние факторов патогенности представителей группы ЭГКП, впервые зарегистрированных на Северо-Западе России

Результаты изучения чувствительности к антибактериальным препаратам (АБП) возбудителей эшерихиозов позволили получить представление о механизмах формирования устойчивости, что может служить основой для коррекции фармакологического формуляра лечения данных заболеваний

Внедрение полученных результатов На основе полученных результатов разработаны методические указания «Особенности лабораторной диагностики эшери-

хиозов, обусловленных энтерогеморрагическими Е coli Ol 57 Н7» (МУК 4 2 01899 - СПб, 1999) Практическая значимость работы подтверждена использованием ее материалов в бактериологических лабораториях Санкт-Петербурга и Ленинградской области, а также в учебном процессе кафедр микробиологии ГОУВПО СПбГМА имени И И Мечникова Росздрава и эпидемиологии и дезинфектологии ГОУ ДПО СПб МАЛО Росздрава

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1 У штаммов Е coli Ol, регистрируемых в настоящее время как возбудители острых кишечных инфекций, отсутствует комплекс генетических детерминант вирулентности диареегенных эшерихий По антигенной структуре и набору факторов патогенности штаммы Е coli Ol Kl Н7 принадлежат к высоковирулентному для птиц серовару и могут рассматриваться как потенциально уропатогенные эше-рихии

2 Популяция Е coli 0144 в настоящее время представлена неинвазивными штаммами биовара 2 и нового биовара 4

3 Штаммы эшерихий серологической группы 0157, зарегистрированные как возбудители острых кишечных инфекций на Северо-Западе России, неоднородны по генотипу, продукции флагеллина и типу продуцируемых шига-подобных токсинов

4 Резистентность к антибактериальным препаратам встречается чаще в популяции диареегенных эшерихий, чем среди эшерихий - представителей нормальной микрофлоры кишечника

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология - XXI век» (Саратов, 2004), Заседаниях отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в Санкт-Петербурге и Ленинградской области (Санкт-Петербург 2004, 2005), Юбилейной научной конференции молодых ученых Северо-Западного региона (Санкт-Петербург, 2004), Всероссийской научной конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные вопросы инфекционной патологии-2005» (Санкт-Петербург, 2005), Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения» (Санкт-Петербург, 2005), Международном симпозиуме «Актуальные проблемы ан-тибиотикорезистентности и антибактериальной терапии инфекционных заболеваний» (Санкт-Петербург, 2006), 7ой международном научном конгрессе по инфек-

ционным заболеваниям стран Балтийского региона (Рига, 2006), IX международном Конгрессе MAKMAX/BSAC по антимикробной терапии (Москва, 2007)

Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 24 научные работы в 1999 - 2007 гг из них 3 в изданиях, рекомендованных ВАК

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, пять глав собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации, список литературы и приложение Работа иллюстрирована 24 таблицами, 18 рисунками и 10 фотографиями Список литературы содержит 235 источников, из них 110 отечественных и 125 иностранных авторов

Материалы и методы исследования

Работа выполнена в 1999-2007 гг в Санкт-Петербургском НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера Изучено 1334 штамма Ecoli, выделенных от больных ОКИ и здоровых лиц в клинико-диагностических лабораториях Санкт-Петербурга, Ленинградской области и др В том числе штаммов Е coli OI (200), Е colt 0144 (740), Е coli OI 57 (6), диареегенных Е coli серогрупп Об, 025, 032, 055, 075, Oil2, OI 19, OI24, 0127, 0128, OI52 (238), а также 150 штаммов Ecoli -представителей нормальной микрофлоры кишечника

Культуралыю-ферментативные и серологические свойства изучали у всех штаммов согласно МУ 04-723/3 МЗ СССР от 17 12 84 г и Приказу № 535 от 22 04 85 г Детекцию К1-антигена у штаммов Е с olí OI проводили с диагностическим набором «Пасторекс Менинго В IE coli OI», (Вю-Rad) Принадлежность 40 штаммов Е coli OI и 40 штаммов Е coli 0144 к определенной серологической группе/варианту определяли также с помощью анализа полиморфизма длин фрагментов рестрикции (RFLP) амплифицированных генов rfb и fliC, контролирующих синтез ЛПС и флагеллина жгутиков, соответственно Полученные паттерны рестрикции ДНК сравнивали с международной базой данных, используя пакет программ Taxotron® (Grimont Р, 2000, Coimbra R , Machado J , 2000)

Чувствительность к антибактериальным препаратам (АБП) 875 штаммов определяли в соответствии с МУК 4 12 1890-04 Использовали два метода диско-диффузионный в отношении (3-лактамных пенициллинов, цефалоспоршюв III-IV поколения, аминогликозидов, тетрациклина, левомицетина, хидалонов и фторхи-нолонов, фуразолидона и ко-тримоксазола, и метод серийных разведений в агаре

Продукцию ß-лактамаз подтверждали методом «двойных дисков» цефтазидим / цефотаксим и амоксиклав Наличие генов ß-лактамаз, относящихся к СТХ-М типу, а также мобильного генетического элемента ISEcpl определяли в ПЦР со специфическими праймерами (F X Weill, 2004) Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса (Takahashi S , 1984) Перенос плазмидной ДНК в Е coli DH10B проводили путем трансформации на аппарате MicroPulser™ (Bio-Rad)

Экспрессию генов вирулентности изучали у 284 штаммов Е coli Ol (121), Е coli 0144 (157), Е coli 0157 (6) Способность к инвазии определяли в пробе Ше-реня (Sereny В , 1957), продукцию энгеротоксинов термостабильного (ST) - на модели интрагастрального заражения мышей-сосунков (Dean A G, 1972), термолабильного (LT) - в тесте отека лапы белой мыши (Вартанян Ю Д, 1978) Продукцию шига-подобных токсинов (Shiga-like toxin I и II, Sit I и Sit II ), иначе называемых веро- токсинами (Vero-toxin I и И, VT1 и VT2) изучали в иммунохроматогра-фических экспресс-тестах Duopath®- Verotoxins, Merck (MP №24ФЦ/976, 2004)

У 106 штаммов методом ПЦР с наборами специфических праймеров определяли гены, кодирующие способность к адгезии (pap, aafl, sfa, afa, eae), инвазии (ipaH, iaT), токсинообразованию (hly, cnfl,2 , elt, LT-II-ген, ST- I, II -гены, sit I-II-гены), персистенции (aer) (Muhldorfer 1, 1994, Tamaki Y , 2005)

Генотипирование 21 штамма E coli Ol осуществляли методами риботипирова-ния и электрофореза в пульсирующем электрическом поле (PFGE) (Grunont Р, 1998, Maslow J et al, 1993) Для штаммов Е coli Ol 57 использовали метод ПЦР с универсальными праймерами №45 и №115 (УП-ПЦР) (Булат С А идр 1992)

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Microsoft Excel-2000 Количественные данные оценивали, используя выборочные параметры М - среднее, ш - ошибка среднего, п - объём анализируемой подгруппы, р - достигнутый уровень значимости Статистически значимыми считали различия при доверительном интервале 95% (р <0,05)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В 2003-2006 гг в Санкт-Петербурге и Ленинградской области отмечена циркуляция эшерихий 36 серогрупп Практически 90% расшифрованных эшерихиозов были обусловлены Е coli Ol, Об, 018ас, 026, 029, 055, 075, 0112ас, 0124, 0143 и 0144, однако их доли в этиологической структуре значительно варьировали от 40,3% до 1,5% (Таблица 1) Доля штаммов Е coli Ol и 0144 в Санкт-Петербурге и в Ленинградской области составляла 39,2%, и 66,1%, соответственно

Таблица 1

Десять серогрупп Е. coli, наиболее часто выделявшихся от людей в 2003-2006 гг.

Санкт-Петербург Ленинградская область

с ер о группа абс % серо группа абс %

Об 2722 30,4 О! 939 40,3

0144 2158 24,1 Ol 44 603 25,8

Ol 1351 15,1 Ol 51 113 4,8

029 551 6,2 Ol 24 85 3,6

075 294 3,3 06 76 3,2

Ol 24 178 2,0 Olli 56 2,5

026 154 1,7 О 26 56 2,5

OlSac 153 1,7 Ol 8ac 55 2,4

ОЩае 149 1,6 055 55 2,4

Ol 43 130 1,5 075 46 1,9

Всего 10 серогрупп 7840 87,6 Всего 10 серогрупп 2084 89,4

Всего 26 серогрупп 1110 12,4 Всего 22 серогрупго.т 246 10,6

Итого 36 серогрупп 8950 100,0 Итого 32 серо группы 2330 100,0

Эпидемиологической особенностью зщерихяозов, обусловленных F.. coli Ol и OI44, является раснрострапешюсть жих микроорганизмов среди здоровых лиц, обследованных с профилактической целью (60,7% в Санкт-Петербурге и 52,1% в Ленинградской области), что в 2-3 раза превышает их находки у больных ОКИ и у лиц, обследованных но контакту с ОКИ (Рисунок I),

10(1 -.....

60,7

¡31,4|

Я2,7

19,0

рщ £

Свикт-Штербург Лен. область

□ липа, обследованные с профилактической целью

Шлица, обследованные по контакту с больными ОКИ

И больные ОКИ

Рисунок 1. Распределение штаммов Е. coli Ol и Е. coli OI44, выделенных в 20032006 гг., гю 1рупнам обследованных лиц

Учитывая широкую распространенность Е coli Ol и Ol44 среди населения на отмеченных территориях, далее в работе были изучены основные биологические свойства и факторы патогенности, позволяющие оценить этиологическую значимость представителей этих cepoipyim эшерихий в развитии ОКИ Биологические свойства Е. coli Ol

Все изученные штаммы Е coli Ol (n = 200) были неподвижны, обладали антигеном К1, по ферментативным свойствам принадлежали «биохимовару» 7, широко распространенному в нашей стране в 70-е годы прошлого столетия (Новгородская Э М, 1972, Сафонова Н В , 1972, Киселёва Б С , 1973, Дробышевская Э И , 1977) Е coli Ol Kl Н- были неиивазивны (не вызывали кератоконъюнктивит у морской свинки), не обладали гемолизирующей активностью, не продуцировали энтероток-сины LT и ST (в тесте отёка лапы белой мыши и в инграгастральной пробе на мышах-сосунках) и шига-подобные токсины VT1 и VT2

Методом RFLP амплифицировашюго участка гена fliC, кодирующего продукцию Н-антигена, у 40 штаммов Е coli Ol Kl Н- выявлены профили рестрикции fliC типа F7, характерные для эшерихий, имеющих антиген Н7 Таким образом, изученные штаммы имели антигенную формулу Е coli Ol Kl Н- F7

Ни у одного штамма не выявлены гены, кодирующие способность к адгезии (afa, sfa, eae, aaj), инвазии (tal, ipaH), продукции гемолизина (hly), к синтезу энте-ротоксинов LT и ST, шига-подобных токсинов VT1 и VT2, а также цитонекротиче-ского фактора CNF 1 и CNF 2, наличие которых характерно для диареегенных эшерихий В то же время, ПЦР-анализ показал, что в геноме всех изученных штаммов Е coli Ol присутствовали гены, присущие уропатогенным эшерихиям рар, кодирующий пиелонефрит - ассоциированные пили (Р пили) и аег, ответственный за продукцию аэробактина (Таблица 2)

Для ответа на вопрос о сходстве Е coli Ol, выделенных от здоровых и больных ОКИ, проведено генотипирование 21 штамма методами риботипирования и электрофореза в пульсирующем электрическом поле (PFGE) Все штаммы Е coli Ol имели идентичные профили риботипирования По данным PFGE большинство изученных штаммов принадлежали к двум близкородственным генотипам, условно обозначенным «1» и «2» К генотипу «1» были отнесены 12 (57,0%) штаммов, а к генотипу «2» - 7 (33,3%) Штаммы каждого из двух генотипов выделяли как от больных ОКИ, так и от здоровых лиц Два штамма имели индивидуальные PFGE -профили (генотипы «3» и «4») Кроме того, эти штаммы отличались от остальных полирезистентностью к АБП и продукцией ß-лактамаз

Таблица 2

Характеристика штаммов Е coli Ol, Е coli 144 и Е coli 0157_

Признак (ген) Е coli

0144 К Н- F30 0144 К Н25 (п=37) 0144 К Н4 0144 К Н- F? (п=120) Ol Kl Н- F7 (п=121) Ol 57 Н7 Ol 57 Н- F7 (п=5) Ol57 НЮ (п=1)

Адгезия Р-пили (рар) - - + -

S-фимбрии (s/a) - - - - -

Афимбриальные адгезины (afa) - - - - -

Интимин (еае) - - - + -

Аггрегативно-адгезивные фимбрии I (aaf/I) - - - - -

Инвазия Ген инвазивности (ipall, плазмида) + - - - -

Ген инвазивности (tal, хромосома) + - - - -

Кератоконъюнктивит у морских свинок + - - - -

Токсинообразование а-гемолизин (hfy) Гемолиз эритроцитов барана : : — : —

Цитонекротический фактор 1-2 (cnfl-2) - - - - -

Термолабильный энтеротоксин I-II (eh I- 1Г) Тест отека лапы белой мыши — — — — —

Термостабильный энтеротоксин I-II (ST-I-II) Интрагастральная проба на мышах сосунках — — — —

Шига-подобный токсин I-II (slt-1-II) Иммунохроматографический тест - — _ + + —

* Продукция аэробактина (аег) - - + - -

* - факторы персистенции, «+»- ген присутствует /есть экспрессия гена, « — »- ген отсутствует / нет экспрессии гена

Таким образом, полученные данные свидетельствуют об однородности изученных штаммов Е coli Ol по антигенной структуре и принадлежности к биовару В то же время, они различались по генотипу Отсутствие у штаммов Е coli Ol генов вирулентности, ассоциированных с диареегешюстью, не позволяет считать их истинными возбудителями ОКИ человека Известно, что штаммы Е coli Ol Kl Н7, имеющие Р-пили и продуцирующие аэробактин, являются высоко вирулентными для птиц, вызывая у них колисептицемию, а у человека они способны к длительной персистенции в кишечнике без развития специфического патологического процесса и могут быть потенциальными возбудителями урологических заболеваний Биологические свойства Е. coli 0144

В настоящее время известны три биоварианта Е coli Ol 44, различающиеся по ферментативным свойствам и принадлежности к серовару К биовару 1 относится неподвижный серовар Е coli Ol 44 К Н- К биовару 2 принадлежат подвижные штаммы Е coli Ol 44 К Н4, третий биовар включает два серовара Е coli 0144 К Н18 и Е coli 0144 К Н25 В 70-х годах прошлого столетия было известно, что из перечисленных сероваров, только штаммы биовара 2 (Е coli 0144 К Н4) не способны к внутриэпителиальной инвазии и не вызывают кератоконьюнктивит у морских свинок (Новгородская ЭМ, 1973, Киселёва Б С , 1973) Штаммы биова-ров 1 и 3 (лабораторная коллекция), выделенные 1968-1974 гг от больных «дизен-териеподобными» заболеваниями, обладали генами инвазивности (ipaH и ial) и закономерно вызывали кератоконьюнктивит у морских свинок, полностью соответствуя по этой характеристике группе ЭИКП

Среди изученных Е coli 0144 (п= 500), выделенных в последние десять лет, не были обнаружены штаммы биоваров 1 и 3, «классические» ЭИКП К биовару 2 были отнесены 15% подвижных штаммов, которые имели антиген Н4 Остальные 85% были неподвижны, как и штаммы биовара 1, а по ферментативным свойствам они отличались от известных биоваров В пробе Шереня ни один из этих штаммов не вызывал кератоконьюнктивит (КК), также как и штаммы биовара 2 серовара Е coli 0144 К Н4 Полученные данные позволили выделить такие штаммы в отдельный биовар 4 (Таблица 3) Для решения вопроса о принадлежности штаммов этого биовара к группе ЭИКП проведено детальное изучение их серотиповой принадлежности и факторов вирулентности Идентифицировать серовар не удалось ни классическим бактериологическим, ни молекулярно-генетическими методами

Штаммы биовара 4 имели одинаковые профили рестрикции гена fliC Этот профиль не соответствовал ни одному го известных профилей fliC— гена, контролирующего синтез флагеллина эшерихий (антигена HI -Н56) (Machado J , 2000)

Таблица 3

Характеристика штаммов различных биоваров Е coli Ol 44

Биовар Серовар Подвижность 1 fliC-теа Ферментация Проба Шереня Гены инвазивности (ipaH, tal)

Н-тип F-тип Глюкоза (газ) Лактоза Дульцит Сорбит Салицин Лизин

1 0144 К Н- - 30 30 - (+) - - - - + +

2 0144 К Н4 + 4 4Ь + + - +/(+) (+) + - -

3 0144КН18 + + 18 25 18 25Ь + - (+) (+) -/(+) - + +

0144 К 1125

4 0144 К Н - - ? ? + (+) - + - + - -

«+» - подвижный / ферментирует субстрат на первые сутки / вызывает КК,

«-» - неподвижный / не ферментирует субстрат в течение 21 суток / не вызывает КК,

«(+)» - замедленная ферментация субстрата на 2-10 сутки,

«?» - индивидуальные профили рестрикции амплифицированного гена fltC

У циркулирующих в настоящее время штаммов Е coli 0144 биоваров 2 и 4 не были обнаружены плазмидные (ipalF) и хромосомные (га/) гены инвазивности, что объясняет отрицательный результат в пробе Шереня Кроме того, данные штаммы бьиш лишены и других изученных генов вирулентности (Таблица 2, 3)

Таким образом, бактерии Е coli Ol 44, регистрируемые в настоящее время как возбудители ОКИ, представляют неоднородную группу, включающую штаммы Е coli Ol 44 К Н4 F4b (биовар 2) и Е coli 0144 К Н- F*> (биовар 4) У этих штаммов отсутствуют гены, контролирующие основные факторы вирулентности, характерные для диареегенных эшерихий Биологические свойства Е. coli 0157

Эшерихиозы, протекающие с гемоколитическим синдромом, вызывают представители группы диареегенных эшерихий - ЭГКП Основными критериями, позволяющими отнести эшерихии к группе ЭГКП, является продукция шига-подобных токсинов или индикация их генов Наиболее яркий представитель этой группы -Е coli 0157 Н7 (Riley L М, 1983, Gransden W R , 1986, Griffin Р М , 1995)

Надзор за циркуляцией Е coli Ol 57 Н7 в Северо-Западном регионе России ведётся с 1999 г, однако лишь в Вологде и Санкт-Петербурге были зарегистрирова-

ны шесть спорадических случаев эшерихиозов, обусловленных Е coli Ol 57 Пять штаммов выделены от детей с диагнозом ОКИ, один - от взрослого без клинических проявлений ОКИ Два из пяти штаммов Е coli Ol 57, выделенных от детей, имели антиген Н7, остальные были неподвижны Вместе с тем, методом ПЦР со специфическими праймерами к fliC^7> у неподвижных штаммов было выявлено присутствие гена, контролирующего синтез антигена Н7, что подтверждало генетическую принадлежность этих штаммов к серовару Е coli 0157 Н7 (Е coli 0157 Н- F7) С помощью иммунохроматографического теста и ПЦР у четырех из пяти штаммов, выделенных от детей, выявлена продукция шига-подобных токсинов VT1 и VT2 и присутствие контролирующих генов (sit I и sit II) Штамм, выделенный от ребёнка с диагнозом «энтероколит, осложненный гемолитико-уремическим синдромом», продуцировал только VT2 и имел ген sit II Методом ПЦР со специфическими праймерами у всех пяти штаммов было идентифицировано присутствие гена белка интимина (еде), участвующего в процессе адгезии (Таблица 2)

Штамм, выделенный от пациента без клинических симптомов ОКИ, обследованного с профилактической целью, принадлежал к другому серотипу Е coli Ol57 НЮ и не имел детерминант вирулентности Генотипирование методом УП-ПЦР штаммов серогруппы Ol 57 подтвердило полученные данные штаммы Е coli Ol 57 Н7 (п = 2) имели идентичные профили УП-ПЦР, которые отличались от профиля УП-ПЦР Е coli Ol 57 Н- F7 (п = 3) и профиля штамма Е coli 0157 НЮ

Случаи регистрации в Северо-Западном регионе России эшерихиоза, обусловленного Е coli Ol57, и возможное наличие резервуара возбудителя среди сельскохозяйственных животных требуют совершенствования лабораторной диагностики возбудителя с учетом неоднородности популяции микроорганизмов группы ЭГКП Отношение к антибактериальным препаратам

Чувствительность к АБП изучена у 875 штаммов Устойчивыми к одному или нескольким АБП оказались 25,6% штаммов Наибольшее число штаммов проявляло резистентность к ампициллину (17,8%), наименьшее - к ко-тримоксазолу (0,7 %) К нитрофуранам, ко-тримоксазолу и ципрофлоксацину сохраняли чувствительность 99% и более всех изученных штаммов Только к полимиксину и меропенему не было выявлено резистентности (Рисунок 2)

Для лучшего представления особенностей формирования резистентности к АБП, штаммы были условно разделены на 4 группы 1 - Е coli Ol (200 штаммов), 2-Е coli Ol 44 (281), 3 - диареегенные Е coli 12 серогрупп (244), 4 - включала 150 штаммов Е coli - представителей нормальной микрофлоры здоровых лиц

ампициллин ■■ -амоксиклав цефотаксим цефтазидим иеропенсн ка намицин гентамшин ГоСрэмицин аника цин тетрациклин ле вомицатин налидиксовая к-та ципро флокса цмн фуразо-пидоч полнымссин ко-тримоксаэол все го

Рисунок 2. Резистентность штаммов Е. coli к антибактериальным препаратам

Резистентные штаммы обнаружены во всех четырёх группах. К ¡3- лактамным антибиотикам резистентность встречалась среди штаммов всех четырех групп, наиболее выражена она была к ампициллин;'. Доля штаммов Е coli Ol и 0144, резистентных к ампициллину, была невысока (3,5-3,6%). В популяции диарсстешшх Е. coli практически каждый второй штамм продуцировал пенициллиназу (45,5%). а среди представителей нормальной микрофлоры такие штаммы встречались в 2,4 раза реже и составляли 18,7% (р <0,05). Достоверно чаще штаммы, резистентные к цефалоспоринам 111 поколения, продуцирующие ß-л актам азы расширенного спектра (БЛРС), встречались в группе диареегешгых эшерихий (Таблица 4). Единичные штаммы, цродушрующис БЛРС, были выявлены среди Е, coli Ol и среди Е. coli -представителей нормальной микрофлоры. 13ее штаммы, резистентные к цефалое-поринам III поколения, характеризовались ко-резиетентностью к нелактамным АВП. У двух штаммов Е. coli Ol, резистентных к цефотдкеиму, но чувствительных к де фтаз ид им у, методом ПЦР обнаружены Ыа- гены, кодирующие ß-лактамазы класса СТХ-М группы СТХ-М1 в составе илазмиды 128 kb.

Таблица 4

Отношение штаммов Е coli к ß - лактамным препаратам

ß -лактамный препарат R/S Е coli Итого ( п=875)

Ol (n=200) 0144 (п=281) диареегенные (п=244) нормальная микрофлора (п=150)

ампициллин R 3,5±1,3 3,6±1,1 45,5±3,2 18,7±3,2 17,8±1,3

S 96,5±1,3 96,4±1,1 54,5±3,2 79,3±3,2 81,8±1,3

амоксиклав R 2,0±1,0 0,7±0,5 5,7±1,5 3,3±1,5 2,9±0,6

S 98,0±1,0 99,3±0,5 94,3±1,5 96,7±1,5 97,1±0,6

цефотаксим R 1,0±0,7 0,0±1,4 12,3±2,1 2,0±1,1 4,0±0,7

S 99,0±0,7 100±1,4 87,7±2,1 98,0±1,1 96,0±0,7

цефтазидим R 0,0±2,0 0,0±1,4 10,2±1,9 1,3±0,9 3,1±0,6

S 100±2,0 100±1,4 89,6±1,9 98,7±0,9 96,9±0,6

R - резистентные, S - чувствительные,

Именно эти штаммы по данным PFGE имели генотипы «3» и «4» Среди диа-реегенных штаммов Е coli резистентных к гентамицину было 20,5%, к тобрамици-ну - 9,8%, к канамицину и амикацину - 6,6% и 6,1%, соответственно Число резистентных к этим препаратам штаммов не превышало 2,0% среди Е coli - представителей нормальной микрофлоры кишечника и Е coli Ol Штаммы Е coli Ol44 были чувствительны ко всем упомянутым препаратам Резистентными к тетрациклину и левомицетину были 31,1% и 27,5% штаммов диареегенных эшерихий, соответственно Обращает на себя внимание относительно высокий процент резистентных к тетрациклину штаммов Е coli - представителей нормальной микрофлоры (24,0%) Напротив, доля резистентных к тетрациклину штаммов Е coli Ol и 0144 не превышала 3,6% Из 281 штамма Е coli 0144 резистентным к левомицетину оказался лишь один штамм

К препаратам группы хинолонов/фторхинолонов были чувствительны более 90% штаммов Уровень резистентности к налидиксовой кислоте в группах диареегенных эшерихий и представителей нормальной микрофлоры составлял 7,4% и 6,0%, соответственно, и превышал таковой к ципрофлоксацину в 5-8 раз

Таким образом, резистентность к АБП была выявлена у 25,6% всех изученных штаммов эшерихий, из них на долю диареегенных эшерихий 12 серогрупп приходилось 55,0% В отличие от них доля резистентных штаммов Е coli Ol и Ol 44, регистрируемых в настоящее время как возбудители ОКИ, составляла 6,5% и 8,2%, соответственно Полученные результаты свидетельствуют, что диареегенные эше-

рихии более активно вырабатывают БЛРС и проявляют резистентность к фторхи-нолонам - препаратам выбора для лечения больных ОКИ

Выводы

1 В Санкт-Петербурге и Ленинградской области Е coli Ol и Е coli Ol 44 чаще выделялись от здоровых лиц, чем от больных острыми кишечными инфекциями

2 Штаммы Е coli 01, не имеющие генов вирулентности диареегенных эшерихий, не могут рассматриваться как истинные возбудители эшерихиозов Циркулирующие в настоящее время в Санкт-Петербурге и Ленинградской области £ coli 01 по антигенной характеристике и наличию генов рар и аег идентичны уропатогенным для человека и высоковирулентным для птиц штаммам Е coli 01 Kl Н7

3 Популяция штаммов Е coli 0144 гетерогенна по основному фактору патогенно-сти энтероинвазивных эшерихий - способности к инвазии Эта серогруппа включает серовары, способные вызывать острые кишечные инфекции у людей, а также серо-вары, у которых отсутствуют факторы патогенности диареегенных эшерихий

4 Е coli Ol44, регистрируемые в настоящее время как возбудители ОКИ, принадлежат к двум сероварам 15% - Е coli 0144КН4 (биовар 2) и 85% - Е coli Ol 44 К Н- F? Штаммы Е coli Ol 44 К Н- F? отличаются от ранее известных бива-ров 1 - 3 и могут быть отнесены к новому биовару 4 У штаммов биоваров 2 и 4 не обнаружены плазмидные (iраН) и хромосомные (шГ) гены инвазивности, а также другие факторы патогешюсти, характерные для диареегенных эшерихий

5 Установлена принадлежность штаммов Е coli Ol57, выделенных на Северо-Западе РФ, к сероварам 0157 Н7, 0157 Н-, 0157 НЮ, которые различались по генотипу и способности к продукции шига-подобных токсинов

6 Резистентность к антибактериальным препаратам различных фармакологических групп выявлена у 25,6% штаммов Е coli независимо от их серологической принадлежности, наличия генов вирулентности и источников выделения Штаммы, резистентные к ß-лактамным антибиотикам и продуцирующие ß-лактамазы расширенного спектра, преобладали среди диареегенных эшерихий, по сравнению со штаммами Е coli Ol, 0144 и эшерихиями нормальной микрофлоры кишечника

Практические рекомендации

Для повышения эффективности бактериологической диагностики эшерихиозов, вызванных!? coli Ol, £ cohOl44,E coli Ol 57 и других серогрупп, целесообразно - идентифицировать штаммы до уровня серовара (определять О- К- Н- антигены) и биовара для подтверждения этиологического диагноза эшерихиозов,

- внедрить в практику работы клинико-диагностических и бактериологических лабораторий быстрые методы определения антигенного комплекса и факторов пато-генности штаммов диареегенных эшерихий, основанные на применении ПЦР,

- проводить серотипирование штаммов Е coli, выделяемых при проведении сани-тарно-микробиологических исследований пищевых продуктов, водных ресурсов и факторов окружающей среды,

- ввести в практику эпидемиологического надзора за эшерихиозами слежение за циркуляцией известных серотипов конкретных серологических групп эшерихий (ферменговаров, биоваров, генотипов и др ),

- создать систему динамического слежения за циркуляцией возбудителей эшери-хиозов общих для человека и животных в рамках единого надзора,

- проводить мониторинг аетибиотикорезиетенгности штаммов эшерихий, выделенных из различных по эпидемиологической характеристике источников,

- для определения биоваров на основании замедленной ферментативной активности следует использовать «жидкие» питательные среды,

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Макарова M А Особенности лабораторной диагностики эшерихиозов, обусловленных энтерогеморрагическими Е coli Ol 57 Н7 / Л А Кафтырева, Е В Вой-тенкова, H И Губина, M А Макарова [и др ] И Методические указания 4 2 018-99 -СПб, 1999-19 с

2. Макарова M А Первые находки энтерогеморрагических эшерихий серогруппы Ol57 на территориях Северо-Западного региона / Л А Кафтырева, M А Макарова, [и др ] // «Детские инфекции на рубеже XXI века настоящее и будущее» материалы Всерос науч -практ конф - СПб, 1999 - С 45

3 Makarova M First findings of enterohemorragic E coll О 157 m Northwestern Russia / L Kaftyreva, E Voitenkova, M Makarova // Colloque scientifique de la reunion du 26 Conseil des directeurs des Instituts Pasteur et associes -Paris, 1999 -P 20

4 Makarova M Biological and genetic properties of E coli 0157 firstly isolated m North-Western of Russia / L Kaftyreva, G Shipulin, M Makarova // 10th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases - Sweeden, - 2000 - P 26

5 Makarova M Bacterial resistance monitoring of enteric pathogens / L Kaftyreva, E Voitenkova, Z Matveeva, M Makarova // Combating infectious diseases m the Baltic Sea and Barents Regions International meeting - Sweeden, 2000 - P 54-55

6 Макарова MA Выделение энтерогеморрагических Ecoli Ol 57 от больных острыми кишечными инфекциями / Л А Кафтырева, Е В Войтенкова, 3 H Матвеева, M А Макарова // Эпидемиологический надзор и социально-гигиенический мониторинг -Москва, 2002 - С 37-38

7 Макарова MA Характеристика популяции энтерогеморрагических эшерихий серогруппы Ol57 / Л А Кафтырева, MA Макарова [и др ] // «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы» материалы междунар конгресса -СПб, 2003 -С 109

8 Макарова М А Антибиотикорезистептность гемолизирующих эшерихий у детей с дисбиотическими нарушениями микрофлоры кишечника / Э С Лавренева, Л А Кафтырева, М А Макарова // «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы» материалы междунар конгресса - СПб , 2003 - С 113

9 Макарова МА Проблемы лабораторной диагностики энтерогеморрагических эшерихий серо группы Ol 57 / М А Макарова [и др ] // Современные средства иммунодиагностики, иммуно- и экстренной профилактики актуальных инфекций труды науч конф с междунар участием - СПб , 2004 -С 237-238

10 Макарова МА Использование методов молекулярной микробиологии для идентификации энтерогеморрагических Е coli Ol 57 / М А Макарова [и др ] // «Медицинская микробиология -XXI век» материалы Всерос науч -пракг конф - Саратов, 2004 -С 138-140

11 Макарова М А Идентификация факторов патогенности энтерогеморрагических Е coli Ol 57 методами молекулярной микробиологии / М А. Макарова // Медицинский академический журнал -СПб, 2004 -Т4, №3 - Прил 5 -С 51

12 Макарова МА Идентификация факторов патогешюсти у диареегешшх энте-рошшазивных Е coli 0144 / М А Макарова // «Санкт-Петербургские научные чтения» тезисы докладов междунар молодёжного конгресса - СПб, 2005 - С 74

13 Макарова М А Чувствительность к антибактериальным препаратам Е coli -возбудителей острых кишечных заболеваний у пациентов детского и взрослого возраста / М А Макарова [и др ] // «Антимикробная терапия» тезисы докладов VII Международной конференции МАКМАХ -Москва, 2005 -С 41

14 Макарова М А Резистентность к антибактериальным препаратам диареегенных Е coli, выделенных от больных и здоровых лиц / М А Макарова [и др ] // «Инфекционные болезни проблемы здравоохранения и военной медицины» материалы Российской науч -практ конф - СПб , 2006 - С 200

15 Макарова МА Резистентность к антибактериальным препаратам патогенных энтеробактерий в Санкт-Петербурге за период 2002-2005 гг / Л Ю Петрова, В Н Алексеенко, Л А Кафтырева, Т И Шестакова, Н М Абакумова, Л Г Григорьева, С А Егорова, М А Макарова [и др ] // «Инфекционные болезни проблемы здравоохранения и военной медицины проблемы здравоохранения и военной медицины» материалы Российской науч -практ конф - СПб , 2006 - С 244

16 Макарова М А Гетерогенность популяции Е coli Ol по антигенным свойствам и факторам вирулентности / МЛ Макарова II «Актуальные вопросы инфекционной патологии - 2006» материалы Всерос науч конф молодых ученых с междунар участием - СПб, 2006 -С 31

17 Makarova М The mechanism of resistance to extended-spectrum ß-lactams among diarrheagemc E coli Ol / M Makarova // 7th Nordic-Baltic Congress on Infectious Diseases -Latvia, Riga, 2006 -P 38

18 Макарова MA Резистентность к антимикробным препаратам штаммов Е coli, принадлежащих к различным группам / М А Макарова [и др ] // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия — М, 2007 - Том 9 -№2 - С 29-30

19 Макарова МА Механизмы резистентности к цефалоспоринам расширенного спектра эшерихий серологической группы Ol / МА Макарова // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия - М, 2007 - Том 9 -№ 2 - С 30

20 Макарова М А Изучение факторов патогенности клинических штаммов энте-робактерий Особенности этиологической роли Klebsiella pneumoniae при острых кишечных инфекциях и дисбиотических состояниях желудочно-кишечного тракта / С А Егорова, М А Макарова [и др ] // «Актуальные вопросы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия Ленинградской области» матнауч прак-тич конф , посвящ 85-летию Гос сан эпид службы - СПб , 2007 -С 233-238

21 Макарова М А Особенности лабораторной диагностики Е coli 0144, циркулирующих на территории Северо-Западного Федерального округа / Л А Кафтырева, М АМакарова [и др ] // «Актуальные вопросы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия Ленинградской области» матнауч практич конф, посвящ 85-летию Гос сан эпид службы - СПб, 2007 - С 222-225

22 Макарова М А Некоторые аспекты дисбактериоза кишечника и чувствительности к антибактериальным препаратам представителей факультативной микрофлоры / С А Егорова, М А Макарова [и др ] П «Современные проблемы медицинской микробиологии» материалыВсерос науч конф - СПб,2007 - С 190-192

23 Макарова М А Возможности применения цефалоспоринов IV поколения, «защищенных» ß-лактамов и карбапенемов для лечения инфекций, вызванных штаммами энтеробактерий, продуцирующих ß-лактамазы расширенного спектра (БЛРС) / С А Егорова, М А. Макарова [и др ] // «Современные проблемы медицинской микробиочогии» материалы Всерос науч конф - СПб, 2007 -С 192-194

24 Макарова М А Характеристика биологических свойств штаммов Е coli Ol 44 / М А Макарова [и др ] // «Современные проблемы медицинской микробиологии» материалы Всерос науч конф - СПб, 2007 - С 216-218

Список сокращений

АБП - антибактериальные препараты

БЛРС - р- лактамазы расширенного спектра

КК - кератоконъюнктивит

ЛПС- липополисахарид

ОКИ - острые кишечные инфекции

УП-ПЦР - полимеразная цепная реакция с универсальными праймерами

ЭГКП - энгерогеморрагические кишечные палочки

ЭИКП — энтероинвазивные кишечные палочки

ЬТ - термолабильный энтеротоксин

БТ - термостабильный энтеротоксин

VI - веротоксин