Создание и разработка схем применения диагностических биопрепаратов на основе выделенных и изученных бактериофагов энтеробактерий

Золотухин, Сергей Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Создание и разработка схем применения диагностических биопрепаратов на основе выделенных и изученных бактериофагов энтеробактерий
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Создание и разработка схем применения диагностических биопрепаратов на основе выделенных и изученных бактериофагов энтеробактерий"

На правах рукописи

111111111

003056107

ЗОЛОТУХИН СЕРГЕЙ НИКОЛАЕВИЧ ----

СОЗДАНИЕ И РАЗРАБОТКА СХЕМ ПРИМЕНЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ БИОПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ВЫДЕЛЕННЫХ И ИЗУЧЕННЫХ БАКТЕРИОФАГОВ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ

03.00.23 - биотехнология 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Ульяновск - 2007

Работа выполнена в лабораториях кафедры микробиологии, вирусологии,

эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы

ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия»

Научные консультанты: доктор биологических наук, профессор

ВАСИЛЬЕВ ДМИТРИЙ АРКАДЬЕВИЧ

доктор ветеринарных наук, профессор КАВРУК ЛЕОНИД СЕРГЕЕВИЧ

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, ст. научн. сотрудник

ИГНАТОВ ОЛЕГ ВЛАДИМИРОВИЧ

доктор биологических наук, профессор ЕЖКОВА ГАЛИНА ОЛЕГОВНА

доктор медицинских наук, профессор ШВИДЕНКО ИННА ГРИГОРЬЕВНА

Ведущая организация: Московский государственный университет

прикладной биотехнологии

Защита состоится 27 апреля 2007 года в 9 ш часов на заседании диссертационного совета Д 220.065.01 при ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия» по адресу: 432980, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1; тел. 44-30-58.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия»

Автореферат разослан «_ ¿м » 2007 года.

Ученый секретарь _

диссертационного совета кПыхтина Лидия Андреевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Всесторонние исследования по изучению бактериофагов, выполненные за последние 40-45 лет, позволили широко использовать их для решения многих задач в микробиологии, вирусологии, генетике, биохимии, иммунологии, радиобиологии, биотехнологии и других областях биологических исследований. Поэтому учение о фагах, развивающееся вначале как узкая область медицинской и ветеринарной микробиологии, в настоящее время приобрела общебиологическое значение.

Однако, несмотря на накопленный большой научный материал по изучению биологических свойств бактериофагов, многие вопросы требуют дополнительных исследований. Так, например, у большинства, как считалось ранее, глубоко изученных модельных эшерихиозных фагов Т-серии, так и не удалось выяснить функцию двух третей синтезируемых ими продуктов (В.Н. Крылов, 2003). До сих пор нет единой схемы таксономии и морфологической классификации этих микроорганизмов, отсутствуют стандартные наборы бактериофагов многих возбудителей заболеваний животных и человека, а также схемы и регламенты их применения (В. С. Русалеев, 1990).

В последние годы, благодаря работам многих отечественных и зарубежных исследователей, расширилось представление об этиологической роли условно-патогенных бактерий семейства Enterobacteriaceae в патологии животных и человека. Энтеробактерии широко распространены в природе, и большая часть их часто обитает в составе нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта животных и человека. Эти микроорганизмы способны вызывать у жи-

вотных и людей как самостоятельные заболевания (эшерихиоз, иерсиниоз, клебсиеллезную и моганеллезную инфекцию и др.), так и в ассоциации с другими микробами различные воспалительные процессы (нагноение ран, абсцессы, маститы, эндометриты, менингиты, пневмонии, сепсис и т.п.), а также кормовые и пищевые токсикозы и токсикоинфекции. Особого внимания заслуживают работы разных ветеринарных исследователей по изучению роли этих микроорганизмов в этиологии инфекционной диареи молодняка животных.

До начала 90-х годов прошлого столетия ветеринарные лаборатории нашей страны бактериологические исследования патологического материала от больного и павшего молодняка животных сводили к выявлению в нем только патогенных эшерихий, сальмонелл, клостридий перфрингенс, стафилококков и диплококков не принимая во внимание многих представителей других родов и видов семейства Enterobacteriaceae ввиду отсутствия нормативных документов по диагностике болезней, вызываемых этими микроорганизмами. Последние были разработаны и утверждены лишь в конце 1991 года (Методические указания по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями) и затем переработаны в 1999 году, согласно которым бактерии родов Proteus, Morganella, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Providencia, Yersinia и др. получили официальное признание возбудителей болезни. В конце прошлого и начале настоящего века также было установлено, что диарею у молодняка животных с признаками геморрагического гастроэнтерита, а также отечную болезнь у поросят могут вызывать отдельные штаммы эшерихий серогруппы 0157 (серовары 0157:Н7 и 0157Н-), ранее не принимавшиеся во внимание как непатогенные для животных (О.А. Тугаринов, М.К. Пирожков, Ю.А. Малахов, 2001).

Контаминируя пищевое сырье и продукты питания, вышеуказанные энте-робактерии представляют большую опасность для людей, вызывая у них тяжело протекающие токсикоинфекции и септический процесс.

При постановке диагноза бактериологическим методом нередко возникает ряд трудностей, связанных с тем, что основой идентификации этих бактерий являются их биохимические (ферментативные) свойства, изучение которых не позволяет быстро и всегда идентифицировать названные микроорганизмы. Современные методы лабораторной диагностики (ПЦР, ИФА, РИА), которые могут быть использованы для их индикации и идентификации, хотя и являются высокоспецифичными и чувствительными, но сложность методик, высокая стоимость оборудования и реактивов для постановки этих реакций, делает их пока недоступными для многих бактериологических лабораторий. В связи с этим возникла необходимость в разработке методов лабораторной диагностики выше указанных инфекций, которые были бы менее трудоёмкими, более быстрыми, достаточно специфичными, чувствительными и доступными для лабораторий любого уровня. Одним из таких методов является фагодиагностика.

Цель и задачи исследований. Целью наших научных исследований явилось конструирование диагностических фаговых препаратов на основе выделенных и селекционированных бактериофагов малоизвестных ранее в ветеринарии патогенных энтеробактерий и разработка методов индикации и идентификации вышеуказанных микроорганизмов.

Для достижения указанной перед нами цели стояли следующие задачи:

1. Выделить из объектов внешней среды бактериофаги, активные в отношении энтеробактерий родов Proteus, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, видов Morganella morganii, Yersinia enterocolitica и Escherichia coli сероваров 0157:H7 и 0157:H-.

2. Изучить основные биологические свойства изолятов фагов (литическую активность, антигенные свойства, интенсивность адсорбции, длительность латентного периода внутриклеточного развития, урожайность, диапазон литиче-ской активности, специфичность, множественность инфекции, морфологию негативных колоний, морфологию фаговых корпускул, тип и размер нуклеиновой кислоты) и дать сравнительную характеристику селекционированным штаммам.

3. Отобрать штаммы фагов с заданными биологическими свойствами для конструирования диагностических препаратов.

4. Определить.таксономическое положение этих фагов в соответствии с современной Международной классификацией и номенклатурой вирусов.

5. Определить оптимальные параметры культивирования бактериофагов для изготовления диагностических препаратов.

6. Разработать технологию получения и контроля фагодиагностикумов.

7. Разработать схемы и условия ускоренной идентификации патогенных энтеробактерий с применением сконструированных диагностикумов.

8. Разработать схемы и технологические параметры индикации вышеуказанных микроорганизмов с помощью РНФ.

Научная новизна. Выделены и селекционированы специфические фаги, лизирующие патогенные для животных и человека энтеробактерии, в результате чего создана коллекция новых штаммов фагов.

Изучены основные биологические свойства выделенных фагов (литическая активность, антигенные свойства, интенсивность адсорбции, длительность латентного периода внутриклеточного развития, урожайность, диапазон литиче-

ской активности, специфичность, множественность инфекции, морфология негативных колоний, морфология фаговых корпускул, тип и размер нуклеиновой кислоты) и дана их сравнительная характеристика. Определено классификационное положение изученных изолятов по биологическим свойствам согласно современной классификации и таксономии вирусов.

Разработаны технологические режимы и условия изготовления и контроля диагностических биопрепаратов из селекционированных изолятов фагов.

Впервые разработаны методы фагоиндикации и фагоидентификации энте-робактерий родов Proteus, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, видов Morganella morganii,Yersinia enterocolitica и Escherichia coli сероваров 0157:H7 и 0157:H-b объектах ветеринарного надзора. Доказана возможность использования созданных биопрепаратов с диагностической целью.

Практическая значимость. Четырнадцать выделенных и изученных штаммов бактериофагов депонированы в коллекции Всероссийского государственного центра качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов, признаны перспективными и рекомендованы для изготовления диагностических и лечебно-профилактических препаратов:

• Штамм бактериофага Phagum Morganella morganii Ml7 УГСХА - ДЕП.

Справка о депонировании от 11.02.1999 г.

• Штамм бактериофага Phagum Morganella morganii М-20 УГСХА - ДЕП.

Справка о депонировании от 11.02.1999 г.

• Штамм бактериофага Phagum Escherichia coli Ol 57 E-61 УГСХА - ДЕП.

Справка о депонировании от 29.05.2002 г.

• Штамм бактериофага Phagum Escherichia coli 0157 Е-67 УГСХА - ДЕП.

Справка о депонировании от 29.05.2002 г.

• Штамм бактериофага Phagum Citrobacter С-61 УГСХА - ДЕП.

Справка о депонировании от 23.04.04 г.

• Штамм бактериофага Phagum Citrobacter С-66 УГСХА - ДЕП.

Справка о депонировании от 23.04.04 г.

• Штамм бактериофага Phagum Citrobacter С-52 УГСХА - ДЕП.

Справка о депонировании от 23.04.04 г.

• Штамм бактериофага Phagum Yersinia enterocolitica Y/9 УГСХА - ДЕП.

Справка о депонировании от 23.04.04 г.

• Штамм бактериофага Phagum Proteus П-16 УГСХА - ДЕП.

Справка о депонировании от 21.02.06 г.

• Штамм бактериофага Phagum Proteus П-261 УГСХА - ДЕП.

Справка о депонировании от 21.02.06 г.

• Штамм бактериофага Phagum Enterobacter Еп-2 УГСХА - ДЕП.

Справка о депонировании от 21.02.06 г.

• Штамм бактериофага Phagum Enterobacter En-13 УГСХА - ДЕП.

Справка о депонировании от 21.02.06 г.

• Штамм бактериофага Phagum Klebsiella К-10 УГСХА - ДЕП.

Справка о депонировании от 21.02.06 г.

• Штамм бактериофага Phagum Klebsiella К-81 УГСХА - ДЕП.

Справка о депонировании от 21.02.06 г.

Разработаны нормативно-техничекие документы по изготовлению диагностических фаговых препаратов:

1. Инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии эшери-хиозных бактериофагов E.coli 0157, Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА, утверждена

ученым советом и ректором УГСХА 16.02.2004 г.

2. Инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофагов Citrobacter С-52 УГСХА, С-61 УГСХА и С-66 УГСХА, утверждена ученым советом и ректором УГСХА 16.02.2004 г.

3. Инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофагов Morganella morganii Ml7 УГСХА, и М20 УГСХА, утверждена ученым советом и ректором УГСХА 16.02.2004г.

4. Инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофага Yersinia enterocolitica Y/9 УГСХА, утверждена ученым советом и ректором УГСХА 17.01.2005 г.

5. Инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофагов Proteus П-16 УГСХА и П-261 УГСХА, утверждена ученым советом и ректором УГСХА 17.01.2006 г.

6. Инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофагов Enterobacter Еп-2 УГСХА и En-13 УГСХА, утверждена ученым советом и ректором УГСХА 17.01.2006 г.

7. Инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофагов Klebsiella К-10 УГСХА и К-81 УГСХА, утверждена ученым советом и ректором УГСХА 17.01.2006 г.

Результаты исследований по разработке методов фагодиагностики вошли в следующие нормативные документы:

1. Методические рекомендации по ускоренной индикации и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки в Е. coli 0157:Н7 и 0157:Н- в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов, утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 4 октября 2004 года;

2. Методические рекомендации по ускоренной индикации и идентификации энтеробактерий вида Morganella morganii в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов, утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 4 октября 2004 года;

3. Методические рекомендации по ускоренной индикации и идентификации энтеробактерий рода Citrobacter в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов, утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 4 октября 2004 года;

4. Методические рекомендации по ускоренной индикации и идентификации энтеробактерий айда Yersinia enterocolitica в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфического бактериофага, утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 26 июня 2006 года;

5. Методические рекомендации по ускоренной индикации и идентификации энтеробактерий рода Proteus в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов, утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 26 июня 2006 года;

6. Методические рекомендации по ускоренной индикации и идентификации энтеробактерий рода Klebsiella в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов, утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 26 июня 2006

года;

7. Методические рекомендации по ускоренной индикации и идентификации энтеробактерий рода Enterobacter в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов, утвержденных Отделением ветеринарной медицины РАСХН 26 июня 2006 года.

Реализация результатов исследования. Выделенные и селекционированные штаммы фагов серии УГСХА родов Citrobacter (С-66, С-61, С-52), Enterobacter (En-2, En-13), Klebsiella (K-10, K-81), Proteus (П-16, П-261), видов Morganella morgana (М-17, М-20), Yersinia enterocolitica (Y/9) и Escherichia coli ce-роваров 0157:H7 и 0157:Н- (Е-67, Е-61), депонированные в ФГУ «ВГНКИ», используются для изготовления диагностических бактериофагов.

Часть результатов диссертационной работы вошла в монографию: «Малоизученные энтеробактерии и их роль в патологии животных» (С.Н. Золотухин,

2004) и два учебных пособия: «Роль Morganella morganii в этиологии кишечной инфекции телят и поросят» (77. С. Каврук, С.Н. Золотухин, В.Я. Ганюшкин, ДА. Васильев, 1998), «Смешанная кишечная инфекция телят и поросят, вызываемая патогенными энтеробактериями» (С.Н. Золотухин, JI.C. Каврук, ДА. Васильев,

2005).

Материалы диссертационных исследований используются в учебном процессе на лекциях и лаборатоно-практических занятиях со студентами и слушателями ФПК по микробиологии, вирусологии, биотехнологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизе продуктов животноводства в Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии, на факультете ветеринарной медицины и биотехнологии Оренбургского государственного аграрного университета, Кубанского государственного аграрного университета, Воронежского государственного аграрного университета им. К.Д. Глинки, Башкирского государственного аграрного университета, Алтайского государственного аграрного университета, Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарева, Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины, Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана, Чувашской государственной сельскохозяйственной академии, Ивановской государственной сельскохозяйственной академии, Самарской государственной сельскохозяйственной академии, Брянской государственной сельскохозяйственной академии, Пермской государственной сельскохозяйственной академии, Ижевской государственной сельскохозяйственной академии, Вологодской государственной молочно-хозяйственной академии им. Н.М. Верещагина.

Апробация работы. Результаты основных исследований подтверждены актами комиссионных испытаний в ФГУ «ВГНКИ» (от 11.02.1999 г.; 30.05.02 г.; 23.04.04 г.; 21.02.06 г.), УГСХА (от 5.06.03 г.); актами испытаний в условиях производства, Чердаклинской районной ветеринарной лаборатории Ульяновской области (от 24.08.04г.,2005), в Сергиевской районной ветеринарной лаборатории (от 30.08.04г.) и в ЗАО «СВ-Поволжское» Самарской области.

(Оренбург, 1993); Межгосударственных научных конференциях «Новые фармакологические средства в ветеринарии» (Санкт-Петербург, 1995, 1997); Международной научной конференции «Инфекционные болезни молодняка сельскохозяйственных животных» (Москва, 1996); научной конференции посвященной 50-летию Краснодарской НИВС «Состояние и перспективы развития научных исследований по профилактике и лечению болезней сельскохозяйственных животных и птиц» (Краснодар, 1996); Межгосударственных научных конференциях: «Актуальные проблемы ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции» (Москва, 1995, 1997); научно-практической конференции «Проблемы экологии Ульяновской области» (Ульяновск, 1997); Международной научной конференции «Проблемы инфекционных и инвазионных болезней в животноводстве на современном этапе» (Москва, 1999); Международной научной конференции «Современные вопросы ветеринарной медицины и биологии» (Уфа, 2000); Международной научно-практической конференции (Воронеж, 2002); Всероссийской научно-производственной конференции (Ульяновск, 2003); Международном научно-практическом семинаре: «Перспективы использования препаратов бактериофага для превенции и лечения инфекций, вызываемых патогенными и условно-патогенными микроорганизмами» (Тбилиси, 2005); Международной научной конференции: «Диагностика, профилактика и лечение инфекционных болезней, общих для человека и животных» (Ульяновск 2006 г.).

Основные материалы диссертации заслушаны и одобрены на заседаниях Отделения ветеринарной медицины РАСХН (4.10.04 г. и 26.06. 06 г.), на расширенном межкафедральном совещании сотрудников факультета ветеринарной медицины ФГОУ ВПО УГСХА (31.10.2006 г.).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 303 страницах компьютерного текста и состоит из общей характеристики работы, обзора литературы, описания собственных результатов исследований, обсуждения, выводов и практических предложений, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 74 таблицами, 35 рисунками. Список литературы включает 354 источников.

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 80 работ в центральных журналах, в трудах и сборниках Международных и Всероссийских совещаний, симпозиумов, конференций.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Схемы позволяющие выделить из объектов внешней среды бактериофаги малоизученных в ветеринарии родов и видов энтеробактерий.

2. Биологические- свойства выделенных фагов и их сравнительная характеристика.

3. Таксономическое положение изученных фагов согласно современной классификации и номенклатуры вирусов.

4. Параметры конструирования из отобранных фагов новых диагностических биопрепаратов.

5. Биотехнологические режимы, условия изготовления и контроля диагностических фаговых биопрепаратов.

6. Схемы и методы идентификации энтеробактерий с помощью специфических бактериофагов.

7. Схемы и методы ускоренной индикации гомологичных фагам энтеробактерий в объектах санитарного надзора с помощью РНФ и созданных диагно-стикумоав.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Диссертационная работа является разделом комплексной темы кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГОУ ВПО УГСХА: «Усовершенствование методов диагностики, профилактики и лечения болезней молодняка сельскохозяйственных животных и пищевых токсикоинфекций людей», имеющую государственную регистрацию (№ 01200.203524). Работа выполнена в период с 1987 по 2006 год в ФГОУ ВПО УГСХА. Отдельные исследования были проведены совместно со специалистами ВНИИЗЖ, ВНИИВМВ, ветеринарных лабораториях и животноводческих хозяйствах Ульяновской и Самарской областей.

Объектом исследования явились бактериофаги малоизученных в ветеринарии энтеробактерий.

В работе использовано 349 штаммов бактерий: видов E.coli различных серологических групп (в том числе 0157:Н7 и Н-), Morganella morganii, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis; родов Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus. Используемые штаммы микроорганизмов обладали типичными для данных родов и видов биологическими свойствами.

Для получения антифаговых сывороток было использован 31 кролик породы калифорнийский, массой 3,0-3,5 кг.

Бактериологические исследования проводили в соответствии с "Методическими указаниями по бактериологической диагностике колибактериоза (эшери-хиоза) животных" (1991,2000), «Методическими указаниями по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями» (1991,1999). При необходимости использовали дополнительные тесты, изложенные в «Определителе бактерий» (Вег-gey's Manual of Determinative Bacteriology, 1997) и руководстве «Энтеробакте-рии» под ред. В.И. Покровского (1985).

Поиск изолятов фагов проводили в сточных водах животноводческих и бытовых помещений, мясокомбинатов; фекалиях больных и переболевших телят и поросят; в воде открытых водоемов различных регионов страны. Исследуемые пробы для повышения вероятности обнаружения фагов обогащали индикаторными культурами энтеробактерий, находящимися в логарифмической фазе роста. Выделение и изучение биологических свойств фагов проводили по методам, предложенным Dulbeio, Vogt (1954), М. Adams (1961), Д.М. Гольдфар-бом (1961), Адельсоном (1962), A.C. Тихоненко (1968), Т.Г. Чшашвши (1968), С. Лурия, Д. Дарнелом (1970), ИМ. Габриловичем (1973), И.П. Рееенко (1978), D. Reanney, H.-W. Ackermann (1982), В.Я. Ганюшкиным (1988) C.B. Леневым (1988), ИМ. Габриловичем, Р.Х. Гайдабековым (1992).

С целью получения чистых линий фагов и повышения их литической активности проводили селекцию клонов бактериофагов методом пассирования выделенных изолятов на индикаторных культурах с периодическим 5-6-ти кратным клонированием типичных негативных колоний до получения их однородной популяции.

Морфологию негативных колоний фагов изучали при посевах фагов методом агаровых слоев. Негативные колонии сравнивали по размеру, характеру края, прозрачности, наличию вторичного роста и характеру роста культур вокруг колоний. Литическую активность фагов определяли методами Грациа и

Аппельмана. Диапазон литической активности и специфичность селекционированных фагов изучали методом нанесения фага на газон гомологичных или ге-терологичных бактериальных культур (Адаме, 1961; Ганюшкин, 1988).

Для получения антифаговых сывороток к фагам энтеробактерий иммунизацию кроликов проводили по методике М.Адамса (1961) и схеме предложенной В.Я. Ганюшкиным (1984).

Фагонейтрализующую активность антифаговых сывороток фагов энтеробактерий изучали в реакции нейтрализации по методу М. Адамса (1961). Константу скорости нейтрализации антифаговых сывороток (К) определяли по формуле:

К= 1п (Р0: Р) х Э : I, где Р0 - исходная концентрация частиц фага (количество фага при времени 0); Р - количество фага при времени I (количество фаговых частиц после нейтрализации); Б - конечное разведение сыворотки в смеси; I - время контакта фага с антифаговой сывороткой.

Антигенное родство бактериофагов изучали в перекрестных реакциях нейтрализации в разведении сывороток 1:80 с гетерологичными фагами.

Эффективность адсорбции фагов выражали в процентах адсорбированных фаговых частиц в сравнении с количеством исходного фага и константой скорости адсорбции, определяемой уравнением - (ёхр : с1*1) = К * Р х В.

Константа скорости адсорбции К-величина, характерная для данного фага и бактерий в условиях опыта, выраженная в см3/мин"'.

При интегрировании представленного выше дифференциального уравнения величина К = 2,3 : (В х 1) х 1ё (р0: р) или К = 1п (Р0: Р): (В х I), где Р0 - фаг, исследованный при времени 0; Р - фаг, неадсорбированный за время 1, в минутах; В - количество бактерий в 1,0 см3.

Изучение длительности латентного периода развития фагов проводили по методу Эллиса и Дельбрюка (1935) на индикаторных культурах энтеробактерий, выращенных в питательном бульоне в течение 18-20 часов.

Изучение морфологии фаговых корпускул проводили совместно с профессором А.П. Пономаревым (ВНИИЗЖ) с использованием электронного микроскопа 1ЕМ-100В (Япония), размеры вирусных частиц определяли с помощью микроскопа МИР-12 т.

Обнаружение, индикацию и идентификацию энтеробактерий проводили с использованием специфических бактериофагов в сравнении с бактериологическим методом исследования.

Реакцию нарастания титра фага ставили по методике В.Д. Тимакова и Д.М. Гольдфарба (1962). В качестве тест-объектов использовали контаминированные энтеробактериями в концентрациях от 101 до 105 м.к./см3 (г) исследуемого субстрата: водопроводную воду, мясо, комбикорм, фекальные массы.

Взятие проб мяса и комбикорма для исследований проводили в соответствии с действующими ГОСТами (ГОСТ 21237—75 и ГОСТ 13496.0-80), а взятие патологического материала - в соответствии с вышеупомянутыми методическими указаниями по бактериологической диагностике смешенной кишечной инфекции и колибактериоза молодняка животных.

Эффективность РНФ в условиях производства изучали в Чердаклинской районной ветеринарной лаборатории Ульяновской области и в Сергиевской районной ветеринарной лаборатории Самарской области, в ЗАО «Поволжское» Самарской области при исследовании проб фекалий от больных диареей телят и поросят, а так же сточных вод, взятых из неблагополучных по диарейным заболеваниям хозяйств этих районов.

Статистическую обработку данных осуществляли с использованием программы Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Выделение бактериофагов и селекция клонов фагов

В качестве индикаторных культур при выделении изолятов фагов использовали штаммы Morganella morganii серогрупп: ОЗЗ (№36/82); 016; 01 (№619) и «13» и 029; для выделения цитробактерных фагов - культуры бактерий Citrobacter freundii №9 и №16; Citrobacter amalonaticus №11; эшерихиозных фагов - E.coli 0157 штамм №904 и E.coli 0157 штамм PJT; для иерсиниозных фагов - Yersinia enterocolitica 06,31; протейных фагов - Proteus vulgaris №261 и №3; клебсиеллезных фагов - Klebsiella pneumoniae №1017 и №8172 и для фагов энтеробактера -Enterobacter cloaceae №10005 и №2601.

В результате проведенных исследований было выделено и селекционировано 20 изолятов фагов, лизирующих энтеробактерий вида М. morganii, 5 изолятов лизировали E.coli 0157, 23 изолята - бактерии рода Citrobacter, 10 изолятов - вид Yersinia enterocolitica, 22 изолята - рода Proteus, 22 изолята - рода Klebsiella и 21 изолят - род Enterobacter (табл.1).

1. Источники выделения фагов

Источник выделения

№ Роды (виды) энтеробактерий в отношении которых получены фаги Сточные воды свинарников Сточные воды коровников Бытовые сточные воды Сточные воды 1 мясокомбината Вода озера Фекалии поросят Фекалии к.р.с. Итого

1 Citrobacter 5 6 12 23

2 Enterobacter 2 1 11 1 1 5 21

3 Proteus 4 5 13 22

5 Klebsiella 2 7 9 3 21

6 M. morganii 9 6 2 3 20

7 Y. enterocolitica 5 3 1 9

8 E. coli 0157 2 3 5

И того 29 31 47 4 1 4 5 121

Изучение биологических свойств фагов Селекционированные изоляты фагов отличались друг от друга по характеру негативных колоний. Их диаметр был в пределах от 0,5 до 10,0 мм. Форма у всех негативных колоний была округлая с ровными краями. Некоторые изоляты образовывали ореол по периферии шириной 2,0-3,0 мм или помутнение внутри колоний, состоящее из фагорезистентных клеток энтеробактерий. Корреляции формы и размеров негативных колоний с видовой и родовой принадлежностью выделенных изолятов, мы не наблюдали.

Литическую активность (титр) выделенных и селекционированных изо-лятов изучали на плотных и в жидких питательных средах (методом агаровых слоев по Грациа и методом серийных разведений по Аппельману).

Проведенные исследования показали, что выделенные нами бактериофаги энтеробактерий имели литическую активность от 10'1 до 10's (по Аппельману) и от 102 до 10 фаговых корпускул в 1,0 см3 (по Грациа). Невысокую активность имели морганеллезные фаги М-2, М-3, М-4, М-8, М-9, М-10, М-11, М-12, М-14; иерсиниозный бактериофаг Y/8 (10"'-10"3 по Аппельману и 102-105 по Грациа). При 10-16 кратном пассировании на индикаторных культурах повышение их литической активности не происходило. По показателю литической активности эти изоляты являются бесперспективными и не могут быть использованы для изготовления фаговых биопрепаратов. Остальные изоляты фагов обладали литической активностью, достаточной для использования их в качестве диагностических препаратов (10'5-10"8 по Аппельману и 107- 109 - по Грациа)

Изучение диапазона литической активности и специфичности выделенных и селекционированных бактериофагов

Для изучения диапазона литической активности и специфичности выделенных бактериофагов использовали энтеробактерии как гомологичных, так и гетерологичных фагам родов и видов.

Все используемые штаммы микроорганизмов обладали типичными для данных видов и родов биологическими свойствами.

Исследования показали, что выделенные и селекционированные бактериофаги обладали разным диапазоном литической активности по отношению к гомологичным видам и родам энтеробактерий и выраженной специфичностью. Ни один изолят фагов не был активен по отношению к бактериям других родов и семейств. Так эшерихиозные бактериофаги были активны только в отношении штаммов Е. coli 0157:Н7 и 0157:Н-, иерсиниозные и морганеллезные бактериофаги лизировали представителей только своего вида, а энтеробактерные, клебсиеллезные и протейные фаги имели межвидовые реакции в пределах рода.

Спектр лизиса гомологичных микроорганизмов находился в пределах от 7 до 100% из числа изученных штаммов.

Встречались изоляты, лизирующие только по оному штамму энтеробактерий: С-20.С-3, Еп-11, Еп-12, М-7, Y/2, Y/5, Y/7.

Изоляты фагов, обладающие стабильно-высоким титром и наиболее широким диапазоном сорместного действия, были отобраны нами для дальнейшего изучения. Это морганеллезные фаги М-17 и М-20, совместный спектр литиче-ского действия которых составил 81,6%, спектр действия фагов Е. coli 0157 Е-61 и Е-67 составил 100%, цитробактерных фагов С-52, С-61 и С-66 - 92,3%, протейных фагов П-261 и П-16 - 95%, энтеробактерных фагов Е-2 и Е-13 - 95%, клебсиеллезных фагов К-10 и К-81 - 97%, иерсиниозного фага - 78,6%. Показатели диапазона литического действия и специфичности этих изолятов представлены в таблице 2.

2.Специфичность и диапазон литической активности производственных __изолятов бактериофагов_

Название рода (вида) микроорганизмов

с % лизируемых культур

Название фага серии УГСХ, Е.соП Ol 57 Е. coli др. ссерогрупп Morganella spp Proteus spp Klebsiella spp Enterobacter spp Citrobacter spp Y. enterocolitica Y. pseudotuberculosis Salmonella spp Pseudomonas spp Staphylococcus spp Bacillus spp Streptococcus spp Listeria spp

М-17 - - 44,7 - - - - - - - - - - - -

М-20 - - 63,2 - - - - - - - - - - - -

Е-61 66,6

Е-67 100,0

С-52 - - - - - - 46,1 - - - - - - - -

С-61 - - - - - - 58,3 - - - - - - - -

С-66 - - - - - - 63,8 - - - - - - - -

Еп-2 - - - - - 71,0 - - - - - - - - -

En-13 - - - - - 62,0 - - - - - - - - -

Y/9 - - - - - - - 78,6 - - - - - - -

П-16 - - - 65,0 - - - - - - - - - - -

П261 - - - 67,5 - - - - - - - - - - -

К-10 - - - - 76,0 - - - - - - - - - -

К-81 - - - - 73,0 - - - - - - - - - -

Примечание: «-»- отсутствие лизиса

Иммуногенные свойства бактериофагов

Для изучения антигенных и иммуногенных свойств бактериофагов и параметров их одиночного цикла развития (длительности латентного периода и урожайности) нами было получено антифаговые сыворотки на 14 бактериофагов.

Изучали нейтрализующую активность с гомологичными бактериофагами в разведениях от 1:5 до 1:5120 при их контакте в течение 2 часов в условиях температуры 37°С. Результаты исследований свидетельствовали о том, что все гипериммунные сыворотки проявляли нейтрализующую активность разведениях 1:5 до 1:640. Наибольшее разведение, при котором происходила нейтрализация 100% фаговых корпускул, у всех сывороток было 1:80. Это разведение мы использовали в дальнейших опытах как рабочее.

Определение константы скорости нейтрализации проводили при взаимодействии сывороток с гомологичными бактериофагами в течение 5 минут при 37°С.

Результаты проведенных исследований показали, что средний показатель константы скорости нейтрализации К антисывороток фага М-17 был равен 28,73±2,7 мин"1; фага М-20 - 27,06±3,06 мин"1; фага Е-61 - 51,85±1,23 мин"1; фага Е-67 - 23,84±2,02 мин"1; фага С-61 - 33,59±1,5 мин"1; С-66 - 20,79±0,6 мин"1; фага С-53 - 71,28±0,61 мин"1; фага Y/9 - 72,05±0,82 мин"1; фага Еп-2 - 39,52±1,77 мин"1; фага Еп-13 - 57,73±4,04 мин"'; фага П-16 - 32,94±0,87 мин"': фага П-261 -47,87±4,14 мин'1' фага К-10 - 57,72±4,04 мин"1: фага К-81 - 52,7±2,44 мин"1.

Антигенное родство фагов изучали в перекрестных реакциях нейтрализации антисывороток с гетерологичными фагами. Полученные данные свидетельствуют о том, что цитробактерные бактериофаги С-61 и С-66 нейтрализуются гетерологичными сыворотками на 52,7 и 52,2% и по этому показателю являются отдаленно родственными. Более тесные антигенные связи имеют протейные бактериофаги П-16 и П-261, так как показатель нейтрализации гетерологичными сыворотками был равен 74,7 и 78,7%. Эти бактериофаги можно считать близкородственными. Остальные изоляты фагов имели процент нейтрализации от 0 до 20,7, что свидетельствует об отсутствии у них родственных антигенных связей (В.А. Полховский, 1971; ИМ. Габрилович, 1973; Н.Н Ворошилова, Е.В. Васяева, 1974; Ф.С. Клепикова, H.H. Беляева, В.Г Жданов, Н.С. Тихонечко, 1978).

Показатели взаимодействия бактериофагов с индикаторными культурами энтеробактерий

Адсорбцию выделенных бактериофагов изучали при взаимодействии их с культурами клеток-хозяев общепринятым методом по М. Адамсу (1961), который основан на исследовании количества корпускул неадсорбированного фага в смеси бактерия-фаг. В качестве бактериальных клеток-хозяев использовали индикаторные культуры энтеробактерий, на которых получали диагностические фаговые препараты.

Время адсорбции для каждого фага устанавливали индивидуально в зависимости от процента максимальной адсорбции для конкретной смеси (фаг+клетка хозяина). Эффективность адсорбции фагов выражали в процентах и константой скорости адсорбции К.

В результате проведенных исследований было установлено, что изучаемые бактериофаги имели-разные показатели скорости адсорбции. Так, фаг М17 за 7 минут контакта с клетками М. morganii 029 адсорбировался в количестве 87,7%, константа скорости адсорбции К=6,1 см3/мин"'; фаг М20 - на клетках М. morganii 016 за 6 минут адсорбировался в количестве 87,%, константа скорости адсорбции К= 6,8 см3/мин"; фаг Е-67 на клетках Е. coli 0157:Н7 шт. PJI за 7 минут адсорбировался в количестве 82,2%, константа скорости адсорбции К= 4,8 см3/мин"'; фаг Е-61 адсорбировался на Е. coli 0157:Н7 шт. №904 за 6 минут в количестве 70,3%, константа скорости адсорбции К= 4,04 см 3/мин"'; фаг С-66 на клетках С. freundii №9 за 5 минут адсорбировался на 83,3%, константа скорости адсорбции К= 7,1 см 3/мин"'; фаг С-61 на клетках С. freundii №16 за 8 минут адсорбировался на 69,3%, константа скорости адсорбции К= 2,9 см 3/мин"'; фаг С-52 за 7 минут адсорбировался на С. amalonaticus шт. №11 на 80,4%, константа скорости адсорбции при этом составила К= 4,6 см 3/мин"';

иерсиниозный фаг Y/9 на клетках Y. enterocolitica 09 шт. №168-035 за 8 минут адсорбировался в количестве 83,2,%, константа скорости адсорбции К= 4,4 см 3/мин"'; фаг Еп-2 на клетках Е. cloacae шт. №10005 за 6 минут адсорбировался на 81,9%, константа скорости адсорбции К= 5,6 см 3/мин"'; фаг En-13 за 7 минут контакта с клетками E.cloacae шт. №1487 адсорбировался в количестве 81,4%, константа скорости адсорбции при этом составила К= 4,8 см 3/мин"'; фаг П-16 за 6 минут адсорбировался на клетках P. vulgaris шт. №3 в количестве 68,8%, константа скорости адсорбции К= 3,8 см 3/мин"'; фаг П-261 при контакте с клетками P. vulgaris шт. №261 в течение 7 минут адсорбировался на них 87,2%, константа скорости адсорбции составила К= 5,8 см /мин"'; бактериофаг К-10 на клетках К. pneumoniae шт.№1017 за 7 минут адсорбировался на 79.8%, константа скорости адсорбции при этом составила К= 4,5 см 3/мин-1; бактериофаг К-81 на клетках К. pneumoniae шт. №8172 за 8 минут адсорбировался на 80,2%, константа скорости адсорбции составила К= 4,05 см 3/мин".

Из анализа результатов исследований, видно, что наиболее выраженные показатели скорости адсорбции на клетках хозяев были у морганеллезных фагов М17 и М20, цитробактерного фага С-66, протейного фага П-261 и энтеро-бактерного фага Еп-2 (К- 5,6 - 7,1 см 3/мин"'.). Менее активно адсорбировались эшерихиозные фаги Е-61 и Е-67, цитробактерный фаг С-52, энтеробактерный фаг Еп-13, иерсиниозный фаг Y/9, протейный фаг П-16, клебсиеллезные фаги К-10 и К-81 (К=3,8 - 4,6 см 3/мин"'). Самую низкую скорость адсорбции из изученных изолятов показал цитробактерный фаг С-61 (К=2,9 см 3/мин-1).

Изучение длительности латентного периода развития и урожайности селекционированных и отобранных фагов проводили на индикаторных культурах энтеробактерий. Результаты этих исследований отражены в таблице 3, из показателей которой видно, что селекционированные нами бактериофаги имели разные показатели длительности латентного периода и урожайности. Наиболее короткий латентный период длительностью 19-22 минуты имели фаги М-20 Е-61, С-66, С-52, Еп-2, П-261, К-81. Фаги Еп-13, П-16 и К-10 имели латентный период в пределах 24-26 минут. Самый длинный латентный период от 36 до 45 минут был у фагов Ml 7, С-61 и Y/9.

Наибольшую урожайность имели морганеллезные бактериофаги Ml7 и М20, эшерихиозный фаг Е-61, цитробактерные фаги С-66 и С-52, энтеробактерный бактериофаг Еп-2, протейный фаг П-261, клебсиеллёзный фаг К-10, которая насчитывала от 126 до 239 фаговых корпускул на одну микробную клетку. Эшерихиозный фаг Е-67, цитробактерный фаг С-61, иерсиниозный фаг Y/9, энтеробактерный фаг Еп-13, протейный фаг П-16 и клебсиеллезный фаг К-81 имели средний выход фаговых частиц на одну микробную клетку в пределах от 50 до 101.

Полученные данные о показателях одиночного цикла развития бактериофагов позволяют использовать изученные изоляты для производства диагностических препаратов.

З.Показатели одиночного цикла развития селекционированных бактериофагов____

Название фага Индикаторная культура Константа скорости адсорбции, cm /мин 1 Длительность латентного периода, мин Урожайность, фаговых корпускул на 1 м.к.

М17УГСХА M.morganii 029 6,1 36-37 181

М20 УГСХА M.morganii 016 6,8 22 222

Е-61 УГСХА Е. coli 0157:Н7 шт.РЛ 4,8 19 239

Е67 УГСХА Е. coli 0157:Н7 шт. №904 4,04 39 62

С-66 УГСХА С. freundii №9 7,1 19-20 146

С-61 УГСХА С. freundii 16 2,9 39-40 101

С-52 УГСХА С. amalonaticus №11 4,6 21-22 126

Y/9 УГСХА Y.enterocolitica 09 №168-035 4,4 44-45 72

Еп-2 УГСХА Е. cloacae №10005 5,6 19-20 123

En-13 УГСХА Е. cloacae №1487 4,8 24-25 101

П-16 УГСХА P. vulgaris №3 3,8 25-26 50

П-261 УГСХА P. vulgaris №261 5,8 21-22 142

К-10 УГСХА Kl. pneumoniae ,№1017 4,5 25 138

К-81 УГСХА Kl. pneumoniae №8172 4,05 20-21 98

Пороги термоинактивации выделенных фагов Проведенные исследования по изучению термоустойчивости выделенных изолятов фагов было установлено, что большинство из них обладали выраженной устойчивостью к температуре 60-65°С.

Так, прогревание иерсиниозного фага У/4 при 50-70°С не оказало влияния на содержание активных корпускул фага в 1,0 см3. При температуре выше 73°С активность данного бактериофага начала снижаться, на газоне индикаторной культуры формировался разреженный рост негативных колоний (по сравнению с контролем, где был сплошной лизис). Температура 83-86°С оказалась для этого штамма критической - количество жизнеспособных фаговых корпускул на-

считывалось в пределах 2х103-1х10'. После прогревания при t выше 89°С активных корпускул фага по показателям негативных колоний не обнаружили.

Изоляты фагов Y/9 и Y/3 проявили термолабильность. Они сохраняли свои исходные показатели титра при 50°С. Затем, при повышении температурного режима, наблюдалось снижение их активности. Температура выше 60-63°С полностью инактивировала названные изоляты фагов. Выраженную устойчивость к воздействию высокой температуры проявили остальные изученные фаги. Бактериофаги морганелл М17 и М20 УГСХА проявили одинаковую термоустойчивость. При нагревании от 59 до 65°С снижения активности последних не происходило. Нижний порог термоинактивации морганеллезных фагов составил 66-67°С. При последующем повышении температуры среды их активность понижались. При воздействии температуры выше 75°С активных корпускул фагов методом агаровых слоев не обнаруживали. Таким образом, верхний порог термоинактивации для этих изолятов составил 75-76°С.

Нижний порог термоинактивации четырех фагов Е. coli Ol 57 (Е-61, Е-2, Е-3 и Е-67 УГСХА) составил 80-81°С, за пределами этой температуры активность фагов по показателю титра снижалась. При температуре выше 85-86°С наблюдалась инактивация этих фагов.

Цитробактерные фаги (С-52, С-61, С-67) не изменяли своей литической активности при нагревании до 73°С. Дальнейшее повышение температуры снижало титр фагов и полная гибель фага С61 наступала при 86-88°С, а фагов С-52 и С-66 - при 88-90°С.

Протейные фаги П-16 и П-261 при температуре выше 73°С начинали снижать свою физиологическую активность (нижний порог термоинактивации) и погибали при температуре 86-88°С.

Бактериофаги клебсиелл К-8, К-10 и К-81 снижали свою активность при температуре 64-67°С (нижний порог термоинактивации), полностью инактиви-ровались при 78-8ГС фаги К-8 и К-10, а фаг К-81 - при 85-88°С.

Прогревание энтеробактерных бактериофагов до температуры 60 - 65°С не оказало влияния на активность обеих штаммов фагов. При температуре выше 67°С титр фагов заметно снижался. Воздействие температуры выше 81°С приводило к полной инактивации бактериофага Еп-2. Штамм бактериофага Еп-13 погибал при температуре 87°С.

Устойчивость выделенных бактериофагов к воздействию хлороформа

Согласно литературным данным бактериофаги обычно устойчивее к хлороформу, чем клетки микроорганизмов, поэтому данный химический агент является хорошим средством для освобождения фаголизата от жизнеспособных бактерий. Определение чувствительности бактериофагов и бактерий к этому веществу проводили, обрабатывая фаговые суспензии и бульонные культуры энтеробактерий хлороформом в соотношении 1:10 при постоянном встряхивании.

Результаты исследований показали, что большинство изученных нами изолятов фагов энтеробактерий устойчивы к хлороформу и за период времени от 15 до 45 минут его воздействия на бактериофаги не снижали свою литическую активность. Однако бактериофаги П-261 и С-52 теряли активность при 15-ти минутной экспозиции и полностью инактивировались в течение 30 и 45 минут контакта с хлороформом. Протейный бактериофаг П-16 сохранял активность при контакте с хлороформом в течение 30 минут, но через 45 минут 70% фаго-

вых корпускул этого изолята инактивировались. Энтеробактерный бактериофаг Еп-13 проявил стабильность при 30-ти минутном воздействии хлороформа и снижал активность на 10% при экспозиции 45 минут. Остальные изоляты фагов проявили стабильность при 45-ти минутном контакте с хлороформом, их активность оставалась на исходном уровне.

Воздействие хлороформом на все культуры индикаторных штаммов энте-робактерий в течение 15 минут приводила к их полной инактивации.

Для определения типа нуклеиновой кислоты и молекулярной массы генома бактериофагов нами поэтапно были проведены следующие операции: освобождение фаголизатов от фрагментов бактериальных клеток; осаждение бактериофагов; выделение нуклеиновых кислот фагов; определение типа нуклеиновой кислоты; определение размера генома фагов электрофорезом в агаровом геле; рестрикционный анализ генома фагов.

Все изученные бактериофаги содержат ДНК (табл.4) размером от 4500 п.о. до 6700 п.о

4.Результаты электрофореза при определении типа нуклеиновой _кислоты у выделенных бактериофагов_

№ Название фага Результат электрофореза

пп В контроле после обработки РНК-азой после обработки ДНК-азой

1 Y. enterocolitica Y/9 + + -

2 Enterobacter Еп-13 + + -

3 Enterobacter Еп-2 + + -

4 Klebsiella К-10 + + -

5 Klebsiella K-80 + + -

6 Citrobacter C-61 + + -

7 E. coli Ol57 E-67 + + -

8 E. coli 0157 E-67 + + -

9 Proteus П-16 + + -

10 Proteus П-261 + + -

11 M. morganii M 17 + + -

12 M. morganii M20 + + -

13 Citrobacter C-66 + + -

14 Citrobacter C-52 + + -

Примечание : «+»- положительный результат; «-»- отрицательный результат

Рестрикционный анализ с эндонуклеазой Hind III в течение 2,5 часов показал, что данная рестриктаза не разрезает образцы нуклеиновых кислот изучаемых фагов.

Изучение морфологии фаговых корпускул проводили методом электронной микроскопии. Результаты проведенных исследований показали, что изучаемые фаги по морфологическим параметрам были неодинаковы.

Фаги М-17 и М-20 (рис1-3), С-52, С-61 и С-66 (рис. 7, 8, 9), Е-61 и Е-67 (рис. 4,5,6), Y/9 (рис.10), К-81 (рис. 13) и фаг Еп-13 (рис.12) имели похожие

морфологические характеристики и представляли собой структуры, состоящие из головки а форме растянутого или равностороннего многогранника с сокращающимся отростком. У основной массы вирионон чехлы отростков находились в растянутом состоянии, которые на всем протяжении были прямыми и имели цилиндрическую форму, что было характерно для интактных частиц. Концевые структуры отростков ограничивались базальными мембранами, от которых отходили короткие нити в виде трезубца.

Диаметр головок вирусных частиц был в пределах 50-100 нм, высота -74112 нм, длина отростков колебалась от 85 до 136 нм, а их диаметр - от 14 до 16 нм. У части в и эионов отростки были в сокращенном состоянии, ири этом их чехол укорачивался и расширялся, просматривались внутренние стержни отростка, головки корпускул в данном случае были «пустые», т.е. освободившееся от нуклеиновой кислоты («тени» фагов) (рис. 3),

В соответствии с морфологическими параметрами вирусные частицы вышеперечисленных изолятов согласно Международной классификации и номенклатуре вирусов относятся к семейству Myoviridae (Bradley. 1995), а по классификации А.С.Тихонечко (1968) - к V морфологической группе: «Фаги с отростком сложного строения, чехол которого способен к сокращению».

Другая группа фагов, куда вошли клебсиеллсзный К-10 (рис. 14.15) и энте-робактерпый Еп-2 (рис. 11), хотя и отличались друг от друга формой отростка, были отнесены нами к одному морфологическому семейству Siphoviridae к IV морфологической группе по Классификации А.С.Тихонеико «Фаги с нссокра-щающимся отростками».

Рис. 1. Фаг М. morganii М-17

Рис. 2. Фаг М. morganii М-20

Протейные бактериофаги 11-16 (рис. 16), и П-261 (рис. 17) но размерам и морфологии вирусных частиц существенно отличались от вышеуказанных изолятов. Вирионь: фага 11-16 имели структуры, состоящие из головки гексагональной формы диаметром 25 нм (± 4) и аналога отростка длиной 1,2 нм (± 0,2). Вирионы бактериофага 11-261 имели сходные с фагом П-16 структуры, состоящие из головки гексагональной формы диаметром 22,5 нм (± 0,2) и аналога отростка длиной 0,6 нм (± 0,1). В соответствии с морфологическими параметрами оба бактериофага П-16 УГСХА и П-261 мы отнесли к семейству Podoviгidae( а

по классификации Л.С. Тихйненко - ко I! морфологической группе: «Фаги с аналогами отростка».

Рис. 4 Рис.5

Фаг Е. соН О Г 57 Е-61

Phc, 7 (|>ai Citrobacter C-52

Phc, 6 4>ar E. coli 0157 E-67

Pnc.9

<I>ai Citrobacter C-66

Phc. H <]>ar Citrobacter C-61

Phc. 10

Oar Yersinia enterocolitica Y/9

tsssmssisi

Phc. 11 Oar Enterobacter En-2

Phc. 12 Oar Enterobacter En-13

Phc. 13 <l>ar Klebsiella K-81

Phc. 14 Phc. 15

Oar Klebsiella K-10

Рис. 16 Фаг Proteus П16

Рис. 17 Фаг Proteus П-16

Таким образом, результаты проведенных исследований показывают, что таксономическое положение фагов не зависит от их видовой принадлежности. Фаги, лидирующие один и тоже род микроорганизмов относятся к разным морфологическим группам и наоборот, фаги лизирующие разные роды и виды эн-теробактерий относятся к одинаковым группам.

Изменение литической активности бактериофагов при хранении

Фаги, в виде лизатов бульонных культур энтеробактерий- хранили в запаянных ампулах по 2,0 см3 и герметически закрытых флаконах объемом 50-100,0 см3 и условиях холодильника при 2-4°С. Литический титр фагон определяли методом агаровых слоев сразу после приготовления и по истечении 2,4,6,8,12 и 24 месяцев. Изменение литической активности бактериофага М. топали М-6 изучали в течение 15 лет.

Результаты исследований показали, что через 4 года хранения этого штамма фага титр не снижался и был в пределах 10' корпускул в 1,0 см3; через 6 лет - 10 ; через 7 лет - 106, через 8 лет - 10?; через 11 лет - 104, через 13 лет - 10э, через 15 лет 102 корпускул в 1,0 см3.

После 3-4-крвтного пассирования бактериофага на индикаторной культуре его литическая активность восстанавливалась до исходной.

Результаты изучения литической активности других селекционированных изояятов фагов, отобранных г га ми для изготовления диагностических препаратов свидетельствовали о том, что у большинства изо .пятое литическая активность но показателю титра не изменялась в течение 12 месяцев, у некоторых штаммов она понижалась на один-два порядка через 24 месяца хранения (срок наблюдения).

Разработка биотехнологических параметров изготовления

фаговых препаратов Определение оптимальных количественных параметров соотношения фаговых корпускул и клеток-хозяев

Для выбора оптимального соотношения концентрации фаговых корпускул и бактериальных клеток в опытные пробирки со стерильным питательным бульоном вносили изоляты фагов и их индикаторные культуры в различных соотношениях. Контролем служили пробирки с индикаторными культурами без фага. Посевы инкубировали в термостате при 37°С в течение 4-6 часов до полного просветления бульона опытной пробирке (лизиса тест-культуры). У полученных фагов изучали литическую активность по Грациа, определяя, при какой множественности инфекции происходит максимальное увеличение титра бактериофага в полученном лизате.

Результаты проведенных исследований показали, что оптимальная множественность инфекции фага En - 2 УГСХА для получения фагов с высоким титром составляет 0,2-0,4 корпускул фага на 1 бактериальную клетку, фага En - 13 УГСХА - 6,4-5,3. Литическая активность морганеллезных фагов М17 и М20 при множественности инфекции от 2,2 до 10,0 была одинаково высокая и соответствовала 109 фаговых корпускул в 1,0 см3. Для получения активного клебси-еллезного фага К-10 множественность инфекции должна быть от 2,2 до 10,0., а для фага К-81 - 2,2; для протейных фагов П-16 и П - 261 этот показатель также соответствовать от 2,2 до 10; для иерсиниозного фага Y/9 - 2,2-2,8.

Изготовление индикаторных бактериофагов

Изготовление фаговых препаратов проводили в лаборатории прикладной микробиологии и бактериофагии Научно-исследовательского инновационного центра микробиологии и биотехнологии ФГУ ВПО «УГСХА».

Технологический процесс производства жидких бактериофагов состоял из следующих этапов: работа с производственными штаммами бактерий; получение маточных бактериофагов; приготовление серии жидкого бактериофага; контроль готовых препаратов, их упаковка и этикетировка.

Маточные штаммы фагов готовили из пассажей исходных штаммов на индикаторных культурах энтеробактерий.

Для изготовления протейных фагов П-261 и П-16 УГСХА использовали штаммы Proteus vulgaris №261 и №3 соответственно; для энтеробактерных фагов Еп-2 и En-13 УГСХА - культуры Enterobacter cloaceae №10005 и Enterobacter aerogenes №2601;'дня клебсиеллезных фагов К-10 и К-81 УГСХА - штаммы Klebsiella pneumoniae*№1017 и №8172; для иерсиниозного фага Y/9 - штамм Yersinia enterocolitica серогруппы 09 №168-035; для цитробактерных фагов С-66, С-62 и С-52 - штаммы Citrobacter №9 и №16, а также Citrobacter amalonaticus №11 соответственно; для эшерихиозных фагов Е-67 и Е-61 УГСХА - штаммы E.coli Ol57 №51659 и РЛ; для морганеллезных фагов М 17 и М20 УГСХА - штаммы Morganella morgan» серологической группы 029 и 016.

Производственные штаммы энтеробактерий обладали типичными для своих родов и видов тинкториально-морфологическими, культуральными и ферментативными свойствами, были чувствительны к гомологичным фагам.

Исходные штаммы фагов поддерживали на вышеуказанных штаммах энтеробактерий. Они имели следующие характеристики: титр по Грациа был не ниже 108 корпускул в 1,0 см3, характерные для паспортных данных морфологии и размеры негативных колони. Фаги лизировали индикаторные и свежевыделен-

ные бактерии гомологичных родов и видов и не были активны по отношению к гетерологичным бактериям.

Питательной средой для приготовления индикаторных бактериофагов служил стандартный питательный бульон для культивирования микроорганизмов, который стерилизовали в автоклаве при 1 атм. в течение 20 минут.

Для приготовления маточных фагов использовали исходные фаги 4-го пассажа на индикаторных культурах. Их готовили на питательном бульоне (рН 7,47,6). Фаги с титром 108-109 корпускул в 1,0 см3 в объеме 2 см3 вносили в колбы с 45,0 см3 питательного бульона (рН 7,4-7,6). В колбы с фагами добавляли по 2,0 см3 18-ти часовых гомологичных фагам бульонных индикаторных культур. В качестве контроля использовали питательный бульон в пробирках объемом 4,5 см3, куда добавляли 0,2 см3 18-ти часовых бульонных индикаторных культур гомологичных фагам. Смеси инкубировали при 37°С в течение 4-6 часов. Через 4-6 часов мясо-пептонный бульон в колбах оставался прозрачным, а в контрольных пробирках наблюдался рост культур. Полученные морганеллез-ные, энтеробактерные, эшерихиозные, цитробактерные, протейные и клебсиел-лезные фаги прогревали на водяной бане при температуре 58-60°С, а фаг иер-синиозный фаг У/9 обрабатывали хлороформом в соотношении 1:10 в течение 30 минут.

Маточные фаги с титром не ниже 108 корпускул в 1,0 см3, в объеме 20,0 см3 добавляли в разные колбы, содержащие по 450,0 см3 питательного бульона. В эти же колбы вносили 20,0 см3 18-ти часовой соответствующих индикаторных бульонных культур, гомологичных фагам. Контролем служили пробирки с 4.5 см3 питательного бульона, куда добавляли 0,2 см3 18-ти часовых бульонных культур индикаторных штаммов. Смеси инкубировали при 37°С в течение 4-6 часов. Полученные термостабильные фаги прогревали на водяной бане при температуре 58-60°С, а термолабильный изолят обрабатывали хлороформом по вышеуказанной методике.

Для получения больших объемов фагов использовали бутыли с 4,5 литрами питательного бульона, куда вносили 200,0 см3 маточных фагов и по 200,0 см318-ти часовых индикаторных бульонных культур. В контрольные пробирки вносили 4,5 см3 питательного бульона и по 0,2 см индикаторных бульонных культур. Смеси инкубировали при 37°С в течение 4-6 часов. Полученные лиза-ты фильтровали через стерилизующие фильтры.

Из полученных объемов фагов отбирали пробы в количестве 30,0-50,0 см3 для определения чистоты физических свойств, титра по отношению к индикаторным культурам, реакции нарастания титра индикаторного фага в питательном бульоне, искусственно контаминированном гомологичными культурами энтеробактерий, спектра литической активности и специфичности. Контроль по всем показателям производили до разлива фагов во флаконы.

Для проверки качества фагов отбирали по 10 флаконов каждой серии, из которых 5 флаконов использовали для анализа, а остальные хранили в музее лаборатории в течение 18 месяцев при 4-6°С.

Контроль бактериофагов проводили, исследуя их на чистоту, стерильность, литическую активность, специфичность и степень нарастания титра фагов в РНФ.

По вышеуказанной методике было поучено по 5 литров каждого фага, которые использовали для дальнейших исследований.

Разработка схем исследования материала с целью выделения и ускоренной идентификации энтеробактерий

Используя строгую родовую, видовую и серогрупповую специфичность селекционированных бактериофагов, нами были разработаны схемы выделения и ускоренной идентификации вышеуказанных микроорганизмов.

В исследованиях использовали воду, комбикорм, мясо и фекалии телят и поросят, контаминированные энтеробактериями в концентрациях от 105 до 101 м.к. / см (г) исследуемого материала.

Бактериологические исследования проводили в соответствии с действующими «Методическими указаниями по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями» (1999).

Выделенные культуры энтеробактерий идентифицировали общепринятым методом и методом фагоидентификации.

В результате проведенных исследований названные микроорганизмы удалось обнаружить бактериологическим методом в концентрации 104-105 микробных клеток в 1,0 см3 (г) исследуемого материала за 96-120 часов.

Разработанные нами схемы фагоидентификации позволили на 42-48 часов быстрее идентифицировать выделенные культуры в сравнении с традиционной схемой, с меньшими затратами посуды, питательных сред и реактивов.

Разработка оптимальных условий постановки РНФ

При разработке оптимальных условий постановки РНФ мы определяли:

- количественный показатель реакции, имеющий диагностическое значение;

- оптимальное время, обеспечивающее полноценное взаимодействие фага с бактериями.

Определение количественного показателя РНФ, имеющего диагностическое значение

Для этих целей мы использовали методику, предложенную В.Я. Ганюшки-ным (1988) для проведения эксперимента постановки РНФ на МПБ, контами-нированном индикаторными культурами вышеуказанных энтеробактерий с различной концентрацией микробных клеток в 1,0 см3 питательного бульона (от 101 до 105).

Питательный бульон контаминировали 18 часовыми индикаторными культурами, гомологичными фагам, выращенными при 37°С. Контролем служил интактный питательный бульон.

Бактериофага использовали в рабочем разведении, содержащем не более 104 фаговых корпускул в 1,0 см3. Реакцию нарастания титра фага ставили по методике В.Д. Тимакова и Д.М.Гольдфарба для каждого разведения культуры.

Оценка результатов исследований представлена в таблице 5. 5. Результат реакции нарастания титра фага (РНФ)_

Увеличение количества корпускул индикаторного фага в отношении с контролем Результат

Увеличение в 2,5 раза Сомнительная оценка

Увеличение от 3 до 5 раз Слабо положительная оценка

Увеличение свыше 5 раз Положительная оценка

Увеличение более чем в 10 раз Резко положительная

В результате проведенных исследований, установлено, РНФ имеет положительный результат (увеличение количества корпускул индикаторных фагов П-16 и П-261 более чем в 5 раз) при контаминации питательного бульона гомологичными бактериями рода Proteus в концентрации 102 м.к./см3. Пробы, контаминированные цитробактерами, морганеллами, клебсиеллами, иерсинией энтероколитикой и Е. coli 0157 давали положительную РНФ с соответствующими фагами С-52 и С-66, М-17 и М20, К-10, Y/9, En-13, Е-61 и Е-57, с концентрацией бактерий 103 м.к./см3. Увеличение титра фагов С-61 (для цитробакте-ра), Еп-2 (для энтеробактера), К-81 (для клебсиелл) более чем в 5 раз происходило при концентрации этих энтеробактерий в питательном бульоне равной 104 м.к./см

Установление оптимального времени реакции нарастания титра фага

Для решения поставленной задачи нами были проведены эксперименты на тест-объекте по выявлению наиболее эффективного временного показателя взаимодействия фага и культуры при сохранении остальных параметров постановки РНФ (температурного режима, концентрации бактериальной культуры и фаговых корпускул в 1,0 см ). В качестве тест-объекта использовали сточные воды животноводческих хозяйств, искусственно контаминированные энтеро-бактериями, гомологичными фагам. Образцы проб сточных вод предварительно проверяли на присутствие исследуемых бактерий бактериологическим методом и в РНФ. Оптимальное время экспозиции выбирали из восьми параметров:

• При предварительном подращивании исследуемого материала в течение 5, 10, 16,24 часов при температуре 37°С, с последующим, после добавления фагов, инкубированием смеси при температуре 37°С в течение 5 часов;

•При увеличении времени контакта исследуемого материала с фагом до 7, 10, 16,24 часов при температуре 37°С.

Результаты исследований свидетельствуют о том, что чувствительность РНФ в зависимости от времени подращивания исходного материала при температуре 37°С повышается при увеличение времени инкубации, так при подращивание в течение 5 часов обнаруживали морганеллы. эшерихии, цитробактеры, энтеробактереры и клебсиеллы в концентрации 10 м.к./см3 (за исключением фага С61, с помощью которого выявляли гомологичных энтеробактерий в концентрациях 104. 10 часовая инкубация повысила чувствительность РНФ до 10 м.к./см3. Увеличение времени подращивания до 16 и 24 не вызвало существенных изменений чувствительности РНФ. На проведение исследование было затрачено 22, 33 и 41 час, соответственно. Бактериологическим методом энтеробактерий выделяли и идентифицировали в концентрации 104 м.к./см3 за 96 часов.

По результатам изучения чувствительности РНФ в зависимости от времени инкубации исследуемого материала с фагами установлена положительная динамика. После предварительного подращивания исследуемого материала в течение 5 часов удалось обнаружить энтеробактерии, гомологичные фагам М-17, М-20, Е-61 Е-67, С-52, С-66, Y/9, Еп-2, Еп-13, К-10 и К-81 в концентрации 103 м.к./1,0 см , фагу С-61 - 104, протейным фагам П-16 и П-261 - 10 м.к./см3. Увеличение времени предварительной инкубации до 10 часов повысило чувствительность РНФ на один порядок для всех фагов, кроме протейных. Во всех случаях энтеробактерии были обнаружены в исходной концентрации 102 м.к./ см , за исключением цитробактерий, которые обнаруживали только с помощью

фага С-61 в концентрации 103 м.к./ем3. Подращивание материала при 16 и 24-часовой экспозиции существенно не повлияло на результаты РНФ. Минимальная исходная концентрация энтеробактерий была такая же, как и при 10-часовой инкубации, за исключением морганелл, которые обнаруживали с помощью фага М-20 в концентрации 10 м.к./см3.

Во второй серии опытов изучали чувствительность РНФ в зависимости от времени инкубирования исследуемого материала с фагами. В результате проведенных исследований было установлено, что при инкубировании материала в течение 5 часов энтеробактерии были обнаружены с помощью РНФ гомологичными фагами М-17, М-20. Е-61, Е-67, С-52, C-66.Y/9, Еп-2, Еп-13, К-10 и К-81 в концентрации 103 м.к./см , фагом С-61 - 104 м.к./см , а фагами П16 и П- 261 -102 м.к./см3 исследуемого материала. Увеличение времени контакта материала с фагами позволило обнаружить исходные бактерии в концентрации 10 всеми фагами, кроме С-61, П-16 и П-261. Цитробактерии обнаруживали в концентрации 104 м.к./см3.

16 и 24часовой контакт исследуемого материала с фагами не повлиял на чувствительность РНФ, кроме опыта с фагом С-61, чувствительность которого повысилась на один порядок и составила 103 м.к. цитробактерий в 1,0 см исследуемого материала.

Полученные экспериментальные данные позволяют считать, что наиболее оптимальным являются режимы РНФ при 5 часовой экспозиции исследуемого материала с фагами, когда удается провести индикацию энтеробактерий в количестве 102- 103 m.k./cm изучаемого субстрата, на исследование которого затрачивается 16-24 часов. Поэтому данный режим используем в дальнейших исследованиях.

Исследование в РНФ проб водопроводной воды, комбикорма, фекалий и мяса, искусственно контаминированных энтеробактериями, с использованием специфических бактериофагов

Для этого пробы водопроводной воды, комбикорма, фекалий и мяса в количестве 5,0 см3(г) контаминировали энтеробактериями Е. coli 0157 шт. PJI и 904, М. morganii серогрупп 016, 029; Y. enterocolitica серогруппы 09, C.amalonaticus №11 и C.freundii №16, №9; Е. cloaceae №10005 и Е. aerogenes №2601; P. vulgaris №261 и №3; К. pneumoniae №1017, №8172 в концентрациях от 101 до 105 м.к./см3(г) исследуемого материала. РНФ ставили для каждого разведения культуры.

При исследовании воды все индикаторные штаммы энтеробактерий были обнаружены с помощью гомологичных фагов в концентрации 103 м.к./см3. Аналогичные данные были получены при исследовании комбикорма. Только с помощью бактериофага П-261 удалось обнаружить протеев в количестве 102 см3/г исследуемого субстрата.

Разную чувствительность в РНФ показали различные фаги при исследовании проб фекалий. Наименьшую чувствительность РНФ показала при обнаружении цитробактерий с использованием фага С-61. Увеличение титра фага более чем в 5 раз происходило при концентрации культуры С. freundii №16 105 м.к./г.

Постановка РНФ с контаминированным энтеробактериями мясом показала, что гомологичные фагам микроорганизмы удалость обнаружить в концентрации 103 м.к./г. Исключением был протейный фаг П-261 при применении которого культура P. vulgaris была обнаружена в концентрации 102 м.к./г.

ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ РНФ В УСЛОВИЯХ ПРОИЗВОДСТВА

Для оценки эффективности реакции нарастания титра фага в условиях производства нами были проведены комиссионные исследования по фагодиагностике кишечной инфекции телят и поросят, протекающих с участием энтеробактерий вида М. morganii, родов Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella и Proteus, а также индикацию бактерий вида Y. enterocolitica в сточных водах ферм животноводческих хозяйств, где циркулировали эти микроорганизмы.

При постановки РНФ с целью обнаружения морганелл, энтеробакгеров, нитробактерий и протеев использовали фекалии от больных диареей поросят-сосунов, принадлежащих ЗАО «СВ - Поволжское» Ставропольского района Самарской области и Учебно-опытному хозяйству УГСХА Чердаклинского района Ульяновской области.

С целью обнаружения клебсиелл и цитробактеров исследовали фекалии от больных диареей новорожденных телят, принадлежащих молочно-товарной ферме учебно-опытного хозяйства УГСХА Чердаклинского района Ульяновской области и колхозу им. «20-летия Партийного съезда» Сергиевского района Самарской области.

Фагоиндикацию Y. enterocolitica проводили в сточных водах, взятых из канализации животноводческих ферм ОАО «Кондабулакское», ООО «Золотая нива», колхоза им. «20-летия Партийного съезда» ОАО «Орлянское» Сергиевского района Самарской области.

Комиссионные исследования проводили в условиях лаборатории кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ УГСХА, в Чердаклинской районной ветеринарной лаборатории Ульяновской области и в Сергиевской районной ветеринарной лаборатории Самарской области.

В результате проведенных исследований одиннадцати проб фекалий бактериологическим методом были обнаружены бактерии рода Morganella в 3 пробах (25%), на исследование было затрачено 96 часов.

При исследовании материала в РНФ с использованием морганеллезных бактериофагов М-17 и М-20 серии УГСХА, положительная реакция была в 6 пробах фекалий (50%). Время индикации при этом составило 18 часов.

В результате исследований 13 проб фекалий от больных диареей телят в возрасте 1-4 суток при помощи РНФ с использованием клебсиеллезных бактериофагов К-10 и К-81, положительный результат отмечали в 38% случаях, в том числе в двух пробах фекалий из которых были выделены бактерии рода Klebsiella. Время индикации при этом составило 22 часа. Бактериологическим методом, клебсиеллы были обнаружены в 15% случаях (в двух пробах) с затратой времени - 96 часов (4 суток).

При исследовании 11 проб фекалий от больных диареей поросят-сосунов в возрасте 1-12 суток бактерии рода Proteus бактериологическим методом были обнаружены в 36% проб при времени исследования 96 часов.

Использование для этих целей РНФ с применением специфических протейных бактериофагов П-16 и П-261 позволило обнаружить бактерии этого рода в 55% проб фекалий, что на 19% больше, чем при бактериологическом методе исследования. Время индикации при этом составило 18 часов.

Бактериологические исследования 10 проб фекалий от больных диареей поросят в возрасте 2-12 суток и 8 проб - от больных диареей телят в возрасте 210 суток с целью обнаружения цитробактеров показали, что названные микроорганизмы были обнаружены в 20 и 37,5% проб. Время, затраченное на исследование, составило 120 часов.

При исследовании материала в РНФ с использованием диагностических цитробактерных бактериофагов С-53, С-61 и С-66 положительная реакция была оценена положительно в 60 и 62,5% проб соответственно. При этом на исследование было затрачено 20 часов.

При бактериологическом исследовании 11 проб фекалий от поросят бактерии рода Enterobacter были выделены в 9% случаев. Время исследования составило 120 часов. При исследовании материала методом РНФ с использованием диагностических бактериофагов бактерии рода Enterobacter были обнаружены в 27% проб.

Таким образом, при исследовании фекалий больных диареей телят и поросят методом РНФ с использованием специфических бактериофагов частота выделения энтеробактерии рода Proteus увеличивается на 19%, рода Klebsiella - на 23%, рода Citrobacter - на 34,1%, рода Enterobacter - на 18% и вида М. morganii — на 25% случаев по сравнению с результатами бактериологического метода исследований. Время на исследования при этом сокращается с 96-120 до 18-22 часов.

Для оценки эффективности РНФ с использованием специфического иерси-ниозного бактериофага Y/9 при обнаружении возбудителя кишечного иерси-ниоза в условиях производства исследовали 40 проб сточных вод, взятых из четырех животноводческих хозяйств Самарской области. Одновременно пробы подвергали бактериологическому исследованию: обычным способом и методом холодового обогащения. Для чего первичные посевы и выделение чистых культур микроорганизмов производили в соответствии с правилами, указанными в вышеупомянутых методических указаниях. Для этого материал высевали на среды Эндо, Серова, агар с бромтимоловым синим (БТС) и инкубировали при температуре 26-28°С в течение 24-48 часов. Оставшийся материал помещали в ФБР для «холодового обогащения» в условиях бытового холодильника (+4°С) на 16 суток, после чего проводили выделение и идентификацию возбудителя кишечного иерсиниоза.

В результате проведенных исследований сорока проб сточных вод из четырех хозяйств удалось выделить Y. enterocolitica: без холодового обогащения из 3 проб (17,5 %), на исследование затрачивалось 96 часов; методом холодового обогащения из 12 проб (30%), на исследование затрачено 16 суток. При исследовании материала в РНФ с использованием иерсиниозного фага Y/9 УГС-ХА положительная реакция была в 24 (60 %) пробах сточных вод. Время индикации при этом составило 24-35 часов (табл. 6).

6.Результаты исследования проб сточных вод хозяйств

Самарской области

Количество проб, в которых обнаружены энтеробактерии Y. enterocolitica

Исследо- бактериологический метод

вано проб без холодового обогащения методом холодового обогащения РНФ

Кол-во % Кол-во % Кол-во %

40 3 7,5 12 30 24 60

выводы

1. Из объектов внешней среды и материала от животных было выделено 121 изолят бактериофагов, лизирующих патогенных энтеробактерий родов Proteus, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella; видов Morganella morganii,Yersinia en-terocolitica, E. coli сероваров 0157.-H7 и 0157:H-, которые имели литическую активность в пределах 10 -10® корпускул в 1,0 см3 (по методу Грациа) и 10'1 -10"8 (по методу Аппельмана).

2. Выделенные и селекционированные бактериофаги обладали разным диапазоном литической активности по отношению к гомологичным энтеробак-териям и выраженной специфичностью. Эшерихиозные бактериофаги активны только в отношении штаммов Е. coli 0157:Н7 и 0157:Н-, морганеллезные и иерсиниозные бактериофаги лизировали представителей только своего вида, а энтеробактерные, клебсиеллезные и протейные фаги имели межвидовые перекрестные реакции в пределах родов. Сектор лизиса составил от 7 до 100% из числа изученных гомологичных фагам штаммов энтеробактерий.

3. Изоляты фагов серии УГСХА Morganella morganii М-17 и М-20; Escherichia coli 0157 Е-61 и Е-67; Citrobacter С-61, С-66 и С-52; Yersinia enteroco-litica Y/9; Proteus П-16 и П-261; Enterobacter En-2 и En-13; Klebsiella K-10 и K-81, обладающие высокой литической активностью, широким диапазоном литической активности и специфичностью были отобраны для конструирования диагностических препаратов, депонированы в коллекции Всероссийского государственного центра качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов, признаны перспективными для изготовления диагностических и лечебно-профилактических препаратов. Они не снижали свою литическую активность при хранении в течение 12 месяцев, большинство были термостабильными и хлороформоустойчивыми.

4. Получены гипериммунные сыворотки на производственные штаммы фагов, которые проявляли нейтрализующую активность в разведениях от 1:5 до 1:640. Наибольшее разведение, при котором происходила нейтрализация 100% фаговых корпускул, у всех сывороток было 1:80. Константы скорости нейтрализации были в пределах 20,79±0,6 - 72,05±0,82 мин'1. Изучение антигенного родства фагов в перекрестных реакциях нейтрализации показало, что гетероло-гичные сыворотки нейтрализовали цитробактерные бактериофаги С-61 и С-66 на 52,7 и 52,2% и по этому показателю фаги являются отдаленно родственными. Близкородственные антигенные связи имели протейные бактериофаги П-16 и П-261, так как степень их нейтрализации гетерологичными сыворотками равна 74,7 и 78,7%. Остальные изоляты фагов имели перекрестный процент нейтрализации от 0 до 20,7, что свидетельствует об отсутствии у них родственных антигенных связей.

5. Селекционированные бактериофаги проявили разную адсорбционную способность. Наиболее активно на клетках-хозяев адсорбировались морганеллезные фаги М-17 и М-20, цитробактерные фаги С-66, протейный фаг П-261 и энтеробактерный - Еп-2, константы скорости адсорбции у которых были в пределах К= 5,6 - 7,1 см 3/мин"'. Менее активно адсорбировались эшерихиозные фаги Е-61 и Е-67, цитробактерный фаг С-52, энтеробактерный фаг Еп-13, иерсиниозный фаг Y/9, протейный фаг П-16, клебсиеллезные фаги К-10 и К-81 константа скорости адсорбции у них составила К=3,8 - 4,6 см 3/мин"\ Самую низкую скорость адсорбции из изученных изолятов имел цитробактерный фаг С-61 (К=2,9 см 3/мин"').

6. Изучение показателей внутриклеточного развития фагов показало, что наиболее короткий латентный период длительностью 19-22 минуты обладали изоляты фагов М-20 М. morganii, Е-61 Е. coli 0157:Н7, С-66 С. freundii, С-52 С. amalonaticus, En-2 Е. cloacae, П-261 P. vulgaris, К-81 Kl. pneumoniae. Фаги Еп-13 Е. cloacae, П-16 P. vulgaris и К-10 Kl. pneumoniae имели латентный период в пределах 24-26 минут. Самый длинный латентный период от 36 до 45 минут был у фагов М17 М. morganii, С-61 С. freundii и Y/9 Y.enterocolitica. Наибольшую урожайность имели бактериофаги Ml7, М20 Е-61,С-66, С-52, Еп-2, П-261, К-10, которая насчитывала от 126 до 239 фаговых корпускул на одну микробную клетку. Бактериофаги Е-67, С-61, Y/9, Еп-13, П-16 и К-81 имели средний выход фаговых частиц на одну микробную клетку в пределах от 50 до 101.

7. Проведенные молекулярно-биохимические исследования бактериофагов свидетельствуют о том, что нуклеиновые кислоты всех изученных фагов представлены типом ДНК размером от 4500 п.о. до 6700 п.о.

8. В результате определения таксономического положения выделенных бактериофагов было установлено, что 10 изученных фагов: морганеллезные (М-17 и М-20), цитробактерные (С-52, С-61 и С-66), эшерихиозные (Е-61 и Е-66), иерсиниозный (Y/9), клебсиеллезный (К-81) и энтеробактерный (Еп-13) в соответствии с Международной классификацией и номенклатурой вирусов относятся к морфологическому семейству Myoviridae, а по классификации А.С.Тихоненко - к V морфологической группе «Фаги с отростком сложного строения, чехол которого способен к сокращению». Два фага - один клебсиеллезный (К-10) и один энтеробактерный (Еп-2), были отнесены нами к семейству Siphoviridae и к IV морфологической группе «Фаги с несокращающимся отростками». Оба протейных бактериофага (П-16 и П-261) по морфологическим показателям относятся к семейству Pododoviridae и ко II морфологической группе «Фаги с аналогом отростка».

9. Разработаны оптимальные биотехнологические параметры производства и контроля фаговых препаратов, которые позволяют получить специфические диагностические бактериофаги для индикации и идентификации энтеро-бактерий родов Proteus, Morganella, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, видов Yersinia enterocolitica и Escherichia coli сероваров 0157:H7 и 0157:H- с литиче-ской активностью не ниже 10"7 (по Аппельману) и не ниже 109 фаговых корпускул в 1,0 см3 (по Грациа).

10. Разработанные схемы и методики выделения и фагоидентификации энтеробактерий с помощью позволяет выделить и идентифицировать гомологичные бактерии за 48 часов.

11. Разработанные схемы и методики ускоренной индикации энтеробактерий с помощью РНФ в объектах санитарного надзора с использованием набора фагов позволяет обнаружить гомологичных бактерий за 18-24 часов.

12. Проведенные исследования по фагоиндикации энтеробактерий в условиях производства, показали, что в сточных водах животноводческих помещений, неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям молодняка животных, а также в фекалиях больных диареей телят и поросят частота обнаружения энтеробактерий рода Proteus увеличивается на 19%, рода Klebsiella - на 23%, рода Citrobacter - на 34,1%, рода Enterobacter - на 18% и вида М. morganii - на 25%, вида Y. enterocolitica - на 48-52,5,5% случаев в сравнении с результатами бактериологического метода исследований. Время на исследования при этом сокращается с 96-120 до 18-35 часов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для изготовления диагностических фаговых препаратов предложено четырнадцать перспективных штаммов, депонированных в коллекции Всероссийского государственного центра качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов: Phagum Morganella morganii М17 УГСХА -ДЕП; Phagum Morganella morganii M-20 УГСХА - ДЕП; Phagum Escherichia coli 0157 E-61 УГСХА - ДЕП; Phagum Escherichia coli 0157 E-67 УГСХА - ДЕП; Phagum Citrobacter C-61 УГСХА - ДЕП; Phagum Citrobacter C-66 УГСХА -ДЕП; Phagum Citrobacter C-52 УГСХА - ДЕП; Phagum Yersinia enterocolitica Y/9 УГСХА - ДЕП; Phagum Proteus П-16 УГСХА - ДЕП; Phagum Proteus П-261 УГСХА - ДЕП; Phagum Enterobacter En-2 УГСХА - ДЕП; Phagum Enterobacter En-13 УГСХА - ДЕП; Phagum Klebsiella K-10 УГСХА - ДЕП; Phagum Klebsiella K-81 УГСХА -ДЕП.

2. Изготовление и контроль фаговых диагностических препаратов рекомендуем производить в соответствие с разработанными нами нормативно-техническими документами:

- «Инструкцией по изготовлению и контролю лабораторной серии эшери-хиозных бактериофагов E.coli 0157, Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА», утвержденной ученым советом и ректором УГСХА 16.02.2004 г.

- «Инструкцией по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофагов Citrobacter С-52 УГСХА, С-61 УГСХА и С-66 УГСХА», утвержденной ученым советом и ректором УГСХА 16.02.2004 г.

- «Инструкцией по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофагов Morganella morganii Ml 7 УГСХА, и М20 УГСХА», утвержденной ученым советом и ректором УГСХА 16.02.2004г.

- «Инструкцией по изготовлению и контролю бактериофага Yersinia enterocolitica Y/9 УГСХА», утвержденной ученым советом и ректором УГСХА 17.01.2005 г.

- «Инструкцией по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофагов Proteus П-16 УГСХА и П-261 УГСХА», утвержденной ученым советом и ректором УГСХА 17.01.2006 г.

- «Инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофагов Enterobacter En-2 УГСХА и En-13 УГСХА», утвержденной ученым советом и ректором УГСХА 17.01.2006 г.

- «Инструкцией по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофагов Klebsiella К-10 УГСХА и К-81 УГСХА», утвержденной ученым советом и ректором УГСХА 17.01.2006 г.

3. Фагоиндикацию и фагоидентификацию энтеробактерий рекомендуем проводить в соответствии с разработанными нами:

- «Методическими рекомендациями по ускоренной индикации и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки в Е. coli 0157:Н7 и 0157:Н- в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов», утвержденными Отделением ветеринарной медицины РАСХН 4 октября 2004 года;

- «Методическими рекомендациями по ускоренной индикации и идентификации энтеробактерий вида Morganella morganii в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов», утвержденными Отделением ветеринарной медицины РАСХН 4 октября 2004 года;

- «Методическими рекомендациями по ускоренной индикации и иденти-

фикации энтеробактерий рода Citrobacter в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов», утвержденными Отделением ветеринарной медицины РАСХН 4 октября 2004 года;

- «Методическими рекомендациями по ускоренной индикации и идентификации энтеробактерий вида Yersinia enterocolitica в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфического бактериофага», утвержденными Отделением ветеринарной медицины РАСХН 26 июня 2006 года;

- «Методическими рекомендациями по ускоренной индикации и идентификации энтеробактерий рода Proteus в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов», утвержденными Отделением ветеринарной медицины РАСХН 26 июня 2006 года;

- «Методическими рекомендациями по ускоренной индикации и идентификации энтеробактерий рода Klebsiella в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов», утвержденными Отделением ветеринарной медицины РАСХН 26 июня 2006 года;

- «Методическими рекомендациями по ускоренной индикации и идентификации энтеробактерий рода Enterobacter в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов», утвержденными Отделением ветеринарной медицины РАСХН 26 июня 2006 года.

4. Материалы диссертационных исследований используются в учебном процессе на лекциях и лаборатоно-практических занятиях со студентами и слушателями ФПК по микробиологии, вирусологии, биотехнологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизе продуктов животноводства в 16 ВУЗах РФ.

5. Создана новая коллекция штаммов бактериофагов, которые могут быть использованы в научных, производственных и учебных учреждениях для прикладных и фундаментальных исследований в области микробиологии, вирусологии, биотехнологии, биологии, ветеринарии и медицины.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Золотухин C.fL Антибиотикорезистентность полевых штаммов морганелл, выделенных от погибших и больных диареей поросят. Материалы 7-ой межгосударственной конференции «Новые фармакологические средства в ветеринарии». Санкт-Петербург, - 1995, - С. 78-79.

2. Золотухин С.Н. Этиологическое значение морганелл в возникновении инфекционной диареи у поросят. Материалы международной конференции МВА «Инфекционные болезни молодняка» // Москва, - 1996.

3. Золотухин С.Н. Выделение и идентификация морганелл при желудочно-кишечных заболеваниях поросят. //Состояние и перспективы развития научных исследований по профилактике и лечению болезней сельскохозяйственных животных и птиц. Материалы научной конференции посвященной 50-летию Краснодарской НИВС. Краснодар, 1996, с. 54-55.

4. Золотухин С.Н., Васильев Д.А., Кузнецов А.Ю., Каврук J1.C. Разработка режимов выделения бактериофагов рода Morganella. Материалы международной кон-

ференции. Проблемы инфекционных и инвазионных болезней на современном этапе в животноводстве. Москва, 1999, - С 71.

5. Золотухин С.Н., Малов A.A. Ганюшкин В.Я. Выделение лактозоотрицатель-ных энтеробакгерий при желудочно-кишечных заболеваниях поросят. // Актуальные проблемы ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции. Материалы 2-ой межгосударственной конференции. Москва, 1997, с. 124-125.

6. Золотухин С.Н., Каврук JI.C. Влияние экологических факторов на биологические свойства морганелл. // Сб. научных работ. Вопросы микробиологии, эпизоотологии и ВСЭ. Ульяновск 1998. - С.51-55.

7. Золотухин С.Н., Каврук JI.C. Биологические свойства морганелл и их значение в патологии сельскохозяйственных животных. // Сб. научных работ. Вопросы микробиологии, эпизоотологии и ВСЭ. Ульяновск 1998. С.56-68.

8. Каврук JI.C., Золотухин С.Н., Васильев Д.А., Ганюшкин В.Я. Роль М. morgan» в этиологии кишечной инфекции телят и поросят. // Учебное пособие. Ульяновск 1998, 38 с.

9. Золотухин С.Н., Малов A.A., Ганюшкин В.Я., Черников A.A. Ускоренный метод первичной дифференциации некоторых энтеробакгерий. // Сб. научных работ. Вопросы микробиологии, эпизоотологии и ВСЭ. Ульяновск 1998, с. 68-72.

Ю.Золотухин С.Н., Каврук J1.C , Васильев Д.А. Биологические свойства бактерий рода Morganella и их значение в патологии животных. // Ветеринария, 1999, №2, с. 25-28.

П.Золотухин С.Н., Васильев Д.А., Данилов О.В., Кузнецов А.Ю., Ганюшкин В.Я. Видовой состав энтеробакгерий выделенных от поросят свинофермы УГСХА. // Сб. научных работ УГСХА. Диагностика, лечение, профилактика заболеваний животных. Сб. научных работ УГСХА. Ульяновск, 1999, С.3-11.

12.Золотухин С.Н., Васильев Д.А., Афонин Э.А. Этиологическая структура возбудителей смешанной кишечной инфекции у телят. // Диагностика, лечение, профилактика заболеваний животных. Ульяновск 1999. с. 91-98.

13.Золотухин С.Н., Васильев Д.А., Кузнецов А.Ю., Данилов О.В. Методы лабораторной диагностики патогенных энтеробактерий. // Диагностика, лечение, профилактика заболеваний животных. Сб. научных работ УГСХА. Ульяновск 1999 с. 87-94.

14. Золотухин С.Н., Данилов О.В., Кузнецов А.Ю., Васильев Д.А. Видовой состав и биологические свойства энтеробактерий, выделенных из фекалий больных диареей поросят. Сб. научных работ УГСХА, часть 2. - Ульяновск, - 1999, - с.

15.Золотухин С.Н., Кузнецов А.Ю., Васильев Д.А., Каврук JI.C. Выделение бактериофагов рода Morganella. // Материалы международной научно-практ. конф. Проблемы инфекционных и инвазионных болезней на современном этапе в животноводстве. Москва, 1999, с.

16.3олотухин С.Н., Северов О.П. Васильев Д.А. Выделение и идентификация бактерий Citrobacter при желудочно-кишечных заболеваниях молодняка. Диагностика, лечение, профилактика заболеваний животных. Ульяновск 1999. с.99-103

17.Померанцев Д.А., Васильев Д.А., Золотухин С.Н. Разработка ускоренной схемы выделения и идентификации бактерий вида Yersinia enterocolitica. // Сб. науч. работ. Вопросы микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы. Вып. 4. Ульяновск, 2000. с. 19-21.

18.Померанцев Д.А., Васильев Д.А, Золотухин С.Н Биологические свойства бактериофагов Yersinia enterocolitica выделенных из объектов внешней среды. // Сб. науч. работ. Вопросы микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы. Вып. 4. Ульяновск, 2000, с. 21-23.

19.Золотухин С.Н., Костров И.С. Этиология желудочно-кишечных заболевания у телят на МТФ Учхоза УГСХА. Вопросы микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы. Вып. 4. Ульяновск, 2000, с.58-60.

20. Золотухин С.Н. Изменение литической активности морганеллезного бактериофага при хранении. Материалы международной конференции. Проблемы инфекционных и инвазионных болезней животноводстве на современном этапе. Москва, MB А, 1999, с. 80.

21.Золотухин С.Н., Кузнецов А.Ю., Васильев Д.А. Распространение фагов мор-ганелл в объектах внешней среды. Сб. Вопросы микробиологии, эпизоотологии и ВСЭ. Ульяновск 2000, С. 41-42.

22. Золотухин С.Н., Васильев Д.А., Ведеркер Ю.В. К вопросу о фагодиагностике рода Klebsiella. Сб. Вопросы микробиологии, эпизоотологии и ВСЭ. Ульяновск 2000, С.42-45.

23.Золотухин С.Н., Васильев Д.А., Молофеева Н.И. Биологические свойства бактерий рода Proteus и их роль в патологии животных Сб. Вопросы микробиологии, эпизоотологии и ВСЭ. Ульяновск 2000, С.47-53.

24.Золотухин С.Н., Васильев Д.А., Пульчеровская Л.П. Бактерии рода Citrobacter и их бактериофаги. Сб. Вопросы микробиологии, эпизоотологии и ВСЭ. Ульяновск 2000, С. 53-58.

25.Васильев ДА., Померанцев ДА, Русалеев B.C., Золотухин С.Н. Усовершенствование бактериологического метода диагностики кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных. Материалы международной конференции «Современные вопросы ветеринарной медицины и биологии», Уфа, 2000. С. 54-57.

26.Васильев Д.А., Померанцев Д.А, Русалеев B.C., Золотухин С.Н. Выделение бактериофагов Y. enterocolitica из объектов внешней среды и их литическая активность .//Материалы международной конференции «Современные вопросы ветеринарной медицины и биологии», Уфа, 2000, с. 57-59.

27.3олотухин С.Н., Молофеева Н.И., Васильев Д.А. Изучение чувствительности Е. coli 0157 к колифагам. Вестник УГСХА, Ульяновск, 2001. С.59-63.

28.Васильев Д.А., Золотухин С.Н., Померанцев Д.А., Каврук Л.С., Русалеев B.C. Биологические свойства бактериофагов Y. enterocolitica. Ж. Ветеринария №1,2003.

29.Золотухин С.Н., Пульчеровская Л.П., Васильев Д.А. Выделение и селекция бактериофагов рода Citrobacter. Вестник ветеринарии, В. V, Оренбург, 2002, с.29-32.

30.Золотухин С.Н., Молофеева Н.И., Васильев Д.А. Выделение и изучение некоторых биологических свойств эшерихиозных фагов. Вестник ветеринарии, В. V, Оренбург, 2002, с. 88-93.

31 .Золотухин С.Н. Васильев Д.А. Проблемы применения бактериофагов в вете-ринарии.//Вестник ветеринарии, В. V, Оренбург, 2002, с. 93.

32.Золотухин С.Н., Пульчеровская Л.П., Кирьянова H.A., Васильев Д.А. Выделение фагов бактерий рода Citrobacter из объектов внешней среды и патологического материала.//Вестник УГСХА, сб, научных трудов УГСХА, Ульяновск, 2003, с. 29-32.

33.Золотухин С.Н., Пульчеровская Л.П., Васильев Д.А. Изменение литической активности бактериофагов рода Citrobacter при хранении. Материалы Всероссийской научно-производственной конференции, Ульяновск, 2003, с.222-223.

34.Коритняк Б.М. Васильев Д.А., Золотухин С.Н. Сравнительное изучение различных методов выделения фагов возбудителя кишечного иерсиниоза // Инновационные технологии в аграрном образовании, науки и АПК России, часть 2: Материалы Всероссийской научно-практической конференции. - Ульяновск, 2003. - с. 231-233.

35.Золотухин С.Н, Молофеева Н.И., Васильев Д.А., Бульканова Е.А. Чувствительность к антибиотикам патогенных и непатогенных штаммов эшерихий, выделенных из объектов внешней среды и патологического материала при желудочно-кишечных заболеваниях молодняка животных. Материалы международной научно-практической конференции, Воронеж, 2002. С. 276-277.

Зб.Золотухин С.Н., Молофеева Н.И., Васильев Д.А. Изучение некоторых биологических свойств выделенных бактериофагов Е. coli. Вестник УГСХА, 2002. С. 36-38

37.Золотухин С.Н., Молофеева Н.И., Васильев Д.А. Влияние факторов внешней среды на бактериофаги Е. coli 0157 и штаммы клеток хозяев. Материалы Всероссийской научно-производственной конференции, Ульяновск, 2003.с.219-222.

38.Золотухин С.Н. Малоизученные энтеробактерии и их значение в патологии животных. Монография. Ульяновск, 2004,152 с.

39.Митрохина Е.Н., Бульканова Е.А., Золотухин С.Н. Бактерии рода Enterobacter и их бактериофаги.// Вестник УГСХА №12, «Ветеринария», Ульяновск, 2004 г. С.22-27.

40.Митрохина Е.Н., Аникин А.С., Золотухин С.Н. Оптимальная схема выделения бактерий рода Enterobacter// Вестник УГСХА №12, «Ветеринария» Ульяновск, 2004 г. С. 27-30.

41.Митрохина Е.Н., Золотухин С.Н. Выделение бактериофагов бактерий рода Enterobacter // Вестник УГСХА №12, «Ветеринария» Ульяновск, 2004 г. - с.30-32

42.Митрохина Е.Н., Золотухин С.Н. Определение активности бактериофагов бактерий рода Enterobacter. Вестник УГСХА №12, «Ветеринария» Ульяновск, 2004 г. С. 32-34.

43.Бульканова Е.А., Золотухин С.Н., Митрохина Е.Н. Биологические свойства бактерий рода Klebsiella и их значение в патологии животных.// Вестник УГСХА №12, «Ветеринария» Ульяновск, 2004 г., С.34-40.

44.Бульканова Е.А., Золотухин С.Н. Выделение бактериофагов рода Klebsiella из сточных вод. // Вестник УГСХА №12, «Ветеринария» Ульяновск, 2004 г. С. 40-42.

45.Золотухин С.Н., Пульчеровская Л.П., Васильев Д.А., Пономарев А.П. Определение морфологических параметров цитробактерного бактериофага // Вестник УГСХА №12, «Ветеринария» Ульяновск, 2004 г. С. 42-46

46.Феоктистова Н.А., Золотухин С.Н., Васильев Д.А.. Методы лабораторной диагностики заболеваний, вызываемых бактериями рода Proteus или протекающих с их участием. // Вестник УГСХА №12, «Ветеринария» Ульяновск, 2004 г. С. 46-50

47.Золотухин С.Н., Пульчеровская Л.П., Васильев Д.А. Разработка оптимальных количественных параметров соотношения культуры фага для получения препаратов с высокой активностью. // Вестник УГСХА №12, «Ветеринария» Ульяновск, 2004 г.- С. 50-53.

48.Золотухин С.Н., Пульчеровская Л.П., Васильев Д.А. Изыскание альтернативных средств и методов для диагностики заболеваний, вызываемых бактериями рода Citrobacter. // Вестник УГСХА №12, «Ветеринария» Ульяновск, 2004 г, с. 53-57.

49.Н.И. Молофеева, Золотухин С.Н., Васильев Д.А. Выделение и ускоренная идентификация Escherichia coli 0157. // Вестник УГСХА №12, «Ветеринария» Ульяновск, 2004 г. С. 57-60.

50.Коритняк Б.М., Васильев Д.А., Золотухин С.Н. Эпидемиология кишечного иерсиниоза // Вестник УГСХА №12, «Ветеринария» Ульяновск, 2004 г. С. 60-63.

51 .Бульканова Е.А., Мелехин А.С., Золотухин С.Н, Васильев Д.А. Биологические свойства бактериофагов Klebsiella, выделенных из объектов внешней среды. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции. Ч.-5, Ульяновск, 2005, с. 154-157.

52.Бульканова Е.А., Мелехин А.С., Золотухин С.Н., Васильев Д.А Литическая активность бактериофагов рода Klebsiella // Материалы Всероссийской научно-практической конференции. Ч.-5, Ульяновск, 2005, с. 152-154.

53.Пожарникова Е.Н., Мелехин А.С, Золотухин С.Н. Диапазон литического действия выделенных бактериофагов бактерий рода Enterobacter. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции. Ч.-5, Ульяновск, 2005, с. 157-159.

54.Пожарникова Е.Н., Золотухин С.Н, Васильев Д.А. Определение устойчивости бактериофагов Еп-2 УГСХА и En-13 УГСХА к воздействию температуры и хлороформа // Материалы Международной научно-практической конференции. Ч.-1, Ульяновск, 2006, с. 392-394.

55.Пожарникова Е.Н., Золотухин С.Н., Васильев Д.А. Антибиотикочцвствитель-ность бактерий рода Enterobacter // Материалы Международной научно-практической конференции Ч -1, Ульяновск, 2006, с. 392-394.

56.Коритняк Б.М., Золотухин С.Н., Васильев Д.А. Изучение устойчивости выделенных бактериофагов к воздействию хлороформа. // Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы часть IV: Материалы научно-практической конференции. - Ульяновск, 2005, с. 162-163.

57.Коритняк Б.М., Васильев Д.А., Золотухин С.Н. Выделение бактериофагов вида Yersinia enterocolitica. // Молодые ученые в решении региональных проблем АПК: Сб. научн. Трудов научно-практической конф. - Самара, 2005.-е. 192-194.

58.Бульканова Е.А., Золотухин С.Н, Васильев Д.А. Выделение бактериофагов рода Klebsiella из объектов внешней среды. // Молодые ученые в решении региональных проблем АПК: Сб. научн. трудов научно-практической конф. - Самара, 2005. - с. 189-191.

59.Молофеева Н.И., Золотухин С.Н., Васильев Д.А. Влияние противоопухлевых препаратов - циклофосфана и лейкерана на бактерии Е. coli 0157 и их бактериофаги. Материалы Всероссийской научно-практической конференции. Ч.-5, Ульяновск, 2005, с.168-170.

60.Феоктистова Н.А., Мелехин А.С., Золотухин С.Н., Васильев Д.А. Выделение фагов бактерий рода Proteus из объектов внешней среды.// Материалы Всероссийской научно-практической конференции. Ч.-5, Ульяновск, 2005, с. 170-173.

61.Феоктистова Н.А., Мелехин А.С, Золотухин С.Н., Васильев Д.А. Изучение некоторых биологических свойств выделенных фагов бактерий рода Proteus.// Материалы Всероссийской научно-практической конференции. Ч.-5, Ульяновск, 2005, с. 173-176.

62.Методические рекомендации по индикации и идентификации энтеробакгерий вида Morganella morganii в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов.// РАСХН, Москва, 2005. 16 с. (С.Н. Золотухин, А.Ю. Кузнецов, Д.А. Васильев, JI.C. Каврук.).

63.Методические рекомендации по индикации и идентификации энтерогеморра-гической кишечной палочки Е. coli 0157:Н7 и 0157:Н- в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бакгериофагов.//РАСХН, Москва, 2005. 16 с. (С.Н. Золотухин, Н.И. Молофеева, Д.А. Васильев, JI.C. Каврук).

64.Методические рекомендации по индикации и идентификации энтеробакгерий рода Citrobacter в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов. РАСХН, Москва, 2005, 16 с. (С.Н. Золотухин, Л.П. Пульчеровская, Д.А. Васильев, Л.С. Каврук.).

65.Методические рекомендации по индикации и идентификации энтеробакгерий рода Klebsiella в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов. РАСХН, Москва, 2006, 16 с. (С.Н. Золотухин, Е.А. Бульканова, Д.А. Васильев, Л.С. Каврук.).

66.Методические-рекомендации по индикации и идентификации энтеробактерий рода Proteus в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов. РАСХН, Москва, 2006, 16 с. (С.Н. Золотухин, Н.А. Феоктистова, Д.А. Васильев, Л.С. Каврук.).

67.Методические рекомендации по индикации и идентификации энтеробактерий рода Enterobacter в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов. РАСХН, Москва, 2006, 16 с. (С.Н. Золотухин, Е.Н. Пожарникова, Д.А. Васильев, Л.С. Каврук.).

68.Методические рекомендации по индикации и идентификации энтеробактерий рода Yersinia в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфического бактериофага. РАСХН, Москва, 2005, 16 с. (С.Н. Золотухин, Б.М. Коритняк, Д.А. Васильев, Л.С. Каврук.).

69.Васильев Д.А., Золотухин С.Н., Жигалева О.Н., Русалеев B.C., Каврук Л.С. Разработки УлГСХА в области фагодиагностики, фаготерапии и фагопрофилактики. // Материалы международного семинара «Перспективы использования препаратов

бактериофага для превенции и лечения инфекций, вызванных патогенными и условно-патогенными микроорганизмами» Тбилиси, 2005, с. 14.

70.Золотухин С.Н., Васильев Д.А., Жигалева О.Н., Каврук JI.C. Определение типа нуклеиновой кислоты у бактериофагов малоизученных энтеробактерий. // Материалы Международного семинара «Перспективы использования препаратов бактериофага для превенции и лечения инфекций, вызванных патогенными и условно-патогенными микроорганизмами» Тбилиси, 2005, с. 35-36.

71.Золотухин С.Н., Васильев Д.А., Пономарев А.П., Каврук J1.C. Электронно-микроскопическое изучение новых бактериофагов малоизученных энтеробактерий. // Материалы Международного семинара «Перспективы использования препаратов бактериофага для превенции и лечения инфекций, вызванных патогенными и условно-патогенными микроорганизмами» Тбилиси, 2005, с. 37-38.

72. Золотухин С.Н. Электронно-микроскопическое изучение морганеллезных бактериофагов.// Журн. Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. -

2005, - №5, - с. 77-78.

73.Золотухин С.Н., Васильев Д.А., Каврук JI.C. Смешанная кишечная инфекция телят и поросят, вызываемая патогенными энтеробактериями. Допущено министерством сельского хозяйства РФ в качестве учебного пособия для студентов высших учебных заведений по специальности 310800 - Ветеринария. Ульяновск, 2005.

74.Золотухин С.Н. Иммуногенные свойства и одиночный цикл внутриклеточного развития морганеллезного бактериофага // Журн. Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2006., - №2 , - с. 69-70.

75.Феоктистова H.A., Золотухин С.Н., Васильев Д.А., Тарасова A.B. Поиск бактериофагов бактерий рода Proteus. // Вестник УГСХА. - Ульяновск, 2006. - с. 54-56.

76.Золотухин С.Н. Перспективы использования бактериофагов патогенных энтеробактерий. // Материалы международной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных», стр. 221-227. Ульяновск, 2006.

77.Золотухин С.Н., Васильев Д.А., Каврук J1.C., Молофеева Н.И., Пульчеровская Л.П., Коритняк Б.М., Бульканова Е.А, Феоктистова H.A., Пожарникова E.H., Барт Н.Г., Мелехин A.C., Катмакова Т.П. Выделение и селекция клонов бактериофагов патогенных энтеробактерий.// Материалы международной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» Ульяновск, 2006, стр. 227-231..

78.Молофеева Н.И., Золотухин С.Н., Васильев Д.А. О специфичности бактериофагов Е. coli 0157. Материалы международной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных». Ульяновск,

2006, стр. 231-233.

79. Золотухин С.Н., Мелехин A.C., Васильев Д.А., Каврук Л.С., Молофеева Н.И., Пульчеровская Л.П., Коритняк Б.М., Бульканова Е.А, Феоктистова H.A., Пожарникова E.H. Чувствительность патогенных энтеробактерий, выделенных при диарее молодняка животных, к антибиотикам и специфическим бактериофагам. Материалы международной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных». - Ульяновск, - 2006, - стр. 233-236.

80. Золотухин С.Н., Васильев Д.А., Мелехин A.C., Бульканова Е.А, Феоктистова H.A., Пожарникова E.H. Бактериофаги малоизученных энтеробактерий и перспективы их применения в ветеринарии // Ветеринарная патология. - 2006. - №3. - С. 80-85.

Подписано в печать 12.03. 2007 г. Формат 60x841/16 Бумага типографская. № 1. Ризограф УГСХА. Усл. печ. л. 2,4. Заказ 52 Тираж 100 экз. 432980, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Золотухин, Сергей Николаевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Биологические свойства энтеробактерий и их роль в патологии животных и человека.

Биологические свойства и практическое применение бактериофагов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Материалы и методы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Выделение бактериофагов и селекция клонов фагов.

Морфология негативных колоний селекционированных бактериофагов.

Литическая активность.

Изучение диапазона литической активности.

Иммуногенные свойства бактериофагов.

Взаимодействие селекционированных бактериофагов с индикаторными культурами энтеробактерий.

Изучение действия инактивирующих факторов на бактериофаги.

Определение типа нуклеиновой кислоты и молекулярной массы генома.

Изучение морфологии фаговых корпускул.

Изменение литической активности бактериофагов при хранении.

Разработка оптимальных количественных параметров соотношния фаговых корпускул к клеткам хозяев для приготовления препаратов с высоким титром

Изготовление и контроль индикаторных фагов.

Разработка схем исследования материала с целью выделения и ускоренной идентификации энтеробактерий видов Y. enterocolitica, М. morganii, Е coli (сероваров 0157:Н7 и 0157:Н-), родов Proteus, Klebsiella, Citrobacter и Enterobacter.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ВЫВОДЫ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Создание и разработка схем применения диагностических биопрепаратов на основе выделенных и изученных бактериофагов энтеробактерий"

Актуальность темы.

Всесторонние исследования по изучению бактериофагов, выполненные за последние 40-45 лет, позволили широко использовать их для решения многих задач в микробиологии, вирусологии, генетике, биохимии, иммунологии, радиобиологии, биотехнологии и других областях биологических исследований. Поэтому учение о фагах, развивающееся вначале как узкая область медицинской и ветеринарной микробиологии, в настоящее время приобрела общебиологическое значение.

Фаги являются одним из наиболее подходящих объектов для глубокого изучения ряда вирусологических проблем и, в частности, взаимоотношения вируса с клеткой-хозяином. При их использовании, возможно, моделировать как явно выраженную продуктивную инфекцию, так и потенциальное вирусоноси-тельство в форме лизогении. Успешно разрабатывается проблема лизогении, имеющая общебиологическое значение для понимания молекулярных механизмов вирусного канцерогенеза и латентных вирусных инфекций.

С 1940 годов бактериофаги стали одним из наиболее популярных объектов молекулярной биологии. Исследования с использованием фагов позволили раскрыть механизмы таких фундаментальных биологических процессов, как репликация ДНК, рекомбинация, транскрипция и генная регуляция. Благодаря х изучению фагов открылись также возможности разработки многих важных методов и направлений генной инженерии (И. Лейгнер и др., 2005).

С помощью фагов проводятся широкие радиобиологические исследования, а также первичный отбор химиотерапевтических средств и некоторых антибиотиков против вирусных болезней и злокачественных опухолей.

С выходом человека на космические орбиты фаги стали использовать для важнейших биологических исследований космического пространства.

Одним из центральных разделов современной биологии бактерий является проблема устойчивости или «надежности» наследственной информации. В настоящее время установлено, что после внедрения в клетку фаг вызывает хромосомные перестройки, что приводит к общей нестабильности наследственного материала (В.Я. Ганюшкин, 1988). В ветеринарии практическое использование фагов связано с изучением наследственной изменчивости бактерий (трансдук-ция, фаговая конверсия), индикацией патогенных бактерий и диагностикой инфекционных заболеваний, а также фаготерапией и фагопрофилактикой.

В течение двух последних десятилетий преобладало мнение, что изучение фагов уже не может дать науке ничего принципиально нового. В России при возникновении и развитии генной инженерии произошла утрата интереса к изучению фагов, и лишь единичные научные лаборатории в настоящее время продолжают заниматься фундаментальными исследованиями бактериофагов. Однако, несмотря на накопленный большой научный материал по изучению биологических свойств бактериофагов, многие вопросы требуют дополнительных исследований. Так, например, у большинства, как считалось ранее, глубоко изученных модельных эшерихиозных фагов Т-серии, так и не удалось выяснить функцию двух третей синтезируемых ими продуктов (В.Н. Крылов, 2003). Кроме того, нет единой схемы таксономии и морфологической классификации этих микроорганизмов, отсутствуют стандартные наборы бактериофагов многих возбудителей заболеваний животных и человека, а также схемы и регламенты их применения (B.C. Русалеев, 1990).

Интерес к фагам у отечественных исследователей возродился сравнительно недавно по ряду причин и, прежде всего, прежде всего с возникновением множественно-устойчивых к антибиотикам возбудителей разных болезней. Кроме того, в настоящее время в результате молекулярно-генетических исследований была выявлена связь генома патогенности бактерий с профагом и отмечена возможность генетического обмена не только между бактериями и фагами, но и между фагами и эукариотами (В.Н. Крылов, 2003).

Кафедра микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы УГСХА определила одно из приоритетных научных направлений - выделение и изучение бактериофагов малоизвестных в ветеринарной практике микроорганизмов. На кафедре в сотрудничестве с ведущими научными центрами страны (ВНИИВСГЭ, ВГНКИ, ВНИИЗЖ, ВНИИВиМ) более тридцати лет проводиться научно-исследовательская работа по этой проблеме, в частности, изучение бактериофагов ранее малоизвестных в ветеринарии патогенных энтеробактерий - возбудителей желудочно-кишечных заболеваний молодняка животных и пищевых токсикоинфекций человека.

Выбор данного направления связан с тем, что в последние годы, благодаря работам многих отечественных и зарубежных исследователей, расширилось представление об этиологической роли ранее неизвестных бактерий семейства Enterobacteriaceae в патологии животных и человека, которые широко распространены в природе и большая часть из них часто обитает в составе нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта животных и человека. Однако, среди этих микроорганизмов имеются виды, варианты и штаммы, способные вызывать у животных и людей как самостоятельные заболевания (эшерихиоз, сальмонеллез, иерсиниоз, клебсиеллезную и морганеллезную инфекцию и др.), так и совместно с другими микробами различные воспалительные процессы (энтериты, нагноение ран, абсцессы, маститы, эндометриты, менингиты, пневмонии, сепсис и т.п.), а также пищевые и кормовые токсикозы и токсикоинфек-ции. Особого внимания заслуживают работы разных ветеринарных исследователей по изучению роли этих микроорганизмов в этиологии инфекционной диареи молодняка животных.

До начала 90-х годов прошлого столетия ветеринарные лаборатории нашей страны бактериологические исследования патологического материала от больного и павшего молодняка животных сводили к выявлению в нем только патогенных эшерихий, сальмонелл, клостридий перфрингенс, стафилококков, диплококков не принимая во внимание многих представителей других родов и видов семейства Enterobacteriaceae ввиду отсутствия нормативных документов по диагностике болезней, вызываемых этими микроорганизмами. Последние были впервые разработаны и утверждены лишь в конце 1991 года (Методические указания по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями) изатем переработаны в 1999 году, согласно которым бактерии родов Proteus, Morganella, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Providencia, Yersinia и др. получили официальное признание возбудителей болезни.

В конце прошлого и начале настоящего века также было установлено, что диарею у молодняка животных с признаками геморрагического гастроэнтерита, а также отечную болезнь у поросят могут вызывать отдельные штаммы эшери-хий серогруппы 0157 (серовары 0157:Н7 и 0157Н-), ранее не принимавшиеся во внимание как непатогенные для животных (О.А. Тугаринов, М.К. Пирожков, Ю.А. Малахов, 2001).

Известно что, эффективность лечебных мероприятий во многом зависит от своевременной диагностики болезни, поэтому совершенствование методов лабораторной диагностики заболеваний, вызываемых представителями патогенных энтеробактерий или протекающих с их участием, имеет важное практическое значение.

В связи с этим возникла необходимость поиска альтернативных методов лабораторной диагностики, которые были бы менее трудоёмкими, более быстрыми и доступными для лабораторий любого уровня. Одним из таких методовявляется фагодиагностика. Специфичность бактериофагов позволяет использовать их с диагностической целью для ускоренной индикации и идентификации гомологичных бактерий.

Методы фагодиагностики, разработанные в середине прошлого века, являются специфичными, не требует больших затрат времени, материалов и общедоступны лабораториям всех уровней (В.В. Аврех, 1954; Д.М. Гольдфарб, В.Н. Кузнецова, 1957; И.В. Домарадский и др., 1957; Ф.И. Ершов, 1959; Адаме М., 1961; Н.Д. Мазурин и др., 1963; B.JI. Тимаков, Д.М. Гольдфарб, 1962; Абду-саматовМ.А., 1962; В.Г. Арский, 1961; З.И. Быкова, 1964; Т.С. Вилькомирской, 1971; В.Я Ганюшкин, 1968, 1984,1988, 1991; B.C. Русалеев, 1990; И.Н. Хайрул-лин, 1990; Т.И. Кольпикова, И.А. Бакулов, В.М. Котляров, 1990, 1992 и др.).

Диссертационная работа является разделом комплексной темы кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии: «Усовершенствование методов диагностики, профилактики и лечения болезней молодняка сельскохозяйственных животных и пищевых токсикоинфекций людей», имеющую государственную регистрацию (№ 01200.203524).

Для достижения указанной перед нами цели стояли следующие задачи:1.Выделить из объектов внешней среды бактериофаги, активные в отношении энтеробактерий родов Proteus, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, видов Morganella morganii, Yersinia enterocolitica и Escherichia coli сероваров 0157:H7 и 0157:H-.

2.Изучить основные биологические свойства изолятов фагов (литическую активность, антигенные свойства, интенсивность адсорбции, длительность латентного периода внутриклеточного развития, урожайность, диапазон литической активности, специфичность, множественность инфекции, морфологию негативных колоний, морфологию фаговых корпускул, тип и размер нуклеиновой кислоты) и дать сравнительную характеристику селекционированным штаммам.

3.Отобрать штаммы фагов с заданными биологическими свойствами для конструирования диагностических препаратов.

4.0пределить таксономическое положение этих фагов в соответствии с современной Международной классификацией и номенклатурой вирусов.

5.Определить оптимальные параметры культивирования бактериофагов для изготовления диагностических препаратов.

6.Разработать технологию получения и контроля фагодиагностикумов.

8.Разработать схемы и технологические параметры индикации вышеуказанных микроорганизмов с помощью РНФ.

Научная новизна.

Выделены и селекционированы специфические фаги, лизирующие патогенные для животных и человека энтеробактерии, в результате чего создана коллекция новых штаммов фагов.

Изучены основные биологические свойства выделенных фагов (литиче-ская активность, антигенные свойства, интенсивность адсорбции, длительность латентного периода внутриклеточного развития, урожайность, диапазон лити-ческой активности, специфичность, множественность инфекции, морфология негативных колоний, морфология фаговых корпускул, тип и размер нуклеиновой кислоты) и дана их сравнительная характеристика. Определено классификационное положение изученных изолятов по биологическим свойствам согласно современной классификации и таксономии вирусов.

Впервые разработаны методы фагоиндикации и фагоидентификации энтеробактерий родов Proteus, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, видов Morgan-ella morganii,Yersinia enterocolitica и Escherichia coli сероваров 0157:H7 и 0157:H- в объектах ветеринарного надзора. Доказана возможность использования созданных биопрепаратов с диагностической целью.

Практическая значимость.

Четырнадцать выделенных и изученных штаммов бактериофагов депонированы в коллекции Всероссийского государственного центра качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов, признаны перспективными и рекомендованы для изготовления диагностических и лечебно-профилактических препаратов:• Штамм бактериофага Phagum Morganella morganii Ml7 УГСХА - ДЕП.

Справка о депонировании от 11.02.1999 г.• Штамм бактериофага Phagum Morganella morganii М-20 УГСХА - ДЕП.

Справка о депонировании от 11.02.1999 г.• Штамм бактериофага Phagum Escherichia coli 0157 Е-61 УГСХА - ДЕП.

Справка о депонировании от 29.05.2002 г.• Штамм бактериофага Phagum Escherichia coli 0157 Е-67 УГСХА - ДЕП.

Справка о депонировании от 29.05.2002 г.• Штамм бактериофага Phagum Citrobacter С-61 УГСХА - ДЕП.

Справка о депонировании от 23.04.04 г.• Штамм бактериофага Phagum Citrobacter С-66 УГСХА - ДЕП.

Справка о депонировании от 23.04.04 г.• Штамм бактериофага Phagum Citrobacter С-52 УГСХА - ДЕП.

Справка о депонировании от 23.04.04 г.• Штамм бактериофага Phagum Yersinia enterocolitica Y/9 УГСХА - ДЕП.

Справка о депонировании от 23.04.04 г.• Штамм бактериофага Phagum Proteus П-16 УГСХА - ДЕП.

Справка о депонировании от 21.02.06 г.• Штамм бактериофага Phagum Proteus П-261 УГСХА - ДЕП.

Справка о депонировании от 21.02.06 г.• Штамм бактериофага Phagum Enterobacter Еп-2 УГСХА - ДЕП.

Справка о депонировании от 21.02.06 г.• Штамм бактериофага Phagum Enterobacter En-13 УГСХА - ДЕП.

Справка о депонировании от 21.02.06 г.• Штамм бактериофага Phagum Klebsiella К-10 УГСХА - ДЕП.

Справка о депонировании от 21.02.06 г.• Штамм бактериофага Phagum Klebsiella К-81 УГСХА - ДЕП.

Справка о депонировании от 21.02.06 г.

Разработаны нормативно-технические документы по изготовлению диагностических фаговых препаратов:1.Инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии эшери-хиозных бактериофагов E.coli 0157, Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА, утверждена ученым советом и ректором УГСХА 16.02.2004 г.

3.Инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофагов Morganella morganii Ml 7 УГСХА, и М20 УГСХА, утверждена ученым советом и ректором УГСХА 16.02.2004г.

4.Инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофага Yersinia enterocolitica Y/9 УГСХА, утверждена ученым советом и ректором УГСХА 17.01.2005 г.

5.Инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофагов Proteus П-16 УГСХА и П-261 УГСХА, утверждена ученым советом и ректором УГСХА 17.01.2006 г.

6. Инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофагов Enterobacter Еп-2 УГСХА и Еп-13 УГСХА, утверждена ученым советом и ректором УГСХА 17.01.2006 г.

7.Инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофагов Klebsiella К-10 УГСХА и К-81 УГСХА, утверждена ученым советом иректором УГСХА 17.01.2006 г.

Результаты исследований по разработке методов фагодиагностики вошли в следующие нормативные документы:1. Методические рекомендации по ускоренной индикации и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки в Е. coli 0157:Н7 и 0157:Н- в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов, утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 4 октября 2004 года;2.Методические рекомендации по ускоренной индикации и идентификации энтеробактерий вида Morganella morganii в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов, утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 4 октября 2004 года;3.Методические рекомендации по ускоренной индикации и идентификации энтеробактерий рода Citrobacter в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов, утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 4 октября 2004 года;4.Методические рекомендации по ускоренной индикации и идентификации энтеробактерий вида Yersinia enterocolitica в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфического бактериофага, утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 26 июня 2006 года;5.Методические рекомендации по ускоренной индикации и идентификации энтеробактерий рода Proteus в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов, утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 26 июня 2006 года;6.Методические рекомендации по ускоренной индикации и идентификации энтеробактерий рода Klebsiella в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов, утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 26 июня 2006 года;7.Методические рекомендации по ускоренной индикации и идентификации энтеробактерий рода Enterobacter в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов, утвержденных Отделением ветеринарной медицины РАСХН 26 июня 2006 года.

Реализация результатов исследования. Выделенные и селекционированные штаммы фагов серии УГСХА родов Citrobacter (С-66, С-61, С-52), Enterobacter (En-2, En-13), Klebsiella (К-10, K-81), Proteus (П-16, П-261), видов Morganella morganii (М-17, М-20), Yersinia enterocolitica (Y/9) и Escherichia coli сероваров 0157:H7 и 0157:Н- (Е-67, Е-61), депонированные в ФГУ «ВГНКИ», используются для изготовления диагностических бактериофагов.

Часть результатов диссертационной работы вошла в монографию: «Малоизученные энтеробактерии и их роль в патологии животных» (С.Н. Золотухин, 2004) и два учебных пособия: «Роль Morganella morganii в этиологии кишечной инфекции телят и поросят» (JT.C. Каврук, С.Н. Золотухин, В.Я. Ганюш-кин, Д.А. Васильев, 1998), «Смешанная кишечная инфекция телят и поросят, вызываемая патогенными энтеробактериями» (С.Н. Золотухин, JLC. Каврук, Д.А. Васильев, 2005).

Материалы диссертационных исследований используются в учебном процессе на лекциях и лабораторно-практических занятиях со студентами и слушателями ФПК по микробиологии, вирусологии, биотехнологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизе продуктов животноводства в Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии, на факультете ветеринарной медицины и биотехнологии Оренбургского государственного аграрного университета, Кубанского государственного аграрного университета, Воронежского государственного аграрного университета им. К.Д. Глинки, Башкирского государственного аграрного университета, Алтайского государственного аграрного университета, Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарева, Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины, Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана, Чувашской государственной сельскохозяйственной академии, Ивановской государственной сельскохозяйственной академии, Самарской государственной сельскохозяйственной академии, Брянской государственной сельскохозяйственной академии, Пермской государственной сельскохозяйственной академии, Ижевской государственной сельскохозяйственной академии, Вологодской государственной молочно-хозяйственной академии им. Н.М. Верещагина.

Апробация работы.

Результаты основных исследований подтверждены актами комиссионных испытаний в ФГУ «ВГНКИ» (от 11.02.1999 г.; 30.05.02 г.; 23.04.04 г.; 21.02.06 г.), УГСХА (от 5.06.03 г.); актами испытаний в условиях производства, Чердак-линской районной ветеринарной лаборатории Ульяновской области (от 24.08.04г.,2005), в Сергиевской районной ветеринарной лаборатории (от 30.08.04г.) и в ЗАО «СВ-Поволжское» Самарской области.

Материалы диссертации доложены и одобрены на научно-практических конференциях: «Аграрная наука в условиях разнообразных форм общественной собственности и регионального хозрасчета», (Ульяновск, 1990) и «Экологические проблемы сельскохозяйственного производства» (Ульяновск, 1992); XII научно-практической конференции молодых ученых «Пути повышения производства и резервы повышения качества сельскохозяйственной продукции» (Оренбург, 1993); Межгосударственных научных конференциях «Новые фармакологические средства в ветеринарии» (Санкт-Петербург, 1995, 1997); Международной научной конференции «Инфекционные болезни молодняка сельскохозяйственных животных» (Москва, 1996); научной конференции посвященной 50-летию Краснодарской НИВС «Состояние и перспективы развития научных исследований по профилактике и лечению болезней сельскохозяйственных животных и птиц» (Краснодар, 1996); Межгосударственных научныхконференциях: «Актуальные проблемы ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции» (Москва, 1995, 1997); научно-практической конференции «Проблемы экологии Ульяновской области» (Ульяновск, 1997); Международной научной конференции «Проблемы инфекционных и инвазионных болезней в животноводстве на современном этапе» (Москва, 1999); Международной научной конференции «Современные вопросы ветеринарной медицины и биологии» (Уфа, 2000); Международной научно-практической конференции (Воронеж, 2002); Всероссийской научно-производственной конференции (Ульяновск, 2003); Международном научно-практическом семинаре: «Перспективы использования препаратов бактериофага для превенции и лечения инфекций, вызываемых патогенными и условно-патогенными микроорганизмами» (Тбилиси, 2005); Международной научной конференции: «Диагностика, профилактика и лечение инфекционных болезней, общих для человека и животных» (Ульяновск 2006 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:1.Схемы позволяющие выделить из объектов внешней среды бактериофаги малоизученных в ветеринарии родов и видов энтеробактерий.

2.Биологические свойства выделенных фагов и их сравнительная характеристика.

3.Таксономическое положение изученных фагов согласно современной классификации и номенклатуры вирусов.

4.Параметры конструирования из отобранных фагов новых диагностических биопрепаратов.

5.Биотехнологические режимы, условия изготовления и контроля диагностических фаговых биопрепаратов.

6.Схемы и методы идентификации энтеробактерий с помощью специфических бактериофагов.

7.Схемы и методы ускоренной индикации гомологичных фагам энтеробактерий в объектах санитарного надзора с помощью РНФ из созданных диаг-ностикумов.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Золотухин, Сергей Николаевич

ВЫВОДЫ

1. Из объектов внешней среды и материала от животных было выделено 121 изолят бактериофагов, лизирующих патогенных энтеробактерий родов Proteus, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella; видов Morganella morganii,Yersinia enterocolitica, E. coli сероваров 0157:H7 и 0157:H-, которые имели литическую активность в пределах 102 - 109 корпускул в 1,0 см3 (по о методу Грациа) и 10" - 10" (по методу Аппельмана).

2. Выделенные и селекционированные бактериофаги обладали разным диапазоном литической активности по отношению к гомологичным энтеробактериям и выраженной специфичностью. Эшерихиозные бактериофаги активны только в отношении штаммов Е. coli 0157:Н7 и 0157:Н-, морганеллезные и иерсиниозные бактериофаги лизировали представителей только своего вида, а энтеробактерные, клебсиеллезные и протейные фаги имели межвидовые перекрестные реакции в пределах родов. Сектор лизиса составил от 7 до 100% из числа изученных гомологичных фагам штаммов энтеробактерий.

3. Изоляты фагов серии УГСХА Morganella morganii М-17 и М-20; Escherichia coli 0157 Е-61 и Е-67; Citrobacter С-61, С-66 и С-52; Yersinia enterocolitica Y/9; Proteus П-16 и П-261; Enterobacter Еп-2 и Еп-13; Klebsiella К-10 и К-81, обладающие высокой литической активностью, широким диапазоном литической активности и специфичностью были отобраны для конструирования диагностических препаратов, депонированы в коллекции

Всероссийского государственного центра качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов, признаны перспективными для изготовления диагностических и лечебно-профилактических препаратов. Они не снижали свою литическую активность при хранении в течение 12 месяцев, большинство были термостабильными и хлороформоустойчи-выми.

4. Получены гипериммунные сыворотки на производственные штаммы фагов, которые проявляли нейтрализующую активность в разведениях от 1:5 до 1:640. Наибольшее разведение, при котором происходила нейтрализация 100% фаговых корпускул, у всех сывороток было 1:80. Константы скорости нейтрализации были в пределах 20,79±0,6 -72,05±0,82 мин"1. Изучение антигенного родства фагов в перекрестных реакциях нейтрализации показало, что гетерологичные сыворотки нейтрализовали цитробактерные бактериофаги С-61 и С-66 на 52,7 и 52,2% и по этому показателю фаги являются отдаленно родственными. Близкородственные антигенные связи имели протейные бактериофаги П-16 и П-261, так как степень их нейтрализации гетерологичными сыворотками равна 74,7 и 78,7%. Остальные изоляты фагов имели перекрестный процент нейтрализации от 0 до 20,7, что свидетельствует об отсутствии у них родственных антигенных связей.

5. Селекционированные бактериофаги проявили разную адсорбционную способность. Наиболее активно на клетках-хозяев адсорбировались фаг П-261 и энтеробактерный - Еп-2, константы скорости адсорбции у коЛ | торых были в пределах К= 5,6 - 7,1 см /мин'. Менее активно адсорбировались эшерихиозные фаги Е-61 и Е-67, цитробактерный фаг С-52, энтеробактерный фаг Еп-13, иерсиниозный фаг Y/9, протейный фаг П-16, клебси-еллезные фаги К-10 и К-81 константа скорости адсорбции у них составила л |

К=3,8 - 4,6 см /мин". Самую низкую скорость адсорбции из изученных

-j | изолятов имел цитробактерный фаг С-61 (К=2,9 см /мин").

6. Изучение показателей внутриклеточного развития фагов показало, что наиболее короткий латентный период длительностью 19-22 минуты обладали изоляты фагов М-20 М. morganii, Е-61 Е. coli 0157:Н7, С-66 С. freundii, С-52 С. amalonaticus, En-2 Е. cloacae, П-261 P. vulgaris, К-81 К1. pneumoniae. Фаги Еп-13 Е. cloacae, П-16 P. vulgaris и К-10 Kl. pneumoniae имели латентный период в пределах 24-26 минут. Самый длинный латентный период от 36 до 45 минут был у фагов Ml7 М. morganii, С-61 С. freundii и Y/9 Y.enterocolitica. Наибольшую урожайность имели бактериофаги Ml7, М20 Е-61,С-66, С-52, Еп-2, П-261, К-10, которая насчитывала от 126 до 239 фаговых корпускул на одну микробную клетку. Бактериофаги Е-67, С-61, Y/9, Еп-13, П-16 и К-81 имели средний выход фаговых частиц на одну микробную клетку в пределах от 50 до 101.

7. Проведенные молекулярно-биохимические исследования бактериофагов свидетельствуют о том, что нуклеиновые кислоты всех изучен

8. В результате определения таксономического положения выделенных бактериофагов было установлено, что 10 изученных фагов: морганел-лезные (М-17 и М-20), цитробактерные (С-52, С-61 и С-66), эшерихиозные (Е-61 и Е-66), иерсиниозный (Y/9), клебсиеллезный (К-81) и энтеробактер-ный (Еп-13) в соответствии с Международной классификацией и номенклатурой вирусов относятся к морфологическому семейству Myoviridae, а по классификации А.С.Тихоненко - к V морфологической группе «Фаги с отростком сложного строения, чехол которого способен к сокращению». Два фага - один клебсиеллезный (К-10) и один энтеробактерный (Еп-2), были отнесены нами к семейству Siphoviridae и к IV морфологической группе «Фаги с несокращающимся отростками». Оба протейных бактериофага (П-16 и П-261) по морфологическим показателям относятся к семейству Pododoviridae и ко II морфологической группе «Фаги с аналогом отростка».

9. Разработаны оптимальные биотехнологические параметры производства и контроля фаговых препаратов, которые позволяют получить специфические диагностические бактериофаги для индикации и идентификации энтеробактерий родов Proteus, Morganella, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, видов Yersinia enterocolitica и Escherichia coli сероваров 0157.-H7 и 0157:H- с литической активностью не ниже 10"7(по Аппельма-ну) и не ниже 109 фаговых корпускул в 1,0 см3 (по Грациа).

Ю.Разработанные схемы и методики выделения и фагоидентификации энтеробактерий с помощью позволяет выделить и идентифицировать гомологичные бактерии за 48 часов.

12.Проведенные исследования по фагоиндикации энтеробактерий в условиях производства, показали, что в сточных водах животноводческих помещений, неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям молодняка животных, а также в фекалиях больных диареей телят и поросят частота обнаружения энтеробактерий рода Proteus увеличивается на 19%, рода Klebsiella - на 23%, рода Citrobacter - на 34,1%, рода Enterobacter - на 18% и вида М. morganii - на 25%, вида Y. enterocolitica - на 48-52,5,5% случаев в сравнении с результатами бактериологического метода исследований. Время на исследования при этом сокращается с 96-120 до 18-35 часов.

1. Для изготовления диагностических фаговых препаратов предложено четырнадцать перспективных штаммов, депонированных в коллекции Всероссийского государственного центра качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов: Phagum Morganella morganii Ml7 УГСХА - ДЕП; Phagum Morganella morganii М-20 УГСХА -ДЕП; Phagum Escherichia coli 0157 Е-61 УГСХА - ДЕП; Phagum Escherichia coli 0157 Е-67 УГСХА - ДЕП; Phagum Citrobacter С-61 УГСХА -ДЕП; Phagum Citrobacter С-66 УГСХА - ДЕП; Phagum Citrobacter C-52 УГСХА - ДЕП; Phagum Yersinia enterocolitica Y/9 УГСХА - ДЕП; Phagum Proteus П-16 УГСХА - ДЕП; Phagum Proteus П-261 УГСХА - ДЕП; Phagum Enterobacter En-2 УГСХА - ДЕП; Phagum Enterobacter En-13 УГСХА -ДЕП; Phagum Klebsiella К-10 УГСХА - ДЕП; Phagum Klebsiella K-81 УГСХА -ДЕП.

- «Инструкцией по изготовлению и контролю лабораторной серии эшерихиозных бактериофагов E.coli 0157, Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА», утвержденной ученым советом и ректором УГСХА 16.02.2004 г.

- «Инструкцией по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофагов Citrobacter С-52 УГСХА, С-61 УГСХА и С-66 УГСХА», ут

- «Инструкцией по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофагов Morganella morganii ml7 УГСХА, и М20 УГСХА», утвержденной ученым советом и ректором УГСХА 16.02.2004г.

- «Инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофагов Enterobacter Еп-2 УГСХА и Еп-13 УГСХА», утвержденной ученым советом и ректором УГСХА 17.01.2006 г.

- «Методическими рекомендациями по ускоренной индикации и идентификации энтеробактерий рода Citrobacter в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов», утвержденными Отделением ветеринарной медицины РАСХН 4 октября 2004 года;

- «Методическими, рекомендациями по ускоренной индикации и идентификации энтеробактерий вида Yersinia enterocolitica в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфического бактериофага», утвержденными Отделением ветеринарной медицины РАСХН 26 июня 2006 года;

4. Материалы диссертационных исследований используются в учебном процессе на лекциях и лабораторно-практических занятиях со студентами и слушателями ФПК по микробиологии, вирусологии, биотехнологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизе продуктов животноводства в 16 Вузах РФ.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Золотухин, Сергей Николаевич, Ульяновск

1. Адаме М. Бактериофаги. // М., Изд-во иностр. литература, 1961.

2. Абдусаматов М.А. Сравнительное изучение реакции нарастания титра фага и бактериологического метода при диагностике брюшного тифа у больных и рековалесцентов // ЖМЭИ. 1960. - № 1. - С. 23 - 27.

3. Аврех В.В. О применении бактериофагов в диагностике сальмо-неллезов // ЖЭМИ. 1954. - № 7. - С. 93 - 96.

4. Адельсон Л.И., Гуторова В.Д., Ключарева Г.Г. Современное состояние проблемы теории бактериофага и его практическое применение // Тез. докл. юбилейной научной сессии Ленинградского сан.-гиг. мед. ун-та. -Л., 1958.-С. 123-131.

5. Адельсон Л.И. Бактериофаги, активные по отношению к энтеропатогенным кишечным палочкам. -Труды Ленинградского санитарно-гигиенического медицинского института, т.66: Вопросы микробиологической диагностики и бактериофагии. Л., 1962, с. 184.

6. Артющенко И.И., Коновалов B.C. //Кишечные инфекции. М.,1987,с.70-73.

7. Алымова А.Ф., Гортинская В.В., Кузнецова А.П., Логинова Л.Л., Смирнова Е.А. Применение реакции нарастания титра фага в очагах брюшного тифа // Тр. Горьковского гос. мед. ин-та им. С.М. Кирова. -1964.-Т. 18.-С. 10-12.

8. Арский В.Г., Ахметов 3.3., Ясенский А.В. Применение реакции нарастания титра фага для диагностики хронической дизентерии // Здравоохранение Таджикистана. — 1961. — № 2. — С. 5 — 11.

9. Архангельский И.И., Степанов Б.А. Фаготипирование патогенных стафилококков, выделенных из молока коров // Ветеринария. 1966. -№ 3. - С. 27.

10. Бабков В.В. Биологическая характеристика умеренных бактериофагов Е. coli 0124:В17 // Проблемы бактериофагии и биология кишечных бактерий: сб. кафедры микробиологии I Лен. мед. ин-та им. акад. И.П. Павлова Л., 1973. 53 с.

11. Бакулов И.А., Смирнов A.M., Васильев Д.А. Токсикоинфекции и токсикозы. Вопросы профилактики. Ульяновск,2003. - С.26-28.

12. Белоусов Ю.Б., Комарова В.Г., Ефременкова О.В. Выбор антибактериальной терапии при лечении инфекций у лиц пожилого возраста // Антибиотики и химиотерапия. 1998. - № 10. - С. 19-23.

13. Блохина И.Л., Соколова К.Я., Левалова Г.Ф. Новое в классификации энтеробактерий // ЖМЭИ. 1992. — №1. - С.49-52.

14. Батуро А.П., Рагинская В.П., Романенко Э.Е. и др.//Этиология острых кишечных заболеваний. Сб. научн. тр., М., 1988, с. 79-82.

15. Бабков В.В. Биологическая характеристика умеренных бактериофагов E.coli 01246:В17. Сб. кафедры микробиологии Ленинградского медицинского института им. Академика И.П. Павлова «Проблемы бактериофагии и биология кишечных бактерий». Л., 1973, с. 53.

16. Барков А.В., Ленченко Е.М. Патогенные и вирулентные свойства иерсиний. // Ветеринария. 1997. №6. с. 20-22.

17. Борисова М.А., Николаевский В.В., Генералов О.В. и др. //Условно-патогенные микробы и их бактериофаги. Нальчик, 1985, с. 9699.

18. Борисов Л.Б., Могучий A.M. Биологическая характеристика фагов энтеропатогенных кишечных бактерий. Сообщ. 1 .- Ж. Микробиология, 1962, №3, с. 94.

19. Борисов Л.Б., Хан-Фимина В.А. Биологическая характеристика фагов энтеропатогенных кишечных палочек. Сообщ,-1. Ж. Микробиология, 1970, №6, с.34.

20. Бондаренко В.М. и др. // Способность штаммов Citrobacterfreindii, выделенных при острых кишечных инфекциях, к LT-энтеротоксинообразованию. // ЖМЭИ №12 - 1986, с. 12-15.

21. Бритова С.В. //Повышение эффективности ветеринарного обеспечения промышленного свиноводства. Матер, научно-практ. респ. конф, Киев, 1987, с.34-35.

22. Бритова С.В., Каврук JI.С.//Эпизоотология, эпидемиология, средства диагностики, терапии и специфической профилактики инфекционных болезней, общих для человека и животных. Матер. Всесоюзн. конф., Львов, 1988, с.343-344.

23. Бритова С.В. //Биологические особенности бактерий рода Мог-ganella и ускоренная индикация их в объектах ветеринарного надзора. Ав-тореф. Канд. Дисс., М., 1997.

24. Башмаков Г.А. Индикация дизентерийных бактерий на поверхности методом реакции нарастания титра фага // Военно-медицинский журнал. 1961. - № 4. - С. 39 - 42.

25. Беркли Р., Бок Э., Буль Д., Бреннер Д., Васильева Л.В., Видель Ф., Грунт У., Гудселлоу М. Определитель бактерий Берджи // Под редакцией Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уильяме. М.: Мир, 1997.-432 с.

26. Бондаренко В.М., Баркус М.М. Энтеротоксигенная способность штаммов рода Klebsiella и Enterobacter, выделенных при острых кишечных заболеваниях у детей // Журн. микробиол. 1986. - № 7. - С. 28 - 32.

27. Бондаренко В.М., Баккус М.М., Брилис В.И. Гемаглютинирую-щая и адгезивная способность штаммов клебсиелл и энтеробактер // Журн. микробиол. 1987. - № 7. - С. 3 - 6.

28. Бутакова Л.Ю., Илинская Б.В., Юрова В.А. Эпидемиология госпитальной инфекции в травматологическом стационаре // Тез. докл. 6 Все-рос. съезда микробиологов, эпидемиологов и паразитологов. М.,1991. -. Т.1. -С.161-162.

29. Воронин Е.С., Девришов Д.А., Ставцева Л.Я. // Лечение и профилактика диарей телят у новорожденных телят с использованием неспецифических препаратов и бактериофагов. Вестник с.-х. науки. 1989. - № 9.-С. 105-110.

30. Воронин Е.С. Дервишшов Д.А., Ставцева Л.Я., Бедоева З.М. Экспериментальное воспроизведение диареи у новорожденных телят. / Вестник с.-х. науки. 1990. -№ 10. - с. 5-10.

31. Ворошилова Н.Н., Васяева Е.В. Вопросы таксономии фагов Ньюкастл. ЖМЭИ, 1974, №6, с. 32-35.

32. Ворошилова Н.Н. Конструирование биопрепарата бактериофага для лечение инфекции, вызванной клебсиеллами пневмонии // Иммунологические препараты для лечения нинфекционных заболеваний. Уфа, 1985 -С.60-62.

33. Вартанян, Г.Г. //Факторы патогенности энтеробактерий, выделенных при диареях новорожденных телят // Автореферат канд. дисс., АН Армении им. Абовяна, 1991.

34. Ващенок Г.И., Андрейчик Э.П. Иерсиниозы в Ленинграде. // Болезни с природной очаговостью. Тр. Ин-та Пастера. Л., 1983. т.60, с. 82-87.

35. Габрилович И.М. Основы бактериофагии. // Минск: «Высшая школа», 1973.

36. Габрилович И.М., Базиев В.Б. //Бактериальные токсины. Матер. Всесоюзн. конф., Юрмола, 1989, т. 5, с. 24.

37. Галаев Ю.В. //Патогенные ферменты бактерий. Изд. "Медицина", М., 1968.

38. Гаффаров Х.З, Иванов А.В., Непоклонов Е.А., Равилов А.З. Моно- и смешанные инфекционные диареи новорожденных телят и поросят. Казань, 2002, Издательство "Фэн"

39. Габидуллин З.Г., Ишкильдан Б.И. Морфологические свойства и адгезивность бактерий рода Proteus // ЖМЭИ 1989. - №6. - С.83-86.

40. Габрилович И.М. Биологические свойства бактериофагов Serratia marcences // ЖМЭИ. 1992. - №6. - С.10-12.

41. Горденко В.А., Шустрова Н.М. Иерсинии в растениях. ЖМЭИ, 1990, №11, стр. 16-17.

42. Гурлева Г.Г., Григорян Э.Г., Шошиев JI.H. О бактериофагии и бактериоциногении. // ЖМЭИ. 1979. №4 с.9-10.

43. Гамизаев П.А., Гасанзаде Н.П., Джагапов М.М., Табылов А.Н. О свойствах бактериофага, изолированного из культуры кишечного иерси-ниоза. // Современные аспекты профилактики зоонозных инфекций. Тез. докл. Ставрополь, 1991. с. 209-211.

44. Гордейко В.А., Пушкарёва В.И. Иерсинии в воде колодцев вблизи зоны орошения стоками свиноводческих комплексов. // ЖМЭИ. 1990 №10 с.64-65.

45. Габрилович И.М., Азаматова А.Б., Хакешева Т.А. Об использовании бактериофагов для идентификации клебсиелл // Проблемы клинической микробиологии в неинфекционной клинике. М., 1983. С. - 139 -140.

46. Газиев Г.М., Батуро А.П., Плетнев А.А. Определение факторов патогенности клебсиелл // Этиология острых кишечных заболеваний: сб. науч. трудов. М., 1988. - С. 86 - 90.

47. Ганюшкин В.Я. Реакция нарастания титра фага при диагностике паратифа поросят // Ветеринария. 1967. - № 3. - С. 69 - 71.

48. Ганюшкин В.Я. Бактериофаги Salmonella choleraesuis, сравнительная характеристика и практическое применение: Автореф. дис. . докт. вет. наук. Ульяновск, 1984. - 84 с.

49. Ганюшкин В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их применение в ветеринарии. Ульяновск, 1988.

50. Ганюшкин В.Я. Обследование свиней на носительство сальмонелл и фагопрофилактика // Вопросы ветеринарной микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы. Ульяновск, 1990. - С. 20 -28.

51. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. М.: Медгиз, 1961. - 299 с.

52. Гольдфарб Д., Островская З.С. Индикация брюшнотифозной палочки в воде с помощью реакции нарастания титра фага // ЖМЭИ. 1957. -№5.-17 с.

53. Гольдфарб Д.М., Кузнецова В.Н. Опыт применения реакции нарастания титра фага для диагностики дизентерии // ЖМЭИ. 1957. - № 8.-С. 90-94.

54. Гордина Р.П. Фаготипирование паратифозных бактерий и действие на них бактериофагов: Автореф. дис. . докт. биол. наук. М., 1954.-52 с.

55. Дайтер А.Б., Полоцкий Ю.Е., Ценева Г.Я. Патогенные свойства иерсиний и их роль в патологии иерсиниозов. // ЖМЭИ. 1987. №2 с. 108

56. Довгаль Г.Д. Биологические свойства Yersinia enterocolitica в зависимости от источников выделения. Автореф. дис. на соиск. уч. степ, канд. мед. наук. Алма-Ата, 1988.

57. Дулатова М.В. Кишечный иерсиниоз. // JL, 1989.

58. Дунаев В.И. Оценка антигенов Yersinia enterocolitica и сывороток к ним, полученных разными способами. // Микробиология и иммунология иерсиниозов. Сб. науч. трудов т. 84. Рязань. 1985. с. 13-16.

59. Домарадский И.В., Мосолова О.Н., Денисенко JI.K. Методика быстрого обнаружения чумного микроба при помощи бактериофага. -Иркутск, 1957.- 18 с.

60. Емельяненко П.А. Энтеротоксины кишечных бактерий. Ветеринария, 2000, №2., стр. 25-27.

61. Ершов Ф.И. Индикация дизентерийных бактерий с помощью РНФ // В кн.: Изменчивость микроорганизмов и иммунитет. М., 1959. -С. 188-191.

62. Жугова Т.Ч. Бактериофаги Yersinia enterocolitica. Автореф. дис. на соиск. уч. степ. канд. мед. наук. Минск, 1985.

63. Жугова Т.Ч., Габрилович И.М., Ющенко Г.В. Фаготипирование культур Yersinia enterocolitica. // Тез. докл. VI Всероссийского съезда микробиологов, эпидемиологов и паразитологов. Нижний Новгород. 1991 т.1 с.78.

64. Зароза В.Г. Эшерихиоз телят// Всесоюзн. Акад. Сельхоз наук им

65. В.И. Ленина, М.: Агропромиздат, 1991,238 с.

66. Зыкин Л.Ф., Щербаков А.А., Хапцев З.Ю. Иерсиниоз и псевдотуберкулез сельскохозяйственных животных // Саратов, 2002.

67. Ивашура А.И. Патогенные бактерии в молоке здоровых и больных маститом коров и методы их индикации: Автореф. дис. . канд. биол. наук. М., 1967.-20 с.

68. Иллютович А.Ю., Петрова З.С., Голубева Е.Е., Четверкина Р.С. Применение РНФ для индикации дизентерийных бактерий флекснера в организме зараженных кроликов // Бюлл. эксп. биол. и мед. 1958. - № 6. -78 с.

69. Каврук Л.С. // Тесты, критерии и методы ускоренной санитарно-бактериологической оценки репродуктивных помещений животноводческих ферм и пути оптимизации в них микробиоценоза, дисс. в форме науч.докл. на соискание учен. степ. докт. ветер, наук М., 1994.

70. Каврук JI.C. Роль Morganella morganii в этиологии инфекционной диареи молодняка // Ветеринария. 1986. - №3. - С.56-58.

71. Каврук JI.C. Ж-л "Ветеринария", 1987, №3, с.76-78.

72. Ковальчук В.П., Пархоменко Л.В. Особенности инициального звена при поражении кишок условно-патогенными бактериями Proteus mir-abilis // Микробиологический журнал. 1991. - №6. - С.78-82.

73. Казановский A.M. //Врачебное дело, 1975, №2, с. 146-148

74. Курашвилли Т.К. Адгезивный антиген K88ad Е. coli. Ветеринария, 1991, №3, стр. 26-27. Мнацаканов С.Т. //ЖМЭИ, 1983, №6, с. 53-55.

75. Коляков Я.Е., Гительсон С.С., Каврук Л.С.// Колибактериоз телят, М. "Колос",1970,223 с.

76. Красноголовец В.Н., Киселева Б.С. // Клебсиеллезная инфекция, Москва «Медицина», 1996,356 е.

77. Климанова Е.М., Белая О.Ф., Лаврова К.В., Белая Ю.А. Использование реакции коаглютинации в диагностике иерсиниозов у детей. // Педиатрия. 1993. №4 с.48-49.

78. Колос Е.Н., Гнутов И.Н., Ющенко Г.В. Сельскохозяйственные животные как источник иерсиниоза. // ЖМЭИ. 1985 №4 с. 77-79.

79. Коршунов В.М. Проблема регуляции микрофлоры кишечника. //ЖМЭИ. 1995. №3 с.48-55.

80. Крылов В.Н. Роль горизонтального переноса генов бактериофагами в возникновении патогенных бактерий. // Генетика, том №5, 2003, с. 595-620.

81. Кудрякова Т.А., Македонова Л.Д., Мишанькин Б.Н., Казакова

82. Кузнецов В.Г. Заселённость овощей и внешней среды овощехранилищ Приморского края бактериями рода Yersinia. // Гигиена и санитария. 1986. №5 с.59.

83. Кузнецов В.Г., Багрянцев В.Н. Пастеризованное молоко как фактор передачи возбудителей иерсиниозов. // ЖМЭИ. 1992. №4 с.22-26.

84. Кузнецов В.Г., Тимченко Н.Ф. Взаимодействия между бактериями рода Yersinia в водной среде. // ЖМЭИ. 1998. №6 с26-29.

85. Камбаратов П.И. Клиническая оценка РНФ как метода лабораторной диагностики острой дизентерии // ЖМЭИ. 1963. - № 4. -С. 29.

86. Капырина Н.А., Бакулов И.А. Идентификация возбудителя листериоза с помощью бактериофага // Профилактика и меры борьбы с лептоспирозом и листериозом с/х животных: матер, симпозиума. -Новочеркасск, 1972. С. 76 - 78.

87. Кац-Чернохвостова Л.Я. Проблема фаготипирования брюшнотифозных и паратифозных микробов и ее эпидемиологическое значение // ЖМЭИ. 1947. - № 8. - С. 312 - 315.

88. Квеситадзе И.Ф. Михайлова И.Ф. Установления сроков выявления в крови антител при разных методах дачи фага. ЖМЭИ, 1957, №1, с. 99-104.

89. Кебу Т.И., Стасюлевич З.К., Джикидзе Э.К., Крылова Р.И. Условно-патогенные энтеробактерии у здоровых и больных острыми кишечными инфекциями обезьян // Микробиология. 1998. - № 3. - С. 177 -182.

90. Килессо В.А. Идентификация сальмонеллезных культур с помощью О-бактериофага // Тез. докл. конф. Таллин, научн.-иссл. ин-та эпидемиол., микробиол. и гигиены. Таллин, 1960. - С. 5 - 6.

91. Киселева Б.С. Род Klebsiella // Энтеробактерии: Руководство / Под ред. В.И. Покровского. М.: Медицина, 1985. - С. 171 - 172.

92. Киселева Б.С. Гедзе Г.И., Солодова T.JI. Результаты идентификации клебсиелл при различных заболеваниях новорожденных и детей раннего возраста // Журн. микробиол. 1982. - № 7. - С. 52 - 57.

93. Киселева Б.С. Капсульные антигены как основа для разработки диагностических и профилактических препаратов // Бактериальные антигены / Под ред. Семенова. М.: МНИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, 1982. - С. 15 - 24; 30 - 39.

94. Киселева Б.С., Дусмухамедов Н.С., Голубева И.В. О выделении бактерий трибы Klebsiella при диарее у полярников // Журн. микробиол. -1978.-№12.-С. 49-52.

95. Ковалева Е.П., Рейзис А.Р. Инфекции, вызванные условно-патогенными микроорганизмами // Профилактика внутрибольничных инфекций / Под ред. Е.П. Ковалевой, Семиной: руководство для врачей. М.,1993.-С. 56-69.

96. Козловский Ю.Е., Плугина И.В., Серебряков С.Н., Барановская О.П., Тихонова Н.Б. Анализ токсигенности штаммов энтеробактерий, изолированных в зверохозяйствах России // Доклады Российской академии с.-х. наук. 2002. - № 3 - С. 44 - 46.

97. Кольпикова Т.И., Бакулов И.А., Котляров В.М. Перспективы практического применения листериозных бактериофагов // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии: матер, научн. конф. ВНИИВиМ. Покров, 1992. - Ч. 11. - С. 211 - 212.

98. Кольпикова Т.И., Бакулов И.А., Котляров В.М. Фаготипирование листерий // Ветеринария. 1990. - № 6. - С. 31 - 32.

99. Корнилова Г.В. РНФ при индикации дизентерийных бактерий в воде в сопоставлении с бактериологическим методом // Материалы 16 межоб-ластн. научно-практ. конф. лабор. работников Зап. Сибири. -Томск, 1960.-С. 20-21.

100. Корольков В.Ф., Колков В.Ф., Перепелкин B.C., Мандрик В.А. Анализ причин заболеваемости кишечными инфекциями личного состава // Военно-медицинский журнал. 1992. - № 6. - С. 54 - 57.

101. Красноголовец В.Н., Киселева Б.С. Клебсиеллезные инфекции. М.: Медицина, 1996. - С.256.

102. Кременчук Г.А., Гицевич М.А., Бояршинова К.П. Применение реакции нарастания титра фага для исследования объектов внешней среды //ЖМЭИ.-1961.-№ 7.-С. 124.

103. Крылова М.Д. Применение бактериофагов для типирования бактерий // В кн.: Бактериофагия. М.: Медгиз, 1961. - С. 220 - 257.

104. Крылова М.Д. Фаготипы бактерий. М., 1963. - 97 с.

105. Крылова М.Д. Схема фаготипирования нетоксигенных дифтерийных бактерий типа gravis // ЖМЭИ. 1970. - № 12. - С. 16 - 22.

106. Кривиский А.С. Вирусы против микробов. М., - 1962.

107. Куваева И.Б., Ладодо К.С. Микроэкологические и иммунные нарушения у детей. М., 1991. - 250 с.

108. Кузнецова В.Н., Хазанов М.И., Ремова Т.Н. Применение реакции нарастания титра фага для индикации дизентерийных бактерий в условиях внешней среды // ЖМЭИ. 1960. - № 6. - С. 59.

109. Кукава Г.Г., Джикидзе Э.К., Стасилевич З.К., Крылова Р.И., Кебу Т.И. Биологическая характеристика клебсиелл, выделенных от обезьян в норме и при патологии // Bait. J. Lab. Anim. Sci. 1998. - № 4. - С. 231 -237.

110. Лебедев В.И. Опыт применения РНФ в эпидемиологической практике // ЖМЭИ. 1963. - № 12. - С. 29.

111. Лебедев В.И. РНФ как ранний метод индикации дизентерии в детских учреждениях // Тр. науч. конф. аспирантов и ординаторов. М., 1964.-С. 105- 107.

112. Ленченко Е.М., Куликовский А.В. Сравнительная оценка биологического и химического методов изучения вирулентности иерсиний. // Сельскохозяйственная биология. 1997. №2 с.83-85.

113. Ленченко Е.М., Павлова И.Б. Электронно-микроскопическое исследование антагонизма бактерий. // Ветеринария. 1998. №7 с. 24-28.

114. Литвин В.Ю., Пушкарёва В.И. Возможный механизм формирования эпидемических вариантов возбудителей сапронозов в почве или воде. // ЖМЭИ. 1994. №5 с. 5-9.

115. Ленев С.В. Способ выделения и свойства бактериофагов // Сб. науч. трудов Всеросс. науч. ин-та вет. препаратов. М., 1991. - С. 24.

116. Лешкович Н.Л., Ермилова В.П. О диапазоне и специфичности действия чумных фагов 1701, 1710 и их мутантов // В кн.: Проблемы особо опасных инфекций. М., 1974. - С. 38-41.

117. Лихачев Н.В. Метод диагностики паратифа свиней при помощи бактериофага // Ветеринария. 1948. - № 7. - С. 32.

118. Лурия С., Дарнелл Д. Общая вирусология. М.: Мир, 1970.397 с.

119. Мазурин Н.Д., Розина-Япкина Ц.С. РНФ при диагностике дизентерии // ЖМЭИ. 1963. - № 1. - С. 113 - 115.

120. Мамонтова Л.М., Савилов Е.Д., Рахманин Ю.А. Условно-патогенные микроорганизмы и их распространение в водных экосистемах Сибири // Гигиена и санитария. 2005. - № 3 - С. 13-17.

121. Миляева Е.Н. Определение зараженности предметов бытовой обстановки дизентерийными микробами с помощью реакции нарастаниятитра бактериофага // ЖМЭИ. 1958. - № 12. - 34 с.

122. Марченков В.И., Зюзина В.П., Бородина Т.Н., Новосельцев Н.Н. Чувствительность иерсиний, выращенных в разных температурных условиях, к бактериофагам. // Сб. науч. трудов вып. 1. Новороссийск. 1994.

123. Методические указания по выявлению Yersinia enterocolitica и Yersinia pseudotuberculosis в пищевых продуктах животного происхождения. // ДВ МСХиП РФ 23.09.1998.

124. Милько Е.С., Егоров Н.С. Гетерогенность популяций бактерий и процесс диссоциации. // М., 1991.

125. Морозов А.А,, Маевский М.П. Выделение и идентификация возбудителей псевдотуберкулёза и кишечного иерсиниоза из биологического материала и объектов внешней среды. // Сб. науч. трудов вып. 1. Новороссийск, 1994 с.287-290.

126. Методические указания по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции, вызываемой патогенными энтеробакте-риями. М.:- 1999, 20 с.

127. Методические указания по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных // М.:-2000.

128. Методы выделения и идентификации энтерогеморрагическойкишечной палочки 0157:Н7 //Методические указания МУК 4.2.992-00. -М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2001. 28 с.

129. Мищенко В.А. и др. Некоторые аспекты патогенеза диареи новорожденных телят. Ветеринария, 1999, №9, стр. 20-23.

130. Наттерман X., Хорш Ф. Этиология и патогенез иерсиниоза. // Ветеринария. 1987. №10 с. 76-78.

131. Никитюк Н.М. Фаготипирование Styfimurium, выделенных на различных территориях СССР // ЖМЭИ. 1970. - № 1. - 53 с.

132. Николаенко Н.И., Тутов И.К. Изучение активности бактериофага Salmonella abortus ovis после длительного хранения его // Диагностика, лечение, профилактика заболеваний сельскохозяйственных животных. Тр.

133. Ставропольск. с/х ин-та. 1970. - Т. 33. - № 4. - С. 221 - 224.

134. Нурызгалиев С.Н. Фаготипирование стафилококков, выделенных от больных гнойными инфекциями // Материалы 10 науч. сем. Алма-Атин. гос. мед. ин-та. Алма-Ата, 1978. - С. 55 - 57.

135. Островская Н.Н., Гольдфарб Д.М. К использованию метода нарастания титра фага для выявления бруцелл во внешней среде // ЖМЭИ. 1961. -№ 5. - С. 145.

136. Островская З.С., Папкова Б.Н. Ускоренный метод диагностики брюшного тифа Vi-фагом // ЖМЭИ. 1951. - № 2. - С. 37 - 40.

137. Пушкарёва В.И. Патогенные бактерии в почвенных и водных сообществах (экспериментально-экологическое исследование). Автореф. дис. д-ра биол. наук. М., 1994.

138. Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных: Сб. санитарных и ветеринарных правил. М., 1996 с. 173-189.

139. Прошутинская М.А. //О-антигены бактерий рода Morganella и их серологическая идентификация. Автореферат канд. дисс., М., 1992.

140. Потапова Т.А. и др. О выделении Е. coli 0157:Н7 возбудителя ОКИ с гемолитико-уремическим синдромом в Тульской области. ЖМЭИ, 2000, №5, стр.115-116.

141. Парайко Е.Т., Парайко И.Н. Серологические варианты и группы протея у поросят при желудочно-кишечных болезнях // Биопрепараты, методы их стандартиз. и контроля: Всерос. гос. науч.- контр, ин-т вет. препаратов.-М., 1990. -С.157-160.

142. Ковальчук В.П., Пархоменко JI.B. Особенности инициального звена при поражении кишок условно-патогенными бактериями Proteus mir-abilis // Микробиологический журнал. 1991. - №6. - С.78-82.

143. Покровский В.И., Поздеев O.K. Медицинская микробиология. -М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1999.

144. Белоусов Ю.Б., Комарова В.Г., Ефременкова О.В. Выбор антибактериальной терапии при лечении инфекций у лиц пожилого возраста // Антибиотики и химиотерапия. 1998. - № 10. - С. 19 - 23.

145. Петровская В.Г. Факторы патогенности энтеробактерий и их генетический контроль // Актуальные вопросы гигиены и краевой инфекционной патологии. Душанбе, 1981. - С. 194 - 200.

146. Петровская В.Г. Генетические основы вирулентности патогенных и условно-патогенных бактерий // Журн. микробиол. 1984. - № 7. -С. 77-85.

147. Петрушина Л.И. Фаготипирование стафилококков, выделенных от больных маститом коров ЖМЭИ. 1967. -№ 5. - 128 с.

148. Поддубный Ф.Н. Изучение специфичности и чувствительности РНТФ при индикации дизентерийных бактерий в воде // ЖМЭИ. 1962. № 1.-С. 29-31.

149. Покровский В.И., Поздеев O.K. Медицинская микробиология. -М.: Медицина, 1999. С. 389 - 393.

150. Покровский В.И. Проблемы внутрибольничных инфекций // Эпидемиология и инфекционные болезни. 1996. - № 2. - С. 4.

151. Покровский В.И., Дунаевский О.А. Современные принципы и методы диагностики инфекционных болезней // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2001. - № 4. - С. 5 - 7.

152. Покровский В.И. Энтеробактерии. М.: Медицина, 1985. - С. 171-192.

153. Поликарпов Н.А., Шилов В.М., Красноголовец В.Н. и др. Биологические свойства патогенных энтеробактерий, выделенных из крови больных // Журн. микробиол. 1985. - № 10. - С. 15-19.

154. Пономарев А.П., Андреева О.Г., Артамонова Т.Н. Электронно-микроскопическое выявление вирусов животных в неконцентрированных вирусосодержащих суспензиях // Вестник РАСХН. 2002. - № 2. - С. 74

155. Пономарев А.П., Мищенко В.А. Электронная микроскопия вирусов животных и некоторых условно-патогенных микроорганизмов //В.: Фолиант.-2005.- 160 с.

156. Понявин Б.Я. Изучение реакции нарастания титра фага в условиях практической лаборатории // ЖМЭИ. 1960. - № 6. - 135 с.

157. Попхадзе М.З. Использование бруцеллезного фага для диагностики бруцелл // ЖМЭИ. 1968. - № 2. - С. 119 - 124.

158. Ратинер Ю.А., Канарейкина С.К., Бондаренко В.М. // Журнал микробиологии. -1976. № 5. - С. 117-121.

159. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике. Киев: Урожай, 1978. - С. 88.

160. Ревенко И.П. К диагностике рожи свиней // Ветеринария. 1970. -№6.-34 с.

161. Рубашкина Б.К., Казакова С.Ф. Применение метода нарастания титра фага для исследования объектов внешней среды // ЖМЭИ. 1959. -№ 6. - С. 110-112.

162. Русалеев B.C. Фагочувствительность аэробных спорообразую-щих бактерий // Ветеринария. 1990. - №8. - С.29-30.

163. Русалеев В.С Фагочувствительность консервированных культур Bacillus anthracis // Ветеринария. 1990. - №9. - С.39.

164. Русалеев B.C. Таксономия вирусов бактерий// Ветеринария1990

165. Свержко А.С., Седзинский М., Книрель Ю.А., Сенченкова С.Н.,

166. Комарова Н.А., Шашков А.С., Амано К. И., Кионо К., Каца В. Структурное и серологическое исследование О-антигена бактерии Proteus mirabilis ОХК (серогруппа 03), используемого в тесте Вайля-Феликса // Биохимия. №1. -1997. - С.28-35.

167. Сельников О.П., Фролов А.Ф., Авдеева J1.B., Лукач И.Г. // Гос-пит. инфек. и лекарств, устойчивые микроорганизмы / ЦНИИ эпидемиол. -М., 1992.-С. 46-47.

168. Сельников О.П., Персидский Ю.В., Барштейн Ю.А. Микробиологическая и патоморфологическая характеристика клебсиеллезной инфекции // Журн. микробиол. 1992. - Т. 54. - № 2. - С. 75 - 80.

169. Сергевнин В.И. Эпидемиологическая структура и экологическая классификация острых кишечных инфекций // Эпидемиол. и инфекционные болезни. 1997. - № 6. - С. 8 - 9.

170. Сергиенко Ф.Е. Новый метод бактерюлопчно! д!агностики за допомогою бактерюфага // Мжробюл. журнал А.Н. УССР. 1936. - № 1. -С. 85-112.

171. Сиволодский Е.П., РовновН.В., Петров Л.Н. Механизм специфической хромогенной реакции Klebsiella spp. на питательной среде с 5-аминосалициловой кислотой // Жур. микробиол. 1994 - № 3 - С. 489 -494.

172. Сиволодский Е.П., Герасименко Л.М., Копейка А.А. Питательная среда Proteus PPM для одноэтапного выделения и идентификации

173. Смирнова Е.Ю, Рыбакова И.А., Евсюкова Н.А. Эпидемиологическое распространение Y. enterocolitica в окружающей среде // Метериаля 8-го съезда ВНОЭМП. М., 2002. - Т.1 - С.З 89-399.

174. Ставцева Л.Я., Федорова М.К., Павлова Г.В. //Вестн. с-х науки, 1992, №5-6, с. 149-152.

175. Сидоров М.А. Колибактериоз (колиинфекция, колидиарея) новорожденных телят// ВИНИТИ. Серия животноводство и ветеринария: Инф. Бол. При пром. Скотоводстве, М., 1980, Том 13, с 114-112.

176. Скрыпник В.Г. Распространение бактерий рода иерсиния среди КРС. // Матер, междунар. науч. конф. "Общая эпизоотология: иммунология, экология и методологические проблемы". Харьков, 1995. с. 131-133.

177. Скрыпник В.Г., Митрофанов А.В. Роль Yersinia enterocolitica в патологии КРС. // Проблемы инфекционной патологии сельскохозяйственных животных. Владимир, 1997 с.210.

178. Смирнов И.В. О значении температуры инкубирования при идентификации кишечных иерсиний. // Микробиология и иммунология иерсиниозов. Сб. науч. трудов т. 84. Рязань. 1985. с. 22-26.

179. Собакин А.С., Зыкин Л.Ф., Хапцев З.Ю., Оркин В.Ф. Выявление кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулёза у животных. // Ветеринария. 1998. № 8 с.15-16.

180. Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Федотов В.Б. // Определитель зоопатогенных микроорганизмов. Справочник. М.: Колос - 1995. - 320.

181. Стронговская Н.В. Сравнительное изучение РНФ для выявления носительства дизентерийных бактерий: Автореф. дис. . канд. мед. наук.

182. Тарарышкин А.П. Экспериментальный иерсиниоз вызванный Yersinia enterocolitica водного происхождения. Автореф. дис. на соиск. уч. степ. канд. биол. наук. Алма-Ата, 1988.

183. Тимченко Н.Ф. Генетико-биохимические механизмы патоген-ности бактерий и перспективы их изучения. // Бюлл. АМН СССР. 1986. №4 с.66-71.

184. Тугаринов О.А. Колибактериоз телят и ягнят// Справочник

185. Тугаринов О.А., М.К.Пирожков, Ю.А.Малахов Сборник научных трудов. М.:ВГНКИ. - 2001. - Т.62. - С.68-75.

186. Тимаков В.Д., Гольдфарб Д.М. Реакция нарастания титра фага (РНФ).-М., 1962.-32 с.

187. Тимаков В.Д., Гольдфарб Д.М. Экспериментальное обоснование нового принципа обнаружения дизентерийных и брюшнотифозных бактерий с помощью фага // ЖМЭИ. 1956. - № 10. - С. 3 - 7.

188. Тихоненко А.С. Ультраструктура вирусов бактерий. М.: Hay

189. Трухина Г.М. Оценка методов выделения и циркуляции клебси-елл в объектах окружающей среды // Методы индикации биоценоза патогенных и потенциально патогенных микроорганизмов в объектах окружающей среды. М., 1985. - С. 63 - 69.

190. Ухо в Ю.И., Тарарышкин А.П. Патоморфология экспериментального иерсиниоза. // Микробиология и иммунология иерсиниозов. Сб. науч. трудов т. 84. Рязань. 1985. с. 39-43.

191. Хейс У. Генетика бактерий и бактериофагов. Основы генетики и молекулярной биологии. М.: Мир, 1965. - С. 275 - 368.

192. Хоменко И.М., Конюхова Н.А. Энтеротоксигенная и адгезивная активность клебсиелл // Молекулятная структура бактериальных токсинов и генитический контроль их биосинтеза: Тез. Всесоюз. конф. М., 1985. -С. 128-129.

193. Ценева Г.Я. Иерсиниоз и псевдотуберкулез // Пособие для врачей. С.-Петербург, - 1992.

194. Цветков К.И. Применение специфического бактериофага для диагностики паратифозного аборта кобыл // Ветеринария. 1941. - № 6. -С. 4-6.

195. Чанишвили Т.Г., Чанишвили Н.А. Научные и методологические основы практического применения бактериофагов// Перспективы использования препаратов бактериофага для превенции и лечения инфекции, вы

196. Черкасский Б.Л, Подунова Л.Г., Акулова Н.К. Пищевые зоонозы у людей в России. // Пищевые зоонозы сальмонеллёзы, кампилобактери-оз, иерсиниозы, листериоз. Методы и средства диагностики, лечения и профилактики: Тез. докл. М., 1995 с. 18-19.

197. Черневская О.М. Биологическая характеристика условно-патогенных энтеробактерий, выделенных в промышленных животноводческих комплексах. Автореф. дис. на соиск. уч. степ. канд. биол. наук. М., РУДН. 1995.

198. Чистякова И.С. О некоторых биологических свойствах иерсиний энтероколитика и псевдотуберкулёзис. // Микробиология и иммунология иерсиниозов. Сб. науч. трудов т. 84. Рязань. 1985. с. 27-30.

199. Чиракадзе Л.Г. Чинашвили Т.Г. Типирование S. typhimurium при помощи селекционированных фагов // ЖМЭИ. 1974. - № 3. - С. 72 - 78.

200. Ценева Г.Я., Бондаренко В.М., Полоцкий Ю.Е. и др. Инвазив-ность и цитотоксичность как критерий оценки аттенуации иерсиний. // ЖМЭИ. 1988 №9 с.10-15.

201. Хакешева Т.А. Фаги цитробактера // Автореферат канд. дис. -М. 1985.

202. Холодкова Е.В., Романенко Э.В., Рагинская В.П. // Моргана бактерии. ЖМЭИ, 1976, №6, с. 11-16.

203. Шантаренко И.В. Изучение РНФ как метода индикации бактерий дизентерии во внешней среде // Тез. докл. и выступл. на 5 Всес. научн. конф. по санитарн. микробиол. М. - 1962. - С. 89 - 93.

204. Шахов А.Г. Этиология и профилактика желудочно-кишечных и респираторных болезней телят и поросят // Ветеринарный консультант. -2003. -№ 1.-С.4-5.

205. Швиденко И.Г. Сравнительное изучение биологических свойств чувствительности и устойчивости к антибиотикам Proteus // ЖМЭИ. -1986.-№10.-С. 18-20.

206. Шипицын А.Г., Басова Н.Ю. Роль микробного фактора в возникновении респираторных болезней телят // Ветеринарный консультант. -2003.-№4.-С. 6.

207. Шкиль Н.А., Нестерова И.с., Коптев В.Ю. Особенности распространения, патогенность и чувствительность к антибиотикам Е. coli 0157:Н7 // Профилактикак, диагностика и лечение инфекционных болез

208. Шумилов К.В., Мельниченко Л.П. Значение диссоциации культуры Y.enterocolitica 09. // Ветеринария. 1996. №10 с. 26-28.

209. Эпидемиология, лабораторная диагностика иерсиниозов, организация и проведение профилактических и противоэпидемиологических мероприятий. // Инструкция МЗ СССР от 30.10.1990.

210. Ющенко Г.В., Дунаев В.М. Методика выделения и идентификации Yersinia pseudotuberculosis и Yersinia enterocolitica. // Лаб. дело 1980. №6 с.367-369.

211. Ющенко Г.В. Актуальные вопросы эпидемиологии и клиники иерсиниоза. // ВНИИМиМТИ Обзорная информация. Вып №4. М., 1984.

212. Ющенко Г.В. Иерсиниозы. // Руководство по эпидемиологии инфекционных болезней. М., 1993 с. 133-148.

213. Ющенко Г.В. Иерсиниозы в России. // Пищевые зоонозы -сальмонеллёзы, кампилобактериоз, иерсиниозы, листериоз. Методы и средства диагностики, лечения и профилактики: Тез. докл. М., 1995 с. 72.

214. Ющук Н.Д., Ценева Г.Я., Алёнушкина Т.В., Куляшова Л.Б. Эффективность применения тимогена при экспериментальной инфекции, вызванной Yersinia enterocolitica. //ЖМЭИ. 1995. №3 с. 106-108.

215. Щеглова М.К. Некоторые свойства листериозного бактериофага //ЖМЭИ.-1962.-№ 1.- С. 99- 102.

216. Ackermann -H.-W., DuBow M.S., Gershman M. Taxonomic changes in tailed of enterobacteria // Archies of virology. 1997. - № 142. - P. 1381 -1390.

217. Atreyee M., Nirmolendu R. Pevisent structure of the capsular polysaccharide of Klebsiella serotype 15 // Syst. and Appl. Microbiol. 1992. - V. 15,№4.-P. 505-512.

218. Abrams H.L. New England J. Med., 1948, v.238, p. 185.

219. Alexander D.M. Rep. Loc. Gov. Bd. Publ. Hlth., 1911/12, №4, p.288.

220. Bahr L., Thomsen A. Zbl. Bact. I. Orig., 1912, v. 66, p.365.

221. Bergey, s Manual of Systematis Bacteriology. 8 Ed., Baltimore,

222. Bagley S.T., Seidler R.J., Talbot H.W.J., Morrow J.E. Isolation of Klebsiellae from within living wood // Appl. Environ. Microbiol. 1978. - V. 36.-P. 178- 185.

223. Coetzee J. N. Nature, 1967, v. 213, p. 614616.

224. Chow J., Yu V., Shiaes D. Epidemiologic perspectives on Enterobacter for the infection control professional //Amer. S. Infec. Control. 1994. - V. 22,№4.-P. 195-201.

225. De Cheldre Y., Rost F., Struelens M.J. Вклад лабораторной диагностики в изучение вспышек, вызванных мультирезистентными штаммами E.aerogenes // Acte clin. belg. 1995. - № 1. - P. 54 - 56.

226. Donaldson S.G, Azizi O., Nogare dal R. Anthony Characteristics of aerobic gram-negative bacteria colonizing critically ill patients //Amer. Rev. respire. Disease. -1991. V. 144, № 1. - P. 202 - 207.

227. Donaldson Scott G., Azizi S.Q., R. dal Nogare Anthony Characteristics of aerobic gram-negative bacteria colonizing critically ill patients // Amer. Rev. Respir. Diseases. 1991. - V. 144, № 1. - P. 202 - 207.

228. Duguid J.P. Old D.C. Adhesive properties of Enterobacteriaceae // Bacterial Adherence / ed. E.H. Beachey. London: Chapman and Hall, 1980. -P. 187-215.

229. Edberg S.C., Piscitelli V., Cartter M. Phenotypic characteristics of coliform and noncoliform bacteria from a public water supply compared with regional and national clinical species // Appl. Environ. Microbiol. 1986. - V. 52.-P. 474-478.

230. Edwards P.R., Ewing W.N. Identification of Enterobacteriaceae // Burgess publ. Co., Minneeaprolis, 1972.

231. Ewing W.H., Edwards P.R., Ewings Identification of Enterobacteriaceae. 4 th ed. - New York; Amsterdam; Oxford; Elsevier. - 1986. - V. 536.

232. Edwards P. R., Ewing W.N. Identification of Enterobacteriaceae. Burgess publ. Co., Minneeapolis, 1955.

233. Edwards P. R., Ewing W.N. Identification of Enterobacteriaceae. Burgess publ. Co., Minneeapolis, 1962, 223-227.

234. Emody L., Voros S., Pal T. Microbiology Letters, 1982, v. 13, p.229264. Ewing W. N., Edwards P. R. Intern. Bull. Of Bact. a. Nomemenclat., 1962, v. 12, p. 93.

235. Eorsi M., jablonszky L., Milch H., Barsy G. significance of bacteriophage in infantile enteric infections. Acta microbiol. Acad. Scihung., 1957, v.4. #2, p. 209.

236. Gaston M.A., Ayling-Smith B.A., Pitt T.L. New bacteriophage tiping scheme for subdivision of the frequent capsular serotypes of Klebsiella spp. // J. clin. Microbiol.- 1987.-V. 117,№2.-P. 1228-1232.

237. Gragia J., Yan G. Demonstration of types of tyfosus by means of preparation of type // Canad. publ. hith. J. 1938. - V. 29, № 9. - P. 448.

238. Graigie J., Felix A. Typing of typhoid bacilli with Vi bacteriophage, suggestions for its standardization // Lancet. 1947. - № 14. - P. 823.

239. Ivanof A., Serban D., Joneseu O. Enterotoxigenic bacteria in infantile diarrheal disease // Arch. roum. Path. exp. Microbiol. 1983. - V. 42, № 2 - 3. -P. 147- 153.

240. Ivanovics G., Alfoldi L. //Acta Microbiol. Acad. Sci. hung., 1955,v.2, p.

241. Jhanjee A., Asnani P.J. Klebsiella pneumoniae enterotoxin // Acta Microbiol. Hung. 1982. - V. 29, № 1. - P. 1 - 7.

242. Jacob F., Wollman E.L., C.R. Acad. // Sci., Paris, 1958, v. 247, p.154.1

243. Jordan E.O., Crawford R.R., McBroom J. J. Bact., 135, v.29, p. 131.

244. Kahlich R., Palecek A., Korych B. Nalez enterobakterove toxikose v Ramcidiagnostiky strevnich epidemii // Voj. Zdrav. Listy. 1982. - V. 51. - P. 260-263.

245. Katznelson H., Sutton M. Rapid phage plague count method for the detection of bacteria as applied to the demonstration of intern along borne bacterial infection of seed // J. Bact. 1951. - V. 61, № 1. - P. 689.

246. Kauffmann F. On the classificacion and nomenclature of family Enterobacteriaceae // Intern. Bull. bact. Nomencl. a. Tacsonom., 1963. V. 13. - P. 187-193.

247. Kauffmann F. On the serology of the Klebsiella group // Acta Pathol. Scand. 1949. - V. 26. - P. 381 - 406.

248. Kaur K., Kaul M., Chhiber S. Enterotoxigemicity, klebocinogeny and antibiotic resistance pattern of food isolated of Klebsiella pneumoniae // Folia Microbiol. 1988. - V. 3, № 6. - P. 500 - 506.

249. Ketti I. A study of Escherichia coli from farm animals during // Acta. Microbiol. Acad. Sci. Hung. 1981. -V. 28. - P. 393-398.

250. Kauffmann F. Enterobacteriaceae. 2 Ed., Copengagen, 1954.p.1-8.

251. Lautrop H //Bergey,s manual of determinantive bacteriology. 8 Ed., Baltimore, 1974, p. 327-330.

252. Lewis С. I. // Great. Brit. Rep. Loc. Gvt. Bd. Suppl. Med. Off., 1911/12, v.41, p.319.

253. Lowel R. //J. Path. Bact., 1929, v.32, p.79.

254. Lindberg R.B., Latta R.L. Phage tuping of Ps. aeruginosa chinical and epidemiologi considerations // J. Infect. Diseases. 1974. - V. 130, № 5. -P. 32-34.

255. Lee C.J., Jung D.S., Jung S.H., Baik J.H., Lee J.H., Cho Y.R., Go B.S., Lee S.W., Han S.Y., Lee D.H. Comparison of Liver Abscess between Diabetic Patients and Non-Diabetic Patients // J Hepatol. Korean. 2005. - V. 11, №4.-P. 339-449.

256. Levintal C., Fisher A. Structural developmet of a bacteriae virus // Biochim. Biophys. Acta. 1952. - V. 9, № 4. - P. 419.

257. Martin W.J., Washington J.A. Enterobacteriaceae // Manual of clinical microbiology. 3rg ed. / Eds. E.H. Lennette et al. - Washington D.S.: ASM, 1980.-P. 195-209.

258. Matsen J.M., Spindler J.A., Blosser R.O. Characterization of Klebsiella isolates from natural receiving waters and comparison with human isolates // Appl. Microbiol. 1974. - V. 28. - P. 672 - 678.

259. Mukherjee Atreyee, Roy Nirmolendu Pevisend serotipe 15 // Syst. and Appl. Vicrobiol. 1992 - V. 15, № 4 - P. 505 - 512.

260. Mollaret H.H., Alonso J.M., Bercovier H. Aspects biologiques et ecologiques des Yersiniosis. // Med. et malad. Infec. 1982. T. 12 p. 664-667.

261. Magheru A. /1С. R. Soc. Biolo., Paris, 1923, v.89, p.643.

262. Mc Futon D. // J. Bact., 1943, №46, p.79-82.

263. Mc Millan S.A. //Lancet, 1972, №2,p.452-455.

264. Morgan H.R. //Brit. Med. J., 1906, №1, p. 908-912.

265. Morrison V. //Pig Farm., 1984, v. 32, №9,p. 116-121.

266. Nicolle, LE Minor S, LE Minor L., Buttiaux R. Lysotipie von Escerichia coli isolirt aus dympeptichen Stiihlen von Negebornen. Zbl. Bakt., I Abt. Orig., 1957, B.t. 168, S.512.

267. Nicolle P., Mollaret H.H., Brault J. Nouveaux resultats sur la lyso-typie de Yersinia enterocolitica portant sur plus de 4000 souches d'origins di-verses // Revue d'epidemiologie et de sante publique. Paris. 1976. - № 24. -P.479-496.

268. Nicolle P., Mollaret H.H., Brault J. Recherches sur la lysogenie, la lysosensibilite, la lysotypie et la serologie de Yersinia enterocolitica // In: Con-tribs. Microbiol, and Immunol. 1973. - № 2. - P.54-58.

269. Nicolle P., Mollaret H.H., Hamon., Vieu J.-F. Etude lysogenique,

270. Nielsen B. and Wegener H.C. Public health and pork and pork products: regional perspectives of Denmark // Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 1997.- №16.-P.513-524.

271. Nilehn B. Electron microscopic studies on flagellation in different strains of Yersinia enterocolitica // Acta Path. Microbiol. Scand. 1969. - № 77. - P.527-541.

272. Nilehn B. Studies on Yersinia enterocolitica. Characterisation of 26 strains from human and animal sources // Acta Path. Microbiol. Scand. 1967.- № 69. -P.83-91.

273. Nilehn B. Studies on Yersinia enterocolitica. Growth on various solid media of 37° and 25°C // Acta Path. Microbiol. Scand. 1969. - №77. -P.685-697.

274. Nilehn В., Ericson C. Studies on Yersinia enterocolitica. Bacteriophages liberated from chloroform treated cultures // Acta Path. Microbiol. Scand. 1969. - №75. - P.177-187.

275. Nilehn, B. Studies on Yersinia enterocolitica with special reference to bacterial diagnosis and occurrence in human acute enteric disease // Acta Path. Microbiol. Scand. Suppl. 1969. - №206. - P. 1-48.

276. Nilehn B. Host range, temperature characteristics and serologic relationship among Yersinia phages // In: Contribs. Microbiol, and Immunol.313.0rscov I., and 0rscov F. Serotyping of Klebsiella // Methods Microbiol. 1984. - V. 14. - P. 143 - 164.

277. Ozeki H., Stocker B.A., Margerie H. // Nature, 1959, v. 189, p.337.

278. Penner J.L., Hennesy J.N. //J. Clin. Microbiol., 1979, v. 10, №1, p. 89.

279. Pieroni P., Rennie R.P., Ziola В., Deneer H.G. The use of bacteriophages to differentiate serologically cross-reactive isolates of Klebsiella pneumoniae // J. Med. Microbiol. 1994. - V. 41, № 6. - P. 423 - 429.

280. Podschun R., Heineken P., Sonntag H.G. Haemogglutinins and adherence properties to HeLa and intenstine 407 cells of K. pneumoniae and K. oxytoca isolates // Zbl. Bakt. Hyg., 1 Abt. Orig. 1987. - Bd 255, № 4. - P. 585 -593.

281. Podschun R., Penner I., Ullmann U. Interaction of Klebsiella capsule type 7 with human polymorphonuclear leucocytes // Microb. Pathog. 1992. -V. 13.-P. 371 -379.

282. Podschun R., Ullmann U. Klebsiella spp. as Nosocomial Pathogens: Epidemiology, Taxonomy, Typing Methods, and Pathogenicity Factors // Clinical Microbiol, reviews. 1998. - V. 11, № 4. - P. 589 - 603.

283. Przondo-Hessek A. Bacteriophages of Klebsiella bacilli. Isolation properties and use in typing. Arch. Immunol. Ther. Exp. 1966. - V. 14. - P. 413-435.

284. Rauss K.//J. Path. Bact., 1936, v.42,183-192.

285. Rauss K., Voros S. //Acta microbiol. Sci hund., 1959, v. 6, p. 232248.

286. Rauss K., // Internat. Bull. bact. Nmencl. A. Taxonom., 1962, v. 12, p. 53-63.

287. Rauss K, Voros S. //Acta microbiol. Sci hund., 1967, v. 14, p. 195198.

288. Rauss K. // Enterobacteriaceae Infectionen, Leipzig, 1968, p. 581594.

289. Rauss K., Putzova H., Dubay L. Et. Al. // Acta microbiol. Acad. Sei. Hung, 1975, v.22, p. 315-321.

290. Report of the Enterobacteriaceae Subcommittee of the Nomenclatur Committee of the Internatil Assoc. Of Microbiologgical Socicieties Intern. Bui. Bact. Nomencl. a. Taxonom., 1958, v. 8, №1, p. 25-70.

291. Report of the Enterobacteriaceae Subcommittee of the Nomenclatur Committee of the Internatil Assoc. Of Microbiologgical Socicieties Intern. Bui. Bact. Nomencl. a. Taxonom, 1963, v. 13, №2, p. 69-63.

292. Reers P.I, Fex B.A. Structure and properties of t the rapidy sedi-menting replicaciong complex staphylococcal phage К DNA. // J. Gen. Virol, 1983, 64, №1, p. 191-198.

293. Riser E, Noone P, Howard F.M. Epidemiological studi of Klebsiella

294. Senior B.W. // J. Med. Microbiol., 1987, v. 23, p. 33-39.

295. Spittel J.A., Martin W. // Proc. Saff Meet. Mayo Clin., 1954, №29, p. 235-237.

296. Sutter V., Foecking S., // J. Bact., 1962, v. 83, p. 933-935.

297. Schindler P.R.G., Metz H. Coliform bacteria in drinking water from South Bavaria: identification by the API 20 E system and resistance patterns // Lentralbl. Hug. Und Umweftmed. 1990. - V. 190, № 5 - 6. - P. 436.

298. Seidler R.J., Knittel M.D., Brown C. Potential pathogens in the environment: cultural reactions and nucleic acid studies on Klebsiella pneumoniae from clinical and environmental sources // Appl. Microbiol. 1975. -V. 29.-P. 819-825.

299. Simoons-Smit A.M., Verweij-van Vught A.M.J.J, Kanis I.Y.R., MacLaren D.M. Chemiluminescence of human leucocytes stimulated by clinical isolates of Klebsiella // J. Med. Microbiol. 1985. - V. 19. - P. 333 - 338.

300. Simoons-Smit A.M., Verweij-van Vught A.M.J.J., MacLaren D.M. The role of К antigens as virulence factors in Klebsiella // J. Med. Microbiol. -1986.-V. 21.-P. 133- 137.

301. Slopek S. Phage typing of Klebsiella // Methods Microbiol. 1978. -V. 11.-P. 193-222.

302. Slopek S., Przondo-Hessek A., Milch H., Deak S. A working scheme

303. Slopek S. Phage typing of Klebsiella // Methods Microbiol. 1978. -V. 11.-P. 193-222.

304. Thjotta T.// J. Bact., 1919, №4, p. 355.

305. Thjotta T.// J. Bact, 1920, №5, p. 67-69.

306. Tucci V, Isenberg H.D. // J. Clin. Micobiol, 1981, v. 14, p. 563-566.

307. Vail M. // Bergeu,s Manual of determinative Bacteriologi. Baltimore, 1939, p. 430-436.

308. Vernet V, Philippon A, Madoulet C., Vistelle R, Jaussand R, Chippaux C. // FEMS Vicrobiol. Lett 1995 - V. 130, № 1. - P. 51 - 57.

309. Ullmann U. Pattern of microbial isolates in hospitalized patients // Zentbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. Ser. 1986. - P. 103 - 113.

310. Weiss R. Klebsiella // Handbuch der bakteriellen Infectionen bei Tieren / Hrsg. Von H. Blobel, T. Schlisser.- Jena 1981. - P. 453 - 479.

311. Williams P., Lambert P.A, Brown M.R.W., Jones R.J. The role of the О and К antigens in determining the resistance of Klebsiella aerogenes to serum killing and phagocytosis // J. Gen. Microbiol. 1983. - V. 129. - P. 2181 -2191.

312. Williams E.W, Hawkey p.M. Penner J.L. et al. J. Clin. Micobiol, 1983, v.18, p. 5-9.

313. Wong S.H, Cullimore D.R, Bruce D.L. Selective medium for the

314. Yanagawa Y., Maruyama Т., Sakai S. Isolation of Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis from apparently healthy dogs and cats // Microbiology and Immunology. 1978. - №22 - P. 643-646.

315. Yokochi Т., Nakashima I., Kato N. Effect of capsular polysaccharide of Klebsiella pneumoniae on the differentiation and functional capacity of macrophages cultured in vitro // Microbiol. Immunol. 1977. - V. 21. - P. 601 -610.

316. Yokochi Т., Nakashima I., Kato N. Further studies on generation of macrophages in in vitro cultures of mouse spleen cells and its inhibition by the capsular polysaccharide of Klebsiella pneumoniae // Microbiol. Immunol. -1979.-V. 23.-P. 487-499.

Информация о работе

Золотухин, Сергей Николаевич
доктора биологических наук
Ульяновск, 2007
ВАК 03.00.23

Диссертация

Создание и разработка схем применения диагностических биопрепаратов на основе выделенных и изученных бактериофагов энтеробактерий - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы