Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение, характеристика и трансплантация сперматогоний типа А хряка

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Выделение, характеристика и трансплантация сперматогоний типа А хряка"

Ж9И2

На 1р«и1 рующк«

Коржиком Светлана Васильевна

ВЫДЕЛЕНИЕ, ХАРАКТЕРИСТИКА И ТРАНСПЛАНТАЦИЯ СПЕРМАТОГОНИЙ ТИПА А ХРЯКА

93.М.23 - Бшгиологн»

АВТОРЕФЕРАТ щспрпиия в» м>иск»ние ученой степени кандидат» биологических наук

Дубровины, 2002

Работа выполнен* » лаборатории клеточной инженерии отдела биотехнологии Всероссийского государственно!« научно-исследовательского института животноводства

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ - доктор биологических наук

Ирина Петровна Савченкоаа

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук,

профессор Лев Петрович Дынсоноа; кандидат биологических наук Татьяна Егоровна Тарадайник

В«дутцес учреждение * ГНУ Всероссийский научно-кссдедомтсльский

институт свиноводства

Защита днссерта» заседании днссе; государственном'

Адрес nnctp ■ -- 'i- v "v v ^Сл., Подольский р-н

j >>)Н1ЦЫ

Сдиссертацией v - ,• \ . . -я -т

Автореферат р*: . ¡¡Л/' ¿ ^¿002г.

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат биологических i

« $ * ' ^ г а "^часоа на

■ Д • >. при Всероссийском

• ■ wживотноводства.

В.П.Губанова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность темы. Разработка новых методических приемов лля

лол у ч« пил животных со стабильной интеграцией и экспрессией рекомбинантной ДНК а геноме имеет важное научно-практическое значение. {ВгешО. « а!., 1991,1995; Ооакег А.е1 а)., 1986; Эрнст Л.К., 1998]. Одним из таких подходов яаЛяется использование ствопоаык клеток; эмбриональных стволовых клеток, приморднальных половых зародышевых меток н стволовых клеток сперматогоний. Особенно перспективными для получения трансгенных животных представляются разработки с не пользованием стволовых клеток сперматогоний (СКС).

Единственным источником потенциально тотипотентных диплоидных клеток во взрослом организме млекопитающих являются стволовые клетки сперматогонни. У половозрелых самцов популяция диплоидных стволовых клеток сперматогоний постоянно обновляется и производит потомство клеток, которое инициирует комплексный процесс днфферешшровки, приводящий к появлению высоко специализированных половых клеток -сперматозоидов. Теоретически одна с лерматогоннальная стволовая клетка способна сформировать 4096 снерматид [КиззеН е1 а1„ 1990),

Уникальное свойство стволовых клеток сперматогоний многократно самообновляться открывает широкие возможности реализации потенциала этих клеток в создании новых видов животных с измененным геномом!

Использование СКС открывает широкие возможности для исследований в таких областях. #ак; фундаментальное исследование сперматогенеза, получение трансгенных крупных домашних животных, защита пацнентоа от бесплодия, возникающего в результате химио и радиотерапии. Ядра стволовых клеток сперматогоний, возможно, могут быть ценным материалом для конструирования новых клеточных типов в процессе клонирования.

Использование СКС в качестве вектора для переноса экзогенной Д1 Ц< в организм млекопитающих может иметь значение идя пяла

ЦЕНТРАЛЬНАЯ НАУЧНАЯ Б. Л; г •ОТЕКА

М0С-(, СвЛЬСКОЮ' >. ЯЧй^А'ИИ

А

экспериментальных работ, например для развития генной терапии н тронсгежписа.

Пересадка модифицированных стволовых клеток донора в семенники стерильного реципиента является перспективным, принципиально новым инструментом в медицине и биотехнологии. Рядом ученых [Вппяег е! а1., 1994] продемонстрирована способность СКС донора колонизировать семенники реципиента и инициировать комплексный процесс дифференцировки» приводящий к продукции потомственных клеток и, в итоге, зрелых сперматозоидов. Полученные результаты дают основание считать целесообразным дальнейшее развитие техники трансплантации для получения трансгенных животных с заведомо известными признаками.

Поскольку исследования в этом направлении ведутся в основном на мышах н крысах (ОоЬгггкМ 1. е( а!.. 2000; Оцамч» Т.« а!., 1997; 6с Кооу О.С., 2001], адаптация данного подхода к крупным сельскохозяйственным животным и, в частности, свинье представляется перспективным направлением современной сельскохозяйственной биотехнологии, а тема настоящей работы имеет несомненную актуальность.

Цель и задач и исследований. Целью работы являлось выделение, характеристика и трансплантация стволовых клеток спермагогоннй типа Л хряков. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

• изучить динамику сперматогенеза у местных помесных хряков в образцах фиксированных тканей;

• оптимизм овать существующие методические приемы, позволяющие изолировать СКС тип« А из семенников хряка;

- * подобрать оптимальные условия, влияющие на поддержание СКС в недифференцированной форме при краткосрочном культивировании и охарактеризовать СКС в культур«;

• оптимизировать схему трансплантации СКС свиней в семенники стерильных реципиентов;

• изучить возможность колонизации клетками донора семенных канальнев стерильного реципиента и е< обновления я них сперматогенеза.

Научная новизна. Впервые изучена динамика сперматогенеза у местных помесных свиней и установлен возраст хрячков, при котором сбор СКС типа А является максимальным.

Разработан эффективный н недорогой метод выделения стволовых клеток сперматогоний нз семенников местнил' помесных хряков м предпринята попытка создания оптимальных условий для их культивирования. Изучена роль и проведен сравнительный анализ использования различных монослоев н ростовых факторов для поддержания СКС в культуре в недифференцированном виде.

Впервые, с. учетом морфо-физно логических характеристик свиней, модифицирована и оптимизирована схема трансплантации донорских клеток в семенники стерильных реципиентов, предложенная ранее для мышей, н разработан метод обработки животных бусульфано т с целью выключения эндогенного сперматогенеза.

Впервые показано на свиньях, что СКС донора возобновляют в, семенных канальцах реципиента полноценный сперматогенез с выработкой зрелых сперматозоидов.

Практическая ценность работы. Полученные экспериментальные данные по выделению очищенной популяции СКС типа А свиньи, проведении с ними манипуляций in vitro и .пересадке их в семенники реципиента представляют практическую ценность в связи с эффективностью и низкой стоимостью разработанных методических приемов, что позволит в

• будущем использовать стволовые клетки сперматогоний типа А, обладающие уникальным свойством -самообновлением в течение всей жизни животного, в качестве вектора для переноса рскомбинантиой ДНК в геном реципиентов с целыо получения животных с заведомо известными признаками.

Основные положения, выносимые на защиту:

-влияние возраста хряка на получение обо гашенной культуры СКС

типа А;

-метод выделения н очистки стволовых клеток сперматогоний типа А свиньи;

-характеристика стволовых клеток сперматогонпА типа А свиньи;

•влияние ростовых факторов и монослоев фидерных клеток на поддержание СКС свиньи в культуре;

-схема обработки самцов свиней бусульфоном с целью подавления эвдогенного сперматогенеза;

■ -потенция СКС свиней возобновлять сперматогенез в семенных канальцах хряков, характеризующихся половой стерильностью, после трансплантации в них донорских клеток.

Лпробиняя работы. Материалы диссертации доложены н обсуждены; на 2-ой Международной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», ВННИСХБ, г.Москва, октябрь 2000г; на международно!) конференции ■ «ДНК-технолог ни в клеточной инженерии к маркировании признаков сельскохозяйственных -животных», ШШПЖ, пЛуброаииы, ноябрь 2001 г; на научно-практической конференции, п.Быково, июль 2001г.; на 7-ом мировом конгрессе генетиков, Франция, август 2002г.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 4 научные работы.

Структура м объем работы. Диссертация изложена на 113 стр., содержит 4 табл., 36 ;ис. (в т.ч. 30 фотографий, 2днаграммы), состоит из следующих .разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты, обсуждение, выводы, список литературы. Список литературы включает (6Д библиографических источников, в т.ч. на иностранном языке.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Работе выношена по плану научно-исследовательских работ в лаборатории клеточной инженерии отдела биотехнологии ВНИИ животноеодетва. На рис. 1 предстаалена общая схема эксперимента.

Рис. 1. Общая схема эксперимент».

Отбор новорожденных хрячков для эксперимента I

. Анализ эффективности трансплантаци и

В экспериментах были использованы хряки, выращенные а ОИХ Кленово-Чегодаево. Для изучения сперматогенеза и получения культур сперматогекных клеток использовали тестнкулы от 51 хрячка, кастрированных с интервалом в одну неделю, начинам с 7 суток после рождения и до 119 суток включительно. В эксперименте по трансплантации сперматогенных клеток использовали 80-суточных хрячков (22 животных).

Изучение динамики сперматогенеза и определение возраста хряков оптимального для максимального сбора С КС осуществляли в образцах фиксированных тканей. Гистологические препараты из ткани семенника готовили по стандартным методикам (Роскин Г.И., 1946, Ромейс Б., 1953, Пирс Э.,1962). ,

Выделение культур клеток из тести кул хряка осуществляли путем последовательной механической и. ферментативной (1мг/мл коллагеназы, 0,25% трипсина) обработок ткани семенника.

Для получения максимально чистой популяции СКС использовали метод, основанный на {различных адгезивных способностях различных типов клеток (Совчевкова и др., 2000) ■

. Морфологическую оценку свежевыделеиных СКС свиньи проводили визуально под фазовс^комтрастным микроскопом, учитывая такие показатели, как форма н размер. клеток, ядерно-цитоплазмптическое соотношение, а также посредством приготовления препаратов СКС, окрашенных по Романовскому-Гимза.

В экспериментах использовали стандартные питательные среды, и растворы отечественного и зарубежного производства.

Ростовой средой для культивирования СКС служила срсда ДМЕМ (среда Игла, в модификации Дюльбекко) с высоким содержанием глюкозы (4,5 г/л) (ПанЭко, Россия). Перед использованием в среду добавляли 15% сыворотки плода крупного рогатого скота (РС5), 2 шМ алцфа-глутлмшт <

США), 0,1 мМ 2-меркалтоэтанола. 0,1 мМ заменимых аминокислот и гентамицин (конечная концентрация 50 мкг/мл) (ПанЭко):

Фолликулярную жидкость получали из плодов свиньи на 28-30 сутки супоросности, фильтровали, аликвотнлн, хранили при -20°С. ..... '

Культивирование клеток проводили а инкубаторе, позволяющем обеспечивать необходимую температуру <37°С), влажность воздуха и содержание COj {5%) (Sanyo, Япония).

СКС культивировали на фидерных слоях, представленных клетками STO, первичными клетками Сертоли из коллекции клеточных культур лаборатории клеточной инженерии ВНИИЖ и перевиваемой линией клеток Сертоли из коллекции ВИЭВ. Для приготовления фидерных слоев монослой клеток обрабатывали ростовой средой, содержащей митомнцнн С фирмы Sigma {конечная концентрация 10-30 мкг/мл), с целью подавления митоза.

Электроцорацню мужских половых клеток осуществляли с помощью прибора для элестроелняння ЕС 100 (США).

Наличие в трансфецированных клетках бета-галактозндазы, продукта экспрессии введенного гена lacZ £.co!i, определяли путем окрашивания в специальном буфере. В качестве субстрата & буфер добавляли X-gal (Sigma, США) 9 концентрации 400 мкг/мл. Долю клеток, продуцирующих бета-галактозидаэу расчитцвали при анализе 1000 клеток.

Для стерилизации животных-реципиентов использонали раствор бусульфана (Sigma, США) в ДМСО. Анализ-стерильности реципиентов проводили по гистологическим образцам после каждой обработки бусульфаном.

. Клетки, выделенные из ткани семенников 80 сут. доноров подверти трансфекцин, ресуспендировали в физиологическом растворе и сразу же вводили в семенники животным-реципиентам.

Успешность трансплантации сперматогенных клеток оценивали в, образцах фиксированной ткаын семенника и составу полученной культуры от хрячко&-рецклиентов через 29 сут. после трансплантации. Эффективность трансплантации определяли по присутствию делящихся клеток в семенных канальцах и явному наличию поздних стадий сперматогенеза.

Для выявления природы экзогенного сперматогенеза в семенниках реципиентов культуры клеток, выделенные через 29 сут. после трансплантации окрашивали на присутствие в клетках бета-галактози дазы -продукта экспрессии гене lacZE coH,

Природу протекающего в семенниках реципиентов сперматогенеза через 10 месяцев после трансплантации осуществляли путем анализа микросателлнтных ДНК, выделенных нэ уха и спермы хрячков, на батарее, состоящей из 11 маркеров. Анализ был любезно проведен в институте животноводства и генетики ветеринарно-медицннского университете (г.Вена).

Лэульташ экспериментов имели трехкратную повторкость документированы фотографиями.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Изучение динамики сперматогенезе к характеристика клеточных типов семенника хряка в образцах фиксированной тканн.

В результате микроскопических исследовании гистологических препаратов приготовленных из ткани семенника от животных, кастрированных с интервалом неделя, начиная с рождения и до 119 сут. включительно, было определено, что, начиная с новорожденного возраста, в семенных канальцах хрячков обнаруживаются только клетки Сертолн н, как мы полагаем, 2 вида сперматогоиий типа А (рнс.2). Первый тип клеток характеризовался темным крупным ядром и небольшим ободком цитоплазмы. Вт "рой тип имел светлое крупное ядро н более тонкий обод«к цитоплазмы. Размер обоих типов клеток находился в пределах с«- 25 до 30 мкм. Сперматогонии типа А располагались либо на клетках Сертоли, либо непосредственно на базальной мембране семенного канальца.

м

Рис, 2. Поперечный срез семейных пмшпмв 7 сут. хряка. Ув, 400. Стрелками у камни дм типа слерматогоииЯ: с темным крупным ядром и топким оводком иитоялазмы я светлым ядром м более узким ободком и иго плазмы.

Опорные клетки Сертоли рее полагались плотным сдоем на базальной мембране семенных канальцев. Эти клетки имели крупное, неправильной формы ядро с одним или несколькими ядрышками и небольшим количеством нукяеолярного хроматина, окруженное ободком цитоплазмы. С увеличением возраста хрячков число к размеры этих клеток существенно не изменялись, и только к 119-сут. возрасту мх количество становилось трудно определимым, так как смешивалось с общей массой спермвтогенных клеток начавшегося сперматогенеза.

С увеличением возраста животных на срезах семенников состав клеток не изменялся. Однако количество сперматогоний типа А постепенно увеличивалось н к 60-ти сут. возрасту достигало максимального количества, насчитываемого в препаратах разного возраста (30К от общего количества клеток, видимых на поперечных срезах семенника). Такое соотношение клеток в семенных канальцах наблюдалось до 80-сут. возраста. Затем

соотношение сперматогенных клеток в тестнкуле менялось. Так, у 98-сут. хрячков отмечалось появление в просвете семенных канальцев промежуточных сперматогоний, сперматогоний типа В к ранних сперматоцитов. К 119 сут. возрасту в семейных канальцах появлялась люмина, в которую высвобождались единичные сформированные сперматозоиды, в к 126-ти сут. возрасту у животных наблюдался полноценный сперматогенез.

* 3.2. Влияние возраста хряка ив волу чем ие обогащенной культуры СКС.

Приготовленный гистологические образцы из семенников хрячков подвергали тщательному микроскопическому исследованию. Для каждого возраста подсчет СКС осуществляли на 30 максимально круглых поперечных срезах семенных канальцев. В тебя. I указано среднее количество СКС, насчитываемое на поперечных срезах семенника в динамике от рождения к до 83 суточного возраста. На основе данных таблицы 1, построена кривая зависимости количества СКС в семенных канальцах от возраста хрячков {рис. 3)

Таблица 1

Количество СКС ив поперечвых срезах семенных канальцев хрячков от рождения и до 83«х сут. возраста.

Возраст (сут.) Кол-во СКС на поперечном срезе семенного канальца

0 0.75

7 1.4

25 1,3$

32 1,45

40 1,75

• ( 47 1,65

62 2.4

83 ' 2.42

Анализ ролученных данных показал, что количество стволовых клеток сперматогоний возрастает цо мере увеличения возраста хрячков и в возрасте 60 сут. достигает максимального значения. В интервале от 60 до 80

сут. количество СКС поддерживается приблизительно на одном уровне и после 80 сут. становится трудно определимым, так как из-за начавшегося сперматогенеза они теряются в обшей мессе сперматогенных клеток.

Гм 3. Зависимость количества СКС «г возраста хртчма.

10 7 25 32 40 ' 47 63 вЭ Возраст (сут.)

Из диапмммы явствует, что возраст хрячков в интервале от 60 до 80 суток после рождения является оптимальным для максимального сбора стволовых клеток сперматогоний типа А.

Параллельно проводили анализ свежевыделениой суспензии клеток из семенников хрячков. Оценку состава и соотношения различных клеточных типов семенника в зависимости от возраста животных производили визуально на основании морфо-фнзиологнческнх особенностей клеток, выявленных в процессе изучения динамики сперматогенеза в образцах фиксированной ткани.

По мере увеличения возраста животных, вплоть до 60 сут., количество сперматогоний в суспензии увеличивалось н в возрасте от 60 до 80 сут. поддерживалось на максимальном уровне (16% от общего количества клеток).

ЭЛ. Выделение СКС ш ткана ееммшика 1рп».

3.3.1. Ср«*нытельнын тмлю эффективности мехам нчеемго и ферменматиеиого способов мыдшяжыж культур клеток ю семенника« свиней

В клеточной бновогни обычно используются 2 метода выделения клеток из тканей и органов млекопитающих: механический и ферментативный. Нами был проведен сравнительный анализ этих методов.

Суспензию клеток, полученную после механической н ферментативной обработок, визуально оценивали под микроскопом. Поскольку в процессе выделения основной целью было высвобождение из ткани семенника стволовых клеток спермаюгоннй, располагающихся на бозалыюй мембране семенных канальцев, то, в качестве основного критерия при оценке полученных клеточных суспензий, мы использовали присутствие клеток с характеристиками стволовых клеток: шарообразное ядро н высокое ядерио-цитоплазматическое соотношение при крупном ядро и небольшом ободке цитоплазмы. Кроме этого учитывали н такие показатели как наличие клеток, объединенных в группы, количество единичных клеток, присутствие в суспензии коллеге новых волокон, дебрнса, неразрушенных семенных канальцев. В табл. 1 представлено соотношение различных клеточных типов семенника, полученное нами при механическом и ферментативном методах выделения. Как видно из результатов, приведенных в таблице, после механической обработки мы получаем только 0,3 % СКС, в то время как после ферментативной обработки мы получаем суспензию, содержащую 16% СКС

После. процедуры механической обработки ткани семенника мы получали суррензию, содержащую наряду с отдельными клетками конгломераты н.^газобщенных (слеток, много клеток крови, волокна колЛагена, дебрис и большое количество неразрушенных семенных канальцев. Суспензия клеток была представлена в основном интерстециальными клетками. Культивирование полученной массы клеток .было крайне затруднено. В процессе культивирования из-за набухания коллагеноаых волокон среда становилась вязкой, что затрудняло оседание н прикрепление клеток к подложке. Кроме того, в связи с наличием в суспензии клеток кров» и коллагена затруднялся просмотр клеток.

Таблица 2

Сравнительный акадш клеточной популяции, выделенной т ткани семенника 80-сут. хрячка посредством двух методов.

Типы клеток Доля клеток в %

Механический метод Ферментативный метод

Интерстециальиые клетки: фибробласты . 5 8

Лейдига 25

Клетки Сертоли 18 73

Сперматогоинн 0.3 16

Неразрушенные семенные канальцы 20 -

Клеткн крови 15

Ммоидные клеткн 4 3

Группы неразобщенных клеток 12

Другие клеточные типы 0.7

После ферментативной обработки ткани семенника мы получали

суспензию, состоящую на 100% из разобщенных клеток. В результате удавалось избавиться от клеток крови н коллагеновых волокон, а клеткн Лейдига удалялись с супернатантом 8 процессе осаждения клеток. Полученная суспензия содержала в основном клеткн семенных канальцев и небольшое количество миоидных клеток н фнбробластов. При культивировании полученной суспензии клеток среда оставалась прозрачной, клетки быстро прикреплялись и распластывались на подложке.

Надо отметить, что после ферментативной обработки ткани наблюдался небольшой процент гибели клеток, что мы связывали с токсичным влиянием ферментов (коллагеназа, трипсин). Однако, несмотря на это, ферментативный метод получения культур клеток из семенников свиней имел неоспоримое преимущество перед механическим и использовался нами в дальнейшем. г

3.3.2. Очистка СКСот других клеточных типов семенника хряк».

Таким образом, после ферментативного обработки в суспензии кроме СКС присутствовали другие клеточные типы семенника. Однако для проведения манипуляций с СКС и их трансплантации нам необходимо было

получить максимально чистую популяцию СКС. Дня этого нами был использован иегов очистки, предложенный ранее для примврдиальных половы к клеток мышей (Савченкова И.П. н др. 2000], основанный на разных адгезивных способностях клеток. В результате проведенной серии экспериментов по выделению н культивированию культур клеток, выделенных из семенника свиньи, мы определили, что стволовые клетки сперм атогонии имеют наименьшую, по сравнению с другими клеточными типами семенника, адгезивную способность. Основываясь на этом свойстве СКС, мы производили нх очистку от других клеточных типов семенника. Для этого полученную суспензию клеток разливал» в чашки Петри и помешали в

* ,1

инкубатор для культивирования прн +37*С в увлажненной атмосфере в присутствии 5% СО} на протяжении 2 - 3-х часов. Затем чашки извлекали из инкубатора н не прикрепившиеся метки, представленные в основном СКС, осторожно перекосили в новые чашки Петр* с фидерными слоями для дальнейшего культивирования.

Данный метод позволил избавиться от всех типов клеток семенника, за исключением некоторого количества клеток Серголи н получить популяцию клеток на 70% представленную спермотогоииями типа А.

3*4. Культивирование СКС.

При культивировании СКС нами было изучено несколько параметров: различные ростовые среды, факторы роста, фидерные слон, представленные монослоями БТО-клеток, первичных и перевиваемых клеток Сертояи.

Как наглядно продемонстрировано в табл. 3 наилучшие условия для культивирования СКС наблюдались прн использовании фидерных слоев н среды для ЭСК (среда Игла в модификации Дюльбекко, с высоким содержанием глюко*и-4,5 г/я), дополненной 15% фетальной сыворотки. 2 мМ альфа-глутамина, 0,1 мМ заменимых аминокислот, гентамишшом (50 мкг/мл).

При этом на всех видах фидерных слоев нам удалось поддерживать культуру С КС в недифференцированном виде в течение 7-10 суток, однако, не фидерном слое, представленном клетками 870, были получены колонии СКС, по морфологи» напоминающие колонии эмбриональных стволовых клеток.

ТаблшмЗ

Зависимость длительности культи—ровянив стволовых клеток

епермятогоннй от мюиусмш ростмш факторов (сут.).

Пластик ято Первичные клетки Сертдоя ПТП Фолликулярная жидкость (25%) ■ к основной среде

ДМБМ +104 1! ; 4 признакид . 4 ифферетяро 3 «км ■ ? гибель (дегенерация)

ДМЕМ для ЭСК* 2 7-10 (формирование колоний сЭСК-падобным фенотипом) 7 7 3 гибель »

КвОМ" г 5-6 5-6. 4 3

(*ЩМЕМ с 4,5 г/л глюкозы, Й№ сапороткн плода коров, 0,1 мМ 2. меркаптоэтанала, 2 мМ, Ь-глутамнна, <М иМ »«существенных аминокислот {100»кратный раствор), гентамнции (гомечнва кшшснтраиия 50 мкг/мл)

(**)Ростовая среда для кул&таяиромшия предьшплактадиоиных эмбриОноа. - ■

3-3. СрмвнгмышИ ИПАМХ ММВИ1МЧ1Т» риМЧЯЫ! ТИПОВ клеток к «огюптмю ре*сои6н н а ВПК*ДШС.

- Для трансфекцнн клеток эаеюрмораине* использовали ДНК , рекомбннантной плазм иды, содержащей рспортсрный ген 1ас7. ЕссЛ, экспрессию которого лепсоопредеяиЯкЬведеине экзогенной ДНК в различные т*пы клеток проводили путей электропо рации. Клетки, вырабатыьающие бета-галакгоэидазу - сцмоухт эк£пр«5ссии этого гена, при окрашивании приобретали зеленый ввек. Дню кяеггок, (фодуцирующнх

бета - галактоз идаэу, расчитывали при анализе 1000 клеток. В табл. 4 приведены результаты влияния электропорации на жизнеспособность различных типов клеток н эффективность экспрессии гена 1ос2Е.соИ.

Таблнка 4

Эффективность траисфскним и жизнеспособности различных типов

клеток.

400У. 500мкФ (в среде ДОЕМ)

Тип клеток Количество трансфецированныч клеток (%) Выживаемость ("/«)

8ТО 10 70

ПТП 12 95

Сертоли 3 85

СКС 1.3 45

Сравнительный анализ трансфекцин различных типов клеток показал, что перевиваемые клетки Серголи наиболее устойчивы к воздействию

электрического тока и при этом наиболее компетентны к поглощению

■ й

экзогенной ДНК.

Эффективность трансфекцин стволовых клеток сперматогоний, культивируемых на 5ТО, составила только 1,3 %.

3.6. Обработке животиых-рецнаногтов бусульфаном с целью выключения их собственного сперматогенеза.

Для осуществления трансплантации СКС необходимо было получить стерильных реципиентов. Выключение стволовых клеток семенника у животных-реципиентов проводили путем обработки их бусульфаном, алкирующим 81 _нтом, который действует избирательно и поражает мужские стволовые клетки сперматогонин, обеспечивал тем самым половую стерильность животных. Проведенные нами гистологические исследования показали, ^то оптимальным сроком для обогащенных культур сперчатогонкй типаАлаляются 60-80 сут. после рождения хрячка. Поэтому обработку животных-реципиентов с целью выключения стволовых клеток мы проводили, начиная с 80-ти сут. возраста. В связи с тем, что процесс

сперматогенеза, включающий последовательную дифференцироаку , сперматогоннй в зрелые сперматозоида), происходит в течение 35 сут„ обработка животных-реципиентов длилась 35 суток.

3.6.1. Влияние кратности обработок бусульфаном на дегенерацию стеалоеих клеток снернатогамий типа А.

С целью получения мышей-реципиентов Бринстер и др. (1985г.) применяли однократную обработку бусульфаном. Нами была проведена серия опытов для выбора оптимального количества обработок хрячков бусульфаном, чтобы обеспечить их половую стерильность. Для этого мы осуществили одно-, двух- и трехкратное введение препарата. Однократная обработка яеквотных-рецнпнектов, применяемая Бринстером на мышах, оказалась неэффективной у свиней. Анализ гистологических срезов и культур, выделенных из семенников свиней, показал, что после однократной обработки животных бусульфаном, а. .довые клетки не погибают. После двукратной обработки в образцах фиксированных тканей семенника обнаруживалось некоторое количество стволовых клеток, и только трехкратная обработка с интервалом в 11,5 сут. приводила к полной гибели сперматогенного эпителия. В связи с этим мы модифицировали схему обработки бусульфаном, предложенную зарубежными исследователями, и для подготовки реципиентов в течение 35 сут. проводили трехкратную обработку животных каждые 11,5 сут.

3.6.2. Влияние обработок бусульфаном на физическое состояние животных-реципиентов.

Введение раствора бусульфака хрячкам оказывало негативное влияние на физическое состояние животных-реципиентов. В местах инъекций у животных наблюдались абсцессы, ухудшалось общее самочувствие животных, аппетит. На разных стадиях эксперимента из 8 животных погибло 5, выживаемость составила 38%.

Сравнительный визуальный анализ показал, что семенник обработанного бусульфаном животного, уменьшался в размерах в два-три

раза по сравнению с контролем. При диссоциации ткани семенника было установлено, что ткань семенника экспериментального животного приобретала более темную окраску с багровыми вкраплениями, белковая ободочка становилась плотной, крепко приросшей к ткани семенника и

средостению.

пя

г

*Г Л .т..

■> л /■

v

й- У • • Л

Рис. 4. Поперечный срез семенных канальпев 80-сут. хрячка, обработанного бусульфлном дважды. У в. 400.

Рм. 5. Поперечный срез семенных канальцев 80-сут. хричка, обдмИотактг» бусульфапом трижды. У в. 400. .

Fm. 6. Схема жвцмимп im трмшмпит СКС сшм.

Orfof» реяшмеял» (twMpmtiwMKtpnMt)

-44-

-)5еут.

«influnm— бусуифмом

Iii

-$Осгт.

OltopAMWfOt (• иоворожлмммх ХрЯЧШВ)

cyi.

Кастрация 80-сут. доноров я выделение из ткани осмей, культур клеток i

1 Траисфекция мужских стммових клеток геном tacZ E.coJi 1

■ 1 г '

Введение донорских трамсфецированных клеток в семенники 115 сут реципиентов, обработанных бусульфаном

1 »m. *

| Односторонняя кастрация реципиентов через 29 сут. после трансплантации 1

1 г

Анализ эффективности колонизации семенников реципиентов клетками доноров

| В культуре | Э образцах фиксированной ткани |

Окраска культур с целью выявления клеток, продуцирующих бета-галактоаидаау_. _

Анализ микросателлитных ДНК, выделенных из спермы и уха 10-мес. реципиентов ___

ЭЛ. Введение допорскм СКС тем А хряка а семенники реципиентов.

Для проведения эксперимента по трансплантации стволовых клеток сперматогоннй было сформировано 2 группы новорожденных хрячков (рис. 6). Каждая группа состояла из 8 животных. Животные первой группы являлись реципиентами, в животные второй группы, отобранные через 35, суток после рождения первой-донорами.

В возрасте 80 суток реципиентов подвергали обработке бусульфаном с целью подавления эндогенного сперматогенеза. Через 33 суток после первой обработки бусульфаном, животным-ре«нпнентам, характеризующимся половой стерильностью трансплантировали клетки, выделенные от доноров, достигших к окончанию обработки реципиентов. 80-ти суточного возраста. Перед трансплантацией клетки подвергали трансфекции плвзмидой с геном 1ас2 £со//. *

3.8. Аивлиз эффективности тряксплаитаыин донорских клггок.

Через 29 суток после трансплантации жн вотных-реции иентов односторонне кветрироввти, из ткани семенников готовили гистологические препараты и выделяли культуры клеток, и подвергали тщательному микроскопическому анализу.

На поперечных срезах семенных канальцев мы обнаружили присутствие делящихся клеток и явное наличие поздних стадий сперматогенеза. Однако примерно 30% семенных канальцев остались пустыми. Это объясняется, на наш взгляд, тем, что используемый нами метод введения суспензии ¿^норских клеток в семенники не обеспечивает полною заполнения семенных канальцев.

Анализ состава полученной культуры нз семенников хрячков (возраст животных 144 сут.), также подтвердил возобновление сперматогенеза в семенниках реципиентов. Основную массу клеток составляли сперматогенные клетки на разных стадиях развития (90%), небольшое количество составляли скопления довольно крупных клеток с лнлидными

пузырями, которые при культивировании распластывались и по морфологии были сходны с клетками Сертоли (9%), и также наблюдались единичные зрелые сперматозоиды (14). Таким образом, сперматогенез клеток донора а семенниках реципиента имел нормальные морфологические характеристики н приводил к появлению зрелых сперматозоидов.

•с.'

о

• о »

в

1' <>_ п

.. ,' . 1 V . \ , ]

: . I. ^ I

Рис. 7, Возобновление сперматогенеза у реципиентов через 29 сут, носле трансплантации донорских СКС (стрелками указаны сперматозоиды). Свежевыделеняые культуры клеток. Ув. 400.

Чтобы подтвердить экзогенную природу протекающего в семенниках реципиента сперматогенеза, выделенные из тестикул культуры клеток были окрашены для выявления в клетках бета-галактозидазы, продукта экспрессии гена 1ас2Е.соИ, введенного в донорские клетки.

Некоторые клетки в результате окрашивания приобретали зеленый цве^, что свидетельствовало .о. продуцирований этими клетками бета-галактоз ид азы. Это подтверждало наши предположения, что именно клетки донора возобновляли сперматогенез в семенниках стерильного реципиента,

3.9. Исследование динамики экзогенного сперматогенеза у жн вотн ы х-рецн п не кто в.

'и X ,1 А-Л *

О, ^ 1

^_

Рис. в. Результаты сравнительного аимиц микросателлнтных ДНК, выделенных из уха и спермы 10 »»ее, хряков (1 - ДНК из спермы хряка № 1; 2 -ДНК нз уха хряка № 1; 3 -ДНК нз спермы хряка Х> 2; 4 -ДНК из уха хряка № I)

Р возрасте 9 месяцев, от односторонне кастрированных реципиентов, стало возможным получение спермы. И, хоте дальнейшее наблюдение за судьбой трансплантированных клеток не входило а наши задачи, представляло большой интерес выявить природу протеквкицего в семени»: л' реципиентов сперматогенеза. .

8 результате проведенного анализа микросателлитных ДНК у реципиентов была выявлена полная идентичность ДНК, выделенных нз уха и спермы (результаты анализа представлены на рис. 8). Это доказывает, что к 9 мес. возрасту в семенниках реципиентов, обработанных бусульфаном, полностью восстанавливается эндогенной ■: сперматогенез, вытесняч экзогенный.

25

ВЫВОДЫ

1. Изучена динамика сперматогенеза у 54 местных помесных хрячков:

а) Показано, что после рождения н до 80 суток в семенных канальцах присутствуют только клетки Сертоли н два вида сперматогоний типа Л. Полноценный сперматогенез у местных помесных свиней наступает не ранее 119 суточного возраста.

б) Впервые установлено, что возраст хрячков местной помесной породы в интервале 60-80 сут. является оптимальным для максимального сбора стволовых клеток сперматогоний типа А.

в) Охарактеризованы 2 вида сперматогоний типа А. Первый тип клеток характеризуется темным крупным ядром и небольшим ободком цитоплазмы. Второй тип имеет светлое крупное ядро и болей тонкий оболок цитоплазмы. Размеры обоих типов клеток находятся в пределах 25-30 мкм.

2. Оптимизирована схема трлне плантации стволовых клеток сперматогоний типа А (ранее предложенная для мышей) с учетом морфо-физиологических характеристик свиней:

а) показано, что трехкратная обработка животных-рсиипиентов бусульфаном позволяет разрушить стволовые клетки сперматогонин т ипа А:

б) предложен метод введения стволрвых клеток донора в средостение семенника животных-реципиентов, который обеспечивает равномерное распределение донорских клеток по семенным канальцам.

3. Последовательные механическая, а затем ферментативная обработки ткани семенника (коллагеназа, трипсин) позволяют выделить стволовые клетки сперматогонии типа А, расположенные на базалыюй мембране семенных канальцев. Дальнейшее инкубирование клеточной популяции в ростовой среде в течение 2-3 часов способствует очистке мужских стволовых клеток от других клеточных типов на 70%.

- 4.' Установлено, что основной средой для культивировании стволоиых клеток сперматогоний типа А является среда, не пользуемая ллн

культивирования эмбриональных стволовых клеток (среда Игла в модификации Дюльбекко с 4,5 г/л глюкозы), с добавлением 15% сыворотки плода коров, 2мМ альфа-гяутамина, 0,1 мМ 2-меркаптозтанола, 0,1 мМ заменимых аминокислот н 50 мкг/мл гентамицина.

5.' Наличие Ядерного слоя, представленного перевиваемыми эмбриональным» фнбробластамн мыши (STO-клетки) или клетками Сертоли позволяет поддерживать СКС в недифференцированной форме в течение 7-Юсут. ,

6. Показано, что мужские стволовые клетки донора, трансплантированные в семенники стерильного реципиента, сохраняются в 'семенниках как минимум 29 сут. Более того, они возобновляют сперматогенез в семенных канальцах реципиента и приводят к формированию зрелых сперматозоидов.

7", Установлено, что бусульфан действует как временный контрацептив. В 9-ти месячном возраст» в семенниках реципиентов, обработанных бусульфаном, восстанавливается эндогенный сперматогенез.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Научным учреждениям, занимающимся проблемами создания новых видов животных с измененным геномом, рекомендуем использовать разработанный методический подход по выделению, очистке и трансплантации СКС в качестве принципиально нового, недорогого и перспективного инструмента биотехнологии.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. С.В.Коржнкова, Н.В.Костерева, И.П.Савченкова, В.Н.Шатайло, И.М.Чабан, Л.К.Эрнст. Выделение и характеристика СКС свиньи f/Тезисы докладов П-й Международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». - ВНИИСХБ - Москва. -2000. V С. 46-47.

¿. Костерева Н.В., Коржикова C.B., Савченкова И.П., Шатайло В.Н, Чабая И.М., Эрнст ЛЛС, Изучение динамики сперматогенеза свиней в

образцах фиксированных тканей //Материалы научно-практический конференции по проблеме «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения». • РАМЖ - п. Быково, Московская область.-2001.-С. 166-168.

3. CD.Коржакова, Н.В.Костерева, И.П.Савченкова, В.Н.ШатаГто, И.М.Чабан, Л.К.Эрнст. Культивирование и трансплантация стволовых клеток сперма то гон и П типа А свиней //Тезисы докладов Международной конференции «ДНК-технологни в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных». - ВГНИИЖ • «.Дубровины, Московская область. - 2001. - С. 77-82.

4. I.P.Savclienkova, S.V.Korgikova, N.V.Kostereva, I.M.Tchaban, L.К.Elmst. Culture and transplantation of spermatogonia! stem cells 1П th World Congress on Genetics Applied (o Livestock Production. - Montpellier, France.-2002.-P.836-840.

Зак. # У 47 Ир. 77 ska. 1.0 У.П.Д. ТШ 4ЕГЛ1 ШК) НИИ г.Подольск 1С

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Коржикова, Светлана Васильевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Стволовые клетки сперматогонии у млекопитающих

1.2. Пролиферация и дифференцировка сперматогоний типа А.

1.3. Факторы, стимулирующие пролиферацию и дифференцировку 21 сперматогоний

1.4. Сперматогенез у различных видов млекопитающих

1.5. Выделение стволовых клеток сперматогоний млекопитающих 28 и культивирование in vitro

1.6. Трансплантация СКС

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выделение, характеристика и трансплантация сперматогоний типа А хряка"

Благодаря активному развитию клеточной биологии и клеточной инженерии открыт перспективный путь к созданию животных со стабильной интеграцией и экспрессией рекомбинантной ДНК в геноме (трансгенные животные). Трансгенные животные могут использоваться как модели для изучения болезней человека и животных, в генной терапии, для улучшения физиологических свойств и продуктивности домашних животных (животные, обладающие общей генетической устойчивостью к различным заболеваниям и неблагоприятным факторам внешней среды, информационным иммунитетом к возбудителям основных эпизоотий, стресс-устойчивостью и т.д.), а также в качестве источников необходимых человеку фармакологических (эритропоэтин, интерферон, инсулин, альбумин, факторы свертывания крови и др.) и технических (химозин и др.) белков [1,2,6,29].

В настоящее время разработаны новые современные подходы получения трансгенных животных. Широко применяются такие методические приемы как: микроинъекция рекомбинантной ДНК в пронуклеус, использование трансгенной спермы в качестве вектора, получение зародышевых химер с помощью эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), ретровирусная трансфекция эмбрионов [3,17,25,27,30,130]. Перенос генов в геном животных возможен на различных стадиях эмбрионального и постнатального развития организма [10,11].

Особенную актуальность в этом направлении приобретают методы клеточной инженерии, позволяющие получать культуры стволовых клеток. [147,155]. Стволовыми клетками принято считать клетки, способные самообновляться, т.е. неограниченно делиться на протяжении длительного времени, по крайней мере, в течение жизни организма. Из каждой стволовой клетки при делении образуются две дочерние, одна из которых способна самообновляться, а другая обладает определенной потенцией к дифференцировке. Стволовые клетки, дающие начало одному виду дифференцированных клеток называют унипотентными, двум -бипотентными, нескольким видам в пределах одного тканевого вида (например, клеткам крови) - полипотентными. Стволовые клетки, обладающие неограниченными потенциями к цитодифференцировке, способные реализовать генетическую информацию ядер клеток, обеспечивая их дифференцировку, а также развитие до целого организма называют тотипотентными [27].

Единственным источником потенциально тотипотентных диплоидных клеток во взрослом организме млекопитающих являются стволовые клетки сперматогонии (СКС). Уникальное свойство стволовых клеток сперматогоний многократно самообновляться открывает широкие возможности реализации потенциала этих клеток в создании новых видов животных с измененным геномом. У половозрелых самцов популяция диплоидных стволовых клеток сперматогоний постоянно обновляется и производит потомство клеток, которое инициирует комплексный процесс дифференцировки, приводящий к появлению высоко специализированных половых клеток - сперматозоидов. Теоретически одна сперматогониальная стволовая клетка способна сформировать 4096 сперматид [48]. После оплодотворения, дополненные женскими гомологами, сперматозоиды участвуют в эмбриогенезе, и в итоге, в дифференцировке каждой клетки организма. В этом случае стволовые клетки сперматогонии могут считаться тотипотентными. И хотя женские ооциты, имеющиеся у половозрелых особей, и принимают генетическое участие в создании потомства, они не являются самообновляющимися - при рождении их имеется конечное количество, которое постоянно уменьшается в течение жизни самки. Поэтому стволовые клетки сперматогонии, по существу, являются единственным самообновляющимся типом клеток у половозрелого животного, способным обеспечить генетический вклад в получение следующего поколения [47].

В настоящее время ряд ученых из ведущих научно-исследовательских институтов мира занимаются изучением различных аспектов, связанных с выделением, культивированием, генетической трансформацией, трансплантацией стволовых клеток сперматогоний млекопитающих, в том числе сельскохозяйственных животных и человека [48,50,64,133]. Актуальность этих исследований заключается в том, что наряду с теоретическими изысканиями поднимаются такие важные практические задачи, как лечение бесплодия (например, после курсов химио- и радиотерапии при лечении рака), регулирование рождаемости у людей, получение животных с улучшенными полезно-хозяйственными признаками и др. [133,21,22].

Пролиферация и дифференцировка сперматогоний являются комплексным процессом, который включает в себя многие регуляторные факторы и межклеточные взаимодействия, что создает большие трудности в изучении этих сложных процессов in vivo. В связи с этим выделение СКС из тестикул млекопитающих, манипуляции с ними in vitro и пересадка их в семенники реципиента открывают новые возможности в изучении сперматогенеза и проведении геномных манипуляций у млекопитающих, и представляют собой одно из перспективных направлений в клеточной биологии.

Ядра стволовых клеток являются ценным материалом для конструирования новых клеточных типов в процессе клонирования. Исследования по клонированию животных путем пересадки ядер развиваются очень интенсивно. Показана возможность клонирования крупного рогатого скота, овец и кроликов путем трансплантации ядер бластомеров в энуклеированные ооциты [14]. При этом исходным материалом служили 4-64-х клеточные эмбрионы. В настоящее время ведутся успешные попытки использования ППЗК в качестве доноров ядер. Так, в США в 1997 году впервые удалось получить клонированного теленка по кличке «Ген» [148]. Исходным материалом для клонирования послужили ядра ППЗК крупного рогатого скота, полученные из закладок гонад плода теленка в возрасте 30 суток.

Сперматогенные клетки - сперматогонии типа А вполне могут служить источником ядер для реконструирования зигот с целью получения животных с заведомо известными признаками. Первой попыткой использования сперматогоний в качестве источника ядер для трансплантации в энуклеированную клетку, с целью определения их потенций, являются исследования, проведенные на лягушках [39]. На человеческих яйцеклетках показано развитие до стадии морулы после 72 часов культивирования реконструированных клеток, полученных путем трансплантации сперматогоний в энуклеированные созревшие ооциты на стадии метафазы II [160]. Актуальность исследований в данном направлении очевидна, т.к. уникальное свойство СКС - потенциальная тотипотентность дает возможность клонирования самцов млекопитающих с помощью трансплантации ядер сперматогоний, полученных из тестикул [143,142].

Очень перспективный подход для получения трансгенных животных посредством использования мужских стволовых клеток был предложен Бринстером и Авербаком [48]. Они разработали технику, с помощью которой возможна трансплантация клеток, выделенных из семенника донора, в мышиные семенные канальцы стерильных самцов реципиентов. В результате проведенных этими авторами исследований, была показана способность трансплантантов возобновлять нормальный сперматогенез у мышей и крыс.

В данном направлении рядом ученых из разных лабораторий ведутся активные исследования. В основном при изучении СКС используются лабораторные животные - мыши и крысы [133,47,93], однако в последнее время появились публикации, в которых объектами изучения являются СКС сельскохозяйственных животных [90,85].

Стволовые зародышевые клетки млекопитающих могут использоваться в качестве вектора для переноса рекомбинантной ДНК в организм животных. Модификации стволовых клеток сперматогоний до пересадки должны повлиять на развитие яиц, оплодотворенных сперматозоидами, полученными из трансформированных стволовых клеток. Возможность введения в стволовые клетки экзогенной ДНК имеет значение для широкого ряда экспериментальных работ, например для развития генной терапии и трансгенезиса [27].

Таким образом, в контексте выше изложенного, и в связи с тем, что данных по изучению СКС крупных сельскохозяйственных животных, в том числе свиней, недостаточно, направление исследований по изучению СКС свиньи является перспективным и актуальным для развития сельскохозяйственной биотехнологии.

Цель и задачи исследований. Целью работы являлось выделение, характеристика и трансплантация стволовых клеток сперматогоний типа А хряков. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

• изучить динамику сперматогенеза у местных помесных хряков в образцах фиксированных тканей;

• оптимизировать существующие методические приемы, позволяющие изолировать СКС типа А из семенников хряка;

• подобрать оптимальные условия, влияющие на поддержание СКС в недифференцированной форме при краткосрочном культивировании и охарактеризовать СКС в культуре;

• оптимизировать схему трансплантации СКС свиней в семенники стерильных реципиентов;

• изучить возможность колонизации клетками донора семенных канальцев стерильного реципиента и возобновления в них сперматогенеза.

Научная новизна. Впервые изучена динамика сперматогенеза у местных помесных свиней и установлен возраст хрячков, при котором сбор СКС типа А является максимальным.

Разработан эффективный и недорогой метод выделения стволовых клеток сперматогоний из семенников местных помесных хряков и предпринята попытка создания оптимальных условий для их культивирования. Изучена роль и проведен сравнительный анализ использования различных монослоев и ростовых факторов для поддержания СКС в культуре в недифференцированном виде.

Впервые, с учетом морфо-физиологических характеристик свиней, модифицирована и оптимизирована схема трансплантации донорских клеток в семенники стерильных реципиентов, предложенная ранее для мышей, и разработан метод обработки животных бусульфаном с целью выключения эндогенного сперматогенеза.

Показано на свиньях, что СКС донора возобновляют в семенных канальцах реципиента полноценный сперматогенез с выработкой зрелых сперматозоидов.

Практическая ценность работы. Полученные экспериментальные данные по выделению очищенной популяции СКС типа А свиньи, проведении с ними манипуляций in vitro и пересадке их в семенники реципиента представляют практическую ценность в связи с эффективностью и низкой стоимостью разработанных методических приемов, что позволит в будущем использовать стволовые клетки сперматогонии типа А, обладающие уникальным свойством -самообновлением в течение всей жизни животного, в качестве вектора для переноса рекомбинантной ДНК в геном реципиентов с целью получения животных с заведомо известными признаками.

Основные положения, выносимые на защиту: -влияние возраста хряков на получение обогащенной культуры СКС типа А;

-метод выделения и очистки стволовых клеток сперматогоний типа А свиньи;

-характеристика стволовых клеток сперматогоний типа А свиньи; -влияние ростовых факторов и монослоев фидерных клеток на поддержание СКС свиньи в культуре;

-схема обработки самцов свиней бусульфаном с целью подавления эндогенного сперматогенеза;

-потенции СКС свиней возобновлять сперматогенез в семенных канальцах хряков, характеризующихся половой стерильностью, после трансплантации в них донорских клеток.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены: на 2-ой Международной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», ВНИИСХБ, г.Москва, октябрь 2000г; на международной конференции «ДНК-технологии в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных», ВНИИЖ, п.Дубровицы, ноябрь 2001 г; на научно-практической конференции, п.Быково, июль 2001; на 7-ом мировом конгрессе генетиков

14

7 th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production), Montpellier, France, 2002.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 4 научные работы.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 119 стр., содержит 5 табл., 29 рис. (в т.ч. 23 фотографии, 2диаграммы), состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты, обсуждение, выводы, список литературы. Список литературы включает 162 литературных источников, в т.ч. 129 на иностранном языке.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Коржикова, Светлана Васильевна

5. ВЫВОДЫ.

1. Изучена динамика сперматогенеза у 54 местных помесных хрячков: а) Показано, что после рождения и до 80 сут. в семенных канальцах присутствуют только клетки Сертоли и два вида сперматогоний типа А. Полноценный сперматогенез у местных помесных свиней наступает не ранее 119 суточного возраста. б) Впервые установлено, что возраст местных помесных хрячков в интервале 60-80 сут. является оптимальным для максимального сбора стволовых клеток сперматогоний типа А. в) Охарактеризованы 2 вида сперматогоний типа А. Первый тип клеток характеризуется темным крупным ядром и небольшим ободком цитоплазмы. Второй тип имеет светлое крупное ядро и более тонкий ободок цитоплазмы. Размеры обоих типов клеток находятся в пределах 2530 мкм.

2. Оптимизирована схема трансплантации стволовых клеток сперматогоний типа А (ранее предложенная для мышей) с учетом морфо-физиологических характеристик свиней: а) показано, что трехкратная обработка животных-реципиентов бусульфаном позволяет разрушить стволовые клетки сперматогонии типа А; б) предложен метод введения стволовых клеток донора в средостение семенника животных-реципиентов, который обеспечивает равномерное распределение донорских клеток по семенным канальцам.

3. Последовательные механическая, а затем ферментативная обработки ткани семенника (коллагеназа, трипсин) позволяют выделить стволовые клетки сперматогонии типа А, расположенные на базальной мембране семенных канальцев. Дальнейшее инкубирование клеточной популяции в ростовой среде в течение 2-3 часов способствует очистке мужских стволовых клеток от других клеточных типов на 70%.

102

4. Установлено, что основной средой для культивирования стволовых клеток сперматогоний типа А является среда, используемая для культивирования эмбриональных стволовых клеток (среда Игла в модификации Дюльбекко с 4,5 г/л глюкозы), с добавлением 15% сыворотки плода коров, 2мМ альфа-глутамина, 0,1 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,1 мМ заменимых аминокислот и 50 мкг/мл гентамицина.

5. Наличие фидерного слоя, представленного перевиваемыми эмбриональными фибробластами мыши (STO-клетки) или клетками Сертоли позволяет поддерживать СКС в недифференцированной форме в течение 7-10 сут.

6. Показано, что мужские стволовые клетки донора, трансплантированные в семенники стерильного реципиента, сохраняются в семенниках как минимум 29 сут. Более того, они возобновляют сперматогенез в семенных канальцах реципиента и приводят к формированию зрелых сперматозоидов.

7. Установлено, что бусульфан действует как временный контрацептив. В 9-ти месячном возрасте в семенниках реципиентов, обработанных бусульфаном, восстанавливается эндогенный сперматогенез.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Коржикова, Светлана Васильевна, Дубровицы

1. Биотехнология клеток животных: в 2-х т. /Под ред. Спиера Р.Е., Гриффитса Дж.Б. М.: Агропромиздат. - 1989. - 480,503с.

2. Брем Г., Зиновьева Н.А., Эрнст J1.K. «Генные фермы» новый путь производства биологически активных протеинов трансгенными животными. //Сельскохозяйственная биология. - 1993. - №6. - С.3-27.

3. Газарян К.Г. Микроинъекция генов в зиготы и эмбрионы. //Успехи современной генетики. 1985. - Т. 13. - С.75-88.

4. Гилберт С. Биология развития: в 3-х т. М.: Мир. - 1995.

5. Глебов O.K. Генетическая трансформация соматических клеток. Л.: «Наука». 1989. - 350с.

6. Гоголевский П.А. Совершенствование биотехнологических приемов получения трансгенных сельскохозяйственных животных. Автореф дис.канд. биол. наук. М. - 1992. - 20с.

7. Данилова J1.B. Сперматогонии, сперматоциты, сперматиды //В кн.: Современные проблемы сперматогенеза. /М: Наука. 1982. - С.25-72.

8. Данилова JI.B. Ультраструктурное исследование сперматогенеза. М: Наука. - 1978.

9. Дыбан А.П. Раннее развитие млекопитающих. Л.:Наука, Лен. Отд. -1988.-228 с.

10. Дыбан А.П., Городецкий С.И. Генетическая трансформация млекопитающих // Молекулярные механизмы генетических процессов. -М. 1985. -С.84-93.

11. Дыбан А.П., Городецкий С.И. Молекулярные и клеточные аспекты биотехнологии. Л.: Наука. - 1985. - С.84-93.

12. Епифанова О.И., Терских В.В., Полуновский В.А. Покоящиеся клетки. М.: Наука. - 1983. - 180с.

13. Милованов В.К. Достижения современной биологической науки в области размножения с.-х. животных. М: Правда. - 1950. - 31с.

14. Миталипова М.М. Факторы, влияющие на развитие эмбриональных стволовых клеток крупного рогатого скота и мыши в системе in vitro и in vivo. Дис.канд. биол. наук. - М., 1994. - 114с.

15. Пахотин М.В. Справочник по ветеринарной хирургии. М: Колос. -1977.-255с.

16. Пирс Э. Гистохимия. Москва. - 1962. - 963с.

17. Полежаева И.А. Получение, генетическая трансформация и использование эмбриональных стволовых клеточных линий. -Автореф. дис.канд. биол. наук. М., 1993. - 25с.

18. Приданцева Т.А. Выделение и характеристика примордиальныхзародышевых клеток свиньи. Дис.канд. биол. наук. - Дубровицы,2001. 110с.

19. Райцина С.С. Сперматогенез и структурные основы его регуляции. -М.: Наука. 1985. -207с.

20. Райцина С.С. Цикл сперматогенного эпителия и кинетика сперматогенеза у млекопитающих //Успехи современной биологии. -1967. Т.63. - С.135-153.

21. Репин B.C., Сухих Г.Т. Медицинская клеточная биология. М.: БЭБиМ. - 1998.-200с.

22. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М.: Мир. - 2000. -592с.

23. Ромейс Б. Микроскопическая техника. Москва. - 1953. - 718с.

24. Роскин Г.И. Микроскопическая техника. Москва. - 1946. - 328с.

25. Савченкова И., Фляйшманн М., Булла И, Брем Г. Использование эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) мыши для получения химерных животных //Цитология. 1996. - №38. - С.1118-1123.

26. Савченкова И.П. Введение гена lacZ E.coli в эмбриональные стволовые клетки мыши D3 электропорацией //Докл. РАСХН. 1996. -№ 6. - С.36-37.

27. Савченкова И.П. Эмбриональные стволовые клетки в биологии: настоящее и будущее. Дубровицы. - 1999. - 95с.

28. Савченкова И.П., Приданцева Т.А., Сергеев Н.И., Эрнст Л .К. Выделение и очистка примордиальных половых клеток зародышей мышей //С.-х. биология. 2000. - №2. - С. 119-121.

29. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды. М.: Мир. - 1987. -412с.

30. Серов O.JI. Перенос генов в соматические и половые клетки. -Новосибирск. 1985. - 120с.

31. Соколовская И.И. Биология воспроизведения с.-х. животных. М: Знание. - 1969. - 56с.

32. Филатов Ф.П., Тугизов Ш.М., Савченкова И.П. и др. Рекомбинантный поверхностный белок вируса гепатита В, экспонирующийиммунодоминанту мембранного белка вируса ВИЧ1 //ДАН. 1992. -Т.327(1). - С.172-175.

33. Amann R.P. A critical review of methods for evaluation of spermatogenesis from seminal characteristics //J. Androl. 1981. - V.2. - P.37-58.

34. Amann R.P. Detection of alterations in testicular and epididymal function in laboratory animals //Environ. Health Perspect. 1986. - V.70. - P. 149158.

35. Amann R.P. Sperm production rates //In: Johnson A.D., Gomes W.R., VanDemark N.L. (Eds.). The Testis. Academic Press, New York. 1970. -V.l. -P.433-482.

36. Behr J.P. Cene transfer with synthetic cationic amphiphiles: Prospects for gene therapy //Bioconjugate Chemistry. 1994. - V.5. - P.382-389.

37. Bellve A.R., Cavicchia J.C., Millette C.F., 0"Brien D.H., Bhatnagar Y.M., Dym M. Spermatogenic cells of the prepubertal mouse. Isolation and Morphological characterization //J. Cell boil. 1977. - V.74. - P.68-85.

38. Berardino M., Hoffner M. Development and chromosomal constitution of nuclear transplants derived from male germ cells //J.of Exper. Zoology. -1976. V.176(1). - P.61-72.

39. Berndtson W.E., Desjardins C. The cycle of the seminiferous epithelium and spermatogenesis in the bovine testis //Am. J. Anat. 1974. - V.140. -P.167-180.

40. Besmer P., Snyder H.W., Murphy J.E., Hardy W.D., Parodi A. The Perodi-Irgens feline sarcoma virus have homologous oncogenes, but in different contents of the viral genome //J. Virol. 1983. - V.46. - P.606-613.

41. Bonnerot C. et all. Methods in Enzymology. 1993. - V.225. - P.451.

42. Bouffard G.Injection des couleurs de benzidine aux animaux normaux //Ann. Inst. Pasteur. 1906. - V.20. - P.539-552.

43. Brinster R.L. & Avarbock M.R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - V.91. - P.11303-11307.

44. Brinster R.L. and Zimmerman W. Spermatogenesis following male germ-cell transplantation //Developmental biology. 1994. - V.91. - P.l 129811302.

45. Brinster R.L. et all. 1995.

46. Brinster, R.L., Palmiter, R.D. Harvey Lect. 1986. - V.80. - P. 1-38.

47. Bucci L.R. & Meistrich M.L. Mutat. Res. 1987. - V.176. - P.259-268.

48. Capecchi M.R. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells //Cell. 1980. - V.22(27). - P.9139-9143.

49. Capecchi, R.L. Science. 1989. - V.244. - P. 1288-1292.

50. Chabot В., Stephenson D.A., Chapman V.M., Besmer P., Bernstein A. The protooncogene c-kit encoding a transmembrane tyrosine kinase receptor maps to the mouse W locus //Nature. 1988. - V.335. - P.88-89.

51. Chen С., Okayama H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA //Mol. and Cell. Biol. 1987. - V.8(8). - P2745-2752.

52. Clermont Y. Kinetics of spermatogenesis in mammals: Seminiferous epithelium cycle and spermatogonial renewal //Physiol. Rev. 1972. - V.52. - P.198-236.

53. Clermont Y. The cycle of the seminiferous epithelium in man //Am. J. Anat. 1963. - V.112. -P.35-51.

54. Clermont Y. Two classes of spermatogonial stem cells in thr monkey (Cercopithecus aethiops) //Am. J. Anat. 1969. - V.126. - P.57-72.

55. Clermont Y., Bustos-Obregon E. Re-examination of spermatogonial reneval in the rat by means of seminiferous tubules mounted "in toto'" //Amer. J. Anat. 1968. - V.122. - P.237-248.

56. Clermont Y., Hermo L. Spermatogonial stem cells and their behavior in the seminiferous epithelium of rats and monkeys //In: Stem cells of renewing cell populanions. /Cambridge: Acad. Press. 1976. - P.273-287.

57. Clouthier D.E., Avarbock M.R., Maika S.D., Hammer R.L. Rat spermatogenesis in mouse testis //Nature. 1996. - V.381. - P.418-421.

58. Courot M., Hochereau-de Reviers M.T., Ortavant R. Spermatogenesis //In:The testis (N.Y.). /Acad. Press. 1970. - V.l. - P.339-435.

59. De Rooji D.G., Grootegoed J.A. Spermatogonial stem cells //Curr. Opin. Cell Biol. 1998. - V.10. - P.694-701.

60. Dirami G., Ravindranath N., Pursel V., Dym M. Effects of ctem cell factor and granulocyte macrophage-colony stimulating factor on survival of porcine type A spermatogonia cultured in KSOM //Biol. Reprod. 1999. -V.61. -P.225-230.

61. Dirk G. de Rooij. Proliferation and differentiation of spermatogonial stem cells //Reproduction. 2001. - V. 121. - P.347-354.

62. Dobrinski I., Avarbock M.R., Brinster R.L. Germ cell transplantation from large domestic animals into mouse testes //Molecular Reproduction and Development. 2000. - V.57(3). - P.270-279.

63. Dobrinski I., Avarbock M.R., Brinster R.L. Transplantation of germ cells from rabbits and dogs into mouse testes //Biol. Reprod. 1999. - V.61. -P.1331-1339.

64. Dolci S., Pesce M., Felici M. de. Combined action of stem cell factor, leukemia inhibitory factor and cAMP on in vitro proliferation of mouse primordial germ cells //Mol. Reprod. Dev. 1993. - V.35 - P. - 134-139.

65. Dym M., Clermont Y. Effects of x-rays on type A spermatogonia in the rat //Anat. Rec. 1967. - V.157 - P.238. Abstr.

66. Dym M., Clermont Y. Role of the spermatogonia in the repair of the seminiferous epithelium following X-irradiation of the rat testis //Amer. J. Anat. 1970. - V.128. - P.265-282.

67. Dym M., Jia M.-C., Dirami G., Price J.M. Expression of c-lcit receptor and its autophosphorylation in immature rat type A spermatogonia //Biology of reproduction. 1995 - V.52. - P.8-19.

68. Dym.M., Fawcett D. Further observations on the numbers of spermatogonia, spermatocytes and spermatids connected by intercellular bridges in the mammalian testis //Biol. Reprod. 1971. - V.4. - P. 195-215.

69. Eagle H., Piez К.A. J. Exp. Med. 1962. - V.l 16. - P.29.

70. Ewing L.L., Davis J.C., Zirkin B.R. Int. Rev. Physiol. 1980. - V.22. -P.41-115.

71. Fawcett D.W. Intercellular bridges //Exp. Cell. Rec. Suppl. 1961. - V.l. -P. 174-181.

72. Fechheimer M., Boylan J.F., Parker S. Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. - V.84. - P.8463-8467.

73. Forster W., Neumann E. Gene transfer by electroporation //In: Electroporation and electrofusion in cell biology. /Press. New York and London. 1989. -P.299-318.

74. Gerssler E.N., Ryan M.A., Housman D.E. The dominant-White Spoting (W) locus of the mouse encodes the c-kit protooncogene //Cell. 1988. -V.55. - P.185-192.

75. Godin I., Deed R., Cooke J. et al. Effects of the steel gene product on mouse primordial germ cells in culture //Nature. 1991. - V.352. - P.807-809.

76. Goldmann E.E. Die aussere and innere Sekretion des gesungen und kranken Organismus in Lichte der "vitalen Farbung" //Beitr. Klin. Chirurg. 1909. -B.64. - S. 192-265.

77. Hannah-Alava A. Premeiotice studies of spermatogenesis //Adv. Genet. -1965. P.157-226.

78. Higashi Т., Sasai H., Suzuki F. Hamster cell line suitable for transfection assay of transforming genes //Proc. Natl. Sci. 1990. - V.87. - P.2409-2413.

79. Hochreau R. M.-T. de., Lincoln G.A. Seasonal variation in the red deer, Cervus elaphus //J. Reprod. Fertil. 1978. - V.54. - P.209-213.

80. Honaramooz A., Megee S., Dobrinski I. Germ cells transplantation in pigs. -2001.

81. Huckins C. Cell cycle properies of differentiating spermatogonia in adult Spraque-Dawley rats //Cell and Tissue Kinet. 1971. - V.4. - P. 139-154.

82. Huckins C. The spermatogonial stem cell population in adult rats. I. Their morphology, proliferation and maturation //Anat. Rec. 1971. - V.169. -P.533-558.

83. Huckins C., Oakberg E.T. Morphological and quantitative analysis of spermatogonia in mouse testis using whole mounted seminiferous tubules //In:The irradiated testis. /Anat. Rec. 1978. - V.192. - P.529-542.

84. Hyttinen J.-M., Peura Т., Tolvanen M., Aalto J.,Alhonen L., Sinervirta R.,Halmekyto M. Bio/Technology. 1994. - V.12. - P.606-608.

85. Izadyar F., Creemers L.B., Ouden K., Rooij D.G. Culture and transplantation of bovine spermatogonial stem cells. VII Inter. Congress of Andrology, Monreal, Canada. - 2001. - 15-19 June.

86. Izadyar F., van Dissel-Emiliani F., van Pelt A., de Rooij D.G. Spermatogonial stem cell transplantation //Molecular and Cellular Endocrinology. 2000. - V.169. - P.21-26.

87. Jaenisch, R. Science. 1988. - V.240. - P. 1468-1474.

88. Jiang F.X. Behaviour of spermatogonia following recovery from busulfan treatment in the rat. //Anat. Embryol. (Berl.). 1998. - V. 198(1). - P.53-61.

89. Johnson L. Review article: spermatogenesis and aging in the human //J.Androl. 1986. - V.7. - P.331-354.

90. Johnson L. Spermatogenesis //In: Cups P.T. (Ed.). Reproduction in Domestic Animals /4th edn. Academic Press (New York). 1991. - P. 173219.

91. Johnson L., Lebovitz R.M., Samson W.K. Germ cell degeneration in normal and microwave-irradiated rats: potential sperm production rates at different developmental steps in spermatogenesis //Anat. Rec. 1984. -V.209. - P.501-507.

92. Johnson L., Petty C.S., Neaves W.B. A new approach to quantification of spermatogenesis and its application to germinal cell attrition during human spermiogenesis //Biol. Reprod. 1981. - V.25. - P.217-226.

93. Johnson L., Petty C.S., Porter J.C., Neaves W.B. Germ cell degeneration during postprophase of meiosis and serum concentrations of gonadotropins in young adult and older adult men //Biol. Reprod. 1984. - V.31. - P.779-784.

94. Johnson L., Varner D.D., Roberts M.E., Smith T.L., Keillor G.E., Scrutchfield W.L. Efficiency of spermatogenesis: a comparative approach //Anim. Reprod. Sci. 2000. - V.60-61. - P.471-480.

95. Johnson L., Wilker C.E., Cerelli J.S. Spermatogenesis in the bull //Tech. Conf. Artif. Insem. Reprod. 1994. - V.15. - P.9-27.

96. Kennelly J.J., Foote R.H. Sampling boar testes to study spermatogenesis quantitatively and to predict sperm production //J.Anim. Sci. 1964. - V.23. - P.160167.

97. Keulen C.J.G., Rooij M.F. de. The recovery from various gradations of cell loss in the mouse seminiferous epithelium and its implications for thespermatogonia! cell renewal theory //Cell and tissue kinet. 1974. - V.7. -P.549-558.

98. Kietsvenbaum A. Mammalian spermatogenesis in vivo and somatic cell lineages //Endocr. Rev. 1994. - V. 15. - P. 116-134.

99. Klein T.M., Wolf E.D., Wu R. High velocity microprojectiles for delivering nuclei acids into living cells //Nature. 1987. - Y.327. - P.70-73.

100. Leblond C.P.,Clermont Y. Definition of the stages of the cycle of the seminiferous epithelium in the rat //Ann. Y. Acad. Sci. 1952. - V.52. -P.548-573.

101. Mansour S.J., Matten W.T., Hermann A.S. Transformation of mammalian cells by constituvely active MAP kinase //Science. 1994. - V.265. - P.966-970.

102. Marret C., Durand P. Culture of porcine spermatogonia: effects of purification of the germ cells, extracellular matrix and fetal calf serum on their survival and multiplication //Reprod. Nutr. Dev. 2000. - V.40(3). -P.305-319.

103. Morena A.R., Boitani C., Pesce M., Felici M. de, Stefanini M. Isolation of highly purified type A spermatogonia from prepubertal rat testis //J. Androl. 1996. - V.17. -P.708-717.

104. Morgan J.M., Morton H.J., Parker R.C. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. - 1950. -N.73.

105. Nagano M., Avarbock M.R., Leonida E.B., Brinster C.I., Brinster R.L. Culture of mouse spermatogonial stem cells //Tissue Cell. 1998, - V.30. -P.389-397.

106. Nagano M., McCarrey J.R., Brinster R.L. Primate spermatogonial stem cells colonize mouse testes//Biol, of Reprod. -2001. V.64. - P.1409-1416.

107. Oakberg E.F. Spermatogonial stem cell reneval in the mouse //Anat. Rec. -1971. V.169. - P.515-532.

108. Oakberg E.F., Huckins C. Spermatogonial stem cell renewal in the mouse as revealed by H3-thymidine labeling and irradiation //In: Stem cells of renewing cell populations. Ed. A.B. Cairnie et all. N.Y.etc. /Acad. Press. -1976. -P.287-302.

109. Ogawa Т., Arechaga J.M., Avarbock M.R., Brinster R.L. Transplantation of testis germinal cells into mouse seminiferous tubules //Int. J. Dev. Biol. -1997. -V.41(l).-P.l 11-122.

110. Pari G.A. Uber die verwandbarkeit vitaler Karmineinspritzungen fur die pathologische Anatomie //Frankfurt. Ztschr Pathol. 1910. - B.4. - S.l-20.

111. Pelt A.M.M. van., Morena A.R., Lissel-Emiliani F.M.F. van., Boitani t\, Gaemers I.C., Rooij D.G. de, Stefanini M. Isolation of the synchronized A spermatogonia from adult vitamin A-deficient rat testes //Biol. Reprod. -1996. V.55. -P.439-444.

112. Potter H. Molecular genetic applications of electroporation //In: Electroporation & electrofusion in cell biology /Press. New York & London. 1989. -P.331-341.

113. Pursel, V.G., Pinkert, C.A., Miller, K.F., Bolt, D.J.,Campbell, R.G., Palmiter, R.D., Brinster, R.L., Hammer, R.E. Science. 1989. - V.244. -P.1281-1288.

114. Rassoulzadegan M., Binetruy В., Gusin F. High frequency of gene transfer after fusion between bacteria and eukaryotic cells //Nature. 1982. - V.295.- P.257-259.

115. Reis M.M.,Tsai M.C., Schlegel P.N., Feliciano M., Raffaelo R., Rosenwaks Z., Palermo D. Xenogeneic transplantation of human spermatogonia //Zygote. 2000. - V.8. - P.97-105.

116. Ribbert M. Die Abschidung intravenous injizierten gelosten Karmins in den Geweben //Ztschr. Allgem Physiol. 1904. - B.4. - S.201-214.

117. Robertson E.J. Using embryonic stem cell to introduce mutations into the mouse germ line //Biol. Reprod. 1991. - V.44. - P.238-245.

118. Romrell I. et al. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. Morphological characterization //Developmental Biology. 1976.- V.49(l).-P.119-131.

119. Rooij D.G. de, Grootegoed J.A. Spermatogonial stem cells //Curr. Opin. Cell Biol. 1998. - V.l0. - P.694-701.

120. Rooij D.G. de. Transplantation of spermatogonial stem cells. 2002.

121. Roosen-Runge E.C. The Process of spermatogenesis in Animals //Cembridge Univ. Press. 1977.

122. Rose J.K., Buonocore L. and Whitt M.A. A new cationic liposome reagent mediating nearly quantitative transfection of animal cells //Biotechniques. -1991. V.10. -P.520-525.

123. Rossi P., Dolci S., Albanesi C., Ricca R., Geremia R. Follicle-stimulating hormone induction of steel factor (SLF) mRNA in mouse Sertoli cells andstimulation of DNA synthesis in spermatogonia by soluble SLF //Dev. Biol. 1993. - V.155. -P.68-74.

124. Rossi P., Marziali G., Albanesi C., Charlesworth A., Geremia R., Sorrentino V. A novel c-kit transcript, potentially encoding a truncated receptor, originates within a kit gene intron in mouse spermatids //Dev. Biol. 1992. - V.152. - P.203-207.

125. Russel L.D., Ettlin R.A., Hikim A.P., Clegg E.D. Histological and Histopathological Evoluation of the Testis //Cache River Press, Gearwater, FL. 1990.-P. 1-40.

126. Russell L.D., Franca L.R., Brinster R.L. Ultrastructural observations of spermatogenesis in mice resulting from transplantation of mouse spermatogonia//J. Androl. 1996. - V.17(6). - P.603-614.

127. Ruysschaert J.-M., Ouahabi A., Willeaume V. A novel cationic amphiphile for transfection of mammalian cells //Biochem. and Bioph. Res. Comm. -1994. V.203(3). - P.1622-1628.

128. Savchenkova I.P., Korgikova S.V., Kostereva N.V., Tchaban I.M., Ernst L.K. Culture and transplantation of spermatogonial stem cells 111 th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. Montpellier, France. -2002. -P.836-840.

129. Seidel G. Embryo transfer: the next 100 years //Theriogenology. 1991. -V.35(l). - P.171-180.

130. Seidel G. Production of genetically identical sets of mammals: Cloning //J.Exp. Zool. 1983. - V.2. - P.228.

131. Smithies, O. Trends Genet. 1993. - V.9. - P. 112-116.

132. Soprano K.J. Use of cloned SV40 DNA fragments to study signals for cell proliferation //In: Recombinant DNA and Cell Proliferation. 1984. - P.4-6.

133. Sorokin L.M., Morgan E.H., Yeoh G.C. et al. A method for infection of cultured myogenic cells with Rous sarcoma virus using polybrene //In vitro Cellular. Devel. Biol. 1989. - V.25(l). - P.63-68.

134. Stewart C.L. Stem cells from primordial germ cells can reenter the germ line //Dev. Biol. 1994. - V.161. - P.626-628.

135. Strelchenko N.S. Die Osnabrucker Schwarzbuntzucht. 1997. - V.3. - P.42.

136. Swierstra E.E., Gebauer M.R., Pickett B.W. Reproductive physiology of the stallion: I. Spermatogenesis and testis composition //J. Reprod. Fertil. -1974. -V.40. -P.l 13-123.

137. Tajima Y., Onoue H., Nishimune Y. Biologically active kit ligand growth factor by mouse Sertoli cells and is defective in Sli mutant mice //Development. 1991. - V.l 13. - P. 1031-1035.

138. Takai T. and Ohmori H. DNA transfection of mouse lymphoid cells by the combination of DEAE-dextran-mediated DNA uptake and osmotic shock procedure //Bioch. and Biophs. Acta. 1990. - V.l048. - P. 105-109.

139. Tan J.C., Nocka K., Ray P., Traktman P., Besmer P. The dominant W42 spoting phenotype results from a missence mutation in the c-kit receptor kinase //Science. 1990. - V.247. - P.209-212.

140. Totzke F., Marme D., Hug H. Inducible expression of human phospholipase C-v2 and its activation by platelet-derived growth factor A-chain homodimer in transfected NIH3T3 fibroblasts //Eur. J. Biochem. 1992. -V.203. - P.633-639.

141. Uckert W., Walther W. Retrovirus-mediated gene transfer in cancer therapy //Pharmac. Ther. 1994. - V.63. - P.323-247.

142. Wheeler M.B. Development and validation of swine embryonic stem cells: a review //Reprod. Fertil. Dev. 1994. - V.6. - P.563-568.

143. Wilmut I., Schnieke A.E., McWhir J. et all. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells //Nature. 1997. - V.385. - P.810-813.

144. Wilmut, I., Hooper, M.L., Simons, J.P. J. Reprod. Fertil. 1991. - V.92. -P.245-279.

145. Zandrum В., Shettles M.D. Diploid nuclear replacement in mature human ova with cleavage //Am J.Obstet. gyncol. 1979. - V.133. - P.222-224.

146. Zelenin A.V., Titomirov A.V., Kolesnikov V.A. Genetic transformation of mouse cultured cells with help of high velocity mechanical DNA-injection //FEBS Letters. 1989. - V.244. - P.65-67.

147. Zimmermann U., Riemann F., Pilwat G. Enzyme loading of electrically homogeneous human red blood cell ghosts prepared by dielectric breakdown //Biochim. Biophys. Acta. 1976. - V.436. - P.460-474.