Характеристика половых клеток семенников кроликов как мишеней для генно-инженерных исследований

Новгородова, Инна Петровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Характеристика половых клеток семенников кроликов как мишеней для генно-инженерных исследований
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика половых клеток семенников кроликов как мишеней для генно-инженерных исследований"

На правахрукоп иси

НОВГОРОДОВА ИННА ПЕТРОВНА

ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛОВЫХ КЛЕТОК СЕМЕННИКОВ КРОЛИКОВ КАК МИШЕНЕЙ ДЛЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

03.00.23 - БИОТЕХНОЛОГИЯ 03.00.13 - ФИЗИОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Дубровицы - 2004

Работа выполнена в отделе биотехнологии Всероссийского государственного научно-исследовательского института животноводства.

Научные руководители: доктор сельскохозяйственных наук,

академик РАСХН Лев Константинович Эрнст;

доктор биологических наук,

профессор Наталия Анатольевна Зиновьева

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

доктор биологических наук, профессор Лев Петрович Дьяконов; доктор биологических наук, профессор Юрий Дмитриевич Клинский

Научно-исследовательский институт пушного звероводства и кролиководства им. В.А. Афанасьева

Защита диссертации состоится

2004 года, в

10.00 часов, на заседании диссертационного совета Д.006.013.01 во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте животноводства.

Адрес института: 142132, Московская обл.,

Подольский р-н, п. Дубровицы. тел. (27) 651163

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВГНИИ животноводства. Л

Автореферат разослан « ^ » ^^^ Ученый секретарь диссертационного совета,

В.П. Губанова

2004 года.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

1.1. Актуальность темы. Изучение процессов созревания и дифференцировки половых клеток семенников животных представляет огромный интерес для сравнительной эмбриологии, биологии развития, медицины и биотехнологии [ММ. Иванова и др., 2000]. Использование клеток гонад животных в биотехнологии рассматривается в качестве перспективного приема получения трансгенных сельскохозяйственных животных. Несмотря на наличие целого ряда методов доставки генетической информации в эмбриональные линии животных [Л.К. Эрнст, НА. Зиновьева, 2002], интерес к использованию клеток семенников сохраняется, вследствие их природной способности поглощать чужеродную ДНК (чДНК) и переносить ее в яйцеклетку посредством оплодотворения р. Gandolfi, 1998].

Среди популяции клеток сперматогенного эпителия интерес исследователей в настоящее время сфокусирован на использовании стволовых клеток сперматогоний (СКС). Именно уникальное свойство многократного самообновления СКС открывает широкие возможности реализации потенциала этих клеток при получении трансгенных животных р. Bhnsteretal., 1998].

Популяция диплоидных СКС постоянно обновляется, в результате инициируется комплексный процесс дифференцировки этих клеток. Все это приводит к появлению высоко специализированных половых клеток - спермиев. Одна СКС способна сформировать 4096 сперматид [А. Могепа et al., 1996; I. Dobrinski et al., 2000; C. Marret et al., 2000]. Понимание молекулярных механизмов, сопутствующих транспорту экзогенной ДНК спермиями в яйцеклетки, способствует прогрессу исследований в данной области и послужит основой для массового переноса генов у различных видов животных.

Стволовые клетки сперматогоний млекопитающих, представляющие большой интерес для таких наук, как биотехнология, клеточная и генная инженерия, являются на сегодняшний день удобной моделью при проведении различных геномных манипуляций у млекопитающих.

1.2. Цель и задачи исследований. Целью диссертационной работы явилась характеристика половых клеток семенников кроликов как мишеней для генно-инженерных исследований. Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:

- изучить гистологические особенности семенников у разновозрастных самцов кроликов;

- дать характеристику популяций клеток сперматогенного эпителия в зависимости от стадии развития;

- выявить наиболее оптимальные стадии для выделения СКС и проведения с ними генно-

- определить эффективность генетической трансформации клеток семенников кролика in vitro с использованием ретровирусных векторов;

- изучить эффективность трансформации клеток семенников кроликов in

vivo.

1.3. Научная новизна работы. В ходе выполнения диссертационной работы впервые подробно изучены гистологические особенности семенников самцов кроликов, находящихся на различных физиологических стадиях сперматогенеза. Дана характеристика популяций клеток сперматогенного эпителия семенных канальцев в динамике. Показана возможность генетической трансформации клеток сперматогенного эпителия кроликов in vivo с использованием ретровирусных векторных систем.

1.4. Практическая ценность работы. Практическая значимость диссертации заключается в определении возраста самцов кроликов, при котором в семенниках наблюдается максимальное количество стволовых клеток сперматогоний - перспективных клеток-мишеней для генно-инженерных исследований. Изучена эффективность генетической трансформации сперматогоний кролика in vivo ретровирусными генными конструкциями, содержащими гены инсулина и гормона роста человека.

1.5. Основные положения, выносимые на защиту:

• Соотношение клеток разных типов в семенных канальцах самцов кроликов изменяется в зависимости от возраста животных;

• В сперматогенном эпителии семенных канальцев самцов кроликов постоянно присутствуют стволовые клетки сперматогонии, число которых изменяется в процессе онтогенеза;

• Сперматогонии семенных канальцев самцов кроликов могут быть трансформированы in vivo с использованием ретровирусных векторов;

• Эффективность генетической трансформации сперматогоний in vivo зависит от генной конструкции и типа ретровирусного препарата.

1.6. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены:

• на научно-методической конференции аспирантов и молодых ученых, ВГНИИЖ, п. Дубровицы, июнь 2003г;

• на международной научно-практической конференции «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения», РАМЖ, п. Быково, июль 2003г;

• на 3-й международной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», ВГНИИЖ, п. Дубровицы, ноябрь 2003г;

• в научном отчете ВГНИИЖ, 2003 г;

• на научной конференции отдела биотехнологии ВГНИИЖ, август 2004 г;

• на международной научной конференции, посвященной 75-летию ВГНИИЖ, сентябрь, 2004 г.

1.7. Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ.

1.8. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 141 странице, содержит 12 таблиц, 35 рисунков (в т.ч. 25 фотографий), состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы. Список литературы включает 267 библиографических источников, в том числе 234 на иностранных языках.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Экспериментальные исследования проводили в лаборатории молекулярной генетики и цитогенетики сельскохозяйственных животных отдела биотехнологии ВГНИИ животноводства в 2001-2004гг.

В качестве объекта исследований были взяты разновозрастные самцы-кролики помеси пород шиншилла и белый великан, содержащиеся на экспериментальном физиологическом дворе ВИЖ в количестве 72 голов.

Исследования проводили по схеме, представленной на рисунке 1.

Материал тканей семенников отбирали в зависимости от возраста: при полостной внутрибрюшинной операции или односторонней кастрации кроликов. Отбор тканей семенников проводили, начиная сЮ-дневного до 12-недельного возраста с интервалом 7 дней и с 3-х до 6 месяцев - с интервалом 14 дней. Гистологические препараты семенников кроликов готовили по общепринятой гистологической методике Б. Ромейса[1953].

Микроскопию гистологических препаратов проводили с помощью микроскопа «Opton» (Германия), объектив х40, окуляр х15 с использованием системы цифровой визуализации изображений (ООО «Система для микроскопии и анализа»).

Для трансформации клеток семенников кроликов использовали ретровирусные генные конструкции, включающие ген инсулина человека под контролем промотора цитомегаловируса, и ген гормона роста человека под контролем промотора вируса саркомы Рауса (предоставлены к.б.н. И.К. Фоминым, Белорусский НИИ переливания крови, г. Минск). В качестве клеток-упаковщиц использовали линию AM 12. Схема используемых генных конструкций представлена на рисунке 2.

Перед введением в семенники кроликов клетки-упаковщицы предварительно оценивались на наличие рекомбинантной вставки методом ПЦР. Трансфекцию клеток-мишеней семенников кроликов in vitro проводили путем совместного их культивирования с клетками-упаковщицами или посредством добавления к культуре клеток семенников культуральной жидкости, содержащих ретровирусный вектор pX-lns.

Рис.1. Схема исследований.

Рис. 2. Схема используемых генных конструкций. RSV - промотор вируса саркомы Рауса; SV - промотор ранних генов вируса SV40; пео - ген неомицинфосфотрансферазы из транспозона Тп5.

В - BamHI, Е - EcoRI, S - Sad, SI - Sail, X-Xhol.

Трансформацию клеток семенников кроликов in vivo проводили генной конструкцией, включающей ген гормона роста человека, на самцах в возрасте 9 недель (n=6) и генной конструкцией, содержащей ген инсулина человека, - на животных в возрасте 8 недель (n=6).

Ретровирусные векторы вводили в паренхиму семенников кроликов (множественное введение 5-8 инъекций на семенник). В качестве источника конструкций использовали взвесь клеток-упаковщиц в среде DMEM, с предварительно заблокированным митозом митомицином С, и супернатант, полученный при культивировании линии клеток, продуцирующих рекомбинантные ретровирусы, освобожденный от флотирующих клеток и их остатков высокоскоростным центрифугированием, дополненные полибреном из расчета 8 мкг/мл, в количестве, соответственно, 1 млн и 0,5 мл (105) на семенник. В зависимости от используемого вирусного препарата для каждой из генных конструкций были сформированы две опытные группы: 1 - введение клеток-упаковщиц (n=3), 2 - введение культуральной жидкости (n=3).

Экспрессию рекомбинантных генов в клетках семенников кроликов определяли иммуногистохимическим методом при помощи набора Novocastra (Sigma, США). Клетки, синтезирующие рекомбинантный вирус, окрашиваются в красно-коричневый цвет.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Гистологические исследования семенников кроликов.

3.1.1. Изучение морфологии сперматогенеза кроликов и выявление возраста с максимальным числом сперматогоний.

Гистологические исследования семенников кроликов проводили в 19 возрастных категориях (от 10 дней до 12 месяцев) на самцах в количестве 56 голов.

Исследования срезов семенников кроликов в возрасте 10-ти дней указывают на то, что основную массу клеток в семенных канальцах составляют мелкие с небольшим темным ядром клетки Сертоли, число которых составляет 16,7±0,44. Кроме того, в канальцах обнаруживаются крупные первичные половые клетки (гоноциты) -11,6+0,52 (фото 1).

В возрасте 14-30 дней (фото 2) выявлены сперматогоний типа А со светлой крупной цитоплазмой, заметны делящиеся формы сперматогоний в стадиях профазы и метафазы, число которых изменяется от 7,0±0,41 до 13,1±0,55, число клеток Сертоли изменяется незначительно - от 23,1 ±0,61 до 23,2±0,75.

На срезах семенников самцов 5-недельного возраста начинают отмечаться некоторые изменения, наблюдается размножение сперматогоний. Семенные канальцы представлены двумя типами сперматогоний: тип А и промежуточный. Число сперматогоний типа А достигает 12,6±0,36, промежуточных дифференцирующихся сперматогоний - 7,3+0,42. Число клеток Сертоли уменьшается до 20,2+0,58 (фото 3).

Канальцы кроликов 7-недельного возраста представлены тремя типами сперматогоний: тип А (10,7+0,32), промежуточный (8,7±0,52) и В (6,6±0,36). Происходит дальнейшая физиологическая гибель (апоптоз) некоторого числа клеток Сертоли (13,6+0,45) (фото 4).

С 10-и недельного возраста в семенных канальцах визуализируются слерматоциты первого порядка (11,2±0,47) (фото 5), а с 3,5 месяцев -сперматоциты второго порядка (13,9±0,70) и сперматиды (22,4±0,89) (фото 6).

В канальцах кроликов 5,5-месячного возраста сперматогенные клетки достигают уровня развития поздних грушевидных сперматид и зрелых спермиев (фото 7). Число клеток сперматогенного эпителия в этом возрасте колеблется в следующих пределах: сперматогоний типа А - 5,2±0,41, промежуточные -4,6±0,28, тип В - 4,4±0,28; сперматоциты первого порядка - 65,8±0,94 и второго -18,9±0,37, сперматиды - 72,4±0,52, спермин - 51,5±0,61 и клетки Сертоли -7,2±0,58.

В возрасте 6-ти и 12-ти месяцев (фото 8) число клеток сперматогенного эпителия значительно не изменяется, и, соответственно, составляет: сперматогонии типа А - 4,7±0,39 и 4,8±0,38, промежуточные - 4,4±0,31 и 5,0±0,38( тип В - 3,9+0,65 и 3,7±0,32, сперматоциты первого порядка - 65,8±0,72 и 65,9+0,80, второго - 19,2±0,44 и 18,8+0,44, сперматиды - 76,1±0,89 и 74,5±0,61, спермин - 91,1±0,71 и 91,4+0,59 и клетки Сертоли - 6,7±0,27 и 6.4+0.45.

Данные о распределении клеток сперматогенного эпителия семенников кроликов в динамике представлены на рисунке 3.

возраст

Рис. 3. Морфологический состав клеток сперматогенного эпителия семенных канальцев кроликов в динамике. 1 - сперматогонии, 2 -сперматоциты 1-го порядка, 3 - сперматоциты 2-го порядка, 4 - сперматиды, 5-спермии, 6-клетки Сертоли.

Как проиллюстрировано на рисунке 3, в возрасте 6-11 недель сперматогонии являются основным типом клеток семенных канальцев самцов кроликов. Максимальное их число выявляется в семенниках кроликов в возрасте 9 недель. С 10-и недельного возраста в семенных канальцах визуализируются сперматоциты первого порядка, а с 3,5 месяцев - сперматоциты второго порядка и сперматиды. В возрасте 5,5 месяцев в семенных канальцах кроликов впервые выявляются спермии, число которых увеличивается к достижению животными возраста 6-и месяцев и остается практически неизменным в возрасте 12-и месяцев.

Морфологическая характеристика тканей семенников у разновозрастных кроликов представлена в таблице 1. Из данных таблицы 1, следует, что в период с 10-и дневного до 12-и недельного возраста наблюдается относительно постоянное число семенных канальцев на единице площади ткани семенника при постепенном увеличении среднего числа клеток на поперечном срезе канальца с 28,3 до 56,9. В последующий интервал с 3,5 до 6 месяцев, соответствующий периоду полового созревания, отмечается уменьшение числа семенных канальцев с 142,9 до 30,6 на 1 мм2.

Табл. 1. Морфологическая характеристика тканей семенников.

Возраст кроликов Среднее число семенных канальцев на 1 мм2, п Среднее число клеток сперматогенного эпителия в семенном канальце, п Доля сперматогенной ткани в семенном канальце, %

10 дн 208,2±0,34 28,3±0,59 61,3±0,088

14 дн 179,6±0,44 30,1±0,93 61,7+0,088

21 дн 165,3±0,33 33,2±0,91 61,0±0,089

30 дн 159,2±0,44 36,3±1,05 61,0±0,089

5 нед 159,2±0,38 40,1±1,04 65,8±0,086

6 нед 173,5±0,36 37,8±0,51 68,0±0,085

7 нед 169,4+0,44 39,6±0,77 63,3±0,088

8 нед 179,6±0,41 40,7±1,35 61,3±0,088

9 нед 183,7+0,35 40,1±1,02 62,5+0,088

10 нед 165,3±0,40 51,8±1,42 63,7+0,087

11 нед 161,2+0,29 56,5±1,33 60,2±0,089

12 нед 167,3±0,34 56,9±1,26 56,8±0,090

3,5 мес 142,9±0,38 101,7±1,35 58,8±0,089

4 мес 104,1±0,40 116,2±1,83 56,8±0,090

4,5 мес 95,9±0,32 163,1±1,5 56,5±0,090

5 мес 87,7±0,39 163,9±1,62 58,1±0,090

5,5 мес 65,3±0,26 230,0±1,76 58,8±0,089

6 мес 30,6±0,17 271,9±0,98 53,0±0,091

12 мес 28,6±0,17 270,5±1,26 55,5±0,090

Эти изменения вызваны увеличением числа клеток сперматогенного эпителия в канальцах, и, как следствие, увеличением объема канальцев. Доля сперматогенной ткани у исследуемых возрастных групп кроликов значительно не изменяется.

Существенное внимание в наших исследованиях было уделено СКС, относящимся к дифференцирующимся сперматогониям типа А. Как показано на рисунке 4, с 10-ти дневного до 4-х недельного возраста сперматогонии типа А являются единственным типом сперматогонии, имеющихся в семенных канальцах кроликов.

I шСп. типа А а Сп. промеж, типа пСл. типа В

100% —'---------- ~ — —----- -

90% ^ 80% § 70% Й 60% 5 50% о 40% § 30% т 20% 10%

0% I I I I (! I I I I I I I I I I I I

т-т-см

возраст

Рис. 4. Распределение сперматогонийразныхтипов на поперечных срезах семенных канальцев разновозрастных кроликов.

Их число в зависимости от возраста варьирует и достигает максимального значения в возрасте 4-х недель (в среднем 13,1 клеток). С 5-недельного возраста происходит уменьшение числа сперматогоний типа А (12,6) и к 6-ти месяцам уменьшается в 2,7 раза по сравнению с 4-х недельным возрастом. Сперматогоний промежуточного типа и типа В идентифицируются в семенниках кроликов, начиная с 5-и и 7-и недель, соответственно.

3.1.2. Определение относительного количества ДНК ядер клеток сперматогенного эпителия.

Одной из задач проведенных исследований было определение относительного количества ДНК ядер клеток сперматогенного эпителия у разновозрастных самцов-кроликов. Этот показатель является критерием пролиферативной активности клеток. Ядра клеток семенников характеризовались различными величинами относительного количества ДНК.

В результате экспериментов было установлено (рисунок 5), что относительное количество ДНК ядер клеток сперматогенного эпителия самцов в возрасте от 10 дней до 9 недель заметно увеличивается: у сперматогоний типа А в 1,5 раз (от 589 до 884) и с 5 недель у промежуточного типа - 1,9 раз (от 326 до 634).

Для этих типов клеток в 9-недельном возрасте содержание ДНК является максимальными, что говорит о высокой пролиферативной активности клеток. Относительная плотность сперматогоний типа В от 7 до 9-недельного возраста изменяется незначительно (от 292 до 328), а в 3,5 месяца достигает максимальной величины (547,8+0,4).

Содержание ДНК в клетках Сертоли с 10-дневного до 8-недельного возраста снижается от 422,8±0,3 до 272,3±0,6, а к 9-неделям увеличивается в 1,6 раз, по сравнению с предшествующим периодом.

При анализе рисунка 5 выявлено, что в 4-месячном возрасте наибольшей пролиферативной активности достигают показатели сперматоцитов первого порядка и клеток Сертоли, соответственно, 499,4±0,5 и 708,3±0,4.

1000

10 14 21 4 5 в 7 8 в 10 11 12 3,5 4 4,5 5 5,5 в 12 дней дней день нвд нед нед над нет нед нед над над мое мес мес мес мес мес мес

—<^Спврмат. типа А .....•"" Спермат. промеж, типа ~"*"~Спермат. типа В

—•Спорматоциты 1 порядка "©""Сперматоциты 2 порядка ""•""Сперматиды ■Спермии_**—- Клетки Сертоли_

Рис. 5. Показатели относительного количества ДНК ядер клеток спврматогвнногоэпителия уразновозрастныхсамцов-кроликов.

С 5,5-месячного возраста в семенных канальцах представлены все типы клеток сперматогенного эпителия. В этом возрасте отмечена наибольшая пролиферативная активность сперматоцитов второго порядка (432,1 ±0,4). В 6 и 12 месяцев показатели относительного количества ДНК ядер сперматид (43,9±0,9 и 40,5±0,7) и спермиев (58,9±0,8 и 59,4±0,5) являются наименьшими.

Фото 1. Семенные канальцы 10-дневного кролика. 1 - первичные половые клетки (гоноциты), 2 - клетка Сертоли. Фиксация:жидкость Буэна. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: объектив х40, окуляр х15.

Фото 2. Семенные канальцы 30-дневного кролика. 1 - сперматогония, 2 - клетка Сертоли. Фиксация:жидкость Буэна. Окраска:гематоксилин-эозин. Увеличение: объективх40, окулярх15.

Фото 3. Семенные канальцы 5-недельного кролика. 1 - сперматогония типа А, 2 - сперматогония промежуточного типа, 3 - клетка Сертоли. Фиксация: жидкость Буэна. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: объективх40, окулярх15.

Фото 4. Семенные канальцы 7-недельного кролика. 1 - сперматогония типаА, 2-сперматогония промежуточного типа, 3 - сперматогония типа В, 4 - клетка Сертоли. Фиксация: жидкость Буэна. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: объективх40, окулярх15.

Фото 5. Семенные канальцы 10-недельного кролика. 1 сперматогония типа А, 2 - сперматогония промежуточного типа, 3 -сперматогония типа В, 4 - сперматоцит 1 порядка, 5 - клетка Сертоли. Фиксация: жидкость Буэна. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: объективх40, окулярх15.

Фото 6. Семенные канальцы 3,5-месячного кролика. 1 сперматогонии, 2 - сперматоцит 1 порядка, 3 - сперматоцит 2 порядка, 4 -сперматида, 5 - клетка Сертоли. Фиксация: жидкость Буэна. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: объектив х40, окуляр х15.

Фото 7. Семенные канальцы 5,5-месячного кролика.

1 - сперматогония, 2 - сперматоцит 1 порядка, 3 - сперматоцит2 порядка, 4 -сперматида, 5 - спермии, 6 - клетка Сертоли. Фиксация: жидкость Буэна. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: объектив х40, окуляр х15

Фото 8. Семенные канальцы 12-месячного кролика. 1 -

сперматогония, 2 - сперматоцит 1 порядка, 3 - сперматоцит2 порядка, 4 -сперматида, 5 - спермии, 6 - клетка Сертоли. Фиксация жидкость Буэна. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: объектив х40, окуляр х15.

Фото 9. Срезы семенников кроликов при иммуногистохимических исследованиях (контроль). Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение: объектив х40, окуляр х 10.

Фото 10. Срезы семенников кроликов с трансформированными клетками (опыт, 7 день). В семенном канальце 2 трансформированных сперматогония (клетки указаны стрелками). Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение: объективх40, окулярх10.

Фото 11. Срезы семенников кроликов с трансформированными клетками (опыт, 7 день). В семенном канальце 3 трансформированных сперматогония (клетки указаны стрелками). Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение: объективх40, окулярх10.

Фото 12. Срезы семенников кроликов с трансформированными клетками (опыт, 7 день). В центре семенной каналец с 3-я трансформированными сперматогониями. В левом верхнем углу 4-и трансформированные клетки и нижнем - 1 (клетки указаны стрелками). Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение: объективх40, окулярх15.

Фото 13. Срезы семенников кроликов при иммуногистохимических исследованиях (контроль). Окраска гематоксилин-эозин Увеличение: объектив х40, окуляр х10

Фото 14. Срезы семенников кроликов с трансформированными клетками (опыт, 7день). В семенном канальце один трансформированный сперматогоний (клетки указны стрелками) Окраска гематоксилин-эозин Увеличение: объективх40, окулярх10

Фото 15. Срезы семенников кроликов с трансформированными клетками (опыт, 14 день). В семенном канальце 2 трансформированных сперматогония (клетки указаны стрелками). Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение: объективх40, окулярх10.

Фото 16. Срезы семенников кроликов с трансформированными клетками (опыт, 14 день). В семенном канальце 3 трансформированных сперматогония (клетки указаны стрелками). Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение: объективх40, окулярх10.

3.2. Получение и характеристика культуры клеток тканей семенников кроликов.

Экспериментальными данными было установлено, что возраст от 10-и дней до 9-и недель является оптимальным для проведения различных биоинженерных манипуляций у кроликов, так как в этот период генеративные клетки семенных канальцев представлены только сперматогониями и наблюдается их наиболее высокая пролиферативная активность. Именно, поэтому, в результате проведенных исследований была изучена культура клеток семенников, полученная от самцов в возрасте 8 недель в трех последовательных пассажах.

При анализе клеточной популяции были выявлены пять типов клеток, отличающиеся по морфологии: половые клетки - сперматогонии округлой формы с крупным сферическим ядром и достаточно узкой цитоплазмой, клетки Сертоли неправильной формы с крупным ядром и размытой формой цитоплазмы, клетки Лейдига неправильной формы, а также фибробластоподобные клетки, имеющие веретенообразную форму и маленькие сферические миоидные клетки.

В зависимости от пассажа процентное отношение клеток в культуре тканей семенников изменялось (рисунок 6). Наиболее многочисленной группой клеток культуры семенников в трех пассажах были клетки Сертоли. В третьем пассаже по сравнению с первым, значительно увеличилось число фибробластоподобных клеток - в 3 раза. Клетки Лейдига и миоидные клетки в третьем пассаже отсутствовали.

Рис. 6. Число клеток культуры семенников в зависимости от пассажа, %. КС-клетки Сертоли, КЛ-клеткиЛейдига.

Было установлено, что в процессе культивирования происходила постепенная утеря сперматогоний. Так, если в первом пассаже на их долю приходилось 29%, то в третьем пассаже их число уменьшилось в 6 раз. По всей видимости, для поддержания сперматогоний в культуре требуется введение в среды дополнительных ростовых факторов.

3.3. Трансфекция клеток семенников кроликов ретровирусными векторными системами in vivo.

Следующим этапом в работе явилось изучение эффективности генетической трансформации половых клеток семенников кроликов in vivo. С этой целью были сформированы группы животных в зависимости от используемой генной конструкции и типа ретровирусного препарата (культуральная жидкость или клетки-упаковщицы) (таблица 2).

Табл. 2. Инъецирование ретровирусных векторных систем в семенники кроликов in vivo.

Генная конструкция pX-RSVhGH pX-lns

Группа 1 2 1 2

Препарат кк КЖ КК КЖ

Количество животных 3 3 3 3

Возраст 9-10 нед 9-10 нед 8 нед 8 нед

Линия клеток-упаковщиц АМ12 АМ12 АМ12 АМ12

Объем суспензии, мл 0,5 0,5 0,5 0,5

Концентрация клеток 1 млн 10° КОЕ/мл 1 млн 10й КОЕ/мл

Анализ наличия трансформированных клеток проводили через 7 и 14 дней после инъекции с использованием иммуногистохимических исследований.

3.3.1. Изучение эффективности генетической трансформации клеток семенников кроликов in vivo генной конструкцией pX-RSVhGH.

При анализе интеграции рекомбинантной генной конструкции, содержащей гормон роста человека (hGH), in vivo положительные сигналы наблюдались в пробах тканей семенников, отобранных от самцов через 7 дней. В гистологических срезах семенников, отобранных от кроликов, которым вводили супернатант и у животных на 14 день после инъекции, клеток с характерным красно-коричневым окрашиванием выявлено не было.

В образцах срезов семенников, взятых от животных первой группы (7-ой день после инъекции): положительные сигналы были обнаружены в 12 из 20

проанализированных срезах. Число трансформированных клеток в одном семенном канальце колебалось от 1 до 4 (фото 9-12). Число окрашенных сперматогоний, встречающихся на одном срезе, достигало 11.

При иммуногистохимических исследованиях гистосрезов семенников кроликов трансформированными были только сперматогоний. Ни в одном из семенных канальцев не было выявлено трансформированных клеток Сертоли. По всей видимости, это связано с активной пролиферацией сперматогоний в этот период и, наоборот, с низкой пролиферативной активностью клеток Сертоли.

Анализ полученных результатов показал, что минимальное число трансформированных канальцев составило от 0,33±0,03 до 1,85±0,08. Среднее значение трансформированных канальцев составило 1,17±0,16, в то время как среднее значение для всех канальцев - 0,70+0,16.

При инфицировании клеток семенников in vivo клетками-упаковщицами, продуцирующими рекомбинантный ретровирус pX-RSVhGH, максимальная величина частоты генетической трансформации сперматогоний составила 5,8%, минимальная -1,9%.

Согласно результатам, представленным в таблице 3, показатель эффективности генетической трансформации при использовании ретровирусного вектора pX-RSVhGH достигал 2,7*10"3.

Табл. 3. Эффективность генетической трансформации клеток семенниковкроликовin vivoгеннойконструкциейрХ-RSVhGH.

Показатели 1 группа 2 группа

КК КЖ

Число трансформированных сперматогоний 80 -

Среднее число клеток в семенном канальце 48,6 -

Число семенных канальцев на срезе 605,0 -

Общее число клеток на срезе 29,4*103 -

Эффективность трансформации клеток 2,7* 103 -

Полученные нами результаты свидетельствуют о возможности успешной трансформации клеток семенников кролика in vivo с использованием ретровирусной генной конструкции pX-RSVhGH, содержащей ген инсулина человека.

3.3.2. Изучение эффективности генетической трансформации клеток семенников кроликов in vivo генной конструкцией pX-lns.

Иммуногистохимическое исследование семенников кроликов через 7 и 14 дней после введения генной конструкции инсулина выявило наличие рекомбинантной ДНК у опытных животных, как при использовании клеток-упаковщиц, так и культуральной жидкости.

Через 7 дней после инъекции клеток-упаковщиц число трансформированных канальцев колебалось от 0,38 до 1,32%, а при инфицировании клеток-мишеней вирусным препаратом - от 0,21 до 0,64%. Результаты, полученные на 14 день составили, соответственно, от 0,50 до 2,59% и от 0,38 до 0,93%.

У самцов на 7 день после инъекции клеток-упаковщиц соответствующее окрашивание клеток наблюдалось в 9-и из 20-и проанализированных срезах. Число трансформированных клеток в одном семенном канальце варьировало от 1 до 3 (фото 13-16). В одном из срезов были выявлены 7 окрашенных сперматогоний в разных канальцах. При инъецировании супернатанта очаги окрашивания наблюдались в 4-х срезах, при этом число трансформированных клеток в одном семенном канальце варьировало от 1 до 2.

Анализ, проведенный через 14 дней после инъекции, показал наличие трансформированных сперматогоний при введении клеток-упаковщиц в 9-и срезах из 20. При этом в одном из срезов было обнаружено 14 трансформированных клеток. При введении культуральной жидкости наибольшее число окрашенных клеток на одном срезе составляло 5.

Максимальная частота интеграции сперматогоний в трансформированных семенных канальцах через 7 дней после инъекции клеток-упаковщиц достигала 4,1+0,1%, минимальная - 3,2±0,1%. Показатели частоты интеграции при использовании супернатанта варьировали от 3,4±0,1 до 4,0+0,1%. В результате данных, полученных через 14 дней, были выявлены колебания частоты интеграции сперматогоний при генетической трансформации клетками-упаковщицами от 3,3±0,1 до 4,0±0,1%. При инфицировании клеток-мишеней вирусным препаратом максимальная величина составила 3,5±0,1%, минимальная - 3,3±0,1%.

Сравнительный анализ эффективности трансформации клеток семенников кроликов in vivo при использовании вектора, содержащего ген инсулина, выявил различия в способности клеток, упаковывающих рекомбинантный ретровирус, инфицировать клетки-мишени в зависимости от используемого вирусного препарата.

Как следует из данных таблицы 4, инъекция клеток, упаковывающих ретровирусные векторы, в семенники кроликов обуславливала более высокую

частоту генетической трансформации по сравнению с использованием культуральной жидкости.

В результате проведенных экспериментов было установлено, что число трансформированных сперматогоний при практически одинаковом среднем числе клеток в семенных канальцах при инъецировании клеток-упаковщиц, как на 7 (33 клетки), так и на 14 день (67 клеток) после инъекции было в 3 раза выше, чем при использовании супернатанта (соответственно, 11 и 23 клетки).

Табл. 4. Показатели частоты генетической трансформации клеток-мишенейrеннойконструкциейpX-lns.

Параметры через 7 дней через 14 дней

1 группа 2 группа 1 группа 2 группа

КК КЖ КК КЖ

Число трансформированных сперматогоний 33 11 67 23

Среднее число клеток в семенных канальцах 29,4 28,3 29,3 29,2

Среднее число семенных канальцев на срезе 497,9 535,4 559,1 517,7

Общее число клеток на срезе 14,6*103 15,2*103 16,4*103 15.1*103

Эффективность трансформации 2,26*10-3 0,72*10"* 4,1*10-3 1,5*10-3

Так, при использовании клеток-упаковщиц на 7 день эффективность трансформации клеток семенников кроликов первой группы составила и, была в 3,1 раза выше, по сравнению с показателем, полученным при инъекции культуральной жидкости (0,72*10"3).

На 14 день после инъекции, частота генетической трансформации при использовании клеток-упаковщиц составила 4,1'Ю"3, что было в 2,7 раз выше по сравнению с использованием супернатанта

Анализ полученных данных в зависимости от времени после инъекции показал, что частота генетической трансформации была неодинаковой и увеличивалась к 14 дню в 1,8 раз при использовании клеток-упаковщиц и 2,0 раза при введении культуральной жидкости. Эффективность трансформации сперматогоний происходила за счет увеличения их числа, что еще раз доказывает наиболее высокую пролиферативную активность этого типа клеток и способность инфицирования именно стволовых клеток сперматогоний.

Таким образом, полученные данные позволяют считать наиболее эффективным введение экзогенной ДНК в виде клеток-упаковщиц, так как при его использовании получен лучший результат.

3.3.3. Сравнительный анализ эффективности генетической трансформации клеток семенников кроликов in vivo при использовании генных конструкций pX-RSVhGH и pX-lns.

Сравнительный анализ эффективности генетической трансформации клеток семенников кроликов в зависимости от генной конструкции показал, что вектор, несущий ген инсулина человека, оказался наиболее способным при переносе ДНК в половые клетки кроликов, по сравнению с вектором, несущим ген гормона роста человека (таблица 5).

Так, на 14 день после инъекции клеток-упаковщиц pX-RSVhGH, трансформации сперматогоний не наблюдалось ни в одном из семенных канальцев. Напротив, при использовании линии клеток-упаковщиц pX-lns, интеграция генных конструкций в клетках семенников была выявлена, как на 7, так и на 14 день после введения. При инъекции в семенники культуральной жидкости pX-RSVhGH трансформации клеток вообще не наблюдалось.

Хотя частота интеграции генной конструкции pX-RSVhGH в сперматогоний кроликов in vivo была ниже по сравнению с pX-lns (3,0% и 3,5%), но частота генетической трансформации, наоборот, была выше на 17,3%, что обуславливалось увеличением числа трансформированных канальцев, как на трансформированных, так и на всех срезах, соответственно, в 2,2 и в 1,6 раза.

Табл. 5. Сравнительный анализ эффективности генетической трансформации клеток семенников кролика in vivo генными конструкциями pX-RSVhGHи pX-lns.

Группы животных

Показатели Конструкция KK КЖ

7дн. 14 дн. 7 ДН. 14 дн.

Частота интеграции*, % pX-RSVhGH 3,0 - - -

pX-lns 3,5 3,5 3,6 3,4

Число трансформиров. канальцев от числа канальцев во всех срезах, % pX-RSVhGH 0,70 - - -

pX-lns 0,32 0,63 0,08 0,22

Число трансформиров. канальцев от числа канальцев pX-RSVhGH 1,16 - - -

в трансформ, срезах, % pX-lns 0,71 1,36 0,41 0,62

Общая эффективность (частота генетической трансформации) pX-RSVhGH 2,7*10"3 - - -

pX-lns 2,3*10* 4,1*10"3 0,7*10"3 1,5*10"3

* число трансформированных клеток от числа клеток в трансформ, канальцах, выраженное в%.

Сопоставляя данные об общей эффективности генной конструкции рХ-!пэ на 7-ой и 14-ый дни после инъекции, следует отметить увеличение частоты генетической трансформации на 14-ый день после инъекции в 1,8-2,1 раза, что при практически равной частоте интеграции было обусловлено увеличением доли трансформированных канальцев на срезах.

Таким образом, полученные нами данные показывают, что эффективность генетической трансформации клеток семенников кроликов зависит от генной конструкции, типа используемого препарата и времени после инъекции в семенники.

ВЫВОДЫ.

1. Установлено, что в период с 14-и дневного до 12-и недельного возраста наблюдается относительно постоянное число семенных канальцев на единице площади ткани семенника (от 159,2±0,38 до 183,7±0,35 на 1 мм2) при постепенном увеличении среднего числа клеток на поперечном срезе канальца с 28,3±0,59 до 56,9±1,26. В возрасте от 3,5 до 6 мес. происходит уменьшение числа семенных канальцев с 142,9±0,38 до 30,6+0,17 на 1 мм2. Эти изменения вызваны увеличением числа клеток сперматогенного эпителия в канальцах от 101,7±1,35 до 271,9±0,98. Доля сперматогенной ткани у исследуемых возрастных групп кроликов значительно не изменяется.

2. Показано, что в возрасте от 10 дней до 4-х недель в семенных канальцах кроликов наряду с клетками Сертоли присутствует единственный тип генеративных клеток - сперматогонии типа А. В зависимости от возраста их число варьирует и достигает максимального значения в возрасте 4-х недель (в среднем 13,1 ±0,55 клеток в 1 канальце). Наибольшее число сперматогонии промежуточного типа отмечается в возрасте 6-и недель (9,2±0,47), а типа В - в 11 недель (11,4+0,59). С 10-и недельного возраста в семенных канальцах визуализируются сперматоциты первого порядка, а с 3,5 месяцев -сперматоциты второго порядка и сперматиды. Максимальное число сперматоцитов первого порядка наблюдается в возрасте 5,5-6 месяцев (65,8±0,94). Число сперматоцитов второго порядка и сперматид достигает максимальных значений в 6-и месячном возрасте (соответственно, 19,2±0,44, 76,1 ±0,89). В возрасте 5,5 месяцев в семенных канальцах кроликов впервые выявляются спермин, число которых увеличивается к 6-и месячному возрасту (91, 1 ±0,71) и остается практически неизменным в возрасте 12 месяцев (91,4±0,59).

канальцах самцов кроликов. Максимальное число сперматогоний отмечается в период 8-9 недель, когда на их долю приходится, соответственно, 65,7 и 71,3%. Установлено, что в период от 10 дней до 9 недель сперматогоний характеризуются наибольшей пролиферативной активностью, что является одним из определяющих факторов для успешного переноса генов посредством рекомбинантных ретровирусных векторов.

4. В результате исследований полученной и охарактеризованной нами первичной культуры клеток семенников кроликов в возрасте 8-и недель, установлено, что в процессе культивирования происходит потеря сперматогоний. Если на их долю в первом пассаже приходится 29,2%, то в третьем пассаже их число снижается в б раз и составляет 1,8%. Показано, что частота генетической трансформации первичной культуры клеток семенников in vitro при использовании клеток-упаковщиц была ниже 3,0'Ю"4.

5. Выполнена трансформация сперматогоний кролика in vivo генными конструкциями несущими, соответственно, гены инсулина и гормона роста человека. Клетки, трансформированные pX-RSVhGH, выявлялись только на 7-ой день после инъекции клеток-упаковщиц в семенники кроликов с частотой 2.7Ч0"3. Частота генетической трансформации сперматогоний вектором pX-lns на 7-ой день после введения клеток-упаковщиц или культуральной жидкости составляла, соответственно, г.ЗЧО"3 и 0,7*10"3. Показано увеличение эффективности трансформации сперматогоний кролика на 14-ый день после инъекции в 1,8-2,1 раза, соответственно, до 4,1*10"3 и 1,5*10'3. Полученные результаты свидетельствуют о возможности успешного внедрения генных конструкций в сперматогоний кролика in vivo посредством рекомбинантных ретровирусов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Для получения оптимальных результатов по генетической трансформации сперматогоний кролика при генно-инженерных исследованиях рекомендуем использовать самцов в возрасте от 10-и дней до 9-и недель, когда в семенных канальцах семенников присутствует наибольшее число клеток этого типа и отмечается их наиболее высокая пролиферативная активность.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ.

1. Ендовицкая И.П. (Новгородова И.П.). Гистологические исследования сперматогенеза кроликов // Материалы международной научно-практической конференции по проблеме: «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения». - РАМЖ, п. Быково. - 2003 г. -В.9.-С.173-174.

2. Ендовицкая И.П. (Новгородова И.П.). Изучение развития сперматогенеза у кроликов // Материалы 52-ой научной конференции молодых ученых и аспирантов: «Молодые ученые - животноводству страны». - ВИЖ, п. Дубровицы. - 2004. - С.62-64.

3. Ендовицкая И.П. (Новгородова И.П.). Изучение сперматогенеза кроликов Огуйс!адив сип1си!ив // 3-я международная научная конференция «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных». - ВИЖ, п. Дубровицы. - 2003 г. - С. 106-108.

4. Ендовицкая И.П. (Новгородова И.П.). Изучение сперматогенеза кроликов посредством анализа гистологических препаратов срезов семенных канальцев // Школа-практикум: «Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных». - ВИЖ, п. Дубровицы. - 2003 г. - В.2. - С.27-34.

5. Ендовицкая И.П. (Новгородова И.П.), Л.К. Эрнст. Использование спермиев и сперматогоний в получении трансгенных животных // Достижения науки и техники АПК. - 2003 г. - №10. - С.20-23.

6. Ендовицкая И.П. (Новгородова И.П.), Зиновьева НА, Эрнст Л.К. Эффективность трансформации сперматогоний у кроликов // Материалы междунар. научно-практической конферен. к 75-летию ВИЖа: «Прошлое, настоящее и будущее зоотехнической науки / Труды ВИЖа. - В.62. - Т.З. -Дубровицы. - 2004. - С. 180-185.

Издательство РУЦ ЭБТЖ 142132, Московская обл., Подольский р-н, п. Дубровицы Тел. (8-27) 65-14-07,65-14-24

Сдано в набор 2.09 2004 Заказ Тираж 100 экз.

Р22 7 1 0

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Новгородова, Инна Петровна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Процесс сперматогенеза у млекопитающих

1.2. Типы клеток сперматогенного эпителия

1.3. Перспективы использования стволовых клеток сперматогоний

1.4. Механизмы контроля пролиферации и дифференцировки сперматогоний

1.5. Культура клеток сперматогоний

1.6. Методы получения трансгенных животных с помощью половых клеток семенников

1.7. Трансформация клеток сперматогенного эпителия

1.7.1. Использование спермиев в качестве вектора для переноса чДНК

1.7.2. Трансплантация стволовых клеток сперматогоний

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Используемые векторные системы

2.2. Реактивы и оборудование

2.3. Приготовление гистологических препаратов 59 семенников

2.4. Определение числа клеток сперматогенного эпителия и относительного количества ДНК ядер клеток 59 семенников

2.5. Иммуногистохимический анализ экспрессии рекомбинантных белков в семенниках кроликов

2.6. Приготовление культуры клеток семенников

2.7. Окрашивание и идентификация клеток культуры тканей семенников

2.8. Генетическая трансформация клеток семенников in 63 vitro

2.8.1. Трансфекция культуры клеток семенников культуральной жидкостью

2.8.2. Трансфекция культуры клеток семенников клетками-упаковщицами

2.9. Введение рекомбинантных векторов в семенники кроликов in vivo

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Гистологические исследования семенников кроликов

3.1.1. Изучение морфологии сперматогенеза кроликов и выявление возраста с максимальным числом сперматогоний

3.1.2. Определение относительного количества ДНК ядер клеток сперматогенного эпителия

3.2. Трансформация клеток семенников in vitro

3.2.1. Получение и характеристика культуры клеток тканей семенников кроликов

3.2.2. Анализ эффективности генетической трансформации клеток семенников in vitro

3.3. Трансфекция клеток семенников кроликов ретровирусными векторными системами in vivo

3.3.1. Изучение эффективности генетической трансформации клеток семенников кроликов in vivo генной конструкцией pX-RSVhGH

3.3.2. Изучение эффективности генетической трансформации клеток семенников кроликов in vivo генной конструкцией pX-Ins

3.3.3. Сравнительный анализ эффективности генетической трансформации клеток семенников кроликов in vivo при использовании генных конструкцийpX-RSVhGH и 101 pX-Ins

ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Характеристика половых клеток семенников кроликов как мишеней для генно-инженерных исследований"

Актуальность темы.

Изучение процессов созревания и дифференцировки половых клеток семенников животных представляет огромный интерес для сравнительной эмбриологии, биологии развития, медицины и биотехнологии [М.М. Иванова и др., 2000]. Использование клеток гонад животных в биотехнологии рассматривается в качестве перспективного приема получения трансгенных сельскохозяйственных животных. Несмотря на наличие целого ряда методов доставки генетической информации в эмбриональные линии животных [Л.К. Эрнст, Н.А. Зиновьева, 2002], интерес к использованию клеток семенников сохраняется, вследствие их природной способности поглощать чужеродную ДНК (чДНК) и переносить ее в яйцеклетку посредством оплодотворения /К Сапс1о1/1, 1998].

Эффективность переноса экзогенной чДНК таким способом у мышей составляет 30-60% /У. СгиепМаит а1, 1991], в то время как при использовании микроинъекции - 25% [V. Ригзе! ег а1, 1989; ВНтгег ег а1, 1994а]. Искусственное осеменение трансформированными спермиями в будущем может рассматриваться как элемент программ по массовому получению трансгенных сельскохозяйственных животных, для которых процедура микроинъекции малоэффективна.

Использование спермиев в качестве вектора имеет ряд преимуществ:

1. Интегрированная в геном организма чДНК может устойчиво передаваться в ряде поколений.

2. Возможно изменение генотипа и фенотипа животных.

3. Сокращаются сроки получения потомства.

4. Снижается стоимость работ по созданию трансгенных животных.

Среди большой популяции клеток сперматогенного эпителия интерес исследователей в настоящее время сфокусирован на использовании стволовых клеток сперматогоний (СКС). Именно уникальное свойство многократного самообновления СКС, открывает широкие возможности реализации потенциала этих клеток при получении трансгенных животных [R. Brinster et al, 1998].

СКС наиболее устойчивы к различным повреждающим факторам и, часто только эти клетки выживают, в то время как остальные типы клеток сперматогенного эпителия погибают. До полового созревания и в течение остального периода жизни организма СКС претерпевают постоянную репликацию, сохраняя свое число* в течение процесса, называемого обновлением состава стволовых клеток.

Вместе с тем, использование половых клеток в качестве генетического вектора для получения трансгенных животных осложняется нарушениями физиологических функций «трансгенного» спермия (уменьшение подвижности, разрушение цитоплазматической мембраны, спонтанная акросомическая реакция, потеря t оплодотворяющей способности), а также детекцией и разделением «трансгенного» и нормального спермиев» [С. Spadafora, 1998]. Преодоление этих негативных явлений позволит получить простой и удобный способ создания трансгенных животных, т.к. искусственное осеменение давно успешно используется в сельскохозяйственной практике.

Понимание молекулярных механизмов, сопутствующих транспорту экзогенной ДНК спермиями в яйцеклетки, способствует прогрессу исследований в данной области и послужит основой для массового переноса генов у различных видов животных.

Методом использования СКС для получения трансгенных животных занимаются ученые многих университетов и лабораторий мира. Объектами их исследования являются как лабораторные [М. Capecchi, 1980; S. Dolci et al, 1993; J.-M. Ruysschaert et al, 1994; T. Ogawa et al, 1998, 1999b], так и сельскохозяйственные животные [I. Dobrinski et al, 1999a; F. Izadyar et al., 2000; Dirk G. de Rooij, 2001J.

Стволовые клетки сперматогонии млекопитающих, представляющие большой интерес для таких наук, как биотехнология, клеточная и генная инженерия; являются на сегодняшний день удобной моделью при проведении различных геномных манипуляций у млекопитающих.

Таким образом, актуальность работы заключается в.том, что показана» возможность использования половых клеток семенников кроликов в качестве мишеней для генно-инженерных исследований.

Цель и задачи исследования.

Целью диссертационной работы явилась характеристика половых клеток семенников кроликов как мишеней для генно-инженерных исследований.

Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:

1. Изучить гистологические особенности семенников у разновозрастных самцов кроликов.

2. Дать характеристику популяций клеток сперматогенного эпителия в зависимости от стадии развития.

3. Выявить наиболее оптимальные стадии, для выделения СКС и проведения с ними генно-инженерных исследований.

4. Определить эффективность генетической трансформации клеток семенников кролика in vitro с использованием ретровирусных векторов.

5. Изучить эффективность трансформации клеток семенников кроликов in vivo.

Научная новизна.

В ходе выполнения диссертационной работы впервые подробно изучены гистологические особенности семенников самцов кроликов, находящихся на различных физиологических стадиях сперматогенеза. Дана характеристика популяций клеток сперматогенного эпителия семенных канальцев в динамике. Показана возможность генетической трансформации клеток сперматогенного эпителия кроликов in vivo с использованием ретровирусных векторных систем.

Практическая ценность работы.

Практическая значимость диссертации заключается в определении возраста самцов кроликов, при котором в семенниках наблюдается максимальное количество стволовых клеток сперматогоний - перспективных клеток-мишеней для генно-инженерных исследований. Изучена эффективность генетической трансформации сперматогоний кролика in vivo ретровирусными генными конструкциями, содержащими гены инсулина и гормона роста человека.

Основные положения, выносимые на защиту:

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены:

• на научно-методической конференции аспирантов и молодых ученых, ВГНИИЖ, п. Дубровицы, июнь 2003г;

• в научном отчете ВГНИИЖ, 2003 г;

• на научной конференции отдела биотехнологии ВГНИИЖ, август 2004 г;

• на международной научной конференции, посвященной 75-летию ВГНИИЖ, сентябрь, 2004 г.

Публикация результатов исследований.

По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ.

Структура и объем работы.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Новгородова, Инна Петровна

выводы.

1. Установлено, что в период с 14-и дневного до 12-и недельного возраста наблюдается относительно постоянное число семенных канальцев на единице площади ткани семенника (от 159,2±0,38 до 183,7±0,35 на 1 мм2) при постепенном увеличении среднего числа клеток на поперечном срезе канальца с 28,3±0,59 до 56,9+1,26. В возрасте от 3,5 до 6 мес. происходит уменьшение числа семенных канальцев с 142,9±0,38 до 30,610,17 на 1 мм2. Эти изменения вызваны увеличением числа клеток сперматогенного эпителия в канальцах от 101,7±1,35 до 271,9±0,98. Доля сперматогенной ткани у исследуемых возрастных групп кроликов значительно не изменяется.

2. Показано, что в возрасте от 10 дней до 4-х недель в семенных канальцах кроликов наряду с клетками Сертоли присутствует единственный тип генеративных клеток - сперматогонии типа А. В зависимости от возраста их число варьирует и достигает максимального значения в возрасте 4-х недель (в среднем 13,1 ±0,55 клеток в 1 канальце). Наибольшее число сперматогоний промежуточного типа отмечается в возрасте 6-и недель (9,2±0,47), а типа В - в 11 недель (11,4±0,59). С 10-и недельного возраста в семенных канальцах визуализируются сперматоциты первого порядка, а с 3,5 месяцев - сперматоциты второго порядка и сперматиды. Максимальное число сперматоцитов первого порядка наблюдается в возрасте 5,5-6 месяцев (65,8±0,94). Число сперматоцитов второго порядка и сперматид достигает максимальных значений в 6-и месячном возрасте (соответственно, 19,2±0,44, 76,1±0,89). В возрасте 5,5 месяцев в семенных канальцах кроликов впервые выявляются спермии, число которых увеличивается к 6-и месячному возрасту (91,1 ±0,71) и остается практически неизменным в возрасте 12 месяцев (91,4±0,59).

3. Выявлено, что оптимальным периодом для проведения генно-инженерных исследований является возраст от 10 дней до 9 недель, когда сперматогонии являются единственным типом генеративных клеток в семенных канальцах самцов кроликов. Максимальное число сперматогоний отмечается в период 8-9 недель, когда на их долю приходится, соответственно, 65,7 и 71,3%. Установлено, что в период от 10 дней до 9 недель сперматогонии характеризуются наибольшей пролиферативной активностью, что является одним из определяющих факторов для успешного переноса генов посредством рекомбинантных ретровирусных векторов.

4. В результате исследований полученной и охарактеризованной нами первичной культуры клеток семенников кроликов в возрасте 8-и недель, установлено, что в процессе культивирования происходит потеря сперматогоний. Если на их долю в первом пассаже приходится 29,2%, то в третьем пассаже их число снижается в 6 раз и составляет 1,8%. Показано, что частота генетической трансформации первичной культуры клеток семенников in vitro при использовании клеток-упаковщиц была ниже

3,0*10"4.

5. Выполнена трансформация сперматогоний кролика in vivo генными конструкциями pX-Ins и pX~RSVhGH, несущими, соответственно, гены инсулина и гормона роста человека. Клетки, трансформированные рХ-RSVhGH, выявлялись только на 7-ой день после инъекции клеток-упаковщиц в семенники кроликов с частотой 2,7*10'3. Частота генетической трансформации сперматогоний вектором pX-Ins на 7-ой день после введения клеток-упаковщиц или культуральной жидкости составляла, соответственно, 2,3*10 и 0,7*10". Показано увеличение эффективности трансформации сперматогоний кролика на 14-ый день после инъекции в 1,8-2,1 раза,

7 7 соответственно, до 4,1*10* и 1,5*10". Полученные результаты свидетельствуют о возможности успешного внедрения генных конструкций в сперматогонии кролика in vivo посредством рекомбинантных ретровирусов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Новгородова, Инна Петровна, п. Дубровицы, Московской обл.

1. Абдрахманов И.К. Характеристика линий клеток, упаковывающих рекомбинантные ретровирусные векторы в переносе экзогенной ДНК в клетки млекопитающих//Автореф. дисс. . канд. биол. наук. Дубровицы. - 2001. - 21с.

2. Алиев A.A. Экспериментальная хирургия. М.: НИЦ Инженер. -1998.-445с.

3. Баранов B.C., Гапала И., Грияч П. и др. Включение макромолекул в половые клетки самцов мышей при помощи электропорации и диметилсульфоксида/ЯДитология и генетика. 1990. - Т.24. - №3. - С.3-7.

4. Богданов Ю.Ф. Ультраструктура хромосом в мейозе и синаптинемальный комплекс/Цитология и генетика мейоза. М.: Наука. -1975. - С.58-95.

5. Бочаров Ю.С. Эволюционная эмбриология позвоночных. М.: Изд-во МГУ. - 1988.-232с.

6. Галат В.В. Методы микроинъекции спермиев как инструмент вспомогательной репродукции и изучения биологии оплодотворения/Юнтогенез. 2000.- Т.31. - №1. - С.5-13.

7. Гистология/Под ред. Ю.И. Афанасьева, H.A. Юрина. М.: Медицина. - 2002. - С.673-695.

8. Глебов O.K. Генетическая трансформация соматических клеток. -Л.: Наука. 1989.-350с.

9. Гловер Д. Новое в клонировании ДНК. М.: Мир. - 1989. - 367с.

10. Грезина Н.М. Гистологические и цитологические особенности молочной железы кроликов как объекта генно-инженерных манипуляций//Автореф. дисс. . канд. биол. наук. Дубровицы. - 2004. - 21с.

11. Данилова Л.В. Сперматогонии, сперматоциты, сперматиды//В кн.: Современные проблемы сперматогенеза. М: Наука. - 1982. - С.25-72.

12. Данилова Л.В. Ультраструктурное исследование сперматогенеза. М: Наука. - 1978. - 142с.

13. Захидов С.Т. Современные достижения в исследованиях проблемы сперматогенеза/ЯТроблемы репродуктивной биологии. М. - 1998. - С.233-259.

14. Иванова М.М., Народицкий Б.С. Перспективы использования современных методов введения генетического материала в эмбрионы млекопитающих//С.-х биология. 2000. - №2. - С.3-11.

15. Коржикова C.B. Выделение, характеристика и транплантация сперматогоний типа А хряка//Автореф. дисс. . канд. биол. наук. -Дубровицы. 2002. - 19с.

16. Костерева Н.В., Коржикова C.B., Савченкова И.П. Культура сперматогенных клеток свиней//Школа-практикум: «Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных». ВИЖ. - п. Дубровицы. -2002. - В.1. - С.67-71.

17. Кузнецов A.B., Пиркова A.B., Дворянчиков Г. А. и др. Исследования переноса чужеродных генов сперматозоидами в яйцеклетки мидии Mytilus Galloprovincialis Lam.//Онтогенез. 2001. - Т.32. - №4. - С.309-318.

18. Меркурьева Е.А. и др. Генетика//М.: Агропромиздат. 1991.247с.

19. Райцина С.С. Регенерация семенников у млекопитающих//Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1956. - №9. - С.51-55.

20. Райцина С.С. Сперматогенез и структурные основы его регуляции. М.: Наука. - 1985. - 207с.

21. Райцина С.С. Травма семенника и аутоиммунитет. М.: Медицина. - 1970. - 182с.

22. Райцина С.С. Цикл сперматогенного эпителия и кинетика сперматогенеза у млекопитающих//Успехи современной биологии. 1967. -Т.63. - С.135-153.

23. Ромейс Б. Микроскопическая техника/Пер. с нем. В.Я. Александрова, З.И. Кроковой. М.: Изд.-во иностр. лит.-ры. - 1953. - 718с.

24. Рузен-Ранге Э. Сперматогенез у животных. М.: Мир. - 1980.255с.

25. Сурикова К.К. К вопросу о цитологических и гистохимических изменениях при сперматогенезе//Вестник ЛГУ. Т. 15. - 1957. - С.53-71.

26. Титова В.А. Молекулярно-генетические аспекты использования ретровирусных векторов для трансгенеза в животноводстве//Автореф. дисс. . канд. биол. наук. Дубровицы. - 2001. - 19с.

27. Хесин Р.Б. Непостоянство генома. М.: Наука. - 1984. - 471с.

28. Хэм А., Кормак Д. Гистология: Пер. с англ. М.: Мир. - 1983. -Т.5. - 296с.

29. Фалин Л.И. Развитие половых желез и происхождение половых клеток в эмбриогенезе человека//Архив анатомии, гистологии, эмбриологии. 1968.- Т.54. - №2.- С.3-27.

30. Филатов Ф.П., Тугизов Ш.М., Савченкова И.П. и др. Рекомбинантный поверхностный белок вируса гепатита В, экспонирующий иммунодоминанту мембранного белка вируса ВИЧ1//ДАН. 1992. - Т.327(1). -С. 172-175.

31. Шихов И.Я., Хамицеева М.П., Лепнов A.C. и др. Методические рекомендации по количественному определению нуклеиновых кислот в клетках и тканях сельскохозяйственных животных. Дубровицы. - 1985. -28с.

32. Эрнст Л.К., Зиновьева H.A. Молекулярно-генетические аспекты в создании и использовании трансгенных сельскохозяйственных животных//Вестник РФФИ. 2002. - №3(29). - С.56-65.

33. Adams J.M., Cory S. The Bcl-2 family: arbiters of cellsurvival//Science. -1998. V.281. - P. 1322-1326.

34. Allan D.J., Harmon B.V., Roberts S.A. Spermatogonial apoptosis has three morphologically recognizable phases and shows no circadian rhythm during normal spermatogenesis in the rat//Cell Prolif. 1992. - V.25. - P.241-250.

35. Allard E.K., Blanchard K.T., Bockelheide K. Exogenous stem cell factor (SCF) compensates for altered endogenous SCF expression in 2,5-hexanedione-induced testicular atrophy in rats//Biol. of Reprod. 1996. - V.55. -P.185-193.

36. Amann R.P. A critical review of methods for evaluation of spermatogenesis from seminal characteristics//! Androl. 1981. - V.2. - P.37-58.

37. Amann R.P. Detection of alterations in testicular and epididymal function in laboratory animals//Environ. Health Perspect. 1986. - V.70. - P. 149158.

38. Amann R.P. Sperm production rates//In: Johnson A.D., Gomes W.R., VanDemark N.L. The Testis. Academic Press, New York. 1970. - V.l. - P.433-482.

39. Archibald A.L. Molekular Biological Approaches and their Possible Aplications, in J.W. Owen and R.F.E. Axford (eds), Breeding for Disease Resistance in Farm Animals, C.A.B. International, UK. 1991. - P.100-122.

40. Arezzo F. Sea urchin sperm as a vector of foreign genetic information//Cell Biol. Int. Rep. 1989. - V.13(4). - P.391-404.

41. Arruda V.R., Fields P.A., Milner R., Wainwright L. et al. Lack of germline transmission of vector sequences following systemic administration of recombinant AAV-2 vector in males//Mol. Ther. 2001. - V.4. - P.586-592.

42. Aslam I., Fishel S., Moore H., Dowell K., Thornton S. Fertility preservation of boys undergoing anti-cancer therapy: a review of the existing situation and prospect for the future//Human Reproduction. 2000. - V.l5. -P.2154-2159.

43. Bachiller D., Schellander K., Peli J. et al. Liposome-mediated DNA uptake by sperm cells//Mol. Reprod. Dev. 1991. - V.30(3). - P. 194-200.

44. Baumer M., Patzelt D. Protamine mRNA as molecular marker for spermatozoa in semen stains//Int. J. Legal. Med. 2003. - V.l 17(3). - P. 175-179.

45. Behr J.P. Cene transfer with synthetic cationic amphiphiles: Prospects for gene therapy//Bioconjugate Chemistry. 1994. - V.5. - P.382-389.

46. Bellve A.R., Cavicchia J.C., Millette O'Brien D.A., Bhatnager Y.M., Dym M. Spermatogenic cells of the prepubertal mouse: isolation and morphological characterization//.!, of Cell Biology. 1977. - V.74. - P.68-85.

47. Berardino M., Hoffher M. Development and chromosomal constitution of nuclear transplants derived from male germ cells//J. of Exper. Zoology. 1976. - V.176( 1). - P.61-72.

48. Berndtson W.E., Desjardins C. The cycle of the seminiferous epithelium and spermatogenesis in the bovine testis//Am. J. Anat. 1974. - V.140. - P. 167-180.

49. Besmer P., Murphy J.E., George P.C. et al. A new acute transforming feline retrovirus and relationship of its oncogene v-kit with the protein kinase gene family//Nature. 1986. - V.320. - P.415-421.

50. Besmer P., Snyder H.W., Murphy J.E. et al. The Perodi-Irgens feline sarcoma virus have homologous oncogenes, but in different contents of the viral genome//J. Virol. 1983. - V.46. - P.606-613.

51. Beumer T.L., Roepers-Gajadien H.L., Gaderman I.S., Lock T.M.T.W., Kal H.B., Dirk de Rooij D.G. Apoptosis regulation in the testis: involvement of Bcl-2 family members//Mol. Reprod. and Devel. 2000. - V.56. -P.353-359.

52. Beumer T.L., Roepers-Gajadien H.L., Gaderman I.S., van Buul P.P.W., Gil-Gomez G. et al. The role of the tumor suppressor p53 in spermatogenesis//Cell Death. Differ. 1998. - V.5. - P.669-677.

53. Blanchard K.T., Boekelheide K. Adenovirus-mediated gene transfer to rat testis in vivo//Biol. Reprod. 1997. - V.56. - P.495-500.

54. Boulo V., Cadoret J.P., Le Marrec F. et al. Transient expression of luciferarase reporter gene after lipofection of oyster (Crassostrea gigas) primary cell cultures//Mol. Marine Biol. Biotech. 1996. - V.5(3). - P. 167-174.

55. Braskett B.G., Baranska W., Sawicki W. et al. Uptake of heterologous genome by mammalian spermatozoa and its transfer to ova through fertilization//Proc. Natl. Acad. Sci. 1971. - V.68. - P.353-357.

56. Brinster R.L., Avarbock M.R. Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation//Proc. Natl. Acad. Sci. -1994a.- V.91. P.l 1303-11307.

57. Brinster R.L., Nagano M. Spermatogonial stem cell transplantation, cryopreservation and culture//Semin. Cell. Dev. Biol. 1998. - V.9(4). - P.401-409.

58. Brinster R.L., Sandgren E.P., Behringer R.R., Palmiter A.F. No simple solution for making transgenic mice. 1989. - V.59. - P.239-241.

59. Brinster R.L., Zimmerman W. Spermatogenesis following male germ-cell transplantation//Developmental biology. 1994b. - V.91. - P.l 129811302.

60. Brokelmann J. Fine structure of germ cells and Sertoli cells during the cycle of the seminiferous epithelium in the rat//Ztschr. Zellforsch. 1963. -Bd.59. - S.820-850.

61. Bucci L.R., Brock W.A., Johnson T.S., Meistrich M.L. Isolation and biochemical studies of enriched populations of spermatogonia and early spermatocytes from rat testis//Biology of Reproduction. 1986. - V.34. - P. 195206.

62. Cadoret J.P., Gendreau S., Delecheneau J.M. et al. Microinjection of bivalve eggs: application in genetics//Mol. Marine Biol. Biotech. 1997b. - V.6(l). - P.72-77.

63. Capecchi M.R. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells//Cell. 1980. - V.22(27). -P.9139-9143.

64. Capecchi R.L. Science. 1989. - V.244. - P. 1288-1292.

65. Capel B. The battle of the sexes//Mechanisms of Development. -2000.-V.92.-P.89-103.

66. Castrillon D.H., Quade B J., Wang T.Y., Quigley C., Crum C.P. The human VASA gene is specifically expressed in the germ cell lineage//Proceedings National Academy of Sciences. 2000. - V.97. - P.9585-9590.

67. Castro F.O. et al. Introduction of foreign DNA into the spermatozoa of farm animals//Theriogenology. 1990. - V.34. - P. 1099-1110.

68. Chen C., Okayama H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA//Mol. and Cell. Biol. 1987. - V.8(8). - P.2745-2752.

69. Clermont Y. Kinetics of spermatogenesis in mammals: Seminiferous epithelium cycle and spermatogonial renewal//Physiol. Rev. 1972. - V.52. -P. 198-236.

70. Clermont Y. The cycle of the seminiferous epithelium in man//Am. J. Anat.- 1963. V.112. - P.35-51.

71. Clermont Y. Two classes of spermatogonial stem cells in thr monkey (Cercopithecus aethiops)//Am. J. Anat. 1969. - V.126. - P.57-72.

72. Clermont Y., Bustos-Obregon E. Re-examination of spermatogonial renewal in the rat by means of seminiferous tubules mounted «in toto»//American J. of Anatomy. 1968. - V.122. - P.237-247.

73. Clermont Y., Heimo L. Spermatogonial stem cells and their behavior in the seminiferous epithelium of rats and monkeys//In: Stem cells of renewing cell populanions//Acad. Press. 1976a. - P.273-287.

74. Clermont Y., Mauger A. Effect of a spermatogonial chalone on the growing rat testis//Cell and Tissue Kinetics. 1976b. - V.9. - P.99-104.

75. Clouthier D.E., Avarbock M.R., Maika S.D., Hammer R.L. Rat spermatogenesis in mouse testis//Nature. 1996. - V.381. - P.418-421.

76. De la Fuente J., Castro F.O., Hernandez O. et al. Sperm mediated foreign DNA transfer experiments in different species//Presented at Biotech. USA, Ramada Renaissance Tech. Wored. Washington, DC. - November 27-29. - 1990. - P.247-262.

77. De Miguel M.P., Cheng L., Holland E.C., Federspiel M.J., Donovan P.J. Dissection of the c-kit signaling pathway in mouse primordial germ cells by retroviral-mediated gene transfer//PNAS. 2002. - V.99. - P. 10458-10463.

78. De Miguel M.P., de Boer-Brouwer M., Paniagua R., et al. Leukemia inhibitory factor and ciliary neurotropic factor promote the survival of Sertoli cells and gonocytes in a coculture system//Endocrinology. 1996. - V.137. - P. 18851893.

79. De Miguel M.P., Donovan P.J. Determinants of Retroviral-Mediated Gene Delivery to Mouse Spermatogonia//Biol. of Reprod. 2003. - V.68. - P.860-866.

80. De Rooij D.G. Proliferation and differentiation of spermatogonial stem cells//Reproduction. 2001. - V.121. - P.347-354.

81. De Rooji D.G., Grootegoed J.A. Spermatogonial stem cells//Curr. Opin. Cell Biol. 1998. - V.10. - P.694-701.

82. De Rooij D.G., Rüssel L.D. All yor wanted to know about spermatogonia but were afraid to ask//J. of Andrology. 2000. - V.21. - P.776-798.

83. De Rooij D.G., van Dissel-Emiliani F.M.P. regulation of proliferation and differentiation of stem cells in the male germ line//Stem Cells. 1997. - P.283-313.

84. Dirami G., Ravindranath N., Jia M.C., Dym M. Isolation and culture of immature rat type A spermatogonial stem cells in signal transduction in testicular cells//In Basic and Clinical Aspects. 1996. - P. 141-165.

85. Dirami G., Ravindranath N., Pursei V., Dym M. Effects of ctem cell factor and granulocyte macrophage-colony stimulating factor on survival of porcine type A spermatogonia cultured in KSOM//Biol. Reprod. 1999. - V.61. -P.225-230.

86. Dobrinski I., Avarbock M.R., Brinster R.L. Germ cell transplantation from large domestic animals into mouse testes//Molecular Reproduction and Development. 2000. - V.57(3). - P.270-279.

87. Dobrinski I., Avarbock M.R., Brinster R.L. Transplantation of germ cells from rabbits and dogs into mouse testes//Biol. Reprod. 1999a. - V.61. -P.1331-1339.

88. Dolci S., Pesce M., Felici M. de. Combined action of stem cell factor, leukemia inhibitory factor and cAMP on in vitro proliferation of mouse primordial germ cells//Mol. Reprod. Dev. 1993. - V.35 - P. - 134-139.

89. Dym M., Clermont Y. Effects of x-rays on type A spermatogonia in the rat//Anat. Rec. 1967. - V.157 - P.238.

90. Dym M., Clermont Y. Role of the spermatogonia in the repair of the seminiferous epithelium following X-irradiation of the rat testis//Amer. J. Anat. -1970.-V. 128.-P.265-282.

91. Dym M., Jia M.-C., Dirami G., Price J.M. Expression of c-kit receptor and its autophosphorylation in immature rat type A spermatogonia//Biology of reproduction. 1995 - V.52. - P.8-19.

92. Ewing L.L., Davis J.C., Zirkin B.R. Int. Rev. Physiol. 1980. - V.22.- P.41-115.

93. Fechheimer M., Boylan J.F., Parker S. Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. - V.84. - P.8463-8467.

94. Feng L.X., Ravindranath N., Dym M. Stem cell factor/c-kit up-regulates cyclin D3 and promotes cell cycle progression via the phosphoinositide 3-kinase/p70 S6 kinase pathway in spermatogonia//!. Biol. Chem. 2000. - V.275.- P.25572-25576.

95. Forster W., Neumann E. Gene transfer by electroporation//In: Electroporation and electrofusion in cell biology/Press. New York and London. -1989. P.299-318.

96. Franca L.R., Ogawa T., Avarbock M.R., Brinster R.L., Russell L.D. Germ cell genotype controls cell cycle during spermatogenesis in the rat//Biol. Reprod. 1998. - V.59(6). - P. 1371-1377.

97. Fransolini M. et al. Evidence for nuclear internalization of exogenous DNA into mammalian sperm cells//Mol. Reprod. and Dev. 1993. - V.34. - P. 133139.

98. Gahne M.B., Pothier F., Sirard M.A. Electroporation of bovine spermatozoa to carry foreign DNA in oocytes//Mol. Reprod. Dev. 1991. - V.29. -P.6-15.

99. Gandolfi F. Spermatozoa, DNA binding and transgenic animals//Trasgenic Research. 1998. - V.7. - P. 147-155.

100. Gendreau S., Lardans V., Cadoret J.P., Mialhe E. Transient expression of a luciferase reporter gene after ballistic introduction into Artemia franciscana (Crustacea) embrios//Aquaculture. 1995. - V.133. - P.199-205.

101. Godin I., Deed R., Cooke J. et al. Effects of the steel gene product on mouse primordial germ cells in culture//Nature. 1991. - V.352. - P.807-809.

102. Gruendbaum J., Revel E., Yarns S., Fainsod A. Sperm cells as vectors for generation of transgenic chickens//J. Cell Biochem. 1991. - Suppl.15. - P. 194.

103. Hadley M.A., Byers S.W., Suarez-Quian C.A., Kleinman H.K., Dym M. Extracellular matrix regulates Sertoli cell differentiation, testicular cord formation, and germ cell development in vitro//J. of Cell Biology. 1985. - V.101. - P.1511-1522.

104. Haneji T., Koide S.S., Nishimune Y., Oota Y. Dibutyryl adenosine cyclic monophosphate regulates differentiation of type A spermatogonia with vitamin A in adult mouse cryptorchid testis in vitro//Endocrinology. 1986. -V.l 19. - P.2490-2496.

105. Haneji T., Koide S.S., Tajima Y., Nishimune Y. Differentia. effects of epidermal growth factor on the differentiation of type A spermatogonia in adult mouse cryptorchid testes in vitro//J. Endocrinol. 1991. - V.128. - P.383-388.

106. Haneji T., Tibell A., Switzer W.M., Sandstrom P., Rosales G.V. et al. No evidence of infection with porcine endogenous retrovirus in recipients of porcine islet-cell xeno-grafts//Lancet. 1998. - V.352. - P.695-699.

107. Hannah-Alava A. Premeiotice studies of spermatogenesis//Adv. Genet. 1965.-P.157-226.

108. Hara T., Tamura K., de Miguel M.P., et al. Distinct roles of oncostatin M and leukemia inhibitory factor in the development of primordialgerm cells and Sertoli cells in mice//Dev. Biol. 1998. - V.l. - P.144- 153.

109. Hasthorpe S., Barbie S., Farmer P.J., Hutson J.M. Growth factor and somatic cell regulation of mouse gonocyte-derived colony formation in vitro//J. of Reproduction and Fertility. 2000 . - V.l 19. - P.85-91.

110. Hasthorpe S., Barbie S., Farmer P.J., Hutson J.M. Neonatal mouse gonocyte proliferation assayed by an in vitro clonogenic method//J. of Reproduction and Fertility. 1999. - V.l 16. - P.335-344.

111. Heckert L.L., Griswold M.D. Expression of follicle-stimulating hormone receptor mRNA in rat tesyes and Sertoli cells//Molecular Endocrinology. 1991. - V.5. - P.670-677.

112. Heller C.G., Clermont Y. Kinetics of the germinal epithelium in man//Recent Progr. Hormone Res. 1964. - V.20. - P.545-571.

113. Hericson B., Backstrom L. Translocation heterozygoty in a boar//Herditas. 1964. - V.52. - P. 166-170.

114. Higashi T., Sasai H., Suzuki F. Hamster cell line suitable for transfection assay of transforming genes//Proc. Natl. Sei. 1990. - V.87. - P.2409-2413.

115. Hochi S., Ninomiya T., Mizuno A., Honma M., Yuki A. Fate of exogenous DNA carried into mouse eggs spermatozoa//Anim. Biotech. 1990. -V.l. - P.21-31.

116. Hochreau R. M.-T. de., Lincoln G.A. Seasonal variation in the red deer, Cervus elaphus//J. Reprod. Fertil. 1978. - V.54. - P.209-213.

117. Holstein A.F. Organisation und Regulation der Gametenreifung//HVBG. 1999. - V.4. - P. 15-30.

118. Honaramooz A., Megee S., Dobrinski I. Germ cells transplantation in pigs.-2001.-P. 1233-1247.

119. Huckins C. Cell cycle properies of differentiating spermatogonia in adult Spraque-Dawley rats//Cell and Tissue Kinet. 1971a. - V.4. - P. 139-154.

120. Huckins C. The morphology and kinetics of spermatogonial degeneration in normal adult rats: an analysis using a simplified classification ofthe germinal epithelium//Anat. Rec. 1978. - V.190. - P.905-926.

121. Huckins C. The spermatogonial stem cell population in adult rats. I. Their morphology, proliferation and maturation//Anat. Rec. 1971b. - V.169. -P.533-558.

122. Huckins C., Oakberg E.T. Morphological and quantitative analysis of spermatogonia in mouse testis using whole mounted seminiferous tubules//In the irradiated testis/Anat. Rec. 1978. - V.192. - P.529-542.

123. Huguet E., Esponda P. Foreign DNA introduced into the vas deferens is gained by mammalian spermatozoa//Mol. Reprod. Dev. 1998. - V.51(l). -P.42-52.

124. Hyttinen J.-M., Peura T., Tolvanen M., Aalto J.,Alhonen L., Sinervirta R.,Halmekyto M. Biotechnology. 1994. - V.12. - P.606-608.

125. Izadyar F., K. den Ouden, Creemers L.B., Posthuma G., Parvinen M., Dirk G. de Rooij. Proliferation and Differentiation of Bovine Type A Spermatogonia During Long-Term Culture//Biol. of Reprod. 2003. - V.68. -P.272-281.

126. Izadyar F., Spierenberg G.T., Creemers L.B., den Ouden K., Dirk de Rooij D.G. Isolation and purification of type A spermatogonia from the bovine testis//Reproduction. 2002. - V.124. - P.85-94.

127. Izadyar F., van Dissel-Emiliani F., van Pelt A., de Rooij D.G. Spermatogonial stem cell transplantation/ZMolecular and Cellular Endocrinology. -2000.-V.169.-P.21-26.

128. Jiang F.X. Behaviour of spermatogonia following recovery from busulfan treatment in the rat//Anat. Embryol. 1998. - V.198(l). - P.53-61.

129. Johnson L. Review article: spermatogenesis and aging in the human//J. Androl. 1986. - V.7. - P.331-354.

130. Johnson L. Spermatogenesis//Reproduction in Domestic Animals (4th edn. Academic Press, New York. 1991. - P. 173-219.

131. Johnson L., Lebovitz R.M., Samson W.K. Germ cell degeneration in normal and microwave-irradiated rats: potential sperm production rates at different developmental steps in spermatogenesis//Anat. Rec. 1984a. - V.209. - P.501-507.

132. Johnson L., Petty C.S., Neaves W.B. A new approach to quantification of spermatogenesis and its application to germinal cell attrition during human spermiogenesis//Biol. Reprod. 1981. - V.25. - P.217-226.

133. Johnson L., Petty C.S., Porter J.C., Neaves W.B. Germ cell degeneration during postprophase of meiosis and serum concentrations of gonadotropins in young adult and older adult men//Biol. Reprod. 1984b. - V.31. -P.779-784.

134. Johnson L., Varner D.D., Roberts M.E., Smith T.L., Keillor G.E., Scrutchfield W.L. Efficiency of spermatogenesis: a comparative approach//Anim. Reprod. Sci. 2000. - V.60-61. - P.471-480.

135. Johnson L., Wilker C.E., Cerelli J.S. Spermatogenesis in the bull//Tech. Conf. Artif. Insem. Reprod. 1994. - V.15. - P.9-27.

136. Kangasniemi M., Kaipia A., Toppari J., Perheentupa A., Huhtaniemi I., Parvinen M. Cellular regulation of FSH binding in rat seminiferous tubules//J. of Andrology. 1990. - V.l 1. - P.336-343.

137. Kennelly J. J., Foote R.H. Sampling boar testes to study spermatogenesis quantitatively and to predict sperm production//J.Anim. Sci. -1964.-V.23.-P.160-167.

138. Keulen C.J.G., Rooij M.F. de. The recovery from various gradations of cell loss in the mouse seminiferous epithelium and its implications for the spermatogonial cell renewal theory//Cell and tissue kinet. 1974. - V.7. - P.549-558.

139. Khoo H.-W., Patil J., Chen E. Sperm-mediated gene transfer: a review//SEAMEO Jasper Fellowship Monograph 1993 Seriesl. 1993. - P.75-92.

140. Kietsvenbaum A. Mammalian spermatogenesis in vivo and somatic cell lineages//End. Rev. 1994. - V.15. - P.l 16-134.

141. Kim J.H., Jung-Ha H.S., Lee H.T. et al. Development of a positive method for male stem cell-mediated gene transfer in mouse and pig//Mol. Reprod. Dev. 1997. - V.46. - P.515-526.

142. Kimura T., van Keymeulen A., Golstein J. et al. Regulation of thyroid cell proliferation by TSH and other factors: a critical evaluation of in vitro models//Endocrine Reviews. 2001. - V.22. - P.631-656.

143. Klein T.M., Wolf E.D., Wu R. High velocity microprojectiles for delivering nuclei acids into living cells//Nature. 1987. - V.327. - P.70-73.

144. Lauria A., Gandolfi F. Recent advances in sperm cell mediated gene transfer//Mol. Reprod. Dev. 1993. - V.36. - P.255-257.

145. Lavitrano M., Camaioni A., Fasio V.M. et al. Sperm cells as vectors for introducing foreign Dna into eggs: genetic transformation of mice//Cell. 1989. -V.57.-P.717-723.

146. Lavitrano M., Maione B., Forte E., Francolini M., Sperandio S. et al. The interaction of sperm cells with exogenous DNA a role of CD4 and major histocompatibility complex class II molecules//Exp. Cell Res. - 1997. - V.233. -P.56-62.

147. Leblond C.P., Clermont Y. Definition of the stages of the cycle of the seminiferous epithelium in the rat//Ann. Y. Acad. Sci. 1952a. - V.52. - P.548-573.

148. Leblond C.P., Clermont Y. Spermatogenesis of rat, hamster and guinea pig as revealed by the «periodic acid-fuchsin sulfurous acid» technigue//Am. J. Anat. 1952b. - V.90. - P. 167-215.

149. Maione B., Lavitrano M., Spadafora C. et al. Sperm-mediated gene transfer in mice//Mol. Reprod. Dev. 1998. - V.50(4). - P.406-409.

150. Marret C., Durand P. Culture of porcine spermatogonia: effects of purification of the germ cells, extracellular matrix and fetal calf serum on their survival and multiplication//Reprod. Nutr. Dev. 2000. - V.40(3). - P.305-319.

151. Meachem S.J., McLachlan R.I., Stanton P.G., Robertson D.M., Wreford N.G. FSH immunoneutralisation acutely impairs spermatogonial development in normal adult rats//J. of Andrology. 1999. - V.20. - P.756-762.

152. Meachem S.J., Schonfeldt V., Schlatt S. Spermatogonia: stem cells with a great perspective//Reprod. 2001. - V. 121(6). - P.825-834.

153. Meachem S.J., Wreford N.G., Stanton P.G., Robertson D.M., McLachlan R.I. FSH is important for the initial phase of spermatogenic restoration in adult rats following gonadotrophin suppression//!, of Andrology. 1998. - V.19. - P.725-735.

154. Meng X., Hyvonen M.E., Parvinen M. et al. Regulation of cell fate decision of undifferentiated spermatogonia by GDNF//Science. 2000. - V.287. -P. 1489-1493.

155. Miller D.G., Adam M.A., Miller A.D. Gene transfer by retrovirus vectors occurs only in cells that are actively replicating at the time of infection//Mol. Cell. Biol. 1990. - V.10. - P.4239-4242.

156. Morena A.R., Boitani C., Pesce M., Felici M. de, Stefanini M. Isolation of highly purified type A spermatogonia from prepubertal rat testis//J. Androl. 1996. - V.17. - P.708-717.

157. Moses M.J. Synaptinamal complex//Annu. Rev. Genet. 1968. - V.2. -P.363-412.

158. Moudgal N.R., Sairam N.R., Krishnamurthy N.H. et al. Immunization of male bonnet monkeys (M. radiata) with a recombinant FSH receptor preparation affects testicular function and fertility//Endocrinology. 1997. - V.138. - P.3065-3068.

159. Muller F., Ivies Z., Eedelyi F., Papp T.,Varadi L., Horvath L., Macleans N. Introducing foreign genes into fish eggs with electroporated sperm as a carrier//Mol. Marine Biol. Biotech. 1992. - V.l. - P.276-281.

160. Muramatsu T., Shibata O., Ryoki S., Ohmori Y., Okumura J. Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer//Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. - V.233. - P.45-49.

161. Nagano M., Avarbock M.R., Leonida E.B., Brinster C J., Brinster R.L. Culture of mouse spermatogonial stem cells//Tissue and Cell. 1998a. - V.30. -P.389-397.

162. Nagano M., Brinster R.L. Spermatogonial transplantation and reconstitution of donor cell spermatogenesis in recipient mice//APMIS. 1998. -V.l06. -P.47-55.

163. Nagano M., Brinster R.L., Orwig K.E., Ryu B.Y., Avarbock M.R., Brinster R.L. From the cover: transgenic mice produced by retrovular transduction of male germ-line stem cells//Proc. Natl.Acad. Sci. 2001. - V.98. - P. 1309013095.

164. Nagano M., Shinohara T., Avarbock M.R., Brinster R.L. Retrovirus-mediated gene delivery into male germ line stem cells//FEBS Lett. 2000. -V.475(l). - P.7-10.

165. Nakanishi A., Iritani A. Gene transfer in the chicken by sper-mediated methods//Mol. Reprod. Dev. 1993. - V.36. - P.258-261.

166. Naysmith T.E., Blake D.A., Harvey V.J., Johnson N.P. Do men undergoing sterilizing cancer treatments have a fertile future?//Human Reproduction. 1998. - V.13. - P.3250-3255.

167. Niemann H., Rath D., Wrenzycki C. Advances in biotechnology: new tools in future pig production for agriculture and biomedicine//Reprod. Domest. Anim. 2003. - V.38(2). - P.82-89.

168. Nocka K., Majumder S., Chabot B. et al. Expression of c-kit gene products in known cellular targets of W mutations in normal and W mutant mice-evidence for an impaired c-kit kinase in mutant mice//Genes Dev. 1989. - V.3. -P.816-826.

169. Norman B. Gene expression during spermiogenesis/In:Cellular and molecular events in spermiogenesis. 1987. - P. 11-13.

170. Oakberg E.F. A description of spermatogenesis in the mouse and its use in analysis of the cycle of the seminiferous epithelium and germ cell renewal//Am. J. Anat. 1956. - V.99. - P.391-413.

171. Oakberg E.F. Spermatogonial stem cell reneval in the mouse//Anat. Rec. 1971. - V.169. - P.515-532.

172. Oakberg E.F., Huckins C. Spermatogonial stem cell renewal in the mouse as revealed by H3-thymidine labeling and irradiation//In: Stem cells of renewing cell populations. 1976. - P.287-302.

173. Ogawa T., Arechaga J.M., Avarbock M.R., Brinster R.L. Transplantation of testis germinal cells into mouse seminiferous tubules//International Journal of Developmental Biology. 1997. - V.41. - P.l 11122.

174. Ogawa T., Dobrinski I., Avarbock M.R., Brinster R.L. Leuorolide, a gonadotropin-releasing hormone agonist, enhances colonization after spermatogonial transplantation into mouse testes//Tissue Cell. 1998. - V.30(5). -P.583-588.

175. Ogavva T., Dobrinski I., Avarbock M.R., Brinster R.L. Xenogeneic spermatogenesis following transplantation of hamster germ cells to mouse testes//Biol. Reprod. 1999a. - V.60. - P.515-521.

176. Ogavva T., Dobrinski I., Avarbock M.R., Brinster R.L. Transplantation of male germ line stem cells restores fertility in infertile mice//Nature Medicine. -2000. V.6. - P.29-34.

177. Ogawa T., Dobrinski I., Brinster R.L. Recipient preparation is critical for spermatogonial transplantation in the rat//Tissue Cell. 1999b. - V.31. - P.461-472.

178. O' Hare M.J., Ormerod M.G., Imrie P.R. Electropremeabilization and electrosensitivity of different types of mammalien cells//In: Electroporation & electrofusion in cell biology. 1989. - P.319-330.

179. Ohbo K., ,Yoshida S., Ohmura M. et al. Identification and characterization of stem cells in prepubertal spermatogenesis in mice small star filled//Dev. Biol. 2003. - V.258(l). - P.209-225.

180. Ohta H., Yomogida K., Dohmae K., Nishimune Y. Regulation of proliferation and differentiation in spermatogonia stem cells: the role of c-kit and its ligand SCF//Development. 2000a. - V.127. - P.2125-2131.

181. Ohta H., Yomogida K., Yamada S., Okabe M., Nishimune Y. Realtime observation of transplanted «green germ cells»: proliferation and differentiation of stem cells//Development Growth and Differentaition. 2000b. -V.42. - P. 105-112.

182. Orsi A.M., Ferreira A.L. Definition of the stages of the cycle of the seminiferous epithelium of the opossum//Acta anat. 1978. - V.100. - P. 153-160.

183. Ortavant R. Action de la duree d* eclairment sur les processus spermatogenetuques chez le Bolier//C. r. Soc. Boil. 1956. - V.150. - P.471-474.

184. Ortavant R. Spermatogenesis and morphology of spermatozoon//In: Reproduction in domestic animals. 1959. - V.7. - P. 1-51.

185. Parreira C.G., Ogawa T., Avarbock M.R., Franca L.R., Brinster L.R., Russel L.D. Development of germ cell transplants in mice//Biology of

186. Reproduction. 1998. - V.59. - P.1360-1370.

187. Passoni L., Mauri L., Luciano A., Pocar P., Ajmone-Marsan. et al. Sperm cells mediated gene transfer: presence of foreign DNAinto bovine blastocyst obtained from in vitro fertilization//A preliminary report. 1995. -P.427-428.

188. Perry A.C., Wakayama T., Kishikawa H. et al. Mammalian transgenesis by intracytoplasmic sperm injection//Science. 1999. - V.284 (5417). -P.l 180-1183.

189. Potten C.S., Loeffler M. Stem cells: attributes, cycles, spirals, pitfalls and uncertainties//Lessons for and from the crypt. 1990. - V.l 10. - P. 1001-1020.

190. Potter H. Molecular genetic applications of electroporation//In: Electroporation & electrofusion in cell biology. 1989. - P.331-341.

191. Pursel, V.G., Pinkert, C.A., Miller, K.F., Bolt, D.J.,Campbell, R.G., Palmiter, R.D., Brinster, R.L., Hammer R.E. Science. 1989. - V.244. - P. 12811288.

192. Radford J.A., Shalet S.M., Lieberman B.A. Fertility after treatment for cancer//British Medical Journal. 1999. - V.319. - P.935-936.

193. Rassoulzadegan M., Binetruy B., Gusin F. High frequency of gene transfer after fusion between bacteria and eukaryotic cells//Nature. 1982. - V.295. - P.257-259.

194. Regaud C. Etude sur la structure des tubes seminiferes et sur la spermatogenese chez les Mammiferes//Arch. anat. microsc. et morphol. exp. -1901.- V.4.-P.231-280.

195. Reis M.M., Tsai M.C., Schlegel P.N., Feliciano M., Raffaelo R., Rosenwaks Z., Palermo D. Xenogeneic transplantation of human spermatogonia//Zygote. 2000. - V.8. - P.97-105.

196. Rex A. Hess. Spermatogenesis//Biol. Reprod. 1999. - V.4. - P.539545.

197. Robertson E.J. Using embryonic stem cell to introduce mutations into the mouse germ line//Biol. Reprod. 1991. - V.44. - P.238-245.

198. Rodriguez A., Castro F. O., Guillen J. et al. Exogenous cloned DNA can penetrate living sperm cells//Advances in Gene Technology: Feeding the World in the 21st Century. 1991. - P.53.

199. Roosen-Runge E.C. The process of spermatogenesis in Animals//Cembridge Univ. Press. 1977. - P.326-335.

200. Roosen-Runge E.C. The process of spermatogenesis in mammals//Biol. Rev. 1962. - V.37. - P.343.

201. Roosen-Runge E. Untersuchungen über die Degeneration samenbilden der Zellen in der normales Spermatogenese der Ratte//Zeit. Zellfarsch. 1955. -B.41. - S.221-235.

202. Roosen-Runge E.C, Giesel L.O. Quantitave studies on spermatogenesis in the abbino rat//The Amer. J. Anat. 1950. - V.87(l). - P.l-30.

203. Rose J.K., Buonocore L. and Whitt M.A. A new cationic liposome reagent mediating nearly quantitative transfection of animal cells//Biotechniques. -1991.- V.10.-P.520-525.

204. Rossi P., Dolci S., Albanesi C., Ricca R., Geremia R. Follicle-stimulating hormone induction of steel factor (SLF) mRNA in mouse Sertoli cells and stimulation of DNA synthesis in spermatogonia by soluble SLF//Dev. Biol. -1993.-V.155.-P.68-74.

205. Rossi P., Marziali G., Albanesi C. et al. A novel c-kit transcript, potentially encoding a truncated receptor, originates within a kit gene intron in mouse spermatids//Dev. Biol. 1992. - V.152. - P.203-207.

206. Roth E., Smidt D. Untersuchungen zur Keimdrusenentwicklung bei mannlichen Veredelten Landschweinen//Zuchtungs künde. 1970. - B.2. - S.144-160.

207. Rottman O., Antes R., Hofer P., Maierhofer G. Liposomemediated gene transfer via spermatozoa into avian egg cells//J. Anim. Breed. Genet. 1991. -V.109. - P.64-70.

208. Rottman O., Hoffer P. A method for transferring organic and inorganic substances to egg cells and somatic cells of animals and composition for use therein//World patent WO 87/05325. 11.09.1987. P.227-236.

209. Russel L.D., Ettlin R.A., Hikim A.P., Clegg E.D. Histological and Histopathological Evoluation of the Testis//Cache River Press. 1990. - P. 1-40.

210. Russell L.D., Franca L.R., Brinster R.L. Ultrastructural observations of spermatogenesis in mice resulting from transplantation of mouse spermatogonia//.!. Androl. 1996. - V.17(6). - P.603-614.

211. Ruysschaert J.-M., Ouahabi A., Willeaume V. A novel cationic amphiphile for transfection of mammalian cells//Biochem. and Bioph. Res. Comm. 1994. - V.203(3). - P. 1622-1628.

212. Sato M., Iwase R., Kasai K., Tada N. Direct injection of foreign DNA into mouse testis as a possible alternative of sperm-mediated gene transfer//Animal Biotechnology. 1994. - V.5(l). - P. 19-31.

213. Schlatt S., Rosiepen G., Weinbauer G.F., Rolf C., Brook P.F., Nieschlag E. Germ cell transfer into rat, bovine, monkey and human testes//Human Reproduction. 1999a. - V.14. - P. 144-150.

214. Schlatt S., von Schonfeldt V., Schepers A.G. Male germ cell transplantation: an experimental approach with a clinical perspective//British Medical Bulletin. 2000. - V.56. - P.824-836.

215. Schlatt S., Zhengwei Y., Meehan T., de Kretser D.M., Loveland K.L. Application of morphometric techniques to postnatal rat testes in organ culture: insights into testis growth//Cell and Tissue Research. 1999b. -V.298. - P.335-343.

216. Schrans-Stassen B.H., van de Kant H.J., de Rooij D.G., van Pelt A.M. Differential expression of c-kit in mouse undifferentiated and differentiating type A spermatogonia//Endocrinology. 1999. - V.l40. - P.5894-5900.

217. Seidel G. Embryo transfer: the next 100 years//Theriogenology. -1991. V.35(l). - P.171-180.

218. Seidel G. Production of genetically identical sets of Mammals: Cloning//! Exp. Zool. 1983. - V.2. - P.228.

219. Shamblott M.J., Axelman J., Wang S. et al. Derivation of pluripotent stem cells from cultured human primordial germ cells//Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1998. V.95. - P. 13726-13731.

220. Shennawy E.I., Gates R.J., Russel L.D. Hormonal regulation of spermatogenesis in the hypophysectomized rat: cell viability after hormonal replacement in adults after intermediate periods of hypophysectomy//J. of Andrology. 1998. - V.19. - P.320-334.

221. Shinohara T., Brinster R.L. Enrichment and transplantation of spermatogonial stem cells//Int. J. Androl. 2000. - V.23. - P.89-91.

222. Singwi M.S., Lall S.B. Spermatogenesis in the non-scrotal bat Rhinopoma kinneari Wrongton//Acta anat. 1983. - V.l 16. - P. 136-145.

223. Spadafora C. Sperm cells and foreign DNA: a controversial relation. Bioassays. 1998. - P.302-324.

224. Sperandio S., Lulli V., Bacci M., Forni M., Maioni B. et al. Spermmediated DNA transfer in bovine and swine species//Anim. Biotech. 1996. - V.7.- P.59-77.

225. Stewart C.L. Stem cells from primordial germ cells can reenter the germ line//Dev. Biol. 1994. - V.161. - P.626-628.

226. Sugiyama N., Obinata M., Matsui Y. BCL-2 inhibits apoptosis of spermatogonia and growth of spermatogenic stem cells in a cell-intrinsic manner//Mol. Reprod. And Development. 2001. - V.58. - P.30-38.

227. Swierstra E.E., Foote R.H. Cytology and kinetics of spermatogenesis in the rabbit//J. Reprod. Fertil. 1963. - V.5. - P.309-322.

228. Swierstra E.E., Gebauer M.R., Pickett B.W. Reproductive physiology of the stallion: I. Spermatogenesis and testis composition//J. Reprod. Fertil. 1974.- V.40.-P.113-123.

229. Takai T., Ohmori H. DNA transfection of mouse lymphoid cells by the combination of DEAE-dextran-mediated DNA uptake and osmotic shock procedure//Bioch. and Biophs. Acta. 1990. - V.1048. - P. 105-109.

230. Tan J.C., Nocka K., Ray P., Traktman P., Besmer P. The dominant W42 spoting phenotype results from a missence mutation in the c-kit receptor kinase//Science. 1990. - V.247. - P.209-212.

231. Tegelenbosch R.A., de Rooij D.G. A quantitative study of spermatogonial multiplication and stem cell renewal in the C3H/101F1 hybrid mouse//Mutation Research. 1993. - V.290. - P. 193-200.

232. Totzke F., Marme D., Hug H. Inducible expression of human phospholipase C-V2 and its activation by platelet-derived growth factor A-chain homodimer in transfected NIH3T3 fibroblasts//Eur. J. Biochem. 1992. - V.203. -P.633-639.

233. Tsai H.J., Lai C.H., Yang H.S. Sperm as a carrier to introduce an exogenous DNA fragment into the oocyte of Japanese abalone (Haliotis divorsicolor suportexta)//Transgenic Res. 1997. - V.6(l). - P.85-95.

234. Uckert W., Walther W. Retro virus-mediated gene transfer in cancer therapy//Pharmac. Ther. 1994. - V.63. - P.323-247.

235. Van der Kooy D., Weiss S. Why stem cells?//Science. 2000. - V.287.- P.1439-1441.

236. Van der Wee K., Johnson E.W., Dirami G., Dym M., Hofmann M.C. Immunomagnetic isolation and long term culture of mouse type A spermatogonia//J. of Andrology. 2001. - V.22. - P.697-704.

237. Van Pelt A.M.M., Morena A.R., Van Dissel-Emiliani F.M.F., Boitani C., Gaemers I.C., de Rooij D.G., Stefanini M. Isolation of the synchronized A spermatogonia from adult vitamin A-deficient rat testes//Biology of Reproduction.- 1996. V.55. - P.439-444.

238. Vergouwen R.P., Jacobs S.G., Huiskamp R., Davids J.A., de Rooij D.G. Proliferative activity of gonocytes, Sertoli cells and interstitial cells during testicular development in mice//J. Reprod. Fertil. 1991. - V.93. - P.233-243.

239. Von Schonfeldt V., Krishnamurthy H., Foppiani L., Schlatt S. Magnetic cell sorting as a fast and afficient method of enriching viable spermatogonia from rodent and primate testes//Biology of Reproduction. 1999. -V.61. - P.582-589.

240. Watt F.M., Hogan B.L. Out of Eden: stem cells and their niches//Science. 2000. - V.287. - P. 1427-1430.

241. Wheeler M.B. Development and validation of swine embryonic stem cells: a review//Reprod. Fertil. Dev. 1994. - V.6. - P.563-568.

242. Wreford N.G. Theory and practice of stereological techniques applied to the estimation of cell number and nuclear volume in the testis//Microscopy Research and Technique. 1995. - V.32. - P.423-436.

243. Wrobel K.H. Prespermatogenesis and spermatogoniogenesis in the bovine testis//Anatomy and Embryology. 2000. - V.202. - P.209-222.

244. Xie T., A.C. Spradling. A niche maintaining germ line stem cells in the Drosophila ovary//Science. 2000. - V.290. - P.328-330.

245. Yamazaki Y., Fujimoto H., Ando H. et al. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells by deoxyribonucleic acid injection into seminerous tubules and subsequent electroporation//Biol. Reprod. 1998. - V.59. - P. 14391444.

246. Yamazaki Y., Yagi T., Ozaki T., Imoto K. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a marker//J. Exp. Zool. 2000. - V.286(2). - P.212-218.

247. Yarden Y., Kuang W.-J.,Yang-Feng N. et al. Human proto-oncogene c-kit: a new cell surfase receptor tyrosine kinase for an unidentified ligand//EMBO J. 1987. - V.6. - P.3341-3351.

248. Yin Y., Stahl B.C., DeWolf W.C., Morgentaler A. p53-mediated germ cell quality control in spermatogenesis//Dev. Biol. 1998. - V.204. - P.165-171.

249. Yoshinada K., Nishikawa S., Ogawa M. et al. Role of c-kit in mouse spermatogenesis: identification of spermatogonia is a specific site of c-kit expression and fimction//Development. 1991. - V.113. - P.689-699.

250. Yu Z., Guo R., Ge Y. et al. Gene expression profiles in different stages of mouse spermatogenic cells during spermatogenesis//Biol. Reprod. 2003. - V.69(l).-P.37-47.

251. Zandrum B., Shettles M.D. Diploid nuclear replacement in mature human ova with cleavage//Am. J. Obstet. Gynecol. 1979. - V. 133. - P.222-224.

252. Zelenin A.V., Titomirov A.V., Kolesnikov V.A. Genetic transformation of mouse cultured cells with help of high velocity mechanical DNA-injection//FEBS Letters. 1989. - V.244. - P.65-67.

Информация о работе

Новгородова, Инна Петровна
кандидата биологических наук
п. Дубровицы, Московской обл., 2004
ВАК 03.00.23

Диссертация

Характеристика половых клеток семенников кроликов как мишеней для генно-инженерных исследований - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы