Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Влияние генотипа, условия выращивания и применения регуляторов роста в культуре пыльников пшеницы при получении исходного материала для селекции

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Влияние генотипа, условия выращивания и применения регуляторов роста в культуре пыльников пшеницы при получении исходного материала для селекции"

й о* «I &

г

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО НАРОДНА ОБРАЗОВАНИЕ

ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЫМ НАРОДОВ имени 11АТРИСА ЛУмУЫЗЫ

На правах рукописи

РАГУБОВА СУДШЕ'Г ДКАмАЛ КШЫ

ВЛИЯНИЕ ГЕНОХШ> УСЛОВИЙ ВЫРАЩИВАНИЯ И ИРИЬЕНЕНИЯ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА В КУЛЬТУРЕ ПЫЛЬНИКОВ ШИЕНИЦЫ ПРИ ПОЛУЧЕНИИ ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ

(06.01.05. - селекция и семеноводство'

Автореферат

диссертации на соискание ученой сгепени кандидата сельскохозяйственных наук

Москва - 1990 г.

•"-""" Работа выполнена на кафедре ботаники я фиводогм растени! сельскохозяйственного факультета Унвверсиета дружба ; народов ливни Патриса Луцунбы к з Научно-нсследовагельскси институте сельского хозяйства Рго-ВостокаСг.Свратов)

Научный руководитель:докмр биологических ваув, ' профессор В.В.Кефелн

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных

наук,профессор П.Ф.Кононков * ;

доктор биологических неук

В.В.Иазин - ' ,. | ■

■ ^

Ведущая организация - Главный ботавический сад АН 0ССР|-

Защита состоится * декабря 1990 года в" ' чаорв не заседании специализированного совета К 053.22.22 в Университете дружбы народов имени Патряоа Луиумбы по адресу 5113093, ' Москва ,ул.Павловская,д,8/3,ауд.228.

С диссертацией иохно ранакониться в научной библиотеке Университета друхбы народов имени Латриса Луиумбы по адресу: 117198,Москва,ул. Миклухо-Маклая,д.6. ;

^Автореферат разослан

Ш.13

" ноября 1990 г.

Ученый секретарь специализированного'совета кандидат биологических наук

А.Н;Лукьпненко

Актуальность проблемы. В современных условиях наблюдается обеднение генофонда, что ограничивает возможности селекции, посхольку успехи ее в значительной степени зависят от богатства и разнообразия генофонда. В связи с этим актуальное значение приобретает разработка методов, способствующих увеличению . частоты л спектра новообразований и ускоряющих процесс получения гомозиготных форм с комплексом хозяйственно-ценных признаков. Одним из таких методов является метод культуры пыльников.

Достижения культуры пыльников и развитие успехов горыоно-логии предоставили селекции уникальную возможность получать исходный материал при создании более высокопродуктивных сортов и гибридов. Метод культуры пыльников позволяет изучить свойства партнеров с п - набором хромосом (гаплоиды). Гаплоиды, полученные методом культуры пыльников, стали объектом как генетических (обнаружение сцепления и взаимодействия генов, оценка генетической изменчивости количественных призн • ков), так и физиологических исследований ( Loo et al., 1985). Одним из достоинств культуры пыльников является регенерация ■ растений из растений' со стерильной пыльцой, которая позволяет сохранять генетический и видовой фонд диких и культурных растений, размножать полученные ценные формы растении, ранее не -существовавшие в природе ( Picard , 1982).

Кроне того, возможность культивирования 'пыльников ускоряла ход селекционных процессов. При этом сроки создания новых сортов сократились с 8-12 лет до 4-5 лет, что делает обсуждаемую проблему особенно актуальной (Лукьянюк, 1983; Anonymoue , 1976; lellte , 1985).

Цели и задачи работы. X. Найти возможные пути соверщенст-вования приемов получения андрогенетических регенерантов (гаплоидов); 2. Выяснить некоторые закономерности морфогенеза в культуре пыльников пшеницы.

Для достижения указанных целей необходимо было решить следующие задачи: I. С целью ускоренного получения гомозиготных линий изучить влияние генотипа на процесс регенерации растений из пыльников пшеницы; 2. Изучить влияние регуляторов роста на интенсивность и направленность индукции регенерантов из пыльников пшеницы; 3. Изучить влияние условий выращивания донорных растений на андрогенетический потенциал и выход регенерантов в культуре пыльников пшеницы; Л. Изучить влияние раз-

личных сочетаний генотипа, условий выращивания и регуяяторо» роста на пути регенерации гаплоидов в культуре пыльников, пшеницы.

Научная новизна. Установлен дифференцированный эффект 6-5ЛЛ щ 2,4-Д на индукции зеленых регенерантов из пыльников, чгопоз-

• воляет значительно ускорить процесс получения гомозиготных . линий в селекции пшеницу.

Установлена зависимость регенерации гаплоидов из пыльников пшеницы от сроков посева доаорных растений. ;

Впервые показано, что в условиях поздних сроков посева растений-доноров в поле (шшь месяц) продуктивность пыльни-? ' ков и индукция регенерантов из пыльников' била одинакова о интенсивностью этих процессов в тепличных условиях. 1 : Практическая ценность. Получены 42 гомозиготные линии яровой мягкой пшеницы, которые переданы в лабораторию селекции и семеноводства яровой пшеницы НИИСХ Сго-Бостока для изучения ¡10 ванным хозяйственно-ценны« признакам.

Установлены оптимальные сроки для выращивания доноров, ■ которые позволяют подучить максимальное число гаплоидных рас-

• / тений. '

Для культивирования пыльников пшеницы наиболее пригодной является картофельная питательная среда РОТАТО-П со следующими дозами и сочетаниями гормонов:

1) для менее отзывчивых генотипов (Саратовская 29) -2,4-Д - 2,0 мг/л; "' ' '

2) для высокоогзывчивого генотипа (семья 35/84) -2,4-Д - 2,0 мг/л и 6-бензилаыинопурин - 0,3 мг/л. Апробация работы. Материалы диссертации долохены на Научной конференции молодых ученых (Москва, 1988), на II конференции

;; научно-учебного центра физико-химических методов исследования '•'■(Москва, 1989), на ГУ конференции молодых ученых (Пущине, 1988). По теме диссертации опубликовано 4 работы. ' ^Структура и объем работы. Диссертация состоит из шести глав, : % в которых приведены: обзор литературы и методов исследования, а также основные результаты и их обсуждение, выводы. Работа , изложена на,^ страницах машинописного текста, содержит 15 таблиц, 18 иллюстраций. Список литературы включает м о ис~ • точников, в том числе 16$, иностранйых авторов.

' т

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В экспериментах по изучении влияния генотипа, регуляторов росте и условий выращивания на интенсивность регенерации гаплоидов из пыльников были изучены различные генотипы пшеницц из. коллекции НИИСХ Юго-Востока (г.Саратов) и отобраны сорт Саратовская 29 и сеиья (или линия) 35/8*4, различающиеся по продуктивности пыльников.

Сорт Саратовская 29 получен методом сложной ступенчатой гибридизации от скрещивания Альбидуы 24 х Люгесценс 55/11. Это самый пластичный сорт яровой пшеницы. В 1973 г. он возделывал-ся в СССР на площади более 18,млн.га.

Семья 35/84 получена на Ершовской опытной станции (селек- ■ ционер Козлов D.i.) от скрещивания Jnia 66 х Кавказ. Форма крупноколосая, многоцветковая. Из-за позднеспелости не был районирован. Для культивирования пыльников, использовалась картофельная среда с добавлением 2,4-Д, кинетин и б-БАП в разных концентрациях.

Для регенерации растений из эмбриоидов и каллусов применялись среда Блейдзо или № 5. Вне зависимости от минерального состава они обладают тремя отличительными особенностями: I), концентрация сахарозы по сравнении с индукционной средой (9sO снижается до 2-3£ при пересадке как эмбриоидов, так и каллусов; 2) для выращивания эыбрибидов из среды регенерации исключали 2,4-Д и использовали более слабый ауксин (НУК, ИУК -0,2-0,5 мг/л); 3) для эмбриоидов в среде регенерации железо- и натрий-содержащие соединения уменьшают в два раза.

Е ходе выращивания донорных растений в теплице поддерживали следующий режим: температура 25°С днем и 18°С ночью,' 16- . часовой фотоЬериод, освещенность 30 тысяч люкс на уровне почвы. Растения поливали 2-3 раза в неделю. В течение вегетации проводили подкормку минеральными удобрениями.

Побеги, у которых влагалище предпоследнего листа находится на уровне центральной части колоса (♦ I см), срезали п уровне почвы. Местоположение колоса в листовой обертке определяли наоцупь (Суханов, 1982). Б колосьях по указанному морфологическому признаку пыльники двух нижних цветков в средней части колоса содержали вакуолизированные микроспоры, Среданные.побеги помечали в сосуд с водой, а затем в холодную камеру с тем-

'пературой +3° - 4°С.

После предобработки холодом побеги обрезали, а колосья вместе с листовой.оберткой стерилизовали в боксе. Б качестве стерилизатора использовали хлорные препараты. В растворе хлорамина (5#) колосья стерилизовали 5-7 минут, а затеи промыва] лк 4-5 порциями стерилизованной и автоклавированной воды. Пос-. ле промывки с колосьев снимали листовую обертку с помощью пин-• цета и их помещали в стерильную и слегка влажную емкость. .' Анализ структур проводился под стереоскопическим микро- -скопом КБС-2. За время культивирования пыльников проводили не менее трех анализов..Первый анализ - через 4 недели после начала культивирования. После анализа подученные эыбриоиды и хаодусы переносили на среду регенерации.

Для развития эмбриоидов использовали пониженные положительные температуры (+10-12 °С). Для этой цели были использованы камеры БКЩ. В камере поддерживали 16-часовой фотопериод, -освещенность 50 тысяч.люкс. Б таких условиях из хорошо сформированных эмбриоидов (при хорошо развитом щитке и колеоптиле) растение регенерирует на 4-5 день.

Каллусы субкулыивировали на питательной среде Блейдза с .содержанием 2,4Д - 2,0 иг/л. После появления очагов морфогенеза (эмбриональных центров), морфологически различаемых как .участки плотной белой ткани, их пер лосили на среды для реге-■ нерации растений.

■ Во время культивирования эмбриоидов и каллусов проводили - контроль за их состоянием под лупой МБИ-2 и. оценивали плотность морфологических структур. _

После завершения всех анализов для каждого генотипа учитывали общее количество эыбриоидов, каллусов, а также зеленых , и альбиносных растений.

Л'.-:'.:;-.-. . ЗАВИСИМОСТЬ ИНДУКЦИИ РЕГ2КЕРАНТ0В В КУЛЬТУТЕ ','<' ПЫЛЬНИК® ПШЕНИЩ ОТ КОНЦЕНТРАЦИИ 2,4-Д

-. Результаты исследования влияния 2,4-Д на формирование ^андрогенных структур и регенерацию растений приведень а таб-"лице и рисунках I, 2, 3. В нашей работе 2,4-Д была использована со следующими концентрациями: 1,0 и 2,0 мг/л. Поскольку отсутствует эффективная технология для одноступенчатого полу-, ченкд гаплоидов, изучение влияния 2,4-Д и других гормонов на .¡Г. акдроген^з в культуре пыльников проводился двухэтапно: I) изу-

ц»стог» МЦУНЦИМ I ^ риюгсмжч * Форм

ам

( ',

ПК.

гьа

-1--Чйс^

гт а

слЛ

<-и»р>Л »««".«у -'м' '

№

£Э

Л

лгтшд 1

Е

ли,

Я

Рис. I. Сезонная специфика изыенелля частот индукций ризоггшшх форм и отзывчивости пыльников.

сорт^аратовская 29

семья 35/8'I (С-35)

КБ

2,4-Д - 2,0 иг/л

кинетин - 0,5 иг/л

ав

2,4-Д - 2,0,иг/л

2,4-Д - 2,0 иг/л б-БАЙ- 0,3 иг/л

' Меняя баланс горыояов в среде, мы той самый молем регулировать процесс возникновения зеленых растении в культуре пыльников пшеницы спрптовскоП селекции, что мохет быть связано с действием горионов на выражение гена, так как у семьи 35/8этот признак пол действием гормонов окспрессируется активнее, чсы у сорта Сираговская '¿(3.

Вместе с тем, опыты по изменению уровней гормонов в питательной среде выявили еле один фактор, который в нашей работе не проверялся. Это уровень эндогенных гормонов и ингибиторов, который мог меняться от генотипа к генотипу и от сезона к сезону, что, в частности, выразилось в различных типах морфогенеза и 4орш:ровшш! рогенерактов. Цохно предположить, что вы-р&хенпе активности гонов обеспечивается уровиеы эндогеиных фи-тогормоков (открывание программы) и ингибиторов (блокировка), Вот почему с помощью одного (2,'<~д) или двух (2,4-д •» цитоки-ииии) гормонов удалялось менять выход эмбриоидов, каллусов, зеленых и альблпосиых растении в культуре пыльников.

особенности ¡!1!ду1щ!!т аидгогшш гасте1ш

в за115!сш10сти от условд шащибашы донорш

гасгенш

Во время насих исследований были проведены 1 посева в различных условиях выращивания: 2 тепличных и 2 полевых посева. Результаты исследования влияния тепличных и полевых условии вьрпщг ания приведены в таблице и на рисунках I, 2, 3. Наблюдали повышение количества андрогенных структур. При выращивании донорных растений в естественных условиях наибольшая разница при регенерации гаплоидов проявилась на заключительном этапе. Если в тепличных условиях вырлщипония у сорта Саратовская 29 вчход зеленых растений составлял 2,&>>, то в полевых условиях регенерация зеленых растений увпличивплась до (табл., рис. 3). У семьи 35/5'» при внрацивапии в естественных условиях регенерация яеяеиых растении увеличивалась в два раза.

Следует отметить, что вопрос о влиянии условий внрапипо-кия на регенерацию растений является спорным. Одни авторы считают, что полевые условия выращивания рпеттии уп^личиваюг выход реговерантов (особенно зеленых) ( гву.вг еь п 1.19Тч;

Оиувпв »1: В1 , 19ЯЗ), ЛрУГНе »0 ОТМОЧВПТ, ЧТО гИХОП р*>Г','Пг-

^«♦»^ИгК-4 «I

А*."«

г .

Т ■* 4

-Л'1

4г *

1 ЧАСТОТА индукции

«лиусеа м>

лихицы.

к«

чг о» 41

в* «гЧ о*

СИ гтг с» СГ> Г см и. ПЙГ < »а »» ««

сл» с*»г~|

н-.'рлси

Ш-.-ЧН/.Й-З "---"

"----"

)2~101ТрХ1ЬНк!1 Еир.ШНТ СЬ-ОШХТКИЯ БйрЯСНТ

е«*очкаст*

Рис. 2. Сезонная специфика изменеггя частоты яндугсциа зыбриоидов и каллусов из пыльников пшеницы.

Сорт Саратовская 29 (С-29)

семья 35/84 (С-35)

КВ

2,»-Д - 2,0 иг/л кинетин- 0,5 иг/л

2,4-Д - 2,0 иг/л кинетин- 0,5 иг/л

ОВ

2,4-Д - 2,0 »^/л

Ь.

2,0 иг/л 0,3 мг/л

1Г

t

Ml

TT

^jdÜE

tu «4 tu tK

Ц'Д11 VlB"

tRIMMMfk .

hiNM MZ«

«

ЛИ

fl»

Jj

Ж

ia

¡i:';-,,»:! ^

Г

T, »"Г Hil

^íTfrf troi?

abaß-

Рис. 3. Сезонная специфика изменения частоты индукции зеленых

и альбияосних регелерпнтов.

29*

семья 35/84 (С-35)

2,4-Д - 2,0 ит/я кинетив - 0,5 ыг/л

2,4-д -

кинетт

2,0 мг/л 0,5 нг/л

2,4-Д - 2,0 иг/л

2,'1-Л - 2,0 мг/л

6-Г.At¡ - 0,3 мг/л

у

рангов при выращивании доноров в естественных условиях не , всегда увеличивается ( Buyser , 1961; Bullock , 1982),',

ВЛИЯНИЕ СЕЗОННОСТИ ВЦРАЦКВАНИЯ ДОНС/РНЫХ РАСТЕНЫ НА ИНДУКЦИЮ ГАПЛОИДНЫХ РЕГЕНЕРШОВ ИЗ ПЫЛЬНИКОВ ШШШ . v

Изменение сезона выращивания донорных растений особенно сильно влияло на индукции андрогенных структур и регенераци»'. растений. Результаты влияния сезонное"» приведены в табл.!н \ рисунках I, 2, 3. i

Если сравнить все ц посева по количеству продуктивных ! пыльников, частоте индукции структур и регенерангов, го наб- ¡.. людается следующее: I) по отзывчивости пыльников и регенерации растений второй полевой посев был менее благоприятный, v< чеы первый; 2) зишше условия очень сильно затормаживали анд-' рогенез пыльников (особенно у сорта Саратовская 29). Если в; , весенней тепличной посеве индукция зеленых растений у семьи1 35/84 составляла 8,8то в зиынец посеве этот показатель I снизился до 1,5je.

Наблсдали резкий сдвиг путей морфогенеза у изучаемых ге? 1 нохипов при изменении сезона вырацивания донорных растений. Так, у сеиьи 35/84 в зимних тепличных условиях индукция ризо-генных новообразований отсутствовала (рис. I), в то *е время у сорта Саратовская 29 она наблвдалась практически во всех изученных вариантах. .

На основании изучения влияния сезонности на андрогенез пыльников мозено сделать следующее заключение: I) Изменение сезона резко изменяет, урожай пыльников и их морфогенетическую активность, независимо от условий выращивания донорных расте- ; ний (тепличных или полевых) и от применения регуляторов роста; > 2) изменение сезонности может усиливать или уменьшать действие других факторов (генотипа, гормонов) на андрогенез пыльников пшеницы.

Сопоставление условий выраииьаяия и реакция пыльников, разных генотипов на гормоны показывает, v-o процессы развития гаплоидов есть результат тесного взаимодействия генома с вне-- ; ними факторами: I) условием питания а гормонов; 2) сезонности -культивирования донорных рутений.

, ОСОБЕННОСТИ ПРОЦЕССА РЕГЕНЕРАЦИИ РАСТЕНИЙ • ИЗ ШЬНИШЗ ПШйШ В ЗАЕШШОСТИ ОТ ГЕНОТИПА

.■i Норфогекетические потенции культивируемых клеток расте- ' йкя реализуются при определенных условиях, в зависимости от особенности генотипа. Одним из методов исследования генетичв-: ской регуляции процесса регенерации растений из пыльников яв-" лается сравнительное изучение генотипов с разной способность» к образованию впдрогенных структур. Поэтому нами специально были подобраны генотипы, резко отличающиеся по индукции андро-генных структур в культуре пыльников: сорт Саратовская 29 -; слобоотзывчивый (т.о. пыльники менее продуктивные), а семья

35/В4 - високоотзывчивая. • : . ' Отзывчивость пыльников семьи 35/84 в 4-5 раз вине, чем у ¡-сорта Саратовская 29, а по индукции структур в 8-9 раз и боль-~ве (рис. I, 2, 3). Семья 35/64 более склонна к образование каллусов, чем сорт Саратовская 29. «

Если, провести такой хе анализ между регенерацией зеленых и альбиносных растений у каждого генотипа, моею отметить, что у сорта Саратовская 29 преобладают зеленые растения, а соотноаение зеленых растений к альбиносам независимо от сезона вырацивания донорных растений сдвигается в пользу первых. Несмотря на то, что выход регенерантов у семьи 35/84 в 5-6 роз больше, чем у сорта Соратовская 29, первый генотип даст более высокий выход альбиносов. Кроме того, у семьи 35/84 доля ризо-геняых форм выше, чем у второго генотипа.

Влияние генотипа сказывается на всех этапах получения гаплоидных регеиорантов в культуре пыльников пвеницы. Но под воздействием других факторов (условия выращивания доиоркых растений, регуляторы роста) нохно изменить отзывчивость пнль-' ников к выход ре.енерантов в пользу зеленых растений.

В В В О Д Ü

I. В результате применения культуры пыльников получены 42 гомозиготных линии яровой мягкоВ пвеницы, которые переданы в лаборатории селекции и семеноводства НКИСХ Сго-Востока дла изучения хозяйственно-ценных признаков и использования как исходного селекционного материала. Полученные линии целесообразно использовать в гаплоидной технологии в качестве доноров признаков "образование андрогеняых структур и регенераций ' растений".

2. Выявлен ярко выраженный дифференцированный эЭДект ■ действия 6-БАЛ и 2,4-Д на индукции регенератов из пыльников. Применение 6-МП у семьи 35/84 резко увеличивало выход золеных., растений (16^), а у сорта Саратовская 29 этот показатель бил значительно ниже. Выход зеленых растений при применении 2,Ч-Д> наоборот, был выше у сорта Саратовский 29 по сравнению с-семьей 35/81. j

3. Б культуре пыльников пшеницы иоаю регулировать про,-цесс образования тех или шшх андрогелиих структур иепля со'от~ ношения концентра дни кинетлна и ¿,4-Д в питательной среде, j. При преобладании кинетики над 2.,4-А наблюдали увеличение индукции ризогенных 40PM1 и выход зеленых регенерантов при зтрм снижался у обоих генотипов,

'I. При изучении влияния всех трех регуляторов роста было отмечено, что с возрастанием их концентрации в питательной', среде увеличивается выход альбиносных растении. :

5. Впервые показано, что в условиях поздних сроков посо- ' ва донорных растения в поле (игшь месяц) продуктивность пыль-vv ников и регенерация растении били одинаковы с интенсивностью' этих процессов в тепличных условиях. , Л

6. Регенерационная способность пыльников ппеницы зависела от сезона выращивания донорных растений. При весенней посеве (тепличном) донорних растении выход регенерантов был зиачи-, тельно выше, -чей при зимнем (тепличной) посеве. ' i;

7. Установлено, что наиболее высокий выход регенерантов . из пыльников пшеницы приходится на ранне-весенний полевой посев донорных растений (посев - конец апреля - начало мая).

8. Отмечено влияние генотипа на все этапы получения"гаплоидов пшеницы ин витро. Однако влияние генотипа можно $егу- ' лировать условиями выращизания донорных растений, а такхе различными сочетаниями и концентрациями регуляторов роста.

у .Список опубликованных работ по теме диссертации

■ I, Рагубова С.Д. Гормональная регуляция эмбриогенеза в культу туре гаплоидов пшеницы.//Материалы научной конференции мо: лоднх ученых ¡Пути повышения эффективности сельскохозяйственного производотва.-Ы..УДН,1988.-С.32-33.

2. Рагубова С.Д. Влияние регуляторов роста на выход зеленых к альбиносннг растений.//II конференция научно-учебного центра физнко-хншчвоках методов исследования:Тез.докл.

: 21-24 февраля 1939 г.-Ы.,УДНД989.-С.201.

3. Рагубова С.Д. Роль генотипа в процеоое морфогенеза пьиь-вяков пленион.//III конференция научно-учебного центра

,. "Применение финко-хзшичвокжх методов исследования в наук» . - я технике":Твз.докл.Часть Н.Иедико-биодогическне в агробиологические наука. 20-23 февраля 1990 г.-Ы.,Щ,1990.-СЛ6б.

ТенагхчеоххЯ план 1990 г., I 417

Подписано х печати 26.11.90. Формат бОхЭОДб. Ротепркнтнвя печать. Уох.л«ч.л. 1,0. Уч.-ивд.л. 0,96, Усл.кр.-отт. 1,125. Ixpas 100 вкэ. Заказ S72. Бесплатно Издательство Университета дружбы народов

_И7923. ГС ПЛ. Москва. тл.Остяотклязс.З_

Типография издательства УДН 117923, ГСЙ»1, Ыосква, ул.Орджояикпдза.З