Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

КУЛЬТУРА ПЫЛЬНИКОВ В СЕЛЕКЦИИ НА УСТОЙЧИВОСТЬ ЛЬНА-ДОЛГУНЦА К ФУЗАРИОЗНОМУ УВЯДАНИЮ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "КУЛЬТУРА ПЫЛЬНИКОВ В СЕЛЕКЦИИ НА УСТОЙЧИВОСТЬ ЛЬНА-ДОЛГУНЦА К ФУЗАРИОЗНОМУ УВЯДАНИЮ"

. • . - На правах рукописи

г*

ПРОЛЕТОВА Наталья Викторовна

КУЛЬТУРА ПЫЛЬНИКОВ В СЕЛЕКЦИИ НА УСТОЙЧИВОСТЬ ЛЬНА-ДОЛГУНЦА К ФУЗАРИОЗНОМУ УВЯДАНИЮ

Специальность: 06.01.05 — селекция и семеноводство 03.00.23 —1 биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2002

Диссертационная работа выполнена в лабораториях биотехнологии и иммунигета Всероссийского научно-исследоватетьского института тьна

Научный руковояитепь доктор биопогических наук, старшин научный сотрудник А.В.Поляков.

Научный консутьтант - кандидат сельскохозяйственных наук, старшии научный сотрудник Н.М.Лошакова.

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор В.Ф. Кенловская,

кандидат биологических наук, доцент Е.А. Калашникова.

Ведущая организация - ВНИИ се 1ьскохозяйственнои биотехно то гии

Зашита состоится «_»___ 2002 г в _ час на

заседании диссертационного совета Д 220 043 10 в Московской сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева

Адрес 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул , 40

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке МСХА им К.А Тимирязева

Автореферат разос I «_ _»__2002 г

Ученый секрета! диссертационно

И Карлов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Лен-долгунец является основным источником натурального волокна и одним из важнейших источников растительного масла в экономике России.

Фузариозное увядание - наиболее вредоносное заболевание льна-долгунца. При поражении растений этим патогеном теряется до 25% урожая, при этом снижается качество волокна и семенная продуктивность.

Поскольку возбудитель этого заболевания — пластичный почвенный патоген, то основной, наиболее эффективный способ борьбы с этим грибом — это выведение новых высокоустойчивых к фузариозному увяданию сортов. Для создания таких сортов селекционеры используют гибридизацию, ведущую к обмену генетической информацией, и отбор.

Традиционная селекция имеет ряд успехов в увеличении содержания волокна, сокращении вегетационного периода растений льна-долгунца. Но при этом необходимо отметить, что большая часть сортов имеет низкое качество волокна, не обладает достаточной устойчивостью к полеганию и болезням, характеризуется низкой приспособленностью к экстремальным факторам внешней среды (засуха, резкое колебание температуры и др.).

Учитывая низкий коэффициент размножения, необходимость селекции на трудносовместимые признаки, полигенный контроль большинства хозяйственно ценных признаков, традиционная селекция льна остается весьма трудоемким процессом, требующим больших затрат времени и средств для создания новых конкурентоспособных сортов.

Использование клеточных технологий в селекции облегчает и ускоряет селекционный процесс.

Получение гаплоидов путем культивирования пыльников - ускоряет селекционный процесс, а клеточная селекция с использованием каллусной ткани ведет к независимому от традиционных методов селекции получению новых форм и сортов растений.

Проведение отбора на уровне растений-регенерантов, или непосредственно в популяции клеток на селективных средах с токсинами возбудителей болезней, позволило получить новые устойчивые формы томатов, картофеля, клевера, земляники и др. культур. На льне-долгунце такие исследования носят поисковый, модельный характер.

Использбвание культуры пыльников может быть эффективно в селекции льна-долгунца на устойчивость к болезням, в т.ч. к фузариозному увяданию. Это позволит сократить селекционный процесс и повысить его эффективность.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось усовершенствование методики получения регенерантов льна-долгунца в культуре пыльников для создания геноисточников, усто

нию.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

• выявить влияние условий выращивания растений-доноров на индуцирование новообразований,

• подобрать условия для повышения морфогенетической активности пыльников,

• исследовать культурально - морфологические признаки используемых штаммов возбудителя фузариозного увядания льна-долгунца - F ox\sparum,

• уточнить условия культивирования штаммов патогена,

• разработать комплекс условий для оценки льна-долгунца на устойчивость эксплантов к токсину возбудителя фузариозного увядания и отбора устойчивых эксплантов на селективных средах,

• создать на основе метода культуры пыльников линии льна-дочгунаа устойчивые к фузариозному увяданию и не уступающие по основным хозяйственно ценным признакам сорту-стандарту Алексим, представляющие интерес для селекционной практики

На\чная новизна и практическая ценность исследований

В результате проведенных исследовании доказана эффективность использования культуры пыльников в селекционно-генетических исследованиях для получения линий льна-долгунца, устойчивых к фузариозному увяданию

Усовершенствована методика получения регенерантов, устойчивых к фузариозному увяданию

Конкретезированы условия выращивания донорных растении культивирования трансплантов льна-дочг\нца, состав питательных сред для увешчения выхода регенерантов

Впервые для потучения устойчивых к фузариозному увяданию форм определены условия культивирования пыльников и новообразований на сетектив-ных средах

Впервые с помощью метода культуры пыльников из восприимчивых к фузариозному увяданию генотипов получены устойчивые жизнеспособные регенераты льна-долгунца, не уступающие исходным формам и сорту-стандарту Алексим по основным хозяйственно ценным признакам

Данные и следования открывают новые возможности создания ценного исходного селекционного материала и перспективных линий льна-долгунца для практической селекции

Апробация результатов диссертации Основные результаты доклады ва-чись на Fourth European Regional Workshop on Flax " Producing for the market (Rouen, 1996), Втором международном симпозиуме "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования (г Пущино, 1о-20 июня 1997), [V Международной конференции ' Регуляторы роста и развития

растений" (г. Москва, 24-26 июня 1997), Международной научно-практической конференции, посвященной 70-летию ВНИИ льна (г. Торжок, 16-18 ноября 2000 г.).

Публикации. Основные материалы и результаты диссертации изложены в 3 печатных работах.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (3 главы), общих выводов, предложений селекционной практике, списка использованной литературы, включающего 193 наименования, в том числе 68 иностранных авторов.

Работа содержит 39 таблиц, 7 рисунков и 6 приложений.

УСЛОВИЯ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работу проводили на льне культурном (Ыпит шйагайтшт Ь.). Лен-долгунец представлен сортами и линиями отечественной и зарубежной селекции. Семена генотипов культурного льна были получены из лабораторий ВНИ-ИЛ: селекции, семеноводства, биотехнологии. После проверки по потомствам, семена использовались в качестве исходного материала.

Донорные растения выращивали в вегетационном домике в сосудах Мит-черлиха по общепринятой методике (Доспехов, 1979). В почву каждого сосуда перед посевом вносили растворы минеральных удобрений (50 мл) из расчета: аммиачная селитра - 1,47 г, хлористый калий - 1,58 г, суперфосфат - 2,4 г. Схема исследований включала проведение дополнительной подкормки донорных растений при достижении ими высоты 20 см, дозой минеральных удобрений, сниженной в 2 раза от рекомендованной. Была проведена некорневая подкормка растворами микроэлементов - бор, марганец, цинк, медь (по 1 г/л раствора). Норма высева составляла 25 и 50 семян на 1 сосуд. г

Устойчивость растений к фузариозному увяданию определяли на'специализированных инфекционно-провокационных фонах в соответствии с "Методическими указаниями по селекции льна-долгунца" (1987) и "Методическим указаниям по фнтопатологическим работам со льном-долгунцом" (1969, 2000). В качестве стандартов использовали сорта льна-долгунца Алексим, А-29, Славный 82 и ВеИпка.

Лабораторные исследования проводили в соответствии с методическими указаниями по культуре ткани и органов растений (Урманцева, 1988). Бутоны с пыльниками стерилизовали при мягком режиме, используя этанол в концентрации 70% в течение 30 секунд. Затем бутоны переносили в 1%-ный раствор хлорамина "Б" (продолжительность обработки 2,0-2,5 минуты) с последующей тщательной промывкой дистиллированной стерильной водой.

Асептически изолированные пыльники помещали в пробирки на питательные среды и культивировали в течение трех недель в термостате с после-

дующим переносом на свет, где их продспжали культивировать при температуре 24°+lrtC, освещенности окото 4000 люкс, фотопериоде 16 часоз день и S часов ночь В опыте использовали лампы дневного света ЛДЦ Питательные среды готовили на основе концентратов Регуляторы роста и pat-1 воры фузариевои кислопы вносили в среды в нужных количествах перед автоклавированием Реакцию рН среды (5,6 - 5,8) устанавливали перед автоклавированием IN раствором NaoH

Математическая обработка данных. Экспериментальные данные обрабатывали методом дисперсионного и регрессионного анализа на ПЭВМ с использованием пакета программ ' БИОСТАТ и Excel 5,0', а так же по методикам, опубликованным рядом авторов (Доспехов, 1979, Плохинский, 1970, Сед-ловский и др , 1982)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Создание форм льна-долгунца, устойчивых к фузариозному увяданию

на основе регенерантов, полученных в культуре пыльников Частота получения новообразований в культуре пыльников может изменяться под влиянием факторов внешней среды, результат действия которых зависит от генетических особенностей организма, фазы его развития, продолжительности и уровня экзогенных воздействий

Для изучения влияния условий выращивания на частоту выхода гаплоидных структур проводили выращивание растении-доноров пыльников при увеличенной с 6,25 см* до 25,0 см2 площади питания двухкратном внесение минеральных удобрений и обрезке соцветий (декапитации) в фазу первого бутона п течение трех лет

Установлено, что применение вышеуказанных приемов в большинстве случаев способствовало увеличению частоты появления новообразований в культуре пыльников льна-долгунца Гаплоидные структуры были получены у 28,0% культивируемых пыльников при увеличении площади питания донорных растений льна-долгунца (11,0% - при рекомендованной), у 17,3% пыльников -при выращивании растений льна-долгунца на высоком агрохимическом фоне (9,6% - при естественном фоне удобренности), у 18% - при декапитации соцве тий (3,0% - без декапитации) (рис 1) Однако генетические особенности различных генотипов льна-долгунца являлись определяющим фактором при анализе полученных результатов Некоторые генотипы производили гаплоидные структуры на уровне контрольных вариантов

Идентификация оптимальной стадии развития микроспоры является важной составной частью культуры пыльников Незначитечьные различия в стадии развития микроспоры существенно сказываются на выходе регенерантов

—1

шж

1 ■

■ нв

.......... и Вт

хонтроль вариант

Варианты опыта

Щалощааь питания Щагрофон обрезка

Рнс.1 Вякание условий выращивания растений-доноров на каллусогенез льна-долгуниа в культура пыльников

Таблица 1

Влияние стадии развития пыльцы на каллусогенез льна в культуре пыль__._ников 1996 -1997гг. (п = 200)__

Стадия развития микроспоры Число пыльников с новообразованиями, % + 28р Коэффициент корелляции, г

1996 г. '

Одноядерная невакуолизированная 5,0 ±_ 1,1 > Д37

Одноядерная вакуолизированная 10,8 + 1,3

Двуядерная 0,0

1997 г.

Одноядерная невакуолизированная 4,7 +1,7 0,68

Одноядерная вакуолизированная 10,8 + 2,5

Двуядерная 0,8 + 0,7

Нами выявлено, что стадия одноядерной вакуолизированной микроспоры, в наибольшей степени соответствует получению регенерантов при культивировании пыльников льна-долгунца. В зависимости от генотипа, на питательной среде БЬ-2, формировался каллус на 15,0% пыльников. В то время как пыльники, содержащие пыльцу на стадиях одноядерной невакуолизированной или дву-

ядерной микроспоры, регенерировали соответственно от 2,0% до 9,0°о (в среднем 4,7%) и от 0% до 1,5% (в среднем 0,8%) новообразований (табт 1)

Таблица 2

Интенсивность каллусо- и эмбриоидогенеза в культ) ре пыльников в зависимости от комбинации регуляторов роста 1999-2000 гг (и - 150)

1 Наименование и концентрация 1 регуляторов роста, мг/л 1 Число пыльников с новообразованиями. Число почек, приводящихся на 1 кал-ivc щт

БА 1,0+НУК 0,05 10,7 ± 4,1 12

БА ЦО + НУК 0,5 1- ИУК 0,3 10,7 ±4,3 8

БА 2,0 + НУК 1,0 6,7 ±2,1

БА 2,0 1,3 ±2,0 0

БА 2,0 1- НУК 0,05 4,0 ±1,1 0

Кинетин 1,0 о 0

Культивирование пыльников на питательной среде, содержащей минеральные вещества, витамины, аминокислоты, регуляторы роста, углеводы на уровне рекомендованной БЬ-2, позволяло получать новообразования практически у всех генотипов, включенных в исследования

Наиболее благоприятным было следующее сочетание компонентов питательной среды регуляторы роста - 1,0 мг/п б-бензиладенин + 0 05 мг.л а-нафтилуксусная кислота, углеводы - сахароза 40 г/т (табч 2, 3)

Питательная среда, содержащая макро- и микроэлементы среды ЬЬ-2, в концентрации 15% и 50% от контрольной, позволяла попучать на 20 0-30 0™ о больше пыльников с новообразованиями нежели контрольная (с полной концентрацией) среда (табл 4) Поэтому эта среда была взята за основу для дальнейших исследований

Фузариевая кислота, метаболит штаммов гриба Ги.\апит охуьритт возбудителя фузариозного увядания льна-долгунца, была включена в исследования в качестве селективного агента В зависимости от целей эксперимента ее добавляли в питательную среду БЬ-2 в различных концентрациях Нами была предпринята попытка создания стандартного метода оценки на устойчивость к фузариозному увяданию т тга и проведения клеточной селекции на зтот признак

Таблица 3

Влияние концентрации углеводов в питательной среде на каллусогенез льна-долгунца в культуре пыльников. 1996, 1999 гг. (п = 150)_

Наименование и концентрация углеводов, % Количество пыльников с новообразованиями

шт. %±2Sp

Сахароза, 2,5 + глюкоза, 2,5 13 8,7 ± 4,6

Сахароза, 13 0 0,0

Сахароза, 3 11 7,3 ± 4,3

Сахароза, 5 9 6,0 ±3,9

Сахароза, 7 8 5,3 ±3,7

Мальтоза, 3 1 0,7 ± 0,4

Мальтоза, 6 3 2,0±2,3

Л-26-8-33 Л141-8-23 Л-957-8-4 Л-301-8-6 Г1351

Генотип

В Каллус 1 пассаж«, полученный ма основе пыльянкоа, культивируемых на среде, соаержашей фузярнеяую кислоту

■ Каллус 1 Пассажа, полученный не оснояе пыльников, культивируемых на среде, не содержащей фузариевую кислоту

Рис, 2 Морфогенез льяв-доягуац* на сепетвно^ сроав »¿>м с.', п^сс/ч*. €

Клеточный отбор на устойчивость включал в себя два основных этапа. Первый этап - культивирование пыльников на селективной среде. В ходе экспериментов удалось определить такое содержание фузариевой кислоты в среде, при котором ингибировался каллусо- и эмбриоидогенез, и лишь небольшая часть пыльников была способна производить почки ипобеги.

При концентрации фузариевой кислоты в среде 0,5 и 1,0 мг/л, черистема-тические зоны на основе пыльников появлялись как у устойчивого (А.-29), так и у восприимчивых (Славный 82, ВеЬпка) сортов (габл 5) ~>ти зоны быги способны производить почки и побеги К четки новообразований, продоч кающие делиться, несмотря на присутствие токсина, переносили на среду 1/2 ЬЬ-2, не содержащую фузариевую кислоту

На втором этапе проводили кучьтивирование морфогенного калчуса и (или) эмбриоидов на среде 5Ь-2 со сниженной в десять раз концентрацией регу-тяторов роста (т е 0,1 мг/л БА ~ 0,005 мг'т НУК) и содержанием фузариевой кислоты 10 мг/л

Каллусы, которые были получены от пыльников восприимчивых и устойчивых к фузариозному увяданию генотипов, культивируемых на селективной среде, при переносе вновь на среду с фузариевой кислотой, имели зеленый цвет, производили почки и побеги А каллусы, полученные от пыльников на среде без токсина, на селективной среде быстро бурели и отмирали Их гибель составляла 97,3 - 100,0% (рис 2) Таким образом осуществлялась проверка сохранения клетками свойства устойчивости к токсину

Таблица 4

Влияние концентрации компонентов питательной с^еды Ы1-2 _на катлусогенез пыльников льна (п=50)_

1 Генотип Концентрация минеральных Пыльников с новообразованиями *

1 » веществ в питательной среде, % шт °аХ 2Бр

ТЕ 93/13 100 (К) 2 4,0 ±2,8

75 22 44,0±7,0 !

50 12 24,0x6,0 1 1

Г1351 100 (К) 17 34,0±6,7

75 29 54 0-7,0

50 35 70,0±6,5

№ке 100 (К) 4 8,0±3,8

75 19 38,0±6,9

50 23 46,0±7,0

Дальнейшее культивирование морфогенных структур осуществляли на среде 1/2 со сниженной в пятьдесят раз концентрацией регуляторов роста (0,02 мг/л БА+ 0,0001 мг/л НУК) без фузариевой кислоты до получения побе

И)

гов Такой состав среды был опредетен ранее (Попяков, Пролетова, 1995), после проведения серии экспериментов

Для оценки на устойчивость к токсинам гриба ¡-ичапит (.фузариевои кислоте) использовали каллус, почученный на основе пыльников льна-долгунца на питательной среде не содержащей токсические вещества возбудителя фу-зариозного увядания

Калзусные культуры первого пассажа культивировали на сечективнои среде, содержащей фузариевую кислоту в концентрациях 2,5 мг/ч, 5 0 мг/л, 7,5 мг'л, 10 мг т и 12,5 мг/л При этом на средах с фузариевой кисютой в концентрациях 2,5 №5,0 мг/л не наблюдали снижения морфогенетическои активности каллусных клеток у устойчивых генотипов Небольшое снижение интенсивности морфогенеза было отмечено у восприимчивых к фузариозному увяданию генотипов Процесс образования почек и побегов шел на уровне контрольного варианта как у устойчивых (А-29, БТЛ-13), так и у восприимчивых (Г ПМ, Славный 82, ВеЬпка) к фузариозному увяданию генотипов При концентрации -12,5 мг/л фузариевой кисчоты - морфогенез был ингибирован у всех восприимчивых генотипов, включенных в эксперимент

Таблица 5

Вчияние фузариевой кис юты на каллу согенез льна-долгунца в ку зьтуре пыль-

ников (п 50)

Генотип Концентрация фузариевой кислоты мг/т Пыльников с новообразованиями 1

шт % ± 1 1

А-29 0 1 2,0 ± 0 б

5 0 0,0

1 0 00

0,5 2 4,0 ± 1,3 1

0,1 2 4 0 ± 1 0 1

ВеЬпка 0 0| 00 ,

1 1 5 0 00

1 1 2,0 ± 0,9 !

0,5 1 2,0 ± 1,1

0,1 1 2,0 + 0.3

Славный 82 0 0 0,0

5 0 00

1 1 1 1 1 3 6,0 ± 2,3

0,5 1 2,0 ±1,3

0,1 0 00

На среде, состоящей из макро- микроэлементов среды 5Ь-2 и фузариевои кислоты в концентрации 10,0 мг/л у устойчивых к фузариозному увяданию сор-

тов каллусные клетки продолжали делиться и производить новообразования. Гибель каллусов была минимальная (0,0 - 8,7%). У восприимчивых генотипов каллусы быстро бурели и отмирали. Гибель составляла до 85,7%. Дифференциация генотипов по устойчивости хорошо просматривалась (табл. 6).

Таблица б

Влияние фузариевой кислоты на морфогенез льна 2001 г._

Генотип Концентрация Число культи- Получено Процент Получено

фузариевой вируемых живых кал- гибели, почек, шт.

кислсггы, мг/л каллусов, шт. лусов, шт. % на 1 каллус

Славн.82 0 25 25 0,0 8

2,5 25 24 2,0 6

5,0 23 14 60,0 6

7,5 21 7 34,8 3

10,0 21 3 85,7 1

12,5 23 0 100,0 0

А-29 0 25 25 0,0 6

2,5 25 25 0,0 6

5,0 20 20 0,0 3

7,5 20 19 2,0 5

10,0 23 21 8,7 2

12,5 25 15 60,0 0

Таким образом, применение культуры пыльников и клеточной селекции с использованием каллусных клеток, полученных на основе пыпьниковых экс-плантов, позволяют проводить отбор устойчивых к фузариозному увяданию форм льна-долгунца и оценивать генотипы на устойчивость к этому патогену в культуре in vitro. Используя вышеперечисленные методы, нами была получена из восприимчивого к фузариозному увяданию генотипа Г 1351 высокоустойчивую форму ПП-9.

Полученные в культуре пыльников регенеранты оценивали на устойчивость к фузариозному увяданию на инфекционно-провокационном фоне. Для создания инфекционно-провокационного фона на устойчивость к фузариозному увяданию льна были использованы популяции патогена, состоящие из сильно- и средневирулентных штаммов, выделенные в различных регионах льносеяния.

Высокой устойчивостью к фузариозному увяданию обладала форма Агесо 631 апЗ R1, полученная на основе Агесо 631.

Линия ПП-9, полученная на основе 9-го пыльника генотипа Г 1351, была высокоустойчива к патогену. Устойчивость составляла 78,6% - 99,0% (табл. 7). В то время как устойчивость исходного генотипа Г 1351 была на уровне 16,2% -21,3%, т.е. исходная форма характеризовалась высокой восприимчивостью к патогену.

Таблица 7

Рез>льтаты оценки генотипов льна-долгунца, полученных в культуре пыльников _на инфекционно-провокационном фоне_

Генотип Количество пораженных растении %, X ср Устойчивость °о ± 2 Sp |

1999 г 2000 г 2001 г 1999 г ' 2000 г 2001 г 1

ПП-9 25,0 0,0 12,0 78,6 ±2,9 99,0 + 03 93,3 + 1 6

1 1351 an 3 84,6 ! 1С0 0 86,4 13 5 ± 1.8 00 J-03 2 3±01>

Г 1351 84,6 | 81,0 86,0 16,2 ± 2,3 16,7 ± 1,1 21.3 ± 1 3

Areco 631ап3 R1 00 | 00 98,0 + 0,1 99,0 ±0 2 1

Агесо 631 00 i 00 99,0 х 0 2 99 0 ±0,2 i

Nike an 97 S7.5 1 46,0+2,6

Nike 13,0 87,8 ± 1,9

ст Алексим 12,4 14 3 | 9,3 90,5 ± 3,5 94,0 ± 2,2 90 6 ± 3 4 ;

ст А-2Ч 10,1 , 7,1 1 6,1 91 0x2,8 93,3 ± 1.5 94,4 ±15!

ст Славный 82 100,0 | 94 8 1 98,3 34± 1,1 5 6 ± 0,S ! 15 ±0,4

i er Be'mka , 86,6 84,8 | 81,3 13 5 + 2,0 ' 14,2 ±1 6 | 14.7 ±1 3

Фитооценка регенерантов, полученных в культуре пыльников в 1993-1995 годах, позволила выявить 4 линии, характеризующихся высокой устойчивосгьвд к фузариозному увяданию

Проведенное испытание линий, полученных в культуре пыльников на инфекционно-провокационном фоне на устойчивость к фузариозному увяданию в условиях вегетационного домика и к ржавчине в полевых условиях, позволило выявить линии льна-долгунца, характеризующиеся высокой комплексной устойчивостью к этим патогенам

Культура пыльников позволяла получать регенераты, которые по двум и более признакам превосходили исходные генотипы В частности получены ре-генеранты, которые по высоте растений и массе стебля существенно превосходили исходные сорта Такие регенераты составляли 6 5% от числа изученных Регенеранты, которые по массе стеб та и чисту семян на растении существенно превосходили исходные генотипы, составляли 6,5° о, а по высоте растений, массе стебля и числу семян на растении - 3,6%

Линия, полученная в культуре пыльников на основе гибрида Г 1351 (ПП-9) проявила не только высокую устойчивость к фузариозному увяданию, но и при испытаниях по типу селекционного питомника 2-го года по основным хозяйственно ценным признакам не уступала сорту-стандарту Алексим (табл 8) Втечение трех лет показатели «масса семян с I мг», «высота растений», «устойчивость к полеганию» были на 2,9 - 22,8% выше, чем у сорта-стандарта Алексим

Таблица 8

Характеристика линии льна-долгунца (ПП-9), полученной в культуре пыльни-___ков на основе Г1351. СП-2 г. 1999-2001 гг.

Название линий Масса с 1 м2, г Содержание волокна, % Высота растений, см Длина вегетац. периода, сут. Устойчивость к полеганию, балл

соломы семян волокна

1999 г.

ПП-9 498 91,4 110,6 22,2 68 89 4,5

в % к ст. 90,9 122,8 78,8 86,7 102,9 + 1 112,5

Алексии, ст 548 74,4 140,3 25,6 70 88 4,0

2000 г.

ПП-9 419 78,6 108,5 25,1 75 78 4,5

в % к ст. 91,5 114,2 83,7 88,7 107,1 -9 112,5

Алексии, ст 458 68,8 129,6 28,3 70 87 4,0

--- 2001 г.

ПП-9 456 83,3 110,5 23,1 72 76 4,5

в % к ст. 92,7 106,1 74,4 89,5 101,4 -4 112,5

Алекснм, ст 492 78,5 148,5 25,8 71 80 4,0

Таким образом, культивирование пыльников in vitro сопровождается образованием регенерантов, а в последующем и линий, характеризующихся высокими показателями основных хозяйственно ценных признаков, устойчивостью к фузариозному увяданию и позволяющих создавать ценный исходный материал для селекции льна-долгунца.

ВЫВОДЫ

1. Определена эффективность использования культуры пыльников льна-долгунца в селекционно-генетических исследованиях на устойчивость к фузариозному увяданию.

2. Усовершенствована методика получения регенерантов в культуре пыльников, позволяющая создавать линии льна-долгунца, устойчивые к фузариозному увяданию.

3. Определены условия выращивания растений-доноров пыльников для увеличения интенсивности каллусогенеза: выращивание растений на высоком

агрохимическом фоне, с увеличенной площадью питания (25 см2), проведение декаиитации в фазу первого бутона, что позволяет контролировать выход мор-фогенных структур в культуре пыльников и увеличивать интенсивность кэллу-согенезадо 15-50%

4 Изолирование пыльников на стадии одноядерной вакуолизированнои микроспоры, и использование среду 81]-2, концентрация минеральных веществ в которой снижена в два или четыре раза, а концентрации сахарозы составляет 3% позвочяет получать до 15° о гаплоидных каллусов

5 Выявлены условия проведения достоверной оценки на устойчивость к фузариозному увяданию, включающие

- проращивание семян на субстрате из фильтровальной бумаги, увлажненной раствором токсина в концентрации 100 мг/л,

- экспресс оценку на устойчивость к токсину на модифицированной селективной среде 5Ь, содержащей фузариевую кислоту в концентрации 10 мг/л,

6 Для получения регенерантов, устойчивых к токсину и фузариозному увяданию льна клеточную селекцию на устойчивость следует проводить путем культивирования пыльников на селективной среде, содержащей 0,5-1,0 мг/т фу-зариевой кислоты, а каллусы - на среде, содержащей 10,0 мг/л токсина

7 Впервые с помощью метода культуры пыльников получены устойчивые жизнеспособные регенераты и тинии на их основе (БТЛ-10, ПП-9) чьна-долгунца, не уступающие исходным формам и сорту-стандарту Алсксим по основным хозяйственно ценным признакам

Предложения для селекционной практики

Разработанные в соавторстве Методические указания по получению регенератов в культуре пыльников, устойчивых к фузариозному увяданию рекомендуется использовать в работе учреждений, занимающихся сепекцией и биотехнологией льна-долгунца

Культуру пыльников использовать для повышения эффективности селекционного процесса на устойчивость к фузариозному увяданию у льна-долгунца

В качестве исходного материала при создании новых сортов рекомендуется использовать формы льна-долгунца (БТЛ-10, ПП-9 и др), созданные в культуре пыльников

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Поляков А В, Пролетова Н В Питательная среда для культивирования пыльников льна - Патент на изобретение № 2120741 от 27 октября 1998 г -Москва - 1998

2 Пролетова Н В , Поляков А В , Лошакова Н И , Чикризова О Ф Влияние фу-зариновой кислоты и культуральной жидкости штаммов возбудителя фуза-

риоза (Fusarium oxysporum f.sp. lini) на длину первичных корешков проростков семян льна. - Международн. научн. конф. 9-11 ноября 1999. - Минск, 1999, с. 212-213

3. Пролетова Н.В. Влияние концентрации регуляторов роста, аминокислот и фузариновой кислоты в питательной среде при культивировании пыльников льна-долгунца (Linum usitatissimum L..). - Международн. научно-практич. конф., поев. 70-летию ВНИИ льна 16-18 ноября 2000 г. - Торжок, 2000, с. 4648.

4. Пролетова Н.В., Поляков A.B., Лошакова Н.И. К методике оценки льна-долгунца на устойчивость к фузариозному увяданию в условиях in vitro. - IV Международн. симпозиум (июнь, 2001 г.). - М.: Пущино, 2001, т.Н, с.270-272.

5. Пролетова Н.В. Повышение устойчивости растений льна-долгунца к фузариозному увяданию методами клеточной селекции. - 1 Съезд микологов. М., 2002, с. 134.

6. Поляков A.B., Пролетова Н.В. Культура пыльников как способ создания высокопродуктивных геноисточников льна (Linum usitatissimum L.) методами биотехнологии / Материалы научно-производств. конф. по льну (Вологда, 26 марта 2000 г.) - Вологда. - 2000. - С. 354.

7. Поляков А.В.,Чикризова О.Ф., Пролетова Н.В. Создание конкурентоспособного селекционного материала льна (Linum usitatissimum L.) методами биотехнологии / II Съезд ВОГИС, 1 - 5 февраля 2000 г. - С.-П.: - НИИХ СПбГУ. - 2000. -т.1. - С.197-198

8. Поляков А.В.,Чикризова О.Ф., Егорова Е.Г., Пролетова Н.В. Влияние регуляторов роста на морфогенез и генетические изменения льна при культивировании изолированных тканей и органов in vitro /Материалы IV Международн. конференц. "Регуляторы роста, развития и продуктивности растений" (24-26 июня 1997 г.) Тез. докл. - М.: МСХА. - 1997. - С. 310-311.

9. Поляков А.В.,Чикризова О.Ф., Егорова Е.Г., Пролетова Н.В. Применение методов биотехнологии для решения селекционно-генетических проблем льноводства /Материалы научно-производствен, конференц. по льну. - Вологда. -2000.-С. 353.

Объем 1,0 п. л.

Зак. 289

Тираж 100 экз.

АНО «Издательство МСХА» 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44