Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Транспорт одновалентного таллия через мембрану эритроцита человека и миноги

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Транспорт одновалентного таллия через мембрану эритроцита человека и миноги"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ им. И. М. СЕЧЕНОВА

На правах рукописи УДК 577.352.465 + 546.683

ШЕРСТОБИТОВ

Александр Олегович

ТРАНСПОРТ ОДНОВАЛЕНТНОГО ТАЛЛИЯ ЧЕРЕЗ МЕМБРАНУ ЭРИТРОЦИТА ЧЕЛОВЕКА И МИНОГИ

03.00.04 —БИОХИМИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

РГ 5 ОД

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1995

Работа выполнена в лаборатории сравнительной биохимии неорганических ионов (заведующий — доктор биологических наук, профессор И. А. Скульский) Института эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор И. А. СКУЛЬСКИЙ кандидат биологических наук Г. П. ГУСЕВ

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Л. В. ЩАГИНА доктор биологических наук В. П. НЕСТЕРОВ

Ведущая организация: Институт физиологии им. И. П. Павлова РАН.

Защита состоится 17 января 1995 г. в « ¿О часов на заседании специализированного совета К 002.89.01 в Институте эволюционной физиологии н биохимии им. И. М. Сеченова РАН по адресу: 194223, г. Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова.

Автореферат разослан « /Ь » декабря 1994 года.

Ученый секретарь

специализированного совета

кандидат биологических наук Л. В. ЗУЕВА

Актуальность темы исследования. Со времени открытия таллия его поведение в биологических системах изучалось практически на всех уровнях структурной организации живого: от молекулярного (взаимодействие с ферментами и другими биомолекулами) - до организма как целого"(высокая токсичность таллия была обнаружена вскоре после открытия элемента). Отличительной особенностью таллоисна 'Т1+), выделяющей его из ряда тяжелых металлов, является спо -бж'-ть к изоморфному замещению иона К+ в различных биологиче* кик процессах. Сходное поведение Т1+ и К+ было выявлено при изучении транспорта этих ионов через мембраны митохондрий, водорослей, бактерий, мышечных, нервных, эпителиальных, асдатных и других клеток, а также эритроцитов, которые стали классической моделью при исследовании процессов ионного транспорта.

К настоящему времени в эритроцитах выявлен и относительно хорошо изучен лишь механизм активного транспорта Т1+ посредством Ыа,К-АТФазы, в котором Т1+ замещает К+ в связывающих центрах фермента с полным сохранением функции насоса, что согласно концепции биологического ионного изоморфизма, развиваемой И.А.Скульским (1991), является характерным для идеального (совершенного) изоморфизма .

Вместе с тем, при исследовании пассивного транспорта данных ионов через эритроцитарные мембраны была обнаружена чрезвычайно высокая таллий-калиевая селективность. Пассивная проницаемость мембраны эритроцитов, крайне низкая для ионов щелочных металлов, оказалась на два порядка выше для Т1+ по сравнению с И*. !1э+, К+ и КЬ+. В основе высокой таллий-калиевой избирательности лежат, по-видимому, специфические различия в механизмах их пассивного транспорта, природа которых неизвестна и для выяснения сущности которых необходимы дальнейшие исследования.

В отношении ионного транспорта эритроциты наиболее примитивных позвоночных класса круглоротых. к которым относятся миноги и мик-сины. занимают уникальное положение, благодаря чрезвычайно низкой анионной (хлоридной; проницаемости. К началу выполнения настоящей работы в доступной нам литературе отсутствовали сведения относительно транспорта одновалентного таллия через мембрану эритроцитов у данного кла- са позвоночных.

Цель работы состояла в выявлении и изучении неизвестных ранее молекулярных Механизмов проницаемости Т1+ чер^з мембрану эритроцитов человека и речной миноги Х-атрегга Лиуг^ииг.

Основными задачами работы являлись:

1. Исследование стационарного распределения Т1+ мевду эритроцитами и внеклеточной средой при различных экспериментальных условиях у человека и миноги.

2. Изучение влияния специфических ингибиторов транспорта и величины мембранного потенциала на однонаправленные потоки (вход и выход) Т1+ через плазматическую мембрану эритроцитов данных видов.

Научная новизна исследования. Впервые выполнено сравнительное изучение механизмов транспорта таллия в эритроцитах человека и миноги.

Обнаружено, что в эритроцитах человека стационарное распределение Т1+ соответствует равновесному распределению по Нернсту, что позволяет использовать одновалентный таллий как инструмент для определения величины мембранного потенциала в этих клетках.

Открыт новый механизм транспорта Т1+ через мембрану эритроцита человека - хлорид (бикарбонат)-зависимый, ДИДС и фуросемид-чувствительный транспорт, опосредованный через белок полосы 3.

Впервые выявлены специфические для мембран эритроцитов миноги калиевые каналы, проницаемые для таллия, и показано, что транспорт Т1+ осуществляется по крайней мере двумя путями: за счет На.К-насоса и калиевых каналов.

Найдено, что фуросемид-чувствительная система На-К-С1 котранс-порта не принимает участия в транспорте Т1+ через мембраны эритроцитов человека и миноги.

Теоретическое и практическое значение работы. Открытие хлорид (бикарбонат)-зависимого, ДИДС и фуросемид-чувствительного транспорта Т1+ в эритроцитах человека вносит существенный вклад в интенсивно изучаемую в настоящее время проблему переноса тяжелых металлов (РЬ, Си, Сс1), а также 1п посредством белка полосы 3 и дает ноше сведения для формирования современных представлений о системе анионного транспорта в биологических мембранах. Большое значение имеет выявление К+-каналов (проницаемых для Т1+) в мембране эритроцита минога, активных при физиологических условиях, в отличие от Са2+-активируемых К+-каналов Гардоша, известных для эритроцитов некоторых видов млекопитающих. Новые сведения о механизмах транспорта таллия могут быть использованы при поиске путей снижения токсического действия этого металла при лечении отравлений.

Апробация работы. Материалы диссертации долоиены и обсуждены на Симпозиумах по ионному транспорту и регуляции функции клетки (Ленинград, 1990; Санкт-Петербург, 1994 > и на 6-ом Международном симпозиуме по физиологии рыб (Хельсинки, 1993).

Публикации.- Основные результаты диссертации опубликованы в шести публикациях.

Структура и объем работ». Диссертация состоит из введешь-, глав и заключения. Изложена на 2. страницах машинописного текста, иллюстрирована /'/рисунками и /& таблицами. Библиография включает наименований, ия них ¿4 на русском языке.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В экспериментах использовали кровь доноров и речных миног Ьаш-р?тга Ниу1аиИб массой 60-80 г. Ьшотных содержали с октября по март в водопроводной воде при 2-4°С с непрерывной аэрацией. Эритроциты отделяли центрифугированием, отмывали холодным раствором следующего состава (мМ): 145 ЫаС1, 10 трис-НС1, рН 7.4 и доводили гематокрит (Гт) суспензии до 30-50?. Полученную суспензию добавляли к инкубационным средам до конечного Гт 2-6% в зависимости от цели эксперимента.

При изучении кинетики накопления и его стационарного распределения суспензию эритроцитов преинкубировали с ингибиторами, затем вносили радиоактивный и через определенные интервалы

времени отбирали аликвоты для подсчета активности. Радиоактивность сред и клеточных лизатов определяли на гамма-счетчике с кристаллом ЫаХ. Коэффициент распределения 204Т1 между клетками и средой рассчитывали как отношение активности 1 мл эритроцитов к активности I мл среды (Шерстобитов с соавт., 1990). Для определения константы скорости входа Т1+ в эритроциты измеряли накопление ка начальном линейном участке и рассчи-

тывали по формуле: КБХ - А^/А^.Т, где А - радиоактивность I мл клеток и 1 мл среды, Т - время инкубации с изотопом. При определении константы скорости выхода II"1" из эритроцитов, клетки на 1ру-жали радиоактивным изотопом, затем отмывали от наружного 2°4ц и добавляли к инкубационным средам. Через 3, ь и 9 мин для эритроцитов человека (в интервале 10-40 мин для эритроцитов миноги) аликвоты суспензии брали для подсчета активности. Константу скорости выхода рассчитывали графически по уравнению: 1п(А^/А0) = ~квшс■г > где Аг и А0 - радиоактивность I мл клеток во время 'Ч" и "О" -(ЗкШБкН а!., 199^).

Измерение содержания Ыа+ и К+ в эритроцитах миноги производили после отмывки клеток М^С12- сахарозной средой с последующим гемолизом в дистиллированной воде. Содержание Ыа+ и К+ определяли на пламенном фотометре Флафо-40 (К.Цейсс).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I. Стационарное распределение одновалентного таллия через мембрану эритроцита человека.

После добавления к суспензии эритроцитов набладэлось его

быстрое накопление в клетках до стационарного уровня (рис.1).

Рис.1. Накопление го^Т1 б эритроцитах человека. По оси ординат - коэффициент распределения г04Т1.(а)- интактные клетки;(б)- клетки, преинкубированные с ингибиторами (0.1 мМ уа-'баина + 0.5 мМ фуросемида; 30 мин при 37°С. Среда инкубации -"%С12 -сахароза", концентрация Т1* в среде и.'.С мМ. Примечание: здесь и на последующи/, рисунках вертикальные отрезки

-95%-ные доверительное и-.тервалк редних значений._

Достижение стационарного распределения между клеткой и сре-

дой являлось результатом выравнивания противоположно направленных потоков таллия через мембрану эритроцита. Время, необходимое для достижения 50%-ной величины стационарного распределения Т1+, составило 3.5 мин для интактных клеток и 5 мин после добавления ингибиторов.

Влияние уаОаинз и фуросемида на стационарное распределение Т!*. В интэктных эритроцитах человека стационарное распределение варьировало ъ широких пределах (2-7), причем болев высокие величины (таблица I) достигались в среде "М§С10(75 мМ) сахароза (85 мМ)" по сравнению со средой "КаС]" Л-! 5 мМ*. ~~ - -- ----- - —

Таблица I.

Влияние уабакна и фуросемида на коэффициент распределения в эритроцитах человека.

Среда инкубации Контроль УаОаян Фуросеиид УаЛаин +

0.1 мМ О.Ь >лМ фуросеиид

"%С12 сахлрсгг" г:. 57 1.5.1 1.46 1.3?

(П-г.) ±0.^ ¿М.Оо ¿0.1'3 +0.1»

"МаС!" ¿.10 5.71' 1.38 1.30

__(П=7 1_¿0.13_¿0.11_¿0.09_¿0.06

п-число опытов, время инкубации-30 мин, температура-37°С, концентрация Т1+б среде-и.О^ мМ.___

Добаеленич к среде 0.1 Ш уаС-аина значительно снижало уровень

накопления 204Т1. Примерно такой ке эффект вызывало введение в среду '..I мМ фуросемида. Одновременное добавление уабзяна и фуросемйдз ке прик'.дмло к аддитивному снижению накопления в

клетках, г.ри атах у лорлых достигался некоторый нижний предел коэффициенте« распределения , одинаковый для ос ¿»их сред и

более стэс-ильный . - сравнению с контролем. Таким образом, вариабельное г».- и боле - -ыооки.е значения коэффициентов распределения в случае иитактш«. •-ритр^аитов были обусловлены екладем уэбаин- и фуросемид-чувствительных компонент.

Влияние конн^нтРч.см »¿¡радиоактивного таллия на накопление. го'1Т1 й ЭРИТ1- 1Я!тах !• ' г..-!)ериментлх использовали фирмы "Атег;-~

Ьаш" с цыс^й д^льн -й активностью (концентрация вносимого с меткой нералиоактийного Т1+ составляла около 0.001 мМ). С увели-чешем к-кценграции нерадиоактивного Т1+ в среде о? о.005 до 0.2 мМ "тациснй'-ко1- распределение приближалось к величинам,

которые ' при алчном угнетении активного транспорта.

Эти данны* укяг-ыйам на быстрое кчсиц<?кие системы активного транспорт.'; гй1инм прь уееллченни его концентрация в среде к снижение вклада актиькогс грэнсп'-рг» в с-уммаркый перенос тГ в клетки.

Зависимость стационарного распределения г04Т1 от величины трансмембранной разности потенциалов была выявлена I) путем уменьшения концентрации С1~ в среде инкубации (деполяризация) и 2) при варьировании концентрации К+ в среде в присутствии валинсми-цина и ингибитора анионного транспорта ДИДС.

I_■ 1_■_I_I_■-■-)

-12 -9 -5 0 6 13 24 42

Рис.2. Стационарное распределение 204Т1 в эритроцитах человека

при различной концентрации С1~ в среде инкубации. По оси абсцисс: вверху - концентрация С1~ в среде, мМ; внизу -трансмембранная разность потенциалов. мВ. По оси ординат - коэффициент распределения 204Т1 (клетка/среда). Инкубационная среда созертат_0^02_^_Т1^_0^1^мМ_£а0аина^____________________________

В каждом опыте определяли накопление 204Т1 в эритроцитах за 30 мин при 6-8 различных концентрациях С1~ в среде, для которых рассчитывали трансмембранную разность потенциалов. Как видно из рис.2, по мере уменьшения содержания С1~ в среде наблюдалось постепенное падение стационарного распределения от ii.37iG.04 при концентрации С1~, равной 160 мМ, до 0.6310.05 при концентрации С1~ 15 мМ.

Известно, что под влиянием ва.пяномицина возникает потенциал за счет высокой проницаемости мембраны для ионов К+, зависящий от градиента концентрации К+. При всех исследованных концентрациях К+ в среде распределение Т1+ было выше в присутствии валиномици-

на, при этом максимальный сдвиг коэффициента распределения составил 0.85±0.12, минимальный - 0.24+0.03 при концентрациях К+, равных 6 и 114 мМ, соответственно.

Полученные результаты подтверждают данные о высокой скорости переноса одновалентного таллия через мембрану эритроцита человека (БКи'бкИ ег а1.. 1978). Для" ионов Ка+ и_К+ константы скорости - __ пассивного транспорта в этих метках составляют примерно и.ий (Сагау е1; р.1 ., 1981), в наших опытах кош-тинта скорости входа Т1+ в присутствии уабаина и фурооем-,у,а была около 4 ч .

Одним из факторов, влияющих к:- стационарное распределение Т1+, является наличие системы активе- г; транспорта, В отсутствие уабя-ина часть входного потока 11+ эритроциты :оздается за сч-^т Ма,-К-насоса; при этом стационарная концентрация Т1т в клетке возрастает (p7ic.it. Вклад в накоплена Т1+ в значительной степени зависит от концентрации :аллия в сргде инкубации. Высокие уровни стационарного распределения таллия между клеткой и средой (около 5-7) достигается только при низких концентрациях Т1+. Снижение стационарной концентрации Т1+ в клетках уже при содержании таллия в среде и,005 мМ свидетельствует о высоком сродстве Ыа,К-насоса для этого иона и о его быстром насыщении.

Другим фактором, от которого зависит уабаин-чувствительное накопление Т1+ в эритроцитах человека, является концентрация конкурирующего за насос иона К4 (иау^гег >Л а1,. 1974). В наших опытах использовалис. номинально б«чк?лиевие среды, но за время инкубации происходила небольшая неконтролируемая утечка К+ из клеток. Активный транспорт Т1+ также заки-.-ел от катионного состава среды: более низкий уровень уабаин-чувствительного накопления Т1+ наблюдался в среде "МаСХ" по сравнению со средой "К^С!.;;,-сахароза".

В связи с выявленной зависимостью стационарного распределения от мембранного потенциала (рис.2) представляет интерес вопрос о равновесности распределения Т1+ м-жду клеткой и средой и возможности использования этого иона для ценки разности потенциалов на мембране эритроцита человека, -чет комплексообразования одновалентного таллия с хлорид-ионами • озволил определить долю "свободного" (распределяющегося потенциа -зависимым образом) Т1+ и получить близкую к обратимой (углс о! коэффициент наклона 53 мВ: "таллио-вую" функцию эритроцит арной мембраны (рис.3) в интервале 50-160 мМ наружного С1" в условиях существенно неравновесного распределения ионов натрия и калия б эритроцитах человека.

Рис.3. Стационарное распределение "несвязанного" Т1+в зависимости ог величины мембранного потенциала.

по оси ординат-меморанный потенциал (мВ), рассчитанный по градиенту С1~; по оси аосцисс-отрицательный логарифм отношения Т1+(клетка;/ Т1+(среда) из формулы на рисунке; к| и к2 -константы образования комплексов Т1+ с С1~-ионами; цифры у точек - кокцеят-

ращш_С1~_в_среде_инк2бациид____________________________________

2. Анион-зависимый транспорт таллия через мембрану

эритроцита человека Появившиеся за последние годы данные по транспорту РЬ2* {БШюпе, 1986), гпг+ (КаИакакои ег а!., 1990) я Сиг+ ШЗа ег а!., 1990) указывают на значительный вклад анион-зависимого переноса этих металлов через мембрану эритроцита человека в виде отрицательно заряженных комплексов различного состава. Принимая во внимание заметную способность Т1+ к образования) комплексных соединений с хлорид-ионами, предположили, что подобный механизм мо-

яет участвовать в трансыеморанном переносе таллия.

Рис.4

Рис.5

16

U -

О J

"" О -контроль -

$| ДОС

ig ¿УРОСЕШД

60-

цо 20

дадо (мкМ)

I . I_I_' I

0 1 2 3 4 5

Ш1 МдС1гтИ03МзШ03\г 0 ом 0.8 1.2 1.6 г.о

Рис.4, Влияние фуросемида (I ыМ) и ДИДС (0.1 мМ) на вход

в эритроциты человека в различных инкубационных средах.

по оси ординат-константа скорости входа **Pa>.Oui по сравнению с контролем.

204,

Т1 (час-1); *Р<о.ои

Рис.Ь. Концентрационные зависимости ингибирущего действия ДИДС и фуросемида на вход 204Т1 в эритроциты человека, по оси ординат-% ингибирования входа 204Т1; эритроциты инкубировали в средах, содержавших 145 мМ NaCl, Ю мМ глюкозы, 10 ыМ -Трис~НС1 рН 7.4; значения 150 получены из графиков.

Влияние уабаина, фуросемида и ДИДС на вход Т1"1" в эритроциты

человека. В контрольных бескалиевых средах наблюдалось быстрое

накопление Т1+ клетками. В среде "ЫаС1" константа скорости входа

составил» 15.6 ± 0.6 ч"1. Вход Т1+ значительно снижался в присут-

—1 —1 —1

ствии уабаина (до II ч ). фуросемида (8 ч ) и ДИДС (8 ч ). В

последующих опытах изучали действие ингибиторов при замене Ла+ и СГ в инкубационных средах на и N0^. В безнатриевой

М^С]^-сахарозной среде константа скорости входа составила

13.4+0.8 ч"1. В этих условиях уаоаин, фуросемид к ДИДС вызывали заметное ингибирование транспорта 21+ на 29, 41 и 462, соответственно (рис.4). Действие уабаина с фуросемидом, а также уабаина с ДИДС было аддитивным, что вызывало снижение транспорта на

67-692. Замена С1~ на N0^ приводила к значительному снижению константы скорости входа Т1+. При всех экспериментальных условиях ингибирукцее действие 1.0 мМ фуросемида совпадало с действием 0.1 ыУ. ДИДС. Более того, совместное добавление этих ингибиторов не приводило к аддитивному эффекту. Зависимость ингибирующего действия ДИДС и фуросемида от концентрации представлена на рис.5. Концентрации полумаксимального ингибирования для фуросемида и ДИДС составили 0.22 мМ и 0.72 мкМ, соответственно. Исходя из приведенных данных, можно предположить наличие С1-зависимой компоненты транспорта Т1+ через мембрану эритроцита человека, ингибируемой фуросемидом и ДИДС.

час

-I

30 120 160

час

_т

20

16 -I 12

6 4 О

рН 8.5

10

рН 7.4

-1-1-(

20 30 40

КОНЦЕНТРАЦИЯ С Г (мМ)

КОНЦЕНТРАЦИЯ НСО3 ( мМ )

Рис.6. Влияние концентрации С1~ и НСО^ на вход Т1+ в эритроциты человека.

Клетки отмыты и суспендированы в среде, содержащей 140 мМ ИаШ^,

мМ КЛО,

, ю мМ Трис-Шд (рН 7.4), Суспензию клеток добавляли к средам с различной концентрацией С1~ или НСи^; сумму Ки^+С!-.НСО^) поддерживали постоянной - 15Ь мМ, по оси ординат-ксн-танта скороставхода^^М.____________________________________________

Зависимость входа Т1+ от концентрации С1~и НСО^. В последующих экспериментах оценивали способность хлорида и бикарбоната активировать анион-зависишЯ транспорт Т1+ (рис.6). Скорость входа Т1+ резко возрастала при увеличении концентрации С1~ от 80 до 155 Дебаэлений НС01 в среду Ь'аЫ03 такве вызывало значительную стимуляцию входа ТГ . При этом стимулирующее действие бикарбоната было более аыргздинш при рН 3.5, чел при рН 7.4. Добавление ДЗДС к инкубационной среде, содержащей 40 иМ НСО^ при рН 3.5, схгпгало константу скорости входа Т1+ до контрольного уровня, в тс время как фуросетшд янгябярсзал вход Т1+ только на 79%.

В двух опытах на эритроцитах одного донора сравнивали яффэкт

40 мМ НСО3 в присутствии либо С1~, либо КО^. В первом случае би-

!-"рбонят константу скорости входа Т1+ с 10.1 до 27

"Г1, в нитратно* среде вход возрастал от 5.2 до 15.4 .

вательно, НС0~-зависимая компонента входа Т1+ в хлоридной среде

о —1

была выше, чем в нитратной (16.9 и 10.2 ч ).

Влияние фуросемида и ДИДС на выход Т1*. По сравнению с контрольным уровнем в хлоридной среде (5.3 ± 0.2 ч-1), фурссемвд снижал константу скорости выхода Т1+ из эритроцитов до 2.5 ± 0.2 ч-1, а ДИДС - до 1,9 ± 0.2 ч"1. В нитратной среде константа скорости выхода составила в контроле 2.6 ± 0.2 ; добавление I мМ

лл/

фуросеькда или 0.05 Ш ДИДС не влияло на выход 71.

Таким образом, показано, что транспорт Т1+ через мембрану эритроцита человека опосредован ДИДС-чувствительныы анионообменни-ком, а не фуросемид-чувствительным На-К-С1 котранспортом. Это подтверждается а) независимостью действия фуросемида от присутствия наружного и К+! б) равенством максимальной величины инги-бирования ДИДС и фуросемидом при отсутствии аддитивности их действия; в) соответствием концентраций полумаксиыального ингибиро-вания входа Т1+ таковым для ингибирования транспорта С1~ по анио-нообменному механизму.

Тот факт, что ДИДС-чувствительный транспорт Т1+ происходит в присутствии С1~ или НСОд, предполагает образование отрицательно заряженных ионных пар или комплексов с этими анионами. Характер активации транспорта Т1+ данными анионами согласуется с относительно более низким сродством анионообменника мембраны к ионам С1~ по сравнению с ~НС0~ (НоИтапп, 1986; Кпаи!, 1979; 1979).

Незначительная стимуляция входа таллия (в 1.7 раза) наблюдалась в присутствии обоих анионов. Подобный кооперативный эффект не может быть объяснен влиянием каждого из них.

Полученные результаты указывают на важную роль анионообменного механизма в транспорте Т1+ через мембрану эритроцита человека в обоих направлениях. В то же время в ряде работ, выполненных на других тканях (Bakker-Grunwald, 19Т9; Johns et al., 1933; Ranga-chari et al., 1906) был обнаружен транспорт Tl+ через фуросемид-чувствительный Na-K-Cl котранспорт. В гладких мышцах участие Na-К-С1 котранспорта вытекает из его зависимости от внутри- и внеклеточной концентрации Na+. С1~-чувствительный вход 'Г1+, изучав-иийся на бедренной артерии собаки, оказался зависимым от наружного Na+ и не чувствительным к ДИДС.

Таким образом, можно заключить, что в мембране эритроцита человека имеется по крайней мере два механизма транспорта Т1+:

(1) уабаин-чувствительный активный транспорт через Ыа.К-насос и

(2) ДИДС (фуросемид)-ингибируемый транспорт через анионообменник мембраны (белок полосы 3), модулируемый концентрацией Cl" или НСОд. Природа (уабаин+ДИДС)-резистентной, остаточной компоненты транспорта одновалентного таллия в настоящее Еремя остается неизвестной. Изучение однонаправленных потоков Т1+ в нитратных средах с переменной концентрацией аниона на фоне 5 мМ К+ (в этих условиях блокирован как активный, так и ДИДС- ингибируемый транспорт Т1+) выявило чувствительность (уабаин+ДИДО-резистентной компоненты транспорта 204ц к величине мембранного потенциала. Изменение концентрации NOg в среде инкубации от 155 до 30 иМ вызывало уменьшение константы скорости входа от 5.3+0.4 до 3.4+0.3 ч-1 (N=6, 37°С). В то же время деполяризация^ мембраны приводила к

знты скор 1.21+0.25 ч"1 (N=11, 18°С).

увеличению константы скорости выхода £-'04т1 с 0.83+0.15 до

3. Транспорт Т1* через мембрану эритроцита миноги.

Внутриклеточные концентрации натрия и калия. У 6-ти исследованных животных внутриклеточное содержание Nа+ и К+ заметно варьировало. Концентрация натрия находилась в пределах от 16 до 41, а калия от 70 до ИЗ ммоль/л клеток. Среднее содержание катионов составило 27 £ 3.7 и 91 ± 5.5 ммоль/л клеток, соответственно.

Поддержание значительных траисмембранных градиентов натрия и калия позволяет предположить наличие в плазматической мембране ядерных эритроцитов миноги Ка,К-насоса и его участие в транспорте

одновалентного таллия. В то же время, отличительной особенностью мембраны эритроцита миноги является низкая хлоридная проницаемость, которая связана с отсутствием анионного переносчика типа белка полосы 3 (0Ьп1вМ, Аза1,1985). В соответствии с этим в наши опытах ДИДС и фуросемид не оказывали значительного влияния на транспорт Т1+ через мембрану эритроцита миноги : при введении в инкубационную среду 0.1 ыМ ДИДС или I Ш фуросемида константа скорости входа составила 90 + 5 % от контрольного уровня.

Стационарное распределение 204^ в эритроцитах миноги достигалось в течение 30 мин (20°С) и при инкубации клеток в бескалиевой среде составило 8.9*1.0 (N=7), что существенно превышает аналогичный показатель для эритроцитов человека-2.1 ¿0.1. Увеличение концентрации наружного калия в интервале 1-20 ыМ приводило к снижению коэффициента распределения 204Т1 от 5.7+0.7 (N=8) до 1.4+0.г (М=-«> вследствие деполяризации мембраны ii конкуренции между Т1+ и К+ на Ма,К-насосе. На фоне 5 мМ К+ уабаин (0.1 мМ) и

р I

блокатор калиевых каналов Ва (1.0 мМ) уменьшали стационарное распределение Т1+ в среднем, соответственно, на 26.2% и 28.5%, при этом наблюдалась аддитивность действия блокаторов. Амилорид (I мМ) оказывал наиболее выраженное влияние на распределение таллия, вызывая 4-х кратное изменение данного показателя (1.4+0.2, N=5).

Таблица 2.

Влияние ингибиторов на константу скорости входа в эритроциты миноги.

Вариант опыта Число Константа скорости

животных_входа (ч 1)

Контроль 17 51 ± 4

Уабаин (0.1 тМ) 17 25 ± 2

Уабаин + Ва"4" (1 .и тМ) 5 3.9 * 0. .4

Уабаин + ТЭА (1.0 тМ) 5 7.7 ± 0. .8

Уабаин + амилорид (1.0 тМ) 4 4.1 ± 0. .6

Константа_скорости_входа 20^Т1 варьировала в широких пределах - от 25 до 89 ч-1, для обработанных уабаином клеток - от 9 до 44 ч~'. В среднем уабаин ингибировал транспорт Т1+ на 51% (табл. 2). Высокая скорость переноса Т1+ могла быть обусловлена транспортом

его через специфичные для мембраны эритроцитов миноги калиевые каналы (Сиэеу ег а1., 1992). Как показывают данные таблицы 2, добавление в инкубационную среду шесте с уабаином Ва , тетра-этилашюния или амилорида вызывало значительное снижение скорости входа Т1+ в клетку.

Таблица 3.

Влияние концентрации К+ в инкубационной среде на константу скорости входа 20<*Т1 в эритроциты миноги.

Т [ЗЯ

Концентрация К Константа скорости входа, (ч )

в среде, мМ в контроле +0.1 мМ уабаина

0 57 ± 11 25 ± 3

0.5 26 5 ---

1.0 22 ± 5 14 ± 1

2.0 19 + 4 12 ± 1

5.0 14 ± 3 ---

10.0 10.0 + 1.6 5.9 i 0, ,7

20.0 8.4 + 2.4 4.7 ± 0, ,5

Влияние концентрации К+ в среде на транспорт Т14. Большая вариабельность скорости входа 20^Т1 при инкубации эритроцитов в бескалиевой среде, по-видимому, связана с влиянием неконтролируемых количеств ионов К+ как на активный транспорт, так и на перенос Т1+ через калиевые каналы. Эффект концентрации наружного К+ был исследован при инкубации интактных и обработанных уабаином эритроцитов миноги (таблица 3). В обоих случаях транспорт Т1+ значительно снижался по мере увеличения концентрации К+ в среде, что, вероятно, обусловлено наличием на мембране эритроцита миноги калиевого потенциала и ее деполяризации под влиянием наружного К+. В эритроцитах человека уабаин-резистентная компонента транспорта Т1+ практически не зависит от концентрации К+ в среде (Сау1егез, ЕПогу, 1974). Отличительной особенностью эритроцитов миноги является наличие уабаин-чувствительной компоненты входа Т1+, даже в средах с высокой концентрацией К+ (таблица 3), что внешне проявлялось как отсутствие заметной конкуренции между 'XI+ и К+ на Ыа,К-АТФазе. Снижение входа Т1+ в присутствии уабаина в калиевых средах могло быть опосредовано через изменение мембранного потенциала за счет электрогенности Ыа,К-насоса.

Изучение кинетики выхода 4Т1 из эритроцитов миноги показало,

что деполяризация мембраны наружным К+ приводила к увеличению константы скорости выхода Т1+ (таблица 4).

Таблица 4.

Влияние концентрации К+ в среде и ингибиторов транспорта на

201

константу скорости выхода из эритроцитов шноги.

Яаригкт опыта Константа скорости

выхода 20Ч'1 (ч-1)

I мм К+ 1.09 0.13

5 кМ К+ 1 .28 + 0.14

20 К+ 1 .56 + 0.15

5 мМ К+ + I мМ Ва2+ 1.25 ± 0.13

ЯМ К' + 0.1 им унбйин ».£7 0.52

5 мМ К+ + I м?,1 амилорид 1.96 ±. 0.31

Эффект деполяризации мембраны в присутствии 5 мМ К+ и I иМ амило-рида также проявлялся в стимуляции выхода одновалентного таллия из клеток. В то же время уабаин не вызывал достоверного изменения скорости выхода по сравнению с контрольными условиями при 5 ыМ наружного калия, что свидетельствовало об отсутствии заметной роли Ма.К-насоса в генерации »ембранного потенциала в эритроцитах миноги.

Таким образом, транспорт Т1+ через мембрану эритроцита миноги осуществляется по крайней мере тремя механизмами: Ма.К-насосом, калиевыми каналами и путем пассивной диффузии. Вклад активной компоненты и К+-каналов в большой степени за'висисит от концентрации внеклеточного К+. При физиологической концентрации К+ в среде (около 4 мМ) Ма,К-насос, по всей вероятности, не участвует в переносе Т1+, около 75Я входа таллия осуществляется через Ва2+-чувствительные калиевые каналы и 25% обеспечивается благодаря пассивной диффузии.

ВЫВОДЫ

1. Для эритроцитов человека и миноги стационарное распределение

одновалентного таллия (Т1+) между клетками и средой обусловлено двумя основными факторами: активным транспортом Т1+ через посредство Ыа.К-насоса и величиной трансмембранной разности потенциалов. Относительный вклад каждого из факторов зависит от ионного

состава инкубационной среды.

2. В эритроцитах человека стационарное пассивное распределение Т1+ оказалось близким к равновесному распределению по Нернсту, что позволяет использовать одновалентный таллий для определения величины мембранного потенциала в этих клетках.

3. Открыт новый механизм транспорта Т1+ через мембрану эритроцита человека: хлорид(бикарбонат)-эависимый, ДИДС и фуросемид-ингибируемый транспорт через белок полосы 3. Участие фуросемид-чувствительной системы Na-K-Cl котранспорта в переносе таллия не найдено.

4. Впервые обнаружены специфические для мембраны эритроцитов миноги К+-каналы, проницаемые и для таллия, которые блокируются ионами Ва^+, ТЭА+, хинином, а также амилоридом и отличаются от известных для эритроцитов некоторых видов калиевых каналов Гардо-ша.

5. В эритроцитах миноги транспорт одновалентного таллия осуществляется по крайней мере двумя путями: через уабаин-чувствительный Ыа,К-насос (активный транспорт) и через калиевые каналы (пассивный транспорт). В бескалиевых средах около 50% поступления Т1+ в клетку происходит за счет его активного транспорта и около 40% через К+-каналы.

ОШрбк работ^ опубжковашшх по теме_диссертации:

1. Шерстобитов А.о., Гусев Г.П. Анион-зависимый транспорт одновалентного таллия через мембрану эритроцита человека. - Цитология, 1990, Т.32, N9, с.959.

2. Шерстобитов А.О., Гусев Г.П., Скульский Й.А. Транспорт одновалентного таллия через мембрану эритроцита человека. - Цитология, 1990, т.32, N3, с.239-244.

3. Шерстобитов А.О., Гусев Г.Л., Скульский H.A. Транспорт одновалентного таллия через мембрану эритроцита миноги Larapetra iluvia-tlliß. -ЦИТОЛОГИЯ, 1991, Т.33, N11, с.130-134.

4. Скудьский А.о,, Глазунов а.В., Гусев Г.П., Шерстобитов А.О.

Влияние анионов на пассивный транспорт одновалентных ионов таллия через мембрану эритроцитов человека. - Биологические мембраны, 199,:, т.У, N4, с.376-381 . - - -----

5. I.A. Skulskli, G.P. Gusev, а.О. Sherstobitov anci V. Manninen. Anion-dependent transport of thaiIons ions through human erythrocyte membrane. - J. Membrane Biol., 1992, I3u, 219-225.

6. Гусев Г.П., Шерстобитов А.О., Лосева М.Н. Стационарное распределение и транспорт одновалентного таллия через мембрану эритроцита миноги J.ampetra iluviaiilis. - Цитология, 1994, (в печати).

Подписано к печати 1.12.94. Формат бумаги G0x84V,„. 1,25 печ. л Тираж 100 эю. Заказ 112-!. ГППП-3. 191104, Санкт-Петербург, Литейный пр., 53