Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Энергообеспечение и биоэнергетические характеристики митохондрий печени миноги (Lampetra fluviatilis) и лягушки (Rana temporaria) в периоды метаболической депрессии и активности

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Энергообеспечение и биоэнергетические характеристики митохондрий печени миноги (Lampetra fluviatilis) и лягушки (Rana temporaria) в периоды метаболической депрессии и активности"

Российская Академия Наук Институт эволюционной физиологии и биохимии имени И. М. Сеченова

На правах рукописи

ЕМЕЛЬЯНОВА Лариса Вадимовна

ЭНЕРГООБЕСПЕЧЕНИЕ И БИОЭНЕРГЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МИТОХОНДРИЙ ПЕЧЕНИ МИНОГИ (LampetrafluviatiUs) И ЛЯГУШКИ (Rana temporaria) В ПЕРИОДЫ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ ДЕПРЕССИИ И АКТИВНОСТИ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации иа соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2005

Работа выполнена в лаборатории сравнительной биохимии неорганических ионов (заведующий - д.б.н. A.A. Никифоров) Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

Научный руководитель: д.б.н. М.В. Савина

Официальные оппоненты: член-корр. РАМН, д.м.н., проф. В.О. Самойлов

к.б.н., ст.и.с. А.О. Шпаков

Ведущее учреждение: Институт цитологии РАН

Защита состоится 2 нв&ёрлХ 2005 г. в 4 { часов на заседании диссертационного совета Д 002.127.01 при Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, по адресу: 194223 Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, д. 44, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

Автореферат разослан 7 октября 2005г.

Wö Ь-1* 1ЬЦЦЦ

ВВЕДЕНИЕ

Акту альность проблемы

Метаболическая депрессия является неотъемлемой частью жизненных циклов многих животных и встречается у большинства видов беспозвоночных и всех классов позвоночных. Это явление характеризуется подавлением батальной метаболической скорости на 50-100% и длится до тех пор, пока организм в состоянии противостоять стрессам окружающей среды. Современные методы молекулярной клеточной биологии широко используются для выяснения механизмов регуляции метаболической депрессии. Но до настоящего времени ни молекулярные механизмы, ни процессы, связанные с контролем гипометаболизма, до конца не изучены, и фундаментальное явление метаболической депрессии остается как с биохимической, так и с физиологической точек зрения слабо освещенным. Тем не менее, за последнее десятилетие в исследовании этого феномена сделан колоссальный прогресс, который будет полезен для дальнейшего осмысления поставленной проблемы.

Анализ существующих фактов позволяет заключить, что центром регуляции интенсивности биохимических процессов, прежде всего, следует считать митохондрии. Долгое время полагали, что основной функцией митохондрий является синтез АТФ. Поэтому наибольшее внимание было уделено регуляции сопряженного с синтезом АТФ дыхания митохондрий [Bohnensack et al., 1982; Erecinska and Wilson, 1982; Balaban, 1990]. Меньшее значение придавали процессу, при котором потребление кислорода не сопряжено с синтезом АТФ. Этот процесс связан с утечкой протонов через специфические белки (АТФ/АДФ - антипортер, аспартат/глутаматный переносчик, белки-разобщители семейства UCP) внутренней мембраны митохондрий [Skulachev, 1998а; Stuart et al.,

2001]. Причем скорость протонной утечки в митохондриях эктотермных позвоночных обнаруживает сезонную динамику [St-Pierre et al-, 2000а; Bishop et al, 2002; Boutilier and St-Pierre,

2002]. Пожалуй, самым поразительным физиологическим свойством протонной утечки является участие в защите от повреждающего действия активных форм кислорода, образующихся в митохондриях [Skulachev, 1998а; Kowaltowski et al., 2001].

Кроме того, в конце 90-х годов стало ясно, что митохондрии играют ключевую роль в развитии и регуляции апоптоза и некроза в клетке [Skulachev, 1998b: Skulachev, 1998b; 2000,2002, Kim et al., 2003a; Kim et al., 2003b], открывая на мембранах неспецифическую пору (mitochondrial permeability transition pore), проницаемую для широкого спектра органических и неорганических веществ. Однако, выбор пути гибели клетки определяется ее энергосостоянием, то есть, эффективностью работы системы окислительного фосфорилирования и соотношением АТФ/АДФ.

В последнее время появилось множество доказательств, что любая патология, связанная с энергетической депрессией, сопровождается, прежде всег гохондрий.

Низкие концентрации адениновых нуклеотидов, повышенная проницаемость внутренней мембраны, супрессия активности электрон-транспортной цепи и системы окислительного фосфорнлирования способствуют развитию многих заболеваний у высших животных, в том числе человека. Но парадоксален и примечателен тот факт, что для низших позвоночных животных эти изменения оказываются вполне приемлемыми и даже полезными в определенные фазы их жизненного цикла Это подтверждает предположение JI.A Орбели о том, что в экстремальных условиях и при патологии высшие позвоночные, в том числе и человек, используют для выживания эвошоционно более древние механизмы, изучению которых и посвящена данная работа.

Объектами наших исследований были минога речная (Lampelra fluviatilis) и лягушка травяная (Rana temporaria). Минога - представитель класса Крутлоротых, наиболее древнее из ныне живущих позвоночных животных, обладает своеобразным жизненным циклом После активного морского периода, в течение которого миноги питаются, паразитируя на разнообразных костистых рыбах, начинается анадромная преднерестовая миграция, которая заканчивается выметом половых продуктов и смертью. Миноги моноцикличны. Мигранты, пришедшие в реку осенью, проводят в них всю зиму, не питаясь Известно, что в гепатоцитах в этот период наблюдается обратимая метаболическая супрессия [Savina and Camper, 1998]. Однако, сведения о молекулярных механизмах этого явления на уровне митохондрий не были изучены

В отличие от миног представители класса Амфибий размножаются многократно. Метаболическая депрессия у лягушек наблюдается в период гибернации и связана, главным образом, с гипотермией и гипоксией

Ряд энергетических характеристик митохондрий печени пойкилотермных позвоночных мы сопоставили с аналогичными характеристиками митохондрий печени гомойотермною позвоночного - мыши (линия ASN).

Для изучения особенностей энергообеспечения митохондрий указанных пойкилотермных животных в работе были проанализированы сезонные изменения в содержании основных энергетических субстратов в плазме крови.

Цели и задачи

Целью работы было

Изучение особенностей энергетического метаболизма пойкилотермных позвоночных на примере миноги речной и лягушки травяной в периоды метаболической депрессии и активности.

Дтя достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать в плазме крови миног и лягушек содержание основных метаболических субстратов: глюкозы, липидов и свободных аминокислот. 1

2. Оценить биоэнергетические параметры митохондрий печени: скорости дыхания и фосфорилирования, содержание адениновых нуклеотйдов в митохондриях и в самой ткани.

4. Исследовать участие белков-переносчиков анионов внутренней митохондриаяьной мембраны (АТФ/АДФ - и аспартат/глутаматного антипортеров) в процессе разобщения дыхания и фосфорилирования.

6 Исследовать проницаемость мембран митохондрий в солевой и в неионнзированной средах инкубации.

7. Изучить действие индукторов (Са2+, Р„ лаурат) и ингибиторов поры (СвА [циклоспорин А], ЭГТА [этиленгликольтетраацетат], Ми2*, АДФ, БСА [бычий сывороточный альбумин], гепарин) на проницаемость мембран митохондрий.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В период метаболической депрессии содержание глюкозы и липидов в плазме крови миног и лягушек существенно снижается; количество свободных аминокислот в плазме миног увеличивается, а в плазме лягушек - уменьшается.

2. Биоэнергетические параметры митохондрий печени миног и лягушек обнаруживают сезонную изменчивость. Скорости дыхания в различных метаболических состояниях супрессированы в период метаболической депрессии и восстанавливаются при выходе из этого состояния.

3. Содержание АТФ в митохондриях и в ткани печени миног и лягушек снижается в период метаболической депрессии и увеличивается в состоянии метаболической активности.

4. В митохондриях пойкилотермных животных утечка протонов через внутреннюю митохондриальную мембран\ обусловлена участием АТФ/АДФ - и аспартатЛлутамагного антипортеров.

5. Изолированные митохондрии печени миног высокопроницаемы для ионов в солевых средах в период метаболической депрессии вследствие открытия неселективной поры, чувствительной к действию ингибиторов: СзА, ЭГТА, М^ АДФ, БСА, гепарин.

6. В неионизированной изоосмотичной среде инкубации индукция поры в митохондриях печени возможна в присутствии Са2+, Р, и лаурата. Действие лаурата, как индуктора, зависит от энергосостояния митохондрий.

Научная новизна

1. Проведен сезонный анализ содержания в плазме крови миног и лягушек глюкозы, липидов и свободных аминокислот.

2. Продемонстрирована сезонная динамика биоэнергетических параметров митохондрий печени у исследованных видов животных.

3. Исследовано содержание адениновых нуклеотидов в печени лягушек в периоды метаболической депрессии и активности.

4. Установлено участие АТФ/АДФ - антипортера и аспартат/глутаматного переносчика в разобщении окислительного фосфорилирования в митохондриях печени миног и лягушек.

5. Исследована мембранная проницаемость митохондрий печени миног и лягушек в периоды метаболической депрессии и активности.

Таким образом, изучены некоторые новые молекулярные механизмы, лежащие в основе метаболической депрессии гепатоцитов пойкилотермных позвоночных.

Теоретическая и практическая значимость

Работа имеет, прежде всего, фундаментальное значение в области эволюционной биохимии и биоэнергетики. Полученные данные дополняют сведения о функционировании и регуляции энергетического метаболизма у эктотермных животных. Кроме этого установлена важная роль митохондрий в развитии обратимого феномена метаболической депрессии. Результаты исследования могут быть использованы для дальнейшего изучения молекулярных механизмов регуляции энергетики митохондрий, а также в прикладных целях. Обнаруженная нами на пойкилотермных животных читохондриальная дисфункция, проявляющаяся в снижении синтеза АТФ, в снижении эффективности системы субстратного окисления, супрессии электрон-транспортной цепи, индукции неспецифической проницаемости мембран митохондрий, является патологичным для млекопитающих. Поэтому исследование молекулярных механизмов метаболической депрессии > пойкилотермных позвоночных животных в дальнейшем можег помочь в разработке новый терапевтических подходов в лечении митохондриальных заболеваний.

Апробация работы

Результаты исследования докладывались на Третьем Съезде Биохимического Общества в г. Санкт-Петербург 2002. Всероссийском симпозиуме «Механизмы терморегуляции и биоэнергетики- взаимодействие функциональных систем» в г. Иваново 2002, Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» в г. Пущине 2003; Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматографические приборы в г. Москва 2004; IX зимней школе на тему «Биоинформатика, от молекулярных механизмов к функциональным системам» на зоологической станции Твярминне, Финляндия, 2005. Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 статей, одна из которых в зарубежном журнале и 8 тезисов, четыре из которых опубликованы в иностранных изданиях.

Структура диссертации

Диссертация состоит из глав: Введение, Обзор литературы, Материал и методы, Результаты, Обсуждение, Выводы, Список литературы, который включает 300 источников.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные животные

В работе использовались минога речная, лягушка травяная и белая беспородная мышь. Миног вылавливали в октябре - ноябре в дельте Невы во время преднерестовой миграции из Балтийского моря в реку и содержали в ваннах с холодной (3-4°С) хорошо аэрируемой водой. Лягушек вылавливали в неурбанизированных зонах Ленинградской области и содержали без кормления в террариумах при температуре 3-4 °С, мышей содержали в виварии при регулярном кормлении и при комнатной температуре.

Измерение уровня глюкозы в плазме крови

Образцы крови животных брали из сердца (лягушки) и брюшной вены (минога). Кровь центрифугировали в гепаривизированных микропробирках в течение 5 мин при 6000 об/мин при температуре 3-4 "С.

Метод основан на взаимодействии глюкозы плазмы крови с орто-толуидином с образованием окрашенного в зеленый цвет продукта, определяемого фотометрически при длине волны 610 нм.

Исследование липидов плазмы крови

Липиды плазмы крови экстрагировали по методу Фолча [Folch et al, 1957]. Для вызеленил суммарных фосфолипидов, триацилглицеридов и свободных жирных кислот проводили одномерную тонкослойную хроматографию в системе гексан-димиловый эфир-уксусная кислота [Чеботарева, 1979]. Для достижения оптимального разделения липидов на пластинках определяли содержание липидного фосфора в экстракте по методу Лоури [Lowry el al-, 1974]. Идентификацию пятен на пластинках проводили по свидетелям и цветным реакциям. Относительное содержание отдельных классов липидов определяли по профилю интегральной интенсивности изображения пятен с помощью программы анализа изображения Matrox Inspector. Абсолютные концентрации липидов (мг/мл плазмы) рассчитывали, исходя из количества нанесенного на пластинку фосфора и относительному содержанию фосфолипидов н других липидов в липидном экстракте. Для определения содержания жирных кислот в разных классах липидов снятые с пластинок пятча суммарных триглицеридов и фосфолипидов подвергали щелочному метилированию, а свободных жирных кислот - кислому метилированию. Анализ метиловых эфиров индивидуальных жирных кислот проводили на газо-жидкостном хроматографе Pye 104 (модель 24) с пламенно-ионизационным детектором. Разделение вели на колонке (1.5м х 4 мм), покрытой хромосорбом W

с размером частиц 80-100 мэш (Perkin Eimer, США) при температуре 192 °С. В качестве жидкой фазы использовали 3% диэтиленгликольсукцинат. Газом-носителем служил гелий со скоростью потока 50мл/мин. Идентификацию жирных кислот проводили по относительному времени удерживания известных стандартов жирных кислот. Количество отдельной жирной кислоты определяли по плошади пика, вычисляемой как произведение высоты пика на его ширину при полувысоте; содержание выражали в процентах от суммы.

Определение свободных аминокислот в плазме крови

Высушенный депротеинизированиый образец плазмы дансилировали дансилхлоридом в ацетонитриле, 40 мин выдерживали в темноте, охлаждали и высушивали под вакуумом [Беленький и др., 1982]. Пробу помещали в морозильную камеру и хранили в темноте при -25 °С до анализа. Перед анализом к сухому остатку добавляли 0.1 N HCl, перемешивали, центрифугировали и вводили пробу в колонку. Хроматографическое разделение даисиламинокислот проводили на жидкостном хроматографе ХЖ-1311 с применением колонки размером 300 х 0.5 мм, упакованной сорбентом Nucleosil 5 Сц, в режиме линейно-ступенчатого градиента ацетонитрила в 0.01 М формиатном буфере (pH 3.53) при скорости элюировання 5 цл/мин. Детектирование флуориметрическое при длине волны возбуждения 254 нм и области флуоресценции 500- 700 им. По методу абсолютной калибровки были построены калибровочные зависимости для каждой аминокислоты.

Выявление гликогена и ляпидов в печени

Для выявления липидных включений фиксация ткани проводилась по методу Идельмана [Idelman, 1965] в модификации для световой микроскопии. Кусочки печени толщиной 2-3 мм в течение 30 мин фиксировали в 4% глутаральдегиде, приготовленном на буфере Миллонига [Millonig, 1961]. Для проводки использовали спирты с возрастающей крепостью Препараты заливали смесью эпона. Срезы окрашивали метиленовой синью.

Для фиксации гликогена использовали 2.5% глутаральдегид в 0.1 М фосфатном буфере (pH 7.2-7.4). Обезвоживание кусочков печени проводили спиртами постепенно нарастающей крепости и абсолютным ацетоном. Полимеризацию проводили эпоном Готовые срезы окрашивали раствором красителя аурамин-SO: [Кудрявцева и др. 1970] или обычным реактивом Шиффа.

Выделение митохондрий

Митохондрии из печени всех животных выделяли методом дифференциального центрифугирования при температуре не выше 2°С с применением совкаина и гепарина (в случае миног и лягушек) в средах выделения для ингибирования фосфолипазы Ai [Savina et al, 1975]. Концентрацию белка митохондрий определяли методом Лоури [Lowry et al., 1951].

Измерение скоростей дыхания митохондрий

Регистрацию скорости дыхания митохондрий проводили при 26°С на полярографе ЬР-7 с использованием платинового электрода типа Кларка. Концентрация белка митохондрий в полярографической ячейке составляла 1 мг/мл.

На митохондриях печени изучались разные метаболические состояния митохондрий: базальное дыхание (в присутствии субстратов), состояние 3 (субстрат и АДФ). состояние 4 (в присутствии субстратов и исчерпании экзогенной АДФ в среде инкубации), разобщенное дыхание в присутствии 2,4 -ДНФ (2.4-динитрофенол) и РССР (карбонияцыанид -п-трифторметоксифенилгидразон). Для определения участия АТФ/АДФ - и аспартат/путаматного - антипортеров в разобщающем действии жирных кислот использовали ингибиторы этих переносчиков- карбоксиатрактилат (Катр) и глутамат (Глут) соответственно. Скорости дыхания, дыхательные контроли (состояние 3/состояние 4), АДФ/О, скорости фосфорилирования бьши рассчитаны из полярографических кривых. Концентрации добавляемой АДФ определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии Значения ресопрягающих эффектов (ослабление разобщающего действия жирной кислоты) рассчитывали по формуле № - Дир)/(|ц -.1о), где .'о и 1и - скорости дыхания митохондрий соответственно до и после добавления лаурата, .1ир - скорость дыхания в присутствии Катр и лаурата или Глут и лаурата.

Исследование набухания митохондрий

Набухание митохондрий (0 5 мг белка/мл) исследовали в пластиковой кювете при комнатной температуре по изменению оптической плотности митохондриальной суспензии при длине волны 540 нм на спектрофотометре СФ-46.

Определение содержания адениновых нуклеотидов в митохондриях и кусочках печени

После декапитации печень животных немедленно замораживали в жидком азоте. Кусочки замороженной ткани растирали до порошкообразного состояния в охлажденной фарфоровой ступке с жидким азотом. Измельченную ткань экстрагировали ледяной 0.4 М НСЮд (10 цл/м1 ткани) и нейтрализовали 4.0 М К2СО3 (10 цл на 100 ¡о экстракта). Гомогенат центрифугировали, супернатант хранили при -80°С до анализа.

Митохондрии экстрагировали аналогичным образом непосредственно после выделения либо после 5-10 мин инкубации в присутствии субстратов.

Измерение уровня адениновых нуклеотидов в образцах проводили метопом обрашснно-фазной хроматографии с применением хроматографа марки «Кпаиег» (Германия) и колонки, заполненной сорбентом «КгошаяЛ 100А-С18» (150x4, 4 цм) (Россия) при длине волны 260 нм. Для полного разделения АТФ. АДФ и АМФ применяли градиентную элюцию фосфатного буфера [МапйесК а1., 2002].

Обработка данных производилась с применением двустороннего критерия Стьюдента и регрессионного анализа для программ Microsoft Excel 7.0 и OriginPro 7.0 for Windows 2003 Расчет количественного состава нуклеотидов в биологических образцах проводился методом внешнего и внутреннего стандартов с помощью программы Мультихром 1.52.0.0 для Windows. Данные в таблицах представлены как среднее и ошибка среднего (M ± m).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Энергообеспечение миног и лягушек в периоды метаболической депрессии и активности

1.1 Содержание глюкозы в плазме крови и гликогена в печени

Концентрация глюкозы в плазме крови миног и лягушек в 'осенне-зимний период метаболической депрессии снижается в 3-4 раза достигая минимального уровня в апреле-мае, 1-2 мМ (рис. 1 А, Б). Гистологические исследования, проведенные нами, показали, что содержание гликогена в печени миног низкое независимо от сезона (41-125 мг%). У лягушек, как и у высших животных, основным депо гликогена является печень. В ноябре, перед зимовкой, в печени содержание гликогена составляет 8000 мг% и постепенно утилизируется в течение зимней спячки, достигая значения 2540 мг% в марте [Львова, 1978].

1 2 Содержание отдельных классов липидов и индивидуальных жирных кислот в плазме

крови

В плазме миног уровень суммарных липидов в зимний период преднерестовой миграции высок (16.0 ± 3.2 мг/мл) и резко снижается весной, начиная с марта месяца (табл. 1). В плазме крови лягушек в начале гибернации уровень общих липидов составляет 4.8 ± 1.0 мг/мл (табл. 2). Во время гибернации их содержание постепенно снижается в 2.5 раза. Таким образом, содержание липидов в плазме крови амфибий значительно ниже в сравнение с миногами. В отличие от миног у лягушек подготовка к спячке сопровождается, главным образом, резервированием гликогена в печени, и в гораздо меньшей степени жира - в жировых тельцах. У миног печень преимущественно депонирует жир, о чем также свидетельствуют результаты проведенного нами гистологического анализа. Осенью в печени много липидных капель, весной их практически нет. В осенние месяцы анадромной миграции жир составляет 50% от сухого веса печени. В марте вес печени снижается на 40% вследствие истощения запасов липидов [Savina and Gamper. 1998].

Так же как и у млекопитающих, липиды плазмы крови миног и лягушек (табл. 1, 2) включают фосфолипиды. холестерин и его эфиры, свободные жирные кислоты и триглицериды. Исключение составляют воска, которых нет в плазме крови млекопитающих. В плазме миног онц составляют довольно значительный процент (7.5-24.6% в зависимости от сезона) от общего содержания липидов. Плазма крови лягушек также содержит воска. В абсолютном значении

X XI XII I И III IV V VI

месяцы

Рис. 1. Сезонная динамика содержания глюкозы в плазме кроен миног (А) и лягушек (Б). Изменение уровня глюкозы в крови пойкилотермиых животных в течение всего экспериментального периода описывается уравнениями линейной регрессии у = -О 03* + 7 40, г = -0 53 (р<0 001) для миног и у - -0.04х * 9 31, г= -0 80 (р<0 001) для лягушек. Эксперименты проводились в 2002 - 2003 г г Римскими цифрами по оси абсцисс указаны месяцы

содержание восков в плазме лягушек многократно меньше чем в плазме миног, однако, в процентном отношении они представлены значительными величинами (6-14%) По-видимому, воска широко представлены в пищевых цепочках миног и амфибий (планктон, беспозвоночные животные). ^

Таблица 1. Динамика содержанка отдельных классов липндов в гл»ме крови миног.

Классы Октябрь-ноябрь Декабрь Март Апрель

липндов

м г/мл плазмы (представлено содержание в %)

Фосфолипиаы Трнацил глицерины Свободные жирные кислоты Холестерин Эфиры холестерина Воска

Общие липидм

2.8 ±0.6 (17.5) сл

3.6 = 0.7(22.5) 7 5= 1.5(469) 2.1 ±0.4(13.1) 16.0 ±3.2(100.0)

3.4 ±0.7 (21 9) 1.5±0 3 (9.7) 0.5 ±0.1 (3.2)

2.4 ±0.5 (15 5) 3.9 ± 0.8 (25.2) 3.8 ± 0 8 (24 5) 15.5 ±3.1 (100.0)

2.4± 0 5 (14 7) 3.9 ± 0.8 (23 9) 0.9 ±0.2 (5.5)

3.0 ±0.6 (18 4) 4.2 ± 0.8 (25.8) I 9 ± 0.4 (11 7) 16.3 ± 33 (100 0)

1.5 ±0.3 (22.1) 1.1 ±0.2(16.2) 0.2 ±0.04 (2.9)

1.3 ±0.3 (19.0) 2.2 = 0 4 (32 4) 0.5 ±0.1 (7 4) 6.8 ± 1.3(100 0)

Таблица 2. Динамика содержания отдельных классов ляпшов в плазме крови лягушек.

К пассы Октябрь- Дегабрк Март Апрель Май

липндов ноябрь

мг/мл плазмы (представлено содержание в %)

Фосфолипиды 0.8 ± 02 (16.6) Тряацнлглицериды сл Свободные жирные сл кислоты

Холестерин 1.2 ±02 (25.0)

Эфвры 2.5 ±0 5 (52.1) холестерина

Воска 0.3 ± 006 (6.3)

Общие липиды 4.8 ± 1 0 (100.0)

1 0±02(21.7) 0.5 ±0.1 (13 9)

0.8 ±0.2 (17 4) 0.4±0.1 (11.1)

0 1 ±0.02(22) 03 ± 0.06(84)

07 ±0.1 (15.2) 0 7±0 1(19.4)

15 ±0.3 (32.6) \2± 0.2 (33 3)

0 5 ±0.1 (10.9) 0 5 ± 0.1 (13 9)

4 6 ± 0.9 (100.0) 3 6 ± 0.7 (100 0)

04±0.1 (21 1) 0.5 ± 0.1 (20 8)

0.1 ±0.02(5.3) 0 1 ±0.02(4.2)

02 ±0.04 (10.5) 0 1 ±0 02(4.2)

04 ±008 (21 1) 0.5± 0 1(20 8)

06*0 1(31.3) 0.9±02 (37.5)

0.2 ± 0.04 (10.5) 0.3 ±0.06 (12.5)

I 9 ± 0.4 (100.0) 2.4 ± 0.5 (100.0)

Содержание фосфолипидов, основная функция которых сводится к образованию мембранных структур, в плазме миног 1.5-3.4 мг/ мл. У лягушек, в силу вообще низкого общего содержания липндов в плазме, концентрация фосфолипидов в зависимости от сезона колеблется от 0.4 до 0.98 мг/мл. Что касается процентного содержания фосфолипидов, то у миног и у лягушек эти величины очень близки (14-23%). Таким образом, ни эволюционный статус животного, ни его физиологическое состояние (стадия многомесячного голодания) не оказывают существенного влияния на удельное содержание фосфолипидов в плазме крови. Чго касается

жирнокислотного состава фосфолипидов, то у миног зарегистрировано более высокое содержание моноеновых кислот (45.4-49%) и полиеновых кислот <»-3 типа (8.9-17%) по сравнению с лягушками, у которых содержание моноеновых кислот ниже (26 3-37%), а полиеновых кислот <»-6 типа существенно выше (24.6-27.6%).

Холестерин вместе с производными (эфиры холестерина) составляет у миног до 50-70% от липидов плазмы и снижается до 40% только в зимние месяцы и ранней весной. У лягушек в процентном отношении суммарное содержание холестерина и его эфиров колеблется в близких к миногам значениях (48 - 77%) Данный факт объясняется тем, что пойкилотермные животные в период метаболической депрессии расходуют запасы липидов (холестерина и фосфолипидов в том числе), которые были сделаны в период активного питания. Поддержание высоких уровней холестерина и фосфолипидов на протяжении этого периода, в частности, необходимо для синтеза половых продуктов.

Что касается свободных жирных кислот и триглицеридов, то в крови миног в самом начале преднерестовой миграции (октябрь, ноябрь) и в крови лягушек осенью они не обнаружены. В марте содержание триглицеридов и свободных жирных кислот в плазме миног заметно увеличивается в 2-2.6 раза. У лягушек на протяжении гибернации концентрация этих липидов постепенно снижается и достигает минимального уровня в апреле - мае. Оценка индивидуальных жирных кислот показывает, что жидкостность триглицеридов миног обусловлена моноеновыми (22-34%) и в большей мере полиеновыми кислотами ш-3 типа (29-54%), тогда как у лягушки -также моноеновыми (36-52%) и полиеновыми кислотами го-6 типа (12.7-23%), которые являются более тугоплавкими по сравнению с го-3 кислотами То есть, триглицериды миног более жидкостны по сравнению с таковыми у лягушек, что подтверждается и низкими значениями индексов ненасыщеаности у последних (226.5 - 328.0 у миног и 114.6 - 141.6 у лягушек). Этот факт можно объяснить своеобразием трофических цепочек животных и их физиологическими особенностями. Качественный состав свободных жирных кислот удивительно похож у круглоротых и амфибий и разительно отличается от состава эстерифициро ванных жирных кислот Большая часть (до 90%) свободных жирных кислот представлена насыщенными и моноеновыми кислотами.

1.3. Аминокислотный состав плазмы

Данные по суммарному пулу аминокислот обнаруживают противоположную динамику у миног и лягушек на протяжении "голодного" периода (табл. 3). У моноцикличных, погибающих весной после вымета половых продуктов, миног в ноябре суммарный пул аминокислот составляет 1118 ± 91 цмоль/л, в феврале он возрастает на 32% и составляет 1486 ± 87, а в апреле пул достигает максимального значения 1943 ± 91 цмоль/л, т.е. увеличивается на 74% в сравнении с осенью. У многократно размножающихся лягушек в октябре пул аминокислот составляет 1401 ±

47 цмоль/л, в ноябре и декабре-январе он снижается на 27-20% и составляет, соответственно, 1030 ± 89 и 1133 ± 90 цмоль/л. В апреле пул свободных аминокислот достигает минимального значения - 827 ±112 цмоль/л, т.е. в сравнении с осенними величинами уменьшается более чем на 40%

Содержание лейцина и изолейцина в плазме крови миног с ноября по апрель стабильно - 1012%, несмотря на количественное изменение суммарного пула аминокислот за этот период. То же самое можно сказать о валине, его сезонные колебания составляют 5-7 5% У лягушки содержание в плазме крови разветвленных аминокислот существенно выше - от 11 до 18% лейцина + изолейцина и от 7 до 12% валина. В октябре аминокислотный пул в плазме лягушек почти на 30 % представлен разветвленными аминокислотами. Преобладание разветвленных аминокислот указывает на строго контролируемый протеолиз белков.

Далее по удельному вкладу в общий пул аминокислот следует аланин (а - и f$- формы). У миног в плазме крови с ноября по апрель а-алаиин составляет 8-10% от суммарного пула, а Э-аланин- 10-12%, у лягушек -7-12% и 3-6%, соответственно. У миног «транспортная» функция а -аланина, скорее всего, используется для «перекачки» белка мышц в белки гонад. У лягушек, по-видимому, происходит окислительный катаболизм а — аланина. Присутствие |3 - аланина свидетельствует о распаде пнримидинов, который в тканях миног происходит интенсивнее в сравнении с лягушками.

Существенный вклад в аминокислотный пул крови миног и лягушек вносят такие аминокислоты как треонин (7-11% от суммарного пула для миног и 6-9% - для лягушек) и лизин (6-11% - миноги и 4-7% -лягушки). Эти две аминокислоты не имеют своих трансаминаз и не могут переаминироваться. поэтому они слабо утилизируются тканями, и их уровни в плазме крови остаются высокими Кроме того, известно, что лизин не синтезируется и не катаболизирует в мышце и, таким образом, его содержание в плазме есть индекс протеолиза белков мышц.

Уровни глицина и серина, из которого образуется глицин, достаточно высоки В плазме миног в ноябре глицин составляет 7% от суммарного пула, а в феврале и апреле - 9-11%. Колебания содержания серина составляют 3.5-5%. У лягушек глицин осенью и весной составляет 5-6% от суммарного пула, а в зимние месяцы - 9-12%. Содержание серина колеблется от 3-5% осенью и весной до 6-8% - в зимний период.

Уровни глутамина в плазме крови миног невысоки, только в начале преднерестовой миграции он составляет порядка 7%, а в зимний и весенний периоды снижается до 3-4% . Глутамат в плазме крови миног в зависимости от сезона колеблется от 1 до 5% от общего аминокислотного пула, а > лягушек - от 2 до 8%. У лягушек с октября по апрель в плазме крови нами зарегистрированы невысокие концентрации глутамина - от 3 до 5% от всего пула аминокислот.

Таблиц* 3. Сезонное содержанке свободных аминокислот в плазм« крови мнног и лягушек (рмоль/л плазмы). В скобках представлено содержание в % от общего пула аминокислот.

миноги лягушки

Аминокислоты Ноябрь Февраль Апрель Октябрь Ноябрь Декабрь-январь Апрель

а-аланин 89 0 ±6.1 (8.0) 146.6 ± 10 7(9 9)* 166 8 ± 19.3 (8 6)' 102.3 ±76 (7.3) 121 3 ±9 5 (11 8) 90.9 ± 14 2(8 0) 78 5 ± 16.3 (9.5)*

(З-аланин 125.4 ± 196(11.2) 177.5 ± 13.3(11.9)' 179 3 ± 20.7 (9.2)* 34.6 ±2.7 (2 5) 62.7 ± 5 б (б 1)* 65.3 ± 8.8 (5 8)* 49 6 ± 11 7 (6.0)

а-аминомасляная кислота 5.9 х 1.0(0 5) 7.3 ± 1 0(0 5) 5 7 ± 2.0 (0 3) • 6 5 ± 0 8 (0 6) 4.6 ± 1.6(0.4) -

Р-аминотомасляная кислот 1 7.6± 12(0.7) 123±56(0 8) 88± 1.5(0 5) 64.3 ±78 (4.6) 38 7 ± 3 3 (3 8)* 32.7 ±2.0 (2.9)* 120 ±2.3(1 5)*'

Аргинин 11 5 ±2.5 (1.0) 10.9 ±25 (0.7) 17.5 ±3.8 (09) 58.3 ± 6.3 (4 2) 10 8 ± 0.8 (1 0)' 7.8 ± 1.7(0.7)* 15.3 ±68(1.9)*

Асларагин 19 7± 4 2 (1.8) II 8 ± 3 2 (0.8) 16 0 ± 3 1 (0.8) 29 0 ±3.4 (2.1) 8 9± 0.6 (0 9)* 11.7 ± 0 7 (1 0)' 11.0 ± 1.9(1.3)*

Валин 55.2 ± 10.9(4.9) 100.8 ± 18.1 (6 7) 146 0± 19.7(7.5)* 166.5 ±9.6 (11.9) 72.5 ± 6.3 (7 0)* 102.5 ± 17.6(9 0)* 69.1 ±9.9 (8.4)*

Гисгидин 33 3 ±7 9(2.9) 35.5 ± 5 5 (2 4) 56.8 ± 10.1 (2.9) 38.8 ± 4.2 (2.8) 48.6 ± 5 0 (4 7) 48 5±9.1 (4 3) 16 9 ±2.9 (2.0)"

Глутамин 76 0 ±6.4 (6.8) 56.5 ±9 1 (3 8) 53 7 ± 8 1 (2 8) 62 0 ± 4 8(4.4) 34.7 * 2.7 (3 4)' 34.8 ±4.7(3 1)* 33.1 ±7 1 (4.0)*

Глутаминоаая кислота 34.9 ±4.3(3 1) 72.6 ± 6 1 (4 9)* 15 9± 2 7(08)*' 20 5 ±5.2 (2 1) 80 6 ± 5 2 (7 8)* 65 7 ± 13.5(5 8)* 15.6 ±3.3(1 9)*

Глнцнн 78 7 ± 10 6(7 0) 159.5 ± 10.4(10.7)' 178 4 ± 12-2(9 2)' 71.3 ± 9.1 (5 1) 118 9± 14.5(11.5)* 99.1 ±27.5 (8.7)* 49 6 ±9.2 (60)"

Лейцин, изолейцин 120.2 ± 1 0(10 8) 150.3* 17 7(10.1) 225.4 ±23.7(1!.6)" 249.6 ± 15.3(17 8) 110.2 ± 11 1 (10.7)* 1744 ± 31.7 (15 4)* 131.3 ± 23 0(15 8)*

Личин 127.0 ±2! 5(11.4) 81.6± 30 3 (5 5)' 161 7 ±4.2 (8 3)' 62.3 ±5.1 (4 4) 41 4± 7 5(4 0)* 77 4 ± 13 5 (6 8) 46.2 ±67 (5.6)*

Метиоиин 5.5 ±0 7 (0 5) 10 0 ± 2.7 (0.7) 11.2 ± 1.9(0 6) 20.3*2.1(1.4) 104± 10(10)* 16 7 ±4.5 (1.5) 14.3 ±2.0(1 7)

Орнитин 58.1 ± 16.9(5 2) 55.0± 166(3 7) 119.1 ± 10.2 (6.1)*' 41 5 ±4.4 (3.0) 39 1 ± 6.4 (3 8) 54 6 ± 4 5 (4.8)* 41 1 ±8.1 (5.0)'

Пронин 16.5±2.7(1.5) 30.8*50(2 1)* 40.5 ±6.0 (2.1)* 26.9 ± 1.1 (1 9) 15 04 2.3 (1.5)* 15.4 ±2.4 (1.4)* 20.6 ±32 (2.5)*

ОН- пролим 5.0 ±0.6 (0.4) 8.3 ± 1 7 (0.6) 6 3 ± 0.8 (0.3) 6.6 ±0.7 (0.5) 8 7± I 3(0.8) 14 4 ±4.7(1 3) 4 9 ± 0.9 (0 6)*

Серии 60 2 ±94 (5.4) 74 1 ± 7 7 (5.0) 68.7 ± 6 2 (3 5) 46 6± 6.4 (3.3) 80 9± 8 9(7.9)* 65 8 ± 13.5 (5 8) 41 6 ±84(5 0)*

Таурин 22.6 ±4.3 (2.0) 37 8 ± 6 9 (2.5) 37.9 ±5.8 (2,0) 44.0 ±5.3(3 1) 19 4 12.4 (1 9)* 19 8 ± 5 0(1.7)* 14 8± 2 0(1 8)*

Треонин !!96± 18.3(10 7) 161.2 ±22 5(10.8) 127.8 ±20.6 (6 6) 124 4 ±8.5 (8 9) 79 6 ± 14 5(7.7)* 71 7 ±27.5 (6.3)* 45.7 ± 9 2 (5 5)*

Триптофан 16.3 ±4.1(1 5) 37 8 ± 12 2(2 5)' 13.2 ± 2 4 (0.7)' 6.3 ± 0.9 (0.4) - 28 7 ± 8.0 (2 5)* 9 2 ± 0 1 (1 1)*

Тирозин - - 223.7 ± 34.3 (11.5) 76 4 ± 8.4 (5.5) - - 70.7 ± 13.7 (8.5)

Фенилалании 30.5 ± 6.5 (2 7) 48.3 * 6 2 (3.3) 62 9 ±5.9 (3.2)" 39.9 ±2 1 (2 8) 21 5 ±2.4 (2.1)* 31 3 ±4.2 (2 8) 36.1 ±66(44)

Суммарный пул 1118 ±91 (100.0) 1486 ±87 (100 0) 1943 ±91 (100.0) 1401 ±47(100.0) 1030 ± 89(100.0) 1133 ± 90 (100 0) 827± ¡12(100)

*- р<0.05 (по сравнению с данными в ноябре или октябре) * - р<0.05 (по сравнению с данными в феврале или декабре-январе)

В отличие от лягушек, миноги аммонотеличны, поэтому в их плазме крови практически отсутствуют аминокислоты орнитинового цикла. Низкое содержание аргинина и орнитина в плазме лягушек зимой свидетельствует, по всей вероятности о том, что синтез мочевины в этот период у лягушек резко замедлен из-за снижения АТФ - зависимого синтеза цитруллина в митохондриях печени.

Большой интерес представляет количественная "вспышка" тирозина, предшественника меланина, в апреле и триптофана, предшественника серотонина. в декабре-феврале в плазме крови миног. Если в ноябре и в феврале тирозин отсутствует полностью, то в апреле он составляет 11.5% от суммарного аминокис тотного пула. У лягушек тирозин зарегистрирован в октябре (5%) и в апреле (9%). У миног вклад триптофана в общий пул аминокислот в ноябре составляет 1.5%, в декабре - 2 5% и снижается в апреле до 0 6%. В плазме крови лягушек в ноябре триптофан не регистрируется. Максимальное содержание триптофана наблюдается в декабре-январе (2.5%) и снижается в апреле (1.1%)

Все остальные аминокислоты в плазме крови миног и лягушек представлены минорными фракциями: гистидин - 2-3%, феиилаланнн - 2-4%, таурин - 2-3%, метионин - 0.5-1.5%, аспарагин -0.8-2% и пролин 1.5-2.5%.

Таким образом, аминокислотный профиль плазмы крови длительно голодающих пойкилотермных позвоночных - миноги и лягушки - обнаруживает сезонные изменения и свидетельствует о контролируемом протеолизе и подавлении биосинтетических процессов в многомесячные периоды синхонии и гибернации.

2. Биоэнергетические параметры митохондрий печени миног и лягушек в периоды метаболической депрессии и активности

2 1 Оценка параметров дыхания митохондрий Сравнение с млекопитающими Скорости дыхания митохондрий печени миног и лягушек в различных метаболических состояниях обнаруживают выраженную зависимость от сезона. Особенно четко это прослеживается на митохондриях миног. При изучении дыхания (базальное дыхание и состояние 4) митохондрий, очевидно, что в апреле скорости дыхания в присутствии пирувата и малата в сравнении с декабрем - февралем увеличиваются почти в 3 раза, в присутствии сукцината ± ротенона - в 1.4 - 2 раза (табл. 4).

В митохондриях активных лягушек скорости базального дыхания и дыхания в состоянии 4 в присутствии НАД - и ФАД - зависимых субстратов в 1.5 - 2 раза возрастают по сравнению с митохондриями депрессированных животных (табл. 5).

У миног и лягушек, находящихся в активном метаболическом состоянии, скорости дыхания митохондрий в состоянии 4 в присутствии НАД - зависимых субстратов практически достигают скоростей дыхания митохондрий мышей (табл. 6)

с »

Таблица 4. Сезонные изменения основных биоэнергетических параметров митохондрий печени миног, инкубированных в среде, евмрмммй (мМ): 250 сахарозы, 3 трис-HCI (рН 7.3). 3 MgCI;, 3 КН,РО,. Конечные концентрации добавок в мМ: S пируватв, I малага, 5 сукцииата, 0.005 ротеиона.

Субстраты

Батальное дыхание

Состояние 3

Состояние 4

нмоль Оз/мин/мг белка

Разобщенное ДК АДФ/О Скорость

дыхание фосфорилирования

нмоль АДФ/мнн/мг белка

Декабрь - февраль

Пируват + малат

(п-9) Сукцинаг (п-5) Сукцкнат + ротенон (п-4)

3 48 * 0.46* 7 05 * 0 76* 4 !7±П65*

6.24 ± 1.18 12 54 ±0.90" 6 45 ±162»

6.81 * I 69 15.27 ± 2 36* 1047* 1 90

4 35 ± 0 56* 1 98 ± 0 29* 2 05 * 0.46

12.97* I 70 2 27 * 0 96 I.1S±031*

18 70 * 0.24* 1 81*0 24* 1 51*0.34

23.36 * 821* 15 63*4.35* 22.47*6 33*

Март

riHpvaaT * малат

(п=9) Сукиинат (ч»5) Сукцинаг + ротенон (п-4)

520*042' 14 32*186* 6 02 * 0 34* 9.62 * 2.40

6 73 * 073 16.66 * 061* 7.95 * 0 37 6.42 * 2.46

7.00 * 042 1034 * 052* 723 * 051* 14.77*1.87

2.4*0.29* 2.51*0.17

228*037 202*0.24

1 45*011 1 49*0 15

46 39x5.15* 3007*3 42* 25 47 * 3 93*

Апрель

11ируват + машп 10.65*106 42.65 * 4.01 12 64* 1 06 31.53 * 8.33 3 53 * 0 44 2.75 * 0 14 (п-9>

Сукцинаг 1094 * 2.50 2701*391 12.43*1 85 30.25 * 6 13 2.20 * 025 2 72 * 0.21

(п-5)

Сукиинат + ротенон 12.11 *340 33 37 * 576 13.24*180 25.09 * 6.00 2.44 * 030 1 63 * 0.18 (п-4)

- р<0 05 (но сравнению с данными в апреле)

229.3*35.61 105 23*23 31 75.91 * 7.10

Таблица 5. Сезонные изменения основных биоэнергетических параметров митохондрий печени лягушек, инкубированных в среде, содержаще! (мМ): ДЯ сахарозы, 3 трис-НО (рН 7.3), 3 М{С1> 3 КН|РО>. Конечны« концентрации добавок а мМ: 8 глутамата. 5 яирувата, I малата. 5 сукиината, 0.005 ротеиона.

Субстраты Базальное Состояние Состояние Разобщенное ДК АДФ/О Скорость

3 4 дыхание фос формирования

Состояние 4

Разобщенное дыхание

нмоль Ог/мин'мг белка

нмоль АДФ/мин/мг белка

Октябрь - март

I лутамат + малат 4.62 ± 0.65 * 9.84.1 2.79* (п-5)

Пируват + малат 4.03 ±0.68 8.79 ± 1.04

(п"-9)

Сукцинат 8 77 ±2.08 17.23 ±3.98* (п-3)

Сукцинат + ротенон 5 56±1.13 919±1.27* (п-4)

7.21 ±2.01* 10.12 ±2.72* 138 ± 0.04 1.38 ±0.05

5.38 ± 0.74 7.19± 1.02 1.72 ±0.22 2.61 ±0.51

12 80 ± 2.98 * 27 43 ± 661 1.33 ± 0.03 1.42 ±0.46

6 60 ± 1.04 14.14 ± 3.88* 1.41 ±0.04 1.74 ± 0.54

26.76 ±2 21 53.14 ± 14.05 30.93 ± 9.44 21.07 ±4.62

Май - сентябрь

Глутамат + малат 9.63 ±0.84 21.93 ±2.88 (п-6)

Пируват + малат 7.36 ± 1.44 14.72 ±2 94 (п-9)

Сукцинат 13.86 ±2.95 27.34 ±3 15 (п-З)

Сукцинат + ротенон 12.10 ±4.13 20.36 ±3 35 (п=4)

- р*-0.05 (по сравнению с данными в мае-сснтябрс)

15.51 ±2.13 23.48 ±3 91 1 61 ±0.34 2.36 ±0.53

9.98 ± 2.32 10.22 ± 2 41 1 60 ± 0.13 3.76 ±0.64

25.06 ±2 88 30.48 ±6 20 1.08 ±0 05 0.88 ±0.35

14 69 ±3.85 24.02 ±4 66 1 60 ±0 25 1.03 ±0.18

37.13 ±8.84 71.|7± 17.16 17.00 ±6.31 28.75 ± 7 47

Таблица 6. Биоэнергетические параметры митохондрий печени мышей, инкубированных в среде, содержащей (мМ): 250 сахарозы, 3 трис-HCl (рН U), 3 MgCb, 3 КН,РО,. Конечные концентрации добавок в мМ: 5 глутамята, I М1.Щ1.5 сукцииата, 0.005 ротеноиа.

Субстраты

Базальное дыхание

Состояние

3

Состояние 4

Разобщенное дыхание

нмоль Oj/mhii/mi белка

ДК АДФ/О Скорость

фосфор ил ирования

нмолъ АДФ/ммн/мг белка

Глугамат + малаг

(п-14) Суюшиат

(п=4) С.'>кцина1 + ротинон (п—4)

14 95 ±1.21 81.91 ±5 91 16.36 ±0 89

38 62 ± 3 54 135 6« ± 22 55 44 35 ±6 14

34 72 ±2 69 131 13 ±24 18 4JI6±6W

76 03 ± 9 74 5.25 ± 0.52 1 79±0 12

135 98 ± 37 02 3.05 ±0.19 I 40 ±0 10

133.07 ±27 75 3.05 ±0.22 120 ±002

249 69 ±39.81 269 24 ± 82.66 173 05 ±21 75

Рис. 3. Влияние 2,4-ДНФ и РССР на исфосфорилирующее дыхание митохондрий. Среда инкубации содержала (мМ). 250 сахарозы, 3 трис - НС1 (рН 7 3), 3 3 КН2РО,, 5 сукцииата, 0.005 ротенона и олнгомицин 4 5 цг/мл. А, В - минога; Б, Г - лягушка Кривые 1 - зима, 2 - весна.

Анализ дыхания в состоянии 3 (табл. 4) показал, что в апреле в сравнении с зимним периодом скорости окислительного фосфорилирования в присутствии пирувата и малата в митохондриях миноги возрастают в 3.5 раза, а интенсивность фосфорилирования в присутствии сукцината возрастает в 2 раза.

Весной улучшается сопряженность митохондрий печени миног, о чем также свидетельствуют существенные изменения величин ДК, АДФ/О и скорости фосфорилирования. Скорость фосфорилирования увеличивается в 10 раз в присутствии субстратов первого дыхательного комплекса и в 3 раза в присутствии субстратов второго комплекса (табл. 4).

Между тем, в митохондриях активных лягушек скорости дыхания в состоянии 3 возрастают только в 1.6-2 раза в присутствии НАД - и ФАД-зависимых субстратов. Величины ДК, АДФ/О и скорости фосфорилирования не обнаруживают значимых сезонных изменений (табл. 5).

Для того чтобы дать дополнительную оценку сезонным изменениям в активности электрон-транспортной цепи следует обратиться к анализу нефосфоршшрующего дыхания, разобщенного 2,4-ДНФ и РССР. При стимуляции нефосфорилирующего дыхания митохондрий 2,4-ДНФ в присутствии сукцината, ротенона и олигомицина можно видеть, что максимальная разобщающая концентрация разобщителя д.1я митохондрий миног не превышает 4 цМ в январе и достигает 8-10 рМ в апреле (рис. 3 А), для лягушек - 8 цМ зимой и 10 цМ весной (рис. 3 Б). Указанные концентрации ДНФ ускоряют нефосфорилирующее дыхание митохондрий пойкилотермных животных почти одинаково - в 2.5 - 3 раза не зависимо от сезона.

Аналогичная закономерность выявляется при использовании другого искусственного разобщителя - РССР. Этот протонофор ускоряет дыхание митохондрий печени миноги в 1.6-2 раза при концентрации 20 нМ в январе и 100 нМ в апреле (рис. 3 В). Весной для максимального разобщения дыхания митохондрий лягушек необходимо 100 нМ РССР, что в 2 раза превышает концентрацию, необходимую для разобщения в период гибернации животных (рис 3 Г).

Приведенные данные свидетельствуют о подавлении активности системы субстратного окисления и низких значениях мембранного потенциала митохондрий пойкилотермных животных в периоды синхонии и гибернации.

2.2. Содержание адениновых нуклеотидов в митохондриях и кусочках печени

В зимние месяцы суммарный пул адениновых нуклеотидов в митохондриях печени миног снижается на 23-34% (3.46 ± 1.04 - 3.79 ± 0.2 нмоль/мг белка) в сравнении с осенними и весенними месяцами(4.93 ± 0 62 нмоль/мг белка). Концентрация АТФ колеблется в пределах 0.7 ± 0.08 - 0.99 ±0.16 нмоль/мг белка. Что касается митохондрий лягушек, известно, что суммарный пул адениновых нуклеотидов в январе снижается на 27-32% (9.25 нмоль/мг белка) по сравнению с данными в сентябре (12.60 нмоль/мг белка) и в апреле (13.6 нмоль/мг белка) [Савина и др., 1992]

Минимальные концентрации АТФ наблюдаются в декабре-январе (2.6 - 3.35 нмоль/мг белка). Следует отметить, что концентрации адениновых нуклеотидов в митохондриях лягушек существенно превосходят значения, полученные нами на митохондриях печени миног.

Ранее проведенные исследования jSavina and Gam per, 1998] показали, что в январе -феврале содержание АТФ в гепатоцитах миног снижается с 1.3 до 0.69 нмоль/мг вл массы, а у единичных особей достигает 0.2-0 11 нмоль/мг вл массы. В ткани печени миног в январе - феврале содержание АТФ колеблется в пределах 0.63-0 74 нмоль/мг вл массы и увеличивается до 1.01 нмоль/мг вл массы в апреле. Энергетический потенциал гепатоцитов заметно возрастает от 0.3 -0.5 зимой до 0.7 в апреле - мае.

В ткани печени активных лягушек суммарный пул нуклеотидов в 2 - 2 5 раза выше (1.38 ± 0.07 - 1.67 ± 0.18 нмоль/мг вл массы) по сравнению с гибернирующими животными (0.65 ± 0.12 -0.8 ± 0.11 нмоль/мг вл массы). Концентрация АТФ значимо уменьшается с октября (0.63 ± 0.1 нмоль/мг вл массы) по февраль (0.21 ± 0.04 нмоль/мг вл массы) и повышается с апреля (0.74 ± 0.21 нмоль/мг вл массы) по июнь (1.18 ± 0.1 нмоль/мг вл массы). Заряд Аткинсона колеблется от 0 64 до 0.87 в зависимости от сезона.

Таким образом, в период метаболической депрессии пойкилотермные животные обратимо супрессируют скорости дыхания и фосфорилирования. Низкий мембранный потенциал, о чем также свидетельствуют кривые по титрованию нефосфорилирующего дыхания разобщителями (2.4-ДНФ, FCCP), недостаточен для оптимального синтеза АТФ. В митохондриях печени миног это наиболее очевидно.

3. Ресопрягающие эффекты карбоксиатрактилата (Катр) и глутамата (Глут) на разобщающее действие ляурата

В клетках печени позвоночных животных от 15 до 40% кислорода, потребляемого митохондриями, не связано с синтезом АТФ и обусловлено пассивной утечкой протонов через внутреннюю мембрану органелл. В изолированных митохондриях этот процесс может быть индуцирован разобщителями окислительного фосфорилирования. Среди природных разобщителей большой интерес представляют свободные длинноцепочечные жирные кислоты Разобщающее действие жирных кислот может быть опосредовано белками внутренней мембраны митохондрий, в частности АТФ/АДФ - и аспартат/гтутаматным антипортерами. Наши исследования показали, что разобщающий эффект лаурата подавляется совместным действием ингибиторов АТФ/АДФ -антипортера Катр и лиганда аспартат/г.тутаматного антипортера Глут. Это свидетельствует о том, что в митохондриях печени миног и лягушек, так же как и в митохондриях печени мышей, в разобщении принимают участие АТФ/АДФ - и аспартат/глутаматный актипортеры Для количественной оценки степени участия в разобщении этих переносчиков могут быть применены величины ресопрягающих эффектов соответственно Катр и Глут [Самарцев и др, 1999] Под

ресопрягающнм действием понимают величину, выражающую степень подавления стимуляции жирной кислотой дыхания митохондрий. Ресопрягающий эффект удобно выражать в %. В осенний и зимний периоды метаболической депрессии в митохондриях величины ресопрятающих эффектов Катр составляют 52 и 49% соответственно. Последующая за Катр добавка Глут не оказывает ингибирующего действия на дыхание митохондрий, разобщенных лауратом в ноябре, и оказывает ресопрягающий эффект (28%) в декабре-январе В марте Катр и Глут полностью ресопрягают разобщающее действие лаурата и частично ингибируют эндогенное дыхание митохондрий, обусловленное присутствием в митохондриях эндогенных жирных кислот Инкубация митохондрий в среде с БСА, связывающего эндогенные жирные кислоты, практически нивелирует сезонные различия в скоростях нефосфорилирующего дыхания, а Катр и Глут не оказывают ресопрятающих эффектов.

В митохондриях печени лягушки ресопрягающне эффекты Катр и Глут не обнаруживают значимых статистических сезонных изменений. В митохондриях зимних лягушек ресопрягающне эффекты Катр и Глут равны (52%), а в весенних - действие Катр незначительно усиливается (67%), а действие Глут снижается (40%). Величины ресопрятающих эффектов, наблюдаемые в митохондриях печени лягушек, близки к таковым в митохондриях печени мышей (Катр 68 - 70%, Глут 26-38%).

4. Мембранная проницаемость митохондрий печени миног и лягушек. Индукция пары. Действие эффекторов поры на набухание митохондрий в разных средах инкубации. Сравнение с млекопитающими

4 1. Проницаемость мембран митохондрий в растворе нитрата аммония

Как видно на рисунке 4 А, в среде 125 мМ NH4NO3, 5 мМ трис-HCI (pH 7.3) митохондрии печени миног (кривая 1). в отличие от митохондрий лягушек (кривая 2) и мышей (кривая 3), пассивно набухают в результате транспорта протонов в матрикс. Одновременный вход ионов NO3" и NHt\ как NH3 и Н+, сопровождается проникновением молекул воды, что приводит к увеличению объема матрикса и последующему снижению светорассеяния.

Энергизация сукцинатом приводит к резкому сжатию митохондрий печени миног в течение всего периода преднерестовой миграции (рис. 4 Б, кривые 1 и 2). Внесение пирувага и маната приостанавливает пассивное набухание зимой (рис. 4 Б, кривая 3) и вызывает сжатие митохондрий с выраженным лаг периодом весной (рис. 4 Б, кривая 4).

Митохондрии печени лягушек, преинкубированные с субстратами I и II комплексов электрон-транспортной цепи, энергизуются не зависимо от сезона, что также приводит к повышению оптической плотности митохондриальной суспензии (рис. 4 Б, кривые 5, 6).

мх

А

Б

6

5

2

ДА 0 025 I_-

3

мин

Рис. 4. Проницаемость мембран митохондрий печени минО|, лягушек, мышей в растворе нитрата аммония (А) Действие энергизации на протонную проницаемость мембран митохондрий печени миног и лягушек (Б). Среда инкубации содержала (мМ) 125 МК,Ж)з, 5 трис-ЫО, (рН 7 3) Стрелками показана добавка митохондрий (МХ) и субстратов Митохондрии (0.5 мг белка/мл) печени вносили в кювету с инкубационной средой перед регистрацией оптической плотности А I - МХ миног, 2 - МХ лягушек, 3 -МХ мышей Б 1 - МХ миног + 5 мМ сукцинаш + олигомицин 4 5 цг'мл (февраль - апрель), 2 - МХ миног + 5 мМ сукой ката + 5 цМ ротенонэ + олигомицин 4.5 цг/мл (февраль - апрель); 3 - МХ миног + 5 мМ пирувата + 1 мМ маната + олигомицин 4 5 цг/мл (февраль), 4 МХ миног + 5 мМ пирувата + I мМ малата + олигомицин 4 5 цг/мл (апрель), 5 - МХ лягушек +■ 5 мМ сукцината + 5 цМ ротенока + олигомицин 4 5 цг/мл (январь-май), 6 МХ лягушек • 5 мМ пирувата + 1 мМ малата + олигомицин 4 5 цг/мл (январь-май) ДА - изменение оптической плотности митохонлриальной суспензии

Рис. 5. Действие ингибиторов поры на набухание митохондрий печени миног в период метаболической депрессии Среда инкубации содержала (мМ) 125 МН.\03, 5 трис - N0, (рН 7 3), 5 мМ пирувата, 1 мМ малата и олигомицин 4 5 цг/мл Стрелкой показана добавка митохондрий (0 5 мг/мл) (МХ) До внесения в среду митохондрий были сделаны следующие добавки' I - без добавок, 2 - I цМ СвА или 10 мг/мл БСА, 3 - 25 ел гепарина/мл; 4 - 1мМ ЭГТА, 5 1 цМ СхА + 0 5 мМ MgClг + 0 3 мМ АДФ или 1 цМ СзА + 10 мг/мл БСА + 25 ед гепарина/мл + 1 мМ Э1ТА

В зимний период преднерестовой миграции набухание энергизованных пируватом и малатом митохондрий печени миног чувствительно к действию ингибиторов поры (СвА, БСА, гепарин, ЭГТА, М^ , АДФ) (рис 5) Наиболее выраженное ингибирование оказываю! ЭГТА (кривая 4) и СвА + М£2+ + АДФ, также как СбА + БСА + гепарин + ЭГГА (кривая 5).

?

мин

В апреле - мае митохондрии печени миног, преинкубированных с НАД-зависимыми субстратами (пируват и малат), не набухают. Действие ингибиторов поры на мембранную проницаемость митохондрий не выражено.

Зимой в печени миноги все метаболические процессы протекают крайне медленно Такие факторы, как низкий пул адениновых нуклео гидов, снижение активности ферментов аэробного метаболизма, спад мембранного потенциала, по всей видимости, являются сигналом для индукции поры в митохондриях печени миноги в этот период.

Эффекты таких ингибиторов как ЭГТА, гепарин, CsA, Mg2+, АДФ приводят к снижению набухания энергизованных митохондрий миног зимой, указывая на тот факт, что в индукции поры в этот период могут быть задействованы ионы кальция, активация фосфолипазы А2, а также белки митохондрий АТФ/АДФ - антипортер, циклофилин Д [Zoratty and §zabo, 1995; Broekemeier and Pfeiffer, 1995; Crompton, 1999].

В последнее время установлена важная роль поры в индукции некротических изменений в клетке [Kroemer et al., 1998; Kim et al., 2003a; Kim et al., 2003b]. Эти изменения имеют место в печени половозрелых миног и прогрессируют с приближением весны [Sterling et al., 1967; Hardisty and Potter, 1971].

4 2. Проницаемость митохондриальных мембран печени миног в неионизированной изоосмотичной среде

Опыты с измерением оптической плотности митохондрий в среде, содержащей 250 мМ сахарозы, 3 мМ трис-HCl (pH 7.3), показали, что мембрана митохондрии миноги в деэнергизованном состоянии не проницаема для молекул воды и сахарозы. Это позволяет заключить, что в митохондриях миног пора находится в низкопроводящем состоянии, когда не возможен транспорт сахарозы.

разные периоды преднерестовой миграции Митохондрии (0.S мг белка/мл) инкубировали в среде, содержащей (мМ) 250 сахарозы, 3 трис-HCl, рН 7 3 Стрелками указаны добавки субстратов 1 - без добавок. 2-5 мМ пирувата + 1 мМ малага + олигомицин 4 5 цг/мл (февраль); 3 - I цМ CsA + 5 мМ пирувата + 1 мМ малата + олигомицин 4 5 цг мл (февраль); 4-5 мМ пирувата + 1 чМ чалата + 4.5 цг мл олигомицин (апрель), 5-5 мМ с\ кцината + 5 цМ ротенона + олигомицин 4 5 цг/мл (февраль - апрель)

Субстраты I комплекса зимой вызывают набухание, практически не чувствительное к действию CsA (рис. 6, кривые 2, 3). Вместе с тем, в период метаболической активности животных митохондрии не набухают в присутствии пирувата, малата и олигомицина (рис. 6, кривая 4) Энергизация сукцинатом приводит к сжатию митохондрий в течение всего периода аиадромной миграции миног (рис. 6, кривая 5).

В присутствии сукцината пору в митохондриях можно индуцировать воздействием таких эффекторов как Са2+, Р, и лаурат Однако действие лаурата, как индуктора, определяется энергосостоянием митохондрий Зимой лаурат в концентрации 30 цМ ослабляет индуцирующий эффекты Са2* (20 цМ) и Р, (1 мМ) в митохондриях миног. Жирная кислота, будучи протонофором, по-видимому, рассеивает ДЧ*М и предотвращает тем самым накопление Са2+ в митохондриях Весной энергетическая ситуация в печени резко улучшается, и лаурат ведет себя, как классический индуктор поры. Кроме того, весной для индукции поры в митохондриях миног необходимы концентрации Са2*, Р, и лаурата, вдвое превышающие таковые зимой Обращает внимание и гот факт, что весной набухание митохондрий миног не чувствительно к действию CsA.

Таким образом, изучение энергетического метаболизма пойкилотермных животных представляет интерес не только с позиции расшифровки феномена обратимой метаболической супрессии Исследование молекулярных механизмов метаболической депрессии может помочь в решении проблем, связанных с митохондриальной дисфункцией. В самые последние годы стало ясно, что такие заболевания, как энцефаломиопатия [Gellerich et al., 2004]. нейродегенеративные болезни (болезнь Паркинсона. Альцгеймера) [Luft, 1994; Greenamyre et al., 2001; Shults, 2004; Aliev et al., 2004], а также патофизиологические процессы (сепсис, ишемия/репефузия. рак) [Cassarino and Bennett, 1999; Modica-Napolitano and Singh, 2004; Halestrap et al, 2004] и старение [Beckman and Ames. 1998] сопровождаются морфофункциональными повреждениями митохондрий, такими как уменьшение концентрации адениновых нуклеотидов, повышение проницаемости митохондриальных мембран, снижение активности ферментов дыхательной цепи Все эти особенности митохондрий отмечены нами в печени пойкилотермных животных в период метаболической депрессии.

ВЫВОДЫ

1. В период метаболической депрессии энергетические траты и развитие гонад у миног и лягушек осуществляются исключительно за счет мобилизации эндогенных субстратов, о чем свидетельствуют многократное снижение уровня глюкозы и липидов в птазме крови и преобладание протеолитических процессов в тканях над биосинтетическими

2. В митохондриях печени миног и лягушек наблюдается обратимая супрессия энергетического метаболизма. Она проявляется в снижении скоростей дыхания в различных метаболических состояниях и снижении содержания АТФ в митохондриях и ткани печени.

3. Скорости дыхания митохондрий печени пойкилотермных животных в период гипометаболизма существенно ниже, чем у млекопитающих Однако в активном состоянии митохондрии печени миног и лягушек в присутствии НАД - зависимых субстратов обнаруживают скорости потребления кислорода, свойственные митохондриям печени мышей.

4. В разобщении окислительного фосфорилирования в митохондриях печени миног и лягушек, также как в митохондриях мышей принимают участие АТФ/АДФ - антипортер и аспартат/глутаматный переносчик. Разобщающая активность этих белков подавляется карбоксиатракгилатом и глутаматом.

5. Высокоамплитудное набухание изолированных митохондрий печени миног в среде нитрата аммония в период метаболической депрессии обусловлено индукцией неселективной поры. Пора чувствительна к действию ингибиторов: СзА, ЭГТА, АДФ, БСА, гепарин.

6. В неионизированной изоосмотичной среде инкубации митохондрии печени миног не набухают, что свидетельствует о существовании поры в низкопроводящем состоянии.

7. В неионизированной изоосмотичной среде инкубации при энергизации митохондрий сукцинатом пора индуцируется Са2+, Р, и лауратом. Эффект лаурата на набухание митохондрий миног может быть двояким в зависимости от их энергосостояния. Зимой в низкоэнергизованных митохондриях лаурат снижает индуцирующее действие Са2+ и Р„ наоборот, весной - усиливает действие эффекторов.

8. Проявления митохондриальной дисфункции в печени миног в период метаболической депрессии (снижение скорости дыхания и фосфорилирования, снижение мембранного потенциала, уменьшение концентрации АТФ, повышение проницаемости митохондриальных мембран) идентичны таковым, наблюдаемым у млекопитающих, в том числе у человека, при патофизиологических процессах (нейродегенеративные заболевания, ишемия/реперфузия, старение).

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Емельянова Л.В.. Савина М.В., Самарцев В.Н., Брайловская И.В. Мягкое разобщение в митохондриях печени пойкилотермных позвоночных (миноги и лягушки) в период метаболической депрессии // Тез. Ш Съезд Биохимического Общества. - Санкт-Петербург. - 2002. -С. 243.

2. Самарцев В.Н, Емельянова Л.В., Савина И.В., Брайловская И.В К вопросу о термогенезе в тканях пойкилотермных позвоночных // Тез. Всероссийский симпозиум. Механизмы

/

терморегуляции и биоэнергетики: Взаимодействие функциональных систем. - Иваново - 2002. -С. 49. /

3. Емельянова Л.В., Самарцев В.Н., Савина М.В. Гормональная индукция эиергизации гепатоцитов миноги речной в весенний период преднерестовой миграции // Тез. Международная конференция. Рецепция и внутриклеточная сигнализация. - Пущино. - 2003. - С. 231-233. 4 Емельянова Л.В., Самарцев В.Н., Брайловская И.В., Савина М.В. Участие ADP/ATP антипортера в разобщающем действии жирных кислот в митохондриях печени лягушки (Raw temporaria) // Журн. эвол. биохим. физиол. - 2003. - Т. 39. - № 6. - С. 524-529.

5. Емельянова Л.В., Самарцев В.Н., Савина М.В. Влияние разобщителей на нефосфорилирующее дыхание митохондрий печени миноги речной (Lampetra fluviatilis) я лягушки травяной (Rana temporaria) в осенне-зимний период метаболической депрессии // Журн. эвол. биохим. физиол. -2004.-Т. 40. -№ 1. - С. 84-86.

6. Емельянова Л.В., Савина М.В.; Королева Е.М. Аминокислотный пул крови длительно голодающих пойкшютермных позвоночных // Росс. Физиол. Ж. - 2004. - Т. 90. - № 4. - С. 447-457.

7. Larisa V. Emelyanova, Elena М. Koroleva, Margarita V. Savina. Glucose and free amino acids in the blood of lampreys (Lampetra fluviatilis L ) and frogs (Rana temporaria L) under prolonged starvation // Comp. Biochem. Physiol. - 2004. V. 138A. - P. 527-532.

8. Емельянова Л.В. Нарушение функций митохондрий гепатоцитов миноги Lampetra fluviatilis L в зимний период преднерестовой миграции. Вестник молодых ученых 2'2004: 50-57.2004.

9 Емельянова Л.В., Похелайнен ЕЛ.. Королева ЕМ., Савина М.В. Высокоэффективная жидкостная хроматография как инструмент эволюционной биохимии // Тез. Всероссийский симпозиум Хроматография и хроматографические приборы. - Москва. - 2004. - С. 95.

10. Emelyanova L.V., Savina M.V. Metabolie state in liver cells of lamprey (Lampetra fluviatilis L) over prolonged starvation // Abstr. The VI International congress on the biology of fish. - Manaus-Amazonas-Brazil. - 2004.

11. Emelyaoova L.V., Savina M.V., Belyae\a E.A. A new sight on an old problem: a one more step to underscore mechanism(s) of metabolic depression // Abstr. The VI International congress on the biology offish. - Manaus-Amazonas-Brazil. -2004.

12. Emelyanova L.V., Savina M.V. Energetic depression caused by mitochondrial dysfunction is the pathology for the mammals and the physiological norm for Poikilothermie vertebrates // Abstr. Mitochondrial Medicine 2004 - Streams of Energy. - Pittsburgh, Pennsylvania, USA. - 2004.

13. Larisa V. Emelyanova, Margarita V. Savina, and Elena A. Belyaeva. Role of mitochondrial dysfunction in mechanism of reversible metabolic depression of over-wintering lamprey liver during pre-spawning migration // Abstr. Mitochondrial Physiology 2005. - Schröcken, Vorarlberg, Austria. - 2005.

(И 8 1 2 7

РНБ Русский фонд

2006-4 16774

г

Тиражирование и брошюровка выполнены в

Центре «Университетские телекоммуникации ». »

Санкт-Петербург, Саблинская ул., 14. Тел. (812)233-46-69 Объем 1 п. л. Тираж 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Емельянова, Лариса Вадимовна

Список сокращений

Введение.

1. Обзор литературы

1.1. Метаболическая депрессия в природе

1.2. Жизненный цикл миноги и лягушки.

1.3. Структура внутриклеточного стандартного метаболизма.

1.4. Регуляция энергетического метаболизма. Роль митохондрий в метаболической депрессии

1.4.1. Система окислительного фосфорилирования.

Метаболические состояния митохондрий по Чансу.

1.4.2. Регуляция энергетического метаболизма в период метаболической депрессии.

1.5. «Утечка» протонов, или разобщение окислительного фосфорилирования.

1.5.1. Разобщители окислительного фосфорилирования

1.5.1.1. Искусственные разобщители.

1.5.1.2. Природные разобщители.

1.5.2. Механизм действия разобщителей: роль мембранных белков митохондрий.

1.5.2.1. Белки внутренней мембраны митохондрий, принимающие участие в разобщении окислительного фосфорилирования.

1.5.2.2. Гипотеза «мягкого разобщения». Механизм функционирования разобщающих белков.

1.5.3. Универсальность свободного окисления и его регуляция в период метаболической депрессии.

1.6. Неспецифическая проницаемость митохондрий. Физиологическое значение и регуляция.

1.6.1. Две конформацин неспецифической поры: низкопроводящая и высокопроводящая. Роль поры в Са2+ сигнализации и клеточной гибели.

1.6.2. Некоторые аспекты регуляции функционирования поры.

1.6.3. Структура поры.

2. Материал и методы исследования

2.1. Экспериментальные животные.

2.2. Измерение концентрации глюкозы в плазме крови.

2.3. Исследование жирнокислотного состава плазмы крови.

2.4. Определение свободных аминокислот в плазме крови.

2.5. Выявление гликогена и липидов на срезах печени.

2.6. Выделение митохондрий.

2.7. Измерение скоростей дыхания митохондрий.

2.8. Исследование набухания митохондрий.

2.9. Определение содержания адениновых нуклеотидов в экстрактах митохондрий и печени.

3. Результаты исследования

3.1. Энергетические субстраты в плазме крови миног и лягушек в периоды метаболической депрессии и активности.

3.1.1. Содержание глюкозы.

3.1.2. Содержание отдельных классов липидов и индивидуальных жирных кислот.

3.1.3. Свободные аминокислоты.

3.2. Биоэнергетические параметры митохондрий печени миног и лягушек в периоды метаболической депрессии и активности

3.2.1. Оценка параметров дыхания.

3.2.2. Содержание адениновых нуклеотидов в митохондриях и ткани печени.

3.3. Ресопрягающие эффекты карбоксиатрактилата и глутамата на разобщающее действие лаурата.

3.4. Мембранная проницаемость митохондрии печени миног и лягушек. Индукция поры и действие эффекторов поры на набухание митохондрий в разных средах инкубации. Сравнение с млекопитащими

3.4.1. Проницаемость мембран деэнергизованных и энергизованных митохондрий в растворе нитрата аммония.

3.4.2. Эффекты ингибиторов поры на набухание митохондрий печени миног.

3.4.3. Проницаемость митохондрий печени миног в неионизированной изоосмотичной среде.

3.4.4. Действие Са2+, Pj, лаурата и CsA на набухание митохондрий

М в неионизированной среде.

4. Обсуждение

4.1. Метаболизм глюкозы, липидов и свободных аминокислот в тканях миног и лягушек в разные сезоны года.

4.2. Биоэнергетические особенности гепатоцитов пойкилотермных позвоночных животных.

4.3. Роль АТФ/АДФ - и аспартат/глутаматного антипортеров в разобщении окислительного фосфорилирования. Вклад свободного окисления в клетках печени миног.

4.4. Роль неспецифической проницаемости митохондрий в развитии деструктивных изменений в печени миног.

4.5. Регуляция функционирования поры в митохондриях пойкилотермных животных.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Энергообеспечение и биоэнергетические характеристики митохондрий печени миноги (Lampetra fluviatilis) и лягушки (Rana temporaria) в периоды метаболической депрессии и активности"

Актуальность проблемы

Метаболическая депрессия является неотъемлемой частью жизненных циклов многих животных и встречается у большинства видов беспозвоночных и всех классов позвоночных. Это явление характеризуется подавлением базальной метаболической скорости на 50 - 100% и длится до тех пор, пока организм в состоянии противостоять стрессам окружающей среды. Современные методы молекулярной биологии широко используются для выяснения механизмов регуляции метаболической депрессии. Но до настоящего времени ни молекулярные механизмы, ни процессы, связанные с контролем гипометаболизма, до конца не изучены, и фундаментальное явление метаболической депрессии остается как с биохимической, так и с физиологической точек зрения слабо освещенным. Тем не менее, за последнее десятилетие в исследовании этого феномена сделан определенный прогресс, результаты которого будут полезны для дальнейшего осмысления поставленной проблемы.

Анализ существующих фактов позволяет заключить, что центром регуляции интенсивности биоэнергетических процессов в клетке, прежде всего, следует считать митохондрии. Долгое время полагали, что основной функцией митохондрий является синтез АТФ. Поэтому наибольшее внимание было уделено регуляции сопряженного с синтезом АТФ дыхания митохондрий (Bohnensack et al., 1982; Erecinska and Wilson, 1982; Balaban, 1990). Меньшее значение придавали процессу, при котором потребление кислорода не сопряжено с синтезом АТФ. Этот процесс связан с утечкой протонов через специфические белки (АТФ/АДФ - антипортер, аспартат/глутаматный переносчик, белки-разобщители семейства UCP) внутренней мембраны митохондрий (Skulachev, 1998а; Stuart et al., 2001). Самым поразительным физиологическим свойством протонной утечки является участие в защите от повреждающего действия активных форм кислорода, образующихся в митохондриях (Skulachev, 1998а; Kowaltowski et al., 2001). В митохондриях пойкилотермных животных скорость протонной утечки обнаруживает сезонную динамику (St-Pierre et al., 2000а; Bishop et al., 2002; Boutilier and St-Pierre, 2002). Кроме того, в конце 90-х годов стало ясно, что митохондрии играют ключевую роль в развитии и регуляции апоптоза и некроза в клетке (Skulachev, 1998b; 2000, 2002, Kim et al., 2003a; Kim et al., 2003b), открывая на мембранах неспецифическую пору (mitochondrial permeability transition pore), проницаемую для широкого спектра органических и неорганических веществ. Однако, выбор пути гибели клетки определяется ее энергосостоянием, то есть, эффективностью работы системы окислительного фосфорилирования и соотношением АТФ/АДФ. d В последнее время появилось множество доказательств, что любая патология, связанная с энергетической депрессией, сопровождается, прежде всего, изменениями свойств митохондрий. Низкие концентрации адениновых нуклеотидов, повышенная проницаемость внутренней мембраны, супрессия активности электрон-транспортной цепи и системы окислительного фосфорилирования способствуют развитию многих заболеваний у высших животных, в том числе человека. Но парадоксален и примечателен тот факт, что для низших позвоночных животных эти изменения оказываются вполне приемлемыми и даже полезными в определенные фазы их жизненного цикла. Это подтверждает предположение JI.A Орбели о том, что в экстремальных условиях и при патологии высшие позвоночные, в том числе и человек, используют для выживания эволюционно более древние механизмы, изучению которых и посвящена данная работа.

Объектами наших исследований были минога речная {Lampetra fluviatilis) и лягушка травяная (Rana temporaria). Минога - представитель класса Круглоротых, наиболее древнее из ныне живущих позвоночных животных, обладает своеобразным жизненным циклом. После активного морского периода, в течение которого миноги питаются, паразитируя на * разнообразных костистых рыбах, начинается анадромная преднерестовая миграция, которая заканчивается выметом половых продуктов и смертью. Миноги моноцикличны. Мигранты, пришедшие в реку осенью, проводят в ней всю зиму, не питаясь. Известно, что в гепатоцитах в этот период наблюдается обратимая метаболическая супрессия (Savina and Gamper, 1998). Однако, молекулярные механизмы этого явления на уровне митохондрий детально не изучены.

В отличие от миног представители класса Амфибий размножаются многократно. Метаболическая депрессия у лягушек наблюдается в период гибернации и связана, главным образом, с гипотермией и гипоксией, ф Для изучения особенностей энергообеспечения митохондрий указанных пойкилотермных животных в работе были проанализированы сезонные изменения в содержании основных энергетических субстратов в плазме крови.

Ряд энергетических характеристик митохондрий печени пойкилотермных позвоночных мы сопоставили с аналогичными характеристиками митохондрий печени гомойотермного позвоночного — мыши (линия ASN).

Цели и задачи

Целью работы было

Изучение особенностей энергетического метаболизма пойкилотермных позвоночных на примере миноги речной и лягушки травяной в периоды метаболической депрессии и активности.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать в плазме крови миног и лягушек содержание основных метаболических субстратов: глюкозы, липидов и свободных аминокислот.

2. Оценить биоэнергетические параметры митохондрий печени: скорости дыхания и фосфорилирования, содержание адениновх нуклеотидов в митохондриях и в самой ткани.

3. Исследовать участие белков - переносчиков анионов внутренней митохондриальной мембраны (АТФ/АДФ - и аспартат/глутаматного антипортеров) в процессе разобщения дыхания и фосфорилирования.

4. Исследовать проницаемость мембран митохондрий в солевой и в неионизированной средах инкубации.

5. Изучить действие индукторов (Са , Pj, лаурат) и ингибиторов поры

Л I

CsA, ЭГТА, ДТТ, Mg , АДФ, БСА, гепарин) на проницаемость мембран митохондрий.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В период метаболической депрессии содержание глюкозы и липидов в плазме крови миног и лягушек существенно снижается; количество свободных аминокислот в плазме миног увеличивается, а в плазме лягушек - уменьшается.

2. Биоэнергетические параметры митохондрий печени миног и лягушек обнаруживают сезонную изменчивость. Скорости дыхания и фосфорилирования супрессированы в состоянии гипометаболизма и восстанавливаются при выходе из этого состояния.

3. Содержание АТФ в митохондриях и в ткани печени миног и лягушек снижается в период метаболической депрессии и увеличивается в состоянии метаболической активности.

4. В митохондриях пойкилотермных животных «утечка» протонов через внутреннюю митохондриальную мембрану обусловлена участием АТФ/АДФ - и аспартат/глутаматного антипортеров.

5. Изолированные митохондрии печени миног высокопроницаемы для ионов в солевых средах в период метаболической депрессии вследствие открытия неселективной поры, чувствительной к действию ингибиторов: CsA, ЭГТА, Mg2\ АДФ, БСА, гепарин.

6. В неионизированной изоосмотичной среде инкубации индукция поры в митохондриях печени возможна в присутствии Са , Pj и лаурата. Действие лаурата, как индуктора, зависит от энергосостояния митохондрий. При низкой энергизации митохондрий лаурат снижает пороиндуцирующее действие Са21" и Pj. В высокоэнергизованных митохондриях лаурат усиливает действие Са и Р;.

Научная новизна

1. Проведен сезонный анализ содержания в плазме крови миног и лягушек глюкозы, липидов и свободных аминокислот.

2. Продемонстрирована сезонная динамика биоэнергетических параметров митохондрий печени у исследованных видов животных.

3. Исследовано содержание адениновых нуклеотидов в печени лягушек в периоды метаболической депрессии и активности.

4. Установлено участие АТФ/АДФ - антипортера и аспартат/глутаматного переносчика в разобщении окислительного фосфорилирования в митохондриях печени миног и лягушек.

5. Исследована мембранная проницаемость митохондрий печени миног и лягушек в периоды метаболической депрессии и активности.

Таким образом, изучены некоторые новые молекулярные механизмы, лежащие в основе метаболической депрессии гепатоцитов пойкилотермных позвоночных.

Теоретическая и практическая значимость

Работа имеет, прежде всего, фундаментальное значение для эволюционной биохимии и биоэнергетики. Полученные данные дополняют сведения о функционировании и регуляции энергетического метаболизма у эктотермных животных. Кроме этого установлена важная роль митохондрий в развитии феномена обратимой метаболической депрессии. Результаты исследования могут быть использованы для дальнейшего изучения молекулярных механизмов регуляции энергетики митохондрий, а также в прикладных целях. Обнаруженная нами на пойкилотермных животных митохондриальная дисфункция, проявляющаяся в снижении синтеза АТФ, в снижении эффективности системы субстратного окисления, супрессии электрон-транспортной цепи, индукции неспецифической проницаемости мембран митохондрий, является патологичной для млекопитающих. Поэтому исследование молекулярных механизмов метаболической депрессии у пойкилотермных позвоночных животных в дальнейшем может помочь в разработке новых терапевтических подходов в лечении заболеваний, связанных с митохондриальной дисфункцией.

Апробация работы

Результаты исследования докладывались на Третьем Съезде Биохимического Общества в г. Санкт-Петербург, 2002; Всероссийском симпозиуме «Механизмы терморегуляции и биоэнергетики: взаимодействие функциональных систем» в г. Иваново, 2002; Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» в г. Пущино, 2003; Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматографические приборы в г. Москва, 2004; IX зимней школе «Биоинформатика: от молекулярных механизмов к функциональным системам» на зоологической станции Твярминне, Финляндия, 2005. Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 статей, одна из которых в рецензируемом журнале, и 8 тезисов, четыре из которых опубликованы в иностранных изданиях. Структура диссертации

Диссертация состоит из глав: Введение, Обзор литературы, Материал и методы, Результаты, Обсуждение, Выводы, Список литературы (277 источников). Работа иллюстрирована 21 таблицей и 25 рисунками.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В данном разделе обобщаются современные представления об особенностях биоэнергетики пойкилотермных животных в периоды гипометаболизма. Обзор начинается с описания жизненных циклов исследуемых объектов и подробного анализа структуры внутриклеточного энергетического метаболизма. Приведенные сведения отражают важную роль митохондрий в развитии метаболической депрессии. В связи с этим, особое внимание уделено рассмотрению наиболее актуальных на сегодняшний день вопросов, касающихся механизмов и роли свободного окисления, а также неспецифической проницаемости митохондрий.

Проблемы, связанные с энергообеспечением миног и лягушек будут рассмотрены в разделе «Результаты» и «Обсуждение».

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Емельянова, Лариса Вадимовна

1. в период метаболической депрессии энергетические траты и развитие гонад у миног и лягушек осуществляются исключительно за счет мобилизации эндогенных субстратов, о чем свидетельствует многократное снижение уровня глюкозы и липидов в плазме крови, а также преобладат1е протеолитических процессов в тканях над биосинтетическими.2. В период мтаболической депрессии в митохондриях печени миног и лягушек наблюдается обратимая супрессия энергетического метаболизма.Она проявляется в снижении скоростей дыхания в различных метаболических состояниях и снижении содержания АТФ в митохондриях и ткани печени,

3. Скорости дыхания митохондрий печени пойкилотермных животных в период гипометаболизма существенно ниже, чем у млекопитающих. Однако в активном состоянии митохондрии печени миног и лягушек в присутствии НАД - зависимых субстратов обнаруживают скорости потребления кислорода, свойственные митохондриям печени мышей.4. В разобщешш окислительного фосфорилирования в лп1тохондриях печени миног и лягушек, также как в митохондриях мышей принимают участие АТФ/АДФ - антипортер и аспартат/глутаматный переносчик.Разобщающая активность этих белков подавляется карбоксиатрактилатом и глутаматом.5. Высокоамплитудное набухание изолированных митохондрий печени миног в среде нитрата аммония в период метаболической депрессии обусловлено индукцией неселективной поры, чувствительной к действию ингибиторов: CsA, ЭГТА, Mg^', АДФ, БСА, гепарин.6. В неионизированной изоосмотичной среде инкубации митохондрии печени миног не набухают, что свидетельствует о существовании поры в низкопроводящем состоянии.7. В неиопизированпой изоосмотичпой среде инкубации при энергизации митохондрий сукцинатом пора индуцируется Са , Р; и лауратом. Эффект лаурата па набухание митохондрий миног может быть двояким в зависимости от их энергосостояния. Зимой в низкоэнергизованных митохондриях лаурат снижает индуцирующее действие Са и Pj, весной, наоборот, - усиливает действие эффекторов.8. Проявления митохондриальной дисфункции в печени миног в период метаболической депрессии (снижение скорости дыхания и фосфорилирования, снижение мембранного потенциала, уменьшение концентрации АТФ, повышение проницаемости митохондриальных

мембран) сопоставимы с таковым у млекопитающих, в том числе и у человека, при патофизиологических процессах (нейродегенеративные заболевания, ишемия/реперфузия, старение).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Емельянова, Лариса Вадимовна, Санкт-Петербург

1. P. 1361-1372. Zoratti M. and Szabo I. The mitochondrial permeability transition // Biochim. Biophys. Acta. 1995. Vol. 1241. P. 139-176.