Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ ЛОШАДЕЙ

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ ЛОШАДЕЙ"

А

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА <ВИЖ)

На правах рукописи УДК 612.646.02

ЛВШДЕВ . Станислав Гуриаич

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ ЛОШАДЕЙ

43.00.13 — Физиологи« человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

п. Дубромщи, Московской области 1994г.

—

Диссертационная работа .V " -на в лаборатории

физиологии размножения лошадей Йс V >чаучно-исследо-»ателъекого института кояеяодствг

■ ■. ■. ■ > ^ . .. * \, ■ ,

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки России,

доктор биологических наук, профессор А.А.Алие»

доктор биологических паук, профессор Н.И.Сергеев

доктор биологических наук, профессор А.АЛасков

Ведущее учреяднение *

Всероссийский научно-исследовательский селекционно-г нетический институт ^

I л Защита диссертации состоится МЛШУ^ 1994 г. 1

я [О часов на заседании специализированного совета Д.020.16.02 при Всероссийском научно-исследовательском институте животис водства

Адрес института: 142012, Московская обл.,Подольский район, пос. Дубровицы

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института Автореферат разослан '1994 г»

Ученый секретарь специализированного совета, доктор биологических наук

П. А. Ноумен ко і

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА.РАБОТЫ

■ 1.1 Актуальность темы. В последние десятилетия, в связи с бурным развитием техники, народно -'хозяйственные требования к количеству-и качеству разводимых в нашей странелотадей значительно, изменились. Направления совершенствования поголовья отдельных конских пород по-хозяйственно - полезным признакам, в настоящее время, требуют существенной.корректировки. Однако, характерная для коневодства, замедленная по сравнения с другими видами животных сменяемость поколений, продолжительная беременность и резко выраженное одноплодие:кобыл/ высокая стой* мость выдающихся животных:усложняет плеиенну» работу,.сдержи-, вает темпы селекционного процесса в.породах. Поэтому, наряду с применением обычных методов селекции,. все большее значение для совершенствования пород лошадей приобретают приемы ускоренного размножения особо ценных животных. В частности■- трансплантация ранних эмбрионов.

Решаемые посредством технологии трансплантации эмбрионов вопросы в коневодствеаналогичны проблемам в других отраслях животноводства. Это - повышение интенсивности размножения генотипов выдающихся самок, совершенствование пород с ограниченным генофондом, сохранение оригинальных мутаций. МЬ, в коневодстве есть и своя специфика. Хозяйственное использование лошадей часто не способствует интенсивному размножению выдающихся по работоспособности ливотных.'1 Например лоиади, победители.крупных всероссийских, и. международных соревнований по конному спорту, как'; .правило совсем устраняется из племенной работы или возвращаются в конные заводы уже в преклонном возрасте с подорванным здоровьем,;. когда' возможность получения от них потомства становится. проблематичной. Применение методов трансплантации эмбрионов,: в этой ситуации, освободит от.необходимости изъятия из спорта на длительный срок выдающихся кобыл,.1 связанного с ■ беременностью\й позволит получать от них приплод без вреда для их дальнейшей спортивной карьеры.

Методы трансплантации-амйрщновотсамок доноров самкам

__._____л__[17А¡т~и'^ипг^гггт .. ___■ _______

реципиентам хорошо разрабо^аны7ЙЛйаЖШодствЗ и уже широко

КЛУЧмЛ^ .БИБЛИОТЕКА'

, ' - 2 -

внедряются в производство. Однако, попытка механического перенесения приемов ускоренного размножения, разработанных на других видах животных, е коневодство часто оканчиваются неудачами. Особенности анатомического строения и физиологии половых функций вносят существенные ' коррективы в разработку приёмов случки и искусственного осеменения, пересадки эмбрионов, регулирования половой цикличности кобыл.' Часть этих особенностей известна и хорош изучена, другая - вдет своего времени. •

фактически, на всех этапах единого процесса воспроизведения (оогеиеэ, овуляция, оплодотворение, ранний и поздний эмбриональный период) у лоиадэй выявлены существенное своеобразие и отличительные видовые особенности. И это, естественно, повлияло »а стратегию исследований и технологинеских, решений при выполнении- научной работы по трансплантации эмбрионов а коневодстве. Наиболее существенными особенностями.воспроизводительных : функций кобыл, влияющих на разработку методов трансплантации зародышей по сравнению с самкамч других видов являются: " ■ ;< .. ~ ..'

1 Резко выраженное одноплодие.

2. Существенные отличия нейро-гуморальной ре гуляща* половой системы. _

3. Сезонность размножения. -

4. Повышенная интенсивность миграции плодов по маточной полости конематок в период ранней беременности. . ■, ■

5. Задерганная, по сравнению с-другими, видами, имплантация плодов. ' - ■.'■;.■ ■

6. Полноценное развитие фолликулов, овуляция и образование иелтых тел-второго' порядка во время жеребости. :

7. Отличия анатомического и гистологического строения половых органов, плаценты и плодов.

- 1.2 Сель и задачи работы

у < - • ■

С целью разработки, совершенствования и внедрения в практику коннозаводства, приемлемого для производственных условий метода трансплантации эмбрионов лошадей были поставлены следующие задачи исследований: * -

1. Изучить сезонные и возрастные изменения половой цикличности кобыл разных пород в условиях континентального климата

Центральной России. ; - ■. ". .

. 2. Разработать параметры отбора животных для работ по трансплантации в группы кобыл-доноров и кобыл-реципиентов,"

3. Выяснить характер изменений концентрации люгеинизируо-щэго гормона (ЛГ) в крови кобыл в фолликулярную фазу, полового цикла. '■. ■ '.'■'■."

4. Определить оптимальные сроки, дозировки, кратность применения хорионического.гонадотропного гормона (ХГ) для синхронизации половых функций кобыл.'

'■' Б. Предложить и апробировать несколько схем синхронизации .сроков овуляции у кобыл-доноров и кобыл'реципиентов в эависи-мости от степени несовпадения их половых' циклов.

. 6. Освоить . и усовершенствовать нехирургический метод извлечения эмбрионов из матки кобыл-доноров, позволяющий многократно извлекать зародыши из одного и того же животного в течение ряда лет без вреда для его здоровья и последующего племенного использования. . ^ ■ ■

■ 7. Определить физиологические факторы, влияювде на результативность извлечения зародышей. ^

8. Предложить способы оценки качества зародышей.

9. Разработать способ продолжительного хранения эмбрионов in vitro при плюсовых температурах в жизнеспособном состоянии.

10. Освоить.. нехирургический траисцервикальный метод перекоса эмбрионов в' матку кобыл-реципиентов.

_ 11. Апробировать в- опытах по пересадкам зародышей изокссуприн лактат (Ханегиф) - препарат, временно подавляющий 'моторику матки. • '...'."■. ■ % . .

.v 12. Проанализировать ход беременности кобыл- реципиентов и качество полученных в опытах жеребят-трансплантатов.

, 1.3 Научная новизна и теоретическая значимость исследований. Впервые выяснено, что переход кобыл от случного сезона в состояние межсезонного акэструса может наступить как в эст-радьную, так и в лютеальную фазы' полового цикла. И это, в последующем, влияет на их половое поведение и реакцию на введение экзогенных гормонов в начальный период следуицэго случ-'ного сезона. Определены возрастные особенности сезонных изменений половой цикличности . у . коОши. Установлено постепенное снижение1 эффективности действия хорионического гонадотролного

...... ...... 4:-.

.гормона на сроки созревания лидирующзго фолликула при его. мно-" гократном и многолетнем применении на одном и томде'животном. '.' '. '■■■ ,.У , .■ У-.■ ■■'■*

Описаны изменения внешнего вида 7 - .9 суточных, бластоцист .лошадей при их хранении в.неадекватных условиях внешней среды.

Считаем, что разработанная нами в соавторстве, с А Ф. Леб?-; девой 1авторское свидетельство' СССР;Н 1497£15)"среда для.-культивирования поздних (экспандированных) . бластоцист • лошадей, главной составной частью -которой является.желток куриных яиц является серьезной теоретической базой для серии,новых, исследований в области раннего эмбриогенеза млекопитамких.. Выясненная в этих опытах необходимость включения в-'культуралъные среды для 7-9 суточных эмбрионов.лошадей 20 - 60 X желтка куриных яиц наводит на. мысль об отсутствии ; существенных ви-доспециничных факторов в;секретах'маточных желез кобыл на этой стадии ранней беременности. •

Впервые» рекомендован при нехирургических пересадках эмбрионов лошадей-миорелги«зант иэокссуприн лактат. Установлено, что из-за высокой интенсивности миграции ранних эмбрионов по маточной полости, кобыл ' эффективнее неглубокое введение' трансплантата при пересадках. . - *• • " -' 1"

,1.4 Практическая значимость. Разработаны-и предложены'для внедрения - в производство рекомендации' по.,;. не хирургической трансплантации эмбрионов лопадей, которые позволяют существен-' но повысить интенсивность размножения выдающихся кобыл. Методика, трансплантации эмбрионов является'.единственно возможным способом вовлечения в племенную работу выдающихся по спортивным достижениям ' в классических видах-конного спорта (конкур» троеборье,, выездка).кобыл, Считаем; что.технология трансплан-' тации эмбрионов должна быть включена в селекционные программы при работе'со спортивными породами лошадей (тракененская, ганноверская, гольпгтинская, буденновская» УТ1Г и дрГ).

1.5 Основные положения диссертации,; вынесенные на защиту.

- Возрастные и породные особенности 'сезонных :изменений интенсивности воспроизводительных, процессов у кобыл.

- Отличительные (по сравнению с другими видами животных) ". принципы синхронизации половш: циклбв у лошадей.1

' : - ' - 5 -

.-Критерии оценки жизнеспособности поздних (экспандиро-ванных) бластоцист лошадей по размерам, внешнему виду и удельной массе.■ . •

- Способ продолжительного (до 24 часов) сохранения во внешних условиях эмбрионов лошадей з жизнеспособном состояний.

- Особенности нехирургической трансплантации вибрионов кобылам-реципиента», позволяющие достигнуть наивысшей результативности пересадок. .

1.6 Объем работ Диссертация изложена ка 245 страницах машинописного текста, содержит 42.таблицы. 18 рисунков. Список использованной 3 работе литературы содержит 302 источника.

/ ' 2. МАТЕРИАЛ И. МЕТОДИКА

. Намеченные цели и задачи научной работы по ■ теме. "Трансплантация эмбрионов лошадей" были решены путем постанов1Г ки серии опытов яа племенном и пользователем поголовье ВНИИ коневодства« Опытного,-Старожиловского, Александровского, Ло-; котского, им.С. 11 Буденного и им. Первой.Коиной Армии конных • заводов России. '

Схема опытов

_________;______________;___;___________;_________

N 1 Перечень изучаеыыхвопросов! Обгем работы! Задачи экспери-опьгга! ' i ' I мента

11

1

I

1. • Вменение сезонных и воэ-г растных изменений половой ': цикличности кобыл разных пород и разного физиологического состояния в условиях континентального климата Центральной России :

Регулярный . Разработать па-

контроль за рамотры отбора

половой цик- кобыл-доноров и

личностью ко- кобыл-реципиен-

6ыл опытной тов ;

группы в те- .

чение 16 лет

2

!'- ; 3 ' і '. L_ 4

2. Изучение'характера изменений концентрации ЛГ в кро-. ви коСил в фолликулярнуп ; фазу полового цикла :

Опыт проведен Выяснение меха-на З-х кобы- низка регуляции лах процессов овуля-

ции у кобыл

Определение действия ХГ на Две группы . Изучение пара-

время овуляции при введо-. юш препарата на разных ' стадиях созревания фолликула '.' *

кобыл ( опыт-; пая и контрольная) по 34 головы в группе

метров эффективного применения препарата : Г

4. Выяснить влияние ; разных. доз ХГ на воспроизводи-* тельные процессы кобыл

6. Анализ эффективности действия разных способов введения ХГ кобылам

2 серии опы- Изучение пара- . тов:1 серия : метров эффектив-поставлена на ного применения 40 кобылах,-. .: препарата■ .. , П-на 44 коб.

'ЗЭкобыл раз- Изучение параде лили на 4 метров эффзктив-группы ного применения

(1 контроль- препарата ная,. 3-опытные) ■'■.-'■■>

G. Изучение последствий многократкого применения ХГ ■ »а одной и том та кивот- :

ном в течение нескольких ■ £вт

2 группа ко- Изучение пара-Оыл (опытная, метров эффектив-контрольная) ного применения; по 10 голов препарата в группе '. ...

7. йоииссконноэ испытание эффективности применения хорионического гонадотро-. пина для синхронизации ; сроков овуляции у кобыл

2 труппы кобыл (опытная/ контрольная) ПО 16 голов в группе

Апробация хг в.

производственных

условиях

8. Применение еинтетичес- ; кого аналога простатлан-■ дина для синхрониза-/ ции эструса у кобыл

Проведено 3 Сравнить "Экви-серии отлов майт", "Эстро-на 58 кобылах фан",

' "Энзапрост-<Р' •

9. Проверить несколько схем синхронизации сроков эст-. руса и овуляции у кобыл _ посредством инъекций простат дандинаи хг

-Проверено 4 Разработка оп-схеш обрабо- тимальных схем ток на 64 синхронизации парах кобыл полових функций

10. Освоить нехирургический метод извлечения эмбрионов из матки - ' кобыл-доноров . '

Проведено 7 -Сравнить 2 из-вымываний по " вестных спосо-Аллену-Роусону ба извлечения и 7 по Огури- вародшей из Тсутоуми матки кобыл

11. Апробировать многократное извлечение еародЬапей нз одной и той же' кобылы-донора в течение ряда дат

В обработку Выяснить возмож-взяты резулъ- ность получения таты 273 большого кол-ва вьмывакий из вибрионов из 21 кобыла одной кобылы-донора

12. Изучить изменения морфологических признаков и.размеров ранних доимпланта-ционных эмбрионов разного . возраста /

Оценили 7 эмбрионов 6-ти даев. возраста, 69

Разработать шкалу оценки качества змбрионоз равного возраста

эмбрионов 7-й дне»., 311 эмэр. а-и дн. 83 эмбриона 9-й дн. и А . эмбрионов 10-и днев. возраста

1 t

I

I

13. Вькскить зоамотаюстк про- - Было постав-

должителъкого хранения леко iO

эмбрионов in vitro в ере- опытов дах различного состава-

Накопить необхо-дикыэ знания для разработки способов хранения ■ Эмбрнноэ

14. Разработать спосоО культивирования эмбрионов, лошадей

Совместно а предложить спо-аспиранткой сов хранения .10. Лебедевой эмОркокоа лова-ашолнеко і дей > серия опытов на 21 варианте сред-.-

15. Освоить нехирургический штод переноса лошадиных вибрионов в матку кобыл-реципиентов

Всего выпод- Излучить живых

нено 164 жерёвят-транс-

пересадки плантатов эмбрионов

16. Вьксяить влияние раэлич- 106 перё-нык факторов на прижив- садок ляемость трансплантатов

: ПОВЫСИТЬ уро--вень прижив-ляешетй трансплантатов

17. Апробировать разработан' ; виз рекомендации по , -трансплантации эмбрионов . лошадей

Довести исследования по трансплантации \ эмбрионов до этапа внедрения метода в практику коннозаводства

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

, 3.1 Синхронизация половых функций кобьи

3.1.1 Лучение половой цикличности. Проведение регулярного круглогодичного контроля воспроизводительных функций кежгребых кобыл в условиях опытов по трансплантации эмбрионов позволяло обратить внимание на ряд известных и неизвестных ранее особенностей их половой цикличности.

Количество регулярно проявлявших зструс (находящихся -s состоянии половой активности) холостых кобьи в екшше . ЫесйЦЫ существенно «еньюе (40-БСЖ), ~ че'м в летние (75,6-89Х). Ишятся заметные колебания показателей половой активности лошадей по годам. В отдельные годы сезонность размножения у холостых кобыл в"наших опытах была выракэна резче (1978,. 1S82, 1689, 19S2 годы), в другие годы -этот признак был более сглажен (1S?3, 1984, 1985 годы). Анализ половой активности конкретных опытк&х кобыл-доноров этой же группы животных за ряд лет, проведенный под нашим руководством аспирантом И. & Черншовыи показал, что у кобыл имеются возрастные особенности овариальной активное;^ связанные с сезонностью. "Было установлено, что у старых кобыл (14-20 летнего возраста) продолжительность межсезонного аяэ^т-рального периода сущэственко длиннее, чем у животных более молодого возраста (190,8±30,4 суток - - у старых животных; 107,1±31,2 суток - у двухлеток; 97,3425,3 суток - у кобыл 3-S *" летнего возраста и 91,3±24,1 суток у 7-13 летних животных.

Существенные ментоловые различия половой активности.холостых кобыл, в . наших опытах, можно объяснить возрастным составом группы животных только частично. Частично, вероятно, повлияли погодные условия и кормовые факторы, а частично - по-~ родные отличия! Сведения об овариалъкоя активности кобыл разных пород приведены в таблице a i.

• - 10 - ;.*■ .. .

. * : . Таблица 3.1

Количество проявленных полноценных половых циклов в течение года кобылами-донорами разных пород.„

Порода . I Количество! Количество!Среднее количество 1 ГОЛОВ 1 плодовых (половых циклов в ; 1 ) дат "1 течение года

Русская рысистая ' 10 28 9,3 ±1.7

Русская тяжеловозная 6 1? 11,7 4 1,9'

Советская тяжеловозная 12 26 12,4 ±1,1

Буденновская и донская б % 1 ' 1в 8,4 ± 2,6

Больше количество проявленных в точение года половых циклов советскимиЧямэловозными кобылами (таблица 3.1) объясняется коротким* а Часто дама полным отсутствием межсезонного анэстраньного периода у' животных этой породы. У буден-нозскнх и донских кобыл севонность размножения выражена резче. Лэшади русской рысистой породы эанимаш по этому' показателю проме^точное положение. ;

Изучахжцие сезонность размножения лошадей исследователи обычно обращают внимание на период перехода кобыл из состояния межсезонного анэструса к половой цикличности. Период же перехода кобыл от сезона размножения.в шжсезонное анэстральное" состояние в специальной литературе почти не освешэн. Проанада-аировав этот переход у кобыл опытной группы мы заметили, что сезонное затухание половой цикличности мотет происходить .по •двум сценариям. В одном случае происходит пролонгирование лю-теалыюй фазы полового цикла. В другом - переход в межсезонное аязстральное' состояние может наступить в период, эструса.. В этом случае размеры ледирушзго фолликула не достигают . максимальных размеров и овуляция не происходит. Обычно через 3-7 дней после начала эструса наблюдается постепенное уменьшение размеров начавшего созревать -фолликула и охота постепенно затухает. У кобылы наступает продолжительный межсезонный анэет-радьный период. Ш нашим наблюдениям примерно у 3/4 кобыл опытной группы сезонное затухание половых функций отмечали в люгеальную фазу подового цикла (68 случаев из 93 наблюдений) и

.r'V " " ■ • - 11 т ■. ---'у. ' .

у 1/4 кобыа - в эстральную фазу (25 случаев).

Затем, весной, переход кобыл от состояния полового покоя в активное состояние, также происходил по двум сценариям. Властные, перешедшие в межсезонный анэструс в лотеахънута фазу полового цикла, приходили весной в первую охоту с одновременно созревающим в яичнике лидирующим фолликулом. У удадшкх ВЭ 3 межсезонный анэструс кобыл в астральную Фазу подового цикла, весной наблвдаотся признаки первой охоты без одновременного развития лвдирушда фолликулов в яичнике. Такое состояние (проявление охоты без созревающих фолликулов) у них может продолжаться довольно длительное время (от 2-3 недель до 1,Б-2 месяцев), № и у кобыл, ушедших в межсезонный анэструс в:лютеальную фазу полового цикла; первая весенняя охота не всегда завершается овуляцией.' Отмечено .много случаев (опало 70S), когда начавший развиваться фолликул не- достигает максииума своих размеров, ачереэ В-7 дней после качала охоты регрессирует н вместо него начинает,созревать другой, а иногда и третий фолликул- .. ' ■'

3.1; 2 применение ' хорионического гоиадотропкна человека (ХГ) скнхронияят^ии проков овуляции у иобыя. Выделяемый гипофизом' кобыл: комплекс гонадотрошшх гормонов существенно отличается'от комплекса гонадотропных гормонов выделяемого.гипофизами самок других видов повышенным содержанием 5СГ и дефицитом ЛР. Поэтому» У кобыл ревко изменено соотношение' продолжительности разных- фаз полового цикла. Обычно диэструс у кобыл составляет-16> 17 суток, эструс- Б - 6 суток. То-есть, по продоллитель ности диэструс у кобыл составляет 76 X полового цикла, эструс 25 X. У коров же, диэсрус составляет 92-95 X времени полового цикла, эструс - 6-7 X. В связи с этими особенностями проявления феноменов полового цикла сроки эффективного действия различных гормональных препаратов на кобылах и коровах различны. РекЬмендованные для применения на коровах схемы синхронизации половых функций на лошадях не эффективны и не приемлемы. Добиться синхронного наступления овуляции у кобыл беэ инъекций хорионического 1ч)на^отропина (ХГ) ие удается.

Влияние хорионического гонадотропина (ХГ) на Сроки овуляции у кобыл, находящихся.на разных стадиях созревания лидирующего фолликула в момент введения препарата, изучали яа племен-

- 12 - - • ном поголовье Александровского и Локотского конных,заводов. .Результаты этих исследований приведены в таблице 3.2.

Таблица 3.2

Влияние ХГ на сроки овуляции при введении препарата на разных стадиях созревания фолликула (доза 2500 МЕ)

Стадия созревания 1V . I I Время от инъекции препарата фолликула в.момент) Группы I п (до овуляции (часы) инъекции препарата! . I I----;-----:—------I I I Мл ш, I Ни \ . Ь

2-Я стадия .Контрольная 18 95,3±6,Б9 48-156 7,9

Опытная ■ 18 42.Otl.32 36-64 -

3-я стадия Контрольная 12 43,816,96 24-108 '' 2.0

. Опытная 12 32,813,30 , 18-48 . 4-*я стадия Контрольная 4 19,5±7,68 6-36 0,6 , Опытная 4 13,5±6,Б6 6-36

При введении хорконического гонадотропина кобылам со 2-ой и 3-ей стадией созревания фолликула овуляция у 27 голов (90%) прокзосла в интервале от 24 до 48 часов после инъекции.

Многократное применение хорионического гонадотропина в теленке пяти лет на одних й тех же кобылах кумысной фермы Опытного тонкого завода показало, что эффективность действия пре? парата постепенно понизилась. В первые .четыре года опытов овуляция у всех животных опытной группы - наступала через* 36-48 часов после введения гормона. , На пятом году опытов были отмечены случаи замедленного созревания фолликулов у части подвергнутых инъекциям ХГ кобыл. Достоверных отклонений от нормы по эаиереблкемости, жизнеспособности шребят, вынашиваемости беременности у кобыл опытной группы при сравнении аналогичных показателей у кх контрольных аналогов ке" установлено. В связи с. существенной разницей продоляителыюсти согревания фолликулов у кобыл опытной и контрольной групп ! было произведено: в опытной группе по 1,2 осеменений одной кобылы в цикле, в конт-ро-^коЯ - по 2,7. Разница по эамеребляемости опытных и контрольных даизотных недостоверна (1. - 1,2).

Проведенное комиссионное испытание гонадотропина хориони-

' ' - із - ' •--■.■ - у."' ■'

ческого с участием специалистов Ветфармсовета СССР подтвердило -высокую эффективность действия препарата на процесс созревания фолликула и овуляции у кобыл (таблица 3,4)

■Таблица 3» 4

Результаты комиссионного испытания гонадотропииа хорионического

Группы (Среднее время! - Среднее количество | Зажереб-",

(по, 16 голов) (от инъекции |—---——-—(ляемость

|до овуляции (ректальных (осеменений) в X |(в сутках) (исследований! 1

Опытная 1.8 2*8 ■ 1.0 68.7

Контрольная 4,4' ; .6.4- 2,1 50,0

Разница между достоверна достоверна достоверна не досто-

группами верна

На основании полученных-результатов испытания ХГ комиссия пришла к выводу о его,'сильном синхронизирующем действии на> созревающий в яичниках кобыл фолликул, что и было отмечено в ваключении комиссии. Препарат был рекомендован к применению нр ■ лошадях. . '-■■..-

а 1.3 Разработка схем синхронизации половых Функций кобыл. Применение хорионического гонадотропина позволяет синхронизировать сроки овуляции у кобыл» находящихся в естественном эструсе. . Однако подобрать для работ по трансплантации необходимых животных одновременно находящихся в. состоянии эструса не всегда удается. Поэтому, нами была апробирована методика применения простатландкна в комплексе с хорионическим гонадотро-пином. Еши испытаны - английский препарат "Зквимайт", чешский "Эстрофан", венгерский "Знзалрбст-О". >. Разницы между препаратами по эффективности действия (индуцирования лшеолизиса) нами не.установлено, Такле ке установлено различий меиду группами по продолжительности индуцировакног о эструса. >

В зависимости от сроков несовпадения половых циклов у ко-.Сыл, в првдшествущий опытам период; нами было апробировано четыре схемы их гормональных обработок, с цель» синхронизации*

в'период подготовки к пересадкам'эмбрионов,' Используя.различные комбинации введения аналогов простагландине 'и ХГ удалось добиться необходимой степени синхронности времени овуляции у кобыл-доноров и кобыл-реципиентов независимо от стадии полового цикла на момент начала опытов. -

3.2 Нехирургическое извлечение эмбрионов из матки кобыл-доноров

3.2.1 Осврение и совершенствование методики вымывания зародышей. Первые попытки извлечь эмбрионы из кобыл-доноров нехирургическим методом провели японские исследователи Н Огури и Кв,Тсутсуми (1972). Применив^ разработанную для крупного рога-. ' того скота нехирургическую методику извлечения.эмбрионов на кобылах им удалось извлечь 40Х 4 аародыгаей. Идентичную методику нехирургического извлечения эмбрионов на лошадях применили в своих опытах английские исследователи Аллен и Роусон в 1975 году, в 1974 году Огури и Тсутсумиопубликовали новое сообщение о результатах своих исследований по трансплантации эмбрионов лошадей. Путем модернизации нехирургического вымывания эмбрионов из матки кобыл-доноров авторам;удалось существенно повысить результативность и достичь ВОХ извлекаемости зародышей. -. Принципиальное различие нехирургического метода извлечения зародышей, приведенного в работах Е Огури и Кв.Тсутсуми в 1972 году и Аллена и Роусона в 1976 году с методом, опубликованным Н.Огури и Кв.Тсутсуми в 1974-году, заключается в том, .что.в первом случае инструмент для извлечения эмбрионов вводят в полость ипсилатерального последней овуляции рога матки, во вто-„ ром случае катетер помещают в тело матки ификсируот его • баллончиком сразу за цервикальиым каналом. По первому способу промывается только один рог матки, по второму - вся маточная полость. Увеличение объема промываемой полости матки позволило японским исследователям существенно улучшить результаты извлечения эмбрионов из кобыл-доноров.

В первых опытах . по .вымыванию зародышей методом Огури- Тсутсу ми (1974) мы пользовались инструментом, изготовленным по схеме авторов, приведенной в опубликованной ими статье, 11 июля 1977 года в этих опытах был извлечен нами первый эмбрион. Однако в трех иэ девяти вымываниях, выполненных этим катете-

ром,' нам не удалюсь полностью извлечь залитую в - матку кобылы промывную жидкость. Попытки удалить остатки раствора путем массажа матки через прямую кишку, привели в травмированию слизистой и появлению примеси крови; в: извлеченной жидкости. В дальнейшем/ , опытным путем, на убойном материале было установлено, . что при небольшом количестве и малом .диаметре входных отверстий инструмента слизистая.оболочка матки током жидкости присасывается к катетеру и препятствует полной эвакуации промывной жидкости.; £шю установлено, что при извлечении зкйрио- ' 'нов по принципу Огури-Тсутсуми жесткость инструмента не является обязательным требованием. Поэтому конструкция катетера для вымывания " эмбрионов была; нами изменена.. Трехканальный инструмент был заменен - двухканальным. Наконечник катетера, вводимый в матку кобылы, удлинили на 10-16 см и на нем сделали 10-12 ■ отверстий диаметром 5 мм. В результате этих изменений сумма площади входных отверстий в 2,6 раза превысила площадь.' поперечного. сечения внутреннего магистрального канала катетера. Предложенный инструмент измененной конструкции был изго- / товлен в НИИ резины и применяется нами беэ существенных иэмене нийдо настоящего времени.' При применении катетера этой конструкции промывная жидкость самотеком эвакуируется из матки кобыл-доноров почти полностью (в полости матки остается макс»-" Мум ЭО-35 мл жидкости).. Ни одного случая травмирования слизистой н появления крови в промывной жидкости отмечено не Оы-ло. Извлечение зародышей из кобыл-доноров проводили'в станках обычной конструкции,; применяемых для зооветеринарных обработок лошадей, обычно, при извлечении эмбрионов кобылы ведут себя спокойно. Это позволяет сделать вывод о том, что вымывание зародышей применяемым методом не вызывает у опытных животных бо~ левых ощущений. Опытами установлено, что в связи с анатомическими особенностями строения родополовых путей кобыл, . катетер для извлечения эмбрионов удобнее вводить маноцервикальным.. методом. В целях защиты руки исследователя и вводимого инструмента" от'случайного загрязнения при прохождении преддверья влагалища». надеваем сверху полиэтиленовый чехол одноразового применения. Пэсле введения кисти руки во .внутренний участок влагалища кобылы передняя часть чехла разъединяется и катетер проталкивается в цервикальный канал. Для выяснения вопроса о том/ в каких порциях промывной жидкости чаще извлекается эмб-

• - 16 - . рион. и'период освоения методики вымывания '(1977-1978 годы) был поставлен специальньйГзксперимент. Вэтих опытах удалось установить, что в первом приеме вымывания извлекаются 70Х эмбрионов, повторном - Й5Х, третьем - бХ. Яэзтому в методику извлечения зародышей было введено правило обязательной трехкратной перфузии матки кобыл-доноров.

3.2. £ Многократное извлечение эмбрионов и воздействие процедуры выпадания на последующую плодовитость кобыл-доноров.

Многократное проведение' опытов по извлечению зародышей освоенным ' нехирургическим методом на одних и тех же животных показало возможность извлечения большого числа, эмбрионов от кобыл-доноров в течение длительного времени без вреда'для их последувдэй плодовой деятельности. В отдельные годы некоторые опытные, кобылы были подвергнуты процедуре вымывания зародышей' а-большинстве проявленных половых циклов. В качестве примера интенсивного использования доноров в таблице 3.6 приведены .данные по вымыванию зародышей из кобыл Хлопуши, Богини и Бо" гии.

ГОсле такого интенсивного и многократного использования . вышеперечисленных . кобыл в опытах по извлечению зародышей все они сохранили нормальную плодовитость. Многократной процедуре вымывания эмбрионов были подвергнуты и другие кобылы опытной группы. ?ах, кобылу Черепицу в течение нескольких лет опытов промывали 46 раз, извлекли £4 зародыша; кобылу Дикцию - 30 раз, извлекли 20 "зародышей; Капу - 23 раза, 17 зародьссей( Пиф-ку - 25 раз, 22 зародит В 1Э85 году, из кобылы-донора Пи£ки в течение одного года было извлечено : 14 .зародышей. Все опытные кобылы в период проведения исследований нормально теребились. Причем, кобылы Дикция и Пифка выкашивали трансплантированных хюребят. Эти Секты свидетельствуют о том, что освоенная нехирургическая методика вымывания зародышей позволяет извлекать Бмбриокы многократко без вреда для последующего племенного использования кобыл-доноров,

В опытах 1677-1989 гг- вьШ1 получены интересные результаты по прододлительности меяэстрального периода у кобыл, подвергнутых процедуре промывания матки с целью извлечения эмбри-

Таблица а 5 Результаты извлечения эмбрионов из кобыл Хюпуши, Богини и Богии

N |

поло-|-

вого i цикла |-

Кличка кобылы

Хлопуша

I

Богиня

Богия

Ідата игвлё-|регуль-|дата иэвле-|резуль-|дата извле-[резуль |чения |тат |чения |тат | чения |тат

1 10;02.78 + 7.01.83 + 31.0а84 + .

г 1.0а78 + 26. 02. 83 ■ - 21.04.84 +

з 1а 04.78 + го.оаез ■ 11.05.84 '+

4 ' £9.04.78 ; 4 8.04.83 . - . ' 1а 07.84 +'

6' а 06. 78 + * 26.04.83 - 9.06.84 +

6 Б.07.78 + 20.05.83 + . 8.09.84 +.

7 20.0 (. 78 ++ 4. Об! 83 + ,4.11.84 ++ ■

8 1а 10.78 - 27. Об. 83 + 19.11.84 слу-

9. 7.12.78 . + 12. 07.83 - ■ чена и оставлена

10 27.12.78 9.09. 83 + ' ■ ' меребой

11 28. 09. 83

12 6.11,83 . ++

13 * 26.11.83 +

14 , 18.12.83 ■ - .

Итого 10 вымываний 10 эмбрионов 14 вымываний . 9 эмбрионов 7 вымываний 8 эмбрионов

Примечание: + - извлечен один эмбрион. ■ \ ++ - извлечено два эмбриона

- - эмбриона нет.: ■' .

онов. Результаты этих экспериментов,приведены в таблице а 6.

• Таблица 3. б Продолжительность межэстрального периода при вымывании эмбрионов в разные сроки после овуляции (опыты 1077-1880 гг.)

Сроки извлечения | Эмбрион найден | Эмбрион не найден I-—-—- ..'■-'

- | п | М + ш | п | М ± ш

Через в суток после \

овуляции г 16,Ь ,. 4 16,3

Через 7 суток 22 . 16 і 1,02 16 17 ±1,0

Через 8 суток • ; 17 16 ± 0,74 12 ■ .16+1,1

Через 9 суток 31 ■■■ • . 17 ± 0,4 12 ' 16 ± 0,9

Через 10 суток 3 • 16,7 • 1 16 ,

Через 11 суток 2 32 '2 18

В этой таблице приведены продолжительность межэстрального периода у нобыл-доноров в половых циклах, в которых были изв-> лечены эмбрионы (т. е.. доказан факт их результативного оплодот-: ворения),. и в циклах, в которых зародышей не оказалось (скорее всего, кобылы оказались не оплодотворенными). Установлено, что при выполнении процедуры вымывания, спустя 6-ю : дней после овуляции, продолжительность межэстрального периода существенно, не различается и находится в обычных пределах.

3.2,3 Влияние различных Факторов на уровень извлекаемости зародышей из матки кобыл-доноров. Исследования по выяснению 'Влияния возраста извлекаемого эмбриона на результативность вы- . мывания выполнены в период с 1977 по 1980 год. Зародыше этих экспериментах извлекали .через 6-11 суток после 'овуляции. Ре-, эультаты опытов приведены в таблице 3.7. " '

Анализ данных этой таблицы показывает,. что эффективность освоенной нехирургичесной методики зависит от возраста- извлекаемого эмбриона. Так, в 6 вымываниях, выполненных через 6 дней' после овуляции у донора, найдено всего 2 эмбриона (33,ЗХ), а через 7 дней после овуляции уже в 38 опытах'найдено 22 зародыша (67,9Х). ' Возрастание результативности освоенной методики извлечения эмбрионов на 7 день после овуляции у доно-

ра. ■ видимо-, объясняется переходом развивающихся зародышей из л ; Таблица 3.7 Результаты извлеадния эмбрионов в опытах 1977-1980 годов .. . --.— :--—;-;—г—у—--:—I----Г"---:- ■

Возраст эмбриона (время от 1 Кол-во|Найдено | Процент овуляции до извлечения) ; | опытов)эмбрионов) извлечения

6 суток .6 ... '3 ■ 33,3

7 суток зв 22' '.-' 67.9

8 суток 29 17 ' Б8.7 -

9 суток 43 V 31 .:*,'. 72.1 ..

' 10 суток. -4 . -3 V 76,0

. 11 суток ■V... • 4 50.0

Итого :. 124 * 77 62,1

яйцеводов в полость матки. -Некоторое увеличение числа найденных эмбрионов от 7-го к-9т!<у дню связано с их размерами.- На' - восьмой-девятый день развития зародыши достигают 1-2 миллимет7 ров в диаметре и становятся хорошо видишми в промывной дид- -кости невооруженным глазом.. Это; в свою очередь, уменьшает ве-.

• роятность'потерь эмбрионов в процессе их поиска. Одиннадцатидневные - бластоцнсты достигают больших размеров и при их извлечении, видимо, с трудом проходят через входные отверстия катетера. В последующих опытах мы полностью отказались от извлечения зародышей в крайние сроки (б и 11 дни после овуляции) и в . .опытах 1961-1985 годов'/полностью перепит на вымывание 8-0 дневных эмбрионов. . ' . - ; .

Анализ результатов извлечения эмбрионов после, осеменения кобыл-доноров тремя различными способами - естественной случкой,' искусственным осеменением свежей спермой и искусственным осеменением криоконсервированной спермой (данные этого анализа приведены в таблице 4.19) показал, что наивысшая их оплодотворяемость ' достигается при искусственном осеменении кобыл свеней спермой (74.3Х). Достаточно высокий процент извлечения зародышей получен и после естественной случки (66,71). '

:: При искусственном осеменении криоконсервированной спермой . результативность извлечения вародытей достоверно снижалась. У

Более высокая оплодотворяемость кобыл при их искусственном осеменении свежей спермой, по нашему мнению объясняется боль-• Таблица 3.8

Зависимость результативности извлечения эмбрионов из матки кобыд-доноров от технологии их осеменения'(1978-1692 годы)

-----і-:-г--1-;—

Технология осеменения | Количество IИзвлечено|Извлекав-

I опытов |эмбрионов|мость в X

J_;_і______ і_

Естественная случка 336 224 66,7

Искусственное осеменение

свежей спермой 309 230 74,3 .

Искусственное осеменение

криоконсервированной спермой 59 , . 27 46,1.

Итого - 704 481 68,3

шей точностью места введения семени под контролем руки исполнителя. С целью уточнения параметров воздействия физиологических факторов на результативность• осеменения кобыл-доноров нами, совместно, с аспирантом И. Л. Чернышевым был проведен опыт по осеменению кобыл разными разовыми дозами спермы. Проверяли три ' объема разовой дозы спермы - 20, 10 и б мл. Результаты этого эксперимента приведены в таблице 3.9.

' Таблица 3.9

Взаимосвязь объема дозы спермы при осеменении кобыд-доноров и результативность извлечения зародышей

----1—т——|—--л—:———I-;---.

Объем довы( Число | Число (Извлечено(Результативность спермы (активных (опытов |эмбрионов(извлечения эмбрионов : (мл) (спермиев 1 I - I в X .

((млн/дозе( (

.,*,•* . ■ .' _I________

20 300 8 6 75,0> 17,67

10 300 8 5 62.6 ± 21;65

'6 300 8 3 37,5 ± 27,95

Проведанные опыты показали, что при уменьшении объема ра-вовой дозы спермы на осеменение кобыл происходит снижение его

результатов. Эти данные полностью согласуются с данными других исследователей. Одновременно этот эксперимент показал, что применение нехирургической методики извлечения зародышей позволяет существенно .упростить проведение исследований по искусственному осеменению.лошадей и . повысить репрезентативность поставленных опытов. .

В течение 1978-1685 годов нами было проанализирована изв- . лекаедасть эародыавй из матки кобыл-доноров в зависимости от времени года. Данные этих исследований' приведены в таблице

■ з.ю. . . /' - . -' ■ . . *... .■ ■

Таблица, 3.10

Поквартальные изменения извлзкавмостн зародышей ив кобыл-доноров С1978 - 1665 годы)

^ I ~Т I

Показатели Г Кварталы года | -

Т.. ' - -1-1-:-1-1 Итого

II I II I III I- IV |

-:-:_I-_I-1-1_;_-

Всего выполнено процедур

вымывания эмбрионов 84 138 ее 86 404 ."'

- Извлечено зародышей 61 82 56 41 230

X извлечения ' 60,7 59,4 58,3 47,6. " 50,0

Из данных таблицы 3.10 следует, что извлекавмость эмбрионов из. кобыл-доноров достаточно стабильна в течение' года и только в конце года (4-ом квартале) несколько снижается.

3. з Поиск, оценка и хранение эмбрионов во внешних условиях

ч

3.-3.1 Отработка приемов поиска зародышей в промывкой жидкости. Эмбрионы млекопитающих, в-том числе и лошадей, - отличаются тем, что в процессе своего роста- и развития они с возрастом из разряда микрообъектов, поиск которых возможен только /С. помощью специальных.оптических приборов, постепенно, вырастают в макрообгекты, хорошо видимые невооруженным глазом. В таблице 3.11 приведены сведения о размерах извлеченных зародышей разного возраста.

■ Таблица 3.11 Размеры извлеченных эмбрионов лошадей

-:-:-—---1—-1-:-•—:-—

Возраст эмбрионов { п |" Диаметр в им

1 ■■ н———•—' '

. I I . М ± т . ..

б суток 7 0,147 + 0,007

7 суток .' . 69 0,436 ± 0,096 .

8 суток 311 0,973 ± 0,112,

9 суток 83 2,182 ± 0,133

10 суток 9 , 4,4 ± 0,571

Большой неожиданностью для Нас явилось то, . что эародыши лошадей рано освобождаются от блестящей оболочки (Zona pelluotda) и начинают быстро (существенно интенсивнее, чем зародыши других, видоз млекопитающих) увеличиваться в размерах, продолжая сохранять шаровидную форму. Сведения о стадийном развитии извлеченных нами зародышей лошадей,приведены в таблице 3.12. . , • -

Таблица 3.12 *'

Стадии развития извлеченных эмбрионов .

*-;—г—-7-;-г-—-. ' -

Возраст (Всего иэвле-| В том числа —

эмбрионов(чено эмбрш-1-1——-—;---' [ " —

"( нов (Шрула) Ранняя бла-. |Расширяю- |Шэдняя

| | [стоциста |щаяся блас-(бласто-

• | II (тоциста : [циста

*_;____1__:_I_;___|_:___I... . ._.„•. '

6 суток 7 '1 2 2 2

7 суток 69 - 2 1 66

8 суток . 311 - ■ : . 311

. л С 1977 по 1990 год шести- и семи-суточные эмбрионы отыскивали в осадке промывной жидкости, после 20-30 минутного отстаивания. Семисуточные зародыш иногда удавалось обнаружить в промывной жидкости невооруженным глазом (около 10 X), на чада 7-и суточные эмбрионы находили с помощью стереоскопического

• - 23 -

микроскопа ИБС-0. с 1990 года при поиске 6-7 - суточных эмбрионов применяли, метод фильтрации. Способ и время поиска эмбрионов разного возраста приведены в таблице 3.13.

. Таблица 3.13 ■

Способы и время поиска эмбрионов разного возраста

—--—:— I --1—(-:—;---~-

Возраст эмбриона| ' Способ поиска ) Среднее время поиска

I - .... I эмбриона ■ _ ■_~ _| __

6 суточные - Осаждение и микроско- •■ 41 минута 1 пирование - ■ - ■ .

6 суточные ■ Фильтрация и микроско- ..■.".

пирование' 27 минут

7 суточные 'в основном осаждение й '

" микроскопирование 34 минуты

7 суточные : в основном фильтрация и

микроскопирование ." 22 минуты

8 суточные ' Часто (801) невооружен-

ным глазом ' . 3 минуты

• О суточные Невооруженным глазом менее -1 минуты 10 суточные Невооруженным глазом Все зародыши, кроме

первого обнаружены в

■ ' - ^ ' процессе вымывания

- Из приведенных в'этой таблице сведений видно, что время поиска эмбрионов лошадей \в промывной жидкости зависит (г их возраста, А это,естественно, связано с их размерами.

Анализируя полученные в процессе освоения нехирургическо-

• го метода извлечения и отработки технологических приемов по-, иска эмбрионов лошадей мы сделали вывод о необходимости разработки.оригинальных (отличных от рекомендованных для зародышей других видов) способов краткосрочного хранения зародышей 1п у1Ьго.:Требовалось разработать быстрый способ оценки жизнеспособности поздних бластоцист (экспандированных) и на основе этого прогнозировать результаты последующих пересадок.

3.3.2 Оценка жизнеспособности экспандированных бластоцист. "... В целях стандартизации показателей при' разработке; метода оценки качества зародышей по морфологическим признакам и упрощения технологий' трансплантации мы обработали полученные све-

дення о размерах и описанию внешних признаков по 394 зародышам лошадей, в том числе 311 - 8-суточного и 83 - 9-суточного возраста. Средние размеры 8-и дневных зародышей составили 0,973 л 0,112 мм', 9-к дневных - 2,182 ± 0,133 мм. Подавляющее большинство зародышей при их оценке под микроскопом ЫБ09 были полупрозрачными, имели правильную шаровидную форму, четко выраг пенную клеточную структуру. Некоторые извлеченные 6-9 дневные зародыши по своему внешнему виду существенно отличались. Они были непрозрачны, матового цвета; внешняя оболочка сильно отделялась от клеточной массы, клетки выглядели сморщенны»» и сжатыми. Их мы.1 отнесли к категории погибших. ; Встретились и несколько зародышей, занимавших промежуточное положение между этими двумя крайними вариантами, которые били оценены нами как сомнительные. Поводом для отнесения помутневяих 'зародышей с . сильно отделенной оболочкой (бластолеммой) и сморщенным» клетками к разряду погибших послужило то, что после' Б-7, часового хранения полупрозрачныхI шаровидных, с четко выраженной кле-'точной структурой эчбрионов с плотно прилегая*!« (и поэтом/ практически • незаметной) внешней оболочкойв фосфатно- солевом буферном растворе Дюльбекко (ИЭС) у пих начинались постепенные изменения внешнего вида. Сначала у таких зародышей становилась все более заметна внешняя оболочка, что вероятно связано с ее отслоением от сообщества клеток. Но клеточная масса продолжала сохранять некоторое время правильную шаровидную форму. ; Затем, изменялся тургор клеток и они сморщивались. .Сообщество клеток эмбриона превращалось в комочек неправильной Форш. Цвет бластоцисты постепенно из полупрозрачного становился мутят (матовым). На основании опытов, по продолжительному хранению эмбрионов в ФБС-среде, мы сделали вывод о том, :. что изменения внешнего вида эмбрионов связано с их гибелью в неадекватных условиях существования. Наиболее важными морфологическими показателями качества зародышей являются: степень прозрачности бластоцист, целостность и состояние оболочек и хорошая выра-хйнкость клеточной массы. Поэтому в настоящее время ш разделяем 8-9 дневные зародыши на 3 категории: 1) жизнеспособные; 2) погибшие; и 3) сомнительные. После получения результатов культивирования зародышей в дедточно-солевой среде и пересадок кобылам-реципиентам. ш пришли к выводу о том, что размеры эмбрионов при их оценке не оказывают существенного влияния на их.

V, ч.;-,-,;:-.--,25 - ,

жизнеспособность.

Жизнеспособные зародыши полупрозрачны, имеют четкую шаровидную или слегка эллипсоидную форму, хорошо выраженную массу клеток, четко различающиеся эмбриобласт и трофобласт. Оболочка (бластолемма) плотно прилегает'к клеткам по всей поверхности и при осмотре под микроскопом практически ие видна.

Пэтибвиеэмбрноны ве прозрачны, клетки сморцзны и сгруппированы в одив штовый комок, оболочка (бластолекма) сильноот-делена от клеток.

Сомнительные зародыши полупрозрачны, клетки имепт правильную шаровидную форму, оболочка (бластолемма) местами, а иногда и по всей поверхности заметно отслоена от клеток. * .V Ниже ( в таблице а 14) приводим данные оценки свежвизвле-ченнъй 8-9 дневных зародышей за весь период проведения опытов.

Таблица 3.14 Оценка_8-9 дневных зародышей (1979-1992 гг)

Показатели -г-1 п 1 BZ

Всего извлечено 8-9 дневных зародышей 1 1 1 394 \ 1 1 100 .

В том- числе отнесено 1 живых к категории '( сомнительных- | погибших . -34S 16 - 36 87.1 3,8 \ Q.1

На основании данных таблицы а 14 напрашивается вывод о том,- что около 10Х зародьгаей гибнет в организме осемененных кобыл до 8-9 дня своего эмбрионального развития. По-видимому, это обычный уровень эмбриональной смертности для конских зародышей на этой стадии развития.

3.3.3 Хранение эмбрионов лошадей во внешних условиях.

. Проведенные опыты по изучению изменений внешнего вида 8-9 суточных бластоцист при их непродолжительном хранении в' различных жидкостях дали толчок к разработке способа культивирования эмбрионов лошадей in vitro. 1&ми, совместно с ЛФ. Лебедевой был предложен и защищен * авторским . свидетельством СССР N14977216, веданным Г апреля'1989 года,' "Способ получения хиа-неспособных поздних бластоцист лошадей". Главным элементом-8а-

■ - 26. - -о/'

питы авторским сыисетельством явилась среда, включающая а свой состав 20-605 желтка куриных-яиц, 0-60Х кипяченого молока;кобыл и/или 0-60Х фосфатно-солевого буферного раствора (ФБС). Помещенные в эту среду поздние бластоцисты лошадей продолжают интенсивно-расти при температуре +37*С.

Для определения оптимальных соотношений вводимых в среду компонентов использовали принцип треугольной трехкомпонентной . диаграммы ГНОбса-РоэеОома. В одной серии опытов готовили 21 вариант" среды с 201-ным интервалом концентрации базового раствора (ФВС), лэлтка и молока.. Всего провели две серии опытов. В первой серии опытов зародыши культивировали в течение 12 ,часов, а эо второй -в течение 24 часов. Фхаконр со средой по--мещага в термостат для подогрева до оптимальной температуры. Извлеченные 8-дневные'эмбрионы лошадей пипеткой переносили в испытуемую культуральну» среду иинкубировали при температуре 37®С. До и после культивирования проводили оценку и измерение эмбрионов под микроскопом ИБО9. Интенсивность роста бласто-цист в проверяемых средах приведена в таблице 3.16.; Наилучший^ результат получен при культивировании в среде 6 (601 желтка и 401 С£С).- Стабильный рост бластоцист наблюдали в среде 7 (601 молока и 401 дэлтка) и в среде 8 (40% молока, 40Х яэлтка и 201 ФВС). Шнее стабильный результат культивирования эмбрионов ло-,шадей был отмечен в средах 4, 5, 0, 10, 11, 12, '13, 14,16.

Анализ результатов культивирования (таблица 3.16) показывает, что бластоцисты развиваются как при 12 часовом, так и при 24 часовом культивировании, причем рост в средах оптимального состава (среды-б, 7 и в) стабилен. При просмотре под микроскопом у всех прокультивированных в этих средах зародышей, каких либо отклонений от нормы ке отмечали. Клетки трофобласта и дмбриобЛаста четко выражены» зародыши полупрозрачны,-правильной шаровидной формы. Помещение в чистый желток или &ВС-раствор эмбрионы не растут. При осмотре под микроскопом у них обнаруживают признаки дегенерации.

Во время проведения опытов по' разработке . оптимального состава культуральной среды неожиданно бшю обнаружено, что эмбрионы о нормальной клеточной структурой, поменянные а.среды, содержащие желток и молоко кобыл всплывают к поверхности жидкости и приближаются к стенкам стекляного сосуда, где могут

Таблица 3.15 .

■■ ' Интенсивность роста бластоцнст в средах разного рола

-г'"".—-:—■-———--—-5-;-:-

номер(Соотношение »шгрндиентов, в X(Интенсивность роста бласто-

среды|——:—-г—'——--1-:-1 цист 4

I молоко | желток | ФЕС |—-;—•—|-:-

| | | |лри 12 часовом Гпри 24 часо-

| | | - . | культивировании (вом культи-

I ■ I | | (вкровании

:_I_—_..I—'.,_—I---1---1__

1 : -1оо ;о , 0

г 20 80 " .. - ■ : 380,0 ,132,3

3 80 20 -и 329,6 0

4 40 60 244,8 270,3

В . 20 60 20 66,7 667,9

в 60 40 326,9 906,5

7 . ■ 60 40 ■" - * 204,9 643,9

8 ' 40 ■ - 40- • ° 20 313,9 744,7

9 ' 20 40 40 33,2 764,9

10 ' , * - - ■ 40 60 205,6 244,0

11 во 20 ■'-- 240,4 , 268,1

12 60 ". / Г 20 20 298,9 342,2

13; ; 40 20 , 40 173,0 609.7

14 20 20 60 23,8 526,6

16 20 80 266,7 618,4

16 100 - ■' :. 76,1 0,

17 80 ' 20 60,0 163,3

16 60 40 125,0 114,3

10 40 . - 60 139,6 90,1

20 . -20 - 80 . 0 . • 0

21 Л' 100 0 ' 0

быть легко обнаружены визуально. Эмбрионы с нарушенной клеточ- ' • ной структурой постепенно, погружаются в толщу жидкости. Кроме . - того, -плавающие у поверхности бласгоцксты аа период культивирования сум&ственно увеличиваются в размерах, опустившиеся в толщу жидкости зародыш не растут.

В настоящее время, под нашим руководством готовит к ввщл-

- 2Ь - . ,

те кандидатскую диссертацию соискатель Н. В. Сидорова. Тема ее работы,- "ранение и транспортировка бластоцист лошади". В проведенных экспериментах установлено, что жизнеспособность эмбрионов лошадей в пёлточно-солевой среде (50 х желтка + 50 2 ФБС) сохраняется в довольно широком диапазоне плюсовых температур (от +10 до +40*С) (таблица 3.16).

; . ■ ■ Таблица 3.16 ■ Влияние хранения при различных температурах в течение 24 часов на 8 - 8,5 суточные эмбрионы

Темпе-) I серия (повторкость) | II серия (повторность)

рагура!---—I—--~Н — ■■■■■ -I-* - -г——-

экспо-(Началь- (Конеч- (Оценка за-(Началь-,¡Конеч- |Оценка заро-зиции |ныЯ раэ-|ный }родьдо . |ный раз-|ныЯ (дыша после (С) ; (мер за- (размер (после 1 мер за- [размер |опыга (родыша (зароди (опьгга (родьша (зароды-1 |( в мм) (оа(мм)| ((в мм)' (ва(им)Г

+42 1.0 0,95 Погиб 1,25 1,0 ПОГИО

+40 1.0 2,0 Жизнеспособен 0,75 1,75 Жизнеспособен

+38 1,0 2,075 Жизнеспособен 0,6 0,85 Жизнеспособен

+3б' 1,05 2,25 Жизнеспособен 0.7 1,16 Жизнеспособен

+34 0,75 1,45 Жизнеспособен 1,8 2,0. Жизнеспособен

+32 1И 2,0 Лизнеспособен 0,925 1.225 Жизнеспособен

+30 1,05 1.1 Погиб " 1.2 1.1 • ГЬгиб

+28 . 1,35 1,75 Жизнеспособен 1,45 1.62 Жизнеспособен

+26 1.7 Жизнеспособен 0,55 0.7 Сомнителен

+24 0,9 1,22 жнзнеспо-' собен 0,9 0,75 Погиб

+22 0,85 1,075 . Жизнеспособен 1,325 1,375 Жнзнеспо-. собен

-т-:-1——---І'--—:-:-1—--—І---Л-

1 12 І З І 4 І 5 16 | 7 _■ ■ "" ' ' " ' '-1_-■ і--1—-1_,_

+20 ■ 1,0 1,2 . Жиэнеспо- .. 1,0:

' собен

+10 1,6 1,76 . Яйзнеспо- 0,6

_ собен

+8 0,926 - . Погиб 0,676

+6 • 0,6 - : Пзгиб 0,676

+4 ,1,16 - ■: ІЬгиб Втер- 0,825 0,826 Сомнителен* мое© с • . ■ -тащим'",

льдом ; " . •" • ,

1,0 .ІЬгиб

0,66 ' Жизнеспособен ^0,6 Погиб . 0,676 Жизнеспособен .

Оба эмбриона, хранившиеся а течение 24 часов при температуре +42*С погибли, 10 зародышей, хранившихся при температуре от +32 до +40*0-сохранили жизнеспособность, из 12 амЗрионов, подвергнутых воздействию температур от +20 до +30»С, 4 погибли,- 1 оценен как сомнительный и 7 - жизнеспособных. К сожалению из-за технических, ограничений нам не удалось провести опыты по хранению эароДшей в зоне температур от +12 до +18®С. № 8 эмбрионов, находившихся 24 часа в термостате при температуре от О до +10®С,'4 погибли, 1 оценен как сомнительный и 3 ж: га-неспособные. " •

3,4 Пересадка эмбрионов кобылам-реципиентам.

Проведенную нами научно-исследовательскую работу по освоению и совершенствованию нехирургического тргнецерв«пального метода- пересадки эмбрионов в матку кобыл-реципиентов условно, можно разделить на 4 этапа.

Первый этап. (О 1978 по 1981 год). В этот период было выполнено 48 попыток пересадок зародышей от кобыл-доноров кобы-дам-реципиентам. -Все 48 пересадок оказались безрезультатными. , В первых опыта» по трансплантации зародышей мы пользовались рекомендованным..для кратного ' рогатого скота прибором Кассу, вводимого коровам ректо-цервикальным методом в шеидатерадьный

к ' функционирующему. желтому тел? рог матки. Вероятно, из-за анатомических и гистологических особенностей строения ПОЛ шх органов кобыл этот способ введения инструмента оказался т; :ш-моопасным для лошадей й поэтому не эффективным.

Второй этап. (1981-1986 годы), в этот период времени было выполнено 54 пересадки - зажеребело 11 кобыл-реципиентов. \ Получено 10 жеребят-трансплантатов. У одной кобылы-реципиента жеребость оборвалась выкидышем неустановленной этиологии. Результативность пересадок в этот период составила 20,42. Этот этап исследований был посвящэн освоению методики* пересадок * и получению первичных данных об оптимальных биологических пара-' метрах технологии трансплантации зародышей у лошадей.

Третий этап. (1986-1987 годы). ; В течение этого времени, основное внимание уделяли совершенствованию метода и его-адаптации к производственным условиям. Шло произведено 28 пересадок - зажеребело В кобыл-реципиентов (32,12). Установили, что замена дефицитной Детальной сыворотки крови крупного рогатого скота на Доступный явлток куриных яиц в пересадочной среде не скидает результативность пересадок. Внутримышечное введение потенциальным реципиентам раствора изокссуприн лактата с целью блокирования спазматических сокращений миометрия в период введения эмбриона достоверно и существенно повысило результативность опытов.

Чэтвертый этап. (1988-1992 годы). В эти годы в 24 . пересадках . у 17 кобыл-реципиентов наступила беременность (70,ВХ), Этот период научной работы по трансплантации эмбрионов лошадей характеризуется устойчивым высоким уровнем прижив-ляемости трансплантатов. Часть пересадок зародышей в 1992 году Выполняли по заказам производственников ва плату. Практически |ьчался этап внедрения технологии трансплантации эмбрионов в фактику коннозаводства. : ■

|. 3.4.1 Влияние различных Факторов на результативность пе-¿ЁЁЗНЦЦ. После освоения нехирургического метода трансплантации вмбрионов в матку кобыл-реципиентов (с 23 марта 1981 года)нами было выполнено 106 пересадок. "Для выяснения оптимального места аппликаций зародыша, глубину введения пересадочного инструмента в матку кобыл варьировали. Данные этого эксперимента приведена в таблице 3.17. * *

- зі - ■■ .г"- / *

■■У' Таблица 3.17

■Результативность пересадок при различной глубине введения инструмента в матку кобыл-реципиентов

.---—-.--—-..-—■■•■, ■--■—"——г—-~"Г~—■—;-

■; Глубина введения инст румент а і Выполнено|Заявребело |Результати-■■■..'.' : - |пересадок|реципиентов(вность в X :_-і___;________і__;_л__;_і_;_і_;—

V Глубокая (10-12 см за церви- 44 . ,2 4,6

кадьный канал) ' " ■ ■ ■ ■ ■

Средняя (Б-9 см за цервикадь- 38 У 18у 47,4

ный канал) У ^

Неглубокая (2-4 см за церви- 24 17 ч 70,8 ,

кальный канал) ' '—.

> • . -.ні ' - • „

Итого V : ; 106 37 . 34,9

Излученные результаты опьгга по месту введения эмбриона в матку реципиента свидетельствуют о том, что при пересадках ва-родышей кобылам трансплантат должен быть помещен в прилегапгий к цервикально'му каналу участоктела матки. Разница между группами достоверна

V В опытах были выполнены пересадки"семи-, восьми- и девя-- тисуточных бластоцист". Сведения о результатах трансплантации эмбрионов в зависимости: от их возраста даны в таблице'а 18. ' фактически, уровень приживляемости во всех возрастных группах / был близок к среднему показателю^

Таблица 3.18 • Цриживляемость бластоцист разного возраста ' . ~

Возраст пересаживаемого .заро-. дыша I-Г--—г—--:—I- |Выполнено|Заяеребело|результатиз-|пересадок(реципиент, (ность в X

7-й суточные бластоцисти 12 - .4 33,3

8-й суточные 70 27 38.6

9-й суточные ... 24 6 25,0

■■" итого . 106 37 34,9.

Разница между группами недостоверна. В последние годы мы

'' ■ / - 32 -

перешли к пересадкам в основном 8-8,5 суточных бластоцист. В этом возрасте эмбрионы лошадей достигши: уде достаточно больших размеров - 0,973 + 0,112 мм в диаметре (см. табл. 3,11). Это позволяет проводить пересадки эмбрионов бег использования стереомикроскола. Достаточно большие размеры 8-и суточных бластоцист позволяют ускорить их поиск и перенос в пересадочную среду. Они хорошо видны в заправленной для пересадки пайе-те, даже в непрозрачной желточно-солевой пересадочной среде. По месту, положения бластоцист в столбе пересадочной среды в пайете можно судить -об ■ их ' жизнеспособности (жизнеспособные всплывают, погибшие опускаются вниз), размеры 8-8,5 суточных эмбрионов позволяют использовать серийно выпускаемые инструменты для трансплантации эмбрионов крупного рогатого; скота. 7 суточные бластоцнсты ет$ очень малы (0,43в£0,096 мм в диамет-—ре). Их трудно обнаружить в жидкости невооруженным глазом. Они становятся практически неконтролируемыми в непрозрачной желточно-солевой пересадочной среде, затрачиваемое на пересадку время сильно затягивается, а это в свою очередь, может снизить 1 результативность работы. 9-и суточные эмбрионы, наоборот, достигают ут чрезмерно крупных размеров (2,182±0,133 мм в диаметре) . Jlpii пересадке 9-и суточных бластоцист применение для. пересадок, йа лошадях'серийно выпускаемых инструментов становится невозможным. ' Повышается риск травмирования бластоцист в процессе манипулирования Ь ними in vitro.

.Применение гормональных препаратов.с целью синхронизации половых .функций доноров и реципиентов не всегда позволяет добиться наступления одновременной овуляции у обеих кобыл. Это может бить связано с функциональным состоянием обрабатываемых: животных, многократностью применения препаратов и другими факторами. Анализ результатов трансплантации эмбрионов"за все, годы работы (таблица 3.10) показал, что у лошадей допустима большая степень асилхронности половых циклов при пересадках, чем у крупного рогатого скота и овец. Достаточно большая амплитуда допустимой асинхронности половых функций кобьщ-доноров и кобыя-реципиентов при пересадках позволяет значительно упростить технологию подготовки животных к трансплантации. В 1G82 году мы практически отказались от воздействий гормонами на половые процессы кобыл-доноров и ограничились однократным внутривенным введением хорионического гонадотропного гормона

(ХГ) любой находящейся в охоте потенциальной кобыле-реципиенту в день овуляции у намечаемого для пересадки донора. Овуляция у подвергнутой такой обработке кобылы-реципиента обычно происходит через 36-48 часов. , '

Таблица аіе

Результаты пересадок эмбрионов в зависимости от степени синхронности половых циклов кобыл-донороэ "л кобыл-рецияиектоз

■-—---——-г--—-1--—:--г—---

Степень синхронности ову-|Количество ІКоличество(Результатив-ляции у доноров и реципи-1 пересадок | керебостей | ность зХ -ентов (в сутках) \ | (

_і;_I___1_;_■ ' _-

-3 - 6 ; . 3 60,0

-2.6 2 0

-2 18 , 7 38,9

-1.6 13 4 30,8

-1 * зі ' 13 41,9

-0.6 6 3 60,0

0 25 6 24,0

+0,6 ■ 4 1 25,0

+1 .. ■ ./:•' і. ' - 0

+1,6 і 0

Итого 106 37 34,9 '

Знаком (-) помечена такая асинхронность половых' функций, когда овуляция у кобыш-донора наступила раньше, чем у kj6u-лы-реципиента. Если! овуляция у реципиента наступила раяьш 'донора ,то поставлен энакплюс (+).

Одной из . вероятных причин; снижающих пригшвляеыость трансплантатов в матке кобыл-реципиентов могут быть спазматические сокращения миометрия.: спровоцированные неадекватный раздражением рецепторов влагалища и цервикального канала в ш-мент введения инструмента с пересаживаемым эмбрионом. С целью блокирования нежелательной реакции яивотного в 1886-1687 годах был проведен опыт по введению кобыгам-реципиентам перед пересадкой эмбриона киорелаксаята "Ханегиф'Ч В опытных пересадках перебость наступила у 6 из 8 обработанных Ханегифом косил- реципиентов. . в контрольной группе зажеребела одна. Разница

между группами достоверна.

3.6 Беременность, роды и последующая плодовитость ко-. ■ \ ' і, / был-реципиентов.

Беременность кобыл-реципиентов устанавливали ректальным методом в общепринятые в коневодстве сроки. Первую проверку на жеребость проводили на 25 день развития плода (через 17 дней после пересадки). Вторую - на 45 день (через 37 дней после пересадки). Третью (заключительную) - на 5-6 месяце беременности. Однако первым признаком наступления или наоборот отсутствия беременности было нарушение или сохранение половой цикличности у кобылы-реципиента после пересадки/выявляемое по ее поведению на "пробе", при общении о жеребцом-пробником.

Из 37 жеребостей кобыл-реципиентов 33 беременности завершились нормальными родами ~и 4-аборта. Три аборта произошли осенью (в .том числе 2 - на 6-ом месяце и один - на 7-ом месяце) Один аборт произошел в феврале месяце (на 9-ом месяце). В _ эти яе сроки наблюдались аборты у интактных кобыл Опытного конного завода, на территории которого размещена экспериментальная коншня ВНИИКа.

За 25-ЭО дней до ожидаемых родов у всех 33 кобыл было отмечено "начало налива вымени. К моменту выжеребки степень налива вымени достигала максимума. У 17 кобш1 реципиентов за сутки до родов на кончиках сосков*были обнаружены сгустки высохшего молозива (молозивные пробки), послабление связок таза, припу-хание наружных половых органов в предродовой период были хоро-. то выражены у всех ожеребившихся кобыл-реципиентов. У 11 кобыл рода прошли в отсутствии обслуживающего персонала, поэтому ход родового процесса у них оказался не проконтролированным. - 22 кобылы-реципиента «єробились в присутствии людей. В 21 родах зафиксировано переднее предлежание л^ребят-трансплантатов, в1; - заднее. Ни одного случая неправильного, мешающего родам, ■ члекорасполояения плодов не зификсйровано. 27 выжеребок кобыл- реципиентов произошли в темное (ночное) время суток'и б- -в дневное. Роды протекали быстро. Необходимости в оказании акушерской помощи кобылам не было ни в одном случае. . У 31 'кобылы послед отделился самопроизвольно. У 2 кобыл, для удаления вадержавюегося последа потребовалось вмешательство ветеринар-

; > ■ - ^Vv; г зз -■ ;:■. ного специалиста. •

Продолжительность беременности кобыл-реципиентов с учетом сроков эмбрионального! развития трансплантатов в организме ко-Оылы-донора (+ 8 ¿уток) была в пределах нормы - 335,9 ± 4,9 суток. '.у ■; V : '-■:'"-'■' ■ ■,

Все кобылы-реципиенты, кроме одной,в течении первых двух недель после выжеребки проявили' нормальный"эструс. Кобыла Дикция проявила первую охоту через два месяца после родов. Плодовитость кобьи-реципиентов после •родов жеребят-трансплантатов сохранилась в норме. Часть бывших кобыл-рецнпиентов посла выжеребкибыла передана в производяаяй состав, кумысной фермы Опытного конного завода. Часть - использовали в опытах в качестве доноров эмбрионов. Части кобыл повторно пересадили эмбрионы. Ш два трансплантата было получено от кобылы-реципхекта Лозы, кобылы Н 006, кобылы N OOS, Опытная кобыла Проекция,; бу-денновской породы была использовала в экспериментах и в качестве донора, затем" -реципиента1 и, после выягребхи трансплантатом - , снова донорол ; Опыты по извлечению ипересад; кам эмбрионов проводили и-ра виргйнных кобылках, й на недавно ожеребившихся кобылах, и . .на длительно.холостекхЕИх по разным причинам животных. Уровень приживляємости трансплантатов в катке: гинекологически здоровых кобыл,, по нашим наблюдениям, одинаков ДЛЯ'всех групп ЖИВОТНЫХ (виргинных, ОЖЭребИВЕИХСЯ в текущем году, холостых).

6.1 выводы ;

■ 1. Разработана нехирургическая технология трансплантации эмбрионов лошадей. ■ Суп$ственными особенностями которой являются: ' '

многократное извлечение эмбрионов из кобыл-доноров а как-, дом следующем друг, за другом .половых циклах, '

пересадка 8-й суточных поздних (экспандированных) бласто-

■ ЦИСТ, . " .

использование пересадочной.среды, содержащей 40-60Ї шгт-ка куриных яиц, -

синхронизация половых циклов кобыД посредством хоркоки-ческого гонадотропного гормона. *

2. Многократное извлечение эмбрионов из матки кобыд-доно-

pos позволяет получить несколько (до 14) зародышей в течение года от одного животного без вреда для его здоровья й последующей плодовой деятельности иотказаться от разработки методов вндуцкрозаняя полиовуляции. . ...

3. Екэкеспособкыз 7-9 -и суточные бластоцисты лошадей су-цэствешгостлячавтсЕ по внешнему виду, прозрачности и удельной кассе от погибших* Жизнеспособные эмбрионы имеют правильную сзрозидауо или слегка эллипсоидную форму, плотно прилегающую к клеткам трофобласта внешхю оболочку (бластолемму), полупрозрачна. При погруяэнии в иелточно-солевую среду (имеющую в своем составе 20 и более процентов желтка) жизнеспособные бластоцисты всплывают к поверхности. Погибшие эмбрионы по внешнему зиду напоминают спуиэнный мяч, внешняя обблочка (бяастолемма) сильно отслоена от клеточной массы, комок клеток бластоцисты мутный (матового цвета). При переносе в же лточно-солевую среду* когибске зародыши погружайтея в толшу жидкости.

4; 8-и и 9-и дневные'бластоцисты лошадей быстро увеличиваются в размерах и в этом возрасте из разряда микрообьектов переходят в! разряд макрообьекгов; становятся хорош видимы в промырной шдкости невооруженным глазом, что позволяет исключить кинроскопирование при пересадках. '

-6, Добавление к фосфатно-солевому раствору (ФБС), либо к кобыльему молоку 20-60Z юелтка куриных яиц позволяет успешно культивировать 7-9 суточные эмбрионы лошадей in vitro в,течение нескольких (от 1 до 3) суток.

б. Хранение- 8 -я суточных лошадиных зародышей в желточ-'ко-солевой среде (50Х яелтка и 50Z ФЕС) в интервале температур' од +32 до +40*С обеспечивает высокую сохранность и способствует интенсивному увеличению их размеров. Снижение ■ температуры ниш +32*С приводит к подавлению роста бластоцист. Сохранность зародышей при понмдошшх температурах ухудшается.

7. Введение хорионического гонадотропного гормона (ХГ) подготавливаемым к пересадкам кобылам в фолликулярную фазу Еструса обязательно. Без шгьекции хорионического гонадотропина овуляция у обрабатываемых кобыл наступает в неконтролируемые сроки, разновременно и необходимой степени синхронности их половых циклов добиться не удается.

'8. Сезонные изменения интенсивности овариашгой функции яичников кобьи связаны с возрастными и наследственными особен- .

ностяии и условиями обитания конкретного ккаотно'го. нобшы советской и русской тяиеловоэаыг пород проявляет В Т6Ч9КИ9 rosa болы» половыж циклов, чемизтккдокскоЯ и будеяновской пород. Русские рысветые кобылы вакииэпр пр этому показателю. ■ про«эсуточное тюлои?ю1е. ■'■;■* \ :.' .

.' 9. Прииехярургмческих пересадках эмбрионов кобыхаа-рэци-пиентаи пересадочный иястру»энт необходимо вводить каяо-цэрзи-калыши методом"неглубоко' (на' 2-4 см) в тело матки. \ .■' ; 10. превентивное введение (га 16-20 минут до пересадка) шокссуприпз лзктата кобылам- реципиантам# повыгаэт проиаляз-мость.эмбрвонов-трансилантатов.

11. Беременность,' роды и-лактация кобал-рвцжпсэятоэ протекает /'.■■■ нормально. : Рост и развитие /полученных - пэра-бят-трансплантатов ве отдичвотся от сверстников. ' ,'* .

првдошия производству

. Разработай, рассмотрен, одобрен Ученым Советом ВНИИ коневодства и ; предлояеа для внедрения проект рекомзкд^ий по трансплантация эмбрионов лошадей в производственных усгсйшяг.

Список основных опубликованных по теш1 диссертации

;■;'..:": ;*.'' .Г-' . научвцт работ: '

1. Shilova А. V., Platov E.U -and Lebedev S.G. ' The usa of Human Chorionic Gonadotropin ror Ovulation Date Regulation in ttares//Proc. 8 int.Cong.'Anlia Reprod. and Art if. Insen Krakov, 12-16 July 1970.- P. 331 ; '

2. СМлова A.R , Лебедев С.Г. Роль гормональных факторов в регудяции процесса созревания фолдякулов у кобыл к , применение хориояического гонадотролива для ускорения овуляции// Кв-вестия ТСХА.- 1978.- N5.- С. 176-184. '.-.V', .

. 3. Лебедев CMY, >Ьлахоэа Т.е. Результаты освоения ке-хирургнческого метода- извлечения ранних вибрионов из матки ко^ бш/ Научные тр. БНИИК "Воспроизводство и улучшение плэиен-ных качеств конского поголовья". - 1979. - С.69-73

.'4. Лэбедев С.Г, Влияние хорданического гонадотропина на воспроизводительные функции кобыл/ Научные тр. ВНИИК "Резервы . развития и повышения эффективности 'коневодства". - , Рязань. -.. .1070. - С. 27-33 , . . ; I , Г

'6.. Лебедев С.Г., Григорьев М.Ю. О механизме оЬуляции у кобыл/ Научные тр. ВНИИК "Селекция и технология выращивания v лошадей в конных заводах". - 1981. - С. 92-98

. б. Lebedew S.O. Unblutige Elgewinnung beim Pferd/ Pro«. ; 30 Internat. Fachtag, fur " Fortpfl. .und ■ Besamminp. - Wals;: '(Osterreich) 24-26 Septeirber 1981.

7. Лебедев С.Г. Нехирургическая пересадка эмбрионов в , коневодстве/ Материалы 33 ежегодной конференции ЕАД. 16-19 августа 1982.- Ленинград. ' . ' ; '* ■

8. Лебедев С. Г. , Малахова Т. С. , Синхронизация времени овуляции у кобыл/ Научные тр. ВНИИК "Биологические 'основы технологии коневодства". - 1982. - С. 48-56 , i ;

9. Лебедев С. Г. Васин А. Д., Силаева ИД.,.; Результаты комиссионного испытания хорионического гонадотропина// Ветеринария, - «3.- 1983.- С. 64 ■■' ; '

10. Лебедев O. P. ; Способ определения оплодотворяющей , способности спермы жеребца.. Авт. свид. СССР N1090384, J9B4.

II/ Лебедев С. Г. Многократное использование кобыл-доноров для трансплантации эмбрионов/ Научные тр. ВНИИК "Достижения . физиологии и их применение в коневодстве".- 1984. - С. 107-116

12. Лебедев а Г., Малахова Т.е.» Сидорова Н. В. ■ Нехирургический метод перекоса ранних эмбрионов в матку кобыл-реципиентов/ Научные тр. ВНИИК "Интенсификация коневодства". - 'l985. -С.?0-79 ' ■ ■ ; ." ■ ■ ; / ■■''..

13. Лебедев С, Г,, Малахова Т. С., Сидорова Н. В, Физиологические основы метода трансплантации зародышей.у лошадей (Од-ношюдие кобыл)/ Научные тр. ВНИИК "Дгти ускорения научно-технического прогресса в коневодстве". - 1986. - С. 133-141 ;

14. Лебедев С. Г. , Лебедева Л.Ф. Способ получения жизнеспособных поздних бластоцист лошадей. Авт. свид. СССР N1497216, 1969. \ ■.:" * / :

15. Лебедев С. Г., Лебедева Л. & Культивирование экспонди-рованных бластоцист лошадей/Научные тр. ВНИИК "Интенсификация селекции и технология выращивания^лошадей".- 1988.- С.202-209'

■■.■■' 16, Чернышов И. Л., Лебедев С.Г. Условия отбора кобыл-доноров эмбрионов/ Об. научн, тр. НИИ племенного дела "Биотехнология воспроизведения и биотехнологические методы разведения с.-х. животных".- 1989,- С. 1Б2-1Б4

17. Лебедев С. Г., Храброва Л. А.. Малахова Т. С., Сидорова Н.Е Совершенствование технологии пересадок эмбрионов нехирургическим методом/ Научные труды ВНИИК "Новое в технологии

; коневодства и коннозаводства". - 1990.- С. 34-51

18. Лэбедев С. Г. О сезонности размножения лошадей/ Научные тр. ВНИИК "ПУтя повышения1племенных, .спортивных, рабочих и продуктивных качеств лошадей". - 1992. - С. 140-152

19. Лебедев С. Г.» Сидорова-Н.ЕГ. Влияние температурного фактора на жизнеспособность бластоцист лошадей/ Научные труды ВНИИК "Цуги повышения племенных, спортивных, рабочих и продукт тивных качесть лошадей". - 1992, - й162-160

Подписано к печати 4.05.94 Тирад 100 .

Закав .^36 Объем 20 л.