Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Культивирование бластоцист лошади in vitro

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Культивирование бластоцист лошади in vitro"

о J

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ КОНЕВОДСТВА

На правах рукописи

ЛЕБЕДЕВА Людмила Федеровна

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ БЛАСТОЦИСТ ЛОШАДИ Лп У\оГО

03.00.13 - физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических на\'к

В Н И И К - 1990

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте коневодства

Научный руководитель - кандидат биологических паук, ' . ЛЕБЕДЕВ С.Г.

Официальные оплонегты: доктор биологических, наук,

профессор ШИХОВ И.Я. кандидат биологических наук АЛЕКСЕЕВ М.Ю.

Ведущее предприятие - Всероссийский научно-исследовательский институт племенного дела

Защита состоится 25 декабря 1990 года в 11 часов на заседании специализированного совета К 120.75.01 во Всесоюзном научно-исследовательском институте

коневодства

Адрес: 391128 Рязанская область, Рыбновсхий район, институт коневодства

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ коневодства

Автореферат разослан ноября 1990 г.

Ученый секретарь п'едиализированного совета С.С.Сергиенко

ZikW'lb-.'l;

Ci!1).. o'iL.i" i

*........н

^ тдел ОНЦАЯ ХАРАКТЕР/¡С ГИХА FAbOTU

.иссертации t

Актуальность темы. Возможность поддержания жизнеспособности зародытеей зао материнского организма - един из важнейших моментов в эмбркотрансплантации, Работа с зародышами сельскохозяйственных животных на предимплантационных стадиях развития позволяет свободно манипулировать наследственным материалом в научных и практических целях.

Почти 8С—летняя история развития вопроса культивирования зародышей привела к создании простых и сложных культу-ральных систем для краткосрочного и длительного хранения эмбрионов in vitro . Сложные синтетические среды позволяют инкубировать зародыши с 1-2-клеточкой стадии до сбрасывания. бластоцистой блестяцей оболочки. Такие системы содержат до 80 компонентов, в том число дефицитных и дорогостоящий, и имеют весьма трудоемкую технологию приготовления в стационарных условиях. Многие из них могут бит* аспользованы лишь в сочетании с определенным газовым режимом в специальной установке .

3 коневодстве развитие данного направления исследования осложнено радом причин: высокая стоимость лошади как экспериментального животного, ярко выраженное одчоплодие кобыл, сложности в вызывании у них полиовуляции. По экономическим ■соображениям в коневодстве отказались от хирургической методики вымывания зародышей, что привело к необходимости работы с эмбрионами ка более поздних стадиях развития (бласто-цясты)и осложнило использование куль гуральных систем, разработанных для,зародышей других видов животных. Таким образом специфика отрасли определила некоторое отставание ее в решении данного вопроса.

В ?о г.е время физиологической особенностью кобыл является задерганный, в сравнения с самками других видов сельскохозяйственных яивотных. срок имплантации в матке / на 38-40-й день после овуляции /. Этот факт превращает зароднш лошади в исключительно интересный объект исследований и открывает более широкие перспективы использования метода, культивирования в коневодстве.

Целью наето.чщзй работы явилась разработка простого и эффективного метода культивирования бластоцпст лошади in vitro . ■ обеспечивающего поддержание их жизнеспособности в течение не мзнее суточного периода времени.

Основное задачи исследований;

1. Подобрэ.ть оптимальное соотношение ингредиентов в куль-туралъной срэде, состоящей из желтка куриного яйца, кобыльего молока и фосфатно-солевэго оуфэрчого раствора Дюльбекко для 8-9-днзвных бластсцист лошади.

2. Провести анализ качества ку.'«турвльной среды по показателям рЕ, осмотического давления, стерильности.

3. Отработать режим культивирования.

4. Провеете гистологический анализ свежеизвлеченных и культивированных зародышей на уровне световой и электронной микроскопии.

.5. Сравнить интенсивность роста бластоцист лошади in vivo и in vitro .

6. Получить жерэбекка от пересадки культивированного зародьгла.

Объект исследований. Исследования проведены на 8-9-дневных эмбрионах, полученных от кобыл Опытного конного завода и

экспериментальной ксншют ВНИИК.

Методика исследований. В опиты отбирали зародышл только хорощаго к отличного качества в соответствии с разработанной в лаборатории 5-балльной шкалой оценки эмбрионов лошедэй по морфологическим признакам. Отработку оптимального состава культуральисй среду проводили с помощью треугольной трехком-понентной диаграммы Гиббса - Розебома /см, рис. 1/. С 20^-нкм интервалом концентраций ингредиентов готовили 21 вариант среды, охзатквая таким образом все возможные сочетания трех ее компонентов /молока, желтка, ФЕС Дюльбокко/. Молоко предварительно расфасовывали в стерильные пенициллиновыо флаконн и автоклави-ровали. Среду готовили непосредственно перед катлым опытом б количества 10 мл и добавляли антибиотики. Температура инкуба--' , ции во всех экспериментах - 3?°С.

Результаты культивирования оценивали по показателю интенсивности роста эмбрионов:

ИРЭ --¿^Д .100% .где

м

V, - объем зародыша до культивирования, Уг - объем зародыша после культивирования, ИРЗ - интенсивность роста эмбриснов а среде; В свою очередь начальный и конечный- объем эмбрионов вычисляли по его диаметру до и после инкубации, измеренному под микроскопом МБС-9:

У.= УзэтК3' иди 0,523 В* '

Проверка интенсивности роста по всем, го есть 21, впри- . антам среды составляла одну серию эксперимента.. Всего было проведено 4 серки. Первая - в 12-чассвом ремге - косила рекогносцировочный характер. Во второй серии период культивирования удлинили до 24 часов.. Третья и четвертая серии проведены

hi-tâ Н-1005

М-20% Зм-с%

Х-80%

С-0% С-20%

M-4ü% "¡A- 20% Ne-0%

Ï-60É Ж- 60% S-6C%

с-оХ С-20% C-40ÍÍ

7 8 9 10

l'í-40% М-20^ U-OI

1-Ш в Ж-40% Ж-40% Ж-40&

С-0% С-Ж С-40% С-6СЙ

11 ^ M-80Í 1-2Ш С-0% 1?. М-6С$ С-2СЙ 12 М-40& К-2СЙ С-4СЙ 14 у М-20? Ж-203 С-6С$ 15 IHÄ, К-20£ С-80£

16 м-юоя с-о* 17 ^ М-8СЙ S-Ctf С-2СЙ 18 ^ z-oí С~40/£ 19 М-4СЙ ж-й C-6G5& 20 ^ M-20Í Ж-О* C-8Q5Í 21 ^ Ж- С-1000

.—■ Л среды 8——' концэнтрация ингредиентов:

!Л-4й%---йолока

Н-40%---нелтка

С-20%---ФБО Дйольбекко

Рис. 1.

Соотношение ингредиентов в различных вариантах ЖС-средн:

" 7

в области положительного результата, полученного б двух предыдущих сериях эксперимента.Рецепт средк,. обеспечивающий наилучшую интенсивность роста бластоцист, использовали б дальнейших экспериментах.

Анализ основных параметров среды - pH и осмотического давления,- а такле тестирование ее на бактериостатические свойства осуществляли стандартными методами в лаборатории физиологии размножения ВНИИК и на кафедре змбриолсгии МГУ.

Приготовление гистологических препаратов дяя световой'и электронной микроскопии, а также фотосъемка и консультация по расшифровке полученных фотоматериалов проведены на кафедре эмбриологии МГУ. _

Сравнительный анализ развития зародышей в условиях in vivo и to vitro сделан на базе накопченных в группе трансплантации материалов и собственных исследований. Биометрическая обработка данных проведена по методике Елохинского H.A.

Научная новизна. Впервые предложена простая и эффективная среда для культивирования поздних бластоцист лошади, состоящая из .желтка куриного яйца, кобыльего молоха и/или CEC ДюльСекко /Авторское свидетельство Л 1497215/. Псгказане. принципиальная возможность использования желтка в высоких концентрациях /до 6С$/ для целей инкубации эмбрионов. Впервые изучена динамика роста 8-9-дневкых зародышей лошади в среде с разным соотношением компонентов. Проведен сравнительный анализ развития бластоцист лошади в условиях in vivo и in viiro в новой культуральной среде. Впервые представлены фотоматериалы, полученные с гистологических срезов свежеизвлеченных и культивированных зародышей лошади посредством световой и электронной микроскопии.

Практическая значимость. Разработанный метод культивирования зародышей лошади отличается эффективностью,'доступ- . ностью и простотой исполнения в производственных условиях и может быть использован для оценки жизнеспособности зародышей, для их транспортировки в другие хозяйства, а также в качестве способа сглаживания чрезмерной асинхронкости в половых циклах донора и реципиента при трансплантации зародышей.

Основные положения диссертации, вынесенные на залягу

1. Кудьтуралькая срада, содержащая желток куриного яйца, кобылье молоко и/или фосфатн'о-солевсй буферный раствор Дильса о кко, при определенно« соотношении компонентов обеспечивает рост и развитие 8-9-дневных бластоцист лошади in vitro з течение не менее 24 часов,

2. Предлагаемая среда позволяет дифференцировать жизнеспособные и погибшие бластоцисты лсшади по их положению е сосуде с культурой.

3. Культивирование 8-9-днеьных бластоцист лошади в МЖС-среде не вызывает существенных изменений в клеточной струк-

• туре зародышей и обеспечивает нормальную jix приживляемость в матке реципиентов.

Реализация результатов исследований. Результаты исследований включены в разрабатываемые БНШКом "Рекомендации по трансплантации рмбрконов лошадей в производственных условиях". Оптимальный рецепт среды намечено использовать в качестве базового при отработке температурных режимов хранения зародышей лошади in vitro .

Апробация работы. Материалы диссертации доложены' на на-'научных конференциях молодых ученых 198? и 1990 г./ВНИИКоне-водства/.

о

Объем работы, Диссертация излечена на 120 страницах машинописного текста, состоит из ьзедьнкя, пяти глаз, I оводов, предложений; содержит 13 таблиц, 3 рисунков, 1Р фотографий. Список литературы содержит 140 на именований, в том числе 102 на иностранном языке.

Публикация результатов исследований. Основные результаты исследований опубликованы в семи научных статьях.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЮЕДОВАШй 1. Отработка оптимального состава кульмуральной среды Анализ культивирования зародшзей в различных вариантах среды позволил выявить зону роста эмбрионов - 4-15 /см. тябл.1/, в рамках'которой определены лучшие по уровню и стабильности роста среды. В качестве наиболее близкого к оптимальному был выбран вариант №6 /Ь\=0%, Ж=6С$, С--40Й/, показавший самый высокий и стабильный результат культивирования, Средняя интенсивность роста бяостоцист в этом варианте среды за 24 часа составила '823,8%. Несколько менее интенсивный, но столь жо стабильный рост змбрионов /592,1-701,3«/ обеспечивают среды Л 5,8,9, состаБ.тяхъ щие вкупе со средой зону надежного положительного результата инкубации. Менее гарантировано в плане стабильности развитие зародышей в средах .4 13 и 14, хотя интенсивность рсста бласто-цист в них так-яе достаточно высокая /551,6-566.7$/. Остальные варианты среды малонадежны, и культивирование в них, как правило, сопровождается отслоецием оболочки эмбриона.

Наблюдения за развитием зародыней в средах с разным соотношением- трех ингредиентов - кобыльего молока, желтка и ФБС Ивль-бекко - показали, что основным ее компонентом является желток. Два других ингредиента взаимозаменяемы и в смеси с желтком могут

Таблица 1

Интенсивность роста змурионов /КРЭ/ ь средах разного состава

¡Соотношение ин-;ИРЭ в сериях эксперимента,# Среда, }гредиелтовД }—:---

Средняя ИРЭ по 1-4 сорк-

** ! М ! 2. ! С \ 1 ! 2 ! з. 4 ,ям опыта,%

1 _ 100 _ 0 0 _ _ _

2 20 80 - 390,9 132,3 - - -

3 - ео 20 329,6 0 - - -

4 40 60 - 244,8 270,3 362,3. 780,0 470,9

5 20 60 20 66,7 667,9 666,1.. 770,0 700,0

б - 60 40 325,9 905,5 633,0 93^) 9 823,8

7 60 40 - 204, Э 643,9 509,4 145,2 432,8

8 40 40 20 313,9 744,7 645,4 542,0 644,0

9 20 40 40' 33,2 764,9 408,9 602,7 592,1

10 - 40 60 205,7 224,0 0 879,0 334,4

11 80 20 - 240,4 263,1 388,5 250,0' 302,8

12 60 20 20 298,9 342,2 437,5 284,0 354,6 '

13 40 20 40 173,0 609,7 450,0 595,4 551,7

14 20 20 60 23,8 526,8 968,2 ' 205,0 566,6

15 - 20 80 266,7 518,4 146.8 188,0 281,7

16 100 - 76,1 0 -- -

17 80 - 20 66,0 163,3 - -

18 60 - 40 125,0 114,3 - - -

19 40 - 60 139,6 30,1 - -

20 20 - '80 0 0 - - -

21. - - 100 0 0 - - -

ооеснечнвать высокую интенсивность роста бластоцист. По мере уменьпгркия концентрации желтка в среде величина этого показателя снижается. Б молочно-солевых вариантах /.$17-20/, а также чистых исходных ингредиентах /Я 1, 16, 21/, зародыши либо погибают, лиоо почти не растут и проявляют признаки дегенерации. Верхняя гранлиа допустимой концентрации желтка проходит приблизительно между 60 и 80^-кым уровнем его содержания в среде.

В процессе проведения опытов то культивированию -зародышей было установлено, что жизнеспособные, по навей оцьнке, ямбрпоны всегда всплывают к поверхности среды, располагаясь, как правило у стенки сосуда. Исключение составляют три варианта /,'е 15, 20 и 21/, в которых 8-9-дкевные бхастоиисты погружаются в толшу среды. Измерение-посредством ареометра глотко-сте по всем вариантам среды выявило, что жизнеспособные зародыши ■ опускаются на дно флакона с культурой, в которой этот показатель на превышает 0,014 г/см3. В остальных вариантах плотность колеблется в пределах 0,016-0,035 г/си3. Но среды 15, 20 и 21 не входят в число рекомендуемых к применению. Более важным оказался другой Факт в наших наблюдениях: явно погибшие эмбрионы погружаются р. среду во всех ее вариантах, что по-видимому, связано с нарушением мембранных механизмов у таких зародышей. Мы считаем возможным использовать вту закономерность в качестве дополнительного теста при оценке яизнеспособности 8-9-дневных бласгодист.

2. Оценка качества среди по показателям рН, осмотического давления, стерильности

При сопоставлении результатов культивирования эмбрионов в различных вариантах среды с показателем рН з этих вариантах /см. табл. 2/ было установлено, что в наилучших по составу средах этот показатель варьирует в пределах 6,05-6,22 /И 6, 5,3,9/. Учитывая, что в большинство культуральных сред для эмбрионов млекопитающих рН колеблется на уровне 7,2-7,3, можно констатировать несовпадение общепринятых взглядов на этот вопрос с полученными в наших экспериментах результатами. Очевидно, что относительно повышенная кислотность ШС-средн вы-

•Таблица 2 ■

Величина рН в различных образцах среды /5 повторноствй/

-!-—---г-----;-

Среда, ! Состав срё^л, % | Биометрический показатель

а 1 М 1 Ж ! С 1 М±т ! Им ! с.„%

1 - 100 - 5,95*0,023 5,90 6,03 0,85

2 20 60 - 6,07*0,019 6,02 Т 6,12 0,69

3 - 80 . 20 6,01-0,021 5,93 • т 6,05 0,79

4 . 40 60 - 6,05-0,017 6,03 • -г 6,14 0,64

5 20 60 20 6,10-0,024 6,03 1 6,16 ' 0,85

6 : - ' 60 40 6,05*0,025 5,97 • •г 6,12 0,91

7 60 40 - 6,27*0,022 6,22 т 6,34 0,76

8 40 40 20 6,19-0,008 6,16 • Г- 6,21 0,30

9 20 20 40 6,22*0,02Г 6,07 * т 6,34 0,92

10 - 40 60 • -6,22*0,003 6,1? 6,23 0,10

11 80 20 - 6,52*0,084 6,47 » V 6,56 0,54

12 60 20 20 6,43*0,018 6,34 • ~г 6,51 0,64

13 40 20 40. 6,46-0,020 6,40' • * 6,51 0,69

14 20 20 60 6,50*0,009 6/46 • т 6,54 0,22

15 20 80 6,43*0,025 6,37 V 6,50 0,^5

16 100 - - 7,0240,034 ' 6,96 • "Г 7,14 1,08

17 80 20 6,77*0,008 . 6,75 4 6,79 0,25-

18 60 - ' 40 6,79*0,018 6,73 • г 6,83 0,60

1? 40 - 60 6,97*0,005 6,96 • т 6,99 0,16

20 20 - 80 7,02-0,022 6,94 • * 7,06 0,69

21 - - . 100 7,13*0,014 7,09 • т 7,17 0,42

зывяется влиянием желтка. В то *ё время снижение его кснцон-траш1и и, соответственно повышение величины рН, сопровождается замедлением интенсивности роста зародышей в средах. А наиболее близкие к рекомендуемому значению рН варианты /.'* 16, 19, 20, 21/ оказываются вообще непригодными для культивирования эмбрионов лошади. • . '

Примерно то яе противоречие наблюдается и в отношении осмотического давления /см. табл. 3/.

Таблица 3

Осмотическое давление в' различных вариантах среды

/5 повторностей/

Срзда, № Состав среды, % | Биометрический показатель

1Р. ! Ж ! С 1М ± т . мОсМ {¡т , мОсМ Г» и/

16 100 - - 285,6*0,96 264 -г 289 0,72.

1 - 100 - 345,2*9,02 325 4- 376 5.84

21 - - 100 294,6-1,29 290 -1 298 0,9.8

7 60 40 - 311,6*3,03 302 i 319 2,17

о - 60 40 322,0-7,58 296 ^ 338 5,30

18 . . 60 - 40 236,6*0,51 285 ^ 287 0,40

8 40 40 20 309,2*0,66 307 4 311 0.43

В наилучшем варианте величина осмотического давления составляет в среднем 322 мОсМ, тогда как отработанный на эмбрионах других видов животных диапазон - 200-300 мОсМ. Ко более желательное снижение величины этого показателя опять же ведет к уменьшению доли яелтха в среде и, следовательно, к ухудшению результата культивирования / в ряду сред 'А б -№8 - «18/.

Отсюда ми делаем заключение, что для 8-9-дневного эмбриона лохадя в целом более важным оказывается факт, присутствия желтка в культуре, нежели связанное с его влиянием небольшое изменение параметров среды. Заметим, что отмеченные отклонения не язляютс-я критическими для эмбрионов в средах.

Исследование MSC-среды на стерильность /вариант ¡S& в 10 поЕторностях/ показали, что свежеприготовленная культура- наделает защищена антибиотиками и, возможно, бактериостатически-ии свойствами желтка от контаминации микроорганизмами. В течение суток, ока обеспечивает стерильные условия для развитая• эмбрионов в 1Ü0/Í случаеЕ. На вторые сутки инкубации гарантия стерильности среды снижается до 90%.

О надежности среды в пл.те постоянства основных параметров в связи о разностью ее исходных компонентов говорит величина когффщиента вариации соответствующих показателей. Несмотря ка то, что в пяти повгорностях опытов ингредиенты среды были взяты иг разных источников, коэффициент вариации рН не выходил за рамхк 0,1-1,así, а осмотического давления -0,4-5,/см. табл. 2 и 3/.

Высокую стабильность рН среды можно гарантировать и в плане ее хранения. Так за трое суток культивирования среды МБ в термостате при 37°0 был отмочен сдвиг рН в кислую сторону всего на 0,13 /6,25-6,12/.

3. Отработка режима культиьмрования

Проведено культивирование эмбрионов в течение суток в двух режимах: с перепассированиэм чзрез' 12 часов в свежую среду /опыт/ и б9з перапассррования /контроль/. При срав-

нении интенсивности роста зародышей на было обнаружено достоверной разности между группами /см. табл. 4, 5/. •

Табллца 4

Культивирование эмбрионов в течение 24 часов о перепассированием в свежую среду после 12 часов инкубации /опыт/

Интенсивность роста эмбриона /й?3/ за время культивирования, %

она . \ 0-12 V ! 0-24 ч

! ЙРЭ ? ! ИРЭ ! 1(5 (ИРЭ)

1 208,9 2,3199 255,7 2,4077 .

2 324,8 2,5116 852,3 2,9306

3 84; 9'. 1,9289 395,4 2,5970

4 309,6 2,4908 309,6 2,4908

5 431,4 2,6349 1535,2 3,1951

6 352,4 2,5470 569,4 2,7554

г» 1 373,0 2,5717 522,3 2,7179

8 286,0 2,4564 437,0 2,6875

М - т 295,4' 2,43270,0791 619,6 2,72280,0883

Пт 1,9289* 2,6349 - 2,40774 3,1951

Су 9Д9 - 9,13

Не в группе с пчрепассирозанием эмбрионов имело место некоторое снижение этого показателя /на 41,2$/ в сравнения с контролем. На основания полученных результатов ми заключили, что.более частая, чем через 24 часа смена культуральной среды ке улучпает результат инкубации.

Таблица 5

Культивирование эмбрионов в 'течение 24 часов без пере-пасскрования в свежую среду /контроль/

Л

эмбриона

Интенсивность роста эмбриона /ИРЗ/, % -----)-

КРЭ

^(ИРЭ)

X

2

3

4

5

6

7

8

905,5 633,3

872.7

285.8

932.9 347,0 737,3 572,2

2,9569' 2,8016 2,9409 2,4561 2,9698 2,5404 2,8676 2,7576

11 гп

Су

680,8

2,78640,0683

2,5404т 2,9698

. 6,98

Более длительное культизирозакие зародышей в отработанном режиме представлено в наших экспериментах результатами наблюдений за развитием 9 зародышей /см. рис. 2/. Сравнение интенсивности роста разных эмбрионов выявило широкую вариабельность в характере развития бластоцист. В то же время морфологическая опенка эмбрионов на промежуточных этапах инкуба-

л эмбрион лопнул в пипетке при проверке --эмбрион лопнул в средо ео время культивирования

Рис. 2. Длительное культггеирование эмбрионов в ОС-среде

ции бала одинаковой /5 баллов/. В свлзи с эти?.: 1лы предположили наличие более глубоких различий в таких' зародышах, обусловленных индивидуальными особенностями.

4. Гистологический анализ свежеигвлеченных и культивиро-' ванных зародышей Анализ пяти эмбрионов /двух свежеизвлеченных в возрасте 8,5 и 9,5-суток; двух инкубированных в течение 24 часов, но с разной интенсивностью роста - 793,4 и 347,05?; одного эмбриона "сомиительного"качества после 36 часов в культуре/ показал следующее."

»

На уровне световой и электронной микроскопии инкубированный зародыш с высокой интенсивностью роста /753,4$/ сохраняет . структуру, характерную для евежеизвлечейнсго зародыша: крупные ядра с тонковолокнистой структурой и плотными ядрышками, .целостность двухслойного клетоаного пласта, большое количество вакуолей и др.,У отставшего в росте эмбриона /347,0$/ на клеточном уровне начинают проявляться отклонения в структуре. Степень накуолиэированности меток снижается, что говорит о затруднении транспортных процессов в клетках. Попадаются ядра, напоминающие по виду пикнотические. Отмечены отдельные случаи выпадения клеток из клеточного пласта в бластоцель и под оболочку зародыша.

В "сомнительном" эмбрионе картина разрушения становится

очевидной даже на полутонких срезах под сватовым микроскопом._ «

Нормальная структура клеток утрачена. Ядерные к клеточные оболочки трудноразличимы, в результате чего двухслойный пласт клеток представляется слившимся в единую недилеренцированную массу с беспорядочно яассредоточеннымя в ней ядрышками. Трофо-

бласт отходит от оболочки, не имея с ней контактов.

Анализ полученных фотоматериалов позволил нам сделать вывод о том, что 1/ культивированные эмориокы с высокой /то есть нормально!! для среды #6/ интенсивностью роста сохраняют нормальную клеточную структуру, свойственную свеяеизвлеченннм зародышам и 2/ выбранный нами в качестве критерия показатель интенсивности роста, действительно, отражает состояние зародыш на клеточном уровне и может служить его дополнительной качественной характеристикой.

5. Сравнение развития эморионов в условиях in vivo и in vitro

Как показали расчеты, проведенные на базе материалов лаборатории и собственных исследований, -8,5-суточные эмбринн достоверно /р >0,999/ отстают в росте от одновозрастных зародышей в условиях in vivo . Разница з интенсивности.роста таких зародышей составила в среднем 279,1%, или около 8 часов /см. табл. 6/. Более продолжительное культивирование увеличивает отставание,'которое на сроке 3S часов подтверждается достоверно /р> 0,95/.

Таблица 6

Интенсивность роста 8,5-суточных бластоцист лошади

in vivo и in vitro в течение 2,5 суток

Условия развития

Интенсивность роста эмбрионов /И?Э/ за время культивирования, %

V¿ Ч ! >4 Ч ! ч ; ' 48 Ч ! 'во"

! П ? ИРЭ i ft ! ИРЭ "Tñ"; ИРЭ in! ИРЭ f"! ИРЭ

in vivo 58 372,2 60 910.2 5 2626,9 - - 1 6258,8

in vitro 8 296,4 17 630,5. 5 1110,9 8 2410,1 1 4864,6

. A 75,8 279,7 1516,0 - - 1394,2

х • 20

6. Лырроадка iv льтивированных эмбрионов

В годтпарждоние эффективности и надежности разработанного метода очло проведено двэ пересапки культивированных в течение суток в среде #6 зародышей лошади. Оба эмбриона прижились. Беременность одного из реципиентов завершилась рождением нормального жеребенка. Вторая кобыла-реципиент абортировала на сроке 5,5 месяцев. Плод - рыжая кобылка - не имел каких-либо отклонений от нормы. Причина аборта, по-видимому, носила травматический характер. Достоверность происхождения полученного жеребенка-трансплантата подтверждена методом иммуногенэтического контроля по группа« крови истинных родителей, приемной матери и самого трансплантата.

ВЫВОДЫ

1. Разработана культуральная среда, обеспечивающая рост и развитие 8-9-дневных бластоцист лошади in .vitro в течение не менее 24 часов /авторское свидетельство № 1497215/.

2. Среда, условно названная "MSC", включает в свой состав желток куриного яйца /20~60#/, кобылье молоко /0-60%/ и/или Фсефатно-солевой буферный раствор Ддньбекко /0-60$/. Наиболь- .

" шал интенсивность роста зародышей /600-800? в объеме/ установлена ,в следующих вариантах среды: . . }£6 - ЬИЙ, Ж=6£$, С=40$ J65 - М-2С*, Ж«6036.. С=2($ № - Ж=40$, С=2($ J69 - Н=40%, С=40Я

3. Обязательным компонентом в ГЖС-средэ является желток, два других ингредиента /кобылье молоко и Ф5С Двльбекко/ взаимозаменяемы и в смеси о желтком обеспечивают интенсивный рост зародышей в среде.

4. Концентрация водородных ионов и осмотическое давление

в разработанной среде находятся в пределах допуст,д:нх значений, установленных при культивировании эмбрионов млекопитающих.

5. 8-9-дневные бластоиисты лошади, оцененные пс морфологическим приз накат/ как жизнеспособные, Бсллыьают в средс с плотностью выше 1,014 г/см3 к ее поверхности, с погибшие во всех случаях опускаются на дно флакона с культурой.

6. МКС-среда обеспечивает стабильность рН и .гарантию стз-рилькости культуры при традиционном способе санирования /пенициллин + стрептомицин/ в течение двух суток инкубации.

?. За 24-часовой период культивирования 8,5--суточные зародили лошади достоверно /р>0,999/ отстает в росте от эд-новозрастнчх эмбрионов ¡r¡ vivo в среднем ча 275,7$ зли примерно на 8 часоп.

8. Микроструктура культивированного зередуша, показавшего за сутки обычную в среде ,'ёб интенсивность роста /793,4#/, на электроннограммах не отличается от структуры контрольного эмбриона ín vivo.

9. 24-часовое культивирование эмбрионов в ЖС-среда /вариант №6/ не оказало отрицательного влияния на приживляемое ть их в матке реципиентов после пересадки.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Предложена новая культуральная среда для 8-9-дневных эмбрионов лошади, отличающаяся доступностью и простотой при изготовлении в производственных условиях.

2. Фам всплывания и погружения эмбрионов в КЗС-средо может служить экспресс-мстодом сценкк их жязнеспособкосп».

Список опубликованных работ по теме дисрертации:

1. Храброва Л.А., Лебедева Л,Ф. Зкспресс-оцэнка жизнеспособности эмбвионов методом витального окрашивания.// Резервы товышения эффективности коневодства и коннозаводства: Тез. докл.-ЕЖК, 1997, С. 72-7?

2. Лебедев С.Г., Лебедева Л.Ф. Культивирование экспан-дироаални;; бластоиист лошадя. //Интенсификация селекции и технологии выращивания лошадей: Сб.нау-я.трудоь-ВНИКК,1988, С.202-210

3.Лебедева Л.Ф. Сравнениэ роста эмбрионов in vivo и

in И ".го . // Современное состояние и перспективы развития

>

научных "'.сслепованкй по коневодству: Тез. докл.-БНШК, 1989, С.70-71

4.Леб9даэ Г., Лебедева Л.Ф. Способ получения жизнеспособных поздних бластоцист лошадей in t/itl"0 Авторское свидетельство 1497215 ст 3 апреля 1989 г., Гос. комитет СССР по делам изобретений и открытий

5. Лебедева Л.Ф. Контроль Г.Ж-среды по показателям pH и осмотического давления. // Новое в технологии коневодства и коннозьводств.а: Сб.научн.трудов.-ВНИЛК, 1990 /а печати/

6. Урабров© Л-А., Лебедев С.Г., Лебедева Л.Ф. Бактерио-' логический аспект нехирургической трансплантации эмбрионов. // Новое в технологии коневодства и коннозаводства: Сб.научн. ттдов.-ЗНИИК /в печати/

7. Лебедева Л.Ф., Лебедев С.Г., Лучинская H.H. Среда для культивирования бластоцист лошади in vítГС . //Сб. те-i-зчсов JJLi-то Всесоюзного совещания эмбриологов.- МГУ, 1991 /в печать/