Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Технология синтеза и очистки рекомбинантных антигенов вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней и цирковируса свиней второго типа и их применение в иммуноферментном анализе

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Технология синтеза и очистки рекомбинантных антигенов вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней и цирковируса свиней второго типа и их применение в иммуноферментном анализе"

На правах рукописи

Богданова Валентина Саттаровна

ТЕХНОЛОГИЯ СИНТЕЗА И ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИГЕНОВ ВИРУСА РЕПРОДУКТИВНОГО И РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ И ЦИРКОВИРУСА СВИНЕЙ ВТОРОГО ТИПА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В ИММУНОФЕРМЕНТНОМ АНАЛИЗЕ

03.00 23 - биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Щелково - 2007 г

0031"74446

003174446

На правах рукописи

Богданова Валентина Саттаровна

ТЕХНОЛОГИЯ СИНТЕЗА И ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИГЕНОВ ВИРУСА РЕПРОДУКТИВНОГО И РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ И ЦИРКОВИРУСА СВИНЕЙ ВТОРОГО ТИПА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В ИММУНОФЕРМЕН ГНОМ АНАЛИЗЕ

03 00 23 - биотехноло! ия

Аш'орефсра!

диссертации на соискание ученой схспсни кандидата биологических наук

Щелково - 2007 г

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии и иммунологии ЗАО «Научно-производственное объединение НАРВАК»

Научный руководитель доктор биологических наук

Забережный Алексей Дмитриевич

Официальные оппоненты

доктор биологических наук Клюкина Валентина Ивановна

доктор ветеринарных наук, профессор Куриннов Виктор Васильевич

Ведущая организация ГУ Научно-исследовательский

институт вакцин и сывороток им И.И.Мечникова РАМН

Защита состоится 02 ноября 2007г в 10 часов на заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук Д 006.069 01 во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности Россельхозакадемии по адресу: 141142, Московская обл, Щелковский район, п/о Кашинцево, пос Биокомбинат, ВНИТИБП

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИТИБП Автореферат разослан 01 октября 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Ю.Д. Фролов

1 .ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1 1 Актуальность темы

Репродуктивный и респираторный синдром свиней (РРСС) и цирковирозы (в основном, синдром послеотъемного мультисистемного истощения свиней - СПМИ) наносят большой экономический ущерб промышленному свиноводству во всем мире

Э1 историческими агентами этих заболеваний являются повсеместно распространенные вирус РРСС и цирковирус свиней второго типа (ЦВС-2) Часто наблюдается одновременное инфицирование животных этими вирусами, причем наличие у положи 1ельных по ЦВС-2 свиней вируса РРСС инициирует проявление клинических симптомов СПМИ

Сходство клинических проявлений РРСС и цирковирозов требуют дифференциальной диагностики этих заболеваний и определения серологическою статуса свиней, в частности, с помощью твердофазного иммуноферментно! о анализа (ИФА)

При нашем участ ии ранее были разработаны и внедрены в ветеринарную практику РФ диагностические иммуноферментные наборы «РРСС-СЕРОТЕСТ» и «ЦИРКО-СЕРОТЕСТ» для выявления антител к вирусу РРСС и ЦВС-2 в сыворо1ке крови свиней В качестве специфических компонентов этих наборов использованы подученные нами рекомбинантные антшены вируса РРСС и ЦВС-2, синтезированные в прокариотической (нуклеокапсидный белок «№> вируса РРСС) и эукариошческой (капсидный белок «С» ЦВС-2) системах экспрессии Однако, эти антигены синтезировались в клетках хозяина, в основном, в нерастворимой форме (в, виде телец включения), для их очистки были необходимы денатурирующие условия, что нарушало пространственную струк1уру белка и усложняло процедуру его очистки В связи с этим, нами была изучена возможность получения растворимых форм рекомбинантных антигенов вируса РРСС и ЦВС-2

1.2.Цель и задачи исследования

Цель исследования - разработка технологии синтеза и очистки рекомбинантных антигенов вируса РРСС и ЦВС-2 для получения на их основе диагностических иммуноферментных тест-систем, предназначенных для выявления антител к этим вирусам в сыворотке крови свиней

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи

1 Сконструировать рекомбинантную плазмиду для синтеза растворимой формы рекомбинантного нуклеокапсидного белка «Ы» вируса РРСС в прокариотической системе экспрессии в виде химерного белка слияния с протяженным, содержащим два полигистидиновых пептида и тиоредоксин, аффинным лигандом,

2 Сконструировать рекомбинантную плазмиду для синтеза растворимой формы рекомбинантного капсидного белка «С» ЦВС-2 в прокариотической системе экспрессии в виде химерного белка слияния с протяженным, содержащим два полигистидиновых пептида и тиоредоксин, аффинным лигандом.

3 Разработать технологию очистки синтезированных в прокариотической системе экспрессии рекомбинантных белков вируса РРСС и ЦВС-2 методом металло-хелатной аффинной хроматографии.

4.Провести оценку очищенных растворимых рекомбинантных белков «Н» вируса РРСС и «С» ЦВС-2 при использовании их в качестве антигенов в непрямом ИФА для выявления антител к вирусам РРСС и ЦВС-2 в сыворотке крови свиней в сравнении с антигенами, применяемыми в диагностических наборах «РРСС-СЕРОТЕСТ» и «ЦИРКО-СЕРОТЕСТ».

1.3. Научная новизна работы

Проведены синтез растворимых форм рекомбинантных антигенов вируса РРСС и ЦВС-2 в прокариотической системе экспрессии и их очистка методом металло-хелатной аффинной хроматографии Эти антигены пригодны для использования в качестве специфических компонентов в иммуноферментных тест-системах для выявления антител к вирусу РРСС и ЦВС-2

1.4. Практическая значимость и реализация результатов исследований

На основе очищенных рекомбинантных атигенов разработаны и внедрены в ветеринарную практику РФ диагностические иммуноферментные наборы «РРСС-СЕРОТЕСТ» и «ЦИРКО-СЕРОТЕСТ» для выявления антигел к вирусу РРСС и ЦВС-2 в сыворогке крови свиней Нормативно-техническая документация на изготовление наборов у1верждена Россельхознадзором Минсельхоза России в установленном порядке (Инструкция по применению набора peaieHTOB «РРСС-СЕРОТЕСТ» б/н ог 12 08 05, ТУ № 9388-01242418073-04, Инструкция по применению набора реагентов «ЦИРКО-СЕРОТЕСТ» б/н от 27 07 05, ТУ № 9388-010-42418073-04) Использование растворимых форм рекомбинантных антигенов вируса РРСС и ЦВС-2 в качестве специфических компонентов диагностических наборов снизит стоимость их производства

1.5.Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных научно-исследова1ельских конференциях «ВЕТЕРИНАРНАЯ МЕДИЦИНА 2005 Современное состояние и актуальные проблемы обеспечения ветеринарного благополучия» - Крым, г Ялга, 2005 i , «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ ГЕНЕТИКИ» - Беларусь, Минск, 2005 г, и на заседаниях ученого совета НПО НАРВАК (2002-2007г г)

1.6. Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 научных работ

1.7. Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту

1 Конструирование рекомбинантной плазмиды, содержащей ген ORF7 нуклеокапсидного белка «N» вируса РРСС, на основе вектора рЕТ32ь+ для синтеза целевого продукта в виде химерного белка слияния с протяженным, содержащим два полигистидиновых пептида и тиоредоксин, аффинным лшандом («tag») в прокариошческой системе экспрессии

2 Конструирование рекомбинантной плазмиды, содержащей ген ORF2 капсидного белка «С» ЦВС-2, на основе вектора рЕТ32ь+ или рЕТ32а+ для синтеза целевого продукта в виде химерного белка слияния с протяженным, содержащим два полигистидиновых пептида и тиоредоксин, аффинным лигандом («tag») в прокариотической системе экспрессии

3 Технология очистки рекомбинантных белков нуклеокапсида «N» вируса РРСС и капсидного белка «С» ЦВС-2, синтезированных в прокариотической системе экспрессии, металло-хелатной аффинной хроматографией

4 Оценка возможности использования очищенных растворимых рекомбинатных белков «N» вируса РРСС и «С» ЦВС-2 в непрямом ИФА для выявления антител к вирусам РРСС и ЦВС-2 в сыворотке крови свиней в сравнении с используемыми в диагностических наборах «РРСС-СЕРОТЕСТ» и «ЦИРКО-СЕРОТЕСТ» антигенами

1.8. Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 139 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения Список литературы включает 218 источников, в том числе 19 отечественных и 199 зарубежных авторов Работа иллюстрирована 38 рисунками и 6 таблицами

2.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 .Материалы и методы

В работе использовали клеточные линии MARC-145 и РК-15, любезно предоставленные Dr William Mengeling (Национальный институт болезней животных, Эймс, США) Для синтеза рекомбинантных белков в прокариотической системе экспрессии использовали штаммы Escherichia coli BL21 (DE3)pLysS и BL21trxB(DE3)pLysS (Novagen, США)

В качестве источника генов нуклеокапсидного белка «N» вируса РРСС европейского типа использовали изолят вируса РРСС 201 Rus 01, любезно

предоставленный профессором Орлянкиным Б Г, американского - NADC8, любезно предос'[ авленный Dr W Mengehng (США)

В качестве источника генов капсидного белка «С» ЦВС-2 применяли штамм вируса ISU-31, предоставленный Dr Prem Paul (Государственный Университет штата Айова, США).

Суммарные: РНК вируса РРСС и ДНК ЦВС-2 выделяли с использованием тризола (Tnzol, "Life Technologies", США) по методике производителя соответственно из монослоя клеток MARC-145, зараженных вирусом РРСС, и из монослоя клеток PK-15, зараженных ЦВС-2

ОТ - ПЦР на матрице РНК вируса РРСС проводили в одной пробирке по схеме 50°С - 1 час, 94°С - 40 с, 54°С - 40 с, 72°С - 40 с (для последнего цикла -7 мин ) Всего -35 циклов Параметры ПЦР на матрице ДНК ЦВС-2 95°С -40 секунд, 55°С - 40 секунд, 72°С - 1 мин (для последнего цикла - 3 мин) Всего -35 циклов

Сыворотки. Для анализа на наличие антител к вирусу РРСС и ЦВС-2 использовали сыворотки крови иммунных и неиммунных свиней из хозяйств России и Беларуси, а также референтные отрицательные и положительные сыворотки крови свиней, полученные из Национального института ветеринарии Швеции (отрицательные на вирус РРСС) и из Центральной Ветеринарной лаборатории Великобритании и Государственного Университета штата Айова, США (референтные положительные и отрицательные на ЦВС-2 сыворотки)

Моноклональные антитела (мкАТ). Для подтверждения иммуноспецифичности рекомбинантною продукта применяли моноклональные антитела «WBE6», специфичные к нуклеокапсидному белку «N» европейского типа вируса РРСС, и мкАТ, специфичные к капсидному белку «С» ЦВС-2, любезно предоставленные Dr Т Drew (Центральная ветеринарная лаборатория, Вейбридж, Великобритания) Кроме того, применяли меченые пероксидазой моноклональные антитела к полигистидиновому [(His)ä-] пептиду (анти-гис'1 идиновый пероксидазный конъюгаг, «Sigma», США)

Синтез рекомбинантных белков в прокариотической системе экспрессии.

Конструирование рекомбинантных донорных плазмид. Для

амплификации гена, кодирующего нуклеокапсидный белок «N» вируса РРСС, использовали праймеры, представленные в таблице 1 Праймеры, использованные для амплификации гена ORF-2, кодирующего капсидный белок «С» ЦВС-2, представлены в таблице 2

Продукты ПЦР встраивали в векторы рЕТ23ь+ рЕТ32ь+ и рЕТ32а+ ("Novagen", США) по имеющимся в полилинкерах соответствующим сайтам эндонуклеаз рестрикции Вектор рЕТ23ь+ содержит последовательность, кодирующую шесть гистидиновых остатков - (His)6, а векторы рЕТ32ь+ и рЕТ32а+ содержат две последовательности, кодирующие полигистидиновый «tag», и последовательность, кодирующую тиоредоксиновый домен (trx)

Продукция рекомбинантных белков. Очищенные рекомбинантные плазмиды рЕТ23ь+ и pET32w (или рЕТ32а+), содержащие гены ORF7 и ORF2, использовали для химической трансформации штаммов Е coli BL21(DE3)pLysS (рекомбинантная плазмида рЕТ23ь+) и BL21trxB(DE3)pLysS (рекомбинантные плазмиды рЕТ32ь+ или рЕТ32а+)

Таблица 1 Праймеры, использованные для амплификации генов, кодирующих нуклеокапсидный белок «Ы» вируса РРСС__

Белок [rN-(His)6] (нерастворимая форма) Штамм Е coli

Вектор Праймер Сайт рестрикци и

рЕТ23ь+ Смысловой EuroBacF 5'- ААТ AAG GAT CCG GCC GGT AAA AAC CAG А-3' BamHI, BL21(DE3)p LysS

Антисмысл овой EuroBacR 5' - CCG САА GCT ТААСТТ GCA ССС TGA CT - 3' Hindlll

Белок [rN- trx] (растворимая форма) Штамм E coli

Вектор Праймер Сайт рестрикци и

рЕТ320+ Смысловой EuroBacF 5'- ААТ AAG GAT CCG GCC GGT AAA AAC CAG A-3' BamHI, BL21trxB(DE 3)pLysS

Антисмысл овой EuroBacR 5' - CCG CA A GCT TAACTT GCA CCC TGA CT - 3' HmdIII

Таблица 2 Праймеры, использованные для амплификации генов,

кодирующих капсидный белок «С» ЦВС-2

Белок [rC-trx 1 растворимая форма Штамм E coh

Вектор Праймер Сайт рестрикци и

рЕТ32ь+ Смысловой 5' - ТТА ТСС CAT GGA TAT GAC GTA ТСС AAG GAG GCG TT - 3' BamHI, BL21trxB(DE 3)pLysS

Антисмысл овой 5' - TAT ATA AGC TTG GGT TTA AGT GGG GGG TCT ГТА AGA TT-3' HindlII

Белок [rC*-trx] (растворимая форма) *- аминокислота «М» в положении 1 заменена на «С» Штамм ( col)

Вектор Праймер Сайт рестрикци и

рЕТ32°+ Смысловой 5' - GTA TCA AGC TTG CAC GTA TCC AAG GAG GCG TT - 3' Hind III BL21trxB(DE 3)pLysS

Антисмысл овой EuroBacR 5' - CCG CAA GCT TAACTT GCA CCC TGA CT - 3' Hmdlll

Бакмассу осаждали центрифугированием и использовали для выделения рекомбинашных белков

Очистка рекомбииантных белков методом металло-хелатнОй аффинной хроматографии (МХАХ).

Рекомбинантные белки очищали на NI-NTA агарозе (Qiagen, США) в нативных и денатурирующих условиях по модифицированной методике фирмы-производителя

Нативные условия очисгки

Клеточную массу лизировали охлажденным буферным раствором, содержащим 20 мМ Трис-HCL + 300 мМ NaCl + ЮмМ имидазол +0,1% тритон XI00 + 1мМ PMSF, рН 8,0 из расчета 20 мл на 1 г сырой биомассы Лизат дезинтегрировали ультразвуком, 6 раз по 10 сек с интервалом 10 сек (на ультразвуковом гомогенизаторе Somfier Model 250/450, США), и центрифугировали 60 мин при 10 000 об/мин Супернатант смешивали с Ni-NTA агарозой, уравновешенной фосфатно-солевым буферным раствором [ФСБ (20 мМ Na2HP04-NaH2P04)+ 150 мМ NaCl), рН 8,0] Смесь инкубировали при 4°С и перемешивании в течение 16 часов

Очис1ку белков проводили после перенесения Ni-NTA а1арозы в хромат ографическую колонку рачмером (¡¿1х10)см Aiapo3y последова1ельно ошывали oi избьика белка 1рис-буферным раивором (ТБР 20 мМ трис-HCl + 300 мМ NaCl + 1 мМ PMSF), рН 8,0, содержащим 10, 20 и 50 мМ имидазола, конфолируя процесс по ошичсской iijioihocih ijmiob (л ™ 280 им), регистрируемой самописцем Продукт элюировали в одну пробирку грис-буферным раствором, содержащим 250мМ имидазола Дена1урирующие условия очис!ки

Клеючную массу лизировали охлажденным буферным pacieopoM [20 мМ трис-HCl +• 300 мМ NaCl н 6 М Gu-HCL + 10 мМ имидазол + 1 мМ PMSF, рН 8,0] из расчета 20 мл на 1 г сырой биомассы Далее производили re же операции, чю и при очиоке белков в нагивных условиях, но во все буферные рас!воры добавляли 6М мочевину

Иммунохимическую активность полученных при очис1ке белковых фракций определяли mci одами непрямого ИФА и иммуноблотт инга со специфическими мкАТ и референтными ноложшельными и огрицашльными сыворотками крови свиней

Степень чистоты полученных препаратов проверяли методом SDS-элекфофореза в 12% полиакриламидном геле (ПААГ)

Концентрацию белки в растворах определяли с использованием коммерческого набора "Micio ВСА Protein Assay Kit" фирмы "PIERCE" (США) Непрямой иммуноферментнтный анализ (ИФА) проводили по общепринятой меюдике Объем вносимых в лунки планшета реагентов - 100 mien В качесше ашигенов использовали очищенные рекомбинангные белки вируса РРСС и ЦВС-2 Применяли меченые пероксидазой антитела к иммуноьтобулину G мыши ('Sigma", США), или меченые пероксидазой анштела к иммуноглобулину G свиньи («НПО НАРВАК», РФ) Использовали субсфашый раствор перекиси водорода с 3,3',5,5'-1ефамегилбснзидином (ТМВ, "МДЛ", Россия) Реакцию учитывали фотометричеески но показаниям прибора Labsystems Multiscan PLUS

(Великобритания) Наличие антител к вирусу РРСС или ЦВС-2 в

исследуемой сыворотке крови свиньи определяли по величине

коэффициента связывания конъюгата (Ксв) сывороточными антителами,

которую вычисляли по формуле (АкаИС<е.~ AvtK - 1Л

Дя.--Xlvv

( А 4SO К i rp. — AiStK - ср.)

Где - (А450 ИСср), (А«о и (А«о К~ср) - среднее (из двух повторов) арифметическое знамение

оптической плотности (А45о) для каждой исследуемой сыворотки (ИС), проб К4" и проб К

Реакцию непрямой иммунофлуоресценции (РИФ) проводили по стандартной методике на монослое клеток РК-15, не зараженных и зараженных референтным штаммом ISUVDL 98-15237 ЦВС-2 (104 ТИД50 /мл) со множественностью заражения 1 10 Исследуемые сыворотки разводили 1/100 в ФСБТ и вносили в лунки с фиксированными клетками Планшет инкубировали 1 час при 37°С, после чего лунки три раза промывали ФСЬТ Затем в лунки добавляли меченные флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) антитела к иммуноглобулину G свиньи ("Sigma", США) в разведении 1/50 и инкубировали 30 минут при 37°С После промывания планшета результаты учитывали при помощи флуоресцентного микроскопа

Статистические расчеты и графики. Расчет значений коэффициента корреляции (г) и построение графиков проводили с использованием программного обеспечения Excel 2003 (Microsoft, США)

2.2.Результаты собственных исследований СИНТЕЗ, ОЧИСТКА И ПРИМЕНЕНИЕ В ИФА РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИГЕНОВ ВИРУСА РРСС

На первом этапе работы методом МХАХ в денатурирующих условиях были очищены бакуловирусные рекомбинантные нуклеокапсидные белки N вируса РРСС американского и европейского типов, содержащие полигистидиновый «tag» (обозначены как [rN-(His)6]) Молекулярная масса белка [rN-(H»s)6] обоих типов вируса РРСС равна 14-15 kDa, выход составил, в среднем, 0,05% от массы содержащих бакуловирус клеток насекомого

(Рекомбинангные бакуловирусы, содсржщис 1сны нуклеокапсидных белков N двух [иное вируса РРСС, получены к б н А П Алексеевым)

Э1И рекомбинаншые белки были использованы в качесше ашшенов в меюде непрямого ИФА для выявления ашиюл к вирусу РРСС в обра щах сыворопси крови свиней Проведено сравнение резулыаюв, полученных при применении очищенных ашшенов [rN-(Ihs)6] американского (NADC-8) и европейского (Lelystad) шпов Высокий коэффициент корреляции результатов (г — 0,9В) привел к заключению о взаимозаменяемоеiи эшх антигенов при разработке дши ностической loci-системы Этот вывод иод1верждеи резулыашми анализа сывороюк непрямым ИФА на основе каждого 1ипа антигена в сравнении с их анализом набором фирмы "IDEXX" (США) в обоих случаях коэффициент корреляции резулыаюв г = 0,80

Однако, сишез белка [rN-(His)<-,] в бакуловирусной сис1еме экспрессии в виде нерас1Воримых 1елец включения и низкий выход при ею очисже вынудили нас искать алыернагивный, более проишоди тельный способ получения рекомбинантною ашшена вируса РРСС Был разработан метод синтеза белка N европейскою тина вируса (как наиболее pacupociраненного на юрришрии РФ), в ирокариотической системе экспрессии

Ре ком Сншантный белок N вируса РРСС, синтезированный в ирокариотической системе экспрессии.

Очищенная рекомбинашная плазмида, полученная кбн КП Алексеевым при встраивании ORF7 вируса РРСС европейского 1ипа в вектор рЕТ23ы, была использована для химической трансформации штамма Е coli BL21(DE3)pLysS и сишеза рекомбинашною белка N, содержащею один концевой поли1 исгидиновый участок - (His)^

Белок [rN-(His),,] синтезировался в клетках BL21(DE3)pLysS, в основном, в нерастворимой форме выход его при очистке в денатурирующих условиях сосывил 0,43%, то1да как в нативных - только 0,04% oi веса микробной массы Иммунохимическая акшвность син1езированного в Еcoli белка [rN-(His)6] подтверждена в непрямом ИФА и иммуноблопингом с мкАТ WBE6 (рис 1В)

очищенный в денатурирующих условиях белок [гМ-(Ш8)6] представлен, практически, единственной полосой на треке 3. Молекулярная масса очищенного белка равна 14-15кО.

а в

1

66 ц \

45 Ц

Я

31 Ё

21 1

и т к—«г «ИМ - ----щ.

1 2 3 3 2 1

Рис.1. Хактеристика чистоты и иммуноспецифичности рекомбинантного белка [rN-(His)6], синтезированного в E.coli при использовании плазмиды (рЕТ23 -ORF7).

\ - SDS- электрофорез в ! 2% ПААГ: 1 -лизат E.coli. содержащих [rN-(His)fi]. 2 - белок [rN-(His)fi], очищенный в дативных условиях, 3 - белок [rN-(His)f,], очищенный в денатурирующих условиях. В - иммуноблоттииг тех же 1репаратов после обработки мкАТ WBE6. Слева отмечено положение стандартов молекулярной массы белка (в «Da).

Дальнейшие исследования показали, что при анализе сыворотки крови свиней в непрямом ИФА на основе очищенного в денатурирующих условиях белка [гМ-(Ш8)6] содержащиеся в антигене минорные высокомолекулярные примеси повышают фон ИФА. Поэтому, несмотря на относительно низкий выход очищенного в нативных условиях белка именно этот продукт

был использован нами в качестве антигена при разработке иммуноферментной тест-системы для выявления антител к вирусу РРСС.

Проведена оптимизация условий постановки твердофазного непрямого ИФА и определена величина «отсекающего» значения коэффициента связывания конъюгата (Ксв = 30%), необходимая для дискриминации положительных и отрицательных сывороток крови свиней. Для этого были использованы референтные отрицательные и полевые положительные и отрицательные сыворотки, предварительно проверенные иммуноферментным набором фирмы «ШЕХХ» (США).

На рис.2 представлена картина сравнения результатов параллельного исследования панели сывороток (п = 35) с использованием тест-системы на основе синтезированного в E.coli белка [rN-(His)6] и набора фирмы «IDEXX» (США). Видно, что результаты, полученные при использовании двух тест-систем, имеют высокий коэффициент корреляции: г = 0.92._

№юс S/P

Рис. 2.Сравнение результатов определения антител к вирусу РРСС тест-системой на основе синтезированного в E.coli белка [rN-(His)(,| и набором фирмы "IDEXX" (США). Индекс S/P - критерий оценки уровня антител набором 'IDEXX". Коэффициент корреляции г=0,92. Число сывороток п= 35.

Чувствительность и специфичность разработанной нами тест-системы в сравнении с набором фирмы «IDEXX» (США) равны, соответственно, 93,5% и 98,2% (в экспериментах использованы 93 положительные и 435 отрицательные на РРСС сыворотки крови свиней).

Разработанная нами тест-система применена для широкомасштабного изучения серологического статуса свиней в хозяйствах России и Беларуси и внедрена в производство. Однако, поскольку используемый в этой тест-системе антиген - белок [rN-(His)6|, синтезировался в E.coli, главным образом, в нерастворимой форме, что резко снижало его выход при очистке в нативных условиях, нами был разработан способ продукции растворимой формы нуклеокапсидного белка N вируса РРСС.

Для этого на основе вектора рЕТ32ь' получена рекомбинантная плазмида, содержащая ORF7 европейского типа вируса РРСС. Наличие вставки гена ORF7 подтверждено электрофорезом продуктов обработки очищенной

плазмиды ферментами Hindlll и BamHI. Отсутствие нуклеотидных замен и делеций в рекомбинантной плазмиде подтверждено ее секвенированием с применением праймеров «Т7-промотор» и «Т7-терминатор», а также праймеров, использованных для получения ПЦР-продуктов гена ORF7.

Очищенная плазмида (pET32b+- ORF7) применена для химической трансформации штамма E.coli BL21trxB(DE3)pLysS и синтеза химерного белка (rN-trx), содержащего два полигистидиновых участка и тиоредоксиновый домен (trx). Плазмида рЕТ32ь+, не содержащая ген ORF7, использована в качестве контроля для синтеза в тех же бактериях белкового тиоредоксинового домена (trx).

Анализ очищенного в нативных условиях белка (rN-trx) показал, что содержащий тиоредоксиновый домен (trx) рекомбинантный белок (rN-trx) гомогенен, иммунологически активен и имеет молекулярную массу 35-36 kDa (рис.3). Синтезированный при помощи плазмиды рЕТ32ь+ и очищенный в тех же условиях тиоредоксиновый домен имеет молекулярную массу 20-21 kDa и не реагирует с мкАТ WBE6.

А В

Ы>я 1 2 3 4 f 2 3 4 5

9" 66 щ -

45 • ■U

31 - 22 14 Л'" 4» ф-щ

Рис.3.Результаты SDS-электрофореза (12% ПААГ) и иммуноблотгинга эелка (rN-trx), очищенного из штамма Е. coli в нативных условиях, с мкАТ

WBE6. А- SDS-электрофорез: 1- стандарты молекулярной массы белков (kDa); 2 - лизат Е. coli; 3 - не связавшиеся с Ni-NTA агарозой белки; 4 - фракция, элюированная с сорбента буфером ГБР с 50 мМ имидазола; 5 - очищенный белок (rN-trx), элюированный с сорбента буфером ТБР с 250 мМ имидазола; В-иммуноблотгинг тех же фракций при использовании мкАТ WBE6

Выход рекомбинантного антигена (rN-trx) вируса РРСС и тиоредоксинового продукта (trx), синтезированных в прокариотической

системе экспрессии и очищенных в нативных условиях, составил, в среднем, 0,35%, тогда как выход белка [rN-(His)6] при очистке в нативных условиях не превышал 0,04%

Белки (rN-trx) и trx, синтезированные в системе экспрессии рЕТ и очищенные в нативных условиях, использованы в качестве антигенов в методе непрямого ИФА для выявления антител к вирусу РРСС в сыворотке крови свиней

Проведена оптимизация условий постановки непрямого ИФА концентрация антигена (rN-trx) - 0,5 мкг/мл, разведение сывороток - 1 50, разведение конъюгата - 1 16 000 В качестве контроля на неспецифическое «связывание» сывороток использовали белок trx в концентрации 0,5 мкг/мл

При анализе 180 референтных отрицательных сывороток крови свиней непрямым ИФА рассчитана средняя величина КсВ без учета результатов, полученных на контрольном планшете, сенсибилизированном белком trx, Ксв = 9,14%, а с учетом этих результатов К^, = 6,82%, что значительно меньше «отсекающего» значения Ксв Таким образом, применение белка (rN-trx) в качестве антигена в иммуноферментной тест-системе не приводит к получению ложно-положительных результатов

Скрининг 65 полевых сывороток крови свиней на наличие антител к вирусу РРСС методом непрямого ИФА с применением в качестве антигенов очищенных рекомбинантных белков [rN-(His)6] и (rN-trx), синтезированных в системе рЕТ, показал, что коэффициент корреляции результатов без учета контроля trx составляет, в среднем, г = 0,91, а с учетом этого контроля г = 0 96 (рис 4)

Следовательно, растворимый рекомбинантный белок (rN-trx) может быть использован для замены белка [rN-(His)e] в диагностической тест-системе при определении антител к вирусу РРСС методом твердофазного непрямого ИФА

250 -200 -150 -100 50 -

-50 4

V

о-К-—^

50 100 trN-(His)6]

150

£ ±

250 -200 -150 -100 -50 -О

-50 *>

в-

50 100 1 ¡гГЧ-(Н1«)6|

¡о

Рис.4. Анализ полевых сывороток крови свиней на наличие антител к вирусу РРСС набором «РРСС-СЕРОТЕСТ» и методом непрямого ИФА с применением антигена (тЫ-1гх), синтезированного в системе рЕТ А - без учета нсснецифнческого связывания сывороток с контрольным антигеном 1гх (г= 0,91); В - с учетом неспецифического связывания сывороток с контрольным антигеном 1гх (г= 0,96)

СИНТЕЗ, ОЧИСТКА И ПРИМЕНЕНИЕ В ИФА РЕКОМБИНАНГНЫХ АНТИГЕНОВ ЦВС-2

Бакуловирусный рекомбинантный белок.

Содержащая ген ОЯР-2 ЦВС2 бакмида сконструирована к.б.н. А.П. Алексеевым. Биомасса клеток 8рос1ор1ега /п^фес/га (Б/-21) с целевым продуктом получена совместно с к.б.н. М.А. Шкаевой Очистка рекомбинантного белка «С» ЦВС2 (обозначен как [гС-(Н1»)б].) проведена в денатурирующих условиях, т.к. целевой продукт синтезировался в нерастворимой форме и элюировался с КЧ-ЫТА агарозы трис-буферным раствором, содержащим 250 мМ имидазола и 6М мочевину (рис.5). Как показали результаты 808-олекгрофорсза в 12% полиакриламидном геле, молекулярная масса очищенного белка [гС-(Н1в)б] равна 30-32 кЭа.

Выход очищенного бакуловирусного белка [гС-(Н1«)(,] составил, в среднем, 0,08% ог количества содержащих бакуловирус клеток насекомого. Этот белок был использован нами в качестве антигена в методе непрямого ИФА для анализа образцов сыворотки крови свиней на наличие антител к

ЦВС-2. Оптимизированы условия проведения ИФА и определено «отсекающее» значение величины Ксв (20%), позволяющее дискриминировать положительные и отрицательные сыворотки данным методом.

Диагностические чувствительность и специфичность разработанной нами тест-системы, рассчитанные при параллельном исследовании (совместно с М.А. Шкаевой) панели сывороток крови свиней (53 положительные и 83 отрицательные) в реакции непрямой иммунофлуоресценции (РИФ) на монослое зараженных ЦВС-2 клеток рК15, составили, соответственно 96,2% и 95,4%; коэффициент корреляции результатов - 0,88.

1.< _________ _

1.4 ■

1,2 ш Щ

s ' 3 ♦»

9.6

9.4 ig

9.2 s>4 Н Й ш

1 2 3 фракция 4 ъ

Рис.5.Активность хроматографических фракций рекомбинантного бакуловирусного капсидного белка ЦВС-2 [rC-(His)6] в непрямом ИФА при использовании моноклональных антител. Денатурирующие условия очистки: все растворы содержат 6М мочевину. 1 осветленный лизат клеток; 2 - фракция белка, не связавшегося с Ni-NTA агарозой; 3 - белок, элюированный с Ni-NTA агарозы буфером ТЕР с 50 мМ имидазола; 4 - белок, элюированный с Ni-NTA агарозы буфером ТБР с 250 мМ имидазола; 5 - буфер ТБР, pH 8,0. (Фракции разведены в 50 раз.)

Тест-система на основе очищенного бакуловирусного антигена [rC-(His),,]

ЦВС-2 успешно апробирована в свиноводческих хозяйствах РФ и Беларуси и ]

!

внедрена в производство.

Для повышения эффективности синтеза и упрощения процесса очистки используемого в этой гест-системе рекомбинантного белка «С» ЦВС-2 (синтезированного в бакуловирусной системе экспрессии в виде нерастворимого продукта), было решено изучить возможность синтеза этого белка в рЕТ системе экспрессии в Е. coli. Однако, мы столкнулись с тем, что

белок гС практически не продуцируется ни при использовании плазмиды на основе вектора рЕТ23Ь1, ни при использовании плазмиды на основе вектора pET32bf. В связи с этим, нами была сконструирована плазмида на основе вектора рЕТ32а1 со встроенным модифицированным геном ORF2*, содержащим нуклеотидный триплет, кодирующий вместо гидрофобного метионина гидрофильный цистеин. Это позволило нам получить более гидрофильный капсидный белок «С*» ЦВС-2, который, как мы полагали, будет лучше растворяться в цитоплазме E.coli BL21trxB(DE3)pLysS, рекомендуемого в качестве штамма для вектора рЕгГ32.

На рис. 6 представлена картина анализа двух очищенных рекомбинантных илазмид (рЕТ32а+ - ORF2*) на наличие вставки гена модифицированного белка «С*» ЦВС-2. Рестриктный анализ этих илазмид проведен при помощи фермента Hind III. Молекулярная масса полученных фрагментов (примерно 700 нн) установлена электрофорезом в 1% агарозе при использовании в качестве маркера продуктов рестрикции ДНК фага X ферментами Hindlli и EcoRI.. Правильность ориентации вставки гена ORF2* и отсутствие делений и нуклеотидных замен в ней подтверждены секвенированием этих плзмид на автоматическом секиенаторе ABI Prism 3130 («Applied Biosystems», США).

1 2 3

I Рис. 6.Анализ фрагментов, полученных при обработке содержащих

I модифицированный ген (ЖР2* ЦВС-2 илазмид рЕТ32ь рестриктазой ЬПпс1111, электрофорезом в 1% агарозе. 1 маркер молекулярной массы, 2,3 - фрагменты гшазмид

Белок (rC*-trx), синтезированный в трансформированном плазмидой (рЕТ32"+ -ORF2*) штамме Е. coli BL21trxB(DE3)pLysS, был очищен на Ni-NTA агарозе в нагивных условиях и охарактеризован методами SDS-электрофореза в ПААГ, иммуноблоггингом и в непрямом ИФА (рис.7).

Иммуноблоттинг с анти-гистидиновым пероксидазным конъюгатом (Sigma, США), выявил содержащие полигистидиновый участок продукты в белковых фракциях, элюированных буфером ТБР с 50 мМ имидазола (молекулярная масса 32-33 kDa) и с 250 мМ имидазола (молекулярная масса 4850 kDa). Однако, как следует из рисунков 7А,В и 8, с положительной сывороткой реагирует только последняя фракция. Выход очищенного в нагивных условиях белка (rC*-trx), в среднем, составил 0,05% от веса микробной массы.

Рис. 7. Анализ иммунохимической активности хроматографических фракций белка (rC*-trx): (D) - SDS-электрофорез в 12% ПААГ фракций белка (гСМгх), очищенного в нагивных условиях; (С) - иммуноблоггинг фракций с использованием антнгистидинового коньюгата (Sigma); (А) - иммуноблоттинг фракций с использованием (+) сыворотки; (В) - иммуноблоттинг фракций с использованием (-) сыворотки: 1 - лизат бактериальной массы; 2 - фракция, элюированная буфером ТБР с 50 мМ имидазола; 3 -фракция, элюированная буфером ТБР с 250 мМ имидазола; 4 - стандарты молекулярных масс белков.

2 0,5 0,13 0,03 АГ, мкг/мл

2 0,5 0,13 0,03 АГ, мкг/мл

^-•—(+) сыворотка: -*—(-) сыворотка^

(■*•) сыворотка -»-(-) сыворотка

Рис.8.Анализ хроматографических фракций белка (гС*-1гх), очищенного в нативных условиях, методом непрямого ИФА с референтными положительной (+) и отрицательной (-) сыворотками крови

свиней. А - в качестве антигена использована фракция белка (гСМгх), элюированная ТБР с 50 мМ имидазола; В - в качестве антигена использована фракция белка (гСЧгх), элюированная ТБР с 250 мМ имидазола. Сыворотки разведены в 50 раз.

На рис.9А представлены результаты титрования сывороток крови свиней в непрямом ИФА при использовании в качестве антигена модифицированного белка (гСМгх) в концентрации 0,5 мкг/мл. Эти же сыворотки были дополнительно проверены в иммуноблоттинге (рис.9В). Представленные на рис.9 результаты наглядно демонстрируют, что очищенный рекомбинантный антиген ЦВС-2 - модифицированный белок (гС*Чгх), специфически реагирует с положительными и отрицательными на ЦВС-2 сыворотками крови свиней.

Сравнительный анализ 65 сывороток крови свиней методом непрямого ИФА при использовании в качестве антигенов бакуловирусного белка [гС-(№$)б] и модифицированного белка (гС*4гх) показал хороший уровень совпадаемосги результатов: коэффициент корреляции результатов без учета 1гх-контроля г = 0,83 (рис.ЮА), а с учетом этого контроля - 0,89 (рис.ЮВ). Следовательно, растворимый рекомбинантный белок (гС*-Пх) ЦВС-2 может

быть использован вместо бакуловирусного нерастворимого белка [гС-(Ш»)й] в непрямом ИФА.

2,5 -2 ■ 1,5 -1 ■ 0,5 -0

1

" 2

3

4

« 5 -6 ■ 7 8

10 40 160 640 0 разведение сывороток, 1:

12 3 4 5 6 7 8

Л»

Рис.9. А-Титрование сывороток крови свиней (№№ 1-8) в непрямом ИФА при использовании в качестве антигена очищенного в нативных условиях модифицированного белка (гС*-1гх) В - ммуноблогеинг очищенного в нативных условиях модифицированного белка (гС*-1гх) с теми же сыворотками крови свиней.

и

110 90 70 50 30 10

V

: : •

♦

120 100 80

ч е 13 60

■10 О 20 40 60 80 100 120 гС-(Н!з)6

40 20 0

. -« г/.*.

50 100

ГС-(Н|8)6

Рис.10. Результаты сравнительного анализа сывороток крови свиней (п=65) методом непрямого ИФА при использовании в качестве антигенов синтезированного в бакуловирусной системе экспрессии белка [гС-(Ж8)«] и модифицированного белка (гСМгх): Л -без учета контроля на белок «1гх» (г= 0,84), В с учеток контроля на белок «йх» (г = 0,89).

Т.о, очищенный растворимый рекомбинантный белок (гС-1гх), ЦВС-2, синтезированный в прокариотической системе экспрессии, может быть использован в качестве антигена в иммуноферментной тест-системе для выявления антител к этому вирусу в сыворотке крови свиней

3. ВЫВОДЫ

1 Разработана технология синтеза растворимой формы рекомбинантного белка «1М» вируса РРСС в прокариотической системе экспрессии в виде химерного белка слияния с протяженным, содержащим два полигистидиновых пептида и гаоредоксин, аффинным лигандом

2 Разработана технология синтеза растворимой формы рекомбинантного белка «С» ЦВС-2 в прокариотической системе экспрессии в виде химерного белка слияния с протяженным, содержащим два полигистидиновых пептида и тиоредоксин, аффинным лигандом

3 Разработана технология очистки синтезированного растворимого рекомбинантного антигена вируса РРСС - нуклеокапсидного белка «И», методом метапло-хелатной аффинной хроматографии Выход очищенного белка «г№> вируса РРСС составил 0,35% от веса исходной микробной массы,

4 Разработана технология очистки синтезированного растворимого рекомбинантного антигена ЦВС-2 - капсидного белка «С», методом металло-хелатной аффинной хроматографии Выход очищенного белка «гС» ЦВС-2 составил 0,05% от веса исходной микробной массы

5 Очищенные рекомбинантные антигены «гЫ» вируса РРСС, растворимая форма, синтезированный в прокариотической системе экспрессии на основе вектора рЕТ32ь+, и «гС» ЦВС-2, растворимая форма, синтезированный в прокариотической системе экспрессии на основе вектора рЕТ32а+, могут быть использованы в качестве специфических компонентов в иммуноферментных тест-системах для выявления антител к соответствующим вирусам в сыворотке крови свиней

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Полученные в результате исследований материалы вошли в следующие нормативные документы Инструкция по применению набора реагенюв «РРСС-СЕРОТЕСТ» б/н от 12 08 05, ТУ № 9388-012-42418073-04 и инсфукция по применению набора реагентов «ЦИРКО-СЕРОТЕСТ» б/н от 27 07 05, ТУ № 9388-010-42418073-04

5.СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1 Т В Гребенникова, А Д Забережный, А Н Власова, М И Мусиенко, М А Соколов, В В Грабовецкий, Цибезов В В, В С Богданова, Б Г Орлянкин, 'ГИ Алипер, ЕА Непоклонов Генетическая вариабельность белка нуклеокапсида вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (РРСС)// 2004 - Молекулярная генетика, микробиология и вирусология -2 -стр 37-40

2 Гребенникова Т В, Алексеев К, П, Гибадулин Р А, Мусиенко М И, Богданова В С, Забережный А Д, Алипер Т И, Непоклонов Е А Синтез в бакуловирусной системе рекомбинап тных белков американского и европейского типов вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней и их антигенные свойства // 2004 - Вопросы вирусологии - 2 - стр 3742

3 Богданова В С, Гибадулин РА , Мусиенко МИ, Алексеев КГ1, Шкаева М А, Гребенникова ТВ, Верховский О А Получение и очистка рекомбинантного белка цирковируса второго типа (ЦВС-2) в бакуловирусной системе экспрессии для использования его в иммунофермешном анализе // Международная научно-практическая конференция «ВЕТЕРИНАРНАЯ МЕДИЦИНА 2005 Современное состояние и актуальные проблемы обеспечения ветеринарного благополучия животноводства» Крым, г Ялта-30 мая - 4 июня 2005 i

4 ВС Богданова, В В Грабовецкий, Л В Костина, ТВ Гребенникова Синтез растворимой формы рекомбинантного белка нуклеокапсида вируса

репродуктивного и респираторного синдрома свиней (РРСС) и применение его для выявления специфических антител к вирусу//Международная научная конференция« СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ ГЕНЕТИКИ» Беларусь, Минск,-17-18 ноября 2005 г

Ъ.Шкаева М А, Богданова ВС, Цибезов В.В, Гибадулин РА, Мусиенко МИ, Алексеев КП,, Гребенникова Т.В.*., Верховский О А., Забережный А Д, Алипер ТИ Иммуноферментный метод выявления антител к цирковирусу свиней второго типа (ЦВС-2) с применением рекомбинантного капсидного белка ORF-2.// Вопр.Вирусологии, -2005-№5-С 44-48

6 ВС Богданова, В.В Цибезов, В В Грабовецкий, О В Елисеева, ТВ Гребенникова, О А Верховский, А Д Забережный, ТИ Алипер Иммуноферментный метод выявления антител к вирусу репродуктивного и респираторного синдрома свиней с применением рекомбинантного нуклеокапсидного белка N // Вопр Вирусологии, -2007 - №2-С 46-49.

Отпечатано в ООО "Мещера" г Щелково, Московская область, Свирская, 8а зак 893, тир 100 экз

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Богданова, Валентина Саттаровна

СОКРАЩЕНИЯ.

Введение.

Цель и задачи исследования.

Научная новизна работы.

Практическая значимость.

Положения, выносимые на защиту.

1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

РЕПРОДУКТИВНЫЙ и РЕСПИРАТОРНЫЙ СИНДРОМ СВИНЕЙ (РРСС).

1.1. Патогенез.

1.1.1.Клинические признаки РРСС.

1.1.2.Паталогоанатомические изменения при РРСС.

1.2. Эпизоотология РРСС.

1.3. Биология вируса РРСС.

1.3.1. Морфология.

1.3.2.Физико-химические свойства вируса РРСС.

1.3.3.Организация генома вируса РРСС.

1.3.4.Белки вируса РРСС.

1.3.4.1,Неструктурные белки вируса РРСС.

1.3.4.2, Структурные белки вируса РРСС.

1.3.4.2.1 .Минорные структурные белки вируса РРСС.

1.3.4.2,2.0сновные структурные белки вируса РРСС.

1.3.5.Репликация вирусов РРСС.

1.4.Профилактика и контроль.

1.4.1. Неспецифическая профилактика РРСС.

1.4.2.Вакцинация против вируса РРСС.

1.5.Диагностика РРСС.

Н.ЦИРКОВИРУСНАЯ ИНФЕКЦИЯ СВИНЕЙ.

II. 1.Патогенез.

II. 1.1. Клинические признаки цирковирозов и механизм патогенеза.

II. 1.2.Паталогоанатомические изменения.

П.2.Эпизоотология цирковирозов.

Н.З Биология ЦВС-2.

II.3.1.Морфология.

П.3.2.Физико-химические свойства цирковирусов.

11.3.3. Организация генома.

11.3.4.Главный структурный капсидный белок ЦВС-2.

П.3.5.Репликация цирковирусов.

П.4.Профилактика и контроль.

П.4.1. Неспецифическая профилактика цирковирозов.

И.4.2.Вакцинация.

11.5. Диагностика цирковирозов.

III.БЕЛКИ СЛИЯНИЯ (ХИМЕРНЫЕ БЕЛКИ) И МЕТАЛЛО-ХЕЛАТНАЯ АФФИННАЯ

ХРОМАТОГРАФИЯ КАК МЕТОД ИХ ОЧИСТКИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Технология синтеза и очистки рекомбинантных антигенов вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней и цирковируса свиней второго типа и их применение в иммуноферментном анализе"

Репродуктивный и респираторный синдром свиней (РРСС), а также нередко сопутствующие этому заболеванию цирковирозы, причиняют большой экономический ущерб промышленному свиноводству. Так в США ежегодные потери только от РРСС достигают 228$ на одну свиноматку (Dee et al.j 1997). Не меньшей проблемой являются цирковирозы, смертность от которых в пораженных стадах составляет до 40% (Орлянкин, 2007), причем у больных поросят иногда достигает 100 % (Morozov et al., 1998.).

Как репродуктивный синдром (патология органов размножения), так и респираторный (поражение органов дыхания), характерны для многих заболеваний различной этиологии, значительная доля среди которых приходится на РРСС, парвовирусную инфекцию свиней (ПВИС) и цирковирозы (в основном на синдром послеотъемного мультисистемного истощения - СПМИ).

Тяжесть цирковирозов, этиологическим агентом которых является цирковирус свиней второго типа (ЦВС-2), часто обусловлена дополнительным воздействием на животных других инфекционных агентов: Pasteurella multocida, Micoplasma hyopneumoniae, вируса свиного гриппа, парвовируса свиней (Krakowka et al., 2000) и вируса РРСС (Harms et al., 2001). Такое совместное инфицирование приводит к продолжительным и необычно тяжелым вспышкам заболеваний свиней и высокому уровню их смертности (Neumann, 2002).

Своевременная дифференциальная диагностика, основанная на современных методах анализа, позволяющих выявлять возбудитель болезни и проводить мониторинг серологического статуса свиного поголовья, способствует снижению тяжести заболеваний животных и связанных с ними экономических потерь.

Разработка современных методов анализа, в частности, серологических, требует наличия препаративных количеств очищенных вирусных антигенов, в том числе, - рекомбинантных белков, полученных с помощью ДНК-технологий. В отличие от культуральных, рекомбинантные вирусные антигены могут быть продуцированы в форме, значительно облегчающей их дальнейшую очистку, и в количествах, достаточных для разработки диагностических тест-систем.

Цель и задачи исследования Цель исследования - разработка технологии синтеза и очистки рекомбинантных антигенов вируса РРСС и ЦВС-2 для получения на их основе диагностических иммуноферментных тест-систем, предназначенных для выявления антител к этим вирусам в сыворотке крови свиней

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1 .Сконструировать рекомбинантную плазмиду для синтеза растворимой формы рекомбинантного нуклеокапсидного белка «К» вируса РРСС в прокариотической системе экспрессии в виде химерного белка слияния с протяженным, содержащим два полигистидиновых пептида и тиоредоксин, аффинным лигандом.

2.Сконструировать рекомбинантную плазмиду для синтеза растворимой формы рекомбинантного капсидного белка «С» ЦВС-2 в прокариотической системе экспрессии в виде химерного белка слияния с протяженным, содержащим два полигистидиновых пептида и тиоредоксин, аффинным лигандом.

3.Разработать технологию очистки синтезированных в прокариотической системе экспрессии рекомбинантных белков вируса РРСС и ЦВС-2 методом металло-хелатной аффинной хроматографии.

4.Провести оценку очищенных растворимых рекомбинантных белков: «№> вируса РРСС и «С» ЦВС-2 при использовании их в качестве антигенов в непрямом ИФА для выявления антител к вирусам РРСС и ЦВС-2 в сыворотке крови свиней в сравнении с антигенами, применяемыми в диагностических наборах «РРСС-СЕРОТЕСТ» и «ЦИРКО-СЕРОТЕСТ».

Научная новизна работы.

Научная новизна результатов, полученных при выполнении работы, состоит в следующем:

Проведены синтез растворимых форм рекомбинантных антигенов вируса РРСС и ЦВС-2 в прокариотической системе экспрессии и их очистка методом металло-хелатной аффинной хроматографии. Эти антигены пригодны для использования в качестве специфических компонентов в иммуноферментных тест-системах для выявления антител к вирусу РРСС и ЦВС-2.

Практическая значимость

В ходе выполнения работ по теме диссертации на основе очищенных рекомбинантных антигенов разработаны и внедрены в ветеринарную практику РФ диагностические иммуноферментные наборы «РРСС-СЕРОТЕСТ» и «ЦИРКО-СЕРОТЕСТ» для выявления антител к вирусу РРСС и ЦВС-2 в сыворотке крови свиней. Нормативно-техническая документация на изготовление наборов утверждена Россельхознадзором Минсельхоза России в установленном порядке (Инструкция по применению набора реагентов «РРСС-СЕРОТЕСТ» б/н от 12.08.05; ТУ № 9388-012-42418073-04; Инструкция по применению набора реагентов «ЦИРКО-СЕРОТЕСТ» б/н от 27.07.05; ТУ № 9388-010-42418073-04). Использование растворимых форм рекомбинантных антигенов вируса РРСС и ЦВС-2 в качестве специфических компонентов диагностических наборов снизит стоимость их производства.

Положения, выносимые на защиту

1. Конструирование рекомбинантной плазмиды, содержащей ген

01^7 нуклеокапсидного белка «14» вируса РРСС, на основе вектора рЕТ32 для синтеза целевого продукта в виде химерного белка слияния с протяженным, содержащим два полигистидиновых пептида и тиоредоксин, аффинным лигандом («tag») в прокариотической системе экспрессии.

2. Конструирование рекомбинантной плазмиды, содержащей ген ORF2 капсидного белка «С» ЦВС-2, на основе вектора рЕТ32ь+ или рЕТ32а+ для синтеза целевого продукта в виде химерного белка слияния с протяженным, содержащим два полигистидиновых пептида и тиоредоксин, аффинным лигандом («tag») в прокариотической системе экспрессии.

3. Технология очистки рекомбинантных белков нуклеокапсида «N» вируса РРСС и капсидного белка «С» ЦВС-2, синтезированных в прокариотической системе экспрессии, металло-хелатной аффинной хроматографией

4. Оценка возможности использования очищенных растворимых рекомбинантных белков: «N» вируса РРСС и «С» ЦВС-2 в непрямом ИФА для выявления антител к вирусам РРСС и ЦВС-2 в сыворотке крови свиней в сравнении с используемыми в диагностических наборах «РРСС-СЕРОТЕСТ» и «ЦИРКО-СЕРОТЕСТ» антигенами.

1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.РЕПРОДУКТИВНЫЙ И РЕСПИРАТОРНЫЙ СИНДРОМ

СВИНЕЙ (РРСС)

Репродуктивный и респираторный синдром свиней (РРСС) - это вирусное заболевание, основными симптомами которого являются репродуктивные нарушения у взрослых свиней и респираторные у поросят.

Название заболевания - «репродуктивный и респираторный синдром свиней» (porcine reproductive and respiratory syndrome), принято в 1992 году на первом международном симпозиуме по РРСС в США вместо используемых прежде названий: «синее ухо», эндемические поздние аборты у свиней, голубой аборт, загадочная болезнь свиней, бесплодие и респираторный синдром свиней (Christianson and Joo, 1994).

Возбудитель болезни - вирус РРСС, принадлежит, по современной классификации, к роду Arterivirus семейства Arteriviridae. Наряду с вирусом РРСС, в это семейство включены также вирусы артрита лошадей, повышения уровня лактатдегидрогеназы мышей и гемморрагической лихорадки обезьян (Cavanagh,. 1997). Семейства вирусов Arteriviridae и Togaviridae объединены в созданный для них порядок Nidovirales (Shnijder and Meulenberg, 1998).

Вирус РРСС повышает восприимчивость организма животных к другим возбудителям. Вторичные инфекции значительно увеличивают экономические потери от заболевания РРСС, их присутствие оказывает сильное влияние на смертность новорожденных поросят. Экономический ущерб, причиняемый РРСС свиноводству разных стран, составляет от 50 до 314 долларов на одну свиноматку (Байбиков и др., 2001). Серопозитивных по РРСС свиней выявляют в 40-80% обследованных хозяйств. В неблагополучных по РРСС хозяйствах специфические антитела регистрируют у 10-95% свиней (Орлянкин и др., 2000).

В России РРСС считается одним из важнейших, требующих пристального внимания, заболеваний свиней (Груздев и др., 2006; Кукушкин, Ковалишин, 2007).

1.1. Патогенез

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Богданова, Валентина Саттаровна

4.ВЫВ0ДЫ

1 .Разработана технология синтеза растворимой формы рекомбинантного белка «Ы» вируса РРСС в прокариотической системе экспрессии в виде химерного белка слияния с протяженным, содержащим два полигистидиновых пептида и тиоредоксин, аффинным лигандом.

2.Разработана технология синтеза растворимой формы рекомбинантного белка «С» ЦВС-2 в прокариотической системе экспрессии в виде химерного белка слияния с протяженным, содержащим два полигистидиновых пептида и тиоредоксин, аффинным лигандом.

3.Разработана технология очистки синтезированного растворимого рекомбинантного антигена вируса РРСС - нуклеокапсидного белка «Ы», методом металло-хелатной аффинной хроматографии Выход очищенного белка «г№> вируса РРСС составил 0,35% от веса исходной микробной массы.

4.Разработана технология очистки синтезированного растворимого рекомбинантного антигена ЦВС-2 - капсидного белка «С», методом металло-хелатной аффинной хроматографии Выход очищенного белка «гС» ЦВС-2 составил 0,05% от веса исходной микробной массы.

5.0чищенные рекомбинантные антигены: «гЫ» вируса РРСС, растворимая форма, синтезированный в прокариотической системе экспрессии на основе вектора рЕТ32ь+, и «гС» ЦВС-2, растворимая форма, синтезированный в прокариотической системе экспрессии на основе вектора рЕТ32а+, пригодны для использования в качестве специфических компонентов в иммуноферментных тест-системах для выявления антител к соответствующим вирусам в сыворотке крови свиней.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Полученные в результате исследований материалы вошли в следующие нормативные документы: Инструкция по применению набора реагентов «РРСС-СЕРОТЕСТ» б/н от 12.08.05; ТУ № 9388-012-42418073-04; нструкция по применению набора реагентов «ЦИРКО-СЕРОТЕСТ» б/н от 27.07.05; ТУ №9388-010-42418073-04.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Богданова, Валентина Саттаровна, Щёлково

1. Байбиков, Г. 3., Гусев, А. А., Яременко, Н. А., Дудникова, Н. С., Гаврилова, В. Л., Кукушкин, С. А., Курман, И. Я., Ковалишин, В. Ф. и Рахманов, А. М. Репродуктивно-респираторный синдром свиней.// Ветеринария, -2001 №.3 - стр. 18-24.

2. Т.З. Байбиков, С.А. Кукушкин. Профилактика основных вирусных болезней свиней в промышленном свиноводстве. // ПРОБЛЕМЫ ИНФЕКЦИОННОЙ ПАТОЛОГИИ СВИНЕЙ /материалы XV МЕЖДУНАРОДНОГО МОСКОВСКОГО КОНГРЕССА, Россия, Москва. -2007 стр. 32-38.

3. К.Н. Груздев, Т.З. Байбиков, С.А. Кукушкин. Мониторинг экономически значимых инфекционных болезней свиней в России. ПРОБЛЕМЫ ИНФЕКЦИОННОЙ ПАТОЛОГИИ СВИНЕЙ /материалы XIV МЕЖДУНАРОДНОГО МОСКОВСКОГО КОНГРЕССА, Россия, Москва. -2006 стр. 29-34.

4. Т.Дрю, Д.Пэйтон. Реродуктивно-респираторный синдром свиней. ПРОБЛЕМЫ ИНФЕКЦИОННОЙ ПАТОЛОГИИ СВИНЕЙ /материалы XIV МЕЖДУНАРОДНОГО МОСКОВСКОГО КОНГРЕССА, Россия, Москва. -2006 стр. 25-29.

5. Каньшина A.B. Разработка иммуноферментного анализа для выявления антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней.// Дисс. к. биол. н.-Владимир -2004.

6. С.А. Кукушкин, В.Ф. Ковалишин. Комплекс респираторных болезней свиней в свиноводческих хозяйствах России. // ПРОБЛЕМЫ ИНФЕКЦИОННОЙ ПАТОЛОГИИ СВИНЕЙ /материалы XV МЕЖДУНАРОДНОГО МОСКОВСКОГО КОНГРЕССА, Россия, Москва. -2007 стр. 24-29.

7. Менгелинг В. Проблемы репродуктивного и респираторного синдрома свиней взгляд из США.// ПРОБЛЕМЫ ИНФЕКЦИОННОЙ ПАТОЛОГИИ СВИНЕЙ /материалы XIV МЕЖДУНАРОДНОГО МОСКОВСКОГО КОНГРЕССА, Россия, Москва. -2006 - стр. 12-17

8. Орлянкин Б. Г., Непоклонов, Е. А., Алипер, Т. И., Забережный, А. Д. и Мусиенко, М. И. Диагностика и специфическая профилактика РРСС. //Ветеринария -2000-№10-стр. 16-19

9. Орлянкин Б.Г., Т.И.Алипер, Е.А.Непоклонов. Цирковирусная инфекция свиней.// Ветеринария, 2002 - № 11 - стр. 48-51.

10. Б.Г. Орлянкин. Цирковирусные болезни свиней: диагностика и профилактика. // ПРОБЛЕМЫ ИНФЕКЦИОННОЙ ПАТОЛОГИИ СВИНЕЙ /материалы XV МЕЖДУНАРОДНОГО МОСКОВСКОГО КОНГРЕССА, Россия, Москва. -2007 стр. 19-24.

11. Сатина Т. А. Цирковирусные инфекции свиней.// Владимир: ФГУ «ВНИИЗЖ», 2003. - 101 с.

12. Шкаева М.А. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антител к цирковирусу свиней второго типа. // Дисс. к. биол. н.-М.-2006 стр.

13. Albina, Е, Madee, F, Cariolet, R. and Torrison, J. Immune response and persistence of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in infected pigs and farm units. //Vet. Rec. -1994 -Vol. 134- p.567-573.

14. Allan G.M, Phenix K.V, Todd.D. e.a. Some biological and physico-chemical properties of porcine circovims.// J. Vet. Med. B, -1994-Vol. 41 p. 17-26.

15. Allan G.M, Ellis J.A. Porcine circoviruses: a review. //J. Vet. Diagn. Invest, -2000 Vol. 12 - p. 3-14.

16. Allan, C. Konoby, L. Hassard, B. Meehan, K. Martin, J. Harding, S. Kennedy, and F. McNeilly. Reproduction of lesions of postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic piglets.// J. Vet. Diagn. Invest. -1999b.- Vol.11-p.3-14.

17. Allan, G.M., B. Meehan, D. Todd, S. Kennedy, F. McNeilly, J. Ellis, E.G. Clark, J. Harding, E. Espuna, A. Botner, and C. Charreyre. Novel porcine circoviruses from pigs with wasting disease syndromes. //Vet. Rec. 1998 -Vol.142-p.467-468.

18. Beyer, J., Fichtner, D., Schirrmeier, H., Polster, U., Weiland, E. and Wege, H. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV): kinetics of infection in Lymphatic organs and lungs.// J. Vet. Med. B 2000-Vol.47- p.:9-25.

19. Bilodeau, R., Dea, S., Sauvageau, R. and Martineau, G. P. "Porcine reproductive and respiratory syndrome" in Quebec. Vet.Rec. -1991 -Vol.129-p. 102103.

20. Biagini, P., P. Gallian, H. Attoui, M. Touinssi, J-F. Cantaloube, P. de Micco, and X. de Lamballerie. Genetic analysis of iull-length genomes and subgenomic sequences of TT virus-like mini virus human isolates. //J. Gen. Virol. 2001 -Vol. 82- p.379-383.

21. Blanchard P, Mahe D, Cariolet R, et al. Detection of porcine circovirus type 2 (PCV2) specific antibodies in post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) studies.//

22. Proceedings, European Society Veterinary Virology, PMWS.-2001-p. 104.

23. Bother, A., Nielsen, J. and Bille-Hansen, V. Isolation of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in a Danish swine herd and experimental infection of pregnant gilts with the virus.// Vet. Microbiol. -1994 -Vol. 40-p.351-360.

24. Bother, A., Strandbygaard, B., Sorensen, K. J., Have, P., Madsen, K. G., Madsen, E. S. and Alexandersen, S. Appearance of acute PRRS-like symptoms in sow herds after vaccination with a modified live PRRS vaccine.// Vet. Rec.- 1997-Vol.141 -p.497-499.

25. Brinton, M. A., Gavin, E. I. and Fernandez, A. V. Genotypic variation among six isolates of lactate dehydrogenase-elevating virus. //J. Gen. Virol.- 1986 Vol.67-p.2673-2684.

26. Brown, C S., Van Lent, J. W. M., Vlak, J. M. & Spaan, W. J. M. Assembly of empty capsids by using baculovirus recombinants expressing human parvovirus B19 structural proteins.//Journal of Virology -1991- Vol.65 -p.2702-2706.

27. Bucher MH, Evdokimov AG, Waugh DS. Differential effects of short affinity tags on the crystallization of Pyrococcus furiosus maltodextrin-binding protein.// Biol Cryst -2002-Vol.5-p.392-397

28. Calsamiglia M, Segales J, Quintana J, et al. Detection of Porcine Circovirus Types 1 and 2 in Serum and Tissue Samples of Pigs with and without Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome. // J Clin Microbiol. -2002-Vol. 40-p. 1848-1850.

29. Carman, S., Sanford, S. E. and Dea, S. Assestment of seropositivety to porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in swine herds in Ontario, 1978-1982. //Can. Vet. J. 1995-Vol.36-p.776-777.

30. Cavanagh, D. Nidovirales: a new order comprising Coronaviridae and Arteriviridae. //Arch. Virol. -1997- Vol.l42-p.629-633.

31. Chaga G, Bochkariov DE, Jokhadze GG, Hopp J, Nelson P Natural poly-histidine affinity tag for purification of recombinant proteins on cobalt(II)-carboxymethylaspartate crosslinked agarose. //J.Chromatogr.A.-1999b-Vol.864-p.257-256.

32. Cheung, A.K. Transcriptional analysis of porcine circovirus. Virology.-2003-Vol.305-p. 168-180.

33. Cheung, A.K., S.R. Bolin. Kinetics of porcine circovirus replication. //Arch. Virol.- 2002- Vol.l47-p. 43-58.

34. Cho, H.J., D. Deregt, and H.S.Joo. An ELISA for porcine reproducible and respiratory syndrome: production of antigen of high quality. //Clin. J. Vet. Res. -1996-Vol.60-p.89-93.

35. Cho, H. J., Entz, S. C., Magar, R. and Joo, H. S. Performance of ELISA antigens prepared from 8 isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus with homologous and heterologous antisera. //Can. J. Vet. Res.-1997-. 61:299-304.

36. Christensen, J., Storgaard, T., Bloch, B., Alexandersen, S. & Aasted, B. . Expression of Aleutian mink disease parvovirus proteins in baculovirus vector system.//Journal of Virology-1993-Vol. 67-p. 229—238.

37. Christianson and Joo, Christianson, W. T. and Joo, H. S. Swine health and production,// -1994-2

38. Clark E. Post-weaning multisystemic wasting syndrome. //Proc AASP Ann Meet.- 1997-p.499-501.

39. Conzelmann, K.K., Visser, N., VanWoensel, P., Triel, H.J. Molecular characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, a member of the Arterivirus group // Virology. 1993. V.193. -P. 329-339.

40. Dea S.A., Joo H.S., Poison DD., Marsh W.E. Evaluation of the effect of nursery depopulation on the profitability of 34 pig farms.// Vet. Rec. -1997-Vol.l40-p.498-500.

41. Done, S. H., Paton, D. J. and White M. E. C. Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS): a review, with emphasis on pathological, virological and diagnostic aspects. // Br. Vet. J. 1996- Vol.l52-p.l53-171.

42. Drew, T. W., Meulenberg, J. J. M., Sands, J. J. and Paton, D. J. Production, characterization and reactivity of monoclonal antibodies to porcine reproductive and respiratory syndrome virus.// J. Gen. Virol.- 1995-Vol.76-p. 1361-1369.

43. Drew, T.W. Comparative serology of porcine reproductive and respiratory syndrome in eight European laboratories, using immunoperoxidase monolayer assay and enzyme-linked immunosorbent assay.// Revue Scientifique et -1995.

44. Drew, T.W., Lowings, J.P., and Yapp, F. Variation in open readingframes 3, 4 and 7 among porcine reproductive and respiratory syndrome V irus isolates in the UK. //Vet. Microbiol.- 1997-Vol. 55-p.209-221.

45. Egli, C., Thur, B., Liu, L. and Hofmann, A. Quantitive TaqManO RT-PCR for detection and differentiation of European and North American strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus.// J. Virol. Meth.- 2001-Vol.98-p.63-75.

46. Ellis,J., S.Krakowka, G.Allan, E.Clark and S.Kennady. The clinical scope of porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection has expanded since 1987: an alternative perspective. //Vet. PathoL,- 1999-Vol36- p.262-265.

47. Goldberg, T. L., Weigel, R. M., Hahn, E. C. and Schreba, G. Association between genetic, farm characteristics and clinical disease in field outbreaks of porcine reproductive and respiratory syndrome virus.// Prev. Vet. Med.- 2000-Vol.43-p.293-302.

48. Gonin P, Mardassi H, Gagnon C. A, Massie B, Dea S. A nonstructural and antigenic glycoprotein is encoded by ORF3 of the IAF-Klop strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. //Arch Virol -1998-Vol.l43-No.l -p.927-1940.

49. Guilmoto, H., and S. Wessel-Robert. Control of PMWS in Brittany: a mainly zootechnical approach. In: PMWS: a new emerging disease of swine. //Merial symposium, new emerging disease of swine. Melbourne, Australia- 2002-p. 45-55.

50. Hamel, A., Lin, L. L. & Nayar, G. P. S. . Nucleotide sequence of porcine circovirus associated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs.//Journal of Virology-1998-Vol.71-p. 5262—5267.

51. Halbur, P.G. 2000. Proceedings of the swine disease conference for swine practitioners, 8:113-8123.

52. Halbur, P.G. 2001. Proceedings of the swine disease conference for swine practitioners, 9:162-9166

53. Harding, J.C., and E.G. Clark. Recognizing and diagnosing postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). //Swine Health and Production. -1997-Vol.5-p.201-203.

54. Hochuli E, Bannwarth W, Dbeli H, Gentz R, Stber D. Genetic approach to facilitate purification of recombinant proteins with a novel metal chelate adsorbent. //Bio/Technology-1988-Vol. 6-p. 1321-1325.

55. Hochuli E, D. and H, Schacher A New metal chelate adsorbent selective for proteins and peptide containing neighbouring histidine residues. //J Chromatogr -1987-Vol.411 -p. 177-184.

56. Horter, D. C., Pogranichniy, R. M., Chang, C.-C., Evans, R. В., Yoon, K.-J. and Zimmerman, J. J. Characterisation of carrier state in porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection.//Vet. Microbiol.- 2002-Vol. 86-p.213-228.

57. Katti SK, LeMaster DM, Eklund H Crystal structure of thioredoxin from Escherichia coli at 1.68 resolution. //J Mol Biol. -1990-Vol.212-p. 167-184.

58. Keffaber, К. K. Reproductive failure of unknown etiology.// ASSP Newsletter -1989-Vol.l-p.l-9.

59. Kim, H. S., Kwang, J., Yoon, I. J., Joo, H. S. and Frey, M. L. Enhanced replication of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in ahomogeneous subpopulation of MA-104 cell line. //Arch. Virol.- 1993-Vol. 133-p.477-483.

60. Kiupel, M, G.W. Stevenson, S.K. Mittal, E.G. Clark, and D.M. Haines. Circovirus-like viral associated disease in weaned pigs in Indiana. //Vet. Pathol. -1998-Vol.35-p.303-307.

61. Kono, Y, Kanno, T, Shimizu, M., Yamada, S, Ohashi, S, Nakamine, M. and Shirai, J. Nested PCR for detection and typing of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in pigs. //J. Vet. Met. Sci.- 1996-Vol. 58-No.10-p.941-946.

62. Krakowka, S, J.A. Ellis, F. McNeilly, D. Gilpin, B. Meeham, K. McCullough and G. Allan. Immunological features of porcine circovirus type 2 infection. //Viral Immunol.- 2002-Vol.l5-p.567-582.

63. Vallie ER, Lu Z, Diblasimo-Smith EA, Collins-Racie LA, McCoy JM Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli. //Methods Enzymol.- 2000-Vol. 326-p.322-340.

64. Cann ,P., E. Albina, F. Madec, R. Cariolet and A. Jestin. 1997. Piglet wasting disease. Vet Rec. 141:660.

65. MagarR., Larochelle R., Thibault S. e.a. Experimental transmission of porcine circovirus type 2 (PCV2) in weaned pigs: a sequential study. //J. CoAp. PathoL, -2000-Vol. 123-p. 258-269.

66. Mandrioli, L., G. Sarli, S. Panarese, S. Balboni, P.S. Marcato. Apoptosis and proliferative activity in lymph node reaction in postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). //Vet. Immun. Immunopathol.- 2004-Vol. 97-p. 2537.

67. Manual of Diagnostic Test and Vaccines for Terrestrial Animals, -2004-http://www.oie.int/eng/normes/mmanual/A 00013.htm.

68. Mardassi H, Massie B, Dea S Intracellular synthesis, processing, and transport of proteins encoded by ORFs 5 to 7 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. //Virology-1996-Vol.221-p. 98-112

69. Mardassi H, Mounir S, Dea S Molecular analysis of the ORF3-7 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, Quebec reference strain. //Arch Virol -1995-Vol. 140-p. 1405-1418.

70. Martelli P. Et al., Proc.l6th IPVSCongress, Melbourne, Melbourne,-2000p.634.

71. Meehan BM, Gilpin DF, Krakowka S, et al. In vivo quantification analyses of PCV2 DNAs: correlation of virus load measurements with disease reproduction. //Proceedings, European Society Veterinary Virology, PMWS.- 2001-p. 103.

72. Meehan, B. M., McNeilly, F., Todd, D., Kennedy, S., Jewhurst, V. A., Ellis, J. A., Hassard, L. E., Clark, E. G., Haines, D. M. & Allan, G. M. .

73. Characterization of novel circovirus DNAs associated with wasting syndromes in pigs. //J. Gen. Virol.- 1998-Vol. 79-p. 2171-2179.

74. Meng X-J, Paul PS, Halbur PG, Morozov I Sequence comparison of open reading frame 2 to 5 of low and high virulence United States isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus.// J Gen Virol.- 1995-Vol. 76-p.3 181-3 188.

75. Meng, X. J. . Heterogeneity of porcine reproductive and respiratory syndrome virus: implication for current vaccine efficacy and future vaccine development. //Vet. Microbiol.,- 2000-Vol.74-p.309-329.

76. Meulenberg J. J. M, Petersen-Den Besten A Identification and characterization of a sixth structural protein of Lelystad Virus: the glycoprotein GP2 encoded by ORF2 is incorporated in virus particle. //Virology-1996-Vol. 225-p.44-51.

77. Meulenberg JJM, Petersen-Den Besten A, De Kluyver EP, Moormann RJM, Schaaper WMM, Wensvoort G. Characterization of proteins encoded by ORFs 2 to 7 of Lelystad virus. //Virology-1995-Vol. 206-p.l55-163.

78. Meulenberg, J. J. M., Petersen-den Besten, A., de Kluyver, E. P., Moormann, R. J. M., Schaaper, W. M. M. and Wensvoort, G. Characterization of proteins encoded by ORFs 2 to 7 of Lelystad virus. //Virology- 1995a-Vol.206-p.155-163.

79. Meulenberg, J. J. M., Bos-de Ruijter, J. N. A., Wensvoort, G. and Moormann, R. J. M. Infectious transcripts from cloned genomelength cDNA of porcine reproductive respiratory syndrome virus.// J. Virol.- 1998a-Vol.72-p.380-387.

80. Morozov, I., T.Sirinarumits, S.D. Sorden, P.G.Halbur, M.K.Morgan, K.-J.Yoon, and P.S.Paul. Detection of novel strain of porcine circovirus in pigs with -weaning multisystemic waating syndrome. // J.Cli.Microbiol.- 1998-Vol.36-p.2535-2541

81. Murtaugh M.P, Elam M.R, Kakach L.T Comparison of the structural protein coding sequences of the VR-2332 and Lelystad virus strains of the PRRS virus. //Arch Virol. -1995-Vol.l40-p. 1451-1460.

82. Murtaugh, M.P„ Z.Xiao, and F. Zuckerman.Immunological responses of swine to porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection. // Viral. Immunol.- 2002-Vol.l5-p.533-547.

83. Nawagitgul, P., Morozov, I., Bolin, S.R., Harms, P.A., Sorden, S.D. and Paul, P.S. Open reading frame 2 of porcine cir covirus type 2 encodes a major capsid protein.//J. Gen. Virol.-2000-81:2281-2287.

84. Nayar, G. P. S., H. Andre, and L. Lihua. Detection and characterization of porcine circovirus associated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs. //Can. Vet. J. 1997-Vol.38-p.384-386.

85. Nelsen, E. A., Murtaugh, M. P. and Faaberg, K. S. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus comparison: divergent evolution on two continents. //J. Virol, -1999-Vol.73-No.l-p. 270-280

86. Neumann/ Eric J. Swine Health Fact Sheet/ Circovirus Infection in Swine.//2002.

87. Nielsen, H. S, Oleksiewicz, M. B, Forsberg, R, Stadejek, T, Bother, A. and Storgaard, T. Reversion of a live of porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccine investigated by parallel mutations. // J. Gen. Virol. -2001-Vol.82-p.1263-1272.

88. Olvera A, Sibila M, Calsamiglia M, et al. Application of a newly developed real time per for the quantification of Porcine circovirus type 2 in different excretion routes.// Proc. 4th Int Symp Emerg Re-emerg Dis, Rome. -2003.

89. Paton, D. J, Brown, I. H, Scott, A. C, Done, S. H. and Edwards, S. Isolation of a Lelystad virus-like particles agent from british pigs and scanning electron microscopy of infected macrophages. //Vet. Microbiol. -1992-Vol.33-p.195-201

90. Pirzadeh B, Dea S Monoclonal antibodies to the ORF5 product of porcine reproductive and respiratory syndrome virus define linear neutralizing determinants. //J Gen Virol.- 1997-Vol. 78-p.l 867-1 873

91. Pirzadeh, B. and Dea, S. Immune response in pigs vaccinated with plasmid DNA encoding ORF5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus.// J. Gen. Virol. -1998-Vol.79-p.989-999.

92. Plagemann PGW Lactate dehydrogenase elevating virus and related viruses. //In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM (eds) Field's Virology, 3rd ed. Lippincott-Raven Philadelphia,- 1996-pp 1 105-1 120.

93. Pogranichnyy RM, Yoon KJ, Harms PA, et al. Characterization of immune response of young pigs to porcine circovirus type 2 infection.//Viral Immunol.-2000-Vol. 13-p. 143-153.

94. Porath J, Carlsson J, Olsson I, Belfrage G Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. //Nature -1975-Vol.258-p.598-599.

95. Quintana, J., M. Balasch, J. Segales, M. Calsamiglia, G.M. Rodriguez-Arrioja, J. Plana-Duran, M. Domingo. Experimental inoculation of porcine circovirus type 1 (PCV1) and type 2 (PCV2) in rabbits and mice. //Vet. Res.-2002-Vol.33-p.229-237.

96. Rodriguez-Arrioja GM, Segales J, Balasch M, et al. Serum antibodies to porcine circovirus type 1 (PCV-1) and type 2 (PCV-2) in pigs with and without postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS).//Vet Rec.- 2000-Vol. 146-p. 762-764.

97. Rodriguez-Arrioja GM, Segales J, Calsamiglia M, et al. Dynamics of porcine circovirus type 2 infection in a herd of pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome. // Am. J .Vet .Res.-. 2002-Vol. 63-p. 354-357.

98. Rosell C, Segales J, Plana-Duran J, et al. Pathological, immunohistochemical, and in-situ hybridization studies of natural cases of postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) in pigs.//J Comp Pathol. -1999-Vol. 120-p. 59-78

99. Rossow, K.D., Collins, J.E., Goyal, S.M., Nelson, E.A., ChristopherHennings, J. and Benfield D.A. . Pathogenesis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in gnotobiotic pigs.// Vet. Pathol. -1995-Vol.32-No4-p.361-373.

100. Rottier PJM, Welling GW, Welling-Wester S, Niesters HGM, LenstraJA, Van derZeijst. Predicted membrane topology of the coronavirus protein //El. ProcNatl AcadSciUSA -1986-81: 1421-1425.

101. Rovira A, Balasch M, Segales J, et al. Experimental inoculation of conventional pigs with porcine reproductive and respiratorysyndrome virus and porcine circovirus 2. //J Virol.-2001-Vol.76-p.3232-3239.

102. Royer R.L., P. Nawagitgul, P.G. Halbur and P.S. Paul. Susceptibility of porcine circovirus type 2 to commercial and laboratory disinfectants.// Swine Health Prod .- 2001-Vol.9-p. 281-284.

103. Segales, J., Piella, J., Marco, E., Mateu-de-Antonio, E.M., Espuna, E. and Domingo, M. 1998. Porcine dermatitis and nephropathy syndrome in Spain. Vet. Rec. 142,483-486.

104. Segales J. Update on postweaning multisystemic wasting syndrome and porcine dermatitis and nephropathy syndrome diagnostics. // Swine Health Prod. -2002-Vol. 10-p. 277-281.

105. Segales, J. and M. Domingo. Postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs. A review. //Vet Q.- 2002-Vol.24-p. 109-124.

106. Segsles, J. and Domingo, M. Porcine circovirus type 2 infection: postweaning multisystemic wasting syndrome and other condidions. //Proceedings of the 17th IPVS congress, Ames, Iowa, USA,- 2002-Vol. l-p.35- 42.

107. Shibarara T„ et al., //J.Vet.Med.Sci, -2000-Vol.62-p.l 125.

108. Shibata, I., Uruno, K. and Mori, M. Serological property and replication in cell cultures of porcine reproductive and respiratory syndrome viruses isolated in Japan.//J. Vet. Med. Sci.- 1996-Vol.58-No8-p.805-807.

109. Shnijder and Meulenberg, Snijder, E. J. and Meulenberg J. M. Molecular biology of arteriviruses. // J. Gen. Virol.- 1998-Vol.79-p.961-979.

110. Sierra, M.A., Mulas, de-las J.M., Molenbeek, R.F., Maanen, van C, Vos, J.H., Quezada, M. and Gruys, E. Porcine immune complex glomerulonephritis dermatitis (PIGD) syndrome. // Eur. J. Vet. Path. -1997-3 (2), 63-70..

111. Smith W.J., Thomson J.R., Done S. Dermatitis/nephropathy syndrome of pigs. //Vet. Rec, -1993-Vol.132-p.47.

112. Snijder, E. J. and Meulenberg J. M. (1998) Molecular biology of arteriviruses. J. Gen. Virol. 79:961-979.

113. Sorden SD. Update on porcine circovirus and postweaning multisystemic wasting syndrome. //Swine Health Prod. -2000-Vol.8-p. 133136.

114. Sorensen, K. J., E.S. Madsen, B. Strandbygaard, and J. Nielsen. Evaluation of blocking ELISA for screening of antibodies against porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus.//Vet. Microbiol. -1997-Vol.56-p. 1-8.

115. Steven D. Sorden, D.V.M., SELECTED DISEASES OF SWINEPh is Diseases of Swine, 8th ed. (1999), BE Straw, S D'Allaire, WL Mengeling, DJ Taylor, eds, Iowa State University Press

116. Stevenson G.W., et. al.,// Proc.l6th IPVSCongress, Melbourne, Melbourne,-2000-p.575

117. Stewart, E. J., Aslund, F. & Beckwith, J. Disulfide bond formation in the Escherichia coli cytoplasm: an in vivo role reversal for the thioredoxins. //EMBO J -1998-Vol.l7-p. 5543-5550.

118. Sur, J.-H., Doster, A. R., Galeota, J. A. and Osorio, F. A. Evidence for the localization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) antigen and RNA in ovarian follicles in gilts. //Vet. Pathol.- 2001-Vol.38-p.58-66.

119. Terpsta, C., Wensvoort, G. and Pol, J. M. A. Experimental reproduction of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (mystery swine disease) by infection with Lelystad virus: Koch's postulates fulfilled.// Vet. Q. -1991-Vol.l3-p.131-136.;

120. Tischer, I., H. Gelderblom, W. Vettermann, and M.A. Koch. A very small porcine virus with circular single-stranded DNA. //Nature-1982-Vol.295-p.64-66.

121. Tischer, I., L. Bode, J. Apodaca, H. Timm, D. Peters, R. Rasch, S. Pociuli, and E. Gerike. Presence of antibodies reacting with porcine circovirus in sera of humans, mice, and cattle. //Arch. Virol. -1995-Vol.l40-p.l427-1439.

122. Tischer, I., R. Rasch, and G. Tochtermann. Characterization of papovavirus and picornavirus-like particles in permanent pig kidney cell lines. //Zentralbl. Bakteriol. Hyg. A -1974.-Vol.226-p. 153-167.

123. Tisher, I., D. Peters, R. Rasch, S. Pociuli. Replication of porcine circovirus: induction by glucosamine and cell cycle dependence. //Arch. Virol. -1987-Vol.96-p. 39-57.

124. Todd D., Me Nulty M.S., Mankertz A. e.a. Family Circoviridae. //In: Virus Taxonomy. Sevent report of the ICTV, San Diego, -2000-p.299-303

125. Van der Meer, Y., van Tol, J. G., Krijnse Locker, J. and Snijder, E. J. ORF la-encoded replicase subunits are involved in the membrane association of the arterivirus replication complex. //J. Virol.- 1998-Vol.72-No.8-p.6689- 6698.

126. Van Woensel, P., Van der Wouw, J. and Visser, N. Detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by polymerase chain reaction. // J. Virol; Meth.- 1994-Vol.47-p. 273-278.

127. Waddilove, A.E.J, and E. Marco. Assessing serotherapeutic control of PMWS in the field. //Proceedings of the 17th International Pig Veterinary Society Congress. -2002-Vol.l-p. 34.

128. Wootton, S. K., Nelson, E. A. and Yoo, D. Antigenic structure of the nucleocapsid protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. //Clin. Diagn. Lab. Immunol.- 1998-Vol.5-p.773-779.

129. Zhang Y, Sharma RD, Paul PS Monoclonal antibodies against conformationally dependent epitopes on porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Vet. Microbiol.- 1998-Vol.63-p.l25-136.

130. Zimmerman, J., Swenson, S. L., Wills, R. W., Pirtli, E. C., Yoon, K. J., Hill, H. T. and McGinley, M. J. Transmission of PRRS virus. //In Proceedings of the Allen D Leman swine conference, university of Minnesota, MN, USA,- 1993-p.51-52