Биологические и генетические характеристики цирковирусов свиней

Малоголовкин, Александр Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биологические и генетические характеристики цирковирусов свиней
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Биологические и генетические характеристики цирковирусов свиней"

На правах рукописи

УДК 619:616.98.578:636.4

МАЛОГОЛОВКИН АЛЕКСАНДР СЕРГЕЕВИЧ

БИОЛОГИЧЕСКИЕ И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЦИРКОВИРУСОВ СВИНЕЙ

03.00.06 «Вирусология» 03.00.23 «Биотехнология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук 2 О [, ]ДР 2С23

ПОКРОВ - 2009

003465566

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийско научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринари им. Я.Р. Коваленко (ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии) и Государственном научно учреждении и Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарно вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных нау (ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ)

Научные руководители:

кандидат биологических наук Надточей Григорий Андреевич доктор ветеринарных наук Колбасов Денис Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Селянинов Юрий Олегович

доктор биологических наук, профессор Еремец Владимир Иванович

Ведущая организация: Федеральное Государственное учреждение «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГУ « ВНИИЗЖ») (г. Владимир).

Защита диссертации состоится 16 апреля 2009 г. в 11.30 мин. на заседании диссертационного совета Д 006.003.01 при Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии по адресу: 601120, Владимирская область, г. Покров, ГНУ ВНИИВВиМ. Тел/факс: (49243) 62125.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИВВиМ. Автореферат разослан ч-^/У■> марта 2009 г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние годы в связи с активным развитием свиноводства, большое значение приобретают заболевания, ранее не зарегистрированные на территории Российской Федерации. В ряде регионов страны значимой проблемой в промышленных свинокомплексах стала цирковирусная инфекция свиней (ЦИС). Результаты проведённых эпизоотологических исследований свидетельствуют о широком распространении цирковирусной инфекции свиней не только в зарубежных странах, но и в нашей стране (Орлянкин Б. Г. и др., 2003, 2006; Тимина A.M., 2006; Allan G.M. et al., 2000, 2003; Ellis J. et al., 2007; Krakowka S. et al., 2007; Segales J. et al., 2007; Stadejek T. et al., 2007).

Обнаруженный впервые I. Tisher, N. Rasch и G. Tochterman в 1974 г. цирковирус свиней 1-го типа (ЦВС-1) был охарактеризован как нецитопатогенный контаминант перевиваемой культуры клеток почек поросят РК-15.

Первые сведения о патогенном цирковирусе свиней появились в 1991 г., когда в Канаде было выявлено новое заболевание - синдром мультисистемного истощения отьемышей (СМИО). У поросят 6-14 недельного возраста наблюдали истощение, одышку, диарею, желтушность кожи. Полученные впоследствии данные охарактеризовали новый вирус, как цирковирус свиней 2-го типа (ЦВС-2) (Сатина Т.А, 2003; Allan G.M. et al., 1998; Clark E. et al., 1997; Ellis J. et al., 1998; Gagnon C. et al., 2007).

Изучение роли ЦВС в инфекционной патологии свиней, свидетельствует об участии ЦВС-2 в патогенезе таких заболеваний, как СМИО, дерматит и синдромом нефропатии (ДСНП) (Сатина Т.А., 2003; Allan G. М. et al., 2000; Drolet R. et al., 1997; Elbers A.R., 2000; Kiupel M. et al., 2005). К этому списку также относят конгенитальный (врожденный) тремор, некротизирующие и пролиферативные плевропневмонии, эксудативные эпидермиты и энтериты. Существуют предположения о способности ЦВС-2 вызывать нарушения репродуктивных функций у свиноматок. Возникновению данного комплекса заболеваний способствует развитие смешанных инфекций ЦВС-2 с другими патогенами вирусной и бактериальной природы (Drolet R. et al., 1999; Lainson L.A. et al., 2002;

Grasland В. et al., 2005; Rapp-Gabrielson V. J. et al., 2008; Keith H. West et al., 1999; Meehan B.M. et al., 2006).

Первые сведения о наличии цирковирусов в популяциях свиней на территории Российской Федерации были получены Щербаковым A.B. в 2000 г. В дальнейших исследованиях представлены генетические характеристики изолятов вируса, циркулирующих на территории России, разработаны методы лабораторной диагностики цирковирусной инфекции свиней на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) и иммуноферментного анализа (ИФА) (Тимина A.M. и др., 2005, 2006; Кукушкин С.А. и др., 2006, Шкаева М.А., 2006).

Тем не менее, в отечественной литературе отсутствуют данные о биологических свойствах изолятов цирковируса свиней 2-го типа, циркулирующих в популяциях домашних свиней.

Исследования репродукции вируса в условиях in vitro также являются важным этапом в разработке диагностических систем для индикации цирковирусов свиней.

Остаются не выясненными вопросы клинического проявления болезней, ассоциированных с цирковирусами при смешанной инфекции. Патологические изменения при полиэтиологичном инфекционном процессе, с участием ЦВС, являются чрезвычайно разнообразными, в связи с чем, необходимо их детальное изучение для установления диагностического значения.

Цель работы ч задачи исследования. В связи с вышеизложенным основной целью наших исследований являлось изучение патоморфологических изменений при цирковирусной инфекции свиней, биологических свойств возбудителя и генетического родства изолятов цирковируса 2-го типа, циркулирующих в популяциях свиней на территории Российской Федерации.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

- изучить патологоанатомические и гистологические изменения у поросят при СМИО и ДСНП;

- адаптировать цирковирус свиней 2-го типа для репродукции в перевиваемых клеточных линиях;

- выделить цирковирус свиней 2-го типа из патологического материала от больных животных;

- изучить морфологию вирионов ЦВС-2 методом электронной микроскопии;

- разработать набор препаратов для обнаружения и дифференциации цирковирусов свиней 1-го и 2-го типов на основе полимеразной цепной реакции и её модификаций;

изучить филогенетические взаимоотношения изолятов ЦВС-2, циркулирующих в популяциях свиней на территории РФ.

Научная новизна результатов исследований.

Показано, что патоморфологические изменения у поросят при СМИО и ДСНП характеризуются продуктивными воспалениями кровеносных сосудов мелкого и среднего диаметра во всех системах органов. Гистологические изменения в органах лимфоидной системы проявляются исчезновением зоны лимфатических фолликулов и замещением её ретикулярной основой.

Установлена способность ЦВС-2 к репродукции в перевиваемой культуре клеток А4С2 с развитием клеточных альтераций.

Разработан набор препаратов для обнаружения цирковируса свиней 2-го типа с применением полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ТацМап).

Установлено филогенетическое родство изолятов ЦВС-1, выделенных из перевиваемых культур клеток РК-15, ЭК-6, ПСГК, ПСГК-60, а также изолятов цирковируса свиней 2-го типа, выявленных от поросят с синдромом мультисистемного истощения отьемышей и дерматитом с синдромом нефропатии на территории Российской Федерации.

Практическая значимость работы.

Представленные данные патологоанатомических и гистологических изменений при синдроме мультисистемного истощения отьемышей и дерматите с синдромом нефропатии важны для дифференциальной диагностики инфекционных заболеваний свиней.

Разработанные методы выявления генома цирковирусов свиней на основе ПЦР и ПЦР в режиме реального времени применяются в ГНУ ВИЭВ и ГНУ ВНИИВВиМ при диагностике цирковирусной инфекции свиней.

Публикации результатов исследований. По теме диссертационной работь опубликовано 6 научных статей, в том числе 2 статьи в журналах рекомендованных ВАК РФ.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» ВНИТИБП (г. Щёлково, 20-21 декабря 2007 г.), на международном семинаре «Porcine circovirus diseases: towards improved food quality & safety within new member states & associated candidate countries.Workshop №3» (Budapest, Hungary, le^O111 May 2008), на международной конференции « Laboratory diagnostics today and its future challenges. Dedicated to the 90th anniversary of the Food and veterinary Service of Latvia (Riga 2829 August 2008), заседаниях ученого совета ГНУ ВИЭВ и ГНУ ВНИИВВиМ в 20062008 гг.

Основные положения диссертационной работы, выдвигаемые на защиту:

1. Патоморфологические изменения у поросят с СМИО и ДСНП;

2.0собенности репродукции ЦВС-2 в перевиваемых клеточных культурах;

3. Морфологические характеристики цирковируса свиней 2-го типа;

4. Метод выявления ДНК ЦВС-2 с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени;

5. Филогенетическое родство изолятов ЦВС-1, выделенных из перевиваемых культур клеток, и изолятов цирковируса свиней 2-го типа, циркулирующих в популяциях свиней на территории Российской Федерации.

Структура и объем диссертационной работы. Диссертация изложена на 131 странице и содержит следующие главы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и обсуждение, заключение, выводы, практические предложения и приложения. Работа иллюстрирована 29 рисунками, 8 таблицами. Список литературы включает 161 источник, в том числе 145 иностранных.

Личный вклад. Основная часть работы выполнена автором самостоятельно, личный вклад составляет не менее 70%. При разработке наборов для выявления и дифференциации цирковирусов свиней 1-го и 2-го типа с использованием ПЦР и

ПЦР в режиме реального времени, оказывали консультативную и методическую помощь сотрудники лаборатории Биофизики ГНУ ВНИИВВиМ; при патоморфологических исследованиях - сотрудники сектора патоморфологии ГНУ ВИЭВ (г.Москва).

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы

Вирусы н бактерии. В качестве референс-штамма использовали ЦВС-2 Stoon 1010 р.34, любезно предоставленный Dr. Т. Stadejek и Dr. К. Podgorska (National Veterinary Institute, Pulawy, Poland).

В работе также использовали вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС), вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ВТГЭС) (штамм ТМ), ротавирус свиней, энтеровирус вирус свиней штаммы Al (тип 10) и VI3 (тип 9), вирус классической чумы свиней (КЧС) (штамм ЛК-ВНИИВВиМ), вирус болезни Тешена (штамм Закарпатский), вирус болезни Ауески, ДНК вируса африканской чумы свиней (АЧС), М. hyopneumoniae, Pasteurella multocida.

Клеточные культуры. В работе использованы клеточные линии, представленные в коллекции клеточных культур сельскохозяйственных животных РАСХН (ГНУ ВИЭВ) и рабочей коллекции культур клеток ГНУ ВНИИВВиМ: перевиваемая линия клеток почки свиньи (РК-15 (Португалия)), 19 клональных сублиний РК-15, перевиваемая линия клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ), перевиваемая линия клеток почки африканской зеленой мартышки (CV-1), перевиваемая линия клеток почки свиньи (SK-6), перевиваемая линия клеток почки африканской зеленой мартышки (Vero), перевиваемая линия клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК, ПСГК-60), гибридная внутривидовая перевиваемая клеточная линия СПЭВ и спленоциты свиньи (А4С2), первичная культура клеток тестикул поросенка (ПТП).

Патологический материал. Материалом для выполнения исследований являлись сыворотки, органы и ткани от свиней из 11 хозяйств РФ, Вологодской, Тульской, Белгородской, Владимирской, Ростовской, Ярославской, Тамбовской, Нижегородской, Волгоградской областей и Республики Северная Осетия.

2.2. Методы

Гистологические исследования.

Изучение микроскопических изменений органов и тканей порос выполняли по стандартной методике с предварительной фиксацией органов в 10 формалине с последующей заливкой в целлоидин («Методические указания п патогистологической технике», Москва, 2005). В ходе работы использовал стандартный метод окраски гематоксилин-эозином, а также сложные окраски: н соединительную ткань по Ван-Гизону и Маллори.

Выделение и культивирование цирковируса свиней 2-го типа.

Заражение клеточных культур проводили путем внесения вируссодержащег материала на частично сформировавшийся монослой или в суспензию, использованием питательной среды Игла-МЕМ, содержащей 5% фетально! сыворотки КРС, 2мМ глютамина. Культивирование проводили при 37°С в течени 5-7 суток.

Концентрнрование и очистка вируссодержащего материала.

Концентрирование вируса из гомогенатов тканей больных животных проводили методом дифференциального центрифугирования с использованием 7% полиэтиленгликоля (ПЭГ) - 6000 и 1,15 M раствора натрия хлорида.

Очистку вируса осуществляли в градиенте плотности сахарозы и хлористого цезия (1,32 - 1,41 г/см3) с применением ультрацентрифуги Beckman L7/55 (Beckman Coultier, США).

Имунноферментный анализ. Обнаружение антител (Ат) к ЦВС-2 и ВРРСС проводили с использованием коммерческих наборов «Цирко-серотест» и «РРСС-серотест» производства НПО «Нарвак» (г. Москва) согласно инструкции фирмы-производителя. Учет результатов реакции проводили на планшетном фотометре Multyscan 340 «Labsystems» при длине волны 405 нм.

Выделение ДНК. Выделение тотальной ДНК из патологических материалов и культур клеток проводили по модифицированной методике Boom et al. (1989), с использованием гуанидинового буфера с фенол-хлороформенной экстракцией, а также коммерческого набора «Рибо-преп» (Интерлабсервис, г. Москва).

Полимеразная цепная реакция. Постановку ПЦР осуществляли в реакционной смеси объемом 25 мкл стандартного состава с добавлением 3 мМ

MgCl2+ и 5 мкл раствора вирусной ДНК. Амплификацию проводили на ДНК-амплификаторах «Терцик МС-2» (ДНК-Технология, Россия) или «IQ-5» (Biorad, США). Программа ПЦР для идентификации ЦВС включала следующие этапы: 94°С - 2 мин.; 30 циклов 94°С - 15 сек., 62°С - 35 сек.; и 72°С - 2 мин. При необходимости проводили второй раунд ПЦР с внутренними праймерами при аналогичных условиях. Учет результатов проводили при помощи электрофореза в 1,5 % агарозном геле с добавлением бромистого этидия при стандартных условиях.

ПЦР в реальном времени (TaqMan) проводили на ДНК амплификаторе «IQ-5» (Biorad, США) с использованием готовых компонентов реакции для ПЦР в реальном времени произодства ЗАО «Синтол» (г. Москва) с добавлением 6 пкМ специфических праймеров и ЗпкМ флуоресцентного зонда.

Нуклеотндное секвенирование проводили с использованием набора «BigDye v. 3.1. Terminator» (Applied Biosystems, США) при помощи генетического анализатора ABI PRISM 3130 XL. Для анализа установленных нуклеотидных последовательностей и построения филогенетических дендрограмм применяли приложение «Mega 3.1».

Электронно-микроскопические исследования. Для проведения электронно-микроскопических исследований использовали модифицированный метод негативного контрастирования по S. Brenner и R.W. Horn (1959 г.).

Программное обеспечение. Для подбора специфических праймеров и зондов использовали пакет прикладных программ «Oligo 6.0» и «Visual Cloning v.l.0». Анализ и множественное выравнивание полноразмерных геномов ЦВС-1 и ЦВС-2 проводили по методу Clustaw X программы «BioEdit». Анализ вторичных структур нуклеотидных последовательностей праймеров и зондов осуществляли при помощи сетевой утилиты «MFold» (http://eu.idtdna.com).

Статистическая обработка данных. Определение среднего арифметического значения (т) размеров вирусных частиц, среднего квадратического (стандартного) отклонения, ошибки средней арифметической и абсолютной вероятной погрешности проводили при помощи программ Microsoft Office Excel 2007.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Выявление серопозитивных к ЦВС-2 животных

Впервые обнаруженный на территории России в 2000 г. цирковирус свиней 2-го типа на сегодняшний день выявлен во многих свиноводческих хозяйствах различных регионов страны. Однако, согласно данным литературы, ЦВС-2 обнаруживается также и у здоровых животных, без видимых клинических признаков (Сатина Т.А., 2003; Тимина А.М., 2006; Pérez-Martín Е. et al., 2007; Opreissing T.et al., 2007, Segales J. et al., 2007).

В своих исследованиях для выявления неблагополучных по ЦВС-2 хозяйств мы применяли метод ИФА. В работе использовали сыворотки крови животных различных возрастных групп и пород. Всего в ходе работы было исследовано 232 проб сывороток из 6 свиноводческих хозяйств Владимирской, Белгородской, Тульской, Тамбовской, Вологодской, Нижегородской областей. Результаты исследований представлены в табл. №1.

Таблица №1

Результаты серологических исследований на наличие Ат к ЦВС-2 и ВРРСС

Группы животных Количество исследованных животных Ат к ЦВС-2 (%) Ат к ВРРСС (%) Ат к ЦВС-2/ ВРРСС

Поросята-сосуны 39 5,1 7,7 10,3

Поросята-отьемыши 91 11 1 17,6 53,8

Подсвинки 57 10,5 12,3 42,1

Свиноматки 45 4,4 6,6 24,4

Наибольшее количество серопозитивных к ЦВС-2 животных было обнаружено в группе отъемного возраста и в период откорма. Наряду с этим отмечали высокий процент животных имеющих Ат как к ВРРСС и так и к ЦВС-2 в группах отъема (53,8%), откорма (42,1%) и у свиноматок (24,4%), что свидетельствует о наличии смешанной инфекции в данных хозяйствах.

3.2. Патоморфологические изменения у поросят при цирковирусной инфекции

По мнению зарубежных исследователей существует 3 основных критерия, на основании которых можно поставить диагноз на ЦИС: наличие цирковируса свиней 2-го типа в органах и тканях больного животного, клиническая картина заболевания и характерные изменения в лимфоидных органах (Allan G.M., 2008; Krakowka S. et al., 2007, Ellis J. et al„ 2007).

В связи с этим изучение патоморфологических изменений у поросят, как наиболее восприимчивой к инфекции возрастной группе, являлось немаловажным аспектом исследований патогенеза данного заболевания.

С этой целью, в свиноводческом хозяйстве Тульской области были отобраны животные в группе отъёма (35-50 дней), с характерными для СМИО и ДСНП поражениями. У поросят наблюдали отставание в росте, отдышку, отказ от корма, вялость, конъюнктивиты, субфебрильную лихорадку, появление множественных петехий на коже животного. Геморрагические поражения кожи могли сливаться и формировать разлитые пятна различной формы и размера.

3.2.1. При патологоанотомическом обследовании вынужденно убитых животных отмечали множественные поражения в различных системах органов.

При вскрытии животных в легких обнаруживали ателектазные участки верхушечных долей. Бронхиальные лимфатические узлы увеличены. Рыхлая соединительная ткань средостения отечна.

Печень у всех животных несколько увеличена, светлее обычной, дряблая на ощупь. Желчный пузырь у всех обследованных животных наполнен густой, темно-зеленого цвета желчью. Портальные лимфатические узлы бугристые, гиперплазированные, кровенаполненные и имели жёлто-красный цвет. В ряде случаев присутствовало значительное увеличение стенки лимфатических сосудов.

Почки у больных животных отёчные, с точечными кровоизлияниями. На поверхности органа присутствовали многочисленные узелки белого цвета, слегка выступающие над поверхностью. На разрезе почечной лоханки обнаруживали разрастание соединительной ткани.

Селезенка кровенаполнена, увеличена в размерах. На разрезе фолликулы почти не различимы. Стенки желудка и отдельных петель кишечника утолщены за

счет отека соединительной ткани. Кровоизлияний на слизистой оболочке в облает пилоруса и илеоцекального клапана не отмечали.

Таким образом, обнаруженные макроскопические изменения в различны органах свидетельствуют о мультисистемном характере заболевания. Данны поражения могли быть вызваны ассоциацией ЦВС-2 с другими инфекционным агентами или воздействием различных стресс-факторов, являющихся пусковым механизмами в развитии инфекции.

3.2.2. Микроскопические изменения

Основными гистопатологическими изменениями в тканях являлис системные продуктивные воспаления кровеносных сосудов мелкого и среднег диаметра.

Изменения были обнаружены в почках, печени, сердце, кишечнике, легких, лимфатических узлах, коже, селезенке.

В почках отмечали очаговые и диффузные гломерулонефриты с лимфогисгиоцитарной инфильтрацией в периваскулярном пространстве. В ряде случаев наблюдали атрофию почечных канальцев.

В печени у всех убитых животных наблюдали сходные изменения. Структура органа была нарушена. Увеличение межклеточного пространства сопровождалось инфильтрацией лимфоидными клетками, печеночные балки были деструктурированы.

В селезенке выявляли очаги некрозов и тромботические васкулиты. Также отмечали обеднение лимфоидной ткани и обнажение ретикулярной стромы.

Многочисленные изменения были отмечены в лимфатических органах. В лимфатических узлах изменения характеризовались: исчезновением лимфатических фолликулов в корковом слое, гистиоцитарной инфильтрацией с синцитиальными клетками, потерей фолликулов В-лимфоцитов и расширением зоны Т-лимфоцитов. Лимфоциты содержали интрацитоплазматические базофильные включения различного размера. Среди лимфоцитов обнаруживали большое число клеток, находящихся в фазе активного деления. Лимфоидные клетки характеризовались ярко выраженным несегментированным ядром.

Выявленные патоморфологические изменения у поросят при цирковирусной инфекции свиней свидетельствуют о поражении многих систем и органов

животных. Наиболее значимые изменения отмечаются в органах лимфоидной системы, связанные с прогрессирующей лимфаденопатией и, как следствие, возникновением структурных и функциональных нарушений в работе других органов. Представленные патоморфологические изменения у животных, инфицированных цирковирусом свиней 2-го типа, не дают нам оснований позиционировать данный вирус в качестве единственного инфекционного агента, ответственного за возникновение данной патологии.

3.3. Разработка полимеразной цепной реакции для выявления цирковируеов свиней

Появление новых геногрупп ЦВС-2 (ЦВС-2а и ЦВС-26) способствовало разработке ПЦР, способной выявлять широкий спектр изолятов как ЦВС-2 так и ЦВС-1. Основным критерием являлось то, что бы разработанный метод ПЦР не уступал в чувствительности и специфичности уже существующим наборам.

Анализ нуклеотидных полноразмерных геномов и участков различных генов ЦВС-1 и ЦВС-2, взятых из базы данных GenBank (NCBI) последовательностей, проводили с применением пакета прикладных программ «BioEdit 6.0». Исходя из нуклеотидного состава геномов ЦВС-1 и ЦВС-2 нами были выбраны участки Сар-гена, наиболее консервативные среди известных изолятов. На консервативные участки были рассчитаны типоспецифические праймеры для ЦВС-1 и ЦВС-2 с использованием программ «Oligo 6.0» и «Visual Cloning 3.0».

Исходя из диагностической ценности эксперимента для обнаружения ДНК ЦВС-1, был выбран «стандартный» вариант ПЦР. Для постановки ПЦР с целью выявления ЦВС-1 были взяты праймеры CV-74 и CV-35, фланкирующие участок в 282 пары нуклеотидов (п.н.).

Для выявления генома ЦВС-2 использовали «гнездовой» вариант ПЦР с наружной парой праймеров CV-10 и CV-42 и внутренними праймерами CV-62 и CV-30, комплементарными участку Сар-гена и амплифицирующими продукты в 349 п.н. и 158 п.н. соответственно. Рассчитанные типоспецифичные праймеры для выявления ДНК ЦВС имели высокую температуру отжига 60-62°С, это позволило объединить два этапа реакции (отжиг и элонгацию), в один. В результате удалось значительно снизить время постановки реакции, что не повлияло на её

специфичность и чувствительность. Постановку ПЦР проводили в реакционной смеси стандартного состава с использованием 10 пкМ каждого праймера, 5 мкг раствора ДНК с добавлением 3 мМ

На рис. 2 показаны результаты исследований инфицированных и интактньк культур клеток и патологического материала методом ПЦР для выявления ДНк!

цирковирусов свиней.

А) Б)

Рис. 2. Результаты исследований инфицированных и интактных культур клеток и патологического материала на наличие генома цирковирусов свиней 1-го и 2-го типа. А) «стандартный» вариант для ЦВС-1 и «гнездовой» вариант для ЦВС-2; Б) «стандартный»вариант ПЦР для ЦВС 2-го типа.

А) Треки 1,4,6 - культуры клеток Vero (1), CV-1 (4), А4С2(6); Треки 7,14 -отрицательные контроли реакции; Трек 9- маркер молекулярной массы; Треки 2,3,5 - культуры клеток РК-15 (2), SK-6 (3), ПСГК (5); Треки 10,11,12- пробы органов и тканей от поросят с признаками СМИО и ДСНП; Трек 13 - пул органов от здорового животного; Трек 8, 15 - положительные контроли реакции. Б) Треки 1, 4, 5, - пробы органов и тканей от поросят с признаками СМИО и ДСНП; Треки 10,11 - инфицированные ЦВС-2 культуры клеток А4С2 (10) и РК-15 клон А9 (11); Треки 2,3,7,8,9 - пробы органов и тканей от серонегативных поросят (2,3) и свиноматок (7,8,9); Трек 6 - положительный контроль реакции; Трек 12 - маркер молекулярной массы; Трек 13 - отрицательный контроль реакции.

Предложенная методика выявления ЦВС-1 и ЦВС-2 позволяет обнаруживать и дифференцировать цирковирусы свиней обоих типов как в пробах патологического материала, так и в инфицированных клеточных линиях. Методика работы включена в «Методические рекомендации по выявлению и дифференциации ЦВС-1 и ЦВС-2 методом полимеразной цепной реакции», утвержденные директором ГНУ ВИЭВ 6 августа 2008 г.

3.4. Обнаружение ЦВС-2 в свиноводческих хозяйствах РФ с использованием метода полимеразной цепной реакции

Эпизоотологические данные, полученные рядом зарубежных авторов, свидетельствуют об убиквитарном распространении цирковирусов (Ellis J. et al., 2007; Segales J. et al., 2007; Grasland В. et al, 2005).

С целью выяснения этиологической роли цирковирусов в инфекционной патологии свиней было исследовано более 400 проб патологического материала из хозяйств: Владимирской, Белгородской, Тульской, Тамбовской, Волгоградской, Ростовской, Нижегородской, Ярославской областей, Вологодской области и республики Северная Осетия.

Материалом для исследований служили пробы органов и тканей от животных разных возрастных групп, как с признаками инфекционной патологии, так и клинически здоровых животных.

Проведенный анализ проб показал наличие ДНК цирковируса свиней 2-го типа у животных разного возраста. Наибольший процент животных, положительных по ЦВС-2, выявлен в группах поросят-отьёмышей и поросят на доращивании, что составляло 52% и 48,4% соответственно (рис. 1).

Рис 1. Результаты обнаружения генома ЦВС-2 в пробах патологического материала от свиней разных возрастных групп.

Результаты исследований свидетельствуют о возможности заражения животных именно на стадиях отьема и доращивания, вследствие проводимой в хозяйствах перегруппировки животных при переводе животных из одной возрастной группы в другую. Полученные данные также показывают достаточно высокий процент инфицированных ЦВС-2 животных среди свиноматок - 39,3 %.

Наличие ЦВС-2 у свиноматок в хозяйствах РФ. как правило, связано с особенностями формирования взрослого поголовья из ремонтных свинок

собственного резерва, которые могут быть инфицированы ЦВС-2. Однако, не следует исключать влияние на распространение заболевания импортируемых в хозяйства животных, являющихся в свою очередь возможными источниками инфекции.

3.5. Обнаружение цирковирусов в клеточных культурах методом ПЦР

Использование клеточных культур, инфицированных цирковирусами, может представлять потенциальную опасность при производстве биопрепаратов, а также может приводить к появлению трудно интерпретируемых результатов при постановке диагностических реакций.

Исходя из вышеизложенного, используемые в ГНУ ВНИИВВиМ и ГНУ ВИЭВ культуры клеток были исследованы на наличие цирковирусов свиней обоих типов.

Для проведения исследований нами были взяты 9 клеточных культур: РК-15, ПСГК, ПСГК-60, Vero, CV-1, SK-6, ПТП (ГНУ ВНИИВВиМ) и СПЭВ, А4С2 (ГНУ ВИЭВ). Анализ проводили постановкой «стандартной» ПЦР с типоспецифическими праймерами.

В результате проведенной работы нами было установлено, что перевиваемые культуры клеток РК-15, SK-6, ПСГК и ПСГК-60 контаминированы цирковирусом свиней 1-го типа. В клеточных линиях А4С2, CV-1, Vero, ПТП и СПЭВ геном цирковирусов свиней обнаружен не был.

3.6. Селекция субпопуляций клеток из перевиваемой клеточной линии РК-15 на наличие генома ЦВС-1

Согласно данным литературы, существуют противоречивые результаты экспериментов относительно пермиссивности клеточной линии РК-15 к цирковирусам свиней (Todd D., 1991; Tisher I., 1987; Allan G.M., 1994.) На основании этих работ, нами была предпринята попытка получения субпопуляций клеточной линии РК-15, свободных от контаминации ЦВС-1.

Для выполнения данной работы нами были отобраны 15 клональных сублиний РК-15. Клеточные клоны получали методом предельных разведений по Puck (1956). Отобранные клоны клеток отличались друг от друга по морфологическим, ростовым показателям и являлись генетически однородными популяциями.

Исследования клеточных субкультур на наличие генома ЦВС-1 проводили постановкой «стандартной» ПЦР с типоспецифическими праймерами на разных уровнях пассажа клеток.

В результате проведенных исследований установили, что 10 из 15 клонов содержали ДНК ЦВС 1-го типа. В ходе дальнейших исследований удалось выяснить, что с увеличением уровня пассажей число «чистых» сублиний (неинфицированных ЦВС-1) сокращается. Данные результаты были получены, начиная с 5 пассажа. Так, на момент окончания исследований лишь клон клеток А9, прошедший 24 последовательных пассажа, оставался неконтаминированным.

Данные результаты можно связывать с пределом уровня чувствительности ПЦР, в связи с низким титром накопления вируса в клеточной системе в пределах 2,5 - 3 lg ТЦД50/см3. Тем не менее, вопрос о получении культуры клеток РК-15, свободных от цирковирусов, остается открытым. Существуют предположения о возможности использования препаратов, содержащих интерферон а, для ингибирования репродукции вируса. Однако, на сегодняшний день для дифференциального изучения цирковирусов является более предпочтительным использование исходной культуры клеток РК-15, не содержащей цирковирусы.

3.6. Выделение ЦВС-2 с использованием клеточных культур

Подбор клеточных линий для культивирования ЦВС-2 в условиях in vitro проводили, основываясь на чувствительности культур клеток к данному вирусу, а также учитывая тропизм цирковируса к лимфоидному типу клеток.

Для размножения ЦВС-2 отобрали клеточные культуры, свободные от контаминации цирковирусом свиней 1-го типа: CV-1, Vero, РК-15 (клон А9), А4С2.

Культивирование культур клеток CV-1, Vero, А4С2 осуществляли при 37°С с добавлением 2-5% фетальной сыворотки КРС и 2 мМ глютамина. Заражение ЦВС-2 и культивирование клеточной линии РК-15 проводили по методу Tisher I. в модификации P.L. Lagan (2007).

Обнаружение ЦВС-2 в инфицированных культурах клеток проводили методом «гнездовой» ПЦР.

Размножение вируса в культуре клеток А4С2 вызывало образование деструктивных изменениях в клетках, при отсутствии таковых в контроле

культуры. Изучение действия вируса на перевиваемую клеточную линию А4С проводили в динамике (24, 72 и 96 часов). После проведения 4-х последовательны пассажей, в клеточной культуре наблюдали постепенное развитие альтераций клетках. Первые изменения в культуре клеток обнаруживали на 2 сутки поел заражения. В перинуклеарном пространстве клеток отмечалась зернистост цитоплазмы.

Подготовку вируссодержащего материала для заражения культур клеток, также концентрирование и очистку вируссодержащих суспензий проводили ш схеме, которая включала в себя этапы подготовки патматериала для заражения культивирование инфицированных культур клеток, замораживание/оттаивани вируссодержащих суспензий, с последующей обработкой ультразвуком липидорастворителями, детергентами, низкоскоростным центрифугированием i ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы и хлористого цезия.

По результатам проведенных исследований в культурах клеток CV-1 и Vero изолировать ЦВС-2 не удалось. В культурах А4С2 и РК-15(А9) обнаруживали ДНК ЦВС-2 методом «гнездовой» ПЦР на уровне 12 пассажа, что свидетельствовало о размножении вируса в данных клеточных линиях. Вопросы же пермиссивности культур CV-1 и Vero для ЦВС-2 требуют дальнейшего изучения.

3.7. Электронно-микроскопические исследования цирковируса свиней 2-го типа

Очищенный препарат ЦВС-2 использовался для дальнейшего изучения методами электронной микроскопии.

Методами негативного контрастирования были исследованы концентрированные и очищенные препараты вируса, полученные из инфицированных клеточных культур, а также суспензий органов от больных животных.

На негативноконтрастированных препаратах вирусной суспензии, полученной при заражении клеточных линий А4С2 и РК-15(А9) ЦВС-2, выявлен мелкий сферический вирус, расположенный дисперсно и в виде небольших агрегатов. Морфологически вирионы характеризуются единой структурой и формой. Шестиугольный профиль капсомерного слоя свидетельствует об

икосаэдрическом типе симметрии. Суперкапсидная оболочка у всех вирионов отсутствует. Среднее значение диаметра, вычисленное на основании промеров вирусных частиц, составило 20,13±0,08 нм (рис. 3).

Рис. 3. Электронная микроскопия ЦВС-2, выделенного из культуры клеток А4С2. Негативное контрастирование ФВК 2%, рН 6,8.

На основании электронномикроскопических исследований, а также результатов ПЦР обнаруженный вирус относится к роду Снопчгш, тип 2.

Выявление зрелых вирусных частиц на негативноконтрастированных препаратах инфицированной ЦВС-2 культуры клеток А4С2, свидетельствует о пермиссивности клеточной линии к данному вирусу и возможности её дальнейшего использования в вирусологических исследованиях. Наличие вирионов ЦВС-2 в культуре клеток РК-15 также было доказано методом негативного контрастирования.

При изучении очищенных препаратов из гомогенатов тканей больных животных были обнаружены вирусные частицы, аналогичные вирионам, присутствующим в инфицированных ЦВС-2 культурах клеток.

Таким образом, полученные данные подтверждают сведения о циркуляции ЦВС-2 в популяциях свиней на территории Российской Федерации.

3.8. Разработка набора препаратов для обнаружения ДНК ЦВС-2 методом ПЦР в режиме реального времени (метод TaqMan)

Для разработки ПЦР в реальном времени нами была выбрана технология гибридизационных зондов ТадМап, контролирующая кинетику ПЦР непосредственно в ходе амплификации с использованием резонансного тушения флуоресценции. Для детекции использовали зонд, несущий флуорофор и тушитель, комплементарный части амплифицируемого типоспецифическими праймерами

фрагмента. Для расчета праймеров и зонда был выбран участок ОРС-2, кодирующий главный структурный белок ЦВС-2. Подбор олигонуклеотидов проводили в сравнении с известными нуклеотидными последовательностями ОРС-2, представленными в базе данных ОепВапк, при помощи пакета прикладных программ «ОП§о 6.0». Праймеры и зонды, удовлетворяющие условиям для проведения ПЦР в реальном времени, были использованы в дальнейшей работе.

Отобранные нами праймеры имели довольно высокую температуру отжига (Та=61-62°С), что позволило исключить этап элонгации из температурных циклов амплификации и уменьшить общее время постановки реакции до 80 минут.

Эмпирическим путем были отработаны температурные и временные условия проведения реакции. Оптимальным протоколом для выявления ДНК ЦВС-2 методом ПЦР в режиме реального времени оказались: 94°С - 3 мин,-1 цикл;

Постановку реакции осуществляли в смеси стандартного состава для ПЦР с использованием 6 пкМ праймеров, 3 пкМ флуоресцентного зонда, 3 мМ и

добавлением 5 мкл ДНК-матрицы. Оценку специфичности разработанного метода проводили с использованием гетерологичных препаратов, содержащих вирусные и бактериальные патогены, наиболее часто диагностируемые у свиней: ВРРСС, ВТГЭС (штамм ТМ), ротавирус свиней, энтеровирус вирус свиней штаммы А-1 (тип 10) и штамм У-13 (тип 9), вирус КЧС (штамм ЛК-ВНИИВВиМ), ДНК вируса АЧС, вирус болезни Тешена (штамм Закарпатский), вирус болезни Ауески, цирковирус свиней 1-го типа (культура клеток РК-15), М. Ьуорпешпошае, Ра51сиге11а ти^осМа.

В результате проведенных исследований в пробах, содержащих перечисленные инфекционные агенты, при постановке ПЦР в реальном времени образование кривых флуоресценции не наблюдали.

Возможность применения метода в диагностических целях оценивали постановкой ПЦР в формате реального времени с пробами различных органов и

10 циклов

детекция

тканей от поросят с признаками СМИО и ДСНП (печень, почки, селезенка, легкие, лимфатические узлы, миндалины, участки тонкого и толстого отдела кишечника, брыжейка, сердце, кровь, сыворотка) и инфицированных клеточных культур. Результаты исследований показали наличие ДНК ЦВС-2 во всех анализируемых образцах.

Таким образом, разработанный набор препаратов позволил идентифицировать цирковирус свиней 2-го типа в различных пробах патологического материала и клеточных культурах. На основе разработанного метода предложен набор для выявления ДНК ЦВС-2 методом ПЦР в режиме реального времени. Результаты комиссионных испытаний показали, что компоненты набора обладали выраженной специфичностью, высокой чувствительностью и воспроизводимостью результатов. Составлены «Методические рекомендации по применению набора препаратов для выявления ДНК ЦВС-2 методом ПЦР в режиме реального времени», которые одобрены на секции «Ветеринарной биотехнологии» и утверждены академиком-секретарем РАСХН 26 октября 2008 г.

3.8. Иуклеогидное секвеннрование ДНК цирковирусов свиней 1-го и 2-го

типов

Определение генетического разнообразия полевых изолятов ЦВС-2, выявленных в свиноводческих хозяйствах Российской Федерации, а также выяснение филогенетических различий генома ЦВС-1, обнаруженных в различных перевиваемых клеточных культурах, являлось одной из задач наших исследовании.

Для проведения нуклеотидного секвенирования использовали специфические праймеры, рассчитанные на участок Cap-генов ДНК ЦВС-1 и ЦВС-2, используемые в данной работе.

Филогенетических анализ и построение дендрограмм, характеризующих степень гомологии исследованных участков генома, проводили с использованием программы «Mega version 3.1».

Согласно проведенным исследованиям ЦВС-1 был обнаружен в интактных перевиваемых культурах клеток РК-15, SK-6, ПСГК и ПСГК-60. При проведении сравнительного анализа все выявленные последовательности ЦВС-1 образовывали один общий кластер. Тем не менее данная группа не являлась строго обособленной

от других известных штаммов и изолятов вируса, т.к. нами не было отмечено большого уровня дивергенций в составе данного участка гена (рис.4). Филогенетические взаимоотношения изолятов цирковируса свиней 2-го типа представлены на рис.5. Из дендрограммы видно, что геном ЦВС-2 является достаточно вариабельным и образует несколько генетических групп (кластеров). Выявленные в ходе исследований, изоляты цирковируса свиней 2-го типа относились к нескольким кластерам. Однако, генетическое разнообразие ЦВС-2 не опосредовано географическим ареалом распространения вируса.

-PCV-1 (China) from eerxim SC-8

О.DOS О DOS О.ООД 0.002 О.ООО

Рис. 4. Дендрограмма, отражающая генетическое родство ЦВС-l, выделенных из клеточных культур.

Так, изоляты, выделенные из разных регионов страны, проявляли достаточно высокий процент гомологии (Осетия, Ярославль, Владимир, Волгоград, Вологда, Тамбов, Тула), то время как изоляты из близлежащих районов отличались большим генетическим разнообразием (Ростов- Волгоград, Нижний Новгород -Владимир).

Филогенетическое родство полевых изолятов ЦВС-2, циркулирующих н территории Российской Федерации, с изолятами, выделенными от свиней зарубежных государствах, скорее всего связано с активным импортом племенны животных в свиноводческие хозяйства нашей страны.

Проведенный филогенетический анализ ЦВС-1, выделенного из различных клеточных систем, показал большое сходство среди выявленных изолятов. Цирковирусы свиней 1-го типа, обнаруженные в культурах клеток, формировали один генетический кластер и проявляли выраженное сходство с изолятами ЦВС-1 из культуры клеток РК-15.

Vologda Tambov Tula PC\/-2 (Croatia) PCV-2 (Chlna-3) PCV-2 (Chlna-1) PCV-2 (Taiwan-1) PCV-2 (Japan) PCV-2 (Taiwan) PCV-2 (China) PCV-2 (Spain) PCV-2 Belfast PCV-2 (Belfast)

1-1)

PCV-2 (Japan-1 )

PCV-2 (Taiwan-3)

PCV-2 (Germany-1 )

PCV-2 (Australia)

PCV-2 (France-2)

PCV-2 (Australia-1 )

PCV-2 (Canada) ceel culture

PCV-2 (Canada- Saskatchewan)

PCV-2 (France)

PCV-2 (Canada) pig

PCV-2 S to on 1010

PCV-2 (Germany)

PCV-2 (USA)

Рис. 5. Дендрограмма нуклеотидных последовательностей участка Сар-гена ЦВС-2, выделенных от домашних свиней.

Нуклеотидное секвенирование ЦВС-2 выявило большое генетическое разнообразие полевых изолятов вируса. Результаты также показали отсутствие взаимосвязи между географическим происхождением изолята и генетическими кластерами.

Применение комплексного подхода в диагностики ЦИС с использованием культур клеток, электронной микроскопии, ПЦР, ИФА и гистологических исследований позволило установить возможность репродукции ЦВС в перевиваемых клеточных культурах и особенности проявления СМИО и ДСНП.

4. ВЫВОДЫ

1. Основными патоморфологическими изменениями у поросят пр синдроме мультисистемного истощения огьемышей и дерматите с синдромо нефропатии являются поражения респираторного тракта, характеризующиес некротическими и интерстициальными пневмониями и изменениями лимфатических узлах, проявляющимися гиперплазиями различной степени нарушением структуры органа. Микроскопические изменения в тканях npi цирковирусной инфекции свиней характеризуются периваскулярным1 инфильтрациями незрелыми клетками лимфоидного типа. В лимфоидных органа, отмечаются дегенеративные изменения.

2. Образцы интактных культур клеток линий РК-15 (Португалия), SK-6 ПСГК, ПСГК-60, (ГНУ ВНИИВВиМ) являются инфицированными цирковирусо\ свиней 1-го типа, в то время как культуры клеток Vero, CV-1, ПТП (ГШ ВНИИВВиМ), А4С2, СПЭВ (ГНУ ВИЭВ) свободны от вирусной контаминации Все исследованные культуры клеток не содержат цирковирус свиней 2-го типа.

3. Установлена пермиссивность клеточной линии А4С2 к ЦВС-2 с развитием клеточных альтераций в ходе репродукции вируса.

4. Разработаны наборы препаратов для ПЦР и ПЦР в режиме реального времени, позволяющие идентифицировать и дифференцировать цирковирус свиней 1-го типа и цирковирус свиней 2-го типа в различных пробах патологического материала, сыворотках крови, а также инфицированных культурах клеток.

5. Методом электронной микроскопии в пробах патологического материала от поросят с признаками синдрома мультисистемного истощения огьемышей и дерматита с синдромом нефропатии, а также в пробах культур клеток, инфицированных цирковирусом свиней 2-го типа, обнаружены вирусные частицы цирковируса свиней 2-го типа, имеющие шестиугольный профиль капсомерного слоя и обладающие икосаэдрическом типом симметрии, с отсутствием суперкапсидной оболочки и средним значением диаметра 20,13±0,08 нм.

свиней 2-го типа установлен сходство отечественных изолятов со штаммами цирковируса свиней 2-го типа, циркулирующими в зарубежных странах.

5.ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

TT--------------------------. , .

11 ai\ 1 > 1' w i w uprimwiwutiyi . i j. i..... I...,

1. «Методические рекомендации по выявлению и дифференциации цирковирусов свиней 1-го и 2-го типа с использованием метода полимеразной цепной реакции», утвержденные директорм ГНУ ВИЭВ 6 августа 2008 г.

2. «Методические рекомендации по применению набора препаратов для выявления ДНК ЦВС-2 методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени», утвержденные академиком - секретарем РАСХН 26 октября 2008 г.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Идентификация генома цирковирусов свиней 1-го и 2-го типов методом полимеразной цепной реакции/ A.C. Малоголовкин, Г.А. Надточей, О.Н. Жигалева, В.Г. Бурдинский, М.Б. Новикова // Ветеринарна медицина 88: м1жвщомчий тематич. науковий зб1рник. Науково-практична конференц1я з М1жнародною участю: «Актуальш проблеми молекулярное диагностики у ветеринарнш медеициш та бюлогн». - Харгав, 2007. - С.137-140.

2. Оптимизация полимеразной цепной реакции для идентификации генома цирковирусной инфекции свиней /A.C. Малоголовкин, Г.А. Надточей, О.Н. Жигалева, В.Г. Бурдинский, М.Б. Новикова// Ветеринарная патология .- 2007. -№2.-С.49-51.

3. Малоголовкин, A.C. Селекция субпопуляций клеток из перевиваемой клеточной линии PK-15 на наличие цирковируса свиней типа 1/ A.C. Малоголовкин, О.Л. Колбасова // Генодиагностика инфекционных болезней-2007 («Молекулярная диагностика - 2007».): сб. Трудов VI Всероссийский науч.- практ. конф., 2007. - Т.2 - С. 32-37.

4. Малоголовкин, A.C. Цирковирусные инфекции животных и человека / A.C. Малоголовкин // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: материалы науч.-практ. конф. ВНИТИБП. - Щёлково, 2007.-С. 158-146.

5. Малоголовкин, А.С. Проблема цирковирусных инфекций в патологии животных и человека / А.С. Малоголовкин// Ветеринария и кормление. - 2008. -№2.-С. 30-31.

6. Malogolovkin, A.S. Causes of detection PCV-2 infection in Russian swin fields/ A.S. Malogolovkin, G.A. Nadtochey, D.V. Kolbasov// Laboratory diagnostics today and its future challenges. Dedicated to the 90th anniversary of the Food and veterinary Service of Latvia; Riga, 2008 - P.16.

Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ, г.Покров Владимирской области. Тираж 80 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Малоголовкин, Александр Сергеевич

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Краткая характеристика цирковпруспых инфекций.

1.2. Таксономическое положение цпрковирусов евппеп.

1.3. Морфологические и структурные особенности цпрковирусов.

1.4. Физико-химические свойства цпрковирусов.

1.5. Молекулярно-бнологнческие особенности строения ЦВС.

1.6. Генетическая вариабельность геномов цпрковирусов свиней.

1.7. Механизм репродукции цпрковирусов свиней.

1.7.1. Чувствительность клеток к заражению ЦВС-2 в условиях in vivo.

1.7.2. Культивирование ЦВС-2 in vitro.

1.8. Распространение ЦВС-1 и ЦВС-2.

1.9. Цнрковнрус человека.

1.10. Синдром мультнснстемного истощения отьемышей.

1.11. Патологоанатомнческне изменения при СМИО.

1.12. Дерматит и синдром нефропатнн (ДСНП).

1.13. Заболевания, ассоциируемые с цнрковнрусом свиней 2 типа.

1.13.1. Инфекционный врожденный (конгенитальный) тремор.

1.13.2. Нарушения репродуктивной функции.

1.13.3. Комплекс респираторной патологии свиней.

1.13.4. Смешанные инфекции.

1.14. Методы диагностики цнрковнруснон инфекции свиней.

1.15. Специфическая профилактика и лечение.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биологические и генетические характеристики цирковирусов свиней"

смио 6 - синдром мультисистемного истощения оъемышей тгэс - трансмиссивный гастроэнтерит свиней тт - Torque teno virus

ТОД50 - тканевая цитопатическая доза

ФБР - фосфатно-буферный физиологический раствор

ФВК - фосворновольфрамовая кислота

ЦВС-1 - цирковирус свиней первого типа

ЦВС-2 - цирковирус свиней второго типа

ЦИС - цирковирусная инфекция свиней цпэ - цитопатический эффект

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ВВЕДЕНИЕ

Первые сведения о патогенном цирковирусе свиней появились в 1991 г., когда в Канаде было выявлено новое заболевание — синдром мультисистемного истощения отъемышей (СМИО). У поросят 6-14 недельного возраста наблюдали истощение, одышку, диарею, желтушность кожи. Полученные впоследствии данные охарактеризовали новый вирус, как цирковирус свиней 2-го типа (ЦВС-2) (Сатина Т.А., 2003; Allan G.M. et al., 1998; Clark E. et al., 1997; Ellis J. et al., 1998; Gagnon C. et al., 2007).

Возникновению данного комплекса заболеваний способствует развитие смешанных инфекций ЦВС-2 с другими патогенами вирусной и бактериальной природы (Drolet R. et al., 1999; Lainson L.A. et al., 2002; Grasland B. et al., 2005; Rapp-Gabrielson V. J. et al., 2008; Keith H. West et al., 1999; Meehan B.M. et al., 2006).

Исследования репродукции вируса в условиях in vitro таюке являются важным этапом в разработке диагностических систем для индикации цирковирусов свиней.

Цель работы и задачи исследования. В связи с вышеизложенным основной целью наших исследований являлось изучение патоморфологических изменений при цирковирусной инфекции свиней, биологических свойств возбудителя и генетического родства изолятов цирковируса 2-го типа, циркулирующих в популяциях свиней на территории Российской Федерации.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

- изучить патологоанатомические и гистологические изменения у поросят при СМИО и ДСНП;

- адаптировать цирковирус свиней 2-го типа для репродукции в перевиваемых клеточных линиях;

- выделить цирковирус свиней 2-го типа из патологического материала от больных животных;

- изучить морфологию вирионов ЦВС-2 методом электронной микроскопии;

- изучить филогенетические взаимоотношения изолятов ЦВС-2, циркулирующих в популяциях свиней на территории РФ.

Научная новизна результатов исследований.

Разработан набор препаратов для обнаружения цирковируса свиней 2-го типа с применением полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ТаяМап).

Установлено филогенетическое родство изолятов ЦВС-1, выделенных из перевиваемых культур клеток РК-15, ЭК-б, ПСГК, ПСГК-60, а также изолятов цирковируса свиней 2-го типа, выявленных от поросят с синдромом мультисистемного истощения отъемышей и дерматитом с синдромом нефропатии на территории Российской Федерации.

Практическая значимость работы.

Представленные данные патологоанатомических и гистологических изменений при синдроме мультисистемного истощения отъемышей и дерматите с синдромом нефропатии важны для дифференциальной диагностики инфекционных заболеваний свиней.

Публикации результатов исследований. По теме диссертационной работы опубликовано 6 научных статей, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» ВНИТИБП (г. Щёлково, 20-21 декабря 2007 г.), на международном семинаре «Porcine circovirus diseases: towards improved food quality & safety within new member states & associated candidate countries.Workshop №3» (Budapest, Hungary, 18th-20th May 2008), на международной конференции « Laboratory diagnostics today iL and its future challenges. Dedicated to the 90 anniversary of the Food and veterinary Service of Latvia (Riga 28-29 August 2008), заседаниях ученого совета ГНУ ВИЭВ и ГНУ ВНИИВВиМ в 2006-2008 гг.

Основные положения диссертационной работы, выдвигаемые на защиту:

1. Патоморфологические изменения у поросят с СМИО и ДСНП;

2.0собенности репродукции ЦВС-2 в перевиваемых клеточных культурах;

3. Морфологические характеристики цирковируса свиней 2-го типа;

4. Метод выявления ДНК ЦВС-2 с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени;

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Малоголовкин, Александр Сергеевич

5. ВЫВОДЫ

1. Основными патоморфологическими изменениями у поросят при синдроме мультисистемного истощения отъемышей и дерматите с синдромом нефропатии являются поражения респираторного тракта, характеризующиеся некротическими и интерстициальными пневмониями и изменениями в лимфатических узлах, проявляющимися гиперплазиями различной степени и нарушением структуры органа. Микроскопические изменения в тканях при цирковирусной инфекции свиней характеризуются периваскулярными инфильтрациями незрелыми клетками лимфоидного типа. В лимфоидных органах отмечаются дегенеративные изменения.

2. Образцы интактных культур клеток линий РК-15 (Португалия), SK-6, ПСГК, ПСГК-60, (ГНУ ВНИИВВиМ) являются инфицированными цирковирусом свиней 1-го типа, в то время как культуры клеток Vero, CV-1, ПТП (ГНУ ВНИИВВиМ), А4С2, СПЭВ (ГНУ ВИЭВ) свободны от вирусной контаминации. Все исследованные культуры клеток не содержат цирковирус свиней 2-го типа.

5. Методом электронной микроскопии в пробах патологического материала от поросят с признаками синдрома мультисистемного истощения отъемышей и дерматита с синдромом нефропатии, а также в пробах культур клеток, инфицированных цирковирусом свиней 2-го типа, обнаружены вирусные частицы цирковируса свиней 2-го типа, имеющие шестиугольный профиль капсомерного слоя и обладающие икосаэдрическом типом симметрии, с отсутствием суперкапсидной оболочки и средним значением диаметра 20,13±0,08 нм.

6. На основе филогенетического анализа показано близкое генетическое родство изолятов цирковируса 1-го типа, выявленного из различных перевиваемых культур клеток. Нуклеотидным секвенированием полевых изолятов цирковируса свиней 2-го типа установлен сходство отечественных изолятов со штаммами цирковируса свиней 2-го типа, циркулирующими в зарубежных странах.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического применения предложены:

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Малоголовкин, Александр Сергеевич, Москва

1. Генетическая характеристика изолятов цирковируса диких кабанов / С.А. Чупин и др.//Мат. международной научно — практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных».ГНУ ВИЭВ, 2006.-С.402.

2. Герилович, А.П. Разработка системы индикации и дифференциации цирковирусов свиней методом полимеразной цепной реакции/ А.П. Герилович, Б.Т. Стегний// Сб. тр. 6-ой всеросс. науч.-практ. конф. «Молекулярная диагностика 2007», T.II.-M.,- 2007 г.-С. 14-15.

3. Гринин, A.C., Очистка, концентрирование и фракционирование вирусов животных/ A.C. Гринин, И.Н. Титов.- М.: Колосс ,1971.- 213 с.

4. Дягилев, К.К. Цирковирусная инфекция свиней и борьба с ней/ К.К Дягилев// Совершенствование технологии производства свинины на комплексах и фермах промышленного типа Минской области: науч.-практ. конф./РНИУПИЭВ.-Минск, -2003.-С.39-43.

5. Меркулов, Г. А. Курс патологической техники/ Г.А. Меркулов. -М.: Медицина, 1969.-422с.

6. Орлянкин, Б.Г. Респираторные нарушения свиней./ Б.Г. Орлянкин// Мат. международной научно практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных». ГНУ ВИЭВ, 2006.-С.135-138.

7. Орлянкин, Б.Г. Цирковирусная инфекция свиней/ Б.Г. Орлянкин, Т.Н. Алипер, Е.А. Непоклонов //Животноводство России.- 2003.- №8.- С. 24-25.

8. Разработка и применение непрямого варианта ИФА для обнаружения Ат к ЦВС-2/ A.M. Тимина и др.// Труды Федерального центра охраны здоровьяживотных / ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГУ «ВНИИЗЖ»). Т.4. Владимир.-2006.-С. 102-113.

9. Респираторная болезнь на свинокомплексах Сибири: диагностика, симптоматика, патология./ Афонюшкин A.M. и др.//Российский ветеринарный журнал.-2007. №2.-С. 12-13.

10. П.Сатина, Т.А. Цирковирусные инфекции свиней/ Т.А. Сатина //Обзор литературы/ ФГУ ВНИИЗЖ. Владимир, -2003. - 101 с.

11. Серологический мониторинг репродуктивно-респираторного синдрома, цирковирусной инфекции и парвовирусной инфекции свиней в Удмуртской республике/ Ю.Г. Крисенко и др.// Вет. врач,- 2007.-№2-С.7-9.

12. М.Тимина, A.M. Разработка методов лабораторной диагностики цирковирусной инфекции свиней: автореф. дис. канд. вет. наук: 16.00.03/ Тимина Анна Михайловна.-Владимир,- 2006.-27с.

13. Шкаева, М.А. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антител к цирковирусу свиней второго типа: автореф. дис. канд. биол. наук: 03.00.06/ Шкаева Мария Александровна.-М.,-2006.-25 с.

14. Absence of evidence for porcine circovirus type 2 in cattle and humans, and lack of seroconversion or lesions in experimentaly infected sheep / G.M. Alan et al.// Arch.Virol.-2000.-Vol. 145, N4.-P.853-857.

15. Activation of the immune system is the pivotal event in the production of wasting disease in pigs infected with porcine circovirus-2 (PCV-2)/ S. Krakowka et al. // Vet.Pathol.-2001.-Vol. 38, N1.-P.31-42.

16. Alan, G.M. Porcine circovirus: a review / G.M. Alan, J.A. Ellis//J.Vet.Diagn.lnvest.-2000.-Vol. 12,N1.-P. 13-14.

17. Alan, G.M. Porcine circovirus: Epidemiology and pathogenesis / G. M. Alan// PigJ.-1996.-Vol. 37.-P.14-19.

18. A sequential study of experimental infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus: immunostaining of cryostat sections and virus isolation / G.M. Alan et al.// J.Vet.Med.Ser.B-2000.-Vol.47, N2.-P.81-94.

19. An experimental model of Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome (PMWS) in growing piglets / E. Albina et al.// J. Comp.Pathol.-2001.-Vol. 125.-P.292-303.

20. Analysis of seroconversion to porcine circovirus 2 among veterinarians from the United States and Canada / J.A. Ellis et al.// J.Am.Vet.Med.Assoc.-2000.-Vol. 217, N11.-P.1645-1646.

21. Analysis of transcription and replication of porcine circovirus PCV / A. Mankertz et al.// IXth lnt.Congr.Virol.-1993.-P.76.

22. Association of porcine circovirus 2 with reproductive failure in pigs: a retrospective study, 1995-1998 / J. Bogdan et al.// Can.Vet.J.-2001.-Vol. 42, N7.-P.548-550.

23. Association of porcine circovirus-2 with swine diseases other than post-weaning multisystemic wasting syndrome / Ellis J. et al.// Vet.Pathol.-1999.-Vol. 36, N5.-P.498.

24. A very small porcine virus with circular single-stranded DNA / I. Tisher et al.//Nature.-1982- Vol. 295. P.64-66.

25. Beak and feather disease virus and porcine circovirus genomes: intermediates between the geminiviruses and plant circoviruses / F.D. Niagro et al. // Arch.Virol.-1998.-Vol. 143, N9.-P.1723-1744.

26. Binding and entry characteristics of porcine circovirus 2 in cells of the porcine monocytic line 3D4/31/ G. Misinzo Journal of General Virology.-2005.- 86.-P. 2057-2068.

27. Boevink, P. Sequence of subterranean clover stunt virus DNA: affinities with the geminiviruses / P. Boevink, P.W. Chu, P. Keese// Virology.-1995.-Vol. 207,-P.354-361.

28. Buhk, H.J. Cloning and sequencing of the porcine circovirus PCV genome / H.J. Buhk, I. Tischer, M.A. Koch // Zbl. Bakteriol. Microbiol. Hyg. Ser.A, Meet. Abstr.-1985.-P.260-465.

29. Buhk, H.J. Replication of negative strand DNA of the singe-stranded porcine circovirus genome / H.J. Buhk, I. Blab, I. Tischer// Abstr. Joint Meeting of Section Virol, and Virus Group of Soc.Gen.Microbiol.-1988.-P.54.

30. Carlton, J. Another new viral disease? / J. Carlton //Swine Practitioner.-1997. -N4.-P.14-15.

31. Cellular localization of porcine circovirus in postweaning pigs with chronic wasting disease / M. Kiupel et al. // Europ.J.Vet.Pathol.-1999.-Vol. 5.-P.77-82.

32. Change of porcine circovirus 2 target cells in pigs during development from fetal to early postnatal life/ R.E. Sanchez et al.// Vet Microbiol.-2003.- 95.-P.15-25.

33. Changes in peripheral blood leukocyte populations in pigs with natural postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) / J. Segales et al. // Vet. Immunopathol.-2001.-Vol. 30, N1-2.-P.37-44.

34. Characterization of novel circovirus DNAs associated with wasting syndromes in pigs / B.M. Meehan et al. // J.Gen.Virol.-1998.-Vol. 79, N9.-P.2171-2179.

35. Characterization of PCV-2 isolates from Spain, Germany and France / A. Mankertz et al.// Virus Res.-2000.-Vol. 66, N1.-P.65-77.

36. Charreyre, C. Natural decrease of anti PCV II material antibodies in conventional piglets / C. Charreyre, L. Boeuf, G. Reynaud//Proc.of the 16th IVPS Congr.-Melbourne, Australia, 2000. P.630.

37. Charreyre, C. Natural transmission of PCV II in seronegative 9 week old pigs / C. Charreyre, L. Boeuf, Brunet S., G. Reynàud// Proc. of the 16th IPVS Congr,-Melboume, Australia, 2000.-P.574.

38. Cheung, A. Transcriptional analysis of porcine circovirus/ A. Cheung// J. Virol. -2003 .-305.-P. 168-180.

39. Choi, C. In situ hybridization for the detection of porcine circovirus in pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome / C. Choi, C. Chae //J. Pathol. -1999.-Vol. 121, N3.-P.265-270.

40. Choi, C. Distribution of porcine parvovirus in porcine circovirus 2-infected pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome as shown by in-situ hybridization / C. Choi, C. Chae //J.Comp.Pathol.-2000.-Vol. 123, N4.-P.302-305.

41. Circovirus-like viral associated disease in weaned pigs in Indiana / M. Kiupel et al. // Vet.Pathol.-1998.-Vol. 35, N4.-P.303-307.

42. Clark E.G. Pathology of the postweaning multisystemic wasting syndrome of pigs / E.G. Clark // Proc.West. Can.Assoc.Swine Pract.-1996.-P. 22-25.

43. Clark, E.G. Circovirus an emerging swine pathogen / E.G. Clark, J.C. Harding// ISU Swine Disease Conf.Proc.-1997.-P.63-64.

44. Clinicopathological findings related to the first description in Spain of porcine dermatitis/nephropathy syndrome / J. Segales et al.// Proc. of the 14th IPVS Congr. Bologna, Italy, 1996.-P.709.

45. Coinfection by porcine circoviruses and porcine parvvovirus in pigs with naturaly acquired postweaning multisystemic wasting syndrome / J.A. Ellis et al.// J.Vet.Diagn.Invest.-2000.-Vol. 12, N1.-P.21-27.

46. Comparison of the Structures of Three Circoviruses: Chicken Anemia Virus, Porcine Circovirus Type 2, and Beak and Feather Disease Virus/ R.A. Crowther et al.// J.of Virology.-2003 .-P. 13036-13 041.

47. Cutlip, B.C. Experimentaly induced infection of neonatal swine with porcine parvovirus / B.C. Cutlip, W.L. Mengeling //Am.J.Vet.Res.-1975.-Vol. 36.-P. 1179-1182.

48. Differential recognition of ORF2 protein from type 1 and type 2 porcine circoviruses and identification of immunorelevant epitopes / D. Mahe et al.// J.Gen. Virol.-2000.-V81, N7.-P. 1815-1824.

49. Detection of porcine circovirus from lesions of a pig with wasting disease in Japan/A. Onuki et al.// J.Vet.Med.Sci.-1999.-Vol. 61, N10. -P.l 119-1123.

50. Development of a polyclonal-antibody-based immunohistochemical method for the detection of type 2 porcine circovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue / S.D. Sorden et al. //J.Vet.Diagn.lnvest.-1999.-Vol. 11, N6.-P.528-530.

51. Development of probes to differentiate porcine circovirus types 1 and 2 in vitro by in situ hybridization / P. Nawagitgul et al. // Vet.Microbiol.-2000.-Vol. 75, N1.-P.83-89.

52. Differentiation of porcine circovirus 1 and 2 in formalin-fixed, paraffin-wax-embedded tissues from pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome by in situ hybridization / J. Kim, C. Chae // Res.Vet.Sci.-2001.-. Vol. 70.-P.265-269.

53. Diffuse hepatic necrosis characterized by infiltration of multinucleated giant ceils associated with porcine circovirus type 2 in a piglet / Okuda K. et al.// JJapan Vet.Med.Assn.-2001.-Vol. 54,N3.-P. 181-184.

54. Double in situ hybridization for simultaneous detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and porcine circovirus (PCV) / T. Sirinarumitr et al. // J.Vet.Diagn.lnvest.-2001.-Vol. 13, N1.-P.68-71.

55. Dulac, G.C. Porcine circovirus antigens in PK-15 cell line (ATCC CCL-33) and evidence of antibodies to circovirus in Canadian pigs / G.C. Dulac, A. Afshar// Canad. J.Vet.Res.-1989.-Vol. 53,N4.-P.431 -433.

56. Edwards, S. Evidence of oncovirus infection in British pigs // S. Edwards, J.Sands // J. Vet. Rec-1994.-Vol. 134, N26.-P.680-681.

57. Ellis, J.A. The natural history of porcine circoviruses / J.A. Ellis, G.M. Alan //MERIAL -PMWS Symposium. Melbourne, 2000.-P.3-19.

58. Epidemiology of post-weaning multisystemic wasting syndrome in Ontario / T.S. Cotrell et al.// Proc.Am.Assoc. Swine Pract.-1999.-P.389-390.

59. Evidence of porcine circovirus infection in pigs with wasting disease syndrome from 1985 to 1999 in Hokkaido, Japan / K. Sato et al. // J.Vet.Med.Sci.-2000.-Vol. 62, N6.-P.627-633.

60. Evidence of shedding of porcine circovirus type 2 (PCV2) in boar semen following experimental infection / R. Larochelle et al. // Proc.of the 16lh IPVS Congr. -Melbourne, Australia, 2000.-P.580.

61. Experimental inoculation of conventional pigs with tissue homogenates from pigs with post-weaning multisystemic wasting syndrome // M. Balasch et al.// J.Comp.Pathol.-1999.-Vol. 121,N2.-P. 139-148.

62. Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus / G.M. Alan et al.// J.Comp.Pathol.-1999.-Vol. 121, N1.-P. 1-11.

63. First report of postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs in Spain / J. Segales Vet.Rec.-1997.-Vol. 141, N23.-P.600-601.

64. Gibbs, M J.Evidence that a plant virus switched hosts to infect a vertebrate and then recombined with a vertebrate-infecting virus / M J. Gibbs, F.W. Weiller// Proc. Natl.Acad.Sci.USA.-1999.-Vol. 96.-P .8022-8027.

65. Haematological parameters in postweaning multisystemic wasting syndrome-affected pigs / J. Segales et al. // Vet.Rec-2000.-V146, N23.-P.675-676.

66. Hamel, A.L. Nucleotide sequence of porcine circovirus associated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs / A.L. Hamel, L.L. Lin, G.P Nayar// J.Virol.-1998.-Vol. 72, N6.-P.5262-5267.

67. Harding, J.C, Recognizing and diagnosing postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) / J.C. Harding, E.G. Clark// Swine Health and Prod.-1987.-N5. -P.201-203.

68. Harding, J.C. Postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS): preliminary epidemiology and clinical presentation / J.C. Harding // 28th AASP.-1997.-P.503-504.

69. Identification and incidence of porcine circovirus in routine field cases in Quebec as determined by PCR / R. Larochelle et al. // Vet.Rec.-1999.-Vol. 145, N5.-P. 140-142.

70. Identification of a novel GC-rich 113-nucleotide region to complete thecircular, single-stranded DNA genome of TT virus, the first human circovirus /

71. Miyata Hironori et al. // J.Virol.-1999.-Vol. 73, N5.-P.3582-3586.

72. Identification of a protein essential for replication of porcine circovirus / A.

73. Mankertz et al.// J.Gen.Virol.-1998.-Vol. 79, N2.-P.381-384.

74. Immunostimulation, PCV-2 and PMWS/ G.M. Alan et al.// Vet.Rec.-2000.1. Vol.147, N6.-P. 170-171.

75. Infection of leucocyte cell cultures derived from different species with pig circovirus / G.M. Alan et al.// Vet.Microbiol.-1994-Vol. 41, N3.-P.267-279.

76. Interstitial pneumonia and lymphadenopathy associated with circoviral infection in a six-week-old pig / B. Daft et al.// 39th Meeting of the Am.Assoc.Vet. Lab.Diagn. 1996.-P.32-39.

77. Intestinal chlamydial infection concurrent with post weaning multisystemic wasting syndrome in pigs / L. Carrasco et al.// Vet.Rec.-2000.-Vol. 146,. N1.-P.21 -23.

78. Increase in PDNS diagnoses in the Netherlands/ A.R. Elbers et al.// Vet.Rec.-2000.-Vol. 147, Nll.-P.311.

79. Isolation and characterisation of circoviruses from pigs with wasting syndromes in Spain, Denmark and Northern Ireland/ G.M. Alan et al.// Vet.Microbiol.1999,-Vol. 66, N2.-P.115-123.

80. Isolation and characterization of porcine circovirus 2 from cases of sow abortion and porcine dermatitis and nephropathy syndrome / B.M. Meehan et al. // Arch.Virol.-2001 .-Vol. 146, N4.-P.835-842.

81. Isolation of circovirus from lesions of pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome / J. Ellis et al.// Can.Vet.J.-1998.-V39, N1.-P.44-51.

82. Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe / G.M. Alan et al.// J.Vet.Diagn.lnvest.-1998.-Vol.lO, N1.-P.3-10.

83. Kawachima, K. Association of porcine circovirus type 2 with respiratory disease in a swine herd with porcine reproductive and respiratory syndrome / K. Kawachima, F. Tsunemitsu // Proc.of the 16th IPVS Cong.-Melbourne, Australia,2000.-P.520.

84. Knell, S. Comparative genetic characterization of Porcine Circovirus type 2 isolates from German wild boar populations /S. Knell //Veterinary Microbiology.-2005.- 109.-P. 169-77.

85. Lack of antibodies to porcine oncovirus type 2 virus in beef and dairy cattle and horses in Western Canada / J.A.Ellis et al.// Can.VetJ.-2001.-Vol.42, N6.-P.461-464.

86. Lack of PCV-2 Infection innon porcine species in spain/M. Rodriguez-Arrioja et al.// Vet. Rec.-2003.-371-372.

87. Larochelle R. Typing of porcine circovirus in clinical specimens by multiplex PCR / R. Larochelle et al. //J.Virol.Methods.-1999.-Vol. 80, N1.-P.69-75.

88. LeCann, P. Identification of porcine circovirus associated with piglet wasting disease / LeCann P. et al. // Proc.of Int.Pig Vet.Soc. Congr.-1998.-V15.-P.402.

89. Liu, Q. Nuclear localization of the ORF2 protein encoded by porcine circovirus type 2 / S.K. Tikoo, L.A. Babiuk//Virology. -2001.-Vol. 285, N1.-P.91-99.

90. Magar, R. Experimental transmission of porcine circovirus type 2 (PCV2) in weaned pigs: a sequential study / R. Magar, R. Larochelle, S. Thibault// J.Comp.Pathol.-2000.-Vol. 123, N4.-P.258-269.

91. Magar, R. Retrospective serological survey of antibodies to porcine circovirus type 1 and type 2 / R. Magar, P. Muller, R. Larochelle //Can.J.Vet.Res.-2000.-Vol.64, N3. -P. 184-186.

92. Mankertz, A. Molecular biology of porcine circovirus/ A. Mankertz// Porcine circovirus diseases: towards improved food quality & safety within new member states & associated candidate countries.Workshop №3. Budapest, Hungary, 18th-20th May 2008.

93. Mapping and characterization of the origin of DNA replication of porcine circovirus/ J. Mankertz et al.//J.ViroI.-1997.-Vol.71, N3. P.2562-2566.

94. Meerts, P. The complex interaction between porcine circovirus type 2 and the pig's immune system: PhD thesis/ Peter Meerts.-Universiteit Gent, 2005.-p.195.

95. Molecular and biophysical characterization of TT virus: evidence for a new virus family infecting humans / I.K. Mushahwar et al. // Proc.Natl.Acad.Sci.USA-1999.-Vol. 96, N6.-P.3177-3182.

96. Morphological characterization of chicken anaemia agent (CAA)/ H. Gelderblom et al.// Arch.Virol. -1998.-Vol. 109.-P.115-120.

97. Morozov, I. Detection of a novel strain of porcine circovirus in pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome / I. Morozov et al. // J.Clin. Microbiol.-1998.-Vol. 36, N9.-P.2535-2541.

98. Multiple porcine circovirus 2-associated abortions and reproductive failure in a multisite swine production unit / B. O'Connor et al. // Can.Vet. J.-2001.-Vol.42, N7.-P.551-553.

99. Multiplex PCR for detection and typing of porcine circoviruses / M. Ouardani et al. // J.Clin.Microbiol.-1999.-Vol. 37, N12.-P.3917-3924.

100. Myocarditis associated with high PCV-2 DNA-load in aborted fetuses and young piglets/ I.M. Brunborg et al.// 5th international symposium on emerging and re-emerging pig diseases Krakow, Poland 24th - 27th June 2007.-p.57.

101. Nayar, G.P. Detection and characterization of porcine circovirus associated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs/ G.P. Nayar// Can.Vet.J.-1997.-V38, N6.-P.385-386.

102. Nayar, G.P. Evidence for circovirus in cattle with respiratory disease and from aborted fetuses / G.P. Nayar, A. Hamel, L. Lin //Can.Vet.J.-1999.-V40.-P.277-278.

103. New pig disease in Hungary: postweaning multisystemic wasting syndrome caused by circovirus (short communication) / I. Kiss et al. // Acta Vet.Hung.-2000.-Vol. 48, N4.-P.469-475.

104. Novel porcine circoviruses from pigs with wasting disease syndromes / G.M. Alan et al.// Vet.Rec.-1998.-Vol. 142, N17.-P.467-468.

105. Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein / P. Nawagitgul et al. // J. Gen. Virol. 2000. -Vol. 81, N9.-P.2281-2287.

106. Oraveerakul, K., Choi C.S., MolitorT.W. Tissue tropisms of porcine parvl.l.virus in swine // K. Oraveerakul, C.S. Choi, T.W. Molitor// Arch Virol. -1993. Vol. 130. - P.377-389.

107. Palmer, K.E. The molecular biology of mastreviruses / K.E. Palmer, E.P. Rybicki//Adv. Virus.Res.-1998.-Vol. 50.-P. 183-234.

108. Pathogenesis of porcine circovirus; experimental infections of colostrum deprived piglets and examination of pig foetal material / G.M. Alan et al.// Vet.Microbiol.-1995.-Vol. 44, N1.-P.49-64.

109. Pathological findings of pigs infected with porcine circovirus type 2 / K. Sato et al. //J.Japan Vet.Med.Assn.-2001.-Vol. 54, Nl.P.13-17.

110. Pathological observations on pigs with porcine dermatitis and nephropathy syndrome in Croatia/ Z. Grabarevich et al.// Veterinarski arhiv.-2004.-74 (1).-P.3-11.

111. PCR detection and characterization of type-2 porcine circovirus / A.L. Hamel et al. // Can.J.Vet.Res.-2000.-Vol. 64, N1.-P.44-52.

112. PCR detection and evidence of shedding of porcine circovirus type 2 in boar semen / R. Larochelle et al. // J. Clin. Microbiol. -2000. Vol. 38, V12. - P.4629-4632.

113. PCV-2-associated PDNS in Northern Ireland in 1990. Porcine dermatitis and nephropathy syndrome / G.M. Alan et al.// Vet. Rec. 2000. - Vol. 146, N24. -P.711-712.

114. Piglet wasting disease // P. LeCann et al. // Vet.Rec-1997.-Vol. 141, N25.-P.660.

115. Pigs confirmed to be infected with porcine circovirus 2 as early as 1988 / M. Hasegawa et al. // J.Japan Vet.Med.Assn.-2001.-Vol. 54, N10.-P.757-760.

116. PMWS and porcine dermatitis nephropathy syndrome in Great Britain // A. Gresham et al.//Vet.Rec.-2000.-Vol. 146, N5.-P.143.

117. Porcine circovirus and PRRS virus co-infection in pigs with chronic bronchointerstitial pneumonia and lymphoid depletion: an emerging syndrome in Midwestern swine / S.D. Sorden et al. // Proc. Am.Assoc.Vet.Lab.Diagn.-1998.-V41.-P.75.

118. Porcine circovirus infection in Northern Ireland / S. Kennedy et al. // Vet.Rec.-1998.-Vol. 142, N18.-P.495-496.

119. Porcine circovirus is present in cases of porcine dermatitis and nephropathy syndrome / J. Segales et al. // 15th Int.Pig.Vet.Soc.Proc. Birmingham, 1998. -P.215.

120. Porcine dermatitis and nephropathy syndrome (PDNS): an overview of the disease / R. Drolet et al.// Swine Health Prod.-1997. -V7.-P.241-245.

121. Porcine dermatitis nephropathy syndrome: a new condition to include into the differential diagnosis list for skin discoloration in swine / M. Duran et al.// Swine Health Prod.-1997.-V5.-P.241 -245.

122. Porcine immune complex glomerolonephritis dermatitis (PIGD) syndrome / M.A. Sierra et al. // Europ.J.Vet.Pathol. 1997. - Vol. 3, N2. - P.63-70.

123. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) infection in pigs naturaly affected with postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) in Spain / J. Segales et al. // Proc. of the 16th IPVS Congr.-Melbourne, Australia, 2000.-P.582.

124. Postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS): epidemiology and clinical presentation / J.C. Harding et al. // Swine Health Prod.-1998.-N6.-P.249-254.

125. Presence of antibodies reacting with porcine circovirus in sera of humans, mice, and cattle./I. Tisher et al.// Arch. Virol.- 1995-. Vol. 140.-P. 1427-1439.

126. Production, characterisation and applications of monoclonal antibodies to porcine circovirus 2 / F. McNeilly et al. // Arch.Virol.-2001.-Vol. 146, N5.-P.909-922.

127. Prevalence of swine Torque teno virus in post weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS)-affected and non-PMWS-affected pigs/T. Kekarainen et al.// J. General Virology.-2006.-Vol. 87.-P.833-837.

128. Psittacine beak and feather disease virus nucleotide sequence analysis and its relationship to porcine circovirus, plant circoviruses, and chicken anaemia virus /M.R. Bassami et al.// Virology.-1998.-Vol. 249, N2.-P.453-459.

129. Quantitative, competitive PCR analysis of porcine circovirus DNA in serum from pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome / Q. Liu et al. // J.CIin.Microbiol.-2000.-Vol. 38, N9.-P.3474-3477.

130. Receptor determined resistance of preimplantation embryos to porcine respiratory syndrome virus/ H. Nauwynck et al.// 5lh international symposium onemerging and re-emerging pig diseases Krakow, Poland 24th - 27th June 2007.-p.164.

131. Renal failure in PRRSV and PCV2 natural infected swine / Gelmetti D. et al. // Virol, in new Millenium: Proc.5lh Int.Congr.Europ.Soc.Vet.Virol.-Brescia, 2000.-P.350-351.

132. Replication of singlestranded porcine circovirus DNA by DNA polymerase-alpha and polymerase-delta // M. Gassmann et al.// Biochem.Biophys.Acta.-1988.-Vol. 951.-P.280-289.

133. Reproduction of lesions of postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic piglets / Ellis J. et al.// J.Vet.Di-agn.lnvest.-1999.-Vol. 11, N1 .-P.3-14.

134. Sequence of porcine cir-s covirus DNA: affinities with plant circovirus / B.M. Meehan et al. // J.Gen.Virol.-1997.-Vol. 78, N1.-P.221-227.

135. Seroprevalence of porcine circovirus types 1 and 2 in the Belgian pig population / G.G. Labarque et al. //Vet.Q.-2000.-Vol. 22, N4.-P.234-236.

136. Shibahara, T. Porcine circovirus induces B lymphocyte depletion in pigs with wasting disease syndrome / T. Shibahara, K. Sato, Y. Ishikawa// J.Vet,Med.Sci.-2000.-Vol. 62, N11.-P. 1125-1131.

137. Smith, WJ. Dermatitis/nephropathy syndrome of pigs / W.J. Smith, J.R. Thomson, S. Done // Vet.Rec.-1993.-Vol. 132.-P.47.

138. Some biological and physicochemical properties of porcine circovirus / G.M. Alan et al.// J.Vet.Med.Ser.B.-1994.-Vol.41, N1.-P. 17-26.

139. Systemic necrotizing vasculitis and glomerulonephritis in grower pigs in southwestern Quebec/ P. Helie et al. // Can. Vet. J.-1995.-Vol. 36.-P. 150-154.

140. The Circoviridae / P. Lukert et al.// Virus Taxonomy. Sixth Rep.lnt.Comm. on Taxonomy of Viruses.-Vienna etc., 1995. P. 166-168.

141. The clinical scope of porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection has expanded since 1987 an alternative perspective/ J.A. Ellis et al.// Vet.Pathol.-1999.-Vol. 36, N3.-P.262-265.

142. The serological characterization of PCV2 isolates using an established virus neytralisation test for PCV-2 antibodies/ C. Duffy et al.// 5th international symposium on emerging and re-emerging pig diseases Krakow, Poland 24th - 27th June 2007.-p.52.

143. Three cases of postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) due to porcine circovirus type 2 (PCV 2) in Switzerland // N.Borel et al.// Schweiz. Arch.Tierheild.-2001.-Vol. 143, N5.-P.249-255.

144. Tissue distribution and genetic typing of porcine circoviruses in pigs with naturaly occurring congenital tremors / G.W. Stevenson et al. // J. Vet.Diagn.lnvest.-2001 Vol. 13, N1.-P.57-62.

145. Todd, D. Circoviruses: immunosuppressive threats to avian species: a review/D.Todd// Avian Pathol.-2000.- 29.-P.373-394.

146. Transcription analysis of porcine circovirus (PCV)/ A. Mankertz et al.//Virus Genes.-1998.-Vol. 16, N3.-P.267-276.

147. Transfusion transmitted virus: A review on its molecular characteristics and role in medicine/ M. Irshad et al.// World J Gastroenterol.-2006.- 12(32).P. 5122-5134.

148. Viral replication and lesions in BALB/c mice experimentaly inoculated with porcine circovirus isolated from a pig with postweaning multisystemic wasting disease / M. Kiupel et al. // Vet. Pathol.-2001.-Vol. 38, N1.-P.74-82.

149. Reproduction of lesions of postweaning multisystemic wasting syndrome by infection of conventional pigs with porcine circovirus type 2 alone or in combination with porcine parvovirus/ B. Meehan et al.// J. Comp. Pathol. -2000,-Vol. 122.-P. 9-24.

150. Pathogenesis of porcine circovirus experimental infections of colostrum deprived piglets and examination of pig foetal material/F. McNeilly et al.//. Veterinary Microbiology.-1995.-Vol. 44.-P.49-64.

Информация о работе

Малоголовкин, Александр Сергеевич
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.06

Диссертация

Биологические и генетические характеристики цирковирусов свиней - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно