Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональные различия темных и светлых гепатоцитов

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональные различия темных и светлых гепатоцитов"

9'£'

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ И ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М. а ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи

КОСЫХ МАРИНА ИЛЬИНИЧНА

СТРУКТУРНО - ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ РАЗЛИЧИЯ ТЕМНЫХ И СВЕТЛЫХ ГЕПАТОЦИТОВ

03.00.11 - ЭМБРИОЛОГИЯ, ГИСТОЛОГИЯ И ЦИТОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 0 О"

Москва 1991

Работа выполнена на кафедре цитологии и гистологии биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова

Научный руководитель - доктор биологические наук, I профессор Ю. С. Чгнцов

Официальные оппоненты - доктор биологических наук,

профессор В. Я. Бродский

кандидат биологических наук М. М. Калашникова

Ведущее учреждение - Кафедра гистологии, цитологии

и эмбриологии НМЛ им. К. II Сеченова

Эавщта состоится ш 1931г. в Ю час;, ка заседании специализированного совета Д. 053.05. 68 при Московском государственном университете им. 1А Е Ломоносова по адресу: 115899, Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, аудитория Ы -I.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета {-ТУ им. М. Е Ломоносова.

Автореферат разослан^ООМ^^&М-* 1991г.

Ученый секретарь специализированного

совета, кандитат биологических наук Е. К. Калистратова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРА! Ии РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Известно, что морфологически однородные клетки ряда тканей обладают различными тинкториальними свойствами: одни интенсивно окрашваатся гистологическими красителями, поэтому их стает называть "темиими" клетками, другие хузсе воспринимают краситель - их нваьговмт"светлыми" ( Яевоин, 19-18; Секауо-ва. Бекетова, 1975; Коломина, 1985).

Были высказаны многочисленные лредполс.тения о мор-фо-функциональных различиях к биологическом значении темных и светлых клеток, причем многие из этих предположений представляют собой взаимоисключаюьдаеся гипотезу.

Так, наличие темных и светлых клеток часто связывают с отражением равличных функциональных состояний одного и того ко клеточного типа, либо о существованием самостоятельных клеточных популяций С Секамовз, Бекетова. 1975: Лноутденко. Маршак. 1983). Согласно одной точка зрения, темные клетки наименее дифференцированные элементы ткани ( Хлопин, 1946-, Яс-еоин. 1948; Крымский и др. , 1958), которые чаще всего встречается в ростковых слоях ткаки и очагах регенерации (Сазар-зик, Румянцев. 19465; согласно другой теории различия в диф-ференпнрозке и пролиферативной активности темню: и светлых клеток отсутствуют С Струве и др. , 1975). Вопрос о природе и Силлогическом значении темных и светлых клеток до сих пор не реке к и остается дискуссионным. Поэтому представляется необходимым провести более упорядоченный и глубокий анализ норфо-функцнокальных отличий темных I'. светлых клеток с привлечением современных морфологических, гистохимических и эяектронномкк-роскопических исследований на одном типе клеток. Наиболее

удобным объектом исследования являются гепатоциты. поскольку в литературе имеется их детальная морфо-функциональная характеристика. Кроме того, для этих целей может^быть использована первичная культура гепатоцитов, которая по маркерным синтезам первые 3 -4 дня не отличается от клеток печени in vivo, и на клетках которой удобно проводить прижизненные наблюдения и гистихимические реакции. .Цель и вадачи исследования.

Целью настоящей работы было выявление морфологических и функциональных особенностей темных и светлых гепатоцитов с помо1цью светооптических и злектронномикроскопических методов.

Были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительную характеристику морфо - функциональных особенностей клеток паренхимы печени на мазках и. срезах по следующим параметрам;

а) частота встречаемости темных и светлых клеток в зависимости от их локализации в печеночной дольке

ü) относительные размеры клеток

в) сравнение количества ДНК, РНК, общего белка,гликогена. а так хв уровня включения меченых предшественников ДНК и РНК в темные и светлые клетки паренхимы печени.

2. Используя первичную культуру клеток печени провести сравнительную характеристику темных и светлых гепатоцитов:

а) выявить гистохимическими методами, различаются ли •х-зихые и светлые клетки содержанием РНК, суммарного белка, нейтральных и связанных липидов. гликогена, кислых мукополм-сахаридов и гликопротеидов ь цитоплазме.

б) соавнить уровни включения меченых предшественников

viiOt СОЙ \jCJI >1 l éítir pVi Cit^UU В i СМПМЛ «4 l.DC 1 rfiXüA i С HQlUU'l

•г ах.

3. Сравнить биоэнергетические свойства темных и светлых гепатоцктов.

•4. Сравнить значения внутриклеточного рН темных и светлых гепатодатов в первичной культуре.

5. Выяснить, являются ли темные и светлые гепатоциты различными субпопуляцилми клеток или они представляют собой переменные клеточные состояния.

6. Используя первичную культуру гепатоцктов, выяснить природу более интенсивного окрашивания темных клеток.

Научная новизна работы.

В настоящей работе впервые предпринята попытка сравнения структурно-функциональных характеристик гелатоцитов и их тинкториальных свойств с поыоп&о метода картирования индивидуальной клетки. Используя картирование отдельных гелатоцитов удалось показать, что темные гепатоциты отличается от светлых высоким энергетическим потенциалом митохондрий и более активным синтезом АТФ. Наряду с этим установлено, что темные и светлые гепатоциты не являются рззличкьши сублопуля-цияии клеток, а представляют собой переменные клеточные состояния. различаггзяеея энергетической активностью. Культивируемые темные гепатоциты также, отличаются от светлых более высоким содержанием гликопротеидов и уровнем включения меченых углеводов в процессе синтеза гдикопротеияов в клетках. Впервые установлено, что темные культивируемые гепзтоциты обладают более низким значением прижизненного внутриклеточного рН, которое могкет меняться с течением времени и коррелирует с тиккториалъными свойствами клеток. Получены данные, из которых следует, что причиной болеа интенсивного окрашивания тем-

ккх клеток является большее количество карбоксильных групп белков.

Научно-практическое екачение работы.

Выполненная работа • в целом имеет теоретический характер и ее акачение заключается, главным образом, в выявлении структурно-функциональных особенностей темных и светлых клеток. Результаты работы, так»? позволили показать, что один и тот же гепатоцит моиет находиться в различных физиологических состояниях. сопровождаемых изменением уровня энергизации ьа;-тохондрий. уровнем прижизненного значения рК, уровнем синтеза гликопротеидов. что вероятно и определяет его способность в резной степени связывать краситель после фиксации. Таким образом показано, что использование простой окраски ыетиленовым синим может служить критерием оценки физиологического состояния клетки.

Апробация диссертационного материала.

Основные результаты были доломекы на межвабораторном семинаре Института биологии развития и ка XXI конференции молодых ученых биологического факультета МГУ (1990).

Публикации.

lio теме диссертации опубликовано 4 печатные работы.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, собственных результатов, обсуждения полученных результатов и выводов. Работа изложена на страницах машинописного текста и содержит фотографии, рисунков. и таблиц.

Список цитируемой литературы включает работ отечеег-u ¡ших и г.у,.убсжкых авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для сопоставления способности клеток окрашиваться с разной интенсивностью метиленовым синим с их морфо-функцчональ-ными особенностями все исследования проводили на картированных преЬаратах. что позволило по определенным параметрам охарактеризовать выбранные клетки.

1. Использовали клетки паренхимы нижней части правой доли печени половозрелой мыши линии С^А в возрасте 1,5-2 месяца, весом 20 гр.

Кусочки ткани печени фиксировали в 2.5 % растворе глюта-рового альдегида, приготовленном на 0.1М натрий калиевом фосфатном буфере рН-7,2-7,4, с дофкксацией в IX растворе ОвО^ или без нее. Исследования проводили на эпоновых срезах и на мазках фиксированных гае тек (КгизМпзку еЪ а1. . 1883), окрашенных метиленовыы синим.

Площади темных и светлых гепатоцитоз измеряли в условных единицах на светооптическом уровне с помощью объектиикромет-ра. Относительное количество ДНК на ядро темного и светлого гепатоцита определяли на мазках клеток нормальней печени на приборе №{0-7 методом логарифмического экрана ( Хруст и др. . 1978).Сухая масса белка оценивалась на интерференционном микроскопе измерением оптической плотности.

Для проведения ультраструктурного анализа отдельно взятых темной и светлой клеток использовали метод прицельного затачивания на индивидуальную клетку. Образцы оаиивали в эпон. используя стандартную для электронной микроскопии методику.

Пролиферативную активность темных и светлых клеток изучали на печени гепатэктомированых кивотных (Нigt? ins, Anderson, 1931). Мышей забивали через 24.32. 36.40.48 и 67 часов после операции. За- 1 час до забоя внутркбрюшинно вводили °Н-тишдин lmkk/r. веса( удельная активность 25 К/мМ) ( Косых и др. . 1990).

Уровень синтетической активности в темных и светлых клетках определяли по включению меченого предшественника син-

РНК ®Н-уркдина. Шли голодали в течение 48 часов, затем часть голодаших ыытей кормили и через 2- 3 часа после этого всех мьшей забивали. Контролем служили мьшш. регулярно получающие пищу. За 40 минут до забоя животным внутрибрюшикно вводили^Н-уридик 10 мкк/г. (удельной активности 25 К/мМ) (Косых и др. 1990).

В работе также использовали клетки первичной культуры

гепагоцитов. полученные из мыши и крысы методом двухэтапной

перфузии изолированной печени с использованием коллагеназк

(Heese, Bvard. 1981). Суспензию клеток в конечной кэнцентра-4 2

иум гепатоцитов 2,5 х 10 кл/см , высевали в среду Игла, содержащую 102 эмбриональной сыворотки и канамицин в концентрации 100 ыкг/мл. • Все исследования проводили на 2-3 день культивирования.

Выявление в клетках РНК. суммарного белка, нейтральных и связанных липидов, кислых ыукополисахаридов, гликогена, угле-водсодсржащих компонентов, активности лактатдегидрогеназы и глюкоао-б-фосфатдегидрогенаэы проводили по стандартным методикам (Пирс. 1962; Кононский. 1276). Комбинированную окраску белков и углеводов проводили проционовыми красителями, пред-ВГлрИТО л ьно обработав клетки амилазой (Иванов. 1SS25.

Для определения уровня включения меченых аминокислот и углеводов в темные и светлые клетки применяли метод аьторади-ографии. Кспольоовали Зй-лсйцин с активностью 10 мкк/мл ( удельная активность 25 К/мУ). Н-фукозу с активностью 100 икк/

3

мл (удельная активность 10.2 К/мЫ) и Н - маннозу с активностью 10 мкн/мд (удельная активность 10 К/мШ. Клетки инкубировали в среде с мечкннм предсэственниками в течение 1 часа.

Для измерения внутриклеточного рН испсдьяовадя метод при жизненней рН-метрик единичных клеток с поиоцыэ флюоресцентного красителя-флюоресцеиндиацетатаСФДАНЛитинская и др. .1984).

Оценку степени эн&ргизации метохсндрий проводили на основании интенсивности флуоресценции катионкого красителя родамина 123 (,1о1"<пзоп et al.. 1931). Для разобщения процесса окислительного фосфзрилирования в митохондриях культивируемых

гепатоцитов использоли протонофоры диннтрофенол (ДН2) в кок--3

цектрацли 1.5x10 М и трифтсрметоксикарбонилциаяидфвнилгидра-зол (ФКФ) в концентрации 5х10~^М

(ХчгуЛ уровэнь синтеза ШФ в культуре опрэдоляли по обцз-известной методике (Вегегпэуег. 1970).

Отщепление фзсфатных групп было проведено прочной фзс-Фатааой. Блокирование карбоксильных групп в клетках было проведено по стандартному методуС Ноаге. 1967).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУГДЕШ® I. Иэрфо-функциональные особенности темных и светлых клеток паренхимы печени ¿n sitv. 1.1. Темные и светлые клетт'. нормальней печени. Относительное количество темных и светлы:; гепатоцитса «э

различалось как в портальных, так и в центральных отделах печеночной дольки нормальных шаей и не аависило от пола особи. бвятой в опыт. Наши данные подтверждают результаты работ Яс-воина (1948). в которых указывается .что-в печени кроликов и морских свинок темные клетки довольно многочисленны и их относительное количество одинаково как в центральной, так и е портальной части дольки. Средние размеры темных и светлых ге-патоцктов в норме и при гепатэктомш не различались.

•Сравнивая ультраструктуру темных и светлы:', клеток, мы не обнаружили качественных различий в строении и локализации клеточных компонентов; темные и светлые клетки различались лишь плотностью гиалоплазмы. Наши данные вполне согласуются с результатами Бреслера и соавторов (1969).полученными на гела-тоцитах мышей линии СдНА. По содержанию ДНК в ядрах гепатоци-тов было обнаружено наличие трех основных классов клеток: 2, 4. и 8 с. Относительное содержание меток с различны/, количеством ДНК в печени исследованных нами ыьакей согласуется с данными литературы ( Бреслер и др. , 1969; Бродский и др. . 1973). Сравнение тинкториадьных свойств гепатоцитов и количества в них ДНК показало, что темные и светлые гепатоциты в равной степени могут принадлежать к любому классу плоидности. Сравнение интенсивности окраски клеток на РНК и их окраски мзткленовым синим показало, что тинкториальные свойства клеток не связаны с содержанием в них РНК.

Измеряя сухую массу белка в гепатоцитах с помощью интерференционного микроскопа, ш выявили клетки с различным количеством белка. Однако, после окраски метиленовым синим оказалось, что клетки с высотам и с низким содержанием белка г- цитоплазме могут б равной мере относится как к темным, так

к к светлым клеткам.

Таким образом, по локализации в печеночной дольке, по размерам, по количеству ДНК. РНК, сухой массе белка темные и светлые клетки не отличается друг от друга в нормальной печени.

1.2. Шпень гепатзктомироваиных животных.

Для определения различий в пролиферативной активности темных и светлых клеток был проведен опыт с частичной гепа-тэктомкгй печени. Шми было обнаружено, что в период регенерации печени (через 31 - 64 часа после гепатзктсмш!) шгсло темных ¡слеток увеличилось в среднем на 10 - 152. а число светлых соответственно уменьшалось. Показано. что после гепа-тэктсмии б синтетический период клеточного цикла вступали как светлые, так и темные гепатоциты и синтез ДНК отмечайся ttaic в одноядерных, так и двуядерных светлых и темных клетках. Показано. что к 64 часам после гепатэктошга количество двуядерных светлых i слеток снижалось примерно с 40% до 102, а количество двуядерных темных клеток уменьшалось примерно на 11%. Е то же время количество одноядерных светлых клэток увеличиваюсь с 21 до 42%, а одноядерных темных клеток с 17 до 30£. Эти результаты не противоречат литературным данным об относительном количестве одно- и двуядерных клеток в печени после гепатэк-томни (Buchner, Clines. 1950: Бродский. Урызаева, 1981). В регенерирующей печени мьапей фигуры митотичеекого деления выявлялись лишь в гепатецитах со светлой цитоплазмой.

Полученные данные свидетельствуют о том, что темные и светлые клетки в равной мере способны к синтезу ДНК, однако митотические фигуры характерны только для светлых клеток.

1.3. Печень яря различных функциональных нагрузках.

- 10 -

Чтобы выяснить, изменяется ли функциональная активность темных к светлых клеток при длительном голодании мывей, определялся уровень включения печеного предшественника синтеза

3

РНК, П-уридина. Установлено, что у контрольных мышей, находившиеся на голодной диете,• а такие у голодных ыьшей после кормления уровень включения Зй-уридина в темные и светлые клетки не различается. В последних работах (Санович и др., 1981) на нервной ткани представлены данные, которые согласуются с нашими результатами.

Таким образом/ интенсивность синтеза РНК в темных и светлых гепатоцитах не различается как в норме, так и при функциональных нагрузках.

IЬ Изучение гепатоцитов в первичной культуре ткани.

11.1. Гистохимическое .и авторадаографическое изучение темных и светлых клеток.

Важным показателем функциональной активности клетки является содержанке в-ней белка и интенсивность белкового синтеза.

При выявлении белка гистохимическим методом была обнару-йена гетерогенность клеток по интенсивности окрашивания. Однако сопоставление иктенсивностей окрашивания одних и тех яе клеток бра (/.феноловым синим и метиленовым синим показало, что тинкториальные свойства гепатоцитов не. связаны с содержанием а них белка. Дгя подтверждения вывода о том, что темные и светлые гепатоцитьгне различаются по содержанию белка, бал проведен эксперимент по включению в культивируемые гепатоциты

■5

П-лейцина и установлено, что различий б интенсивности включения меченого предевственника белкового синтеза в темные и сш-тлыс,- клетки не наблюдалось.

- 11 -

Гетерогенность окраски такие была обнаружена при гистохимическим выявлении РНК. связанных липидов и гликогена. Од-совпадений по интенсивности окрашивания клеток на укззакные вещества и ыетиленовьм синим такие не отмечено. Вместе с тем. интенсивность окрашивания реактивом Шиффа, по РАЗ-методу и толуидиновкм синим с предварительной обработкой амилазой полностью 1 совпадает с интенсивностью окрашивания их метилековым синим, что позволяет предположить, что темные клетки более богаты гликопрэтеидами и гликолипидамя (Пирс. 1962; Кононс-кий. 1976).

Чтобы проверить это предположение, клетки окрашивали проционовыми красителями для выявления гликопротеидов ( нов, 1982). Было установлено, что степень окрашивания клеток на гликопротеиды совпадала со степень« окрашивания метилековым синим. Зти данные позволяют предположить, что в цитоплазме темной клетки содержится большее количество глнкопротеи-дов, чем в светлой.

3. ч.

Наши результаты по включении гЬфуксзы и тН-маннозы в

клони первичной культуры гепатоцитов показали, что в темные клетки включается в 1.6 раза болызэ меченой фукозы к в 1.6 раза больше меченой манноэы. чем в светлые, что подтверждает данные гистохимии о большем содержании углеводсодержаиих соединений в темных клетках. Необходимо также отметить, что фу-коза является стабильным углеводом, избирательно вклачакгаимся в х'ликопротеиды гепатоиитов и локализующимся на концевом участке углеводной цепи макромолекул ( ЕеппеЬЬ. ЬеЫспО.

1971). На основании полненных нами данных о тем, что вкл.кче-3

кие Н-фуковы в гликопротеиды выпе в темных клетках, и данных

литературы можно предположить, что г темных клетках синтегв-

- 12 -

рует'ся больше гликопротеидов.

Учитывая то обстоятельство, что основная часть шукоэы включается преимущзетвенно в гликопротеиды крови (Векез1. У1и21ег, 1967), а также сведения о том. что 80% гликопротеи-дов. выделяемых в кровь, синтезируется клетками печени ( Альберте и др. 19Б5 ), мы предполагаем, что в темных клетках Синтезируется большее количество гликопротеидов плазш крови.

Из установленных фактов следует, что в первичной культуре темные и светлые гепатоциты не отличается по общему содержании белка к по вклгочешш в кэго ^Н-лейцина; в то ие время темные клетки более интенсивно окрашиваются гистохимически на гликопротеиды и более интенсивно ьключаш меченые фукозу и макнозу.

Ультраструктурный анализ отдельно взятой темной и светлой клетки культуры гепатоцитов не показал качественных различий в строении и локализации клеточных компонентов, вместе с тем позволил выявить более плотный матрикс цитоплазмы темных клеток.

П. 2. Биоэнергетические характеристики темных и светлых гепатоцитов.

Для сравнения уровней энергетического состояния митохондрий в кивых темных я светлых клетках использовался флуоресцентный краситель родамин 123, интенсивность свечения которого в митохондриях зависит от уробня их ■ энергиэацпи ( .¡с;пзоп еЬ а1. . 1981; СПеп еГ. а1. , 1982).

Опыты показали, что окрашенные родамином клетки очень гетирогенна по интенсивности флуоресценции митохондрий, Сравнивая интенсивность свечения митохондрий в клетках и их ткнк-ториалькыа свойства после фиксации било обнаружено, что гепа-

тощггы о низким уровнем свечения принадлежали к клеткам светлого типа, а с высоким уровнем свечения к клеткам темного типа.

Нами было показано, что в темных клетках повышена активность лактатдегидрогеназы по сравнению со светлыми клетками. В то ж время, в светлых клетках выявляется более высокий уровень1активности глшозо-6-фосфат дегидрогеназы. По нашему мнению повышенная активность лактатдегидрогеназы в темных («етках мохет быть связана с увеличением потребностей зтих клеток в пирувате, который, как известно, идет непосредственно на' окислительное фосфорилирование в митохондриях.

Данные о повышенной активности в светлых клетках глккозо -6-фосфатдегидрогеназы - ключевого фэриента пентозофосфатного пути, с нашей точки зрения, позволяет предположить, что светлые клетки имеят менее экергиэоашшые митохондрии по сравнению с темными.

Дяя проверки наиего предположения о более высоком энергетическом потенциале митохондрий в темной клетке, на гепато-циты, предварительно окрашенные родамином 123, подействовали разобщителями окислительного фосфорилирования. После того, как во всех клетках интенсивность флуоресценции снизилась до уровни фона, препараты зафиксировали и окрасили метиленовым синим. Оказалось, что все клетки стали светлыми. Этот эксперимент, с одной стороны, подтвердил наш данные о более высокой степени экергиэации митохондрий в темных клетках по орав-неш'ю со светлыми клетками, а с другой стороны показал, что возмолвн переход митохондрий в клетке из высокознергетичэско-гэ состояния в ннзкоэиергетическое и соответственно переход темных ¡метек в светлые.

- 14 -

О возможности перехода темных клеток в светлые свидетельствуют данные динамики изменения клеточного состава популяции гепатоцитов в культуре. Проводя оценку клеточного состава популяции по тиикториальньа: свойствам на 1. 2, 4 и 7 день культивирования, нами установлено, что количество темных клеток в популяции уменьшается с Бб до 10%, то есть количество клеток с выаоанергетическим состоянием митохондрий уменьшается.

Чтобы получить более убедительные данные о высоком энергетическом уровне митохондрий в темных клетках, а также возможности перехода темной клетки в светлую, был проведен опыт с воздействием ка клетки ионофора кигерицина с последующим воздействием протоиофора.

В начале эксперимента мы окрашивали популяцию гепатоцитов родамином 123 и выбирали определенное поле зрения, в котором клетки с флуоресцирующими митохондриями составляли около 40 - 45%: в некоторых клетках митохондрии не были видны совсем. Далее, одновременно вводил! в среду культивирования родамин 123 и нигериции. и после отмывания клеток от реагентов было обкаруляно, что часть светившихся клеток увеличила интенсивность свечения, в то газ время не светившиеся ранее становились фгуоресцимруюциыи. Вместе с тем., часть клеток так и остались не флуоресцирующими. По nasal данным около 15 - 20 £ клеток увеличили интенсивность свечения около. После воздействия протонофором ФК1' на окрашенную таким образом культуру, интенсивность флуоресценции снижалась до уровня фона и посла фиксации и окраски все клетки выглядели светлыми. Из этих данных мокко сделать вывод, что теыкыэ клетки действительно имеют более высокий энергетический уровень митохокд-

рнй, чем светлые. На основании данных литературы ( Скула-:ез, 1989). что интенсивность свечения родамина о митохондриях яа-висит от трансмембранного потенциала, то есть его составляющей, которая связана с конным обменом, а таю© собственных результатов, что лишь незначительная часть клеток изменила интенсивность флуоресценции при воздействии нигерицииа, можно предположить. что темные и светлые клетки различается не только уровнем энергизации митохондрий, но и интенсивность» синтеза АТФ в клетках. Шжно такле утверждать, что переход из темной клетки в СЕетлую возможен.

Другим вамшм вопросом, на который мы попытались ответить. состоял в следующем: возможно ли повышение уровня энергизации митохондрий в светлой клетке и переход ее в текшую, другими словами существуют ли циклические колебания уровня, энергшзации митохондрий в плетках и свяеешныэ с ними изменения тинкториальных свойств клеток?

В литературе представлены многочисленные данные об околочасовых ритмах в клетках активности синтеза белков, ферментов, гормонов, вначений внутриклеточных рН и других параметров (Бродский. Нечаева. 1988). В частности на синхронизированной культуре китайского хомячка. были обнаружены колебания уровня активности дактатдегидрогеказы (Klevecz. 1969; Gilbert. 1974) и ритмические изменения уровня активности глзокозо-6-фосфатдегидрогекази ( Klevecs. Ruddle. ]S58: Gilbert. Tsilintras, 19в1). По нааим данным в темных и светлых гепзтоцитах существует различия в активности этих ферментов. 8ти данные позволили нам высказать гипотезу, что гепатоцит мо»?т иметь в разные периоды времени различные тинкториалъные свойства и находиться на резных уровнях энер-

гнэации митохондрий. Длительные наблюдения за динамикой изменения интенсивности флуоресценции родамина 123 в митохондриях клеток позволили обнаружить, что у части клеток, активно накопивших краситель, через некоторое время интенсивность флуоресценции саштно снижалась или утрачивалась полностью полностью. У другой жа части клеток, ке светившихся изначально, интенсивность флуоресценции постепенно нарастала и могла достигать максимального уровня - эти клетки относились по ткик-ториальным свойствам к гепатоцитам темного типа. Колебания интенсивности флуоресценции в одной и той же клетке говорит с том. что тешше клетки, теряя высокий уровень энергизации митохондрий, цогут переходить в светлые и, повышая энергетический уровень их, вновь становиться темными.

На основании результатов, полученных в опыте 'с воздействием нигерицина, мы предположили, что темные и светлые клетки различаются не только внергетическим потенциалом митохондрий. но и интенсивностью синтеза АТФ. Поскольку недавно было продемонстрировано существование ритмов уровня АТФ в первичной культуре гепатоцитов (К*гавицкий и др.., 1989), логическим продолжением наших исследований стало сопоставление результатов биохимического и цитологического анализа и поиск корреляции меаду общи« уровнем синтега АТФ и изменением относительного количества темных клеток в одних и тех ке культурах, на одних и тех зйэ сроках. . Исследования показали, что в культуре клеток в течении всего эксперимента меняется соотношение темных к светлых клеток. Построенный по полученным данным график изменения во времени относительного количества темных клеток в культуре представляет собой кривую с периодом колебания около 60 минут и амплитудой 10 - 20%. Сопоставляя кривую из-

мененкя количества темных клеток в культуре и кривую изменения уровня АТФ, установили, что они практически совпадают (рис. 1).

Рис. 1 Изменение общего уровня АТФ (1); изменение относительного количества темных гепатоцитоз (2) в культуре (левая ордината - АТФ на 1 мкг ДНК, правая ордината -X те мши клеток).

Таким образом, на основании полученных данных можно сделать вывод, что происходит увеличение числа клеток с высокоэ-нергизованными митохондриями ( темные гае тки), которые способны к активному синтезу АТФ. а не активация всей популяции ¡меток. Эти данные татае согласуются с нашими результатами, полученными с использованием нигерицина. из которых следует, что при воздействии ионофора активируется трансмембранный потенциал лишь у незначительного числа клеток, а остальные 1сак светящиеся, так и не светящиеся клетки не изменяет (или изменяют незначительно) степень энергизации. Поэтому могега утверждать, что яркое свечение митохондрий в темных ¡метках связано не с перераспределением ионов, а с субстратным окислением. результатом которого является активный синтез АТФ.

- 16 -

Периодичность измоне-кия числа клеток в популяции, способных активно синтезировать АТ.Ф. по всей вероятности может страгсатъ и периодичность функциональной активности гепатоци-тов - .паление и возрастание в них уровней специфических, синтезов. что согласуется о нагим предположением об увеличении специфического. для печени синтеза гликопротеидов в темных клетках.

11. 3. Значониз прижизненного внутриклеточного рН геаатсцитов.

: Как нами было показано ранее, в темных клетках активность л&.кт атде гид роге нзз ы значительно ъыае. чем в светлых, и наоборот, в светлых клетках более высокая активность глюкогоб ••■ ^осфатдегидрогеиаэы. Из литературы известно, что оптимальной активности ^большинства ферментов соответствует определенная область аначзянй рН: \-.для лактатдегидрогенаэы рН оптv.:.с/и лелея? меа-ду 6.G и 7.5. а для глитазо-б-фосфагдегвдрогеказы мевду 7. й и 6,0.' причем большинство ферментов изменяют свою активность поп незначительном увеличении или уменьшении рН ( Цусил и ДР. . 1931).

Поэтому было решгно выяснить., нет. ли различий в прижизненном, внутриклеточное значении рН цитоплазмы темных и светлых клеток. Наши измерения показали, что среднее значение рК цитоплазмы • темных клеток несколько сдвинуто в кислую сторону и составляет ь среднем 6.С, ь то арсуя как рН цитоплазмы светлых клеток'приближается к 7. Эти результаты согласуется с данными Ялтинской и. соавторов (1&Б7); котэрыэ показали на ге-патоцитах крысы . что внутриклеточное рН в клетч:ах может варьировать от 6.6 дс 7,3. га авторами г клетках ки-

тайского хомячка была обцаругана вариабельность значений

- 19 -

внутриклеточных рН от 6.4 до 7.7.

В связи с тем. что многие параметры могут подвергаться колебаниям, была определена динамика изменения прижизненного внутриклеточного рН цитоплазмы гепатоцитов. Наши результаты показали, что внутриклеточное значение рН в культивируемых гепатоцитах не является постоянным, а колеблется с амплитудой 0,5 - 0.7 (при погрешности метода 0.16). Поскольку ранее нами было обнаружено, что темные и светлые клетки имеют разные внутриклеточные рН. то можно предположить. что эти колебания связаны с колебаниями энергетического состояния митохондрий и изменения уровня синтеза АТФ в гепатоцитах. а также с их тинкториальными свойствами. Для проверки этого предположения мы сопоставили значения рН клеток в конечной точке измерений и их тинкториальные свойства после быстрой фиксации и последующей окраски клеток метиленовым синим. В 80% случаев клетки. значения рН которых было близко к 6,5 оказались темными, а клетки, рН которых приближалось к 7 - светлыми. Поскольку из графиков колебаний значения рН видно (рис 2). что резкое изменение значения рН монет происходить в течении 3-5 минут, можно предположить, что в 2QZ. случаев значение рН могло измениться эа время удаления среды из камеры наблвдения и Фиксации. Вместе с тем. такой высокий процент совпадения, при котором клетки с более кислым значением рН имели интенсивную окраску метиленовым синим, и наоборот, клетки с нейтральным значением рН имели более светлую окраску в конечной точке на-шх измерении, подтверждает ранее полученные нами данные о том. что изменение внутриклеточного рН сопровождается изменением тинкториальных свойств клеток. Поскольку изменение внутриклеточного рН является одним из важных элементов в слокнай

системе регуляции клеточного метаболизма, можно представить, что в темных клетках при увеличении уровня энергивации митохондрий и активного синтеза АТФ происходит изменение внутриклеточного рН. который -в свою очередь оказывает влияние в целом на клеточный м&таболивм.

Ркс. 2 Динамика значений прижизненного внутриклеточного рН ь культивируемых гепатоцитах.

11. 4. Природа тинкториальвых различий гепатоцитов.

Чтобы дать определенный ответ на вопрос, почему часть ¡■теток в популяции скрашивается более интенсивно, был проведен эксперимент на фиксированной культуре гепатоцитов. в котором клетки окрашивали штиленовым синим с различными рН от 3 до 11. В результате оказалось, что только при окраске ¡слеток красителем с рН выше 7 выявляются клетки с разной интенсивностью окрашивания. Интенсивность окрашивания гепатоцитов другим катиоиным красителем-родамином 123 при щелочных рН совпадала с таковой метилекопим синим. На основании полученных г«-."'УЛьт:лтов можно предположить, что за более интенсивное

окрашивание клетки, отвечают кислые группы макромолекул, скорее всего белков.

Поскольку в опытах с разобщением окислительного фосфсрилирования темные клетки превраидлись в светлые в течении нескольких минут, то мокко предположить, что энергетические изменения клеток сопровождались изменениями внутриклеточных рН и вызывали конформационныэ изменения макромолекул и в первую очередь белков. Гйэи этом белковые молекулы могут изменять свои конформацию, обиалая кислые карбоксильные группы. После фиксации глютаровым альдегидом такая конфэрмация закрепляется и при окраске карбоксильные группы з темных клетках становятся в большей степени доступны для взаимодействия с положительно заряженным красителем, таким как ыетиленовый синий или катионный краситель родамин 123. Результаты наших опытов с обработкой клеток щелочной фосфатовой свидетельствуют о незначительном влиянии дефосфорилирования на степень окраски, однако ш не молем полностью исключить вклад фосфатных групп в Солее интенсивное окрашивание темных клеток.

Чтобы выяснить роль карбоксильных групп белковых молекул в окраске клеток, было проведено блокирование их на фиксированных препаратах ( Ноаге, 1967). После повторного окрашивания кетиленовым синим различий в интенсивности окрашивания клеток не обнаруживалось - все гепатоциты становились светлыми. Это доказывает, что наше предполотаине о важной роди карбоксильных групп белков в интенсивности окрашивания темных и светлых клеток правильно.

Ранее нами было обнаружено соответствие между интенсивностью окраски темных и светлых клеток метиленовым синим и плотностью гиалеплазиы этих клеток на улътрзтонксм срезе. Ос-

таэтся неясной причина более интенсивного окрашивания одних клеток по сравнению с другими на электронномикроскопическом

уровне.

Чгобы выяснить на каком этапе приготовления препаратов для алектронной микроскопии начинают выявляться различия в интенсивности окрашивания темных и светлых клеток, просматривали неокрашенные среэы, сревы липь контрастировашше урани-лацетатом, или только окралккные по методу Рейнодьдса. Было установлено постепенное появление равдичий в интенсивности окраски темных и светлых клеток. Совместное же контрастирование ткани уранилацетатом и солями свинца. по методу Рейколь-диа. давали наибольщую разницу в плотности окраски темных и светлых клеток, видимую в электронный микроскоп.

По-видимому, эффект контрастирования заключается в том, что катион уранила связывается с карбоксильными и фосфатными группами, а компоненты, входящие в состав красителя Рейноль-дса. образуют соединения с карбоксильными, фосфатными и суль-фгвдрилькыми группами, а также, с окисью осмия (Гайер, 1974).

Из полученных результатов можно сделать вывод, что различия в интенсивности окраиивания темных и светлых клеток на световом и электронном уровне связано, по-видимому, с большим количеством демаскированных карбоксильных и небольшого количества фосфатных групп доступных для красителя. Это может быть связано с изменением конформации белковых молекул в зависимости от внутриклеточного рН. которое сопряиено с увеличением энергетического состояния клетки, а так»» увеличением синтеза АТФ. В тоже время, темные клетки содержат больвее количество гликог.ротеидов. вероятнее всего идущих на экспорт, чти связано, по-видимом!', с более высокой синтетической ак-

тивиостыо этих клеток.

ВЫВОДЫ.

Исследования структурно-функциональных особенностей ге-патоцитов. проведенные на срезах и мазках паренхимы печени мыши и в первичной культуре гепатоцитов мыши и крысы позволяют сделать следующие выводи:

1. Тёмные и светла« клетки встречается во всех отделах печеночной дольки и не различается по размеру.

2. Темные и светлые гепатоциты не отличаются по уровню синтеза ДНК, РНК и белка, а такие по содержанию ДНК, РНК, белка, нейтральных и связанных, липидов, гликогена и кислых мукополисахаридов.

3. Оигуры митотических делений при частичной гепатзктсмии встречаютя лзшь в клетках со светлой цитоплазмой

4. В электронном микроскопе как темные, так и светлые клетки характеризуются сходными чертами строения и локализации клеточных компонентов ; различия состоят лить в большей электронной плотности гиаяоплазмы темных клеток.

Б. Темные гепатоциты отличаются от светлых более высоким содержанием гликопротеидов и уровнем включения меченых углеводов в процессе синтеза гликопротеидов .

6. Темные гепатоциты в культуре ткани отличаются от светлых высоким энергетическим уровнем митохондрий и более активным синтезом АТФ.

?. Темные и светлые гепатоциты не- язляотсл двумя различными субпопуляциями, а представляют собой клетки, находящиеся в переменных клеточных состояниях, связанных с энергетической активностью."

8. Точные гепатоциты обладают более низким прижизненным

е-, качением внутриклеточного рН, который мокет меняться - увеличиваться при переходе темной клетки в светлую.

9. Причина более интенсивного окрашивания клеток, веро-

*

¡'.1 но. заключается зз большем количестве демаскированных карбоксильных групп белков, доступных после Фиксации к взаимодействию с красителем.

Список работ,опубликованных по теме диссертации

1. Косых 1С Я. Коломина С. ¡1 , Чепцов Ю. С. Некоторые структурно функциональные свойства светлых и темных гепатоци-тов мгшгй//Биолог, науки. - 1830. - Т. 319. ¡¡V. - С. 46-Б2.

2. Косых М. 11 . Ченцов Ю. С. Биоэнергетические свойства "темных" и "светлых" клеток//ДАН СССР - 1991.- Т.316. N2. -С. 475 - 478.

3. Нечаева Н. В. . Косых ПЛ.. Новикова Т.Е.. Чеицоз

B. С. ,Юровицкий Совпадение энергетической и морфологической динаьаки гепатоцитов в культуре/УДАН СССР - 1991.-Т. 316, N5.-

C. 1147 - ИБО.

4. Яэеых М. И. . Ченцо» Ю. С Гистохимические различия темных и светлых гепатоцитов в первичной культуреУ/Проблемы современной биологии: Тр. 21 науч. конф. мол. ученых биол. фак. МРУ.5А , ВЙНКТИ. 1990. - Ч. .-С.