Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ультраструктура и трехмерная организация ядрышек гепатоцитов мыши при одноразовом воздействии гепатоканцерогенном диэтилнитрозамином

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Ультраструктура и трехмерная организация ядрышек гепатоцитов мыши при одноразовом воздействии гепатоканцерогенном диэтилнитрозамином"

ТБИЛИССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫ!! УНИВЕРСИТЕТ им.И.ДЕАВШШВИЛИ Биологический факультет

На правах рукописи

МДИВАНИ Тея Вахтанговяа

• УДК 576.3

УЛЬТРАСТРУКТУРА И ТРЕХМЕРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЯДРЫШЕК Ш1АТОЩГГОВ МЫШИ ПРИ ОДНОРАЗОВОМ ВОЗДЕЙСТВИИ ГЕПАТОКАНЩРОГЕНОМ ЩЭЩНШОЗШт '

03.00.11—эмбриология, гистология, цитология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискацие ученой степени кандидата биологических наук

ТБИЛИСИ-

1992

г Работа выполнена в лаборатории биологии развития Тбилис-, ок'ок государственного университета и лаборатории синтезе биологически активных .веществ Тбилисского НИ11 виноградарства, садоводства и виноделия Академии сельскохозяйственных наук Грузин .

•

Научные руководителя: доктор биологических наук, профессор Г.Д-.ТУШНЙШИИ доктор технических наук, профессор Л.А.МУД231РИ

. Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор М.Д.ГЕЩЕВАНЖШ'ШИ доктор биологических наук, профессор Г.К.ГООТОДЗЕ

Ведущее учреждение: НИИ экспериментальной морфологии им.А.Н.Натишвиля АЛ Грузии

Байта диосертации состоится " " V 1992 г.

в час. на заседании Специализированного совета

К 057.03.17 по защите диссертаций на соискание ученой степени, кандидата наук при Тбилисском государственном университете им.И.Джавахишвили по адресу; 380029, Тбилиси, ул. Университет- • екая, 2, биологический факультет Т1У им.К.Джавахишвили.

..Автореферат разослан "8" / 1992 г.

Учвньй секретарь , .

Специализированного совета, »

кандидат биологических наук Н.Ц.Цинцадзе

I. ВЗШ2Ш

Актуальность пообломк. Структура ядрршка относится к ос-нойнкм морфологическим критериям, дспользуеиш для определения различай в функциональном состояния клеток в процессе роста, дифференцирован, мятотическом цикле я т.п. 3 структурной организации ядрншка отракэни основные этап» молскужяриюс ссбктий. огя-занкнх с биогенезом рибосом, что создает предпослали для визуального наблюдения за -экспрессией одного яг< главных зяоньев ге-яош эукаряот. По степени развития л топографии ядрь\л!;оЕкх компонентов судят об интенсивности синтеза, иропессиига и транспорта прэрибссом {Goessenr , 1984;Нsuljiolov ,1355; Hernandez-Verdun, IS86; Zaisepina e-t ai,IS88, Г9В9). Согласно ме'кдуяарод- • вой номенклатуре» выработанной на Европейских совещаниях по структуре и функциям ядригЖа, принято различать следующие ядрыл-ковыэ .компонента:

- ф и б р _и л л я р н к .э центры (СЦ) - структуры, содерзсаяша рДНК и балки, соответствующие ЯО^ млтотлческих хромосом; ' j

-плотннй $ и 6 р и л л я р н кй компонент (ПСК), лрэдетавленннй РНП-фибриллаш толщяно-л 4--S ям, в состав которых входят яовоскнтезиоованпая пре-nPHK и болкг:;

- г р а н у л я р я ы й компонент в виде РНП-частнц диаметром 10-25 нм представляет собой прерпбосомк из разных этапах созревания;

- О К О Л О- Я В Н У ! Р 2 Я 3 ? IJ II Ч О 2 ? !i X р С -

м а т я н образован Д^Я-фибриллами дяамзтрсп 20-30 ну; внутра-лдрышкозыЯ х рогатик структурно связан с ЗЦ;

- я д р н ш к о в н'-э в а у'с л и (лакун;:) - сэзтлго зонн внутри ядрншка, материал которкх по структуре не отличим от нуклеоплазмы; предполагает', что вак?/олярн!гЛ иог/локент .\ю:.*.ет принимать участие в' депонировании, лрецвеелнге и транспорте рРНП.

■Ядрнако, вследствие динамичности его ультразтруктурц, аи-рско используется б качестве морфологического критерия при стенке карупенпй процесса биогенеза риооео:.: при ле:":стг;::н я а г.'с? г/ экзогенных факторов химической природ/.'. 3 это?,; плане больгоГ: интерес как с обшебиологических, так и а ^ьпихо-блолсгичсскмс позиций вь'зива-ст различите химические соединения, с^адат'днс кап-цэрогеннкмя свойства.-,':!. Многие1ns них "cnoco-ik.» плият:» на скорость

продукции срерпбосом, вызнвея при этом оудэстчонные изменения в структуре ядршщ& (Hadjiolov , 1955¡Hernandez- Verdun ,1986; Ло-

маган, 1987 л., ' .

Одной из наиболее ишроко распространенных моделей идя изучения индуцированного канцерогенеза является печень грызунов, после действия наиболее эффективных гепатоканцерогенов, таких как диэтилкитрозамин (ДЗНА) ( Solt.Parber.I97G; Банников, 1981,1986; Захарова,1087).

Несмотря на обилие работ, посвященных изучения механизмов действия химических канцерогенов (2 том числе и. ДЗНА) на клеточном а субклеточном уровнях, целый ряд принципиальных вопросов остается нерссеннюл. X их чцолу б парную очередь следует отнести вопрос о специфичности действия на ультраструктуру ядркпка этой группы химических соединений. Кроме того, для понимания механизмов опухолевого роста существенно 'установить, какая кз популяций клеток ткеки, допворгшейся действию канцерогена, претерпевает злокачественна трансформация. Есть все основания полагать, что ' источником новообразований являются клетки, сохранившие ?.изнеспособность после воздействия канцерогеном в дозе, способно;' -вызвать частичный некроз ткани. Однако неизвестно, визигает ли действие канцерогенов какие-либо специфические изменения япрвиек.на основе которых мог.но било бы выцедить группу клеток с -морфо-фушщионалышкл нарушениями, способными в дальнейшем стимулировать неолластическлй роет. Точно так не не прослежена судьба клеток, которые в результате одноразового воздействия канцерогеном обнаруживают признаки нарушения -нормального хода биогенеза ' рибосом. Неясно, происходит ли в дальнейшем нормализация функций ядрышка и. слзповательно, клеточного метаболизма, или же часть родвзргаихся воздействия клеток погибает. В целом могшс сказать, что особенностям структурной организации и функциональней активности яйрневк в лренеопластичеекяй период не удалялось долгого е.чимйнкя. 3 это ке время, пренеопластические шрфофулкционалыше изменения гепатоцнтов привлекают все больший интерес (Barbason et al, 1975; Ogawa et al,IÔRO;Farber ,1960;Pitot .Sirica, X980;?ereino et al, 1983,1984). ■'

Анализ отечественной и зарубекноК лит-ературь: последних лет по:«'П:;вэет, что среди суг'.остдузмцих подходов к исследованию структур!: ядришга наиболее ин^ерматпвньк признан стереодогичсс-кк'' анализ в сочетании с количественной олектрончо": микроскопией.

При этом успешнее всего применяется трехмерная реконструкция о ломоцью -серийных ультратонких срезов (аоеезепе,1984;га-Ьзер1па вt а1,1983,1989; Чаищзо, 1990).

Нвль и задач;: работ;:. Основной цедыс настояае"; рабстн било изучение трехмерной организации ядршек и динамики перестроек его компонентов в условиях одноразового газдойсж'я одного из широко применяемых гепатокэнцерогенов - ДГНА на нормальные и пралиферируетдее гэпатоцитн мши в ирензодластическиА период. Поставленная задача решалась па основе стереологетеского и мор-•- йометрстеского анализа объемних изображений ядрышек, полученных методом серийных ультратонких срезов.

"Уонкретане задачи работ» состояли в следующем:

1. Установить главные закономерности трехмерной организации и определить осноеныо количестванчке параметры ядршек нормально функционирующих гепатоцптов шиш.

2. Описать динамику изменений пространственной организации' к изучить количественное параметры яаркшек рогенерирутедпх гепа-тоцитов.

3. Провести стерзологическое л кор1юкетричсское изучение яаршэк и охарактеризовать особенности их ультрастр! ктурной организации в нормальных и регенерирующих гепатоцьтах, лодвергшгх-

• ся одноразовому воздействия ДЭНА.

Одной из важных медико-биологических проблем, троко об-сучдакдейся в литературе, является поиск путей и средств <Тзруа-кологдческой профилактики опухолевой патологии, Б ото;,: плане все больиее внгсйадо привлекает особая группа бзологлчепка ак-тивнкх веществ, таких как экстракты элеутерококке.,- корня г.еныне-яя и др., обьеаяяекнцг под названием, авдатэгекг (Ер сх:.:а я, 1968). Это слогике комплексу биологически еятавню: соедицбкай растяч-ель-пего ила тшзотного происхождения, оказквакше защитное али стл-. г.зглярущее действие на различные 'уйкцлп организм человека (Брех'/анДЗбВ; ДардыювД981; Адскеакпров,1ЭС4; Г/зла ма п др.. 1986; Ерплис и др. ,1987). Б накоторкх работах стуг^алпсь ентг-йластогсшше свойства ряда адяятегеног- (Грлбадь я др. ,1985; ."г-пг.н, Целевая,19С8; Грабе;1Ь,1=г>4,1050), что делает перспектиг.:«-.' дальнейшее г-зучеяао клеточных л субхютсчпух аспектов -¿х. П 1-х свойств.

Одг.:; из адаптогеяов - хгс-ярж: - £<~л яиг.ояея я «слояоган в Лаборатория синтеза биологически сп:т:1£,?г~ ввести Тб-.у;ясского

НИИ виноградарства, садоводства и виноделия Академии сзяьскохо-вяйстпокянх наук Грусии. Исходя из ввиескзэанного, предстаачяет-ся целесообразным изучения этого препарата о целью прог«рки его вогмоглкх антяЗластогепних свойств. Поэтому на данном этапо ъа-бот« в задачи исследования входило:

1) охарактеризовать действие адаптогена аапряма на ультраструктуру 'регоасрярувтих гопатоцятов;

2) охарактеризовать действие ¿ЗЫА ьа ультраструктуру регенерирующих печеночных клеток на фоне хронического введения адаптогена .капрмма.

Научная новизна. Получен ряд принципиально новых фактов, • открывающих основные закономерности изменений морфофункцзональ-ной организация япрниек нормальннх и регенерирующих гепатоцитов миши, вызываемых одноразовым воздействием ¿¡ЗНА. •

Среди новых результатов, е первую очередь, мояно выделать следующие. (I). Получена детальная картина динамики перестройки трехмерной организации при переходе ретикулярных и вакуолизярс-ванннх якрнаок в нуклеолонемные ядрышки, озоРственнне регенерирующей почени. (2). Определены основные количественные параметры структурных' компонентов указанных типов ядрышек и установлена Закономерность та изменений прй переходах из одного типа в другой. (<<). Установлено, что после обработай регенерирующих гепато-цйтов ДЭНА, даке при отсутствии гистологических признаков прс-неогластического роста, мозшо обнаружить группы клеток с нетипичной для гепьтоцитов мишя структурой ядришка, (4). Стераолоуи-ческяЕ анализ позволил выявить ряд особенностей объемной организации и количественных .параметров ядрышек гепэтоцитов, обработанных ДЭНА. (5). Существенном представляется обнаружение на ранних сроках действия ДЭНА факта снижения количества некротических и ' патологически измененных гепатоцитов у животных, котором за 3 неделя до операции еяаоневао.вводили капрям, что может указывать на гопатопротекторнне свойства этого препарата.

Практическая ценность работы. Результаты отереслогического я мо а'я метргч ее ко го анализа ядрышка могут использоваться в целях оценки уровня синтеза рРКК в норме и при различных ■ патологических процессах. Лаяние, полученные при изучении огруктурной органя-. вацнй ядрылек гепг.тецитов, подвергшихся одноразовому воздействию ДЭПА,- ;/огут быть использованы .для выявления популяции феко-типически измененных клеток на ранних стадиях экспериментального

канцерогенеза, прецшоствуявдх препссппаетическсму «осту. Результаты по изучению действия каприма могут бкть рекомендован!! гля дальнейшие исследован::!":. в том числе и миялчасклх, с целые апробации их гепатопротекторных свойств.

Основное результат«- исследования включен;! е учебную программу курса лекций по биологии клетки на тоТедре гистологии, цитологии я эмбриологии Тбилисского государственного университета.

Апробация работы. Основное поличопия работу били долояенн "и обсучдены на семинарах Лаборатории синтеза биологически активных веществ Тбилисского НШ виноградарства, садоводства и виноделия Академии сельскохозяйствен:^ наук Грузни, на раслярзняом заседании Лаборатория биологии разлития биологического-.¡Гакульте-та Тбилисского государственного университета, а та;ео на семинарах ряда институтов АК Грузия.

Структура пиосеотации. Диссертация изложена на 190 страницах машинописного'текста (собственно текста 158 страниц), состоит из следующих разделов: введения, обзора литературн (глава I), описания материала и методов жоледовзна* (глава П), результатов собственных исследований (глава и), обстапення получрнных данных (глава 17), вчводов н указателя литературн, солерча:1,аго 276 яс-точяячов, из них 40 отечественятс и 236 - иностранных авторов. Работа иллюстрирована 61 монтаяами олектронсграмм и объемна моделей, .8 таблицами, е также 4. схемами и II графиками.

П. МАТЕРИАЛ II :-/ЕТ0Д;

ПЛ. Краткая характеристик* ехтан эксперимента я объектов иеллепоьания

Работа проведена на-,половозрелых беспоролцкх »л'шах весо?.! 20-25 г. Животные били раздал сны на С грулг. га 35-45 мкяз!? в кагг-до'1 группе.

Группа I (35): ймзам ежедневно пропэгопглл одноразовое шутрибрзззшшое звепение 0,1 мл стандартного растаем каярпма. Материал брали б течение суток через 3,в,5.12,18.¿2,24 ч. поело первой инъекции препарата, через 24 ч. после второ?. кчъек-ции (на схеме 48 ч.), а затем через 7 и 14 суток.

Группа 2 (45): мгдам под гекеантлов;".! ьарнозом прохэвод/.--ля резекцию 2/3 печен;:. Ь?зогшж декаплтнрсьпи через 3,6,3,12, 15,18,22,24,56,78 часов, а такие через 7 и 15 суток после спог.а-дии.

Группа 3 (35): мышам за 3 неделя до тепатзктомии ежедневно вводили 0,1 мл каприма. После операции введение препарата продолжалось. та:<~е с суточным интервалом. Материал брал". на тех жо сроках после хчэпатэктомии, что л в группе I.

Группа 4 (35): мышам вчутрлбрюшййно вводили раствор ДЭНА, приготовленный на персиковом масле, в дозе 100 мг на кг веса тела животного. Декапитацшо животных производили через 3,6,9,12,16, 18,22,24,56,78 ч., а таю?е через 7 и 14 суток после инъекции канцерогена.

Группа 5 (45): мышам производили частичную гелатэктомию и через 3 часа после операция внутрябрзгашнно вводили раствор ДЗЯА в дозе 100 мг на кг веса тела животного. Материал брали.через 4,6,9,12,16,22,24,56,78 ч., а также через 7 и 14 суток поете операции.

Группа 6 (45): яизотным за '3 недели до операции ежедневно вводили 0,1 мл препарата каприма. Через 3 часа после частичной гепатэктомии производили внутрибршинчую инъекция раствора ДЭНА в дозе ICU глг на кг веса тела яивотногс. Введение каприма после операции продолжалось с суточным интервалом. Еиьотных цекеппти-ровали через те те сроки, что и в группе-5.

На кэт.дый из изучав.'.та сроков эксперимента брали по 3 животных. В качестве контроля использовали мыаей, не подвергшихся воздействию ДЭНА и каприма. Еивотнне содерталисъ на стандартной дието и за 24 ч. до операции не кормились.

Выбор схемы обработки кивотнкх ДЭНА был обусловлен поставленной целью. Разработанная нами схема эксперимента отличается' от описанных ранее моделей индуцированного ДЭНА гепатоканцеро-генеза. Так. как в задачи нашей работы входило изучение структуры ядрышка на наиболее ранних стадиях, .действия ДЭНА, лредшёствующлх появлению в печени гистологически и гистохимически идентифицируемых очагов пренеопластичеоки измененных клеток, из схемы был. иекчхчен фенобарбитал, иопользуемый обычно в качостзе опухолевого промотора ( í'arber, 1980; Захарова, 1987). Кроме того, нас интересовало действие ДЭНА на покоящиеся и получившие проли^ератиЕНый стимул клетки "в шшамике, начиная с первых же часов после инъекции. Поэтому канцероген вводился через 3 часа после операции.

При такой постановке задачи выбор яиво^ных не имеет реиах>-щзго значения. Дело s том, что перечисленные вгже схемы разработаны i», апробированы на крысах, в то время кок в опытах на мышах

- ? -

Д2НА используат очень редко. 3 тс ?.о врзмч, с точка зрения ответной реакция ядрк:пка представляемся интересным провести подобного рода исследование я на м:-яах. Во-серагос, для гепатопитоз ыгая характерно присутствие ретикулярных ядрыяек '(см. классгЛотацж;: TIauiдзе,Зацепина,I93C), в которых структурное перестройки', обязанные с переходом з более актявву» нуклеолокеннукз "ерму, отчетливо скрашены (ЧзаддзоДЭЗО). Во-вторых, неизвестно? ранее особенностью печеночной мсеая m является интопсквно лрогокащиЯ процесс вакуолизации лдрыака. 3 результата, е частя гегатепитов обнаруживаются вакуолззхрэванные яцрклка, отличающиеся резким, асимметричным расапренлэм одно;: пли двух вакуолей. Таким образом, есть всэ основания полагать, что у uvuieii -но все гепатеш.кты находятся в одинаковом ^ункцлэнапьном состояния (Челидзе,1990). Поэтом!' не липен интереса вопрос о действии ДЗНА на обо группу гепатоцитов. В-третьих, используя гйпатошин ua¿, мозно рояить вопрос о возможности ззаяущяс nepoxos.es ретикулярных, лакуоллзл-розагшых л нуклсолонемякх ядрышек л спасать прочеходяиле при этом структурное перестройки. - s

!

П.2. Краткое описание методов доследования

Фиксацию кусочков ткани проводила в 2,5% на 3Í растяоро ■ глутарсвого альдегида на 0,1 U çociaraoM буфере Ееренсена ;-ля U,I IS иa-какопматнсм буфере. После прекгсяа материала л чистом буфере ткань денонсировали в 1% растворе четырехокисл оомг.я. приготовленном на тех не буферах.

Для светсоптЕчэс"Ого изучения ¡/атйргала из блечов ткаяя, зали-гюс а эпоксидную смолу, пр/гстомяля лолутоккиэ

срезы, толщиной 1-3 мкк, которые окрдЕпватигсь раствором толуиди-нового елнег». Серийные ул'ьтратенкяе ерг.^ь ••очтироЕ&га <ча декрн-тко соркаром бленды, по ад а *ого ара сматривал:: к foïorp2iiir.u2a,ii« . Е микроскопах "Hitachi ИЗ4 И "Hitachi ЯП 12''.

Для построения трехмерных {/оделен ? мо^фокетричьсксго анализа ксподьзоталя полные серии срезов но угнее 5 ;?г,р!;:;ек. Пса ото.'/: у первого ъ'зо-гвдго иетнстру;1роЕ?л:: по I r.nvvztry s гггхйх дзух разных кяеток, у второго - I я:п;:гг;о, г. у третьего - 2 ядрышка одного ядра. Учитывая, что Еолгчсетаеиг'ко параметры ядр-гга зависят от плоскости метки (zatjepifls et aj.,IS£â; Еалалияп :i др. ,1939), для с:ереологпчес;;ого г. ;,*.ор:ометг;:чес^ого гяалг.зг отбирались только яиплоадаке гсг;атсп.т:-. П:ЗЯЪ:ЗС?» кгеткя спрегя—

ляли по числу я структуре цептряолей (Онлзенко, 1978; Vo г о t> j е v , Chen~?ov,19-32). При трйхкерной реконструкции пользовались методом сормззения контуров' ядркгка и исследуемы? структур (ГЦ, ЗЖ, гранулярного компонента s вакуолей), перенесенных с электронно-rpar/jj ка прозрачяке целлулоидные листы (Челидзе и др. ,1988; Za-tsepina et ai,I988; Зацепина и др., 1989).

На полутонках срезах вычисляли частоту встречаемости клеток, содержания Еахуолизированнге ядрышки в пределах дольки. Tß-кле подсчет;,' проводильсь на срезах 15 долек (по 5 долек ка каждое животное). Статистическую обработку проводила с помощью ЭВМ "Электроника ЕС 1410".

Е. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ЖСЛЖСВАНИЙ

Ш. I. Трекерная организация и количественная характеристика ядрииек покоящихся Гедатоцятов мныш

, При просмотре полутоякдх срезов нормальной леченя мнлш в сяотоеом микроскопе можно внделить две группы :0епат0ци!0в, отличающихся по оптической плотности, - тешшс и светлые. -Светлые го-патоцнтт: никогда не образуют скопления, и их доля невелика, составляя в среднем около 5%. Fla ультраструктурном'уровне темные гепатоцятк характеризуются слабки ила умеренным развитием л рав-номорпим распределением по цитоплазме гликогена. Б целом цитоплазма богата органоидами (эндоплазматическим ретинулуыом, полк-сомами, мятохондрвчми и т.д.). Светлые гепатоциты эндоплазмам- . чеекого ретикулума имеют правильную, параллельную ориентацию. -

В нормальной печени взрослой мкпи наиболее часто встречаются клетки с ядрнлпамя, обнаруживающими ярко вкра^енные признаки ретикулярного типа*'. Кроме того, как уке отмечалось, в печени

^Многие азтеок'не проводят четкой грани ме-зду ветикулярнк-кл и нукяеолояешккя трт&шя и исиользуит оба термина как ей-•юншз (et.".,напримео:Негпапаеа-Verdun,I98G). Впервые тзегикуляр-гте яздашш видаленн в самостоятельна"! тип в классификация Чам-дзе и Ёацоакной (I9SB). Осноззой идя такого разделения послужило то, что несkotw на г?орг,:аль:!ое сходств» указанных двух типов . (сетчатое строение," отчетливо вграженнке вакуоли и др.), группа ядркззк, отнесенная к р. о т а к у л я р н о м у (т'р а б е -у у л я р п о у ) тяну, по ряду признаков отличается от нук-леолоне-лнтсс и характеризуется: (I) вкраненнил г у б ч а т ы гл ;> р а б-о к у л л р в v и) строением; (.2) слабом развитием ".готпого сТиорклллрного и гпаяуляпного компонентов; (3) хорошо вя-пячоняуке ~пбзяллкря>-т;и центрам"; (4) интенсивно Ьазвитнм вакуо-хярилп компонентом, так лю састша вакуолей и РИЗ-структуры пэзйитк пгшзшо в олнвакоБОй степени.

- Э -

мной встречается группа клеток с ваяуолаэяроваянклс кп.ры:гкам',, которая составляет около 20? Такав ядрийса о^паиталаалг соотношение РНП Фибрилл к гранул, сходное с ретшвулкрнги тяпо*:. И хорошо вкраяены я лохат на гранще с еакуолякк. Бонн ПК на поверхности Щ »«раздан слабее, чеп 'в ретикулярных Я'Тркиках.

На трвхмерагос моделях регакуляркэго ящя-тлка (рас«1,а) отчетливо видно,насколько вь'сола степень развития вакусляпяой системы. Об этом :ке свидетельствуют дачные кор^окетрпческого анализа, показавшие, что доля, пряхецящаяся на средней сулкарввИ объем вакуолей, составляет около 4СЙ от объема ядрышка. Как помазал .стереоаяапиз, тело ретикулярных ядркзек гэпатоцптоз представлено сетьто трабекул фибрилляряо-гракулярноЯ структуры. . В зав-чслкб'стя от степени развития гакуолярной системы, диаметр трабекул меняется. -Единая сеть вакуоляркрй системы пролизывает всй ядрышко.

Рас.1. Трехмерные коти,десонстрк-стиукту^у я хзрактег. тйспЪэ-делепяя "Щ (помечет: л;;ээнЪ<с?ой' линией) и вакуслясно:1. спстомы (ВлК) в ретяэтлярнои (а) л- Езт^уолия'-ро-вакном 1б) япрылкзх нопмгльньх го-патоцятоь

ФЦ распределены по вселту ядрхтау и лгла? яа границе грабк-• кул к вакуолей. • Они.г.моот вллппт'гческуто ¿орму и гладит поверхность. Периферически раеполояекнкз контактируют с ¿.••о^-.а конденсированного хремаглка. ¿наляз сер^яж аовзоп закрайке слабое развитие П'ЬХ," который в ют.е зпекретных яоя локализован на поверхности 51!.

СтереологаческчЙ анализ ЕакуолазарсЕзн.ыых ядрышек (риз. 1,6) показал, что по сравае-я;*я с ретккуляря'з-я япрыгка:.*;: в это." заметно редуцирована ТНП-часгь. 3 влкузлизиро^зк".?:* ягуы^кчх средни"' суммарны!! объем вакуслярксй с-;стя:.;ы ъ Г,5 рога нга-з по

сравнению с ретикулярной формой и достилает 60;» от объема япрыш-ка. в вакуолязироьанннх япрыздах гсиатоцитов мыши хорошо выражены, я создается впечатление, что при вакуолизации они как бы "оттесняются" в периферические области ядркажа. Зонн ГМ на поверхности выражены слабее, чем л ретикулярных ядрышках.

Анализ 1/орфометраческкх данных (таблица I) показал, что в вакуолизирезанных ядрнаках отмечается достоверное снижение среднего количества ФЦ (с 27 в ретикулярных до 24 в вакуолизированных ядрышках). При этом значения средних суммарных объемов ФЦ ( ¿V фц) я вместе взятых ФИ к -ЕК ( ¿у фц+цфк) также достоверно понижаются (с 0,252 мкы3 и 0,333 мкм3 до 0,232 мкм3 и 0,297 мкм3, соответственно). Таблица I

Результаты морйометоичоского анализа ретикулярных и вакуолизировадных ядрыпок нормальных гепетоцитов

•Гпа ядрызка V Кол. ядр. ФЦ V фц £у фц ¿V . V ФЦ + Мк. пфн V рнп

Ретикулярное ядрышко 4.614+ 27+ 0.267 2~ 0.008Э+ 0.0001 0.252+ 0.003 0.333+ 1.841+ 0.007 0.06Б 2.773+ 0.20Е

Закуолизиров. ядрышке 6.505+ 24+ 0.201 I 0.0096± 0.232+' 0.0010 0.003 0.297+ 3.933+ 0.004 0.100 2.573+ 0.127

Е.2. Трехмерная организация а количественное параметры ядрышек регенерирующей печени мчши

Анализ полутонких срезов регенерирующей печени маши на всех сроках эксперимента не выявил выраженных очагов некротически измененных меток. Как я в контроле, преобладают темные "гелатоцяты, а количество светлых клеток в среднем составляет около В течение 24 ч. после операции частота встречаемости светлых клеток не меняется.

Выявленные при ультраструктурном анализе особенности тонкого строения гопатоцгаов можно свести к еле пуп-'ему. Уже через 3 часа после операции в цитоплазме темных клеток обнаруживаются многочисленные крупные; мировые включения и сильно развитый шероховаты;; ендоялазматичесиий ротккулум, не обнаруживающий признаков строгой ориентации. Рерна гликогена равномерно распределены по цйтоплг.зме и лияь изредка образуют небольшие скопления. Ядра бслъпинотза гопатоцптов приобретают выткнутую форму и волнистые /онтури.

Стлячителшэл признаком светлгсс гепатоцитов является округлая форма и гладкие контуры ядер, тек~е слабо? резвитиз ондс-плазматического ретакулума. Еароик кап&ль, как к в темные метках,, много я они больиях размеров. Грапулк гликогена равномерно распределены по цитоплазме, не образуя скоплений.

3 течение 17 ч. с начала симуляции гепатоцитов частичной резекцией печени ядрыекк сохраняет ретикулярную структуру, хотя в них уже наблюдается ряд структурных изменений, в частности, сокращается размеры вакуолэй и, соответственно, утолпалтея трабе-"" кулн. Количество гранулярного компонента увеличивается, '.'орфомет-.рлческий анализ показывает прогрессивное нарастание объема ядркк-ка, РНП-частя я количества ФЦ. Средние объ'еш индивидуальных Щ достоверно понижаются. Б то те время увеличения суммарного объема •ЗЦ в промежутках менду 3 и 2 ч. не происходит, так как различи по этому дараметру ядркяка недостоверны.

Подсчет процентного соотнесения ядрышек, принадле-лщих к разным типам, выявил постепенное понижение частот:; встречаемости вакуолизиро1£шнкх ядретек. К примеру, тгор^з 16 ч. вакуслззирояан-нке ядрызки обнаруживаются лишь в 7% гепатоцитов. Однако, наиоо-лао существенные изменения наблмаэтеч на 18-24 ч., характеризующиеся, как показывает ультраструктуряый анализ, появление;.; нук-лсолонемнкх ядрышек. При алектрснлзмикроеколяческон исследовании .печеночной ткани через 18-22 ч. после. стимуляция, ур.кчелизирован-нке яарывки составляли лазь 2-4?, в то ррсмя как куклослояганко ядрынгсп отмечались в 32'J. 3 нуклеслокемнта ягегтаках р?гк>ернрул-цих гепатоцитов ».таи выявляется мош.н.яя сеть нуклеаденкда "боль-псе количество ядркзкевта грянул.

Анализ серийных срезов покапывает, что адюкплу.еннкв -УД' имеют преимуглествэлно сферическую ¡порму л цсьсхьпс i&saove.pm распределяются л объеме япркака (рис.2), луклэог.оке.-а, состоялая главным образом из ПчК, представяяот собо:'. чспрор^гянГ тд», объ-единя:-)?;!:! вое ОЦ. ,

J.to изометрический анализ компоненту": нуклеолопеулы?: ялры-тх Заказывает на резкое возрастание, по срази ени-п с реытглг.яр.-'гми ялрызками, нормальных гепатоцитов, числа и среднего cv-.л-арлзго объема "'Ц (с 27 и 0,252 мкм3 в ретикулярн;зс яг рынках до 68 г. С,370 мкм3 в нуклеоленомяых) при лосюркр.чс.'л гхк.гмнил их кклилл-дуашиж размеров (с 0,СС89 г-к? до С,ССГ>2 :.::<•.?). Гсэп7-"яря:.-Г. кошояоат я П?Х интенсивно разегт:; и ssnm-r.T- сгслс GuT и 2CCI

объема яаркдка. Данные морфомегрического анализа основных коли-чзстьзншс:' параметров ядрышек гепатоцитов регенерирующей почеяя мгши суммированы в таблице 2.

1-мкм

Рис.2. Объемная структура нуклео-лонемн 1НЯЮ, а также количество и распредале-нне щ (помечены черным цветок) в ядркшкз стимулированного гепато-цита через 22 ч. после частичной резекции печени.

Результат:: морфометрического анализа ядрышек регенерирующей печени мгая

Таблица 2

Время п.с.

и тип ЯПРНПКЗ

V

ядр.

Кол,- V

од- Фп

в

фц

• IV

йц +

•■ ПД'К

V

вак.

V

рнп

-3 ч.

ретикулярное яг.рылко_

5.829+ • 0.192

33+ 0.Г071+ I 0.0006

С.275+ 0.СС4

0.373+ 0.С05

1.022+ 0.038

4.805+ 0.160

9 ч. сетккуляриое

ЯДРТ'К'КО _

6.507+ 0.101

42+ 0.С069+ I 0.00С5

0.235+ 0.005

0.401+ 0.029

1.079+ 0.022

5.507+ 0.094 .

22 ч. ретикулярное

ЯПРЬЧДКО

7.323+ 0.037

49+ 0.0062+ Г 0.0001

С.303± 0.003

0.483+ 0.011

0.801+ 0.013

6.212+ 0.096

22 ч.

нунхеолонеу.

ЯЧТГ'Г.КО-_

' 9.496+ 0.438

67+- 0.0055+ 2 О.ССОГ

0.364+ 0.007

2.461+ 0.075

1.822+ 0.011

7.8С9+ 0.478

24 ч.

нуялеолонем.

я'" ОУ'ТКО_

11.014+ 0.116

68± 0.0052+ I 0.002

0.370+ 0.С02

2.878+ 0.064

2.093+ 0.046

8.533+ 0.087

Ш.З. Влияние каприма на покоящиеся и регенерирующие гепатоцати шм

Анализ полутонки;: срезов но выявил каких-либо существенных :ш№.рия& яри паЕстзкЕ каоряуя на яптянтну.з и регеаеряруяпую псчмь. При иослеговапп;: ультратолких срезов гепатоцитов интакт-

ной печени ив обнаружено никаких признаков влияния каприма на структуру ядрнгаек. Лдрллки гепатоцитов мгшей.в течение двух недель ежедневно получавших ксприм, сохраняла все признаки ретикулярного типа. Об этом -;е свидетельствуют результата морТ:ометри-ческого анализа.

Динамика ультраструвтурнкх азу.ешшй язркгек регенерирующие на фоне калрямл гозатоц;дтоа такая .ve, как я ооерлрэЕЗНичх животных, не получавших указанный препарат. В тс те врегдя, подсчет частот« встречаемости ядрышек разного типа показал, что т.пвотнкэ, получавшие перед операцией в течение трох недель каптллл, характеризуются более ет-'Соким процентнга: содержанием нуклеолонекш'х лд-рыпекГТа:;, -через 2? ч. после частично": резекции печвиз нукЛеоло- ■ нэмнкэ ядрышки обнаруживаются в 39^ клеток, а через 24 ч. - в 43!?. Через 7 и 14 суток после операции у тавотн'к, которку. -вводили' та- . прим, наблюдается полная нормализация гепатоцитов. При этом на ультратонких срезах ?.ялно обнар.уълть только рет.лкуляркь'": и закуо-лизярованнгй типг ядргаек.

Суммируя полученное результату, ¿:,сгяо сказать, что обпаруле.ч-нке в нормальной и рсганэрирую:т:е;1 печеяп разнообразнее ciopr.ru яд-рняек отражают различнее зтапк перестройка структур!-' япр'дша при его активация и (Т-ормкровании нуглсолонз'.-яоЛ структур* ь процессе ■усиления работы рабосокнюс генов (р-гзпов). 33 зтом ~е нас yoe"ja-. ют наблюдения за динамикой происходящих в прсрэпдпяатлв:»о?^ периоде изменений процентного еоотпокочи* разлечнт-х тииоз ялргзек ¿ нолдчественнт.гх параметров их структуршгх когглопентов.

Активация лдрклеа гу.латоцитсв кузй осу.г.естЕ.ляотся в -"па этапа. Вначале про nexo прогреез.лвноэ нарастал;:)-:- olzors ялрилллс и за счет протекающего одновременно сократшая размерен ва:(.услоГ: заметно увеличивается сбъя.: РПЛ-чьст;-:, Скорее эсесо, «акко ;:s.vc-hc-нпя охватывает обе группы ялруглек, пс."еутп?5у.-'::.к>: ь порьгально:' . печени. Наиболее существенное сокра-ленле раз>.'орог отме-

чается г течение первих трех часов. Па более позд>;:-л: сроке:;, вплоть до 18 ч., sorna наблюдается г.ереуод у-.т:::су."ярк;х ядрггз«:? в нугслеслоне^нке, количостгеняке г.з;.'спан::я sa'.yc.'y.r.sc?. с?.с?м" несущественна. :.!о~по преддолочкть, что йпбл;о-.ае:»с<? ял лпрлп:.: эт-:-со актявац;-:;». ядртака сокрацзаао г.йе-s гакус.-.яр.тзго "/сл/лолелта, скорее всего, прелехо ит вследствие г-лзл-ол с корост:: тлялслолтг-г.т процессов л скс.тле:шя прегуу.тов алтлнн'о?;: р-;*02св " ".оно

Второй этап активации, ь.асгуиах-еГ: чс-:.23 1С ч. после аьхогя

стимуляции гепэтоцитов, сопряжен с более глубокими структурными перестройкам;! и Армированием непрерывного тяжа нуклеолонемн. В эю время не фоне дальнейшего уменьшения индивидуальных и существенном росте суммарных объемов ФЦ происходят скачкообразное увеличение ШК, связанное, очевидно, с усилением транскрипции р-ге-нов вследствие более сильной деконденсации рДКК, входящей, согласно ряду авторов, в состав нуклеолонемяого тяжа (Mirre, Stahl, 1978,193I;Hartung et al,I990), Очевидно, что до сравнении с ретикулярным типом в нуклеолонемних ядрышках гораздо больяая часть рДНК покрыта транскриптами (ПФК), вследствие чего и образуется непрерывный тяк нуетеолонс-ж.

Лдадюгок - каприм не обнаруживает заметного действия на кормальяув печень, В то те время этот препарат мояет стимулиро-г вать регенерац;;онные процессы у гепатэктомированных животных, что в'-ргтается в повышения частот?' встречаемости меток с нукяоо-лонемязш ятфкишами.

К. 4. Трехмерная организация и количественные параметры гепатоцитов мыши при действии ДЭНА

СветоосЬический анализ полутонках срезов ке выявил в печени тавотных, подвергшихся одноразовому воздействию ДЭНА, признаков возникновения в течение двух недель очагов, измененных гепа- • тоцятов. В то че время, уке через 6 часов после введения ДЭНА отм?чаотся повешение количества светлых гепатоцитов. Ультра структура; л: анализ показал, что значительная часть светлых клеток проявляет ярко выраженные признаки дегенараций я некротических изменений.

Наряду с некротическими гепатоцитами в печени мышей, обработанных в течение 6 часов ДЭНА, на;.-и обнаружена еще одна "группа ' светлых клеток. Это богатые органоидами клетка с одним или двумя гладким,- о кругл и/, и ядрами. Обращает на себя внимание обилие и правильная ориентация цистерн шероховатой эндоплазматической сети. Гликогена мало и он никогда не образует скоплений. Богатые органоидами светлые клетки всегда лежат поодиночке, в го врелш как некротические изменения могут охватывать достаточно обширные группы гепатоцитов. Особенно отчетливо некротические изменения' Ет,рз-:-.<пы через 22 ч. после введения канцерогена. Через 78 ч, по-сл-о воздействия ДЭНА яекротяческие клетки не обнаруживаются. Начиная е. 24 ч. после введения канцерогена в цитоплазме богатых

фганоидакя одно- и вдуядврагас светлых ¡моток набллдается прогрессивное накопление гялногена, «Торияруваего обгсирныо скопления. !собого внимания заслуживает группа одноядерных, богатых гликогеном светлых клеток малых размеров, встречающихся только а обработанной канцерогеном печени. Динамика изменения частота встречаемом светлых'клетокгпок'азэнэ на рис.3.

Рис.3. Изменения количества светлюс гепатоцитов на разных стзоках посла введения ДЗДА.

1 - некротические клегки;

2 - богатые органоидами светлыэ клетки. На кол-вой 2 треугольником помечено появление богатых гликогеном светлых клеток, стрелкой - богатых глпкогзном одноядерных гепетоцптов малых размеров.

6 18 24

Через 7 и 14.суток'после,введения канцерогена частоте встречаемости светлых клеток обнарунивает тенденцию к понижения и составляет около .10% и -7% соответственно. Анализ сери;';.кых полутонких срезов показал, что группа светлых кчеток.на. стих сроках эксперимента представлена ист'лючител!но_ одноядерными клетками малых размеров. *

7льтрас?руктурнкй анализ выявил выраженный лолилярфизл ядрышек гепатоцктов, обнаруживающий четкую зависимость от времени действия ДЭНА. Учитывая такое многообразие, для стереологичесгого и корфометрического анализа бьли отобраны слелутопшз группы и подгруппы клеток: (1) диплоидные темные гепатоцитн с уплотненными ядркшками через 3 часа поело обработка животных канцерогеном; (2) диплоидннз темные гепатоцитк с,ретикулярными ядрышками черзз 12 ч. л 24 ч. после действия Л2ЯА;. (3) дпалоидные (одноядерные) богатые гликогеном светлые гепатециты малых размеров с псевдо-нуклеолонемнпли яцрипкаип через 73 ч. после действия Д311Л; (4) диплоидные темные гепатоциты с'гипертрофированными ядрышками через" 73 ч. после воздействия канцерогеном! (5) дкплоядинё темные гепатоцитн с "цветковидяжК1" ("Clorai nucleoius" ко Yasuzurai et al,

- 16 -

1970) ядрышками через 78 ч. поело введения канцерогена.

При кратковременном (3 ч.) действии ДЭНА вызывает ¡эозкое уплотнение и умекылкшс объема ядрышек почти в два раза*-. Число ФЦ сокращается но 4-6 (рис.4,а), а их средний объем существенно возрастает, в то время кок сроднее значение ¿У'Тц уменьшается.по сравнении с контроле« более чем в два раза (табл.3). Ядрызки этой группы настолько уплотняются, что от обдирной вакуолярной системы остаются лишь небольшие светлые лакунк (средне объем вакуолярной системы понижается по 0,059^0,010 мкм3 против 1,8-11x0,063 г.;км3 в контроле).

Ркс.4. Трехмерные модели, цемокстпкрулэле ярпацйп стоуктурной.. организации, а танке число, структуру л адг-корр Щ (помечены цифрами черни.; цветом) япэтоек гепатоцктсв па адзнше сроках действия ДЭНл: а - уплотненное ядрымко через 3 ч. после действия ДЭНА; б - псевдонуклеолопекное ядсынко чеоез 78 ч. после действия ДЭНА; ь- лакуяаркая система.

35• Через 3 часа посла введения ДЗМ в больтакстве светлых клеток тилжз Естоечаотся уплотненные ядрнакя. Однако, особое внимание привлекает"светлые клетки со значительно кзмгнегшон струк-тугоГ: ядоыЕка. Ндрыпкя этих клеток проявляет отчетливые пгазнаки сегрегации кокяонечтов. Пои этом £>Д и Я'Н образу-эт небольшие зон! четко отграниченные от гракудярк о Г. части ядрышка. Интеоеско, что л цитоплазме таких кдеток обозначаются признаки дестру1{ц:ш: оча* готае поосветдепке :: "олустояекяо" цитоплазмы, дезориентация кр::ст митохондрий, снижение количества свободна полисом и др. Такие клетки встречается редко к составляют около 1Й от всех прссмственных гелатоцятэЕ. Стгроологически;' и мор*ометгшческий анализ этого тяа ядрктака но поовешися.

Таблица 3

Результатн мор;Тометрического анализа различных типов яар'пика при действия на витактяую печень JiOíil

Время п.а. и тип яд рынка V Я др. Кол. Щ •V Фц ¿у фц ад + п?к V V вак. рнп

3 ч. 2.318+ 5+ 0.026+ 0.124+ 0.191+ 0.С09+ 2.102+

плотное ядрызко 0.05S I С. 001 0.003 0.006 0.015 О.СЗв

24 ч. 5.738+ 38+ 0.0072+ 0.272+ 0.392+ 1.321+ 4.144;

ретикулярное ядрышко 0.CG3 I O.OCOI 0.G0I 0.0С6 0.039 0.032

78 ч. R.5I3+ 71+ 0.С036+ 0.251+ 4.948+ 3.419+ 0.120+

псевдо.чукл. ядрышко 0.035 I 0.0002 0.С08 0.073 0.107 0.031

78 ч. гипертроей. япрыкяо 13.440+ 0.744 67+ í О.СС53± 0.476+ 0.0001 0.003 5.681+ 0.127 3.555+10.177+ 0.202 0.428

78 ч. "цветков." ЯДРЯЕКО 17. 813± ICIt 0.145 I 0.0047+ 0.0001 0.474+ С. 005 5.G34; 0.178 2.7СЗ+ 8.851+ 0.619 0.107 s

Б дальнейшем (6-24 ч.) в большинстве тешнх и богзтшс органоидами светлых гепатоцктса ядршкл восстанавливают ретикулярную ci-руктуру. Так, чзрзз 12 ч. ло сравнении с предндушш сроком эксперимента отмечается'увеличение объема ядрышка'до 5,387+0,ОГО мкм3, Количество ФЦ повышается и приближается к контрольному, составляя в средней 24 (в контроле 27). Срэднии объем индивидуальных ФЦ понгтается до 0,0107+0,0010'мкм3, в то время как значение среднего суммарного объема возрастает до 0,266+0,040. По сравнении о контролем взкуолярная система существенно расширяется, и её объем превышет таковой в контроле почти в 15 раз (табл.3). Через 24 ч. посла инъекции Д2НА в' ретикулярных ядркпшах отчетливо проявляется тенденция к дальнейшему ловыпенго и.г объемов, числа я среднего суммарного объема '2Ц, е гагг::о среднего объема Plffi-частн. При этом средние о&ьвхи ннливидуальных 5Ц понижается. Чо основным количественным параметрам ялрыпка исследованные нами через ?А ч. после действия Д£!!А кготкл г. peso сходят гепатоцг.ты нормальней почека.

Как р;е говорилось, к гонцу парЕк:с суток в печени обработанных £ЭМА itKSOTüwc отмечается появление богатых гликогеном одло- и двуялерлкх клеток. Одни: из наиболее ярких признаков этой группы клеток является своеобразная псеглонуклеолонешая структура ядрышка (с.м.&чъсси^акаоа'о: Че.сагтзе.ЗацепвнаДЭбб).

Такая не форма ядрышка свойственна и богатым гликогеном светлым гепатоцитам малых размеров, впервые отмечаемых- через 78 ч. после инъекции канцерогена. Изучение трехмерных моцалей (рас.4,6) показало, что псевдонуклеолонемные ядрышки представлены непрерывным сильно извитым и разветвленным тяжем рыхло упакованной нук-леолонемк, состоящей главным образом лз ГОК. Гранулярный компонент развит значитадыю слабее и сосредоточен по периферии нук-леолоаемного тя?.а. Единая систем« расширенных каналов вгкуолярко сети пронизывает вое ядркшко. Щ, преимущественно ох<руглке в -эллиптической формы, располагается в петлях нукдеолонемк я хаотичв рассеяны по всему ядру. В принципе, строен^ нуклеолонемы и орга низация (ВЦ у этой формы яарншка ничем не отличается от таковых в типичных нуклеолонемнш? ядрышках. По количествен:"-;.- параметрам они также близка (табл.з).

Стереологичзский и ыорфоыетрдческдй анализ гипертрофирован • них ядрышек гепатоцктов, подвергшихся в течение 78 часов Одноразовому воздействии канцерогена, 'выявил очень близкий к нуклеолэ-немной форме принцип организации, однако значительно превосходят последнюю по количественным параметрам. Гипертрофированные ядрцз ки очень крупные и сильно вытянуты. Как а в случае с нуклеолонсм вит я псевпокукдеслонекными ядрышками, гипертрофированные ядрда ки обнаруживают непрерывный тяж нуклеолонемы. Iii объем почти в 2 раза в-аае такового ядрипак нуклеолокемного типа. Число ОЦ в среднем достигает 103+2,6, т.е. значительно превосходит количест во <ЗЦ в нуклеолонешюм типе. Размеры индивидуал ыпвс Щ колэблютс в широких продолах. По степени развития Ш-д гипертрофированные ядрышка почти в 3,5 раза 'превосходят кукдеолонемную (форму ядрыазе (тебд.З).

В объемном строении "цветкоиидние" ядрышки счень близки к-нуклеолонемпым и гяпэртрофкрсваннть; ядрышкам. 'Основное различие мевпу перечисленными формами касается степени развития и характера распределения гранулярного компонента. "Дветкозидные" ядрышки содержат кеньге Р1Ш-гранул, однако судя по другим'параметрам (табл.3), количеству и суммарному объему ФЦ, интенсивности развития ПЕС и другим показателям приближаются к гипертрофированным яцр>'-лкам.

Пи5. Трехмерная организация и количественные параметры ядрышек ' гопатоцитов регекер;фужией печеЕги мыащ при действии ДЗНА

В принципо, действие канцерогена на регенерирующую печень вызывает 'сходные с предыдущими фенотяпические изменения гепато-цлгов. Результатом действия ДЭ11А туг таюхе является ярко выраженная морфологическая и функциональная гетерогенность гепатоцитов л соцутсгвуидяй отому ядрышковый полиморфизм. Пря атом также, как и в печоки кооперированных животных, получивших ДОНА, обнаруживается несвойственные нормальной печени популяции клеток. Обнаруженные наш различия касались количественного сооткогаечия разных групп гепатоцитов, если сравнивать меяду ссбЪи обработанных канцерогеном неоперарованннх и оперированных зшвотных, взятых в одни г. те яе сроки эксперимента. В частности, гепатэктомия продлевает время выявления в обработанной канцерогеном печени богатых гликогеном светлых клеток малых размеров, частота встречаемости которых удеркивается на постоянном уровне^начиная с момента их появления (75 ч. поело введения ДЗ!М) в течение двух недель. В это же гремя различные <][ормк ггуклеолонекных ядрыяек выражены отчетливее, чем яа соответствующих сроках после гепат-экгоьии у животных, яе лолучавлах канцероген и т.д.

Примечательно, что среди некротических клеток мы обнаружили светлые гшштоцлтн с весьма своеобразно!! картиной распределения ядрышко в! "X компонентов. Такие клетки содержат крупные, богатые РНП-гранулаки ядрышки с признаками сегрегации. Частота встречаемости этой подгруппа клеток составляет около 3$ от общего числа генатоцитоэ. 3 цитоплазме видны обыирные "опустошенные" участки, (Трагментнрованный эпдошшзматпчес:;и,; ретякулум и митохондрии, с признаками набухапкя и дезориентации крист.

СтереологнческпЙ и морТомстрпческ!".': аналчз проводится яа тех же группах и подгруппах клеток, что и в предыдущей серии экспериментов. Реконструкция трехмерной структуры я количественна! анализ ядрьгяек обработанных ДЭНА гегатоцятсв оперированных ммзеЛ Е'-явилл сходство их пространственной организации- я морфо-' метрических параметров с соответствуюаягл: (Торгами ядрышек, встре-'че'ЗДШсКСя в печексчн!.?: клетках обработашпх'канцерогеном кооперированных животных, а так\:з з гепатоцитах регенерирующей печени мыаи. Количественное параметры ретикулярных ялрышак стимулированных гэпатошлов как необработанных ДЭНА, так а подвергшихся Дей-

стаям канцерогена, достаточно близки. Гипертрофированные ядрышки обработанное ДЭНА клеток печени гепатэктокпрованных и нзопериро-х»янис нишей также обнаруживают сходство. Б то же время, по мор-фокетрическим параметрам нуклеолонемнге ядрншки спустя 21 ч. после'введения Д2НА приблятактся к гипертрофированной <*орме, встре-, чающейся в печени кооперированных ¡каютнис спустя трое суток После введения канцерогена.

Ш.6. Влияние капрякэ на регенэрирущие геяатоцитн мши, полвергаиеся действия ДЭНА

Ультраструктурный стереологический а морйометрический анализ гепатоцитов регенерирующей печени мкией, получавших канцероген, не выявил никаких признаков влияния капрпма ке юр'ологпя, трехкерную организации и количественные параде'!!:-- ялрнлка. Б гз-патоцитах оперирсваннкх нивотннх, котором за три я с-дед и до операция ежедневно вводили адаатоген, бкли вьшелснн те.яе индуцируемте ДЭНА изменения ядршка, что и в печени мпье'л, не ползавших каприм. Динамика ультраструктуркЕ: изменена:» ядришек на различные сроках после введения канцерогена на фона каприма яч отличается 01' таковой в отсутствия адаптогена. Однако сравнение' -частоты встречаемости различных популяций гепатоцитов у зтлх. двух групп мышей показам, что а печени тлвотних, получавших*кап-рим, отт.:ечается скакание числа некротически изменение клеток. Так, через 6 ч. после .введения канцерогена (9 ч. поело операция) процент некротически измеленные гепатоцитов у яавотнкх, ползавших адалтоген, составлял 5% от общего количества просмотренных гепатоцитов, в то время как в отсутстьио гстркга это число приближается к 12$. Через 21 ч. посла введения ДЭНА, когда в отсутствие адаптогена число некротически изменонннх клеток было равным приблизительно 11%, на фоне каприма отмечалось лишь незначительное повышение количества клеток о признаками деструкции до Соответственно на свзтооптпческих препаратах частота встречаемости светлих клеток в точение первгх суток после введения ДЕНА у яизотных, получавших капркм, кипе. В то те время, пр опредагении количества богатнх органоидами и глакогепок светла клеток ын не обнаружат» признаков вкияняя капрнма на частоту встречаемости это'! субпопуляции клеток.

Действие ДЭКА не? гепатоциты ыкик складнгзется, по меньшей м'^ре, из двух моментов: (I) первичного, кратковременного ингиби-

рую";ьго эффекта, приводящего к гибели нзбол-ьпой части гепатоцк-тов, ■ л (2) более позднего, активирующего действия, приводящего к появления специфических форм нуклеолонемта ядрышек. При этом и нормально функционирующие, и • активированные гепатоциты реагируют сходным образом.

Ингибирующее действие ДЗНА особенно хорошо проявляется в клетках с признаками деструкции. В ядрышках таких гепатоцитов обнаруживается наиболее глубокие изменения, выражающиеся в сегрегация компонентов. Топография компонентов уплотненных ядрыиек -резко отличается от таковой в сегрегированных ядрьш'ках. Учитывая, что в гепатоцитах с уплотненными ядрышками признаки деструкции в целом не обнаружены, их могао рассматривать как жизнеспособные клетки, восстанавливающие в дальнейшем ретикулярную структуру ядрышек. Сегрегированные ядрышка скорее всего отражают предельную степень нарушения клеточного метаболизма, связанную с развивай>-¡цимиея некротическими процессами. Они могут возникать как из уплотненных ядрышек, так л из ретикулярных, а также-н/клеолонемных ядрышек. Очевидно, в условиях действия ДЗНА на гепатоциты мши сегрегированные ядрыпж? не способны переходить в ретикулярную форму, хотя в литературе сообщалось о способности таких ядрышек восстанавливать нормальную структуру после удаления ингибиторов (например, актаномищша ми адриабл'астипа; (з±таг<1,1970; Ченцов, Поляков, 1974 ¡згтаг а et а1,1974; Ломагин, 1987; Челидзе,Зацепина, 1308; Челидзе,1090). Несомненно, что это связано б токсическим действием канцерогена на метаболизм гепатоцита в целом, приводящим к некротическим изменениям а гибели гиетки.

!" Активирующее действие ДЗНА на биосинтез рибосом печеночных клеток миля выражается в появлении псездонухлеолонемних, гипертрофированных и "цветковидных" яярьетек, не встречающихся ни б нормальных, ни в активированных г отсутствие ДЭНА гепатоцитах. Тут такт.е не имеет значения, дейстзует ля канцероген на нормальные или стимулированные гепатоциты. Реакция в обоих случаях од-' нотипна.

Предварительная обработка мь'кей кгпримом не способна предотвратить развяваюанеся под действием Д311А функциональные нарушения гепатоцитов. Заслуживает внимания факт, стадетельствущий о различном действии капр.чма на регвяерлруйау» печень в условиях обработки канцерогеном я без такозой. Б отсутствие канцерогена кадрам способствует усиления рогенеращюгшых процессов, о чем

свидетельствует1 уволпчение частота встречаемости клеток, содержащих нуклеолонемные ядрышки.

В регеперярртдей печин^ животных, подвергшихся обработке ДЭНА, действие каприма выра',тае*ся в понижения числа некротически измененных гепатоцитов. Это свадетодьствует о повышении рези-стентяостя той группы гепатоцитов, которая проявляет нБаболъшрз чувствительность к токсическому действию ДЭНА. Таким образом, получено свидетельство наличия у каприма гелетешротекторяю: свойств.

И1.7. Ультраструктурная классификация гепатоцитов нормальной и регенерирующей печени мной при действии ДША

В основу принимаемой в настоящей работе сзстеат лсло^оик следующие 7 групп гепатоцитов, изученных' нами с почина нормальных, гегштэктошрованннх и обработанных ДЭНА мь-зей.

' " I ГРУППА. 3 данную группу коели одно- или двумерные: тем- ■ ные гзпатоцитн, описанные при светсоптачеоком и ультраструктурном анализе нормальной а рогенерирущей печени мыши. 11х общим признаком явпяется богатая органоидами цитоплазма с умеренным или низким содержание!,! гликогена.

В этой группе' наеладается достаточно широкий спектр структурно преобразований яарк-ляа, свойственных не обработанной канцерогенами печени. 3 нормально (Тункцконируглвдх гепатоцктах присутствуют только ретикулярные и ваггуоллзирояашше лдрыаки. В активированных клетках эти ^.ормы даэт начало типичным куклеслонем-ным ядрыакям. К характерной черте цитоплазм]: активированных ге-патош1тов можно отнести появление крупных акрошх включений. Ядра в норме скруглив и гладким' контуром» При активация меток ядра приобретают волнистые очертания. .

В количественном отношении &та группа составляет около 90-$^.

П ГРУППА. Эту группу образуют богатые органоидами светлые гепатоциты. Зстречачтся как в норми, так в после частичной гопат-эктомии г. при пе':етп:::: Д2ПА. Энлоплазматический рэтикулуы развит очень сильно а имеет правильную ориентация в виде яараллельнкх рядов цистерн. Гликогзка мало к он равномерно распределен по цитО' плазме. Лдрыяки ретикулярного типа. Одно- идя двуя .черные хдатки. Ядря скругл!;о с гладки.' контуром и низке'. стэаеььэ конденсации хрекзтияа. В норме к яря частичкой гедатэктскяи глровке вмйче1№я

- 23 - .

либс малых размеров, ллбо их нот. При обработке ДЭНА п т-птоплазме ат.тх клеток могут козникзть крупвы.о х?пгдч-:в ксплн.

В норме на поля етой пспуляции гспатоцитов приходится около клеток. Их количество-на меняется в течение первых суток после частичной гепзтэктомии. Череп двое или тро^ суток наблюдается увеличение частоты лх встречаемости по 0? я II?» соответственно. Через семь суток обнаруживается тенденция к тааньченп-о их количества (до Т'). Через II суток после операции число клеток второй группы приближается к норме. Б'обраээтанных ДЭН.ч не&тоизя-рованных гепагоцитах сначала наблюдается незначительное увеличение ах количества до 7% (3 ч. посла введения канцерогена), а за-г тзм, спустя 6 ч. частота их встречаемости понижается ло <1%. Через 18 ч. после введения вновь происходит увеличение числа богатых органоидами светлых платок до й?, '' концу первых сую к эта группа че идентифицируется. Через 7 ч. после действия ДЭНА на активированные гепатоыкты число так ме, как а в печрни оперированных лшеотнкс, не получавши канцерогена, составляет -»-75?. Количество таких гепатоцитов не меняется спустя 6 ч. после обработки гепаг-эктомирозаняых кивотннх ДЗНА (9 ч. после операции). В дальнейшем, через 15 часов после инъекции ДЭНА (18 ч. после операции) наблюдается увеличение частота встречаемости богатых органоидами клеток до 12^. В это не время в них поваляется отчетливая тенденция к накопление гликогена. К концу первых суток, после операции (19 ч. и 21 ч. лооло подачи канцерогена) эта группа члеток но идентифицируется.

Ш ГРУППА. К ней мы отнесли богатые органоидами темные гз-патоциты с уплотненным; ядрышками. Встречается только на ранних сроках действия ДЕКА (I ч. и 3 ч. после введения канцерогена) на янтактную или оперированную печень. Отличается сильно развита гранулярным эндоллйзматическим ретикулумом, цист'сряы которого либо окружают митохондрия, либо поавильно уломекьч Гликогена мало . и он равномерно распределен по всему объему цитоплазмы. На более поздних сроках, через 9 ч, в 12 ч. после ввэдения ДЭНА (12 ч. и . 15 ч. после 'операции) йта группа восстанавливает ретяаулярпул структуру ядрнжка и переходит в темные гепатецитн с ретикулярными ядрышками. Популяции гелатоцитсв с уплотненными яцрншкамя составляют около

Г/ ГРУППА. 3 данную группу мы включили богатые органоидами темные гезатоцкт:- с гипертрофированными и "цветковидными" ядрнзка-

ми. Они встречаются только при действии ДЭНА на нормально функционирующие и активированные гепятоцитн, начиная с конца первых суток после операции и в течение последующих двух недель. Гликогена мало и он равномерно распределен.по цитоплазме. Содержат кировне включения в виде крупных капель. Одно- и двуядерныз клетки. Степень конденсации низкая. Б зависимости oír срока операции и воздействия могут составлять от 37 до 5?;¿.

-У ГРУППА. В нее вошли богатые органоидами и гликогеном крупные СЕОТлне гепатоциту с поендонуклеолонемннми ядрышками. Одно- или двуядерные клетки крупных, размеров. Встречаются только при действии ДЗНА на нормально Функционирующие и стимулированные гепатоциты. Появляются к концу первых суток после действия канцерогена, скорее всего из богатых органоидами светла клеток с низким содержанием гликогена.

У1 ГРУППА. Гбпатоцитн этой групп" встречаются в инт'актной и 'оперированной печени мыши только при действии ДЭНА. Это богатый гликогеном свзтлке гепатоцатн малых размеров, с асевдонуклео-лонемныыа ядрышками, Исключительно одноядерные клетки. Липидных включений шло или вовсо не обнаруживаются. Содержат округлые ядра с низкой стенанья конденсации хроматина. Появляются на вторив сутки после действия ДЗНА. В интактной ночбни их число чэре: 78 чесов равно 12;». Спустя 7 и 14 суток наблюдается тенденция к снижению их числа до 10% и 7% соотдагстведно. У мышей, подвергшихся сначала гепатоктомии, а затем' обработке канцерогеном, их изначальное число выше, составляя 2155. Как уча отмечалось, чере ? и 14 суток после операции и введения канцерогена их число не свшается, оставаясь на' уровне .21-25$.

УП ГРУППА. Объединяет светлые клетки с признаками дострук цив и некроза. Возникает только в результате действия ДЭИА;~ Пер выо некротически измененные клетки появляются через 6 часов по еле подачи нормальным и оперированиям животным ДЗНА. В этой гру не клеток обнаружкзаэтея как уплотненные, так к сегрегированные ядрнони. В зависимости от вида и сроков эксперимента могут составлять: в интактной лочони, подвергшейся действию канцерогене а при сочетании обработай Д2НА с гопатэг,томной - 3-12?. Налбольаео количество некротических гепатоцитов зарегистрировал к концу перв'лх суток. Спустя трое суток эта группа нами не идог ти^ицирована.

Естественно, что в первую очередь'каше внимание привлеки-

ют глетки о измененным пел действием ДОНА Фенотипом, нз встреча-шшоч в нормальной печени. Средк язкеке-няк* гепатоцитов наибольшие отклонения от нормального принципа организации проявляются в 71 группе, включающей богатые гликогеном светлые гепатоциты малых размеров о псввдонуклеолонзмники ядрышками. Не исключено, что клетки с такими .фенотипаческимд отклонениями могут рассматриваться как возможные предшественники опухолевых клеток. Следует подчеркнуть, что наличие дсевдонуалеолонеминх ядрышек относится к стенотипическому признаку клеток при экспериментальном и споя--такном канцерогенезе (Уазиаип! еЪ а.1, 1970; Челлззе, Зацепина, 1988).

1У. в;гооды

Суммируя результаты, полученные при изучении трехмерной организации ядрышка и общей ультраструктурпо.й морфологии гепатоцитов в нормальных, регенерирующих и подЕергкгасся воздействию ДЗНА печени мышей, «окно сделать следующие выводы:

1. Ядрышки клеток нормально фуккцчонирутедях* гепатоцитов обнаруживают ряд тканесиепифчческих признаков, соответствующих функциональному состоянию гепатоцитов у этого вида грызунов.

К таковым относится присутствие в гепатоцитах ретикулярных и вакуолизированких ядрышек, характеризующихся строго определенной трехмерной организацией и количественными параметрами.

2. В процессе стимуляция гепатоцитов к пролиферации найлх>- . даются переходы вакуолязяровапных ядрышек в ретикулярные ядрышки; последние при дальнейшей активации.дают начало нуклеолоием-ным ядрышкам.Структурные перестройки ядрышка, связанные с его инактивацией, развивается в обратном направлении, т.е. пуклео-лскемные ядрышки переходят в ретикулярные, и те. в свою очередь, дают аачшю вакуолизированнкм ядрышкам. При атом четко проел сбивается строю определенная динамика трехмерной организации ядрышка и корреляции-метау его структурой и количественными параметрами.

3. Активация ретикулярных ядрышек нормальнее гепатоцитов выражается в следующем: (а) нарастании объема ядрыика л РНП-частя (утолщение тр'абекул, увеличение зон Л5К и гращ'ляркого компоненте.) , при одновременном сокращении вакуолярной 'системы; (б) прогрессивном росте числа ФЦ л увеличении их суммарного объема при одновременном сокращении размеров индивидуальных 511; (в) формировании из дискретных зон,образован:«« Щ к ПФК, непрерывного нук-

леолсаемного тята, объединяющего ьсе СЩ; (г) дальнейшем нарастании е нуклеолояемных ядрышках гранулярного компонента и. образовании б тшшччых случаях периферического слоя РШ-гранул: (д) рао-ыкренки вакуолярной системы при переходе-от трабекуяяряой к нук-леолокеыной структуре. • . .

4. Гепатоканцерсген дизтилкагрезашн при одноразовом воздействия на интактную и рзгекерируяшуи печень мыши индуцирует специфические преобразования в пространственной организации и количественных параметрах ядрыика. К специфическим формам ядрышек относятся псевдо::у::леолоаекиые, гипертрофированные и "цветновкд-иыо" ядрышки, отличающиеся повынелной скоростью продукции ире-рРНК, определяемой по объему 1Ш.

5. Действие диотаянитрозамина на интактную и регенерирующую печень мыши выражается: (а) в бистром и кратковременном иаглби-рунщом и цитотоксическом действии, приводящем к гибели частд гэ-сатоцитов; развивающиеся при этом перестройки трехмерной оргади-зациа л изменение ксличеса,Еект,х параметров ядрыпек свидетельствуют с понижении активности р-генов; (б) в продолзитаяьиом ек-тдЕнрукм.ем действия, приводящем сначала к восстановления ретикулярной структуры ядрызьса, а затем к переходу их в гипэртрофиро- -ванный л "цзстковицныо" ядрышки.

6. Результатом действия диэтвлнятрозамчна является ярко вы-т ¿а.-; морфологическая и функциональная гетерогенность гепато-:,::г-сгг. Г;ра этом ебкарунквазгея не свойственные нормальной печена популяциа клеток. Действие канцерогена кй яптактную я регеяеря-.. р;ло-'.''> '¡очень вкзыьаот сходные феиотплические изменения геаато-*ытг*. 3 то кз время, по количественному соотношении разных грул"1 геяатоцлтов эти двг методических подхода заметно различ2(-\ic.u частности» гс-пзтзктомия продлевает время выявления в ' . о.'на'стскной канцерогеном печены богатых гликогеном светлых аде-'.'ок ход.д размеров, частота встречаемости которгж удерживается

уа постоянном уровне, начиная с момента 1сс появления (75 ч. поело введения дяэТ2лк1л-роэа?;кна и 78 ч. после операция) в течение ::т.-х недель.

•Т. Грк действии на лнтачтнузэ, регенерирующую и обработанную -,:о1 счом печено чну.о "кань адпптоген кааршл ароягаяея гопато-: ог/-ц:о свойства, что выражается в снижении количества не-.• • чос:-.;:х клеток по сравнении с яевотнктд;, не получавекмя ка-..•:. При атом кавркм не обладает заметным аффектом действия на

нормальную печень. Это позволяет рекомендовать указанный препарат. ддя дальнейших испытаний о целью внясненая его защитных свойств по отношению к различным паренхиматозным ядам.

СПИСОК ТАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ГО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ * , •

1. Мдивани Т.В., Агла^зе А.Г., Туманишвили Г.Д. Изменение ультраструктуры ядрышек гепатоцитов крас при двусторонней адре-налэктомии и после введения кортизола // Цитология и генетика, 1989, т.24, № 4, с.3-6.

2. Мдивани Т.Б., Туманишвили Г.Д. Особенности ультраструктурной организации ядрышек нормально функциснируктдих г регенериру»-

• щих гепатоцитов мыши // Известия АН РГ, 1991, т.142, № X, с. 169-172.

3. Цдяванл Т.В., Туманишвили Г.Д. Изменение ультраструктуры ядрышек нормальных и стимулированных гепатоцитов шшл после одноразового воздействия геиатоканцерогеногл диэтилнитрозамн-ном // Известия АН ?Г, 1Э92, т.145, * 2. о.263-265.'