Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выявление в геноме мыши генов-мишеней транскрипционных факторов FoxA, связанных с регуляцией пролиферации

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Выявление в геноме мыши генов-мишеней транскрипционных факторов FoxA, связанных с регуляцией пролиферации"

На правах рукописи

894600109

БРЫЗГАЛОВ ЛЕОНИД ОЛЕГОВИЧ

ВЫЯВЛЕНИЕ В ГЕНОМЕ МЫШИ ГЕНОВ-МИШЕНЕЙ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ РОХА, СВЯЗАННЫХ С РЕГУЛЯЦИЕЙ ПРОЛИФЕРАЦИИ.

(03.02.07 - генетика)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 АПР 2010

Новосибирск - 2010

004600109

Работа выполнена в лаборатории регуляции экспрессии генов, учереждении Российской академии наук Института цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Т.И.Меркулова

Институт цитологии и генетики СО РАН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Д. П. Фурман

Институт цитологии и генетики СО РАН

кандидат биологических наук С. П. Коваленко Институт молекулярной биологии и биофизики СО РАМН

Ведущее учреждение: ГНЦ ВБ "Вектор", Новосибирск п.г.т. Кольцово

Зашита диссертации состоится «29» апреля 20 Юг, на утреннем заседании диссертационного совета Д003.011.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук в Институте цитологии и генетики СО РАН, в конференц-зале Института по адресу 630090, г. Новосибирск, 90, Проспект академика Лаврентьева, 10, т/ф (383) 3331278, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан 2010г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

У

Т.М. Хлебодарова

Актуальность темы. Понимание молекулярных механизмов возникновения и развития злокачественных опухолей является необходимым шагом для разработки эффективных методов лечения и профилактики онкологических заболеваний. Одним из активно развивающихся направлений исследований в этой области является изучение роли различных рсгуляторных белков (факторов роста, рецепторов, компонент путей передачи сигналов, факторов транскрипции) в процессах канцерогенеза. Так, изменение экспрессии или активности тех или иных транскрипционных факторов под действием канцерогенных соединений может инициировать каскад событий, ведущих к злокачественному перерождению клетки. При этом в зависимости от того, на какие регуляторные белки влияют эти вещества, могут поражаться лишь определенные ткани, а именно те, в которых данные белки играют ключевую роль в поддержании клеточного фенотипа и/или в контроле пролиферации, что может объяснять тропность многих канцерогенных соединений к тому или иному органу. Таким образом, представляется интересным выяснение механизмов опухолесупрессорного или опухолеиндуцирующего действия факторов транскрипции, экспрессирующихся в ограниченном числе тканей и органов, и обеспечивающих дифференцировку различных типов клеток.

Ранее в нашей лаборатории на линиях мышей, устойчивых и чувствительных к действию гепатоканцерогена орто-аминоазотолуола (ОАТ), были получены данные, указывающие на антионкогенные свойства транскрипционных факторов подсемейства FoxA (по старой номенклатуре HNF3), которые играют ведущую роль в становлении и поддержании фенотипа клеток печени и вовлечены в процесс торможения пролиферации гепатоцитов. Было установлено, что ДНК-связывающая активность FoxA белков под действием ОАТ снижается только у взрослых животных тех линий, у которых он вызывает опухоли печени. Были получены также данные о видовой специфичности влияния 3-метил-4-диметиламиноазобензола (3'- МеДАБ) гепатоканцерогенного для крыс, но не для взрослых мышей и гепатоканцерогенного только для мышей ОАТ на FoxA ДНК-связывающую активность в печени этих животных. В этой связи большой интерес

представляло проведение более систематического исследования, включающего как изучение влияния видоспецифичных ОАТ и 3'- МеДАБ, видонеспецифического гепатоканцерогена диэтилнитрозамина (ДЭНА), а также неканцерогенного 4'-метил-4-диметиламиноазобензола (4'-МеДАБ) на активность FoxA белков в печени взрослых мышей и крыс, так и действия ОАТ и 3'- МеДАБ FoxA ДНК-связывающую активность в печени 12 дневных мышат, для которых оба соединения являются гепатоканцерогенами.

Известно, что антионкогенные свойства связанных с дифференцировкой транскрипционных факторов обусловлены их способностью блокировать пролиферацию клеток и/или запускать апоптоз [Timchenko et al., 1996; Wang et al., 2001; Amsterdam et al., 2002]. Поэтому логично предполагать, что среди генов-мишеней факторов FoxA должны находиться гены, продукты которых участвуют в этих процессах. Хотя к настоящему времени выявлено немало генов, контролируемых FoxA белками, круг их ограничен, главным образом, генными сетями метаболизма глюкозы, аминокислот и липидов, а также экспрессирующимися в печени генами, которые кодируют белки плазмы крови [Schrem et al., 2002]. Гены-мишени факторов транскрипции FoxA, связанные с торможением пролиферации и апоптозом, остаются неизвестными. Выявление таких генов внесет существенный вклад в понимание тканеспецифичных механизмов регуляции процессов пролиферации и апоптоза в норме и будет способствовать развитию методов, позволяющих корректировать нарушения этих процессов при злокачественном перерождении клеток. Цель и задачи исследования. Целью работы было выяснение роли транскрипционных факторов FoxA в механизмах гепатоканцерогенеза, включающее дальнейшее изучение влияния гепатоканцерогенов на FoxA белки в печени мышей и поиск генов-мишеней этих факторов, связанных с процессами пролиферации и апоптоза.

1. Изучение влияния видонеспецифического гепатоканцерогена ДЭНА и неканцерогенного соединения 4'-МеДАБ на ДНК-связывающую активность FoxA белков в печени мышей линии А/Не.

2. Исследование влияния гепатоканцерогенных аминоазокрасителей ОАТ и 3'-МеДАБ на FoxA ДНК-связывающую активность в печени 12 дневных мышат линии ICR, а также у взрослых мышей этой линии.

3. Изучение влияния гепатоканцерогенов на взаимодействие FoxA с регуляторными районами их генов-мишеней в условиях in vivo на примере глюкокортикоид-индуцибельных энхансеров гена TAT.

4. Поиск потенциальных генов-мишеней FoxA, связанных с контролем пролиферации и апоптоза, с использованием опубликованных данных массового анализа экспресии генов мыши и компьютерных методов распознавания сайтов связывания FoxA.

5. Получение GST-слитых белков, содержащих ДНК-связывающие домены FoxA2 и FoxA3 крысы и мыши соответственно, проверка их активности и специфичности

6. Экспериментальная проверка предсказанных компьютерными методами сайтов связывания FoxA с использованием рекомбинантных белков и белков ядерного экстракта.

7. Определение влияния ОАТ (снижающего FoxA ДНК-связывающую активность в печени мышей) на экспрессию потенциальных генов-мишеней FoxA мыши и взаимодействие этих транскрипционных факторов с регуляторными районами таких генов в условиях in vivo.

Новизна и научно- практическая значимость исследования.

Установлено, что ДНК-связывающая активность транскрипционных факторов FoxA в печени мышей снижается под действием видонеспецифического канцерогена ДЭНА, вызывающего опухоли печени как у крыс, так и у мышей. Показано что неканцерогенный для обоих видов животных аминоазокраситель 4'-МеДАБ на активность FoxA белков в печени мышей не влияет. Показано, что у 12 дневных мышат FoxA ДНК-связывающая активность снижается как под действием «мышиного» гепатоканцерогена ОАТ, так и «крысиного» гепатоканцерогена З'-МеДАБ, вызывающего развитие опухолей печени и у мышей при условии его введения в возрасте 12-и дней. На мышах

линии ICR показана прямая связь между активностью FoxA белков и снижением глюкокортикоидной индукции TAT.

Обнаружены два района на расстоянии -2,5 и -6,2 т.п.н. от старта транскрипции гена TAT мыши, высокогомологичные глюкокортикоид-индуцибельным энхансерам гена TAT крысы, и впервые показано взаимодействие с ними FoxA белков (Foxa2 и FoxA3) in vivo. Впервые показано снижение под действием ОАТ связывания FoxA белков с данными регуляторными районами in vivo. Найден новый тип "сильных" сайтов связывания FoxA белков, организованных в виде трех и более повторов тетрануклеотида TTTG. Выявлено два потенциальных гена-мишени FoxA белков - Си12 и Cdc73. Показано, что уровень экспрессии гена См/2 под действием ОАТ, снижающего активность FoxA белков, увеличивается в 10 раз, a Cdc73 в 5 раз, что позволяет предполагать репрессию данных генов этим транскрипционным фактором. Полученные результаты имеют существенное значение для понимания роли тканеспецифичных транскрипционных факторов, в частности FoxA, в механизмах возникновения и формирования опухолей печени под действием гепатоканцерогенов

Выявленный новый тип сайтов связывания в виде TTTG повторов позволяет проводить предварительный поиск новых генов-мишеней FoxA белков контекстным анализом. Материалы данной диссертации используются при чтении лекций по ряду спецкурсов на ФЕН НГУ.

Положения, выносимые на защиту.

1. FoxA ДНК-связывающая активность снижается под действием видонеспецифичного гепатоканцерогена ДЭНА в печени мышей и не изменяется при введении неканцерогенного 4'-МеДАБ.

2. Под действием ОАТ ДНК-связывающая активность FoxA белков снижается как у взрослых, так и у 12 дневных мышей линии ICR. З'-МеДАБ снижает активность FoxA у мышей линии ICR только в возрасте 12 дней, но в меньшей, чем ОАТ, степени.

3. Транскрипционные факторы FoxA2 и FoxA3 in vivo связываются с районами, расположенными на расстоянии -6,2 и -2,5 т.п.н. от старта транскрипции гена TAT мыши, ОАТ снижает связывание FoxA с этими районами in vivo.

4. Уровень изменения ДНК-связывающей активности белков FoxA у мышей линий ICR и А/Не соответствует изменению уровня глюкокортикоидной индукции гена TAT.

5. Найдены 12 потенциальных генов-мишеней транскрипционных факторов FoxA.

6. Показано, что ОАТ увеличивает экспрессию Cu/2 в 10 раз, a Cdc73 - в 5 раз; уровень экспрессии генов СгеЬЗВ, Ppp2r5d, Ptk2b и Pdcd8 изменяется недостоверно.

7. Транскрипционные факторы FoxA эффективно связываются с сайтами организованными в виде 3 и более повторов тетрануклеотида TTTG.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на П Съезде общества клеточной биологии совместно юбилейной конференцией, посвященной 50-летию Института цитологии РАН(Санкт-Петербург, 16-19 октября 2007) и 34th FEBS Congress (Prague, Czech Republic. 2009).

Публикации по теме диссертации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, изложения и обсуждения собственных экспериментальных данных, выводов и списка литературы (189 наименований). Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, и содержит 6 таблицы и 20 рисунов.

МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ.

Работа выполнена на 12-дневных и взрослых самцах мышей линий А/Не и ICR, а также самцах крыс линии Wistar весом 200-250 г разведения вивария Института цитологии и генетики СО РАН. Связывание белков экстракта ядер и рекомбинантных GST слитых белков, синтезированных в E.cole, с различными олигонуклеотимдами изучали методом задержки ДНК пробы в геле. Уровень экспрессии измеряли с помощью ПЦР в реальном времени. Для определения

связывания белков FoxA2 и FoxA3 с их регуляторными участками в генах в условиях in vivo использовался метод иммунопреципитации хроматина. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Изучение влияния ДЭНА и 4'-МеДАБ на FoxA ДНК-связывающую активность в печени мышей. Ранее были получены данные, указывающие на связь между видоспецифической гепатоканцерогенной активностью соединений З'-МеДАБ, и ОАТ у крыс и мышей и 4'-МеДАБ и ДЭНА у крыс и их способностью снижать связывание FoxA белков из печени этих животных со специфическими ДНК сайтами в условиях in vitro [Kropachev et al., 2001; Меркулова и др., 2003]. Для логического завершения этой работы было необходимо изучить действие 4'-МеДАБ и ДЭНА на ДНК-связывающую активность FoxA белков в печени мышей. В ходе работы были также дополнены данные о действии видоспецифичных З'-МеДАБ и ОАТ на FoxA белки как в печени взрослых мышей, так и в печени взрослых крыс.

Исследование влияния всех перечисленных соединений на FoxA ДНК-связывающую активность проводили методом задержки в геле ДНК-зонда, соответствующего известному сайту связывания FoxA из промотора гена транстиригина (TTR), белками ядерного экстракта клеток печени (рис. 1). Видно, что взаимодействие FoxA белков из экстракта ядер печени с меченым зондом как у взрослых мышей, так и у крыс значительно снижается под действием ДЭНА - вызывающего опухоли печени как у крыс, так и у мышей.

Рис 1. Влияние гепатоканцерогенов на FoxA ДНК-связывающую активность в печени мышей (АУНе) (1-6) и крыс (7-12); подвижность 32Р-меченого зонда (TTR) (1, 7); подвижность меченого зонда после инкубации с ядерным экстрактом клеток печени интактных животных (2, 8), обработанных за 24 часа до забоя ОАТ (3, 9), З'-МеДАБ (4, 10), 4'-МеДАБ (5, 11), ДЭНА (6, 12)

Аминоазокраситель 4'-МеДАБ очень близкий по своей химической структуре как к О AT, так и З'-МеДАБ, но неканцерогенный для обоих видов животных, не влиял на связывание с ДНК-зондом FoxA белков из печени взрослых мышей и крыс. Исследование видоспецифичных гепатоканцерогенов ОАТ и 4'-МеДАБ подтвердило ранее полученные результаты [Kropachev et al., 2001; Меркулова и др., 2003], то есть снижение FoxA ДНК-связывающей активности наблюдалось только у животных того вида, у которого данное соединение вызывало опухоли печени: ОАТ - у мышей, З'-МеДАБ - у крыс.

Таким образом, впервые было показано, что ДНК-связывающая активность FoxA белков в печени мыши снижается под действием гепатоканцерогенного ДЭНА, и не меняется при введении неканцерогенного 4'-МеДАБ. Были также дополнены данные о влиянии гепатоканцерогенных аминоазокрасителей на активность FoxA в печени мышей и крыс, а также ДЭНА в печени крыс.

Влияние ОАТ и З'-МеДАБ на ДНК-связывакнцую активность транскрипционных факторов FoxA у мышей линии ICR разного возраста. Для исследования молекулярных механизмов индуцированного гепатоканцерогенеза наиболее удобной моделью являются 12-дневные мышата, так как развитие опухолей печени происходит после однократного введения гепатоканцерогена в этом возрасте. Однако существует ряд особенностей действия гепатоканцерогенов на мышей в этом возрасте. Так неканцерогенный для взрослых мышей З'-МеДАБ при введении в возрасте 12 дней, так же как и ОАТ обладает, хоть и немного менее выраженной, опухолеиндуцирующей активностью. Для изучения возможного участия FoxA белков в процессах гепатоканцерогенеза у мышат, было определено влияние ОАТ и З'-МеДАБ на FoxA ДНК-связывающую активность у мышей линий ICR и А/Не в возрасте 12 дней методом задержки ДНК-зонда (TTR) в геле (рис. 2). Видно, что введение ОАТ 12-дневным мышатам как линии ICR, так и линии А/Не приводит к значительному снижению ДНК-связывающей активности FoxA в экстрактах ядер клеток печени. Эта активность снижается и под действием З'-МеДАБ, но в меньшей степени. При введении исследуемых азокрасителей мышам в

возрасте 3 месяцев, наблюдается уже существенное различие в действии ОАТ и З'-МеДАБ на FoxA ДНК-связывающую активность, активность FoxA у взрослых снижается под действием ОАТ, так же как и у 12-дневных мышат, при этом З'-МеДАБ, который у взрослых мышей не вызывает образование опухолей печени, на нее практически не влияет (исследования изменения FoxA активности у взрослых мышей линии А/Не проведены ранее [Kropachev et al., 2001]). Таким образом, показано, что в ответ на введение соединений, вызывающих впоследствии опухоли печени, в возрасте 12 дней, как и при обработке взрослых мышей, происходит снижение FoxA ДНК-связывающей активности. Также показано, что, как и у остальных чувствительных к гепатоканцерогенному действию ОАТ линий мышей, таких как А/Не и SWR, у взрослых мышей линии ICR происходит снижение активности FoxA под действием этого гепатоканцерогена.

Рис. 2. Влияние ОАТ (3) и З'-МеДАБ (2) на ДНК-| связывающую активность FoxA белков в печени 12 дневных (А) и 3 х месячных (Б) мышей линии ICR и 12 дневных мышей линии А/Не (В). i Контрольным животным вводили растворитель (Г). В каждом варианте для приготовления ядерного экстракта использовали печени 3-х животных.

WlS^Wi;

, «и

Влияние ОАТ на связывание FoxA с регуляторными районами гена TAT in vivo. При анализе регуляторных районов гена TAT мыши и крысы были выявлены схожие районы, степень гомологии в которых была более 80%, соответствующие глюкокортикоид-индуцибельнымным энхансерам -2,5 и -5,5 т.п.н. гена TAT крысы, которые, содержат сайты связывание FoxA.

Методом иммунопреципитации хроматина мы изучили связывание FoxA белков с этими районами у 12-дневных мышат линии ICR и А/Не in vivo. Результаты эксперимента приведены на рис. 3. Видно, что происходит обогащение данными районами преципитатов ДНК, полученных с использованием антител к FoxA2 и FoxA3.

-6,2 т.п.п.

2 3 45 6 78 9

OAT контроль

контроль

Рис. 3. Определение взаимодействия FoxA2 (2 и 7) и РохАЗ (4 и 8) с районами -2,5 и -6,2 т.п.н. гена ТА Ту интактных (6-9) и обработанных ОАТ (1-5) мышей (А/Не) методом иммуноприципитации хроматина. Контроль ПЦР (1). Неспецифическая сорбция ДНК на смолу оценивалась в отсутствии антител (2 и 6), и с использованием антител к Ah рецептору (5 и 9).

Введение ОАТ, приводит к снижению занятости сайтов связывания FoxA белков в обоих районах гена ТАТ(рис. 3), при этом наблюдается связь между активностью FoxA белков и глюкокортикоидной индукцией гена TAT.

FoxA ДНК-связывающая активность 12-дневных ыыш ей

FoxA ДНК-сяязывающая активность взрослых мышеи

f

Trf

■ i ' - -

>• ■

Рис. 4. Изменение индукции TAT и FoxA ДНК-связывающей активности под действием ОАТ и З'-МеДАБ у мышей линии ICR. За единицу взята FoxA ДНК-связывающая активность у интактных мышей. Приведены данные, полученные в результате 3-х независимых выделений ядерного экстракта.

Данные по индукции TAT предоставлены В.И. Калединым и С.И. Ильницкой

Из данных приведенных на рис. 4 видно, что изменение ДНК-связывающей активности FoxA четко соотвествует степени снижения глюкокортикоидной индукции TAT. Таким образом, было доказано существование сайтов связывания FoxA в районах, расположенных на расстоянии -2.5 т.п.н. и -6,2

ГлюкокортихоиднавиндуицияТАТу 12 дневных мышеи

взрослые мыши Г.нокоя'ортпк'ондная ялдукыия

т.п.н. от старта транскрипции гена TAT мыши, а также показано, что введение ОАТ приводит к тому, что как FoxA2, так и FoxA3 перестают связываться с этими районами in vivo, что, по-видимому, и приводит к нарушению глюкокортикоидной регуляции данного гена после введения гепатоканцерогенов. Можно предположить, что снижение активности FoxA белков приводит к нарушению регуляции не только гена TAT, но и других генов, в том числе и генов, связанных с регуляцией дифференцировки и пролиферации клеток, что в свою очередь в дальнейшем может приводить к развитию опухолей в печени.

Поиск потенциальных генов-мишеней FoxA, связанных с регуляцией клеточного цикла и апоптоза, с использованием данных массового анализа экспрессии генов. Для первичного выбора генов, продукты которых могут быть связаны с осуществлением или регуляцией процессов пролиферации и апоптоза в печени, были использованы результаты массового анализа экспрессии генов в различных органах взрослых мышей, опубликованные в базе данных Gene Expression Omnibus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Поскольку известно, что в печени взрослых мышей наблюдается высокий уровень экспрессии белков FoxAl и FoxA2, а в тканях почки их экспрессия отсутствует [Kaestner et al., 1994], нами было отобрано 686 генов, уровень экспрессии которых в печени достоверно (р>0,999), согласно данным базы Gene Expression Omnibus, отличался от такового в почках. Логично ожидать, что такая выборка будет обогащена генами-мишенями FoxA.

Для этих генов была собрана информация о возможности их участия в процессах пролиферации и апоптоза путем анализа данных, опубликованных в базах данных NCBI и литературных источниках. В результате была составлена выборка из 40 генов.

Поиск потенциальных сайтов связывания FoxA белков, и их возможных генов-мишеней с помощью метода SITECON. Нуклеотидные последовательности 40 отобранных генов и прилегающих к ним районов 5000 п.н. выше старта транскрипции были экстрагированы из баз данных GenBank/EMBL.

Затем, с помощью биоинформатического метода 51ТЕССМ [ОБсЬеркоу Л а1., 2004] сотрудником лаборатории теоретической генетики ИЦиГ СО РАН Д. Ю. Ощепковым был проведен поиск потенциальных сайтов связывания РохА в последовательностях этих генов и прилегающих к ним районах до - 5000 п.н. Для адаптации метода поиска этих сайтов, предварительно на основании данных литературы, нами была сформирована обучающая выборка из 19 сайтов связывания РохА, выявленных методом футпринтинга с использованием ДНКазой

Хотя бы один сайт связывания РохА был обнаружен практически во всех анализируемых генах (38 из 40), в 27 было обнаружено более 2 сайтов связывания. Так как регуляторные районы известных генов-мишеней РохА, как правило, содержат несколько близкорасположенных сайтов РохА [8с1юпеуе1с1 сЧ а1., 2004; Меркулова и др., 1997], в качестве потенциальных генов-мишеней этих факторов нами рассматривались только те гены, в последовательностях которых находились кластеры из двух и более близко расположенных потенциальных РохЛ-сайтов.

Экспериментальная проверка предсказанных сайтов связывания РохА белков. Для экспериментальной проверки были взяты 9 сайтов с различной первичной структурой (см. материалы и методы) из потенциальных генов-мишеней. Проверка проводилась методом задержки ДНК-пробы в геле с использованием соответствующих предсказанным сайтам двуцепочечных олигонуклеотидов и белков ядерного экстракта клеток печени взрослых крыс линии \Vistar. Данные представлены на рис. 5А. Полосы задержки, соответствующие ДНК-белковым комплексам, присудствовали в 6 пробах, причем только в 4-ой и 7-ой пробах подвижность основных ДНК-белковых комплексов совпадала с подвижностью комплексов с ДНК-зондом, соответствующим известному сайту связывания РохА из промотора гена транстиретина мыши (дорожка 1). В остальных 4 пробах (2, 3, 5 и 8) подвижность ДНК-белковых комплексов значительно отличалось от контрольной, что может означать, что комплекс сформирован не БохА белком,

либо то, что помимо РохА белка с данным фрагментом ДНК взаимодействуют

Б

123456789 10

-- Ш -

Яр ' ■* >Яш 'Т а, Г;

Рис. 5. Экспериментальная проверка предсказанных сайтов связывания РохА методом задержки в геле с использованием белков ядерного экстракта (А) клеток печени взрослых крыс, и использованием бактериального рекомбинантного белка очищенного на глутатион-агарозе ОЙТ-ОВО-РохА2 (Б). 1 - ДНК-зонд, соответствующий РохА сайту из гена транстиретина; 2-10 -зонды, соответствующие предсказанным сайтам связывания РохА: 2 - СБС40_-4195; 3 - СБС40_-4168; 4 - СОС73_+1302; 5 - Е2Р4_-3170; 6 - Е2Р4 -615; 7 -К1юс_-3019; 8 - Ююс -3050; 9 - Тгр53шр1_-998; 10 -Тгр53шр1_-1256.

другие ядерные белки.

Для подтверждения взаимодействия белка РохА с предсказанными для него

сайтами нами были получены и использованы очищенные СЯТ-слише белки.

К 1 2 3 4 5 6 Рис. 6. Взаимодействие 08Т-слитого белка, П1а а б"а б"а б"а б^а б' содержащего ДНК- связывающий домен ; I о\А2 (С.ХТ-1)1Ш-РохА2). с

' олигонуклеотидами, соответствующими

.: : .лУ'1 ч ; ^ ^¿С^ С - : предсказанным РохА-сайтам и

содержащими двух-(2), трех-(3), четырех-(4), пяти- (5) и шести- (6) кратный повтор

ттто.

Связывание 08Т-ОВО-РохА2 с РохА-сайтом из промотора гена транстиретина (ТТк-РохА) без конкурента (к) и в присутствии конкурентов: ТТ11-РохА(1), СВС40 -4168(2), 0X73 -2044(3),СТВ_-3581(4), СОС73 1302(5), и ЬК2_-1970(6). Конкурент добовляли в 1х(а) и 10х(б) избытке.

содержащие ДНК-связывающие домены FoxA2 (GST-DBD-FoxA2) и FoxA3 (GST-DBD-FoxA3).

Результаты эксперимента по задержке ДНК-зонда в геле с использованием 9 исследуемых олигонуклеотидов и очищенного на глутатион-агарозе GST-DBD-FoxA2 приведены на рис. 5(Б). Как видно данные полученные с химерным белком, хорошо согласуются с результатами по взаимодействию предсказанных сайтов связывания с белками ядерного экстракта клеток печени крысы (рис. 5(A)). Т.е там, где подвижность ДНК-белковых комплексов соответствовала подвижности в контрольной пробе (рис. 5А, проба 4 и 7), там и наблюдалось сильное связывание с химерным белком (рис. 5Б проба 4 и 7).

Наиболее сильным сайтом оказался участок гена CDC73, содержащий 5 повторов тетрануклеотида TTTG, соответствующий последовательности CDC73_+1302. 3-6 звенные повторы этого тетрануклеотида были обнаружены в 13 генах, причем в 11 из них они образуют кластеры сайтов связывания FoxA. В связи с этим было изучено связывание FoxA2 с сайтами, содержащими разное число тетрануклеотидов TTTG. Для этого была исследована конкуренция немеченых олигонуклеотидов, соответствующих предсказанным сайтам связывания, содержащим разное число повторов, с природным сайтом из гена TTR мыши за связывание с рекомбинантным белком GST-DBD-FoxA2. Как видно из данных, приведенных на рисунке 6, предсказанные сайты связывания, содержащие 3-6 звенные повторы TTTG, эффективно связываются с рекомбинантным белком. В то же время двухзвенный повтор, содержащийся в ряде предсказанных сайтов, не связывался с GST-DBD-FoxA2. Данные повторы образуют кластеры FoxA-сайтов в 11 из 40 найденных потенциальных генов-мишеней FoxA. Для дальнейшего изучения возможной регуляции FoxA белками было отобрано 6 из этих генов - Creb3l3, Ppp2r5d, Cdc73, Cul2, Ptk2b и Pdcd8.

Влияние OAT на экспрессию потенциальных генов-мишеней FoxA. Для изучения влияния FoxA белков на экспрессию найденных потенциальных генов-мишеней был использован тот факт, что в результате обработки ОАТ мышей чувствительных к его гепатоканцерогенному действию линий происходит снижение активности этих факторов в печени [Kropachev et al., 2001]. В данной

работе в качестве экспериментальной модели были использованы 12-дневные мыши линии ICR. Из данных, представленных на рисунках 10 и 11, видно, что обработка ОАТ 12-дневных мышат ICR приводит к практически полному ингибированию ДНК-связываюшей активности FoxA.

Изучение действия ОАТ при введении его 12-дневным мышам ICR на экспрессию 6 генов, содержащих кластеры подтвержденных микросателлитных сайтов FoxA: Creb3l3 (cAMP responsive element binding protein 3-like 3), Ppp2r5d (protein phosphatase 2, regulatory subunit В (B56), delta isoform), Cdc73 (V cell division cycle 73, Pafl/RNA polymerase II complex component, homolog (S. cerevisiae)), Cu!2 (Cullin2), Ptk2b (protein tyrosine kinase 2 beta), PdcdS (programmed cell death 8) - с помощью ПЦР в реальном времени показало, что наиболее сильно на обработку животных гепатоканцерогеном реагировали гены Си12 и Cdc73 (рис. 7). Экспрессия гена Си12 увеличилась в 10 раз, a Cdc73 - в 5 раз. Экспрессия остальных генов изменялась значительно слабее. Либо как в случае генов Ppp2r5d, Ptk2b и СгеЬЗВ недостоверно.

Рис. 7. Изменение уровня мРНК 6 потенциальных генов-мишеней FoxA в печени под действием ОАТ. Приведена обобщающая диаграмма.

В качестве внутреннего контроля взят ген домашнего хозяйства GAPDH. При изменении внутреннего контроля на 18S РНК картина экспрессии меняется мало.

-в a. is "О з ь-т-й, — "os

О а, а, а. О О О ь tu в. О о Контроль ОАТ

Таким образом, принимая во внимание наличие сайтов связывания FoxA белков в районах генов Си12 и Cdc73 и изменение их экспрессии под действием ОАТ, снижающего FoxA активность, можно предположить прямое участие этих транскрипционных факторов в регуляции этих двух генов.

Исследование участия FoxA белков в регуляции гена Cul2 in vivo. Для

дальнейшего исследования возможного участия FoxA белков в регуляции экспрессии гена Си12 была предпринята попытка обнаружить наличие FoxA белков in vivo в месте их предсказанных сайтов связывания в данном гене с помощью метода хроматиниммунопреципитации. Для эксперимента были взяты 12 дневные мыши линии ICR и А/Не. В качестве положительного контроля были использованы обнаруженые нами регуляторные районы гена TAT мыши расположенные на расстоянии 2,5 т.п.н. и 6,2 т.п.н. и содержащие сайты для FoxA белков. Однако, нам не удалось показать взаимодействие FoxA белков с районом гена CuI2, содержащим предполагаемый сайт связывания FoxA. Данный результат может быть следствием низкой разрешающей способности используемого нами метода.

Выводы

1. Впервые показано, что видонеспецифичный гепатоканцероген ДЭНА снижает FoxA ДНК-связывающую активность в печени мышей, а неканцерогенный 4'-МеДАБ на нее не влияет.

2. Показано, что ДНК-связывающая активность FoxA белков снижается под действием ОАТ как у взрослых, так и у 12 дневных мышей линии ICR. Показано, что З'-МеДАБ, гспатоканцерогенный для мышей в возрасте 12 дней, снижает активность FoxA у мышей линии ICR в этом возрасте, но в меньшей, чем ОАТ, степени.

3. Методом иммунопреципитации хроматина показано связывание FoxA2 и FoxA3 in vivo с районами, расположенными на расстоянии -6,2 и -2,5 т.п.н. от старта транскрипции гена TAT мыши. Показано, что под действием ОАТ уменьшается занятость этих районов FoxA белками in vivo.

4. На модели 12-дневных и взрослых мышей линии ICR показано, что уровень ДНК-связывающей активности белков FoxA соответствует уровню глюкокортикоидной индукции гена TAT мыши

5. С использованием опубликованных данных о профилях экспресии генов мыши и компьютерного метода SITECON с выборочной экспериментальной

проверкой предсказанных этим методом сайтов связывания FoxA найдены 12 потенциальных генов-мишеней этих транскрипционных факторов.

6. Методом ПЦР в реальном времени изучено влияние ОАТ, снижающего активность факторов FoxA, на экспрессию 6 потенциальных генов-мишеней: Creb3l3, Ppp2r5d, Cdc73, Cul2, Ptk2b и PdcdS. Показано, что OAT увеличивает экспрессию Си12 в 10 раз, a Cdc73 - в 5 раз; уровень экспрессии остальных генов изменялся недостоверно.

7. Обнаружен новый тип "сильных" сайтов связывания транскрипционных факторов FoxA, организованный в виде 3 и более повторов тетрануклеотида TTTG.

Основные результаты работы содержатся в следующих публикациях

1. К.Ю. Кропачев, М.Ю. Пахарукова, JI.O. Брызгалов, В.И. Каледин, В.Ф. Кобзев, Т.И. Меркулова. Неизвестный ядерный белок, снижающий активность HNF3, обеспечивает видоспецифичность действия гепатоканцерогенных аминоазокрасителей.// Доклады Академии Наук, 2004. 397. 5. 694-696.

2. Merkulova, T.I., Kropachev, K.Y., Tiraofeeva, O.A., Vasiliev, G.V., Levashova, Z.B., Ilnitskaya, S.I., Kobzev, V.F., Pakharukova, M.Y., Bryzgalov, L.O., Kaledin, V.l. Species-specific effects of the hepatocarcinogens 3'-methyl-4-dimethyl-aminoazobenzene and ortho-aminoazotoluene in mouse and rat liver // Mol. Carcinog. - 2005. - V. 44. - N 4. - P. 223-232.

3. JI.O. Брызгалов. Н.И. Ершов, С.И. Ильницкая. Транскрипционные факторы FoxA определяют амплитуду глюкокортикоидной индукции тирозинаминотрансферазы у мышей.// Бюллетень экспериментальной биологии. - 2007. т. 144 N11 стр. 565-567

4. JI.O. Брызгалов, Н.И. Ершов, Д.Ю. Ощепков, В.И. Каледин, Т.И. Меркулова. Выявление генов-мишеней транскрипционных факторов FoxA, связанных с регуляцией пролиферации // Биохимия - 2008 Том 73, N1, стр. 70-75.

Подписано к печати 9.03-201 От.

Формат бумаги 60x90. Печ.л.1. Учлзлл.0,7.

Тираж 100 экз. Заказ 17.

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10.