Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительное исследование структуры и функции фенилаланил-тРНК-синтетаз из ESCHERICHIA COLI и THERMUS THERMOPHILUS

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сравнительное исследование структуры и функции фенилаланил-тРНК-синтетаз из ESCHERICHIA COLI и THERMUS THERMOPHILUS"

г^У

АКАДЕМИЯ НАУК СССР СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

На правах рукописи УДК 577.217.32

БОБКОВА Екатерина Вениаминовна

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ ФЕН ИЛАЛАН ИЛ-тРНК-СИНТЕТАЗ ИЗ ESCHERICHIA COLI И THERMUS THERMOPHILUS

03.00.04 — биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск 1991

Работа выполнена з Новосибирском институте биоорганической химии СО АН СССР.

Научный руководитель: доктор химических наук Лазрик О.И. Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Фаворова 0.0. кандидат биологических наук Будкер В.Г.

Ведущая организация:

Институт биохимии им. А.Н.Баха АН СССР, г. Москва

Защита состоится "¿У" -¿¿х Л 1991 года в^часов на заседании Специализированного совета К 003.52.01 в Новосибирском институте биоорганической химии по адресу: 630090, Новосибирск 90, проспект ак.Лаврентьева, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии.

Автореферат разослан"^" ¿^/^-¿^--(1991 года Учбный секретарь Специализированного

совета, кандидат химических наук

О.С. Фёдорова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

. Актуальность темы. Изучение особенностей функционирования ашшоацил-тРНК-синтетаз при'высоких температурах и взаимосвязь их с термостабильностью имеет большое значение для понимания природы и механизмов взаимодействия этих ферментов с субстратами. Одним из основных подходов к исследованию природы термостабильности белков является сравнительное изучение пространственной организации аналогичных ферментов из мезофильных и термофильных источников. Однако известные к настоящему моменту данные, в большинстве своём касаются белков, имеющих небольшие молекулярные веса 100 кДа) и, соответственно, простую олигомерную структуру. Одним из наиболее перспективных методов изучения пространственной структуры является используемый в данной работе метод тритиевой планиграфии, позволяющий изучать доступную поверхность молекулы белка в растворе.

Фенилаланил-тРНК-синтетаза, один из ключевых ферментов биосинтеза белка, имеет сложную олигомерную структуру Ogpg-™113' Ферментативные свойства и структура активного центра фенилаланил-тРНК-синтетазы из E.coli изучались в течение ряда лет, в то время как фенилаланил-тРНК-синтетаза из экстремального термофила Thermus thermophilic, живущего при 75°С, была выделена и охарактеризована лишь недавно (Ai&ilova et al., 1988). Для фермента из Thermus thermophilic получены кристаллы, пригодные для изучения методом рент-геноструктурного анализа, в то время как*попнтки получения кристаллов фенилаланил-тРНК-синтетазы из E.coli не увенчались успехом. В этой связи данная работа имеет принципиальное значение и как один из немногих способов исследования пространственной структуры фермента из E.coli и сравнения её со структурой термофильного фермента.

Цель работы. Настоящая работа посвящена соавнительному исследованию олигомерной структуры и доступных поверхностей фенилаланил-тРНК-синтетаз из E.coli и Thermus thermophilus, а также изучению взаимосвязи термостабильности и особенностей функционирования этих ферментов.

Научная новизна. Впервые исследована взаимосвязь термо-

стабильности, структуры и функции для сложных гетероолиго-мерных ферментов а?р9-типа. На основании полученных результатов предлагается пространственная модель укладки субъединиц и механизм олигомеризации фенилаланил-тРНК-синтетаз из E.coli и Thermus thermophllus. Выявлено, что при переходе от мезофильного фермента к термофильному термостабилизация пространственной структуры достигается путём повышения содержания гидрофобных остатков, в основном засчбт Phe и Pro, возрастания доли экспонированных на поверхности белковой глобулы заряженных остатков (Asx и Arg), упрочения межсубъединич-ных контактов. Впервые изучены особенности функционирования фенилаланил-тРНК-синтетаз из E.coli и Thermus thermophllus при повышенных температурах.

Практическая ценность. Развитые в работе подходы для изучения олигомерной структуры могут быть применены для исследования других гетероолигомерных ферментов. Разработанная методика обработки данных, полученных методом тритиевой пла-ниграфии, позволяет использовать его для сравнения доступных поверхностей различных белков. Понимание основных закономерностей взаимосвязи структуры, термостабильности и функции олигомерных ферментов1 открывает возможность решения многих задач биотехнологии.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на 13-м Международном рабочем совещании по тРНК (Ванкувер, 1989), Международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1?89), Советско-шведском семинаре "Современные методы разделения и ха-рактеризации белков и пептидов" (Новосибирск, 1989), Всесоюзной конференции "Методы получения, анализа и применения ферментов" (Юрмала, 1990).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 научных работы.

Структура и объём диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, результатов работы и их обсуждения и выводов. Работа изложена на 101 странице, включая 10 таблиц и 16 рисунков. Список цитируемой литературы включает 94 работы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Механизм олигомеризации. Пространственная модель олигомерной структуры.

Кс&М

Возможность разделения гетероолигомерных ферментов на субъединицы является одним из необходимых условий для успешного решения таких проблем, как выявление функций различных суОъединиц в процессе катализа, изучение пространственного строения и механизмов самосборки олигомеров. Способность субъединиц к ренатурации после удаления денатурирующего агента находится в прямой зависимости от длительности проводимых разделений.

В данной работе впервые для разделения суОъединиц амино-ацил- тРНК-синтетаз был применён метод высокоэффективной жидкостной хроматографии, что позволяло осуществлять разделение не более чем за 40 мин. Типичные результаты показаны на рис.1. д,

Рис. I: Разделение суОъединиц фенилала-нил-тРНК-синте тазы из E.coll на колонке Mono Q НН 5/5, уравновешенной 0.02 M p.oi-буфером трис-HCI (рН 7.5) с 6 M мочевиной. На колонку наносили 0.5 мг фермента (после диссоциации на суоъедини-цы). Элюцию проводили градиентом концентрации NaCl (00.3).

1 - а-суОъедшпща;

2 - р-суОъедшгица ;

3 - смесь а- и р-субъединиц.

I--

L—

z&o

[/VaCiJ.M ю

-----

Эффективность разделения субъединиц была вше в случае фе-нилаланил-тРНК-синтетазы из E.coli, которая в присутствии 6 M мочевины в течение 30 мин. диссоциировала нацело. Диссоциацию на субъединицы термофильного фермента проводили в 8 M мочевине в течение не менее 2-х часов. Даже в столь жбстких условиях олигомер иногда не диссоциировал полностью, на что указывает наличие пиков, содержащих как а-, так и р-субъединицы. Выявленное различие в устойчивости к воздействию денатурирующего агента позволяет сделать вывод о том, что в термофильном ферменте контакты а-р-типа являются более прочными, чем в ферменте из E.coli.

Полученные препараты индивидуальных субъединиц были проанализированы с помощью нативного градиентного электрофореза (рис.2). Впервые получены данные, что р-субъединицы фермента

р-субъединиц фермента из E.coli; 6 - р-субъединица фермента из E.coli; 7 - а-субъе-диница фермента из E.coli.

Рис.2. Нативный градиентный электрофорез отдельных субъединиц фенилаланил-тРНК синтетаз из Е. coll и Thermus thermophilics и их смесей: I - нативный фермент из E.coli; 2 - смесь а- и р-субъединиц фермента из Thermus theimophilus;

3 - р-субъединица фермента из Thermus thermopnllus;

4 - а-суОъединица фермента из Thermus t hemophilus;

5 - смесь а- и

i Z Ъ к 5 6 7

кЪа.

- t> -

из E.coli существуют в растворе в основном в виде мономеров, с небольшой примесью р2-димеров, в то время как термофильные р-субъединицы обнаружены исключительно в форме ^"ДимвР8-а-Субъединицы обеих фенилаланил-гРНК-синтетаз существуют в растворе в виде с^-димеров и имеют сильную склонность к агрегации (серия полос с разницей по молекулярной массе * 40 кДа). На основании обнаружения си,- и р2-димеров делается вывод о наличии мексубъединичных контактов а-а- и р-р-типов для обоих ферментов.

С целью обнаружения интермедиатов процесса сборки олиго-меров был проведён электрофорез эквимолярных смесей а- и р-субъеданиц обеих фенилаланил-тРНК-синтетаз в нятигных условиях (рис.2). Поскольку ни в том, ни в другом случаях не наблюдалось каких-либо других интермедиатов, кроме упоминавшихся выше, было выдвинуто предположение о том, что самосборка исследуемых ферментов протекает по следующему механизму: а). объединение мономеров а-субъединиц в с^-димеры, аналогично и для р-субъединиц; 0). последующая ассоциация с^-димеров с р2~димерами.

Для изучения зарядовых характеристик обоих ферментов и их субъединиц был использован метод кривых титрования в различных диапазонах рН. Методом кривых титрования в диапазоне рН 4+6.5 были определены изоэлектрические точки (pi) обеих фе-нилаланил-тРНК- синтетаз и их субъединиц (табл.1). Сопостав-

Таблица I. Изоэлектрические точки фенилаланил-тРНК-синтетаз из E.coli и Thermus thermophilic и их субъединиц.

Белок Pi

аЕ.со11 «T.t. Ре.,coil Pl.t. фенилаланил-тРНК-синтетаза из Esherlchla coll фенилаланил-тРНК-синтетаза из Thermus thermophllus 6.05 ± 0.03 5.75 ± 0.03 4.85 ± 0.03 5.13 ± 0.03 . 4.75 ± 0.03 5.00 ± 0.03

ление значений р1 а-суоъединиц с соответствующими значениями р-субъединиц и целых ферментов покгзало заметное различие. Для исследования зависимости эффективного поверхностного заряда от рН были получены кривые титрования в диапазоне рН 3+9. Установлено, что кривые титрования а-субъединиц мезо-фильного и термофильного ферментов настолько похожи, что при проведении совместного титрования наблюдалась одна кривая, которая расходилась лишь при приближении к области р! (см! рис.3).

Рис. 3. Кривые титрования а-субъединиц фенилаланил-тРНК-синте таз из E.coll и Ther-mus thermopliilus :

[-] - а-субъединица

фермента из Thermus thermophilics; [ — ] -а-субъединица фермента из E.coll.

Сравнение кривых титрования р-субъединиц (рис.4) и самих нативных ферментов (рис.5) показало качественное сходство, в то время как поведение а-субъединиц в градиенте рН резко отличалось как от р-субъединиц, так и от самих ферментов. Этот факт, с учётом анализа изоэлектрических точек и склонности а-субъединиц к агрегации, позволяет выдвинуть предположение о том, что при объединении а- и р-субъединиц в тет-рамер, а-субъединицы либо претерпевают сильную конформацион-ную перестройку, либо, что наиболее вероятно, располагаются в олигомере таким образом, что р-субъединицы в значительной

к5$ s.io

Рис. 4. Кривые титро вания р-субъединид фенилаланил-тРНК- син-тетаз из E.coli и The-rmus thermophilic:

t-] - (3-суСъединица

фермента из Thermus thermophilic; [ — ] -(3-суОъединица фермента из E.coli;

Рис. 5. Кривые титрования фенилаланил-тРНК-синтетаз из E.coli и Thermus thermophilic: [-] - термофильный фермент; t — ] - мезофильный фермент.

мере экранируют их поверхность, и эффективный заряд олигоме ра определяется в основном зарядом р-суСъедшшц.

Известно, что фенилаланил-тРНК-синтетаза является функциональным димером (СогэЫсота ег а1., 1983), причем активные центры, согласно данным аффинной модификации, располагаются, скорее всего, в области контакта а- и р-субъединиц (ЮюсЗугеуа ег а1., 1985). Это указывает на то, что в олиго-мере, по всей видимости, имеются два контакта а-р-типа. Кроме того, методом малоуглового рентгеновского рассеяния показано,что макромолекула фенилаланил-тРНК-синтетазы имеет пространственную форму эллипсоида с соотношением осей 2,2 (ТигИсоу е1; а!.. 1988).На основании обнаружения контактов

а-а- и р-р-типов, данных по кривым титрования , а также с учбтом всех вышеперечисленных данных других авторов была предложена модель укладки субъединиц прокариотических фенил-аланил-тРНК-синтетаз (рис.6).

Исследование экстремально термофильных систем биосинтеза белка находится в настоящее время в начальной стадии. Известны только литературные данные, касающиеся термоста-

Рис. 6. Модель укладки субъединиц фенилаланил-тРНК-синтетаз из E.coli и Thermus thermophilics.

2. Взаимосвязь термостабильности и функции

бильности термофильных тРНК и рРНК (Watanabe et al., 1980, Zeikus et al., 1970). Каких-либо данных по исследованию белковых компонентов системы биосинтеза бэлка в литературе не имеется. Поэтому представляло большой интерес изучение взаимосвязи термостабильности и функции исследуемых нами фенил-аланил-тРНК-синтетаз из E.coli и Themus thermophilus.

С этой целью были получены температурные зависимости скоростей реакций пирофосфагного обмена и аминоацилирования тРНК и кривые термостабильности обоих ферментов (рис.7). В случае мезофильного фермента в области повышенных температур

нил-тРНК-синтетаз из E.coll (I) и Thermus thermophllus (2): ,_„_, _ термостабильность

- скорость реакции аминоацилирования тРНК о—о—о - скорость реакции пирофосфатного обмена

наблюдается хорошая корреляция термостабильности и каталити ческой активности как в реакции пирофосфатного обмена, так и в реакции аминоацилирования. Поскольку известно, что температура плавления мезофильной тРНК составляет 75°С (Watanabe et al., 1980), можно утвервдать, что падение каталитической активности после 43°С объясняется термоденатурацией фенил-аланил-тРНК-синтетазы. Нативный градиентный электрофорез

инкубационных смесей показа." появление п^юс, соответствующих субъединицам, что указывает на термодлссоциацию этого фермента.

Совершенно иная картина наблюдалась в случае термофильного фермента (рис.7). Вплоть до 90°С фермен/ обладал термостабильностью и, по крайней мере, вплоть до 85°С сохранял способность катализировать пирофосфатный обмен. В то же время уже после 78°С наблюдалось уменьшение скорости аминоаци-лирования тРНК. Очевидно, что причиной того, что скорость реакции аминоацилирования падает при температурах выше 78°С

является не фенилаланил-тРНК-синтетаза. По данным работы

Php

(Watanabe et al., 1980) термофильная тРНК начинает плавиться с 78°С, причём еб температура плавления составляет 85°С. Эти данные хорошо коррелируют с характером полученной кривой аминоацилирования. Следовательно, в случае термофильной системы уменьшение каталитической активности при повышенных температурах объясняется термоденатурацией тРНК.

Нативный градиентный электрофорез проинкубированной при денатурирующих температурах термофильной фенилаланил-тРНК-синтетазы показал наличие только одной полосы, соответствующей нативному олигомеру. Сопоставление этого результата с данными электрофореза мезофильного фермента указывает на резкое упрочение межсубъединичных контактов в термофильной фенилаланил-тРНК-синте тазе.

Полученные результаты чрезвычайно полезны для понимания основных путей термостаОшшзации и оценки возможных пределов термостабильности системы биосинтеза белка. Очевидно, что из-за небольших размеров тРНК стабилизация её третичной структуры путём повышения GC-содержания и метилирования возможна в меньшей степени, чем, например, для ДНК. Что касается рРНК, то, по данным работы (Zelkus et al., 1970), её термостабилизация достигается при образовании комплекса с рибо-сомными белками. На основании анализа литературных данных и полученных результатов можно предположить, что в экстремальных термофилах наиболее уязвимыми к воздействию высоких температур являются именно рибонуклеиновые компоненты клетки.

3. Аминокислотный состав и доступные поверхности С целью изучения структурных различий, обеспечивающих возможность функционирования термофильной фенилаланил-тРНК-синтетазы при высоких температурах, был определён аминокислотный состав и методом тритиевой планиграфии исследованы доступные поверхности мезофильной и термофильной макромолекул. Облучение горячими атомами трития позволяло вводить тотальную метку преимущественно в поверхностный слой белковой глобулы, при сохранении её нативной структуры.

Результаты аминокислотного анализа обоих белков приведены в табл. 2. Поскольку молекулярные веса ферментов немного

Таблица 2. Распределения площадей доступных поверхностей и параметры локализации аминокислотных остатклв фенилаланил-тРНК-синтетаз из E.coii и Thermus thermophilic.

1/K. 1 S! SD D. 1 N. 1 C. l i. 1

E.o] i Thermus therm. S01y E.coii Thermua therm. KGly 1

Asx 0 Q ?.4Q,o .14 1. *8»0. 1? 1.?7 1 .88 ton»? ?.** 0.46 0 81

Thr 1 .1 я,a?»o • ?7 *.14»Л. *4 1.9? ? iyi*? 64»? 1.84 1.04 1 44

Пег 0 9 *.17*0 18 1.97»o. 11 1.09 1.61 94*4 46.1 1.70 0.64 0

Olx 0 9 4.64*О.П4 4.49*0. 73 0.70 1 .04 271*7 ?8Я*3 0.94 0.74 1 11

Pro 1 0 ?6.6**o 7° **.44*1 0.44 0 • fö 121*8 21**8 0.47 0.94 1 40

Gly 1 0 1?.41»o 6? Я.4*»о . Vi 1.00 1 48 166»? 17**? 0.96 1.04 1 44

Aln 1 * 4.?o»? 11» 4.40*1 .0? 0.78 1 16 19*.* 208*2 0.9* 0. 1 24

V,i ? 4 4.9'I»0 Q7 ?.6?*o • ?1 1.?8 1 .89 141. * 146-1 1.24 1.0; О 40

lie 1 eu ? * 1 6 »1.81»? 0? ?*.14*1 .74 0.61 0 O0 1*0*? ?40** 4}*1 *?1*1 1.04 0.44 0 86

о я 1.07*0 04 1.*?*0 .04 0.44 0 Я1 ?4*10 *0** 0.80 0.69 1 01

Phe 1 Q ?.об*о '16 ?.Я?*П .41 0.40 о 7* 7**? 111»? 0.66 0.76 1 11

"is 1 ? 1. 84 vi 1« 1.0?*0 .08 1.?? 1 80 47*? 46*1 1.2» o. 44 1 44

kTp 1 1 4.64*-> 84 11.67*1 .41 0 4Й 186*? 180*1 0.87 0. *8 о 44

С v.- - - - ??*1 9»1 ?. 44

lys - - - Q4.? 6?»1 1.4? -

отличаются (на «6$), для более корректного сравнения данные для каждого типа аминокислотных остатков были представлены в виде мольных долей, выраженных в процентах. Как видно из сравнительной диаграммы на рис.8, термофильный фермент содержит значительно большее количество Pro, Leu, Phe, Arg и

/00

1S

к

13 12 11 10 9 3 7 6 5 í 3 2 1

А

i

M

As» Thr Ser OU Pro GfcJ Ыа Cijz Ш he leu Туг Phe Ujs His Arg

Рис. 8. Сравнитель ный аминокислотный состав фенилаланил тРНК- синтетаз из E.coli и Thermus thermophllus (в мольных %): В _ фермента из Thermus thermophllus; Q -фермента из E.coli.

меньшее количество Asx, Ile, Thr, Ser, Lys по сравнению с мезофильным аналогом. Количество гидрофобных аминокислот в мезофильном белке составляет 46%, в то время как фермент из Therm? thermophllus содержит 53% гидрофобных остатков. Сопоставление алифатических индексов мезофмльной и термофильной фенилаланил-тРНК-синтетаз (107.7 и 100.9 соответственно) с индексами гидрофобности (1.03 и 1.45) показало, что добавочная гидрофобность термофильного фермента обеспечивается возрастанием содержания неалифатических остатков (Phe и Pro).

Методом тритиевой планиграфии были определены радиоактивности аминокислотных остатков обеих фенилаланил-тРНК-синтетаз, кроме активностей Cys, Met и Lys. В случае термофильного фермента не удалось разделить пики радиоактивности, соответствующие Не и Leu, поэтому все расчёты проводись для их суммы (Пе+Ьэи). Полученные данные по удельным величинам доступных площадей аминокислотных остатков (Буд= Sj/ )

представлены в табл. 2. На сравнительной диаграмме (рис. 9) приведены величины S^ аминокислот обоих белков (для фермен-

S(%)L

Рис. 9. Распреде ление площадей доступных поверхностей аминокислотных остатков (в % от общей площади поверхности): | -фенилаланил-тРНК-с интетазы из Ther-шиз thennophllus; □ - фенилаланил-тРНК-синтетазы из

_[кл_Е-соИ-

Pro leu Gly Thr Arg Vcl Gl* Ser Asx phe His Туг íe

та из E.coli по мере убывания). Видно, что в случае мезо фильного фермента наибольшей доступностью обладают остатки Pro, (Ile + Leu), Thr, 31y. На поверхности фенилаланил-тРНК-синтетазы из Thermus thermophllus наиболее доступными кроме Pro, (Ile + Leu), Gly являются остатки Arg. И в том, и в другом случаях наблюдается довольно высокая степень гидро-фобности поверхности: 60% для фермента из E.coli и 67% для термофильного белка. Для выяснения вопроса о природе термостабильности было проведено сравнение этих результатов с данными по суммарной гидрофобности обоих белков. Установлено, что распределение гидрофобных остатков между внутренней частью глобулы и поверхностью для рассматриваемых мезофиль-ной и термофильной фенилаланил-тРНК-синтетаз примерно одинаково.

Этот эффект пропорционального увеличения гидрофобности на поверхности и во внутренней части глобулы при переходе от мезофильного фермента к термофильному был весьма интересен, но ещб более важной представлялась возможность выявления разницы в локализации каждого вида аминокислотных остатков. Для корректного сравнения белков между собой были проведены нормировки двух типов: на суммарную площадь доступной по-

верхности (SS1) и на площадь доступной поверхности Gly

(SGly). Для того чтобы количественно проследить изменение поверхностной локализации остатков при переходе от мезофиль-ного фермента к термофильному, был введен ряд параметров (Cj, D^, Lj), вычислявшихся по следующим формулам:

С1= цЕ.соИ, jjT.t^ Di= sE.coli/ sT.t^ li= Di/Cl, где n?,co11 и NÏ,t;" - количества остатков типа i в ферментах

F РГ>1 "! Ф t

из E.coll и Thennus thermophilus; и Sj - удельные

площади доступных поверхностей остатков типа 1 в случае ме-зофильного и термофильного ферментов соответственно.

Параметр D^ выражает изменение площади доступной поверхности 1-того остатка при переходе от мезофильного белка к термофильному; параметр - различие в содержании 1-той аминокислоты. Сопоставление этих величин дабт параметр L^, характеризующий изменение локализащш остатков 1-того типа на поверхности белковой глобулы. При L1< I доля остатков 1-того вида, находящихся на поверхности термофильного белка, будет больше доли поверхностных остатков мезофильного Фермента и, наоборот, для случая L1> I доля остатков 1-того вида будет расти во внутренней части глобулы при переходе от мезофильного белка к термофильному.

Сопоставление данных, полученных нормированием на ZS^ и

SG1y, показывают, что наблюдаются изменения в локализации Азх, (Не + Leu) и Arg, что выражается в увеличении экспони-рованности этих остатков на поверхности термофильного фермента.В связи с этим интересно рассмотреть роль заряженных остатков в каталитической функции фенилаланил-тРНК-синтетаз. Согласно целому ряду литературных данных (Киселёв и др., 1984), в состав нуклеотидузнавдих участков аминоацил-тРНК-синтетаз входят остатки Arg и Lys, участвующие в электростатических взаимодействиях с отрицательно заряженными субстратами нуклеотидной природы (АТР и тРНК). Кроме того, можно ожидать, что АТР и тРНК в виде комплексов с Mg2* будут также вступать во взаимодействие с отрицательно заряженными остатками Asp и Glu. Наблюдаемое явление возрастания экспаниэо-

ванноети на поверхности термофильной глобулы заряженных остатков можно объяснить необходимостью компенсации дестабилизирующего воздействия высокой температуры путбм введения дополнительных электростатических взаимодействий с субстратами. Вполне вероятно, что этот феномен имеет общий характер, поскольку, согласно некоторым литературным данным (Walker et al., 1980, Parllla et al., 1987, Мелик-Нубаров и др., 1990), большая часть структурных изменений, влияющих на термостабильность белков, происходит на поверхности.

ВЫВОДЫ

1. Разработана методика разделения субъединиц фенилаланил-тРНК-синтетаз из Escherichia coll и Thermus thenrophllus методом ВЭЖХ. Изучены свойства отдельных субъединиц в растворе. На основании полученных данных предлагается механизм олигсмеризации и пространственная модель олиго-мерной структуры фенилаланил-тРНК-синтетаз.

2. Исследована взаимосвязь термостабильности -и функции фе-нилаланил-тРНК-синтетаз. Установлено, что в случае термофильного фермента падение каталитической активности при температурах выше оптимальной (43°) происходит из-за термодиссоциации фермента на субъединицы. Термофильный фермент обладает экстремальной термостабильностью и уменьшение активности в реакции аминоацилирования при повыщенных температурах (>78°С) вызвано денатурацией тРНК. Показано, что межсубьединичные контакты в термофильном олигомере намного стабильнее к воздействию высоких температур, чем в мезофильном.

3. Определен аминокислотный состав и методом тритиевой пла-кигрэфии исследована доступная поверхность обоих ферментов. Найдено очень высокое содержание алифатических остатков в обоих ферментах и увеличение содержания гидрофобных аминокислот в термофильном белке. Показано, что добавочная гидрофобность обеспечивается возрастанием содержания неалифатических неполярных остатков (Pro, Phe). Установлено, что распределение гидрофобных остатков между поверхностью и внутренней частью глобулы для сравниваемых

белков примерно одинаково. Для обеих фенилаланил-тРНК-синтетаз наиболее доступными являются остатки Pro, (Leu + Не) и Gly, кроме того, в случае фермента из E.coli еще и остатки Thr,а в случае термофильного бежа - остатки Arg.

4. На основании полученных данных делается предположение о том, что в случае фенилаланил-тРНК-синтетазы из Thermus thermophllus экстремальная термостабильность фермента обеспечивается заметным изменением аминокислотного состава путём увеличения содержания гидрофобных и экспониро-ванности заряженных остатков Азх и Arg, а также значительным упрочением межсубъединичных контактов.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Бобкова Е.В., Вольфсон А.Д., Анкилова В.Н., Лаврик О.И. Разделение и сравнительная характеристика субъединиц фе-нилаланил-тРНК-синтетаз из Escherichia coll МНЕ-600 и Thermus thermophllus НВ8. // Биохимия 1990. Т. 55. J6 3. С. 525-533.

2. БобкоЕа Е.В., Гедрович А.В., Анкилова В.Н., Лаврик О.И., Баратова Л.А., Шишков А.В. Сравнительное исследование фенилаланил-тРНК-синтетаз из Escherichia coli и Thermus thermophllus методом тритиевой планиграфии. // Биохимия 1990. Т. 55. Л 9. С. 1570-1577.

3. Bobkova E.V., Gedrovich A.V., Ankilova V.N., Lavrik 0.1., Baratova L.A., Shlshkov A.V. Comparative study ol the phenylalanyl-tRNA synthetases from Escherichia coll and Thermus thermophllus by the tritium topography method. // Biochemistry Int. 1990. V. 20. № 5. P. 1001-10J9.

4. Bobkova E.V., Gedrovich A.V., Lavrik 0.1., Baratova L.A., Shlshkov A.V. The accessible surfaces of phenylalanyl-tRNA synthetases from E.coli and Thermus thermophllus. // International Symposium "Molecular organization of biological systems", abstracts. Moscow. 1989. P.50.